Commenta-t-on découvert toutes les polymérases
chez les eucaryotes ?
Cours du 23 Septembre 2008 : PN2
Commenta-t-on découvert toutes les polymérases chez les eucaryotes ?
-par purification de protéines.
-mutations (délicat)
Chez S.cerevisae, on a pu identifier 4 sous unités de la polymérase ξ et leurs gènes. Il y a une sous
unité catalytique et d’autres sous unités en relation avec cette sous unité catalytique mais aussi avec
l’extérieur.
Pour la Pol δ, on a aussi 3 sous unités. Mais on ne sait pas trop qui fait quoi…
Pol δ code pour un gène ayant un certain nombre de régions conservées, des ragions caractéristiques
de l’activité polymérase de 5’ vers 3’. LA délétion d’une sous unité est létale.
Les polymérases se regroupent en grandes familles :
- Famille A : polymérases ressemblant à Pol I
- Famille B : polymérases ressemblant à Pol II
- Famille C : polymérases ressemblant à Pol III
- Famille D : polymérases ressemblant à Pol IV
- Famille Y : polymérases ressemblant à Pol V
2 hypothèses :
- Soit la polymérase est antérieure aux règnes des archaebactéries, bactéries et
eucaryotes.
- Soit il y a eu des transferts d’information.
On remarque en comparant les gènes que les différentes pol-δ, pol-ξ et pol-α ont des séquences
communes, et d’autres qui se sont spécialisées. Pol- ξ a la particularité de tolérer une délétion
partielle de la zone de polymérisation et exonucléase. La région C-ter semble être essentielle pour ne
pas être létal (cependant, avec cette délétion, la cellule n’est pas en forme).
Comment étudier séparément pol-δ et pol-ξ ?
On va modifier les protéines qui doivent tout de même conserver le meilleur de leurs
capacités de polymérisation. On leur attache une signature. Il faudrait que cette caractéristique
singulière soit une erreur spéciale faite par la polymérase pour que l’on puisse la distinguer de la
forme sauvage.
Ensuite, on fera des expériences In-vivo avec pol-δ* - pol-ξ mais aussi avec pol-δ, pol-ξ*. On fera des
alignements de séquences chez les différentes espèces afin de voir les motifs conservés et afin de
faire de la mutagénèse dirigée. En faisant des analogies de séquences d’acides aminés, mais aussi de
structures 3D des protéines, on choisi un site à muter chez la levure (marquée par une * sur le
polycopier).
Imaginons que la signature soit une transversion de bases :
On a donc deux moyens d’obtenir la même chose suivant que l’on touche le brin continu ou
discontinu.
On utilise LacZ avec un bactériophage.
Si la polymérase est mutée, alors LacZ ne sera pas correctement répliqué donc ne sera pas
fonctionnel : après analyse sur milieu contenant du XGal, les bactéries transfectées par le
bactériophage seront blanches. Mais attention, il faut non seulement que la mutation existe mais
aussi qu’elle ait un phénotype (du fait de la redondance du code, une transversion n’aboutira pas
forcement à une protéine mutante avec un phénotype différent du sauvage !)
Analyse des points chauds sur le gène capable de conférer un phénotype.
Effet mutateur du mutant pol-ξ M644G.
Cette mutation augmente le mésappariement des bases. Entre le WT et le mutant, on a un
grand effet significatif pour les changements T-T (incapacité à tecter ces mésappariements, dans la
forme WT et mutante). Cette mutation ne discrimine pas les mésappariements T-T mais se débrouille
très bien avec touts les autres.
Est-ce que la polymérase a un effet différent sur le brin précoce et muté ?
On va intégrer cette protéine dans le vivant (levure).
On ne peut donc plus utiliser la β-galactosidase. On utilise alors le gène URA3 comme marqueur. On
intègre URA3 dans le chromosome de la levure avec une Origine de réplication. En jouant sur le sens
du gène, sur la place de l’origine de réplication, on peut déterminer qui est le brin précoce et le brin
tardif.
Dans le cadre #1, on remarque une position mutatrice avec une grosse augmentation du nombre de
T. Puisque la mutation en cause est une mutation caractéristique de la pol-ξ et qui donne des
mésappariements T-T, les résultats ne peuvent s’expliquer que par la pol-ξ qui es responsable du brin
continu.
On fait la même expérience pour la pol-δ : synthèse du brin discontinu. Cependant, la pol-δ est
également capable de faire la synthèse du brin continu quand la pol-ξ est défectueuse.
Translesion synthesis. (TLS)
Il arrive que la polymérase soit face a quelque chose qu’elle ne connait pas (X : site abasique,
dimère de thymines etc.). Avec une polymérase translésionelles, elle va associer n’importe qu’elle
base en face ce site X. En général, ces polymérases translésionnelles sont mutatrices.
On utilise un plasmide ayant un aminofluorène emchant la polymérase de répliquer correctement.
(=anomalie volontairement placée) sur un brin, et l’autre brin rallongé de 3 nucléotides (permettant
de le reconnaitre après un Southern-Blot).
Pour valider ce modèle, on fait d’abord avec les souches non mutées (sur le Southern-Blot, on voit
bien que les deux brins sont synthétisés de manière coordonnée). Sur la souche mutante, on voit que
les deux brins présentent des anomalies : les fourches de réplications se bloquent au niveau de la
lésion rouge. Face à une lésion de ce genre, Pol III est incapable de passer au travers. On va
commencer à introduire des mutants Pol II et Pol V. on peut déduire que lorsque Pol III arrive sur une
lésion, elle s’arrête puis Pol II et Pol V vont avoir leur activité de polymérases translésionelles.
Quand la lésion est sur la matrice servant de brin continu, on va avoir une extrusion d’une
longue boucle d’ADN simple brin car l’hélicase elle, continue à avancer. (Le simple brin sera recouvert
de la protéine RecA = système SOS).
Si c’est sur la matrice servant au brin discontinu, le système ne sera pas bloqué mais laissera derrière
lui des brins d’Okazaki non terminés.
Le système SOS :
=système mis en place en cas de stress. Le système fige la division cellulaire tant que le
problème n’est pas résolu. L’acteur principal est RecA. Soumise a des UV, il va y avoir une
transcription / traduction de certains gènes chez la bactérie qui sont en temps normal éteints par un
répresseur : LexA.
En cas de stress, RecA* va aller voir LexA qui s’auto-clive (LexA est une endopeptidase). Cela va
entrainer la transcription de gène : immédiatement pour certains, mais plus tardivement pour
d’autres : il y a des régulations subtiles dans le temps.
Le système SOS sera de nouveau réprimé au bout de 30-40min par retranscription des gènes de
LexA.
Les gènes codés par le système SOS sont des gènes d’arrêt du cycle cellulaire.
Les polymérases translésionelles n’ont pas les capacités de relecture : mutations.
Le gène UmuDC (codant pour pol V) va être transcrit / traduit et sa protéine sera clivée :
l’hétérotrimère umuD/umuD’/umuC va être créé. Ce complexe a des propriétés de polymérisation.
Cet hétérotrimère prends le nom de Pol V.
Sur le graphe, les points blancs représentent les mutants de Pol II. En cas normal, les mutants de Pol
II sont comme les sauvages, et les mutants de Pol V sont beaucoup plus sensibles aux UV. Le double
mutant présente un effet encore plus grave : cela laisse penser que Pol II a quand même quelque
chose à voir avec la réparation.
On regarde ensuite les synthèses d’ADN suite à une irradiation UV.
A t0, on irradie : on met la synthèse d’ADN à l’arrêt (normal car on induit plein de lésions) mais chez
le WT ca redémarre au bout de quelques minutes. Chez le mutant ΔumuDC, ca s’arrête et ca
redémarre plus lentement.
En comparant le WT avec le mutant de la Pol B, on note que Pol B s’effondre et seulement longtemps
après la synthèse d’ADN repart.
Dans les conditions ou la polymérase a été inactivée par la température postérieurement à une
irradiation UV, alors que le Pol III est inactive, il y a une légère synthèse d’ADN faite donc par Pol II
(Pol II est transitoirement capable de faire la synthèse de quelques nucléotides puis s’arrête).
1 / 4 100%
La catégorie de ce document est-elle correcte?
Merci pour votre participation!

Faire une suggestion

Avez-vous trouvé des erreurs dans linterface ou les textes ? Ou savez-vous comment améliorer linterface utilisateur de StudyLib ? Nhésitez pas à envoyer vos suggestions. Cest très important pour nous !