Médecine thérapeutique

Médecine thérapeutique
Médecine thérapeutique. Vol. 7, Numéro 8, Octobre 2001 : 605-10, Revue : CMV
Le diagnostic virologique de l'infection à
cytomégalovirus humain
Marianne Leruez-Ville,
Christine Rouzioux
Laboratoire de virologie, Hôpital Necker-Enfants-Malades, 149, rue de
Sèvres, 75015 Paris, France.
Tirés à part
Reprints
M. Leruez-Ville
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RESUME / SUMMARY
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L'utilisation d'outils simples, rapides et sensibles pour le diagnostic et le suivi thérapeutique de
l'infection à cytomégalovirus est devenue indispensable afin d'optimiser la prescription des
médicaments efficaces contre le cytomégalovirus.
L'infection à cytomégalovirus est ubiquitaire et fréquente ; environ 50 % de la population
d'adultes jeunes est séropositive pour ce virus dans les pays occidentaux. Le cytomégalovirus
humain (CMVH) appartient à famille des herpesviridae. Il possède un ADN double brin de 240
kpb enfermé dans une capside icosaédrique constituée de deux protéines : la protéine majeure
(MCP) et la protéine mineure (mCP). La capside est entourée d'un tégument (ou matrice)
composé d'une vingtaine de phosphoprotéines dont la phosphoprotéine 65 (pp65) représente 95
%. L'enveloppe virale est composée d'une bicouche lipidique portant des glycoprotéines dont la
principale est la glycoprotéine B (gB). La multiplication du CMVH se fait en trois étapes
successives avec une phase de transcription très précoce (EI pour Immediate early) qui aboutit
à la synthèse de protéines non structurales, indispensables d'une part à la transcription des
gènes précoces codant pour les enzymes de la réplication virale et, d'autre part, à la
transcription des gènes tardifs codant pour les protéines structurales virales [1].
Lors de la primo-infection virale, le CMVH va pénétrer dans l'organisme et infecter les
leucocytes sanguins. Cette virémie leucocytaire va permettre la diffusion dans les différents
organes. Le virus, qui se multiplie dans les macrophages tissulaires et dans les cellules
endothéliales, peut être mis en évidence dans les reins, les poumons, les glandes salivaires et
le foie. La réaction immunitaire antivirale est insuffisante pour éliminer le virus qui va rester
indéfiniment dans l'organisme. Le virus reste sous forme latente dans les monocytes sanguins
et les macrophages tissulaires, en particulier au niveau du poumon et du foie. Des réactivations
virales avec reprise de la réplication virale peuvent survenir, elles sont asymptomatiques chez
les sujets immunocompétents, et peuvent en revanche être responsables de manifestations
cliniques plus ou moins graves chez les sujets immunodéprimés.
Le diagnostic virologique de l'infection à CMVH va être réalisé avec l'aide de différentes
techniques qui seront décrites dans une première partie. L'utilisation d'une technique plutôt
qu'une autre se fera en fonction des indications cliniques. Les trois circonstances cliniques
rencontrées sont les suivantes : des symptômes évoquant une primo-infection, une suspicion
d'infection congénitale, et des signes évoquant une infection virale chez les patients
immunodéprimés. La démarche du diagnostic virologique en fonction de ces circonstances
cliniques sera détaillée dans une deuxième partie.
Mots clés
cytomégalovirus humain, culture virale, antigénémie pp65, PCR en
temps réel.

Key-words
ARTICLE
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Les méthodes du diagnostic virologique d'une infection à CMVH
Diagnostic direct : mise en évidence du virus ou de ses constituants
La culture virale
Les techniques de culture virale ne sont réalisables qu'au sein d'un laboratoire spécialisé en
virologie. En effet, ces techniques délicates nécessitent d'une part, un équipement permettant
de réaliser de la culture cellulaire et d'autre part, une prise en charge par un personnel
expérimenté.
La culture virale peut être réalisée à partir de divers prélèvements : sang, urines, biopsies, LCR,
salive, lavage broncho-alvéolaire ou liquide amniotique. Il est impératif que ces prélèvements
soient acheminés rapidement au laboratoire afin d'y être rapidement inoculés. Cette contrainte
majeure de la culture virale est liée à l'extrême fragilité du virus qui survit peu de temps dans le
milieu extérieur. L'utilisation de milieux de transports viraux permet de pallier cette fragilité et
d'assurer la survie du virus pendant quelques heures ; cependant ces milieux ne sont pas
utilisables pour les prélèvements sanguins.
La culture virale consiste à inoculer les prélèvements sur une nappe subconfluente de cellules
fibroblastiques embryonnaires humaines en culture. Il existe deux méthodes pour révéler la
présence du virus qui s'est multiplié dans les cellules fibroblastiques : la technique classique qui
consiste à attendre la survenue d'un effet cytopathique, et la technique rapide qui met en
évidence la présence de protéines virales précoces.
La culture classique
Après une à trois semaines, la présence du CMVH se traduit par l'apparition dans le flacon de
culture de foyers de cellules qui ont perdu leur aspect normal fusiforme pour devenir arrondies :
c'est l'effet cytopathique caractéristique du CMVH.
Cette technique présente deux inconvénients majeurs qui sont d'une part, la lenteur d'obtention
du diagnostic (1 à 3 semaines), et d'autre part le manque de sensibilité (de l'ordre de 40 à 50
%). Cependant, cette technique, qui n'est pas suffisamment performante pour le diagnostic
d'une infection à CMVH, reste malgré tout utilisée dans les laboratoires de virologie puisque
c'est la seule qui permet d'isoler le virus. En effet, une souche virale ainsi isolée peut être
conservée congelée et un test de résistance aux antiviraux ou une caractérisation
épidémiologique pourront être réalisés en cas de nécessité.
La culture rapide
Dans cette technique, les prélèvements sont inoculés sur des cellules cultivées dans les puits
d'une plaque de culture. La culture est arrêtée après 24 à 48 heures d'incubation, et la présence
des protéines très précoces du CMVH synthétisées dans les noyaux est révélée par
immunofluorescence ou par réaction immunoenzymatique en utilisant un anticorps monoclonal

dirigé contre une protéine précoce du CMVH [2].
Cette technique de culture rapide qui a remplacé la culture traditionnelle permet d'obtenir des
résultats en 48 heures avec une meilleure sensibilité que la technique classique.
L'antigénémie pp65
Cette technique dont le principe est simple permet de détecter et de quantifier la virémie à
CMVH (c'est-à-dire le nombre de cellules sanguines circulantes infectées par le CMVH en
phase réplicative) [3]. Il existe deux kits commerciaux permettant de réaliser ce test dans de
bonnes conditions de reproductibilité. Le sang est recueilli dans un tube contenant un
anticoagulant et, après lyse des globules rouges, les leucocytes sont déposés sur une lame. La
présence du CMVH dans les leucocytes est révélée par immunofluorescence à l'aide d'anticorps
monoclonaux dirigés contre la protéine du tégument pp65. Les cellules positives présentent une
fluorescence nucléaire caractéristique (figure 1).
La détection de l'antigénémie pp65 est beaucoup plus sensible que la culture virale pour
détecter une virémie à CMVH et a largement supplanté cette dernière [3-5]. Elle a aussi
l'avantage d'être quantitative puisque l'on peut estimer le nombre de cellules positives pour 100
000 leucocytes déposés sur la lame. Cependant, cette technique, en théorie réalisable dans
n'importe quel laboratoire équipé d'un microscope à fluorescence, reste longue et fastidieuse, à
la fois pour la préparation et pour la lecture des lames. Par ailleurs, elle est peu informative en
cas de leucopénie.
Les techniques de biologie moléculaire : l'amplification génique
(polymerase chain reaction ou PCR)
Les techniques de biologie moléculaire sont de plus en plus utilisées pour le diagnostic des
infections à cytomégalovirus. Elles présentent en effet l'avantage, par rapport aux techniques de
culture cellulaire ou à l'antigénémie pp65, d'être réalisables de manière différée sur des
prélèvements stockés congelés, et d'être rapides, sensibles et automatisables. De nombreuses
techniques « maison » ont été mises au point dans les laboratoires de virologie avant que
n'apparaissent quelques trousses commerciales encore peu diffusées. Ces techniques peuvent
être réalisées sur de nombreux prélèvements (plasma, leucocytes, urines, LCR, biopsies, liquide
amniotique).
Les techniques de PCR qualitative ayant l'ADN viral pour cible
Ces techniques sont d'une très grande sensibilité, en particulier lorsqu'une double PCR (PCR
nichée) est utilisée. De nombreux laboratoires de virologie disposent d'une PCR CMVH «
maison » et actuellement une trousse commerciale est disponible : il s'agit du kit Amplicor CMV
de Roche Diagnostic System basé sur l'amplification du gène de l'ADN polymérase virale.
L'avantage de ces techniques est leur très bonne sensibilité. Ce type de PCR va donc être un
outil précieux dans tous les cas où l'on veut pouvoir détecter la présence de CMVH sans risque
de faux négatif. Ainsi, par exemple, une PCR négative dans le liquide amniotique permet
d'exclure le diagnostic d'infection du fœtus en cas de suspicion d'infection maternofœtale à
CMVH. Ces techniques détectent l'ADN du CMVH, qu'il provienne de virus en phase de
réplication ou de virus en phase de latence ; ainsi ces techniques seront difficiles à interpréter
pour le diagnostic des réactivations virales dans le cadre du suivi des patients immunodéprimés.
Les techniques de PCR qualitatives ayant les ARN messagers viraux pour
cible
Ces techniques qui amplifient les ARN messagers viraux permettent de détecter uniquement les
virus en phase de réplication active, contrairement aux techniques précédemment décrites.
Plusieurs équipes ont développé des techniques de PCR basées sur ce principe [6] et une

technique commerciale est disponible : test CMV NASBA (Organon Teknica).
Les techniques de PCR quantitative
Des techniques de PCR quantitative par compétition ou semi-quantitative ont été développées
par différentes équipes mais restent difficiles d'utilisation par leur manque de standardisation,
leur lourdeur et leur coût. Une seule technique commerciale standardisée est actuellement
disponible (Amplicor Monitor CMV test, Roche Diagnostic System) [7]. Le développement récent
des techniques de PCR en temps réel, simples et peu coûteuses va probablement révolutionner
le diagnostic virologique par biologie moléculaire (figure 2), et leur application au diagnostic des
infections à CMVH a déjà donné lieu à quelques publications [8, 9].
Le diagnostic indirect de l'infection à CMVH : la sérologie
La recherche d'IgG anti-CMVH est actuellement réalisée à l'aide de trousses ELISA
commerciales qui utilisent des protéines recombinantes ou des peptides de synthèse. La
recherche d'IgM anti-CMVH est réalisée par des tests ELISA avec immunocapture ; les IgM anti-
CMVH ne sont présentes que dans environ 70 % des primo-infections chez le sujet
immunocompétent. Les IgM anti-CMVH peuvent persister 16 à 20 semaines après une primo-
infection ; cependant il faut rappeler qu'elles ne sont pas spécifiques de la primo-infection
puisqu'elles peuvent être aussi détectées lors d'une réactivation virale à CMVH. Par ailleurs, on
décrit, lors de l'utilisation de ces tests, des résultats d'IgM-CMVH faussement positifs liés à des
réactions croisées avec les anticorps dirigés contre d'autres herpèsvirus.
La détermination de l'index d'avidité repose sur le fait que les IgG apparaissant lors d'une primo-
infection ont une faible avidité pour l'antigène. On peut mesurer l'avidité des IgG pour un
antigène en comparant le titre des anticorps en présence ou non d'urée 8M ; en effet l'urée
dissocie les anticorps peu spécifiques. En pratique, lors de la primo-infection à CMVH, l'index
d'avidité des IgG anti-CMVH sera bas (< 30 %), alors que, dans une infection ancienne, il sera
élevé (> 70 %) [10].
La démarche diagnostique de l'infection à CMVH dans les différentes
situations cliniques
Le diagnostic de la primo-infection à CMVH chez le sujet
immunocompétent
La primo-infection à CMVH chez le sujet immunocompétent est en général asymptomatique et
atteint le sujet jeune. Les sujets symptomatiques présentent une fièvre et des myalgies
associées à des adénopathies et à des anomalies biologiques tels qu'un syndrome
mononucléosique et une élévation des enzymes hépatiques ; le tableau clinique de la primo-
infection peut rarement être plus sévère.
Le diagnostic virologique de la primo-infection à CMVH repose sur le diagnostic indirect :
- essentiellement sur la mise en évidence d'une séroconversion des IgG entre deux
prélèvements pratiqués à distance l'un de l'autre. En effet, au moment des symptômes évoquant
la primo-infection, les IgG anti-CMVH sont déjà positives, bien qu'à un taux faible ;
- sur la mise en évidence d'IgM anti-CMVH, en sachant que la positivité des IgM ne permet pas
d'affirmer une primo-infection. En effet, les IgM peuvent être présentes en cas de réactivation,
bien qu'à un taux plus faible que lors d'une primo-infection ;
- sur la détermination de l'index d'avidité des IgG anti-CMVH, un index bas (inférieur à 30 %)
étant en faveur d'une infection récente de moins de trois mois [10].

Au moment où le diagnostic de primo-infection est établi chez le sujet immunocompétent, la
recherche par culture du virus dans les urines est toujours positive, car il se multiplie activement
dans le rein pendant plusieurs semaines. En revanche, à ce stade de l'infection, la virémie, qui
est de courte durée chez le patient non immunodéprimé, a le plus souvent disparu, et à ce stade
l'antigénémie n'est positive qu'environ une fois sur trois [11].
Le diagnostic de l'infection maternofœtale à CMVH (tableau 1)
L'infection congénitale à CMVH survient chez environ 1 % des nouveau-nés. Elle est
symptomatique à la naissance dans 5 % des cas : c'est la maladie des inclusions
cytomégaliques qui est une infection généralisée très sévère. Parmi les 95 % d'enfants
asymptomatiques, 15 % présenteront ultérieurement des séquelles neurosensorielles de gravité
variable.
Le diagnostic d'une infection maternofœtale à CMVH peut être réalisé devant trois éventualités :
- rarement, en cas de symptomatologie évocatrice d'une primo-infection chez la mère.
Le plus souvent, devant des anomalies fœtales révélées par l'échographie (retard de croissance
intra-utérin, oligoamnios, hydrocéphalie, calcifications intracrâniennes, grêle hyperéchogène) ;
- ou en cas de symptômes évocateurs de maladie à CMVH à la naissance.
Le diagnostic de l'infection maternelle
Dans les tous les cas, il faut s'efforcer de faire la preuve de la survenue d'une primo-infection
chez la mère pendant la grossesse. En effet, les infections congénitales graves à CMVH
surviennent le plus fréquemment au décours d'une primo-infection maternelle. Il est souvent
possible de tester du sérum prélevé lors des contrôles sérologiques systématiquement réalisés
pendant la grossesse, afin de mettre en évidence une éventuelle séroconversion.
Le diagnostic de l'atteinte fœtale à CMVH
La transmission in utero va survenir dans environ 30 % des cas au décours d'une primo-
infection maternelle. Le diagnostic de l'atteinte fœtale repose sur la mise en évidence du CMVH
dans le liquide amniotique, très riche en virus en cas d'infection. Il se fait soit par culture
cellulaire, ou mieux, par PCR CMVH sur le liquide amniotique, et ne peut être réalisé qu'au sein
de laboratoires agréés pour le diagnostic anténatal en virologie [12, 13].
Le diagnostic de l'infection à CMVH à la naissance
Les IgM CMVH ne sont présentes dans le sang du nouveau-né que dans 80 % des cas. Ainsi, le
diagnostic d'infection congénitale après la naissance repose sur la mise en évidence du CMVH
par mise en culture des urines prélevées lors de la première semaine de vie.
Le diagnostic de la réactivation de l'infection à CMVH chez les
immunodéprimés
Le diagnostic de l'infection à CMVH chez les transplantés (tableau 2)
La primo-infection à CMVH est très fréquente et sévère chez les receveurs dont la sérologie est
négative avant greffe et pour lesquels le donneur est séropositif. Chez les patients séropositifs
avant greffe, la réactivation de l'infection à CMVH survient dans environ 50 à 70 % des cas.
L'infection à CMVH survient 1 à 3 mois après la greffe et se manifeste par le syndrome à CMVH
qui associe une fièvre et une leucopénie à une élévation des transaminases. Sur le plan
virologique, elle se manifeste par une virémie positive liée à la réplication du CMVH dans