I/ Modification et culture des bactéries compétentes

I/ Modification et culture des bactéries compétentes
1) Principe
Les bactéries modifiées sont des bactéries rendues perméables à l'ADN,
elles peuvent donc sans problème intégrer un plasmide. Le plasmide
fournissant à la bactérie une résistance à l'ampicilline, on utilisera une gélose
à ampicilline pour ne faire cultiver que les bactéries ayant intégré le plasmide.
Le plasmide est intégré à la bactérie par choc thermique.
Les bactéries utilisées sont des bactéries commandées chez
INVITROGEN: One Shot TOP10 Competent Cells, ce sont des E.Coli. On
utilisera deux plasmides différents, donc ce protocole est exécuté avec chacun
des plasmides. Cette manipulation se fait de manière stérile.
2) Mode Opératoire
Transformation
-On introduit 0,5 µL de plasmide dans un aliquot de 50µL de bactéries
compétentes décongelées dans la glace. On mélange en tapotant le tube,
mais pas par aspiration-refoulement.
-Chaque tube est placé dans la glace pendant 30min
-On effectue ensuite un choc thermique en plaçant les tubes 30s à 42°C
-Puis les tubes sont refroidis dans la glace
-On rajoute ensuite 250µL de milieu SOC dont la composition est donnée
en annexe
-On incube 1h à 37°C en agitant à 225rpm
Ensemencement
-On étale 10µL et 20µL de chaque préparation sur une boîte LBA, dont la
composition est donnée en annexe, à l’aide d’un râteau stérile.
-On incube toute la nuit à 37°C
3) Résultats
Les résultats sont convaincants, on obtient à peu près une vingtaine de
colonies par boîtes, toutes identiques. L’intégration du plasmide à donc bien
fonctionné, on a obtenue les bactéries désirées. Les boîtes sont ensuite
stockées en chambre froide pour stopper leur développement et pouvoir les
utiliser plus tard.

II/ Production, extraction et analyse des protéines : premier
essai
1) Principe
Les bactérie ayant intégrée le plasmide ont cultivé sur le milieu. Il va
maintenant falloir faire cultiver ces bactéries et leur faire produire la protéine
désirée en quantité suffisante. On utilise de L'IPTG pour induire la production
de la protéine.
La cinétique se fait sur deux jours, d'abord on laisse cultiver les bactéries
toute la nuit, puis le lendemain on fait le suivit de la DO à 600nm et à partir de
0,4, on introduit l’IPTG dans le milieu et on prélève une quantité de bactérie
toute les heures.
Le protocole d’extraction utilisé ici est le protocole pour les petits volumes.
Les échantillons prélevés sont centrifugés et remis en suspension plusieurs
fois. On prélève les fractions, surnageant ou culot selon le protocole, que l’on
stocke à –80°C.
Les fractions prélevées sont ensuite analysées par électrophorèse sur gel
d’acrylamide : SDS-Page, on pourra ainsi constater quels sont les protéines
présentes et dans quels fractions.
2) Mode opératoire
Production et prélèvements
-Ajout d'une colonie dans 50mL de milieu LB
-Incubation toute la nuit à 37 °C et 225rpm
-Dilution des bactéries au 1/20 et mesure de la DO
DO mesurée : Tube du plasmide PPI1 : 0,176
Tube du plasmide PPI2 : 0,110
-Ajustement de la DO à 0,1
-Suivit régulier de la DO jusqu'à 0,4
-A partir de 0,4, ajout de 1mL d'IPTG a 50mM pour une concentration finale
de 1mM
Ajout à : Tube PPI1 : 13H15
Tube PPI2 : 12H45
-Prélèvement de 1 mL toutes les heures, puis un autre le lendemain
-Les prélèvements sont centrifugés 10min à 5000rpm, on enlève ensuite le
surnageant
-Congélation à -80°C ou si on a le temps, on poursuit le protocole

Extraction
-Remise en suspension du culot dans 300µL de B-PER, agiter au vortex
pendant 1min
-Centrifugation à 13000rpm pendant 5min
-Le surnageant est récupéré et congelé à -80°C, le culot est remis en
suspension
dans 300 µL de B-PER
-Ajout de 6 µL de lysozyme à 10 mg/mL, vortexer 1min, puis ajout de 1mL
de
B-PER au 1/10 et vortexer à nouveau 1min
-Centrifugation à 13000rpm pendant 10min, récupérer le culot et le mette
en suspension avec 1mL de B-PER au 1/10. Répéter cette étape 3 fois de
suite.
-Remettre le culot en suspension dans 300 µL d'eau stérile
Schéma d’extraction :
Analyse
-On mélange 50 µL de chaque fraction avec 10 µL de solution NuPage LDS
sample, ce composé va se fixer sur la protéine et lui permettre de migrer
dans le gel grâce au tampon.
-On chauffe à 70°C pendant 10min, puis on centrifuge quelques secondes
à 15000rpm
-On prépare la cuve et le ou les gels : Le gel se présente sous forme d’une
plaque, le gel étant à l’intérieur, on enlève le peigne en haut de la plaque
pour introduire les échantillons et la languette en bas de la plaque pour
permettre la circulation du tampon et donc la migration. La cuve est remplie
avec du tampon NuPage MOPS SDS Running Buffer 1X.
-On introduit 30 µL de chaque échantillons préparé précédemment dans les
puits, avec un marqueur témoin dont la compostions en protéines est
connues.
-On fait migrer 45min à 200V
-On casse la plaque et on sort le gel
-On colore avec une solution au Bleu de Coomassie dont la composition
est donnée en annexe pendant 30min
-On décolore avec un composé dont la composition est donnée en annexe
pendant 4h, en changeant la solution de temps en temps
-Le gel est ensuite séché pendant 2h
3) Résultats
Cette première expérience n’est pas des plus concluante, il y a trop peu de
protéines dans chaque échantillon pour tenter une purification, il faut donc
recommencer la manipulation mais en prélevant un volume plus conséquent

de bactéries. Par contre cette étape a permis de constater que la quantité
maximale de protéines prélevées s’est faite au prélèvement 4h après
l’induction pas l’IPTG, on n’effectuera donc que ce prélèvement dans la suite
de la recherche.
III/ Production, extraction et analyse : deuxième essai
1) Principe
On recommence le même protocole que ci-dessus, pas contre on prélève
cette fois-ci 40mL au temps t= 4h au lieu de 1mL. Le protocole effectué
ensuite sera le protocole pour les volumes moyens qui s’enchaîne sur une
préparation du culot final récupéré pour effectuer une dialyse.
2) Mode opératoire
Production et prélèvements
Identique à ci-dessus mis à part :
-Ajout de l’IPTG à une DO de 0,5
-Prélèvement de 40mL uniquement au temps t= 4h
Extraction
-Remise en suspension du culot dans 5mL de B-PER, agiter pendant
10min
-Centrifugation à 15000rpm pendant 15min
-Le surnageant est récupéré et congelé à -80°C, le culot est remis en
suspension dans 5mL de B-PER
-Ajout de 100 µL de lysozyme à 10 mg/mL, agiter, incuber 5min à
température
ambiante, puis ajout de 15mL de B-PER au 1/10 et vortexer.
-Centrifugation à 15000rpm pendant 15min, récupérer le culot et le mette
en suspension avec 20mL de B-PER au 1/10. Répéter cette étape 3 fois de
suite
-Le culot récupéré est gardé pour la dialyse
Solubilisation des protéines du culot
-Le culot est pesé contre un tube identique à celui qui le contient
-On utilise 8mL de Inclusion Body Solubilisation Reagent par g récolté
Calcul : v = m * 
Mesure : Culot PPI1 : 0,6g => 0,6 * 8 = 4,8mL
Culot PPI2 : 0,6g => 0,6 * 8 = 4,8mL

-On agite la suspension pendant 30 min
-On enlève les débris cellulaires par centrifugation à 15000rpm pendant
15min
-Le surnageant est prélevé est utilisé pour effectuer une dialyse.
Dialyse
-Le surnageant est placé dans une membrane
-La dialyse s’effectue en tampon Tris-HCl à 25mM et pH 7,5
-Les bains sont changés toutes les heures
-On récupère le surnageant
Analyse
Identique à celle ci-dessus
3) Résultats
On observe la présence d’un culot après la dialyse, et l’électrophorèse ne
révèle pas la présence de la protéine recherchée, la protéine s’est agrégé
lors de la dialyse, il faut donc recommencer cette étape, mais cette fois-ci
en utilisant un tampon Urée-Tris-HCl à diverses concentrations en Urée .
IV/ Troisième essai
1) Principe
Le principe reste identique à l’étape ci-dessus, mis à part pour la dialyse où
le tampon change de composition, on effectuera différents bain allant d’une
concentration de 8M à 0 ,025M en Urée diluée dans du Tris-HCl. Le but de
cette étape étant d’empêcher les protéines recherchées de s’agréger.
2) Mode opératoire
Dialyse
La dialyse s’effectue cette fois-ci avec des tampons Urée-Tris-HCl de
concentration en Urée : 8 ; 6 ; 5 ; 4 ; 3 ; 1 ; 0,5 et 0,025M
Les tampons sont changés toute les heures si possible, sinon on laisse
dialyser toute la nuit et continue le lendemain. L’échantillon et ensuite
récupéré pour effectuer une électrophorèse.
3) Résultats