Boîte
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Réseau Algérien de Surveillance de la Résistance des bactéries aux Antibiotiques Travaux Pratiques Vétérinaires Salmonella et Proteus Lundi 3 Décembre 2007 : 10h- 12h30 Chaque binôme travaillera sur : - Un souche de Salmonella et une souche Proteus - Distribution d’une galerie classique et une galerie Api 20 E - Distribution d’une souche de salmonella sur GN inclinée ou sur gélose MH. Lundi 3 Décembre 2007 : 13h 30 - Repiquage des souches distribuées sur milieu TSI. Réaliser des antibiogrammes de la souche de référence ATCC 25922 et de la souche distribuée en utilisant les antibiotiques correspondants aux entérobactéries selon la standardisation vétérinaire 2007). Milieu : - Gélose Mueller Hinton (MH), coulée en boîtes de Pétri sur une épaisseur de 4mm. - Les géloses sont séchées avant l’emploi. Inoculum : - A partir d’une culture pure de 18H sur milieu d’isolement, racler à l’aide d’une anse de platine quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques. - Décharger l’anse dans 5 à 10 ml d’eau physiologique stérile à 0,9%. - Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc Farland ou à une D.O de 0,08 à 0,10 lue à 625nm. - L’inoculum peut être ajusté en ajoutant, soit de la culture s’il est trop faible, ou bien de l’eau physiologique stérile s’il est trop fort. - L’ensemencement doit se faire dans les 15mn qui suivent la préparation de l’inoculum. Ensemencement : - Tremper un écouvillon stérile dans la suspension bactérienne. - L’essorer en le pressant fermement (en le tournant) sur la paroi interne du tube, afin de le décharger au maximum. - Frotter l’écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées. - Répéter l’opération deux fois, en tournant la boîte de 60° à chaque fois sans oublier de faire pivoter l’écouvillon sur lui-même. Finir l’ensemencement en passant l’écouvillon sur la périphérie de la gélose. Dans le cas où l’on ensemence plusieurs boîtes de Pétri, il faut recharger l’écouvillon à chaque fois. Application des disques d’antibiotiques : - Il ne faut pas mettre plus de 6 disques d’antibiotiques sur une boîte de 90mm de diamètre. Les disques d’antibiotiques doivent être espacés de 24mm, centre à centre. - Tester la liste des antibiotiques indiqués dans le tableau suivant selon la bactérie isolée. - Presser chaque disque d’antibiotique à l’aide de pinces pour s’assurer de son application. Une fois appliqué le disque ne doit pas être déplacé. Boites 90mm Boîte 1 Aviaire Ampicilline/ Amoxicilline * Boîte 2 Ruminants Ampicilline Animaux domestiques Ampicilline/ Amoxicilline* Equine Ampicilline Cunicole Colistine Amoxicilline+ Acide clavulaniquea Amoxicilline+ Acide Amoxicilline+ Acide Ceftiofura clavulaniquea clavulaniquea Apramycine Ceftiofura Ceftiofura Ceftiofura Gentamicineb Gentamicine Neomycine Cefalexine Gentamicineb Sulfamides Flumequine Acide Nalidixique Tetracycline Trimethoprime + sulfamethoxazole Trimethoprime + sulfamethoxazole Enrofloxacine Trimethoprime + sulfamethoxazole Colistine Tetracycline Tetracycline Colistine Trimethoprime + sulfamethoxazole Sulfamides Sulfamides Furanes***** Flumequine* Flumequine* Enrofloxacine Chloramphenicol ** Gentamicine Norfloxacine Tilmicosine Bacitracine Sulfamides Boîte 3 Tylosine Tetracycline Enrofloxacine Sulfamides Incubation : - 18 heures à 35°C**. - La durée d’incubation peut être prolongée dans certains cas : oxacilline, glycopeptides et aminosides. Lecture : - Mesurer avec précision les diamètres des zones d’inhibition à l’aide d’un pied à coulisse métallique, à l’extérieur de la boîte fermée. - Comparer ces résultats aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture . Classer la bactérie dans l’une des catégories : Sensible, Intermédiaire ou Résistante a: b: * le ceftiofur doit être appliqué prés d’un disque d’AMC pour la recherche de la BLSE (bêtalactamase à spectre élargi) Si Gentamicine R d’autres Aminosides pourront être testés : Les molécules testées n’ont pas de valeurs critiques du CLSI. Préparer un inoculum à 0,5 MF et le diluer au 1/100 ème. Molécules ayant les valeurs critiques du CA-SFM . ** ** : Antibiotiques testés au laboratoire dans le cadre de la surveillance de la résistance aux antibiotiques. Température optimale de croissance Mardi 4 Décembre 2007 : 13h 30 - Lecture des antibiogrammes des souches de référence et des souches distribuées. Agglutination des souches de Salmonella à l’aide d’antisérums. Définir le sérotype isolé , auquel cas faire une inversion de phase : _ sur milieu Sven Gard afin de déterminer la 2eme phase de la salmonella . _ sérum anti salmonelle de la 1ere phase selon schéma suivant : _ Ensemencer cette gélose en touche centrale et incuber la boite 24h à 37°C. Milieu Sven Gard Ag 1ere phase Boite de petri Prélever la culture en périphérie de la zone d’envahissement pour la recherche de la 2eme phase par agglutination à l’aide d’antisérums. Séance de Travaux Pratiques concernant le Staphylocoque : 1. Les antibiotiques à tester sont représentés dans le tableau suivant : Boîte 90mm Boîte 1 Aviaire Bovine, ovine, caprine et cameline Penicilline Penicilline Oxacilline Oxacilline Streptomycine Streptomycine Neomycine Erythromycine Canine et féline Boîte 2 Penicilline Erythromycine Amoxicilline+Acide Streptomycine Spiramycine Oxacilline Gentamicinea Enrofloxacine Tétracycline Sulfamides Flumequineb clavulanique Enrofloxacine Erythromycine Enrofloxacine Bacitracine Spiramycine b Tetracycline Streptomycine Trimethoprime + sulfamethoxazole Vancomycine Erythromycine Tétracycline Sulfamides Sulfamides Enrofloxacine Vancomycine Boîte 3 Bacitracineb Sulfamides 2. Recherche de la résistance à l’Oxacilline. - Réalisation du test de diffusion à la cefoxitine Test de sreening à l’oxacilline pour Staphylococcus aureus Demonstration de la technique (mise en evidence de la PlP2a) 3. Screening test à la vancomycine. Cunicole Penicilline Trimethoprime + Trimethoprime + sulfamethoxazole sulfamethoxazole Apramycine Equine Gentamicinea Vancomycine
