SIITUB Protéines

S. I. I.T.U. B.
Protéines
Concanavaline A
PROPRIETES PHYSICOCHIMIQUES
La concanavaline A est une protéine de la famille des lectines. Ces dernières sont des
protéines capables de se fixer sur des glucides, et ce, de façon très spécifique.
Normalement, la lectine se lie sur un monosaccharide spécifique ou une gamme très
restreinte de monosaccharides très structuralement très similaires. Ces glucides
peuvent être intégrés dans des oligosaccharides, des glycoprotéines ou des
glycolipides. En autant évidemment que le (les) monosaccharides en question est
(sont) présent(s) et accessible(s) au site de liaison de la lectine. Les lectines sont
abondamment produites par les plantes légumineuses (pois, fèves, haricots, arachides,
etc.). Mais on en a aussi découvert chez des invertébrés marins et des
microorganismes. Les plus connues sont la phytohémaglutinine (pois vert),
l'hémaglutinine (arachide) et la concanavaline A (haricot sabre).
La concanavaline A (Con A) est produite par le haricot sabre (Canavalia ensiformis)
où elle s'accumule dans le fruit (fève). La con A est spécifique pour le D-mannose et
par extension le D-glucose, deux hexoses ne différant que par la disposition de
l'alcool sur le carbone 2.
Elle est composée de sous-unités
fortement glycosylées de 26.5 kDa.
Chaque sous-unté comprend 237 sous
unités et lie deux atomes métalliques,
un Ca2+ et un métal de transition
(généralement du Mn2+). Le pI est de
l'ordre de 4.5-5.5. Sa structure
tertiaire a été élucidée et est bien
connue (1). De même on connait bien
ses interactions avec les métaux qui la
composent de même qu'avec les bases
moléculaires de son affinité pour le
mannose et le glucose (Loris et
al,1998)
Comme la très grande majorité des
lectines, la con A est un
homotétramère (a4), ici de 106 kDa. Encore ici sa structure est bien connue. Puisque
le tétramère a quatre sous-unités identiques, chacune peut lier un mannose ou un
glucose. Un tétramère de con A pourra donc lier en même temps quatre structures
possédant un de ses deux hexoses spécifiques. C'est la base même de ses capacités
d'agglutination.
L'assemblage des sous-unités est affectée par le pH. A pH 7, les tétramères sont
formés préférentiellement alors que les pH plus acides (pH 4.5 à 5.6) favorisent la
formation de dimères seulement. Chaque sous-unité a un poids moléculaire de 26.5
KDa.
Isolement et purification
La principale technique pour purifier la con A est justement basée sur sa principale
propriété biologique, son affinité pour le mannose et le glucose. Il suffit donc de la
mettre en présence d'une résine ayant la capacité de lier la con A, Cette résine devrait
donc avoir des groupements mannosyles ou glycosyles (ou l'équivalent structural).
C'est le principe même d'une chromatographie d'affinité (voir Siitub: chromatographie
d'affinité)
Justement une résine comme le Sephadex™ est un polymère de dextran (un polymère
linéaire de glucose) dont les fibres sont réticulées à l'épichlorohydrine. Dans le
Sephadex™, la partie de la molécule de glucose sur laquelle se fixe la con A est
accessible. Donc en mettant de la con A en présence de Sephadex, la protéine se liera
dessus mais non pas les autres protéines. Lorsqu'on a lavé la colonne de ces protéines
non liées, on peut récupérer la con A en la détachant en faisant percoler sur la résine
une solution contenant du glucose (ou du mannose). Cette dernière molécule pourra se
lier sur les sites de la con A, ces sites étant saturés, ils ne pourront plus se lier au
Sephadex, s'en détacheront et élueront hors du gel.
D'autres techniques doivent aussi être employés pour se débarasser d'autres protéines
ou d'autres molécules: précipitation différentielle, dialyse, etc.
Typiquement dans la technique classique, on commence par boyer des fèves de
haricots sabres (Canavalia ensiformis, "jack beans"). Par centrifugation, on se
débarrasse des particules trop grosses. Le surnageant de cette centrifugation est alors
soumis à une précipitation différentielle au sulfate d'ammonium. La fraction soluble
entre 30 et 80% de saturation de sulfate d'ammonium, contenant la con A, est alors
dialysée pour éliminer ce sel. Le rétentat est ensuite l'objet d'une chromatographie
d'affinité telle que décrite précédemment. La con A est éluée du complexe con Adextran avec du glucose. Ce dernier est éliminé par une autre dialyse. La solution
résultante, très diluée en con A est alors lyophilisée pour enlever l'eau et on obtient
finalement une poudre de con A pratiquement pure.
PROPRIÉTÉS BIOLOGIQUES ET APPLICATIONS
Agglutination
Tel que mentionné précédemment, la con A peut se fixer en même temps sur un à
quatre mannose, ou structure contenant un de ces sucres: oligosaccharide,
glycoprotéines, glycolipides. Evidemment les cellules ayant à leur surface, de façon
accessible, une telle glycoprotéine, glycolippide ou oligosaccharides, pourront se lier
à la con A .
La concanavaline A peut causer une agglutination des globules rouges ou d'autres
cellules. A cause de leur forme et leur couleur, les globules rouges se prêtent
particulièrement bien à l'observation de l'agglutination. La con A peut se lier à
potentiellement quatre cellules et les maintenir à proximité une de l'autre tout en les
empêchant de se compacter une sur l'autre comme dans une sédimentation simple.
Figure: Globules rouges agglutinés par une protéine ayant cinq site de liaisons.
Remarque: la con A n'a que quatre sites de liaison; ces illustrations ne sont que des exemples
d'agglutination.
On dit alors que les cellules sont agglutinées. Cette procédure consiste simplement
à mettre dans les puits d’une plaquette des globules rouges et en présence ou
non de glucose ou de manose. Après quelque temps, le sucre ayra agglutiner les
cellules tandis qu’en absence de sucre, les golbules auront simplement
sédimenter dans le fonds du puits de la plaquette.
Cette agglutination donne un aspect typique facile à distinguer d'une sédimentation.