Un nouveau type de sonde pour la détection du radical superoxyde
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Vincent Nivière, iRTSV-CBM, équipe Biocatalyse
Proposition d’un sujet de thèse 2015
Titre:
Un nouvel outil pour étudier la biologie des espèces réactives de l’oxygène: sonde génétique
pour détecter le radical superoxyde in vivo
Title:
A new tool for studying the biology of ROS: genetic probe to detect superoxide radical in vivo
Résumé:
Le stress oxydant et la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), tel le radical
superoxyde, représentent un problème majeur pour les cellules. On sait actuellement que chez
l’homme ce type de stress peut être à l’origine de pathologies graves, tels certains cancers.
Malheureusement, l’étude de la production des ROS in vivo est particulièrement difficile et
les méthodes de dosage actuelles basées sur l’utilisation de sondes chimiques manquent
dramatiquement de spécificité. Dans ce projet, nous avons pour objectif de développer un tout
nouveau type de sonde enzymatique, codée génétiquement, pour détecter spécifiquement le
radical superoxyde directement dans les cellules par imagerie de fluorescence. Cette sonde
sera constituée d'une protéine de fusion entre la superoxyde réductase (SOR), une enzyme
hautement spécifique pour le superoxyde et une protéine fluorescente verte (GFP). Le projet
de thèse aura pour but de construire et de mettre au point cette sonde enzymatique par des
techniques de biologie moléculaire et cellulaire, de biochimie ainsi que d’imagerie de
fluorescence sur des cellules en culture. Le développement d’une sonde spécifique du radical
superoxyde représente un élément essentiel pour mieux comprendre les mécanismes
cellulaires à l’origine du développement de certaines pathologies associées au processus de
stress oxydant.
Summary:
Oxidative stress and production of reactive oxygen species (ROS), such as the superoxide
radical, are a major problem for cells. In humans, this type of stress is strongly suspected to
cause serious diseases like some cancers. However, the study of ROS production in vivo is
very difficult and the current assay methods based on chemical probes lack dramatically of
specificity. We aim to develop a new type of enzymatic probe enzyme, genetically encoded,
to detect very specifically the superoxide radical directly into the cells by fluorescence
imaging. This probe will consist of a fusion protein between the superoxide reductase, an
enzyme highly specific for superoxide, and a green fluorescent protein. The PhD project will
aim to develop this enzymatic probe, using molecular and cell biology, biochemistry, and
fluorescence imaging in cell culture. The development of a highly specific probe for the
superoxide radical is a very important issue in cell biology, which will allow for instance to
better understand the cellular mechanisms behind the development of certain diseases.
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Descriptif du projet:
Le stress oxydant représente un problème majeur pour les organismes vivants. Il est à
présent bien établit qu’il peut être impliqué dans le développement d’un certain nombre de
pathologies graves pour l’homme, tels certains cancers, maladies cardio-vasculaires,
Alzheimer, ainsi que dans le vieillissement. Le stress oxydant a pour origine la production
d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), hautement toxiques, parmi lesquelles le radical
superoxyde O2●- occupe une position centrale. En effet, O2●- est le premier ROS qui se forme
in vivo et constitue l’élément déclencheur du processus de stress oxydant.1
D’un autre côté, des données plus récentes ont montré que les ROS peuvent jouer un rôle
bénéfique pour les organismes et qu’à faibles concentrations ils peuvent être impliqués dans
des processus de signalisation cellulaires.2
Cette nouvelle vision des ROS nécessite des outils performants pour étudier plus en détail
la dichotomie de leurs effets. En particulier, des méthodes bien adaptées pour détecter,
quantifier et localiser in cellulo chaque ROS sont absolument nécessaires. Cependant, et en
dépit d’efforts considérables au cours de ces dernières décennies, la détection in vivo des ROS
et de O2●- est loin d'être une tâche facile.3 Ceci est principalement dû au fait que les ROS sont
des espèces très instables, souvent présentes à de très faibles concentrations dans les cellules.
De nombreuses méthodes utilisant des sondes chimiques ont été développées jusqu'à présent
pour détecter les ROS, mais malheureusement la plupart d'entre elles manquent
dramatiquement de spécificité et conduisent souvent à des interprétations erronées.3
Ainsi le développement de méthodes plus efficaces et plus fiables pour étudier la formation,
la localisation subcellulaire et le devenir des ROS et de O2●- dans les cellules intactes
représente toujours un enjeu de premier ordre. De plus, en matière de santé humaine,
déterminer les causes initiales du stress oxydant, à savoir la formation de O2●-, est essentiel
pour mieux caractériser et comprendre les processus d'initiation des pathologies graves pour
lesquelles le stress oxydant est un facteur déclenchant.
Ce projet a pour objectif de développer un tout nouveau type de sonde enzymatique codée
génétiquement pour détecter la formation du radical superoxyde O2●- dans les cellules. Cette
sonde sera constituée d'une protéine de fusion entre la superoxyde réductase (SOR), une
enzyme hautement spécifique pour le superoxyde,4-6 et une protéine fluorescente verte
(GFP).7 Cette fusion vise à produire une émission de fluorescence associée à la réaction de la
SOR avec le superoxyde, permettant une détection directe de O2●- dans les cellules par
imagerie de fluorescence.
Le principe de fonctionnement de cette fusion est basé d’une part sur la très grande
spécificité de la SOR pour O2●- mais aussi sur deux propriétés tout à fait remarquables de la
GFP. Premièrement, la découverte récente de réactions redox photo-induites du chromophore
de la GFP, qui font passer sa fluorescence du vert au rouge en présence d’un accepteur
d’électron (oxidative redding),8 pourra être idéalement exploitée dans le cas de la SOR. Une
série de premières expériences nous a montré que ce processus de changement de
fluorescence de la GFP pouvait se produire en présence de SOR, qui à la suite de sa réaction
avec O2●- peut jouer ce rôle d’accepteur d’électrons vis-à-vis de la GFP. Ainsi, le changement
de fluorescence du vert au rouge de la GFP en présence de SOR permettra une détection
spécifique de O2●-. Deuxièmement, en utilisant des mutants circulairement permutés de la
GFP,7 il sera possible de construire différents types de fusions SOR-GFP dans lesquelles le
site actif de la SOR pourra être placé très proche du chromophore de la GFP. Cela permettra
d'optimiser le couplage entre la SOR et la GFP et de sélectionner les fusions qui donneront le
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meilleur signal de changement de fluorescence associé à la réaction de la SOR avec O2●-.
Récemment, nous avons montré que lorsque la SOR et la GFP sont fusionnées de cette façon,
le chromophore de la GFP est correctement maturé et la réactivité de la SOR avec O2●- est
conservée. Ces données valident la faisabilité de notre approche.
A ce jour, une telle détection enzymatique de O2●- n'a jamais été explorée. Cela fournira un
outil sans précédent pour analyser précisément les conditions qui induisent soit une situation
de stress oxydant, soit des processus de signalisation cellulaire. En tant que sonde codée
génétiquement, la fusion SOR-GFP pourra être exprimée de façon contrôlée dans différents
types de cellules, en particulier de mammifère, et être adressée dans un compartiment
cellulaire donné. Cela permettra l’étude de la production de O2●- spécifiquement dans le
cytosol, la mitochondrie, le chloroplaste ou le noyau, ce qui jusqu'à présent est quasiment
impossible à réaliser avec des sondes chimiques. Enfin, la détection enzymatique confèrera
une très grande spécificité au système, ce qui représentera une amélioration majeure par
rapport aux sondes chimiques.3
Le projet de thèse abordera les différents aspects de la mise au point de cette sonde
génétique fluorescente. Il s’agira de:
i) Construire et purifier différentes fusions SOR-GFP. En particulier des méthodes
d’évolution dirigées couplées à un criblage bactérien à haut débit seront utilisées pour obtenir
une série de fusions SOR-GFP qui présenteront une réponse spécifique à la présence de
radical superoxyde.
ii) Etudier et caractériser dans le détail les fusions qui conduiront au signal de fluorescence
le plus intense en présence de radical superoxyde. Cela permettra de sélectionner les fusions
les plus aptes à être utilisées pour les cellules.
iii) Tester par imagerie de fluorescence les fusions sur des cultures de cellules de
mammifère dans des conditions de stress oxydant pour évaluer leur capacité à spécifiquement
détecter et quantifier le radical superoxyde in vivo.
Le développement de ce sujet s’appuiera sur plusieurs collaborations. D’une part avec
Dominique Bourgeois (Institut de Biologie Structurale IBS Grenoble), qui est un spécialiste
des protéines fluorescentes et avec qui nous avons activement collaboré pour l’étude de la
SOR.4 D’autre part avec deux groupes l’Université de Paris-Sud (Orsay), Marie Erard et
Oliver Nüsse,9 spécialistes de biosenseurs pour la détection de ROS et de biologie cellulaire
pour l’expression de la sonde dans des cellules de mammifères.
Références:
1. Winterbourn (2008) Nature Chem Biol 4, 278
2. Paulsen, Carroll (2010) ACS Chem Biol 5, 47
3. Dikalov, Harrison (2014) Antioxidants & Redox Signaling, 20, 372
4. Katona, Carpentier, Nivière, Amara, Adam, Ohana, Tsanov, Bourgeois (2007) Science, 316, 449
5. Bonnot, Molle, Ménage, Moreau, Duval, Favaudon, Houée-Levin, Nivière (2012) Journal of American
Chemical Society, 134, 5120
6. Bonnot, Tremey, von Stetten, Rat, Duval, Carpentier, Clemancey, Desbois, Nivière (2014) Angewandte Chem.
Int. Ed. 53, 5926
7. Pédelacq, Cabantous, Tran, Terwilliger, Waldo (2006) Nature Biotechnol 24, 79
8. Bogdanov, Mishin, Yampolsky, Belousov, Chudakov, Subach, Verkhusha, Lukyanov, Lukyanov (2009)
Nature Chem Biol, 5, 459
9. Tlili, Dupré-Crochet, Erard, Nüsse (2011) Free Radical Biology and Medecine, 50, 438
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