I/ Modification et culture des bactéries compétentes 1) Principe Les bactéries modifiées sont des bactéries rendues perméables à l'ADN, elles peuvent donc sans problème intégrer un plasmide. Le plasmide fournissant à la bactérie une résistance à l'ampicilline, on utilisera une gélose à ampicilline pour ne faire cultiver que les bactéries ayant intégré le plasmide. Le plasmide est intégré à la bactérie par choc thermique. Les bactéries utilisées sont des bactéries commandées chez INVITROGEN: One Shot TOP10 Competent Cells, ce sont des E.Coli. On utilisera deux plasmides différents, donc ce protocole est exécuté avec chacun des plasmides. Cette manipulation se fait de manière stérile. 2) Mode Opératoire Transformation -On introduit 0,5 µL de plasmide dans un aliquot de 50µL de bactéries compétentes décongelées dans la glace. On mélange en tapotant le tube, mais pas par aspiration-refoulement. -Chaque tube est placé dans la glace pendant 30min -On effectue ensuite un choc thermique en plaçant les tubes 30s à 42°C -Puis les tubes sont refroidis dans la glace -On rajoute ensuite 250µL de milieu SOC dont la composition est donnée en annexe -On incube 1h à 37°C en agitant à 225rpm Ensemencement -On étale 10µL et 20µL de chaque préparation sur une boîte LBA, dont la composition est donnée en annexe, à l’aide d’un râteau stérile. -On incube toute la nuit à 37°C 3) Résultats Les résultats sont convaincants, on obtient à peu près une vingtaine de colonies par boîtes, toutes identiques. L’intégration du plasmide à donc bien fonctionné, on a obtenue les bactéries désirées. Les boîtes sont ensuite stockées en chambre froide pour stopper leur développement et pouvoir les utiliser plus tard. II/ Production, extraction et analyse des protéines : premier essai 1) Principe Les bactérie ayant intégrée le plasmide ont cultivé sur le milieu. Il va maintenant falloir faire cultiver ces bactéries et leur faire produire la protéine désirée en quantité suffisante. On utilise de L'IPTG pour induire la production de la protéine. La cinétique se fait sur deux jours, d'abord on laisse cultiver les bactéries toute la nuit, puis le lendemain on fait le suivit de la DO à 600nm et à partir de 0,4, on introduit l’IPTG dans le milieu et on prélève une quantité de bactérie toute les heures. Le protocole d’extraction utilisé ici est le protocole pour les petits volumes. Les échantillons prélevés sont centrifugés et remis en suspension plusieurs fois. On prélève les fractions, surnageant ou culot selon le protocole, que l’on stocke à –80°C. Les fractions prélevées sont ensuite analysées par électrophorèse sur gel d’acrylamide : SDS-Page, on pourra ainsi constater quels sont les protéines présentes et dans quels fractions. 2) Mode opératoire Production et prélèvements -Ajout d'une colonie dans 50mL de milieu LB -Incubation toute la nuit à 37 °C et 225rpm -Dilution des bactéries au 1/20 et mesure de la DO DO mesurée : Tube du plasmide PPI1 : 0,176 Tube du plasmide PPI2 : 0,110 -Ajustement de la DO à 0,1 -Suivit régulier de la DO jusqu'à 0,4 -A partir de 0,4, ajout de 1mL d'IPTG a 50mM pour une concentration finale de 1mM Ajout à : Tube PPI1 : 13H15 Tube PPI2 : 12H45 -Prélèvement de 1 mL toutes les heures, puis un autre le lendemain -Les prélèvements sont centrifugés 10min à 5000rpm, on enlève ensuite le surnageant -Congélation à -80°C ou si on a le temps, on poursuit le protocole Extraction -Remise en suspension du culot dans 300µL de B-PER, agiter au vortex pendant 1min -Centrifugation à 13000rpm pendant 5min -Le surnageant est récupéré et congelé à -80°C, le culot est remis en suspension dans 300 µL de B-PER -Ajout de 6 µL de lysozyme à 10 mg/mL, vortexer 1min, puis ajout de 1mL de B-PER au 1/10 et vortexer à nouveau 1min -Centrifugation à 13000rpm pendant 10min, récupérer le culot et le mette en suspension avec 1mL de B-PER au 1/10. Répéter cette étape 3 fois de suite. -Remettre le culot en suspension dans 300 µL d'eau stérile Schéma d’extraction : Analyse -On mélange 50 µL de chaque fraction avec 10 µL de solution NuPage LDS sample, ce composé va se fixer sur la protéine et lui permettre de migrer dans le gel grâce au tampon. -On chauffe à 70°C pendant 10min, puis on centrifuge quelques secondes à 15000rpm -On prépare la cuve et le ou les gels : Le gel se présente sous forme d’une plaque, le gel étant à l’intérieur, on enlève le peigne en haut de la plaque pour introduire les échantillons et la languette en bas de la plaque pour permettre la circulation du tampon et donc la migration. La cuve est remplie avec du tampon NuPage MOPS SDS Running Buffer 1X. -On introduit 30 µL de chaque échantillons préparé précédemment dans les puits, avec un marqueur témoin dont la compostions en protéines est connues. -On fait migrer 45min à 200V -On casse la plaque et on sort le gel -On colore avec une solution au Bleu de Coomassie dont la composition est donnée en annexe pendant 30min -On décolore avec un composé dont la composition est donnée en annexe pendant 4h, en changeant la solution de temps en temps -Le gel est ensuite séché pendant 2h 3) Résultats Cette première expérience n’est pas des plus concluante, il y a trop peu de protéines dans chaque échantillon pour tenter une purification, il faut donc recommencer la manipulation mais en prélevant un volume plus conséquent de bactéries. Par contre cette étape a permis de constater que la quantité maximale de protéines prélevées s’est faite au prélèvement 4h après l’induction pas l’IPTG, on n’effectuera donc que ce prélèvement dans la suite de la recherche. III/ Production, extraction et analyse : deuxième essai 1) Principe On recommence le même protocole que ci-dessus, pas contre on prélève cette fois-ci 40mL au temps t= 4h au lieu de 1mL. Le protocole effectué ensuite sera le protocole pour les volumes moyens qui s’enchaîne sur une préparation du culot final récupéré pour effectuer une dialyse. 2) Mode opératoire Production et prélèvements Identique à ci-dessus mis à part : -Ajout de l’IPTG à une DO de 0,5 -Prélèvement de 40mL uniquement au temps t= 4h Extraction -Remise en suspension du culot dans 5mL de B-PER, agiter pendant 10min -Centrifugation à 15000rpm pendant 15min -Le surnageant est récupéré et congelé à -80°C, le culot est remis en suspension dans 5mL de B-PER -Ajout de 100 µL de lysozyme à 10 mg/mL, agiter, incuber 5min à température ambiante, puis ajout de 15mL de B-PER au 1/10 et vortexer. -Centrifugation à 15000rpm pendant 15min, récupérer le culot et le mette en suspension avec 20mL de B-PER au 1/10. Répéter cette étape 3 fois de suite -Le culot récupéré est gardé pour la dialyse Solubilisation des protéines du culot -Le culot est pesé contre un tube identique à celui qui le contient -On utilise 8mL de Inclusion Body Solubilisation Reagent par g récolté Calcul : Mesure : v=m* Culot PPI1 : 0,6g => 0,6 * 8 = 4,8mL Culot PPI2 : 0,6g => 0,6 * 8 = 4,8mL -On agite la suspension pendant 30 min -On enlève les débris cellulaires par centrifugation à 15000rpm pendant 15min -Le surnageant est prélevé est utilisé pour effectuer une dialyse. Dialyse -Le surnageant est placé dans une membrane -La dialyse s’effectue en tampon Tris-HCl à 25mM et pH 7,5 -Les bains sont changés toutes les heures -On récupère le surnageant Analyse Identique à celle ci-dessus 3) Résultats On observe la présence d’un culot après la dialyse, et l’électrophorèse ne révèle pas la présence de la protéine recherchée, la protéine s’est agrégé lors de la dialyse, il faut donc recommencer cette étape, mais cette fois-ci en utilisant un tampon Urée-Tris-HCl à diverses concentrations en Urée . IV/ Troisième essai 1) Principe Le principe reste identique à l’étape ci-dessus, mis à part pour la dialyse où le tampon change de composition, on effectuera différents bain allant d’une concentration de 8M à 0 ,025M en Urée diluée dans du Tris-HCl. Le but de cette étape étant d’empêcher les protéines recherchées de s’agréger. 2) Mode opératoire Dialyse La dialyse s’effectue cette fois-ci avec des tampons Urée-Tris-HCl de concentration en Urée : 8 ; 6 ; 5 ; 4 ; 3 ; 1 ; 0,5 et 0,025M Les tampons sont changés toute les heures si possible, sinon on laisse dialyser toute la nuit et continue le lendemain. L’échantillon et ensuite récupéré pour effectuer une électrophorèse. 3) Résultats On obtient une bande sur le gel à l’endroit ou nos protéines doivent apparaître. Le résultat est concluant, on peut donc effectuer une purification et ensuite passer à un plus gros volume d’extraction. V/ Purification 1) Principe La purification se fait sur colonne de Nickel. On utilise une résine Ni-NTA, cette résine est utilisée pour purifier des protéines recombinées possédant un tag 6xHis exprimées dans des bactéries, des cellules de mammifères ou d’insectes. Ce système peut être utilisé avec des protéines fonctionnelles, dénaturées ou hybridées. Les protéines purifiées sont directement utilisables pour de futures applications. La résine Ni-NTA est composé d’acide nitroloacétique sur une matrice d’agarose, celui-ci est lié au Ni2+ par quatre sites de coordination. 2) Mode opératoire Préparation de la colonne -La résine Ni-NTA est remise en suspension dans la bouteille en la retournant et en la secouant faiblement -On pipette 1,5mL de résine que l’on met dans une colonne de purification de 10mL. On laisse la résine sédimenter dans la colonne ou alors on centrifuge à faible vitesse. -On ajoute 6mL d’eau distillée stérile et on remet la résine en suspension -On laisse la résine sédimenté comme ci-dessus, puis on enlève le surnageant -On ajoute 6 mL de tampon dénaturant : Denaturing Binding Buffer. On remet la résine en suspension et on laisse sédimenter, on enlève le surnageant. Cette opération est à effectuer deux fois. -La colonne ainsi préparée est préservée avec 0,02% d’azide ou 20% d’éthanol, puis bouchée avec un capuchon ou du parafilm. Le stockage se fait à température ambiante. Procédure de purification -Ajout de 8 mL de la solution protéique à purifier dans la colonne préparée à l’avance -On agite lentement pendant 15-30min pour laisser la résine en suspension et permettre la fixation des protéines -On laisse sédimenter et on prélève le surnageant qui est stocké à 4°C -On lave le colonne avec 4mL de tampon de ligation : Denaturing Binding Buffer. On sédimente la résine et on prélève le surnageant que l’on stocke à 4°C. Cette opération est effectuée 2 fois. -On lave le colonne avec 4mL de tampon de lavage : Denaturing Wash Buffer (pH 6,0). On sédimente la résine et on prélève le surnageant que l’on stocke à 4°C. Cette opération est effectuée 2 fois. -On poursuit l’opération de lavage avec 4mL de tampon de lavage : Denaturing Wash Buffer (pH 5,3). On sédimente la résine et on prélève le surnageant que l’on stocke à 4°C. Cette opération est effectuée 2 fois. -La colonne est placée verticalement, on enlève le capuchon en bas de la colonne. La protéine fixée à la colonne est éluée avec un 5mL de tampon d’élution : Denaturing Elution Buffer. On collecte des fractions de 1mL -On mesure la DO280 des fractions obtenues****** 3) Résultats