RÉACTIFS D`IDENTIFICATION DES COLONIES BACTÉRIENNES

RÉACTIFS D'IDENTIFICATION DES COLONIES BACTÉRIENNES
Trois grandes réactions biochimiques sont utilisées pour identifier les colonies bactériennes obtenues par
culture :
 L'oxydase
 La catalase
 La nitrate réductase
OXYDASE
Matériel :
Réactif, papier buvard blanc, pipette Pasteur, tube à hémolyse 5 ml + bouchon opaque
Préparation du réactif : Attention, le réactif est carcinogène : manipuler derrière un écran et porter gants et
masque.
 Dans un petit tube à hémolyse de 5 ml, dissoudre une point de couteau de N, N, N' , N' tétraméthyl
1-4 phénylène diamine dans 5 ml d'eau distillée.
 Boucher puis agiter.
 Recouvrir le tube de papier aluminium, il est très sensible à la lumière.
 Le réactif conservé au réfrigérateur à l'abri de la lumière, il est stable 6 heures.
Il est conseillé de pratiquer en parallèle un témoin positif (Neisseria) et un témoin négatif (entérobactérie)
Test : il est déconseillé de pratiquer le test directement sur la gélose.
 Déposer quelques gouttes du réactif sur un papier buvard blanc.
 Prélever 2 ou 3 colonies avec une pipette Pasteur flambée et les mélanger à la goutte.
Conclusion :
 Une coloration nettement bleue signe une oxydase positive.
 Pas de coloration ou décoloration signe une oxydase négative.
CATALASE
Matériel :
Eau oxygénée 10 volumes, Tween 80 (ou à défaut liquide vaisselle), récipient de 125 ml, lames
Préparation du réactif :
 Mélanger dans un récipient de 125 ml : 100 ml d'eau oxygénée à 10 volumes et 5 ml de Tween 80
(ou liquide vaisselle).
 Le réactif conservé au réfrigérateur est stable un an.
 Il est conseillé de pratiquer en parallèle un témoin positif (Staphylocoque) et un témoin négatif
(Streptocoque, entérobactérie)
Test :
 Déposer une goutte de réactif sur une lame propre.
 Délayer une colonie dans la goutte à l'aide d'une pipette Pasteur.
Conclusion :
 Présence de bulles : catalase positive
 Absence de bulles : catalase négative
NITRATE REDUCTASE
Introduction :
Différents états de l'azote organique :
NO3
-->
NO2
-->
N
Nitrate
-->
Nitrite
-->
Azote
Nous disposons d'un milieu comportant des nitrates (eau nitratée), d'un test de mise en évidence des nitrites
et d'un réactif catalysant la transformation nitrates --> nitrites.
Matériel :
Tubes 15 ml, KNO3, acide sulfanilique, acide acétique, a -naphtylamine, poudre de zinc, eau peptonée.
Préparation des réactifs :
Peptone nitratée : Ajouter 0.1 gramme de KNO3 à 100 ml de milieu nutritif peptoné, stériliser en tubes.
Mise en évidence des nitrites :
 Réactif A : mélanger 0.8 gramme d'acide sulfanilique dans 100 ml d'acide acétique 5N
 Réactif B : mélanger 0.5 gramme d'a -naphtylamine dans 100 ml d'acide acétique 5N
 Mélanger juste avant le test 1 ml des solutions A et B : on obtient le réactif de Griess.
Catalyse de la réaction nitrates--> nitrites :
Poudre de zinc : attention il s'agit d'un réducteur fort.
Test :
 Incuber à 37 ° pendant 24 heures une colonie bactérienne dans 5 ml d'eau peptonée nitratée
 Verser quelques gouttes du mélange A+B dans le tube.
 Si il n'y a pas apparition d'une couleur rouge, ajouter au tube une pincée de poudre de zinc
Conclusion : différents cas sont possibles
1
2
3
Dans le cas 3, les nitrates ont été réduits en nitrites, eux-mêmes réduits en azote : on ne peut donc pas
mettre en évidence les nitrites, bien que le test soit positif.