S. I. I.T.U. B. Protéines Concanavaline A PROPRIETES PHYSICOCHIMIQUES La concanavaline A (con A) est une protéine de la famille des lectines. Ces dernières sont des protéines capables de se fixer sur des glucides, et ce, de façon très spécifique. Normalement, la lectine se lie sur un monosaccharide spécifique ou une gamme très restreinte de monosaccharides très structuralement très similaires. Ces glucides peuvent être intégrés dans des oligosaccharides, des glycoprotéines ou des glycolipides. En autant évidemment que le (les) monosaccharides en question est (sont) présent(s) et accessible(s) au site de liaison de la lectine. Les lectines sont abondamment produites par les plantes légumineuses (pois, fèves, haricots, arachides, etc.). Mais on en a aussi découvert chez des invertébrés marins et des microorganismes. Les plus connues sont la phytohémaglutinine (pois vert), l'hémagglutinine (arachide) et la concanavaline A (haricot sabre). La concanavaline A (Con A) est produite par le haricot sabre (Canavalia ensiformis) où elle s'accumule dans le fruit (fève). La con A est spécifique pour le D-mannose et par extension le D-glucose, deux hexoses ne différant que par la disposition de l'alcool sur le carbone 2. D’autres monosaccharides comme le fructose ou galactose ne possèdent pas cette structure ne peuvent lier la con A. Elle est composée de sous-unités fortement glycosylées de 26.5 kDa. Chaque sous-unité comprend 237 sous unités et lie deux atomes métalliques, un Ca 2+ et un métal de transition (généralement du Mn2+). Le pI est de l'ordre de 4.5-5.5. Sa structure tertiaire a été élucidée et est bien connue (1). De même on connait bien ses interactions avec les métaux qui la composent de même qu'avec les bases moléculaires de son affinité pour le mannose et le glucose (Loris et al, 1998) Comme la très grande majorité des lectines, la con A est un homotétramère (a4), ici de 106 kDa. Encore ici sa structure est bien connue. Puisque le tétramère a quatre sous-unités identiques, chacune peut lier un mannose ou un glucose. Un tétramère de con A pourra donc lier en même temps quatre structures possédant un de ses deux hexoses spécifiques. C'est la base même de ses capacités d'agglutination. L'assemblage des sous-unités est affecté par le pH. A pH 7, les tétramères sont formés préférentiellement alors que les pH plus acides (pH 4.5 à 5.6) favorisent la formation de dimères seulement. Chaque sous-unité a un poids moléculaire de 26.5 KDa. METHODE EXPERIMENTALES Isolement et purification La principale technique pour purifier la con A est justement basée sur sa principale propriété biologique, son affinité pour le mannose et le glucose. Il suffit donc de la mettre en présence d'une résine ayant la capacité de lier la con A, Cette résine devrait donc avoir des groupements mannosyles ou glycosyles (ou l'équivalent structural). C'est le principe même d'une chromatographie d'affinité (voir Siitub: chromatographie d'affinité) Justement une résine comme le Sephadex™ est un polymère de dextran (un polymère linéaire de glucose) dont les fibres sont réticulées à l'épichlorohydrine. Dans le Sephadex™, la partie de la molécule de glucose sur laquelle se fixe la con A est accessible. Donc en mettant de la con A en présence de Sephadex, la protéine se liera dessus mais non pas les autres protéines. Lorsqu'on a lavé la colonne de ces protéines non liées, on peut récupérer la con A en la détachant en faisant percoler sur la résine une solution contenant du glucose (ou du mannose). Cette dernière molécule pourra se lier sur les sites de la con A, ces sites étant saturés, ils ne pourront plus se lier au Sephadex, s'en détacheront et élueront hors du gel. D'autres techniques doivent aussi être employés pour se débarrasser d'autres protéines ou d'autres molécules: précipitation différentielle, dialyse, etc. Typiquement dans la technique classique, on commence par broyer des fèves de haricots sabres (Canavalia ensiformis, "jack beans"). Par centrifugation, on se débarrasse des particules trop grosses. Le surnageant de cette centrifugation est alors soumis à une précipitation différentielle au sulfate d'ammonium. La fraction soluble entre 30 et 80% de saturation de sulfate d'ammonium, contenant la con A, est alors dialysée pour éliminer ce sel. Le rétentat est ensuite l'objet d'une chromatographie d'affinité telle que décrite précédemment. La con A est éluée du complexe con Adextran avec du glucose. Ce dernier est éliminé par une autre dialyse. La solution résultante, très diluée en con A est alors lyophilisée pour enlever l'eau et on obtient finalement une poudre de con A pratiquement pure. Agglutination Tel que mentionné précédemment, la con A peut se fixer en même temps sur un à quatre mannose, ou structure contenant un de ces sucres: oligosaccharide, glycoprotéines, glycolipides. Evidemment les cellules ayant à leur surface, de façon accessible, une telle glycoprotéine, glycolipide ou oligosaccharides, pourront se lier à la con A. La concanavaline A peut causer une agglutination des globules rouges ou d'autres cellules. A cause de leur forme et leur couleur, les globules rouges se prêtent particulièrement bien à l'observation de l'agglutination. La con A peut se lier à potentiellement quatre cellules et les maintenir à proximité une de l'autre tout en les empêchant de se compacter une sur l'autre comme dans une sédimentation simple. Figure: Globules rouges agglutinés par une protéine ayant cinq site de liaisons. Remarque: la con A n'a que quatre sites de liaison; ces illustrations ne sont que des exemples d'agglutination. On dit alors que les cellules sont agglutinées. Cette procédure consiste simplement à mettre dans les puits d’une plaquette des globules rouges et en présence ou non de glucose ou de manose. Après quelque temps, le sucre ayra agglutiner les cellules tandis qu’en absence de sucre, les globules auront simplement sédimenter dans le fonds du puits de la plaquette. Cette agglutination donne un aspect typique facile à distinguer d'une sédimentation. Figure: Expérience d'agglutination de globules rouges. Entre autres dans les puits supérieurs gauches, ceux de la colonne de droite et de la rangée inférieure, on remarque une sédimentation simple des globules (taches rouges foncées, denses, bien compactes). Entre autres dans les puits centraux, on peut observer une agglutination typique (taches roses, diffuses, larges) Cette réaction d'agglutination peut évidemment être inhibée, en tout ou en partie, par des sucres libres. comme le glucose, qui lieraient ses sites de liaison sur la con A. D'autres conditions physicochimiques (pH, force ionique, etc.) inhibant l'affinité de la con A pour ses sucres, perturberaient évidemment l'agglutination. Isolement et purification de la con A Un usage fréquent de la con A (et des lectines en général) est la purification de protéines. Cet emploi est toujours basé sur leur affinité pour les sucres. Ainsi, on peut créer des colonnes d'affinité ou on a fixé de façon covalente de la con A. En faisant circuler un extrait cellulaire dans cette colonne d'affinité, les protéines contenant un groupement glycolyses contenant du mannose ou du glucose, s'adsorberont sur la colonne. Les autres protéines passeront tout droit. Pour récupérer ces protéines liées à la colonne, on n'a qu'à éluer avec une solution contenant du mannose ou de glucose. Ces derniers compétioneront avec la protéines adsorbées, celles-ci élueront alors et pourront être récupérées facilement. Autres Il existe de nombreuses autres applications expérimentales comme le marquage des protéines de surface des cellules, l'inhibition de protéines ou d'enzymes glycosylées, etc.