PROCESSUS D`EVALUATION DES PROJETS DE THESE

Année 2015-2016 - Demande d’allocation doctorale
ED Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (SSBCV) n°549
1. Informations administratives :
Nom de l’encadrant responsable de la thèse : Dr Driffa Moussata
Unité : INSERM UMR 1069
Equipe (si unité multi-équipes):
Email de l’encadrant : [email protected]
Co-encadrant éventuel : Dr P Besson
2. Titre de la thèse :
Implication des canaux sodiques dépendants du voltage dans la carcinogénèse
colorectale
3. Résumé :
Parmi les cancers colorectaux (CCR), on distingue plusieurs catégories telles que les
cancers sporadiques et les cancers sur maladie inflammatoire chronique de l’intestin (MICI,
incluant la rectocolite hémorragique et la maladie de Crohn), se distinguant par leur voie de
cancérogénèse (1). Parmi les facteurs impliqués dans les cancers sporadiques, on trouve les
canaux ioniques qui ont été identifiés comme étant pro-oncogènes avec une action sur le
contrôle de la prolifération cellulaire et l'apoptose, le contrôle de la migration/invasion et la
propagation métastatique. Parmi eux, on trouve les canaux sodiques dépendants du voltage
(Nav) qui sont sur-exprimés dans le tissu tumoral colique des cancers sporadiques. Dans les
lignées de cellules cancéreuses humaines de colon SW620, SW480, et HT29, il a récemment
été identifié l’expression d’ARNm pour plusieurs isoformes de NaV, les transcrits les plus

abondants étant ceux encodant le canal Nav1.5. La présence des protéines Nav1.5 a été
confirmée par immunocytochimie et leur activité par patch clamp (2). La présence des
protéines NaV1.5 à la membrane plasmique de la surface luminale des cellules cancéreuses a
également été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer
du côlon sporadique, tandis qu’il n’existait aucun marquage au niveau du tissu colique non-
cancéreux (2).
Il a été montré que le milieu extracellulaire des tumeurs est plus acide que celui des tissus
normaux et que ceci favorise la dissémination métastatique des cellules cancéreuses. Ce
phénomène est associé à l’« Effet Warburg », qui correspond à la sélection de cellules
cancéreuses qui relarguent une quantité importante de protons issus de leur métabolisme
glycolytique afin de conserver un pH intracellulaire (pHi) compatible avec leur survie (3).
Parmi les régulateurs du pH intracellulaire, l’échangeur Na+/H+ de type 1 (NHE1), pourtant
ubiquitaire, a attiré l’attention car il est surexprimé dans les cellules cancéreuses et son
activité est associée à la survie des cellules cancéreuses et à la progression tumorale. Il est
connu que l’expression de NHE1 est augmentée dans le cas de rectocolite hémorragique en
réponse à une variété de signaux inflammatoires tels que l’interleukin-1 (IL-1), le TNF-alpha
ou l’interféron gamma (4). Dans les cellules cancéreuses mammaires, nous avons récemment
montré que les effets pro-invasifs et pro-métastatiques des canaux Nav1.5 sont liés à une
stimulation de l’efflux de protons par les échangeurs NHE1 (5) dans les invadopodes (6), et
que leur inhibition pharmacologique par l’utilisation d’un antiangoreux utilisé en clinique, la
ranolazine, permet de réduire la colonisation métastatique des tissus (7). Ainsi, nous nous
proposons d’étudier et de comparer l’expression et activité des canaux ioniques de type Nav,
de leur sous-unités auxilaires β et de l’échangeur NHE1 à partir de prélèvements humains de
cancers colo-rectaux sporadiques et sur MICI, en parallèle d’une étude mécanistique sur
lignées cellulaires de cancer colorectal comparés à des lignées non cancéreuses, et d’étudier
les régulations du pH intra et extracellulaire en relation avec les canaux NaV afin de mieux
comprendre les mécanismes de cancérogénèse colique. Comme les voies de cancérogénèse
colique sont différentes en cas de CCR sporadique et sur colite et que les lignées cellulaires
disponibles ne font pas la différence, nous prévoyons de mettre en culture des explants issus
de biopsies de CCR sporadique et de CCR issu de colite (cultures organotypiques) (8). Cette
technique est maitrisée au sein de l’unité.
Ce projet a pour but de renforcer la connaissance des mécanismes cellulaires conduisant
au développement du cancer colique sur MICI et permettra d’identifier de nouveaux
marqueurs diagnostiques qui pourront être utilisés dans la détection endoscopiques. En effet,

la détection des lésions pré-néoplasiques est rendue difficile par le fait qu’elles apparaissent
en muqueuse plane. Parmi les techniques endoscopiques aidant au diagnostic des lésions
néoplasiques, on compte l’endomicroscopie confocale qui permet de réaliser un examen
histologique in vivo grâce à l’utilisation de fluorescéine injectée par voie intra-veineuse (9).
En EMC, les cellules cancéreuses apparaîssent noires et de grande taille. Or il est bien connu
que la diffusion de la fluoroscéine est pH-dépendante et que les canaux NaV participent à la
régulation du pH, ce qui en fait une cible potentielle de marquage de cancer. Il a été publié
récemment qu’il était possible d’utiliser des marqueurs tels que des anticorps marqués à la
fluorescéine ciblant des lésions néoplasiques (10). Sur un modèle de CCR sur colite murin au
DSS (Dextran Sulfate Sodium) traité à l’azoxyméthane, il est possible d’explorer in vivo les
lésions aux différents stades de cancérogénèse (inflammation-dysplasie-cancer) en endoscopie
conventionnelle et en endomicroscopie confocale. Ce matériel pour animal et ce modèle
murin sont disponibles dans l’unité de recherche CREATIS avec qui le Dr Moussata
collabore. Il est donc possible d’envisager d’explorer in vivo les canaux ioniques cibles sur
colite avec dégénérescence colique. Puis, à partir des prélèvements murins, il est envisagé de
réaliser un examen histologique avec microscope à fluorescence pour confirmer les résultats
obtenus en endomicroscopie confocale.Ce travail permettra à terme d’améliorer la détection
des lésions néoplasiques sur MICI qui ont la particularité d’être difficile à détecter en
endoscopie.
Principales techniques utilisées:
- Culture cellulaire (dont les techniques d’évaluation de la survie, de la prolifération de la
migration et de l’invasivité cellulaire)
- Mise en culture d’explants issus de biopsies (cultures organotypiques)
- Biologie moléculaire et cellulaire (extraction ARNm, RT-PCR, extraction de protéines,
western blotting, co-immunoprécipitation)
- Electrophysiologie cellulaire (patch clamp configuration cellule entière)
- Spectrofluorimétrie (sondes pH : BCECF-AM et SNARF-1, fluoresceine-DHPE ; sondes
sensibles au Na+ : sodium green, SBFI)
- Microscopie d’épifluorescence (immuno-cytofluorescence, microscopie time-lapse)
- Marquages immunohistochimique
Références :
1. Yashiro M. Molecular Alterations of Colorectal Cancer with Inflammatory Bowel Disease.

Dig Dis Sci. 2015; 60: 251-63.
2. House CD, Vaske, CJ, Schwartz, AM, et al. Voltage-gated Na+ channel SCN5A is a key
regulator of a gene transcriptional network that controls colon cancer invasion. Cancer Res
2010; 70, 6957-6967.
3. Lemasters JJ, Holmuhamedov EL, Czerny C, et al. Regulation of mitochondrial function by
voltage dependent anion channels in ethanol metabolism and the Warburg effect. Biochim
Biophys Acta. 2012; 1818:1536-44.
4. Farkas K, Yeruva S, Rakonczay Z Jr, et al. New therapeutic targets in ulcerative colitis: the
importance of ion transporters in the human colon. Inflamm Bowel Dis. 2011;17:884-98.
5. Brisson L, Gillet L, Calaghan S, et al. Na(V)1.5 enhances breast cancer cell invasiveness by
increasing NHE1-dependent H(+) efflux in caveolae. Oncogene 2011 ; 30 : 2070-6.
6. Brisson L, Driffort V, Benoist L, et al.. NaV1.5 Na⁺ channels allosterically regulate the
NHE-1 exchanger and promote the activity of breast cancer cell invadopodia. J Cell Sci.
2013;126 :4835-42.
7. Driffort V, Gillet L, Bon E, et al.. Ranolazine inhibits NaV1.5-mediated breast cancer cell
invasiveness and lung colonization. Mol Cancer. 2014;13:264.
8. Rajcevic U, Knol JC, Piersma S et al. Colorectal cancer derived organotypic spheroids
maintain essential tissue characteristics but adapt their metabolism in culture. Proteome Sci.
2014 ; 11;12-39.
9. Moussata D, Goetz M, Gloeckner A et al. Confocal laser endomicroscopy is a new imaging
modality for recognition of intramucosal bacteria in inflammatory bowel disease in vivo. Gut.
2011; 60: 26-33.
10. Atreya R, Neumann H, Neufert C et al. In vivo imaging using fluorescent antibodies to
tumor necrosis factor predicts therapeutic response in Crohn's disease. Nat Med. 2014; 20:
313-8.