2.3. Compte-rendu

BTS BIOANALYSES ET CONTROLES
TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE
1e année - TP n°17
AFBB
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BREVET DE TECHNICIEN SUPERIEUR
BIOANALYSES ET CONTROLES
Epreuve E5 – Unité U52
Techniques de microbiologie
Au cours de l’épreuve, le jury appréciera les qualités d’organisation, le respect des règles d’hygiène
et de sécurité en laboratoire.
Pour une bonne réalisation de l’épreuve, une gestion optimale du temps imparti est nécessaire en
fonction des temps d’incubation. Le candidat prendra soin de bien lire l’ensemble du sujet avant de
commencer les manipulations.
Documents interdits – Calculatrice autorisée
1er JOUR – DUREE DE L’EPREUVE : 3h00
Les probiotiques sont des micro-organismes vivants (le plus souvent des bactéries) qui, lorsqu'ils sont
ingérés en quantité suffisante, exercent un effet positif sur la santé au-delà des effets nutritionnels
traditionnels : diminution des allergies ; inhibition des bactéries responsables de diarrhées ; digestion du
lactose ; amélioration du transit intestinal…
Les bactéries lactiques sont adaptées à une croissance et à une survie dans du lait ou dans des milieux
dérivés du lait. Elles survivent à l'acidité du produit fini mais doivent pour cela changer leur métabolisme.
Dans le tube digestif, les conditions d'environnement sont très différentes du produit laitier. Dans
l'estomac, l'acidité peut être très élevée mais une part importante des bactéries lactiques est évacuée avec
les premières vidanges gastriques et elles atteignent rapidement l'iléon, en une à deux heures après le
repas.
On abordera ici quelques aspects des probiotiques :
1. caractérisation d’une souche utilisée comme probiotique ;
2. évaluation de la résistance à l’acidité des bactéries lactiques d’un lait fermenté ;
3. mise en évidence du pouvoir inhibiteur d’une souche de probiotique.
4. identification d’un contaminant de la chaîne de production.
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1. Caractérisation d’une souche utilisée comme probiotique
1.1.Matériel et réactifs
-
Souche de Lactobacillus casei DN-114 001 isolée sur milieu MRS en tube noté « L »
-
Tube d’eau physiologique stérile (5 mL)
-
Pipettes Pasteur stériles
-
Lames de verre et lamelles
-
Matériel et colorants pour réalisation et coloration de frottis
-
Réactifs pour tests enzymatiques
-
Milieu MRS stérile à couler en boite de Pétri
1.2.Mode opératoire
A partir de la culture fournie, réaliser examens macroscopiques et microscopiques puis un test
enzymatique.
Vérifier la pureté de la souche en réalisant un isolement sur milieu MRS.
1.3.Compte-rendu
Présenter les descriptions et les résultats obtenus.
2. Evaluation de la résistance à l’acidité des bactéries lactiques d’un lait fermenté
Un probiotique doit arriver vivant et en quantité suffisante dans l’intestin pour que les bénéfices sur la
santé soient perceptibles.
Pour qu’un probiotique soit efficace, il doit :
-
être vivant et en grand nombre dans l’aliment (concentration d’au moins 108 UFC par gramme
d’aliment) et être capable de demeurer viable pendant toute la durée de conservation du produit ;
-
arriver sur son site d’action c’est à dire dans l’intestin, à une concentration d’au moins 107 UFC
par gramme de liquide intestinal. Cette concentration minimale semble nécessaire pour que le
probiotique exerce un effet bénéfique
Un probiotique doit par conséquent être capable de survivre au transit dans le tube digestif (l’estomac est
une barrière très acide que les probiotiques doivent être capables de franchir).
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2.1. Matériel et réactifs
-
1 tube à hémolyse contenant 3 mL de lait fermenté noté « A »
-
1 tube contenant 9 mL de solution d’acide chlorhydrique 0,1 N
-
1 tube contenant 9 mL d’eau distillée stérile
-
pipettes stériles de 1 mL
-
9 tubes d’eau physiologique stérile (9 mL) pour dilutions décimales
-
1 flacon contenant 100 mL de milieu MRS en surfusion
-
6 boites de Pétri stériles
-
P200 et cônes stériles
2.2. Mode opératoire
Dans le tube contenant 9 mL d’eau distillée stérile, introduire 1 mL de lait fermenté (noter ce tube « T »).
Dans le tube contenant 9 mL de solution d’acide chlorhydrique, introduire également 1 mL de lait
fermenté (noter ce tube « E »).
Homogénéiser les deux tubes et laisser en contact pendant une heure à 37°C.
Pendant ce temps, préparer 6 boites de Pétri contenant environ 15 mL de milieu MRS.
Homogénéiser à nouveau à la fin du temps de contact.
Effectuer :
-
6 dilutions successives au dixième du contenu du tube « T » ;
-
3 dilutions successives au dixième du contenu du tube « E ».
Déposer à la surface des milieux MRS les inoculums (v = 0,1mL) de la façon suivante :
Boite
Dilution de « T »
Boite
Dilution de « E »
1
2
3
10-4
10-5
10-6
4
5
6
10-1
10-2
10-3
Répartir les inoculums de façon homogène dans les boites à l’aide de pipettes « râteau » ou de billes
stériles.
Laisser sécher quelques minutes puis incuber 48 heures à 37°C.
2.3. Compte-rendu
Justifier les conditions expérimentales (acide chlorhydrique, temps et température de contact).
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3. Mise en évidence du pouvoir inhibiteur d’une souche de probiotique
La présence de Lactobacillus spp. dans le tube digestif de l’Homme ou des animaux permettrait une
inhibition de la croissance voire une diminution de la population de certains micro-organismes
pathogènes tels que Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus ou Salmonella.
La méthode des « tests à l’encontre » requiert plusieurs étapes :
1. La souche de probiotique testée est déposée dans des puits réalisés dans une gélose MuellerHinton ;
2. Une seconde couche de gélose Mueller-Hinton, préalablement inoculée avec une souche
pathogène est ensuite déposée à la surface de la préparation précédente ;
3. Après incubation, la présence d’une activité inhibitrice se caractérise par l’apparition d’un halo
d’inhibition autour des puits.
3.1. Matériel et réactifs
-
Souche de Lactobacillus casei DN-114 001 cultivée en bouillon MRS noté « L »
-
Culture de Staphylococcus aureus ou de Salmonella en bouillon nutritif
-
Une gélose Mueller-Hinton coulée en boite de Pétri
-
Un tube contenant 8 mL de milieu Mueller-Hinton en surfusion
-
Tubes de milieu MRS en surfusion
-
Bouillon MRS stérile
-
Tubes à hémolyse stériles
-
pipettes stériles de 1 mL
-
P200 et cônes stériles
3.2. Mode opératoire
Dans la gélose Mueller-Hinton, réaliser 3 puits à l’aide d’un tube à hémolyse utilisé comme emporte
pièce (vider les puits à l’aide de deux pipettes Pasteur piquées obliquement dans la gélose).
Dans un tube à hémolyse, introduire 1 mL de milieu MRS en surfusion puis 1 mL de culture de
Lactobacillus casei en bouillon MRS.
Homogénéiser, puis remplir deux puits (environ 0,25 mL par puits) avec cette préparation.
Prévoir un témoin négatif dans le troisième puits.
Laisser diffuser environ 20 minutes à température ambiante.
Incorporer 200 µL de la culture de Staphylococcus aureus ou de Salmonella en bouillon nutritif dans 8
mL de milieu Mueller-Hinton en surfusion. Homogénéiser délicatement puis verser immédiatement à la
surface de la gélose Mueller-Hinton en boite de Pétri préparée précédemment.
Laisser solidifier quelques minutes puis incuber 48 heures à 37°C.
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3.3. Compte-rendu
Donner la composition du témoin négatif.
4. Identification d’un contaminant de la chaîne de production
4.1. Matériel

Contaminant isolé sur gélose columbia au sang de mouton numérotée

Pipettes Pasteur stériles

Lames de verre et lamelles

Matériel et colorants pour réalisation et coloration de frottis

Réactifs pour tests enzymatiques
4.2. Mode opératoire et compte-rendu
A partir de la culture fournie, réaliser les examens macroscopiques et microscopiques (état-frais, frottis
coloré au Gram) et un test enzymatique.
Indiquer les résultats des examens microscopiques et du test enzymatique sur le compte-rendu.
Orienter l’identification du contaminant et proposer sur le compte-rendu une liste de milieux à
ensemencer pour la vérification des caractères de la souche (la galerie choisie devra être en
microméthode).
Ensemencer les milieux fournis et incuber les milieux.
Préciser la température d’incubation souhaitée sur le compte-rendu.