Protocole electrophorese - Echange TV.Le Valentin.free.fr
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ELECTROPHORESE Dans un cadre scolaire, la classe de BTS Technologie Végétale Promotion 2009-2011 du lycée agricole du Valentin a réalisée un TP de Génétique ayant pour but de concrétiser les connaissances théoriques sur les électrophorèses. Ce dernier consiste à étudier des protéines contenues dans des extraits bruts de certains organismes vivants (ici du monde végétal) à partir d'un support, ici un gel d'amidon. Préalablement à l'électrophorèse, nous avons donc mis en culture dix variétés de blé, une de haricot et de pois afin d'en étudier leurs différentes compositions en protéines enzymatiques. Grâce à l'électrophorèse, nous allons être capables d'aborder l'étude des gènes au travers des propriétés biochimiques des protéines à partir de trois allèles correspondant aux enzymes nommées AAT, MDH, IDH. La technique d'électrophorèse a un intérêt dans la sélection végétale. Elle permet d'une façon générale la différenciation des variétés sur le plan génotypique, ce qui limite considérablement la bio piraterie. Dans un premier temps, elle permet de choisir des parents homozygotes pour l'obtention d'un nouvel hybride et donc de sélectionner des parents pour les caractères souhaités. Deuxièmement, ce qui prend le plus de temps c'est la stabilisation de la variété, phase pendant laquelle on rend homozygote une lignée. L'électrophorèse va permettre de mettre en évidence une différence allélique et donc de choisir et de sélectionner des individus homozygotes pour le gène d'intérêt et donc de raccourcir le temps de sélection. De plus, l'électrophorèse permet de découvrir des gènes marqueurs pour des gènes d'intérêt en établissant une carte génétique, ces gènes marqueurs nous permettront eux aussi de diminuer encore le temps de sélection. De surcroît, l'électrophorèse peut nous servir à étudier et utiliser différentes techniques de biotechnologie comme la mutagenèse, la transgénèse, les variations soma-clonales, etc... L'électrophorèse va vous être présentée de la manière suivante: Pour commencer, nous allons vous expliquer le processus de préparation des solutions, nécessaire à la création du gel d'amidon. Puis, nous allons vous communiquer la méthode pour couler le gel d'amidon ainsi que la technique de révélation qui met en évidence le parcourt effectué par la protéine durant sa migration. Pour finir, nous verrons en conclusion les différents problèmes que nous avons pu rencontrer lors de cette expérience. Bibliographie Avec l'aide des documents suivant : - N. Pasteur G. Pasteur F. Bonhomme J.Catalan J. Britton.Davidian, Manuel technique de génétique par électrophorèse des protéines, Technique et documentation, Paris, 1985. Protocole de l’électrophorèse Matériels et méthodes Préparation des échantillons L’électrophorèse sera effectuée sur des échantillons de différentes espèces végétales. Les graines sont semées 1 semaine avant la manipulation pour pouvoir prélever des feuilles, et d'autres quelques jours avant pour pouvoir prélever des embryons germés. Variétés utilisées: Blés tendre: monocotylédone, graine albuminée, avec des réserves d'amidon. Les variétés: - Barok - Toison d'or - Isidor - Galopain - Chevalier - Goncourt - Accroc - CM 2108 - Rehan - Crousty Pois: dicotylédone, graine ex-albuminée, avec des réserves d'amidon. Haricots: dicotylédone, graine ex-albuminée, avec des réserves d'amidon. Préparation des échantillons : Après une semaine, les graines ont germé, pour effectuer les électrophorèses on prélève et on réduit en « bouillie » à l'aide d'une tige en verre différentes parties des plantules (embryon, feuille et gemmule) de chaque espèce sur des lamelles séparées, avec une goutte de solution tampon. Ensuite on imbibe des lamelles de papier Wattman de ces « bouillies » que l'on insérera dans le gel. Cette opération est effectuée deux fois étant donnés que nous utiliserons deux gels. Ordre des échantillons: 1 Barok feuille 2 2a 3 Barok Barok Toison embryon gemmule d'or feuille 4 4a 5 Toison Toison Isidor d'or d'or feuille embryon gemmule 6 6a Isidor Isidor embryon gemmule 7 8 8a 9 10 10a 11 12 12a Galopain Galopain Galopain Chevalier Chevalier Chevalier Goncourt Goncourt Goncourt feuille embryon gemmule feuille embryon gemmule feuille embryon gemmule 13 Accroc feuille 14 14a 15 16 17 Accroc Accroc CM 2108 CM 2108 Rehan embryon gemmule feuille embryon feuille 21 Poix 22 Haricot 18 19 Rehan Crousty embryon feuille Préparation des solutions Pour la réalisation de l’électrophorèse il faut tout d’abord préparer plusieurs solutions (11) : 1) Les solutions qui serviront à l’élaboration du gel d’amidon et au tampon des éléctrodes: Solution 1 : tampon gel Solution 2 : tampon électrode Solution 3 : solution tris 1M 2) Les solutions de révélations qui permettront la lecture du gel La solution de lactate est composée de 5 solutions différentes qui sont : Solution 4 :Tris .A Solution 5 : Acides lactique Solution 6:NAD Solution 7 :NBT Solution 8 :PNS 20 Crousty embryon La solution de malate est composée de 7 solutions différentes qui sont : Solution 4 : Tris .A Solution 6 :NAD Solution 7 :NBT Solution 8 : PMS Solution 9 :Acides malique Solution 10 :MgCL2 Solution 11 :MTT Solutions 1 et 2 Matériels: TRIS (0,62 M) (227,147g) (solution n°2) TRIS (1 M) (étalonnage pH-mètre – Solution n°3) ACIDE CITRIQUE (0,14 M) (90,09g) (solution n°2) H2O (4L) Bêcher Pipettes Balance Fiole jaugée Eprouvette graduée Marmite pH-mètre Protocole: Nous avons convertis le volume de la deuxième solution, dont les dosages des produits étaient initialement sur une base de 5L, à un volume de 3L. Nous avons pesé le TRIS et l’ACIDE CITRIQUE, les avons mis dans une fiole jaugée et avons complété jusqu’à obtenir 1L de solution. Cette solution a été versée dans une marmite puis complétée avec 2L d’eau distillée. Nous avons étalonné le pH à 8,5 au lieu de 8 à cause d’une défaillance du pH-mètre à l’aide de la solution n°3. Théoriquement nous aurions dû diluer la solution n°2 à 1/29 (1mL de solution n°2 pour 29mL d'H2O), mais au final il a été décidé de faire 2 solutions différentes : 1 diluée à 1/29 et l’autre non diluée. Concernant la dilution, le dosage a été de 33,33mL de solution n°2 pour 966,57mL d’H 2O. Les deux solutions ont été versées dans deux éprouvettes graduée jusqu’à un volume de 400mL. Solution 3 Matériel : Becher 600ml Balance de précision (0,0001 g) Fiole jaugé 500ml Agitateur magnétique Protocole: La TRIS =121,14 g /mol Le but est d’obtenir 500ml de solution de TRIS a une mol /l Calcul de la masse de poudre de TRIS à diluer .La masse molaire M=121,14 g /mol m=M*0,5 m=121,14/2=60,57 g Puis il y a dilution des 60,57 g de TRIS dans 500 ml d’eau distillée Conception du gel d'amidon Une fois toutes les solutions terminées, nous allons pouvoir concevoir le gel d'amidon. Pour cela, seul les solutions 1, 2 et 3 seront utilisées. Les autres seront placées au frais et serviront à la lecture du gel d'amidon. Le gel est préparé à partir de ces 3 solution mélangé à de l’amidon hydrolysé à 12%. La solution 1 correspond au tampon gel (solution 2 et 3 et eau distillée). La solution 2 correspond au tampon électrode. Elle permet de faire passer un courant électrique à travers le gel d'amidon afin de faire migrer les enzymes. La solution 3 correspond à l'étalonnage du pH, elle permet donc de réguler le pH. La solution 1 a été obtenue par mélange de la solution 2 et de la solution 3. Cette solution est placée dans une burette graduée de 400mL. Dans une fiole à vide ont été versé 48g d'amidon puis on rajoute 400mL de solution tampon. La fiole à vide est placée sur une plaque chauffante. Le but est d'agiter la fiole à vide sans faire bruler le gel d'amidon au fond de la fiole et d'éviter que le gel boue Lorsque nous observons un changement de texture de la solution, le chronomètre est déclenché pour 1minute et 15 secondes. Une foi le temps écoulé, l'agitation de la solution doit cesser. La solution est retirée de la plaque chauffante. Le dégazage est effectué grâce à une trompe à eau qui va permettre d'évacuer l'air se trouvant à l'intérieur de la fiole à vide fermée par un bouchon. La solution est répartie de façon homogène dans un cadre de coulage de 1cm d'épaisseur et 21cm de longueur sur 19cm de large. Il y a alors obtention du gel d'amidon. Il faut ensuite laisser le gel refroidir une nuit entière pour qu'il se solidifie. Or par manque de temps, nous avons décidé de laisser le gel refroidir à l'extérieur seulement quelques heures. Une fois que le gel est coulé et qu’il a refroidie, il faut faire le découpage du gel à l’aide d’un scalpel, tout au tour de la plaque qui contient le gel, pour le décoller du bord. Solution 4 Matériel: Béchers Fiole jaugée de 200ml Agitateur avec une plaque chauffante Une balance de précision Tri (hydroxyméthyl) eminométhane Ethylène glycol-bis (2-aminoéthyl)-N,N,N’,N’-tetraaceticacid Protocole: LACTATE=35ml TRIS-A 0,2 M 2 g EGTA 121 g TRIS Compléter à 5ml avec H20 distillé. Nous avons besoin de 200ml de solution tampon TRIS-A 0,2 M Nous avons peser 0,08 de EGTA que nous avons ensuite placé dans un bécher avec de l’eau distillé puis agiter sur une plaque chauffante afin que la solution se dilue .4 ,84 g de TRI ont été pesé puis eux aussi ont été mis dans un bécher puis dilués à l’aide d’un agitateur et de l’eau distillé. Le tout est placé dans une fiole jaugée de 200 ml .Ensuite, nous avons compléter jusqu’au trait de jauge afin d’obtenir une solution tampon TRIS-A 0,2 M .La solution est prête puis versé dans une bouteille. Calcule : 5l=5000ml, 5000ml /25=200 ml 2g /25=0,08g de EGTA 121 g/25=4,84 g de TRIS Compléter à 200ml d’eau distillé. Solution 5 Matériel: Becher Fiole jaugée de 50mL Balance de précision Protocole: La solution basique est de 9,6g de D-L-Lactate de lithium pour 200mL d'eau. Nous avons besoin seulement de 6mL, alors, nous avons préparé 50mL par sécurité. 9,6/4=2,4g Nous avons donc pesé 2,4g de D-L-Lactate de lithium puis nous lavons dilué dans 50mL d'eau distillée. Solution 6 Matériel: Fiole jaugée de 10mL Petite spatule Feuille d'aluminium Balance de précision au 10ème de mg Protocole: Préparation d’une solution de NAD à 1%. Pour une solution de 10ml, on pèse donc 0,1g de NAD que l’on verse dans la fiole jaugée que l’on complète ensuite jusqu’au trait de jauge avec de l’eau distillé. Solution 7 Matériel: Fiole jaugée de 10mL Petite spatule Feuille d'aluminium Balance de précision au 10ème de mg. Protocole: Préparation d’une solution de NBT à 1%. Pour une solution de 10ml, on pèse donc 0,1g de NBT que l’on verse dans la fiole jaugée que l’on complète ensuite jusqu’au trait de jauge avec de l’eau distillé Il est conseillé de placer la solution au froid. Solution 8 Matériel: Fiole jaugée de 10ml Petite spatule Feuille d'aluminium Balance de précision au 10ème de mg Protocole: Préparation d’une solution de PMS à 1%. Pour une solution de 10ml, on pèse donc 0,1g de PMS que l’on verse dans la fiole jaugée que l’on complète ensuite jusqu’au trait de jauge avec de l’eau distillé. Solution 9 : Préparation d’une solution d’acide malique à 2M et à PH 7 Matériel: Becher Cristallisoir remplie de glace pilée Agitateur magnétique et barreau Fiole jaugée de 50 mL Acide malique (13,41 g) NaOH en paillettes (8 g) Eau distillée (H2O) PH-mètre Protocole: Apres pesée on verse l acide malique dans un bécher que l on place dans un cristallisoir le tout sur un agitateur magnétique. On place le bécher dans la glace car solubiliser du NaOH provoque une réaction exothermique. On ajoute de l eau distillée puis on active l agitateur. Une fois le mélange homogène on ajoute très lentement le NaOH jusqu’ à dissolution totale Une fois terminé et homogénéisé on complète le volume jusqu’ à 50mL avec de l eau puis on étalonne la solution a pH 7 avec de la soude en paillette. Il faut toujours faire attention à ce que la solution ne se trouble pas ni ne s échauffe. Solution 10 Matériel: Fiole jaugé de 50mL Bécher Entonnoir Agitateur pour diluer Protocole: Évaluer la quantité de solution à préparer nécessaire pour réaliser les deux solutions de révélations, ici 50ml. MgCl2 a pour masse molaire 203,31g/mol et pour concentration 0,5mol/L. Nous voulons 50mL (0,05L) donc 0,05 x 101,655=5,08g La quantité à peser est donc de 5,08g On verse le MgCl2 pesé dans un bécher de 40mL, on dilue ensuite avec de l'eau distillée. Une foi diluée, on verse la solution dans une fiole jaugée de 50mL que l’on complète jusqu’au trait de jauge avec de l’eau distillée. Solution 11 MTT, nécessaire à la préparation du malate. Matériel: fiole jaugée de 10ml petite spatule feuille d'aluminium balance de précision au 10ème de mg Protocole: Préparation d’une solution de PMS à 1%. Pour une solution de 10ml, on pèse donc 0,1g de PMS que l’on verse dans la fiole jaugée que l’on complète ensuite jusqu’au trait de jauge avec de l’eau distillé. La solution est ensuite placée sur un agitateur chauffant pour accélérer la dilution. Toutes les solutions étant prêtes ainsi que le gel, le système d’électrophorèse peut être préparé en vu des migrations électro phorétiques. Le système d’électrophorèse Préparation du gel avant migration a Une fois le gel coulé et cerclé sur tous les côtés, on effectue une coupe longitudinale du gel à l’aide d’une plaque de plexiglas et d’un scalpel. Ensuite les bouts de papiers Wattman®, imbibés des « bouillies » des divers échantillons, seront insérés à l’aide d’une pince dans la fente du gel. Les échantillons sont espacés entre 2 et 5mm les uns des autres et décalés d’1 cm des bords du moule afin d’éviter l’ « effet bord » (migration des protéines le long de la paroi qui pourraient fausser la lecture du gel) et 1 goutte de Bleu de Bromophenol est ajouté de part et d’autre des échantillons en temps que témoin afin de voir l’état de migration. Afin que la migration puisse avoir lieu, un courant électrique doit passer dans le gel. Pour cela, la solution tampon d’électrodes est placée dans 2 bacs de 250mL chacun et est relié à un générateur. Des éponges imbibées de cette solution seront insérées dans les fentes du couvercle des bacs et trempent dans la solution tampon. Les éponges jouent le rôle de « tampon conducteur » entre la solution des bacs et le gel, afin que le courant électrique puisse circuler entre les bacs et à travers le gel. Le gel, dans son moule, est placé sur les deux bacs et les éponges viennent se placées sur le gel et une plaque de verre vient recouvrir le gel et les éponges de manières à les plaquer. Dans chaque bac, il y a une électrode (cathode, anode) qui baigne dans la solution tampon et qui est relié à un générateur qui est réglé sur une tension de 60V, une intensité de 250mA, et une puissance électrique de 20W. Le système (bacs et gel) est placé au réfrigérateur afin de ne pas dénaturer les protéines. Puis le générateur est mis en marche. La migration éléctrophorétique commence et durera 15h. Préparation du gel pour l’interprétation Le lendemain, une fois la migration terminée, le système est sorti du réfrigérateur. Le témoin (en bleu) permet de voir si la migration à eu lieu. Le gel est ensuite découpé au niveau du front de migration (défini par le témoin) puis il est sortit de son moule. Une découpe diagonale est effectuée en haut à droite du gel de manière à ne pas perdre le sens de lecture si le gel est inversé. On pose ensuite le gel sur une plaque de plexiglas ayant des rebords d’une hauteur d’1mm. Une autre plaque est disposée sur le gel, puis à l’aide d’un fil à découpé que l’on fait glissé sur la plaque inferieur, on obtient plusieurs tranches (ici 6) de gel d’une épaisseur de 1mm. Il faut ensuite séparer les deux parties découpées sans casser le gel (étant plus ou moins fragile en fonction son temps de cuisson, qualité de l’amidon, reste de bulle d’air…). Les tranches sont disposées une à une dans les bacs de révélations. Puis on verse la solution de révélation choisie (ici malate et lactate). Dans notre cas la solution de malate fut plus efficace. Le bac doit être placé dans l’obscurité en attendant l’apparition des taches de migration. Résultat de la migration Lecture du gel On remarque la présence de bandes au front du gel. Ceci correspond à deux protéines donc traduisant la présence d’un groupe de gènes. La mise en évidence de paterne permet de dire qu’il ya un polymorphisme allélique, un ou plusieurs allèles codant pour un seul caractère. On remarque également la présence d’une bande en bas du gel. Il y a en effet plusieurs taches positionnées sur la même ligne mais pas sut toutes les colonnes. Conclusion Lors de ce TP sur l'électrophorèse, plusieurs difficultés sont venus perturber le bon déroulement de l'expérience: Certaines solutions de révélations ont été refaite à cause d'une mauvaise lecture du protocole de préparation des solutions. En premier lieu, le gel d'amidon numéro 1 se cassait lorsque nous voulions le couper afin de procéder à la révélation. Ceci pourrait être du à la cuisson du gel qui s'effectue de manière approximative à cause de la manière de chauffe ( chauffage électrique et non au gaz). Ensuite, la première révélation du gel numéro 1 a mal fonctionné car nous avions oublié de placer le bac à l'obscurité (quand on sait que les solutions de révélation permettent l'observation de la migration des protéines grâce à l'obscurité). Quand au gel d'amidon numéro 2, la migration des protéines s'est peut effectué. Cela pourrait être du aux solutions qui n'avaient pas été diluées contrairement au gel d'amidon numéro 1. Cette expérience a été appréciable et enrichissante pour tous malgré un certain échec de l'expérience car elle a permis de mettre en application la théorie vue en cours à l'aide de notre professeur de génétique, Yannick Rivet ainsi que Madame Barros Béatrice, la laborantine. Nous pouvons donc dire qu'il n'est pas facile de réaliser un gel d'amidon ainsi que sa révélation, même en présence de 21 effectifs.
