Boîte

Réseau Algérien de Surveillance de la Résistance des bactéries aux Antibiotiques
Travaux Pratiques Vétérinaires
Salmonella et Proteus
Lundi 3 Décembre 2007 : 10h- 12h30
Chaque binôme travaillera sur :
- Un souche de Salmonella et une souche Proteus
- Distribution d’une galerie classique et une galerie Api 20 E
- Distribution d’une souche de salmonella sur GN inclinée ou sur gélose MH.
-
Lundi 3 Décembre 2007 : 13h 30
- Repiquage des souches distribuées sur milieu TSI.
- Réaliser des antibiogrammes de la souche de référence ATCC 25922 et de la souche distribuée
en utilisant les antibiotiques correspondants aux entérobactéries selon la standardisation
vétérinaire 2007).
Milieu :
- Gélose Mueller Hinton (MH), coulée en boîtes de Pétri sur une épaisseur de 4mm.
- Les géloses sont séchées avant l’emploi.
Inoculum :
- A partir d’une culture pure de 18H sur milieu d’isolement, racler à l’aide d’une anse de platine
quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques.
- Décharger l’anse dans 5 à 10 ml d’eau physiologique stérile à 0,9%.
- Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc Farland
ou à une D.O de 0,08 à 0,10 lue à 625nm.
- L’inoculum peut être ajusté en ajoutant, soit de la culture s’il est trop faible, ou bien de l’eau
physiologique stérile s’il est trop fort.
- L’ensemencement doit se faire dans les 15mn qui suivent la préparation de l’inoculum.
Ensemencement :
- Tremper un écouvillon stérile dans la suspension bactérienne.
- L’essorer en le pressant fermement (en le tournant) sur la paroi interne du tube, afin de le
décharger au maximum.
- Frotter l’écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées.
- Répéter l’opération deux fois, en tournant la boîte de 60° à chaque fois sans oublier de faire
pivoter l’écouvillon sur lui-même. Finir l’ensemencement en passant l’écouvillon sur la
périphérie de la gélose.
Dans le cas où l’on ensemence plusieurs boîtes de Pétri, il faut recharger l’écouvillon à chaque
fois.
Application des disques d’antibiotiques :
- Il ne faut pas mettre plus de 6 disques d’antibiotiques sur une boîte de 90mm de diamètre. Les
disques d’antibiotiques doivent être espacés de 24mm, centre à centre.
- Tester la liste des antibiotiques indiqués dans le tableau suivant selon la bactérie isolée.
- Presser chaque disque d’antibiotique à l’aide de pinces pour s’assurer de son application. Une fois
appliqué le disque ne doit pas être déplacé.

Boites
90mm 
Aviaire
Ruminants
Animaux
domestiques
Equine
Cunicole
Boîte 1
Ampicilline/
Amoxicilline *
Ampicilline
Ampicilline/
Amoxicilline*
Ampicilline
Colistine
Amoxicilline+ Acide
clavulanique
a
Amoxicilline+ Acide
clavulanique
a
Amoxicilline+ Acide
clavulanique
a
Ceftiofur
a
Apramycine
Ceftiofur
a
Ceftiofur
a
Ceftiofur
a
Gentamicine
b
Gentamicine
Neomycine
Cefalexine
Gentamicine
b
Sulfamides
Flumequine
Acide Nalidixique
Tetracycline
Trimethoprime +
sulfamethoxazole
Trimethoprime +
sulfamethoxazole
Enrofloxacine
Trimethoprime +
sulfamethoxazole
Colistine
Tetracycline
Tetracycline
Bacitracine
Boîte 2
Colistine
Trimethoprime +
sulfamethoxazole
Sulfamides
Sulfamides
Furanes**
***
Flumequine
*
Flumequine*
Enrofloxacine
Chloramphenicol **
Gentamicine
Norfloxacine
Tilmicosine
Sulfamides
Boîte 3
Tylosine
Tetracycline
Enrofloxacine
Sulfamides
Incubation :
- 18 heures à 35°C**.
- La durée d’incubation peut être prolongée dans certains cas : oxacilline, glycopeptides et
aminosides.
Lecture :
- Mesurer avec précision les diamètres des zones d’inhibition à l’aide d’un pied à coulisse
métallique, à l’extérieur de la boîte fermée.
- Comparer ces résultats aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture .
Classer la bactérie dans l’une des catégories : Sensible, Intermédiaire ou Résistante
a : le ceftiofur doit être appliqué prés d’un disque d’AMC pour la recherche de la BLSE (bêtalactamase à spectre élargi)
b : Si Gentamicine R d’autres Aminosides pourront être testés
* :
Les molécules testées n’ont pas de valeurs critiques du CLSI. Préparer un inoculum à 0,5 MF et le diluer au 1/100
ème
.
Molécules ayant les valeurs critiques du CA-SFM .
** : Antibiotiques testés au laboratoire dans le cadre de la surveillance de la résistance aux antibiotiques.
** Température optimale de croissance

Mardi 4 Décembre 2007 : 13h 30
- Lecture des antibiogrammes des souches de référence et des souches distribuées.
- Agglutination des souches de Salmonella à l’aide d’antisérums.
- Définir le sérotype isolé , auquel cas faire une inversion de phase :
_ sur milieu Sven Gard afin de déterminer la 2eme phase de la salmonella .
_ sérum anti salmonelle de la 1ere phase selon schéma suivant :
_ Ensemencer cette gélose en touche centrale et incuber la boite 24h à 37°C.
Milieu Sven Gard
Ag 1ere phase
Boite de petri
Prélever la culture en périphérie de la zone d’envahissement pour la recherche de la 2eme phase par
agglutination à l’aide d’antisérums.

Séance de Travaux Pratiques concernant le Staphylocoque :
1. Les antibiotiques à tester sont représentés dans le tableau suivant :
Boîte
90mm 
Aviaire
Bovine, ovine,
caprine et
cameline
Canine et féline
Equine
Cunicole
Boîte 1
Penicilline
Penicilline
Penicilline
Penicilline
Erythromycine
Oxacilline
Oxacilline
Amoxicilline+Acide
clavulanique
Streptomycine
Spiramycine
Streptomycine
Streptomycine
Oxacilline
Gentamicine
a
Enrofloxacine
Neomycine
Erythromycine
Tétracycline
Sulfamides
Flumequineb
Trimethoprime +
sulfamethoxazole
Trimethoprime +
sulfamethoxazole
Gentamicinea
Apramycine
Enrofloxacine
Vancomycine
Boîte 2
Erythromycine
Enrofloxacine
Bacitracine
Spiramycine
b
Tetracycline
Streptomycine
Trimethoprime +
sulfamethoxazole
Vancomycine
Erythromycine
Tétracycline
Sulfamides
Sulfamides
Enrofloxacine
Vancomycine
Boîte 3
Bacitracine
b
Sulfamides
2. Recherche de la résistance à l’Oxacilline.
- Réalisation du test de diffusion à la cefoxitine
- Test de sreening à l’oxacilline pour Staphylococcus aureus
- Demonstration de la technique (mise en evidence de la PlP2a)
3. Screening test à la vancomycine.