Protocole electrophorese - Echange TV.Le Valentin.free.fr

ELECTROPHORESE
Dans un cadre scolaire, la classe de BTS Technologie Végétale Promotion 2009-2011 du lycée agricole du
Valentin a réalisée un TP de Génétique ayant pour but de concrétiser les connaissances théoriques sur les
électrophorèses. Ce dernier consiste à étudier des protéines contenues dans des extraits bruts de certains
organismes vivants (ici du monde végétal) à partir d'un support, ici un gel d'amidon.
Préalablement à l'électrophorèse, nous avons donc mis en culture dix variétés de blé, une de haricot et de pois
afin d'en étudier leurs différentes compositions en protéines enzymatiques.
Grâce à l'électrophorèse, nous allons être capables d'aborder l'étude des gènes au travers des propriétés
biochimiques des protéines à partir de trois allèles correspondant aux enzymes nommées AAT, MDH, IDH.
La technique d'électrophorèse a un intérêt dans la sélection végétale. Elle permet d'une façon générale la
différenciation des variétés sur le plan génotypique, ce qui limite considérablement la bio piraterie.
Dans un premier temps, elle permet de choisir des parents homozygotes pour l'obtention d'un nouvel hybride et
donc de sélectionner des parents pour les caractères souhaités.
Deuxièmement, ce qui prend le plus de temps c'est la stabilisation de la variété, phase pendant laquelle on rend
homozygote une lignée. L'électrophorèse va permettre de mettre en évidence une différence allélique et donc de
choisir et de sélectionner des individus homozygotes pour le gène d'intérêt et donc de raccourcir le temps de
sélection.
De plus, l'électrophorèse permet de découvrir des gènes marqueurs pour des gènes d'intérêt en établissant une
carte génétique, ces gènes marqueurs nous permettront eux aussi de diminuer encore le temps de sélection.
De surcroît, l'électrophorèse peut nous servir à étudier et utiliser différentes techniques de biotechnologie
comme la mutagenèse, la transgénèse, les variations soma-clonales, etc...
L'électrophorèse va vous être présentée de la manière suivante:
Pour commencer, nous allons vous expliquer le processus de préparation des solutions, nécessaire à la création
du gel d'amidon. Puis, nous allons vous communiquer la méthode pour couler le gel d'amidon ainsi que la
technique de révélation qui met en évidence le parcourt effectué par la protéine durant sa migration.
Pour finir, nous verrons en conclusion les différents problèmes que nous avons pu rencontrer lors de cette
expérience.
Bibliographie
Avec l'aide des documents suivant :
- N. Pasteur G. Pasteur F. Bonhomme J.Catalan J. Britton.Davidian, Manuel technique de génétique
par électrophorèse des protéines, Technique et documentation, Paris, 1985.

Protocole de l’électrophorèse
Matériels et méthodes
Préparation des échantillons
L’électrophorèse sera effectuée sur des échantillons de
différentes espèces végétales.
Les graines sont semées 1 semaine avant la manipulation pour
pouvoir prélever des feuilles, et d'autres quelques jours avant
pour pouvoir prélever des embryons germés.
Variétés utilisées:
 Blés tendre: monocotylédone, graine albuminée, avec des réserves d'amidon.
Les variétés:
- Barok
- Toison d'or
- Isidor
- Galopain
- Chevalier
- Goncourt
- Accroc
- CM 2108
- Rehan
- Crousty
 Pois: dicotylédone, graine ex-albuminée, avec des réserves
d'amidon.
 Haricots: dicotylédone, graine ex-albuminée, avec des
réserves d'amidon.
Préparation des échantillons :
Après une semaine, les graines ont germé, pour
effectuer les électrophorèses on prélève et on réduit
en « bouillie » à l'aide d'une tige en verre différentes
parties des plantules (embryon, feuille et gemmule)
de chaque espèce sur des lamelles séparées, avec une
goutte de solution tampon.
Ensuite on imbibe des lamelles de papier Wattman
de ces « bouillies » que l'on insérera dans le gel. Cette
opération est effectuée deux fois étant donnés que
nous utiliserons deux gels.

Ordre des échantillons:
1
2
2a
3
4
4a
5
6
6a
Barok
feuille
Barok
embryon
Barok
gemmule
Toison
d'or
feuille
Toison
d'or
embryon
Toison
d'or
gemmule
Isidor
feuille
Isidor
embryon
Isidor
gemmule
7
8
8a
9
10
10a
11
12
12a
Galopain
feuille
Galopain
embryon
Galopain
gemmule
Chevalier
feuille
Chevalier
embryon
Chevalier
gemmule
Goncourt
feuille
Goncourt
embryon
Goncourt
gemmule
13
14
14a
15
16
17
18
19
20
Accroc
feuille
Accroc
embryon
Accroc
gemmule
CM 2108
feuille
CM 2108
embryon
Rehan
feuille
Rehan
embryon
Crousty
feuille
Crousty
embryon
21
22
Poix
Haricot
Préparation des solutions
Pour la réalisation de l’électrophorèse il faut tout d’abord préparer plusieurs solutions (11) :
1) Les solutions qui serviront à l’élaboration du gel d’amidon et au tampon des éléctrodes:
- Solution 1 : tampon gel
- Solution 2 : tampon électrode
- Solution 3 : solution tris 1M
2) Les solutions de révélations qui permettront la lecture du gel
 La solution de lactate est composée de 5 solutions
différentes qui sont :
- Solution 4 :Tris .A
- Solution 5 : Acides lactique
- Solution 6:NAD
- Solution 7 :NBT
- Solution 8 :PNS

 La solution de malate est composée de 7 solutions différentes qui sont :
- Solution 4 : Tris .A
- Solution 6 :NAD
- Solution 7 :NBT
- Solution 8 : PMS
- Solution 9 :Acides malique
- Solution 10 :MgCL2
- Solution 11 :MTT
Solutions 1 et 2
Matériels:
 TRIS (0,62 M) (227,147g) (solution n°2)
 TRIS (1 M) (étalonnage pH-mètre – Solution n°3)
 ACIDE CITRIQUE (0,14 M) (90,09g) (solution n°2)
 H2O (4L)
 Bêcher
 Pipettes
 Balance
 Fiole jaugée
 Eprouvette graduée
 Marmite
 pH-mètre
Protocole:
Nous avons convertis le volume de la deuxième solution, dont les dosages des produits étaient initialement sur
une base de 5L, à un volume de 3L.
Nous avons pesé le TRIS et l’ACIDE CITRIQUE, les avons mis dans une fiole jaugée et avons complété jusqu’à
obtenir 1L de solution.
Cette solution a été versée dans une marmite puis complétée avec 2L d’eau distillée.
Nous avons étalonné le pH à 8,5 au lieu de 8 à cause d’une défaillance du pH-mètre à l’aide de la solution n°3.
Théoriquement nous aurions dû diluer la solution n°2 à 1/29 (1mL de solution n°2 pour 29mL d'H2O), mais au
final il a été décidé de faire 2 solutions différentes : 1 diluée à 1/29 et l’autre non diluée.
Concernant la dilution, le dosage a été de 33,33mL de solution n°2 pour 966,57mL d’H2O.
Les deux solutions ont été versées dans deux éprouvettes graduée jusqu’à un volume de 400mL.
Solution 3
Matériel :
 Becher 600ml
 Balance de précision (0,0001 g)
 Fiole jaugé 500ml
 Agitateur magnétique
Protocole:
La TRIS =121,14 g /mol
Le but est d’obtenir 500ml de solution de TRIS a une mol /l
Calcul de la masse de poudre de TRIS à diluer .La masse molaire M=121,14 g /mol
m=M*0,5
m=121,14/2=60,57 g
Puis il y a dilution des 60,57 g de TRIS dans 500 ml d’eau distillée
Conception du gel d'amidon
Une fois toutes les solutions terminées, nous allons pouvoir
concevoir le gel d'amidon. Pour cela, seul les solutions 1, 2 et 3

seront utilisées. Les autres seront placées au frais et serviront à la lecture du gel d'amidon. Le gel est préparé à
partir de ces 3 solution mélangé à de l’amidon hydrolysé à 12%.
La solution 1 correspond au tampon gel (solution 2 et 3 et eau distillée). La solution 2 correspond au tampon
électrode. Elle permet de faire passer un courant électrique à travers le gel d'amidon afin de faire migrer les
enzymes. La solution 3 correspond à l'étalonnage du pH, elle permet donc de réguler le pH.
La solution 1 a été obtenue par mélange de la solution 2 et de la
solution 3. Cette solution est placée dans une burette graduée de
400mL. Dans une fiole à vide ont été versé 48g d'amidon puis on
rajoute 400mL de solution tampon. La fiole à vide est placée sur une
plaque chauffante. Le but est d'agiter la fiole à vide sans faire bruler
le gel d'amidon au fond de la fiole et d'éviter que le gel boue Lorsque
nous observons un changement de texture de la solution, le
chronomètre est déclenché pour 1minute et 15 secondes. Une foi le
temps écoulé, l'agitation de la solution doit cesser. La solution est
retirée de la plaque chauffante.
Le dégazage est effectué grâce à une trompe à eau qui va
permettre d'évacuer l'air se trouvant à l'intérieur de la fiole à vide
fermée par un bouchon.
La solution est répartie de façon homogène dans un cadre de
coulage de 1cm d'épaisseur et 21cm de longueur sur 19cm de
large. Il y a alors obtention du gel d'amidon. Il faut ensuite
laisser le gel refroidir une nuit entière pour qu'il se solidifie. Or
par manque de temps, nous avons décidé de laisser le gel
refroidir à l'extérieur seulement quelques heures.
Une fois que le gel est coulé et qu’il a refroidie, il faut faire le
découpage du gel à l’aide d’un scalpel, tout au tour de la plaque
qui contient le gel, pour le décoller du bord.