Année 2012-2013 - Demande d`allocation doctorale ED Santé

Année 2012-2013 - Demande d’allocation doctorale
ED Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (SSBCV) n°549
1. Informations administratives :
Nom de l’encadrant responsable de la thèse : Sébastien ROGER
Unité : UMR INSERM U1069 – « Nutrition, Croissance et Cancer »
Equipe : unité mono-équipe dirigée par Pr Stéphan Chevalier
Email de l’encadrant : [email protected]
2. Titre de la thèse :
Nature des interactions fonctionnelles entre le canal sodique Na
V
1.5 et l'échangeur
NHE1 dans les invadopodes des cellules cancéreuses mammaires. Conséquence sur
l’invasivité et le développement métastatique.
3. Résumé : (1 page maximum, en times 11)
Le cancer du sein est le cancer féminin le plus fréquent et représente la première cause de
mortalité des femmes par cancer dans le monde. La forte mortalité associée à ce cancer dépend
essentiellement du développement des métastases, pour lesquelles il n’existe à ce jour aucun marqueur
ni traitement spécifique. Le microenvironnement tumoral est un élément clé dans la progression
cancéreuse. En particulier il a été montré que le milieu extracellulaire des tumeurs était plus acide que
celui des tissus normaux, avec un pH compris entre 6,2 et 6,8 au lieu de pH 7,2-7,4 et que ceci
favorisait la dissémination métastatique des cellules cancéreuses (Cardone et al., 2005). Ce
phénomène est associé à l’« Effet Warburg », qui correspond à la sélection de cellules cancéreuses
ayant une préférence métabolique pour la production d’ATP par la glycolyse (Kroemer and
Pouyssegur, 2008). Une étape clé dans le développement métastatique est l’invasion de la matrice
extracellulaire par les cellules cancéreuses. Le canal sodique dépendant du voltage Na
V
1.5 est exprimé
dans des biopsies de tissu cancéreux mammaire, et non dans les tissus sains, et son niveau
d’expression est corrélé au développement métastatique (Fraser et al., 2005; Yang et al., 2012). Nous
avons montré que l’activité de ce canal potentialise l'invasion de la matrice extracellulaire par les
cellules cancéreuses mammaires (Roger et al., 2003). La fonctionnalité du canal Na
V
1.5 est associée à
une acidification extracellulaire, qui potentialise l’activité protéolytique des cathepsines B et S
extracellulaires (Gillet et al., 2009). Le canal Na
V
1.5 est co-localisé avec l’échangeur Na
+
/H
+
de type
1 (NHE1), dans les radeaux lipidiques riches en cavéoline-1 (cavéoles), et augmente son activité
d’efflux de protons, conduisant à l’acidification du pH périmembranaire (Brisson et al., 2011). Notre
étude récente tend à montrer que le canal Na
V
1.5 est responsable d’une modulation allostérique de
l’activité de NHE-1. Par ailleurs Na
V
1.5 et NHE1 sont co-localisés dans les invadopodes des cellules
cancéreuses mammaires, qui sont des structures protrusives impliquées dans la dégradation de la
matrice extracellulaire (Brisson et al., en révision dans J Cell Science).
L’hypothèse que nous formulons est que, dans les cellules cancéreuses mammaires, l’activité des
complexes protéiques contenant le canal Na
V
1.5 (associé à ses sous-unités auxiliaires β) et
l’échangeur NHE1 (complexe Na
V
), pourrait accroître le risque de développer des métastases. Ce
projet de thèse consiste par conséquent à 1) comprendre in vitro la nature des interactions
fonctionnelles entre ces deux transporteurs ioniques membranaires et déterminer les mécanismes
moléculaires de l’invasivité cancéreuse mammaire (formation et activité des invadopodes) et 2)
déterminer, in vivo, l’implication des protéines du complexe Na
V
dans la croissance tumorale et le

développement des métastases dans un modèle murin de xénogreffe de lignées de cellules cancéreuses
mammaires humaines.
Principales techniques utilisées (déjà validées):
- Culture cellulaire (dont les techniques d’évaluation de l’invasivité cellulaire : inserts
d’invasion, invasion de matrices tridimensionnelles de matrigel)
- Biologie moléculaire et cellulaire (extraction ARNm, RT-PCR, amplification et purification de
plasmides, transfection cellulaire, isolement de radeaux lipidiques sur gradients de saccharose, western
blotting, co-immunoprécipitation, cross-linking)
- Electrophysiologie cellulaire (patch clamp configuration cellule entière) pour la mesure de
l’activité des canaux sodiques NaV1.5 et du potentiel de membrane cellulaire
- Spectrofluorimétrie (sondes pH : BCECF-AM et SNARF-1, fluoresceine-DHPE, sonde
sodium : SBFI-AM, sondes de potentiel de membrane)
- Microscopie de fluorescence (mesure de la protéolyse grâce à l’utilisation de substrats
fluorogéniques des protéases extracellulaires de type z-FR-AMC, DQ-gelatin®, MagicRed®,
immunocytofluorescence
- Etude des invadopodes par épifluorescence (U1069), microscopie confocale et SIM
(Plateforme Nikon Imaging Center- Institut Curie) et par enrichissement de fractions invadopodiales
issues de cellules cultivées sur couche de gélatine.
- Xénogreffes de cellules cancéreuses mammaires humaines chez la souris immunodéprimée
(plateforme In Vivo du Cancéropôle Grand-Ouest).
Originalité du projet:
L’unité U1069 « Nutrition, Croissance et Cancer » est un groupe leader sur le plan mondial
travaillant sur l’implication des canaux ioniques et en particulier des canaux sodiques NaV dans les
propriétés d’invasivité des cellules cancéreuses. Le projet exposé ici est un projet original qui tente de
déterminer la nature des interactions entre NaV1.5 et NHE1, deux protéines membranaires
surpexprimées dans les cancers du sein et associées à la progression métastatique. Ceci permettra de
mieux caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’invasivité des cellules
cancéreuses et le développement des métastases.
Références bibliographiques :
Brisson, L., Gillet, L., Calaghan, S., Besson, P., Le Guennec, J. Y., Roger, S. and Gore, J.
(2011). Na(V)1.5 enhances breast cancer cell invasiveness by increasing NHE1-dependent H(+) efflux
in caveolae. Oncogene 30, 2070-6.
Cardone, R. A., Casavola, V. and Reshkin, S. J. (2005). The role of disturbed pH dynamics and
the Na+/H+ exchanger in metastasis. Nat Rev Cancer 5, 786-95.
Fraser, S. P., Diss, J. K., Chioni, A. M., Mycielska, M. E., Pan, H., Yamaci, R. F., Pani, F.,
Siwy, Z., Krasowska, M., Grzywna, Z. et al. (2005). Voltage-gated sodium channel expression and
potentiation of human breast cancer metastasis. Clin Cancer Res 11, 5381-9.
Gillet, L., Roger, S., Besson, P., Lecaille, F., Gore, J., Bougnoux, P., Lalmanach, G. and Le
Guennec, J. Y. (2009). Voltage-gated Sodium Channel Activity Promotes Cysteine Cathepsin-
dependent Invasiveness and Colony Growth of Human Cancer Cells. J Biol Chem 284, 8680-91.
Kroemer, G. and Pouyssegur, J. (2008). Tumor cell metabolism: cancer's Achilles' heel. Cancer
Cell 13, 472-82.
Roger, S., Besson, P. and Le Guennec, J. Y. (2003). Involvement of a novel fast inward sodium
current in the invasion capacity of a breast cancer cell line. Biochim Biophys Acta 1616, 107-11.
Yang, M., Kozminski, D. J., Wold, L. A., Modak, R., Calhoun, J. D., Isom, L. L. and
Brackenbury, W. J. (2012). Therapeutic potential for phenytoin: targeting Na(v)1.5 sodium channels
to reduce migration and invasion in metastatic breast cancer. Breast Cancer Res Treat.