UNIVERSITE KASDI MERBAH, OUARGLA FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE ET SCIENCES DE LA TERRE ET DE L'UNIVERS DEPARTEMENT DES SCIENCES AGRONOMIQUES Mémoire MASTER ACADEMIQUE Domaine: Sciences de la nature et de la vie Filière: Biologie Spécialité: Microbiologie appliquée Présenté par: DECHACHE Aicha MOFRADJ Zitouna Thème Contribution à l’étude de conservation d'une souche de lactocoques isolée à partir du lait caprin Soutenu publiquement Le : 09/06/2014 Devant le jury: Président: KHALLEF Sakina M.A.A UKM Ouargla Encadreur: SIBOUKEUR Oumelkheir Professeur UKM Ouargla Co-encadreur: SIBOUKEUR Amina M.A.B UKM Ouargla Examinateur: BOURICHA M'Hamed M.A.B UKM Ouargla Examinatrice: BALLA Asma M.A.B UKM Ouargla Année université: 2013/2014 Remerciements Avant tout, nous remercions Dieu le tout puissant, le Miséricordieux, de nous avoir donné le courage, la force, la santé et la persistance. Nous remercions notre promotrice Professeur SIBOUKEUR Oumelkheir et Mme SIBOUKEUR Amina Maître Assistante B du Département des Sciences Biologiques ; Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, Université Kasdi Merbah d’Ouargla, pour l’honneur qu’elles nous ont fait en dirigeant ce travail, pour leurs aide, leurs conseils, tout au long de l’élaboration de ce modeste travail A Mme KHALLEF Sakina Maitre Assistante A, du Département des Sciences Biologiques ; Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, Université Kasdi Merbah d’Ouargla, nous adressons nos remerciements les plus sincères pour l’honneur qu’elle nous fait en acceptant de présider ce jury. A Mr. BOURICHA M’Hamed et Melle BALLA Asma, Maitres-assistants B, du Département des Sciences Biologiques ; Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, Université Kasdi Merbah d’Ouargla pour l’honneur qu’ils nous font en acceptant de bien vouloir juger ce travail. A Mr. Le Professeur CHEHMA Abdelmadjid, Directeur du Laboratoire Bioressource, nous adressons notre profonde gratitude pour nous avoir permis d’accéder à son laboratoire. Au personnel des laboratoires, surtout Mr. BEGARI El Aich, Premier Responsable des laboratoires pédagogiques, Mme KACI Safia, Magister en Sciences Agronomiques et Melle KHAMGAOUI Amina Responsable du laboratoire pédagogique de microbiologie, nous adressons notre profonde reconnaissance pour leur soutien et leur infini gentillesse. Que Mesdemoiselles SOUID Wafa et BOUDERHEM Amel, Maitres- Assistantes du Département des Sciences Biologiques ; Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, Université Kasdi Merbah d’Ouargla trouvent ici l’expression de notre gratitude pour leurs conseils et orientations. Enfin, nous remercions, tous ceux qui de près ou de loin, ont contribué à la réalisation de ce travail. Dédicace Grace à Allah … Je dédie ce modeste travail à : Ma chère mère Massaouda, pour l’affection et l’amour qui m’ont donné le courage et la force dans les moments les plus difficiles. Mes chères sœurs : Nissa, Fatima, Fatiha, Sarah, sans que j’oublie mes deux nièces : Randa et chaima Mon frère unique : Mohammed Toutes mes amies, surtout ; Zekri Maria, Djalabi Fatima el-zohra, Boukhloua Samia, Gharbal aldjia, et particulièrement, ma binôme Dechache Aicha. J’aimerai bien leur dire : que suis très heureuse de passer tous ces années avec eux, des liens crées, de nouvelles amitiés, ainsi que, pour tous les moments passés ensemble et ceux encore à venir. En fin je dédie ce travail à toute la promotion 2èmeMaster Microbiologie Appliquée 2014. Zitouna Dédicaces Je dédie ce mémoire à : Ma très chère mère : Halima ; A mon père : Mohamed ; A mes sœurs : Fatima, Dalila, Massaouda A mes frères : Djamel, Aissa, Khaled ; A ma belle binôme : Zitouna;A mon A toute ma famille ; A tous mes chers amis surtout : Meriem, Samiha Aicha Liste des abréviations Ca Calcium CPE Cryo-protecteur extracellulaire °D Degré Doric DO Densité optique G+ GRAM positif H2O2 Le peroxyde d'hydrogène IgG Immunoglobuline G IgM Immunoglobuline M L(+) L'acide lactique Lc Lactococcus OSCN- L'hypothiocyanate P Phosphate SCN Thiocyanate T Température TB Le taux butyreux TP Le taux protéique Liste des figures Figures Intitulé page Dégradation du glucose par les bactéries lactiques (De 1 ROISSART et LUQUET, 1994) 12 2 Procédure expérimentale 25 3 Etapes suivies pour conserver la souche isolée et purifiée 31 Courbe d'étalonnage de la souche 1 isolée sur gélose M17 4 5 36 Evolution de la biomasse conservée 20J à la T. ambiante 38 Evolution de la concentration bactérienne de la souche conservée à 6 la réfrigération 39 Evolution de la concentration bactérienne de la souche conservée à 7 la congélation sans cryo-protecteur 39 Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée 8 à la congélation avec cryo-protecteur Glycérol (10%) 40 Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée 9 à la congélation avec cryo-protecteur Saccharose (12%) 41 Liste des tableaux N° I II III Intitulé Germes typiques de la flore du lait cru (JAKOB et al., 2009) Constitution des lots expérimentaux Caractéristiques physico-chimiques de l'échantillon de lait caprin page 15 30 31 Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques VI de la souche de lactocoque 35 Résultats [ ] de la biomasse bactérienne en % après 5 jours pendant V 20jours. 37 Table des matières Remerciements Dédicace Liste des abréviations Liste des tableaux Liste des figures Introduction 01 Synthèse bibliographique 1.1 Généralités 1.1.1 Chèvre 1.1.2 Avantages de l'élevage caprin 1.1.3 Exigence de l'élevage caprin 1.1.4 principales races de l'élevage caprin algérienne 1.1.4.1 L'arabia 1.1.4.2 La Makatia 1.1.4.3 La chèvre du M'zab 1.1.4.4 La chèvre Kabyle (naine de kabyle) 1.1.4.5 La montagnarde des Aurès 1.1.5 La production laitière caprine 1.2 Le lait de chèvre 1.2.1Compositions et propriétés physic-chimiques du lait 1.2.2 Propriétés médicales 1.2.2.1 Immunoglobulines 1.2.1.2 Lactoferrine 1.2.2.3 Lactoperoxydase 1.2.3 Technologiques fermière du lait caprin 1.3 Bactéries lactiques 1.3.1 Définition et caractéristiques des bactèries lactiques 1.3.2 Applications des bactéries lactiques 1.3.3 Propriétés fonctionnelles et technologiques recherchées 1.3.3.1 Activité acidifiante 1.3.3.2 Production de métabolites d'intérêt 1.3.3.3 Propriétés enzymatiques 1.3.3.4 Propriétés spécifiques aux probiotiques 1.3.3.5 Critères de performance 1.3.4 Microbiologie du lait chèvre 1.3.5 Caractéristique de Lactococcus lactis 1.3.5.1 Habitat 1.3.6 Utilisation industrielle des ferments lactiques 1.3.7 Avantages de l’utilisation des ferments concentrés 1.4 Conservation et formes commerciales des ferments lactiques 1.4.1 Congélation 1.4.2 Réfrigération 03 03 03 03 04 04 05 05 05 05 05 06 06 07 08 08 08 09 10 10 13 13 13 14 14 14 14 14 16 17 17 18 18 18 19 1.5 Cryoprotection des bactéries lactiques 1.5.1 Mécanisme d’action des cryoprotecteurs 19 20 II- Matériel et méthodes 2.1 Matériel d’étude 2.1.1 Lait de chèvre 2.1.2 Milieux de culture 2.1.2.1 Milieu d'isolement, purification (M17) 2.1.2.2 Milieu de conservation 2.1.3 Appareillage 2.1.4 Petit materiel 2.1.5 Produits chimiques et réactifs 2.2 Méthodes analytiques 2.2.1 Analyses physico-chimiques du lait 2.2.1.1 Mesure du pH 2.2.1.2 Acidité Dornic 2.2.1.3 Densité 2.2.2 Analyses microbiologiques 2.2.2.1Test de réductase 2.2.2.2 Isolement de la souche 2.2.2.3 Ensemencement dans un milieu sélectif 2.2.2.4 Pré-identification de la souche 2.2.2.4.1 Analyses préliminaires 2.2.2.4.1.1 Etude morphologique 2.2.2.4.1.1.1Observation macroscopique 2.2.2.4.1.1.2 Observation microscopique 2.2.2.4.1.1.2.1 Examen à l'état frais 2.2.2.4.1.1.2.2 Examen après double coloration de GRAM 2.2.2.4.1.1.2.3 Test de catalase 2.2.2.4.2 Pré-identification physico-chimiques et biochimiques 2.2.2.4.2.1 Tests physico-chimiques des souches 2.2.2.4.2.1.1 Croissance à différentes temperature 2.2.2.4.2.1.2 Tolérance à la salinité 2.2.2.4.2.1.3 Tolérance au pH alcalin 2.2.2.4.2.2 Tests biochimiques des souches 2.2.2.4.2.2.1Type fermentaire 2.2.2.4.3 Purification par repiquage successif 2.2.2.5 Propagation de la souche 2.2.2.6 Mesure de la croissance de la souche isolée 2.2.2.6.1 Mesure de la turbidité 2.2.2.6.2 Courbe d'étalonnage 2.2.3 Conservation des souches isolées 22 22 22 22 22 22 23 23 23 23 23 23 23 24 24 26 26 26 26 26 26 27 27 27 27 28 28 28 28 28 28 28 28 28 29 29 29 30 2.2.4 Suivi de la croissance par densité optique 30 III- Résultats et discussion 3.1 Qualité physico-chimique du lait 31 3.1.1 Mesure du pH 31 3.1.2 Acidité titrable 31 3.1.3 Densité 32 3.2 Analyses microbiologiques 32 3.2.1 Test de réductase 32 3.2.2 Test de catalase 32 3.3 Isolement, pré-identification et purification de la souche 33 3.3.1 Isolement de la souche 33 3.3.1.1 Observations macroscopiques 33 3.3.1.2 Observations microscopiques 33 3.3.2 Pré-identification de la souche 33 3.3.2.1 Caractéristiques morphologiques, microscopiques, physico-chimiques et biochimiques des deux souches isolées 33 3.3.3 Purification 35 3.4 Propagation de la souche 36 3.4.1 Courbe d’étalonnage 36 3.5 Conservation de la souche isolée 36 3.5.1 Température ambiante 37 3.5.2 Réfrigération 38 3.5.3 Congélation sans cryo-protecteur 39 3.5.4 Congélation avec cryo-protecteur 40 3.5.4.1 Glycérol 40 3.5.4.2 Saccharose 41 Conclusion 42 Références bibliographiques 43 Annexes Introduction Introduction Introduction Le lait est un aliment de couleur généralement blanchâtre produit par les mammifères femelles (KECHAOUI, 2013). L'intérêt nutritionnel du lait réside dans sa richesse en nutriments de base (MOULEK, 2011), comme les protéines de qualité, contenant les acides aminés essentiels c'est-à-dire des acides aminés que l'Homme doit se procurer par son alimentation car incapable de les synthétiser lui-même (FICOW, 2010). Les lipides représentant une source importante d'énergie, car ils sont métabolisés dans la mitochondrie des cellules qui récupèrent leur énergie chimique pour synthétiser de l'ATP (DESJEUX, 1993), et les glucides. Le sucre principal du lait est le lactose, c'est le composé prépondérant d e la matière sèche totale. Le lait contient un certain nombre de minéraux. Leur concentration totale est inférieure à 1% du poids total. Les sels les plus importants sont les sels de calcium, de sodium, de potassium, et de magnésium. Les sels de potassium et de calcium sont les plus abondants dans le lait ordinaire (KEBCHAOUI, 2013). Le lait est également riche en vitamines A, B, D et E, des vitamines liposolubles liées à sa matière grasse (FICOW, 2010). En Algérie, il y a une spécialisation des zones Agro-écologiques en matière d'élevage. Les parcours steppiques sont le domaine de prédilection de l'élevage ovin et caprin avec plus de 24 millions de têtes qui y vivent entrainant une surexploitation de ces pâturages. L'élevage caprin vient en seconde position avec 4.7 millions de têtes, c'est-à-dire 14% comprenant 50% de chèvres. Il se trouve concentré essentiellement dans les zones montagneuses, les hauts plateaux et les régions arides (MAMI, 2013). Le lait de chèvre est considéré comme étant l'un des plus complets et des mieux équilibrés parmi les laits (AMROUN‐LAGA ET ZERROUKI, 2011). Le lait est l'un des rares aliments qui convient pour les différentes tranches d'âge où il peut être consommé tel quel à l'état frais ou transformé, notamment en fromage ou en yaourt (MOULEK, 2011). Dans cette transformation, les bactéries lactiques composant la microflore du lait cru, participe de façon importante à l'élaboration des caractéristiques organoleptiques des produits laitiers fermentés. De nombreuses études montrent que les produits laitiers préparés traditionnellement à partir du lait cru ont des saveurs typiques et des qualités nutritionnelles de plus en plus recherchées par le consommateur (BALLA, 2011). Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans la fermentation de différents aliments. Leur capacité à produire des acides organiques accompagnés de l'abaissement du pH est le facteur majeur par lequel ces dernières inhibent la croissance des autres microorganismes concurrents 1 Introduction D'autres métabolites tels que le peroxyde d'hydrogène, l’alcool et le diacetyl synthétisés par les bactéries lactiques peuvent aussi contribuer à la conservation des produits agro-alimentaires. L'existence d'un souchier au niveau d'une usine de transformation du lait permet d'assurer une meilleure régularité des fabrications et une réalisation en routine de l'ensemencement direct du lait. Il existe plusieurs méthodes de conservation des souches. Toutefois celles-ci affectent souvent la viabilité des souches d'intérêt, en l'occurrence les souches acidifiantes et/ou les souches aromatisantes, si certaines précautions ne sont pas prises. Parmi les nombreux facteurs qui interviennent efficacement sur la survie des souches, l'addition de cryoprotecteurs au milieu de conservation. Ces substances permettent aux cellules bactériennes de mieux supporter les basses températures lors des traitements de conservation et/ou lors du stockage (BALLA, 2011). L'objectif de ce travail, vise à la conservation d’une souche de lactocoques isolée à partir du lait caprin cru, en suivant les étapes: Isolement de la souche sur milieu sélectif; Pré-identification, par des tests physico-chimiques et biochimiques; Repiquages successifs afin de la purifier; Conservation de la souche dans un milieu de conservation sous différentes conditions: T. (Température) ambiante (témoin), réfrigération, congélation sans cryo-protecteur, et congélation avec cryo-protecteur (Glycérol 10% et Saccharose 12%). 2 I Synthèse bibliographique Synthèse bibliographique 1.1 Généralités 1.1.1 Chèvre Les chèvres ont de tout temps joué divers rôles, dans la religion, l’économie, la nutrition, les coutumes, et même l’habillement de l’Homme. Les chèvres ont ainsi été utilisées pour différentes raisons, comme la production de lait, de viande, de fibres, de cuir…etc (DUBEUF et al., 2004). Elle appartient au genre Capra à la sous famille des Caprinés, de la famille des Bovidés. Ces derniers dérivent du sous-ordre des ruminants, classe des mammifères pourvus d’un placenta (sous classe Placentaires) et qui se regroupent dans l’embranchement des vertébrés du règne animal (MANALLAH, 2012). La chèvre domestique dont le nom scientifique est Capra hircus appartient: Domestiquée, il y plus de 10.000 ans avant Jésus-Christ, la chèvre (Capra Hircus) est réputée pour sa rusticité. C’est un animal adapté aux conditions rudes et à la sécheresse (SHKOLNIK et al., 1980). 1.1.2 Avantages de l'élevage caprin La chèvre représente pour le petit paysan un certain nombre d'avantages: - Animal de petite taille ; - Coût relativement bas ; - Elevage comportant moins de risques ; - Facile à nourrir ; - Relativement plus féconde ; - Adaptée aux régions arides et semi arides ; - Résistante à certaines maladies (maladie du sommeil) (CARL et KEES VAN, 2004). 1.1.3 Exigence de l’élevage caprin Le bien être et la productivité de la chèvre dépendent dans une large mesure de son alimentation. 3 Synthèse bibliographique Une alimentation conforme doit : Favoriser l’ingestion durant les phases aux besoins élevés, d’un fourrage de bonne qualité ; Adapter l’apport en nutriment et en minéraux aux différents phases du cycle de production, telles que la gestation et la période d’allaitement ; Permettre l’accès au pâturage dès que les conditions le permettent ; Etre composée d’au moins 60% de la ration journalière en fourrage grossiers ; Pouvoir L’apport améliorer le profil d’acides gras du lait et donc celui du fromage. de l’herbe verte et du foin d’augmente la teneur en acides gras polyinsaturé et diminue celle des acides gras saturés (LEGARTO et PALHIERE, 2013). 1.1.4 Principales races caprines algérienne L'espèce caprine se présente en Algérie sous la forme d'une mosaïque de populations très variées appartenant toutes à des populations traditionnelles. Elle comprend en plus de ces populations locales, à sang généralement Nubien, des animaux mélangés aux sangs issus de races standardisées. La population caprine d'Algérie renferme 05 types majeurs, l’Arabia, la Makatia, la chèvre du M'zab, la chèvre Kabyle (naine de kabyle), la montagnarde des Aurès (TEJANI, 2010). 1.1.4.1 L'Arabia La plus dominante de ces populations est la chèvre arabe dite population Arabomaghrébine. Elle se localise en zones steppiques ou semi steppiques et présente un format peu développé, brun foncé et dépourvue de corne. Au niveau phénotypique, elle manifeste des caractères plus homogènes: Robe noire à long poils, pattes blanches au dessus du genou, raies blanches et fauves sur le visage, tâches blanches à l'arrière des cuisses. Cet animal est parfaitement adapté aux contraintes des parcours et semble posséder de bonnes aptitudes de reproduction. La chèvre est principalement élevée pour la viande de chevreaux même si son lait, produit en faible quantité, représente un intérêt indéniable (TEJANI, 2010). 4 Synthèse bibliographique 1.1.4.2 La Makatia Aux caractères assez hétérogènes, robe polychrome aux poils courts, oreilles tombantes, elle semble être le produit de multiples croisements réalisés à partir de races méditerranéennes. Elle est peu résistante sur les parcours et son intérêt réside dans sa production laitière et son adaptation à l'environnement. Ces animaux sont également saisonnés (TEJANI, 2010). 1.1.4.3 La chèvre du M'zab Elle se trouve surtout dans le sud et serait un noyau de l'Ombrine qui est une bonne laitière et très féconde. Cette race est très appréciée dans l'Est méditerranéen pour sa capacité laitière et fait partie du rameau Nubio-Syrien (TEJANI K, 2010). 1.1.4.4 La chèvre Kabyle (naine de kabyle) C'est une chèvre autochtone qui peuple les massifs montagneux de la Kabylie et des Aurès. Elle est robuste et massive, de petite taille, de couleur noirâtre ou blanchâtre avec de longs poils. C’est une mauvaise laitière et est appréciée plutôt pour sa viande (TEJANI, 2010). 1.1.4.5 La montagnarde des Aurès C’est une chèvre qui ressemble au type de Kabylie. Elle est très appréciée pour la quantité et la longueur de ses poils. Elle se distingue des autres populations par la longueur des oreilles allongées, constituant une défense contre les effets de la sécheresse et par la longueur des poils qui est à la base d'une industrie artisanale (TEJANI, 2010). 1.1.5 Production laitière caprine Le consommateur recherche de plus en plus des produits particuliers en matière d’origine et de goût. C’est pourquoi les produits à basede lait de chèvre sont très recherchés et la production a fortement augmenté au cours de ces dernières années. Alors que de nombreuses chèvres sont détenues en petits troupeaux et que leur élevage représente souvent une activité accessoire, 20.000 tonnes de lait de chèvre au France, sont transformée chaque année, en fromage et en d’autres produits à base de lait. Afin de pouvoir garantir la qualité et 5 Synthèse bibliographique la sécurité des produits, le besoin de méthodes simples et fiables pour la surveillance de la qualité du lait de chèvre croît (WALTER, 2007). 1.2 Le lait de chèvre Le lait de chèvre est un liquide blanc ou mât, due à l’absence de β-carotène contrairement au lait de vache. Il a une odeur assez neutre. Parfois en fin de lactation, une odeur caprine apparait et après stockage au froid il acquiert une saveur caractéristique (BOSSET et al, 2000). Il donne une impression bien homogène c'est-à-dire ni trop fluide ni trop épais. Du point de vue de ses qualités nutritives et digestives, le lait de chèvre possède une bonne valeur nutritionnelle. Ces qualités diététiques sont la conséquence d'un certain nombre de caractéristiques physico-chimiques et microbiologiques (MONTEL, 2003). 1.2.1 Composition et propriétés physico-chimiques du lait Le lait de chèvre a une composition et des caractères physico-chimiques particuliers qui les différencient nettement du lait de vache (ABI AZAR, 2007). Le lait sécrété par les différentes espèces de mammifères présentent des caractéristiques communes, et contient les mêmes catégories de composantes : eau, matière grasse, lactose, minéraux et protéines (CHILLIARD et SAUVANT, 1987). Le pH du lait normal varie de 6,2 à 6,8. La majorité des laits ont un pH situé entre 6,4 et 6,6 et l'acidité entre 14 - 18° Dornic. Sa densité à 15°C est de l’ordre de 1.027-1.035 et son point d’ébullition de l’ordre 100.5°C. Le point de congélation varie entre - 0,550 et - 0,583°C (ANSART, 1995). Sa teneur en eau égale à 87% (AMIOT et al., 2002). La matière grasse représente une source importante d’énergie. Elle se présente sous forme de triglycérides, pauvres en acides gras polyinsaturés qui sont nécessaires au métabolisme humain (TOUHAMI, 1996). Le lait caprin est aussi plus difficile à écrémer que le lait de vache du fait que les globules gras caprins se démarquent par leur petite taille (HOLMES et al, 1945 ; JEAN AMIOT et al., 2002). Il se caractérise par la présence, d’acides gras à chaîne relativement courte (dont les acides caproïque et caprylique) qui peuvent être absorbés par un mécanisme plus simple que celui des acides gras à chaîne longue (DESJEUX, 1993). 6 Synthèse bibliographique Le lactose est le glucide le plus important du lait, d’autres glucides peuvent provenir de l’hydrolyse du lactose (glucose, galactose). Certains glucides peuvent se combiner aux protéines, formant des glycoprotéines ou peuvent se trouver sous forme libre (HOLMES et al, 1945 ; AMIOT et al., 2002). Il constitue ainsi de source d’énergie et un apport de galactose pour le développement du système nerveux central (MAHE, 1996). Le lait de chèvre est moins riche en lactose, par rapport au lait humain (70g/l), avec une variation allant de 40.6 à 42.7 g/l. Sa teneur en ce nutriment est proche de celle du le lait de vache (44.13g/l) (MOUALEK, 2011 ; SIBOUKEUR, 2007). Le lait contient tous les minéraux considérés comme essentiels pour la nutrition humaine (KEBCHAOUI, 2013). La composition minérale du lait de chèvre est proche de celle du lait de vache. Il est légèrement plus riche en Calcium (Ca) et phosphate (P) et nettement plus riche en Magnésium, Potassium et Chlore (GUEGUEN, 1996). Le lait de chèvre est pauvre en carotène et en acide folique (B9) (AMIOT et al., 2002). Le taux de caséine totale est un peu plus faible dans le lait de chèvre que dans le lait de vache. Il représente 75% de matière protéique contre et 78 % dans le lait de vache (G RICORDEAU, 1993 ; ABI AZAR, 2007 ; KEBCHAOUI, 2013). De plus l'équilibre entre les différentes fractions caséiniques est très différent et se caractérise par deux proportions 20 et 50 % de caséine Kappa et β alors qu'elle est de 13 et 34% dans le lait de vache (RICORDEAU, 1993 ; ABI AZAR, 2007 ; KEBCHAOUI, 2013). La taille moyenne des micelles du lait de chèvre est inférieure à celle du lait de vache (HENNANE, 2011). Le lait de chèvre est plus riche en protéines solubles que le lait de vache soit, 8.10 % contre 6.0 %. La β- lactoglobuline est la protéine majeure du lactosérum du lait caprin. Elle représente environ 55% soit plus de 4.4g/l de lait contre 25% pour le lait bovin (FAO, 1998). 1.2.2 Propriétés médicinales 7 Synthèse bibliographique Le lait de chèvre est supposé porteur de vertus diététiques et thérapeutiques qui en font un produit de qualité. Il aurait une meilleure influence sur la prévention de l’ostéoporose et l’athérosclérose. Il préviendrait la prévention les inflammations des artères, et toutes les maladies dans lesquelles le stress oxydatif joue un rôle : inflammations, vieillissement, fertilité réduite chez l’homme, schizophrénie, cancer, maladies cardio-vasculaires. Les oligosaccharides dans le lait de chèvre protègent contre les bactéries pathogènes dans les intestins, et stimulent la croissance des bifido-bactéries dans le tractus gastro-intestinal (FRANK, 2003). Il existe également un nombre important d’espèces quantitativements mineures, dont certaines jouent un rôle essentiel dans la protection du petit. C’est le cas des immunoglobulines, la lactoferrine, la lactoperoxydase (DORA, 2007). 1.2.2.1 Immunoglobulines D’une grande hétérogénéité, les immunoglobulines constituent un groupe protéique complexe et différent significativement des autres protéines sériques (EIGEL et al, 1984). Sur les 5 classes d’immunoglobulines seules les IgG, IgA et IgM se retrouvent dans le lait caprin (PARK et al, 2007). La fonction protectrice de ces protéines, s’exprime à travers le lait d’une part par la protection des glandes mammaires et d’autre part par celle du nouveau né (DE WIT, 1998 ; MARSHALL, 2004). 1.2.2.2 Lactoferrine Métallo glycoprotéine fixatrice du fer (HURLEY et al, 1993 ; MARSHALL, 2004), la lactoferrine joue le rôle de promoteur dans l’absorption intestinale de celui-ci (HURLEY et al, 1993). De plus, du fait de son homologie avec la transferrine, elle est souvent qualifiée de lactotransferrine (VOJTECH et al, 2008). Vu ses propriétés bactériostatiques (SHUSTER et HARMON, 1990), par ferriprivation (MAYNARD et al, 1989), sa concentration dans le lait est un indice de résistance des glandes mammaires à l’implantation d’une infection bactérienne (SHUSTER et HARMON, 1990 ; RIBADEAU-DUMAS, 1991). 1.2.2.3 Lactoperoxydase 8 Synthèse bibliographique Enzyme la plus abondante du lait (RIBADEAU-DUMAS et GRAPPIN, 1989), la lactoperoxydase est connue pour son caractère bactéricide du fait qu’elle est le catalyseur de l’oxydation par le peroxyde d’hydrogène (H2O2) du thiocyanate (SCN) donnant naissance à l’hypothiocyanate (OSCN-) (RIBADEAU-DUMAS et GRAPPIN, 1989 ; RIBADEAUDUMAS, et al, 1991). L’hypothiocyanate est un puissant antibactérien. Du fait de cette caractéristique bactéricide, la lactoperoxydase est utilisée comme agent protecteur du lait cru en particulier dans les régions tropicales (RIBADEAU-DUMAS et GRAPPIN, 1989). 1.2.3 Technologie fermière du lait caprin Traditionnellement, la production fermière de fromages à partir du lait de chèvre se base sur l’action des bactéries lactiques (LEFRILEUX et al., 2009). Ces dernières interviennent dans de nombreuses transformations du lait en crème maturée, en laits fermentés, en yaourts, en fromages frais et affinés (DESMAZEAUD, 1998). L'ensemencement est assuré par le repiquage du lactosérum issu de la fabrication précédente (technique de pieds de cuve) (LEFRILEUX et al., 2009). Le lait de chèvre est plus pauvre en caséines que le lait de vache. Son rendement fromager est par conséquence plus faible. Ce sont les spécificités de la composition de sa matière grasse qui donnent au fromage de chèvre son goût caractéristique. Le lactose, et surtout les l’équilibre minéral (Ca, P), facteurs de variations qui sont:la race et la conduite d'élevage (nutrition, reproduction, saisonnalité) sont à l’origine des particulaires de ce lait (ZELLER, 2005). Même si un certain nombre de recherches ont permis de faire le point sur les facteurs alimentaires influant par exemple sur le taux butyreux (TB) ou le taux protéique (TP) du lait caprin, ainsi que leurs effets sur l'aptitude à la coagulation, le lien entre l'alimentation des animaux et la composition azotée et minérale du lait et des produits laitiers a fait l'objet de peu de travaux concernant cette espèce. A partir de données collectées dans des exploitations caprines, un lien entre l'alimentation des chèvres et le profil des courbes d'acidification en technologie lactique a été mis en évidence. La présence d'urée en excès dans le lait de cette espèce a été suspectée dans l’apparition de défauts de caillage en technologie lactique, ou dans un ralentissement de l’acidification en technologie pâte pressée non cuite (LEFRILEUX et al., 2009). Il existe deux procédés de fabrication du fromage de chèvre. Le plus répandu utilise des bactéries lactiques pour la coagulation. C’est un procédé naturel, lent qui donne un caillé friable et perméable. L’autre technique consiste à ajouter de la présure et on obtient assez rapidement un caillé ferme et imperméable (ZELLER, 2005). 9 Synthèse bibliographique 1.3 Bactéries lactiques Bien avant que l'on soit conscient de l'existence des bactéries lactiques, elles avaient été utilisées dans la conservation des aliments à base de lait, de viande, de poissons, de légumes et de fruits (PAUL ROSSE et al., 2002). Pour trouver la cause de la coagulation acide du lait, les chercheurs ont conclu que la présence de bactéries lactiques était responsable de l’acidification du lait et de la maturation de la crème (De ROISSART et LUQUET, 1994 ; VALERIE et al, 2003). 1.3.1 Définition et caractéristiques des bactéries lactiques Les bactéries lactiques sont des cellules vivantes, procaryotes, hétérotrophes et chimio-organotrophes. Elles forment un groupe hétérogène composé de coques et de bacilles, dont la principale caractéristique est la production d'acide lactique à partir de la fermentation des sucres. Non pathogènes, à quelques exceptions près, la majorité de bactéries lactiques ces sont GRAM positives (G+), immobiles, asporulée. Elles sont anaérobies facultatives mais aérotolérantes. Elles ne produisent pas de catalase mais certaines souches possèdent une pseudo-catalase. Elles sont nitrate réductase, et cytochrome oxydase négative. Elles colonisent des milieux naturels variés tels que la surface des végétaux et les muqueuses des mammifères (intestin, bouches, vagin et surface de la peau). Elles ont des exigences nutritionnelles nombreuses (acides aminés, peptides, sels, acides gras et glucides) (HOGG, 2005; BADIS et al., 2005). Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans la fermentation de différents aliments. Leur capacité à produire des acides organiques responsables de l’abaissement du pH leur permet d’inhiber la croissance des autres microorganismes concurrents. D’autres métabolites tels que le peroxyde d’hydrogène, l’alcool et le diacetyl synthétisés par les bactéries lactiques peuvent aussi contribuer à la conservation des produits alimentaires par l’inhibition de la croissance de la flore indésirable. De plus ces dernières peuvent synthétiser des composés inhibiteurs de nature protéique appelés bactériocines (SIBOUKEUR, 2011 ; SOUID, 2011). Toutes les bactéries lactiques ont un métabolisme fermentaire strictement saccharolytique qui, en utilisant les glucides, peuvent produire soit de: 10 Synthèse bibliographique - L'acide lactique exclusivement (bactéries homolactiques strictes), (Fig.1) - L'acide lactique et de l'acide acétique (bactéries hétérolactiques facultatives), - L'acide lactique, de l'acide acétique ou de l'éthanol et de CO2 (bactéries hétérolactiques strictes) (VANDAMM et al., 1996). (Fig.1) Certaines espèces ou certaines souches peuvent en outre produire de l'acide formique ou de l'acide succinique. Parmi les nombreux genres de bactéries lactiques (Aerococcus, Alloiococcus, Atopobium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus…) le genre Lactococcus joue un rôle important dans l’industrie agro- alimentaire. Toutefois, il est important de souligner, l’appartenant du genre Bifidobacterium aux bactéries lactiques du fait de son effet probiotique et de son utilisation dans le secteur alimentaire. 11 Synthèse bibliographique Figure 1 : Dégradation du glucose par les bactéries lactiques (De ROISSART et LUQUET, 1994 12 Synthèse bibliographique 1.3.2 Applications des bactéries lactiques Les bactéries lactiques présentent des activités métaboliques assez diversifiées et une capacité d'adaptation à différents environnements (SALMINEN et VON WARTGHI, 2012). Cette diversité est responsable de leur large gamme d'applications à l'échelle industrielle. Dans l'industrie alimentaire, ces microorganismes permettent la conversion d'une grande variété de matières premières, conduisant ainsi à de nombreux produits. Les saucissons, les laits fermentés et les fromages représentent des produits fabriqués à partir de matières premières d'origine animale, tandis que la choucroute, les olives et certains vins (fermentation malolactique) sont des exemples de transformation de matières premières d'origine végétale. Parmi ces applications, l'industrie laitière est, sans doute, le plus grand consommateur de ferments lactiques commerciaux, pour la production de laits fermentés, fromages, crèmes et beurres (EGON, 2002). La fermentation du lait par les bactéries lactiques est à l'origine d’un nombre important de produits différents, chacun possédant des caractéristiques spécifiques d’arôme, de texture et de qualité (MAYRA-MAKINEM et BIGRET, 1998). Les bactéries lactiques sont également utilisées dans l'industrie chimique (production d’acide lactique), dans le domaine médical (notamment pour le traitement de dysfonctionnements intestinaux) et dans l’industrie des additifs alimentaires (production d'exo polysaccharides et de mannitol) (RUAS-MADIEDO et al., 2002 ; WISSELINK et al., 2002). Elles sont aussi utilisées pour la production de bactériocines (RODRIGUEZ et al., 2003), et pourraient être impliquées dans la production de protéines thérapeutiques ou comme vecteurs de vaccins (LANGELLA et al., 2001). 1.3.3 Propriétés fonctionnelles et technologiques recherchées L’utilisation des bactéries lactiques pour une application industrielle donnée, est déterminée par leurs propriétés fonctionnelles et technologiques, telles que l’activité acidifiante, la production de métabolites d’intérêt, et propriétés enzymatiques. 1.3.3.1 Activité acidifiante La transformation du lactose ou d’un autre sucre assimilable en acide lactique, conduit à l’acidification du produit. Cette acidification accroît sa durée de vie en limitant sa contamination par les microorganismes d’altération ou pathogènes (FRANK et HASSAN, 1998 ; MAYRA-MAKIEN et BIGRET, 1998). 13 Synthèse bibliographique 1.3.3.2 Production de métabolites d’intérêt Selon les espèces et selon les souches, les bactéries lactiques sont capables de produire des métabolites tels que l’acide acétique, l’éthanol, des arômes (diacétyle, acétaldéhyde…), des bactériocines (activité antimicrobienne), des exo-polysaccharides, des enzymes (protéases, peptidases, lipases…) et du CO2 responsable de la formation d’ouvertures dans les fromages (MAYRA-MAKIEN et BIGRET, 1998; FRANK et HASSAN, 1998 ; BEAL et al., 2008). 1.3.3.3 Propriétés enzymatiques Les activités protéolytiques et peptidasique sont importantes car elles déterminent la capacité des bactéries lactiques à utiliser la fraction azotée du milieu. L’activité lypolytique présente, de plus, un intérêt pour les applications fromagères (BEAL et al., 2008). 1.3.3.4 Propriétés spécifiques aux probiotiques En plus des activités précédentes, les souches probiotiques doivent être résistantes aux acides gastriques et aux sels biliaires rencontrés lors de leur passage dans l’estomac, le duodénum et l’intestin (DORA ANGELICA., 2007 ; OUWEHAND et al., 2002 ; NOUSIAINEN et al., 2004).De plus, elles présentent des propriétés thérapeutiques spécifiques à chaque souche, principalement en termes d’activités immunostimulantes et antidiarrhéiques. 1.3.3.5 Critères de performance Indépendamment de la propriété fonctionnelle envisagée, les bactéries lactiques doivent être résistantes aux bactériophages, aux traitements mécaniques, à la congélation et ou à la lyophilisation. Elles doivent également être tolérantes aux inhibiteurs de croissance (tels que l’antibiotiques, l’acidité, l’éthanol, le chlorure de sodium) (BEAL et al., 2008). 1.3.4 Microbiologie du lait chèvre Des analyses microbiologiques de lait de chèvre, ont montré que les genres bactériens rencontrés étaient représentés par six genres de bactéries lactiques: Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Weissella, et Pediococcus. Les espèces de Lactobacillus et Lactococcus dominent cette microflore lactique (BADIS et al., 2004 ; 14 Synthèse bibliographique BADIS et al., 2005). Aujourd’hui, il n’existe pas de normes et de valeurs limites reconnues d'une manière générale au niveau international pour définir la qualité bactériologique du lait de chèvre. Ainsi, pour le contrôle de la qualité de ce lait, seul le dénombrement des germes totaux et dans quelques cas isolés celui des staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus) fréquents dans ce lait, sont effectués. Toutefois, une bonne hygiène au niveau de l'exploitation et de la traite ainsi qu’un refroidissement du lait directement pendant et après la traite, permettent d'éviter des teneurs en germes trop élevées. (MAURER et al,. 2013). Concernant l’aptitude à la transformation du lait caprin, la charge globale en germes, et la composition de la flore sont déterminants. Des analyses concernant des germes ou des groupes de germes spécifiques se justifient. Cependant seulement pour des germes problématiques, la composition de la flore du lait, fournit aussi des informations précieuses au sujet de l'origine des germes et aussi concernant de possibles sources de contamination (voir tableau I) (JAKOB et al., 2009). Tableau I: Germes typiques de la flore du lait cru (JAKOB et al., 2009). Germes GRAM positives Source de contamination Germes sporulés aérobies Terre, poussière, foin (très répandu ) Germes sporulés anaérobies(Clostridies) Ensilage, fourrage vert ou non (Clostridies) fermentation, bourbe Entérocoques Fèces, résidus de lait Staphylocoques Peau, muqueuses Microcoques Peau, résidus de lait Bactéries propioniques Peau, résidus de lait, fourrage vert en fermentation, ensilage Bactéries lactiques Plantes, ensilages, résidus de lait, Muqueuses Bactéries corynéformes Peau, sol Germes GRAM negatives - Colibactéries (E. coli) Fècès, eaux usées - Entérobactéries Plantes, fécès, eaux usées Pseudomonas Eau, sol (très répandu) Acaligenes, Flavobacterium, etc. Eau, sol (très répandu) Levures Sol, plantes, résidus de lait (très répandues) 15 Synthèse bibliographique 1.3.5 Caractéristiques de Lactococcus lactis Les bactéries appartenant au genre Lactococcus se présentent sous forme de coques rassemblées en chaines de longueur variable. Elles appartiennent au groupe N de la classification de Lancefield. Elles sont faiblement α-hémolytiques et non β-hémolytiques (DELLAGLIO et al, 1994). Le genre Lactococcus comporte plusieurs espèces et sous espèces, dont les plus importants sont les espèces suivantes: Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp .lactis biovar diacetylactis (TEUBER, 1995).Ces sousespèces et biovariants se différencient selon certains caractères biochimiques, telle la production de diacétyle à partir du citrate, la désamination de l'arginine, la capacité à croitre en présence de 4% de sel, à pH 9,2 et à 40° C. (BADIS et al, 2004). Les deux sous espèces de Lc. lactis : Lc. lactis ssp. lactis et Lc. lactis ssp. cremoris se distinguent essentiellement par leur capacité acidifiante et leur sensibilité à la température. La sous espèce Lc. lactis ssp. cremoris est incapable de pousser au- dessus de 37°C. Le biovar Lc. lactis ssp .lactis var diacetylactis, utilise le citrate, produit du diacétyle, de l’acétoine et du CO2 (BADIS et al, 2005). L’espèce Lactococcus lactis subsp lactis est une bactérie à GRAM positif, à catalase négative aéro-anaérobie facultative. Elle se trouve en forme de coques disposées en chaines de longueur variable. Les cellules sont ovoïdes ou sphériques de 0.5 à 1 μm de diamètre. Elle possède un métabolisme homofermentaire et produit exclusivement de l’acide lactique L(+). Le genre lactococcus, se caractérise par la présence d’antigène du groupe N, par son caractère faiblement α hémolytique et non β-hémolytique, par sa température de croissance minimale inférieure ou égale à 10° C et optimale voisine de 30°C, par sa thermosensibilité et son inaptitude à croitre en présence de 6.5% de NaCl et à pH 9,6. Des travaux ont montré que l’espèce Lactococcus lactis subsp lactis était résistance à l’acidité, à la bile, au sel et à la congélation (KIM et al., 1999; TEUBER et GEIS, 2006). Elle présente aussi des propriétés inhibitrices envers la flore d’altération et envers la flore pathogène du fromage, grâce à la production de métabolites tels que les acides organiques, le péroxyde d’hydrogène et les bactériocines ou à sa compétition écologique vis-à-vis des nutriments (O’SULLIVAN et al., 2002 ; DORTU et al.,2009). 16 Synthèse bibliographique 1.3.5.1 Habitat Les bactéries du genre lactococcus sont les bactéries lactiques les plus importantes d'un point de vue commercial. Cependant, on peut également les isoler des plantes (SANDINE et al ,1972), ainsi que de la peau de certains animaux, et il semble que la contamination qui a lieu au cours de la traite ait pour origine principale, le fourrage (RAYNAUD, 2006). Les habitats les plus importants des Lactococcus lactis demeurent le lait, les laits fermentés et les fromages, où on les trouve en quantité dominante (DELLAGLIO et al, 1994). 1.3.6 Utilisation industrielle des ferments lactiques Les ferments lactiques ont été produits pour la première fois sous forme concentrée et congelée au cours des années 1965-1970, et commercialisés, sur le marché américain par les compagnies Boll-Hansen et Marshall-Miles (MARUEJOULS et CAIGNIET, 1983), permettant ainsi l’ensemencement semi-directe ou directe des cuves de fabrication. Ce type de ferment a commencé à être produit, en France à partir de 1978 par les sociétés BOLLHANSEN et EUROZYME (MARUEJOULS et CAIGNIET, 1983). L’utilisation industrielle des ferments lactiques se faisait autrefois grâce à la technique du « pied de cuve », où une partie du produit fermenté était conservée pour ensemencer les fermentations suivantes. La nécessité d’un contrôle plus précis du procédé de fabrication et de la qualité finale du produit, ajoutée à une meilleure connaissance des propriétés technologiques des souches, a permis de développer, à partir des années 1920, la méthode d’ensemencement par précultures (LEJARD et al., 1994). A partir d’un échantillon liquide et en respectant les étapes successives de propagation, le ferment est multiplié jusqu’au volume nécessaire pour l’inoculation du produit. Cette méthode a permis une amélioration significative dans la conduite du procédé et la standardisation du produit final, par comparaison à la méthode du pied de cuve. Par contre, elle présente des inconvénients, concernant le risque de contamination des cultures et de mutation des souches. De plus, son coût est élevé, car elle nécessite un personnel spécialisé ainsi que des installations permettant de faire le « scale up » des précultures (BEAL et al., 2008 ; SMITH, 2001 ; TAMIME et ROBINSON, 1999). De plus, selon (TAMIME et ROBINSON, 1999), cette méthode n’est pas appropriée dans le cas d’utilisation de cultures mixtes, car le maintien des proportions est 17 Synthèse bibliographique difficile à conserver. Actuellement, les producteurs de ferments font appel à leur concentration. 1.3.7 Avantages de l’utilisation des ferments concentrés Les avantages de l'utilisation des ferments concentrés se résument ainsi : - simplicité de leur utilisation ; - amélioration du contrôle de la fabrication ; - obtention de produits plus réguliers, due à la standardisation des cinétiques d’acidification, la régularité et la reproductibilité des productions ; - limitation des risques de contamination et des infections phagiques ; - flexibilité de l’organisation de la fabrication ; - réduction et meilleure maîtrise des coûts de production ; - possibilité de réalisation de mélanges précis entre les souches (MAYRA-MAKIEN et BIGRET, 1998 ; BEAL et al., 2008). 1.4 Conservation et formes commerciales des ferments lactiques La préparation en laiterie des levains de bactéries lactiques destinés à la fabrication des produits laitiers fermentés tels que: fromages, beurre et laits fermentés, est une opération délicate et coûteuse. Elle constitue pour les laiteries une charge importante en investissements (matériel, cuves à levains) et en main-d'œuvre spécialisée, aussi bien au stade de l'entretien des souches qu’au laboratoire de la laiterie. Lors de la préparation proprement dite du levain à l'usine, des « accidents » peuvent se produire: contaminations diverses et attaques de bactériophages. Ils ont pour résultat un mauvais développement des bactéries du levain et éventuellement des fabrications défectueuses. C’est pour cela qu’il existe plusieurs laboratoires étrangers étudiant actuellement ce problème. On trouve aux Etats- Unis des suspensions concentrées et congelées de bactéries lactiques utilisables pour la fabrication des produits laitiers (ACCOLAS et AUCLAIR, 1967). 18 Synthèse bibliographique 1.4.1 Congélation La congélation est actuellement la technique de conservation des bactéries lactiques la plus utilisée dans le domaine agro-alimentaire. Une bonne maîtrise de cette opération est nécessaire pour éviter ou minimiser les pertes de viabilité liées à l'abaissement de la température et à la formation de glace au cours de la congélation. Cependant, elle induit aussi des pertes de viabilité, inégalement maîtrisées jusqu'à présent. De plus, les ferments congelés nécessitent une attention spéciale par rapport au maintien de la chaîne du froid lors de leur transport et leur stockage. Il est aussi préconisé que les bactéries congelées soient stockées à des températures inférieures à -45 °C, afin d’assurer la stabilité de la qualité et de l'activité des ferments (STREIT, 2008). Cependant la congélation à une température de – 20°C permet une conservation de la plus part des microorganismes pendant 1 à 2 ans et le métabolisme de ces derniers en dessous de -18°C est totalement inhibé (LARPENT, 1997). 1.4.2 Réfrigération La conservation à basse température réduit la croissance et l'activité des bactéries à l'origine de la dégradation et prolonge la durée de conservation du lait. La conservation à des températures en dessous du minimum de croissance entraîne une prolongation continue de la phase de latence jusqu’à ce que la multiplication cesse et la croissance du microorganisme s’arrête (DOYLE et al, 1997). D’autre part, aux températures comprises entre 0 et 10°C des changements mineurs dans les conditions physico-chimiques ont de grands effets sur la croissance bactérienne (KORKEALA et al, 1989). Toutefois la réfrigération ne tue pas ou n’élimine pas une contamination microbienne. Elle permet la croissance, le développement aux seuls microorganismes psychrophiles capables de croître sur le lait à des températures en dessous de 15 à 20°C (RUTHERFORD et al, 2007). La réfrigération du lait dès la ferme et son stockage pendant un temps plus ou moins long sélectionne des bactéries psychrotrophes qui peuvent devenir alors une flore dominante. Parmi ces bactéries le genre Pseudomonas est le plus fréquent (MIRANDA et GRIPON, 1986). 1.5 Cryoprotection des bactéries lactiques Il existe des substances protectrices qui permettent aux cellules de mieux supporter une congélation ou une décongélation lentes et un stockage à température supérieure à - 50°C, 19 Synthèse bibliographique appelées cryoprotecteurs (FONSECA et CORRIEU, 2001). Ces substances, qui doivent être peu volatiles, solubles dans l’eau et n’avoir aucun caractère toxique, ont des origines diverses : polyols (glycérol, sorbitol), sucres (lactose, saccharose), protéines laitières (lait écrémé, caséines), acides aminés (glutamate), antioxydants (acrobates) ou macromolécules (maltodextrines) (BEAL et al., 2008). Les bactéries contiennent naturellement des cryoprotecteurs : les sucres (sucrose et le tréhalose), chez les bactéries G+ (BERT et al., 1998) ; les polyols (glycérol, sorbitol, et mannitol), que l'on retrouve chez les algues, les champignons, les levures, les plantes et certaines bactéries (KETS et al., 1996; HANS et al., 1995), les acides aminés et dérivés (bétaïne et carnitine), chez plusieurs groupes de bactéries (CSONKA, 1989) et l'acide tetrahydroxypyrimidine carboxylique (hydroxyectoïne) chez les bactéries halophiliques (DELMORAL et al., 1994), le glutamate, la glutamine, la proline et l’alanine chez Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas et d'autres micro-organismes (JEWELL et al., 1991) et les acides aminés bêta chez les bactéries méthanogènes (LAI et al., 1991). Les cryoprotecteurs sont groupés en deux classes : Cryoprotecteurs intracellulaires Ce sont des substances de faible poids moléculaire (< 100) qui pénètrent à l'intérieur de la cellule. Ils sont utilisés à une concentration de l’ordre de mol/l et agissent principalement lors d’une congélation lente. Le plus important représentant de cette catégorie, est le glycérol, mais on trouve aussi le diméthyle sulfoxide, méthanol éthanol, polyéthylène oxyde, diméthylacétamide1-2 propanediol. Cryoprotecteurs extracellulaires Ce sont des substances de haut poids moléculaire (>10.000) qui se concentrent à l'extérieur de la cellule. Ils sont utilisés à une concentration plus faible, de l'ordre de la millimole/l, et sont indiqués lors des congélations rapides. Parmi les molécules les plus utilisées de cette catégorie se trouvent le lactose, le saccharose, le tréhalose, la maltodextrine, polyvinyl pyrolidone, le dextrane et l'amidon (STREIT, 2008). 20 Synthèse bibliographique 1.5.1 Mécanisme d’action des cryoprotecteurs Les mécanismes de la cryoprotection sont l'objet de nombreuses études de nos jours. Les modes d'action les plus probables sont : un accroissement du volume de la phase liquide interstitielle, à une température donnée, par dépression du point de congélation commençante et donc réduction des effets liés à un refroidissement lent, une diminution de la taille des cristaux de glace par abaissement de la température de nucléation et une réduction de leur vitesse de croissance et une stabilisation de la configuration native des protéines (LESLIE et al., 1995). Lorsque les premiers cristaux de glace apparaissent, les CPE se concentrent uniquement à l'extérieur des cellules, contrairement aux autres solutés qui se concentrent à l’intérieur et l’extérieur des cellules. La perte d'eau des cellules conduit donc à une concentration en autre soluté, plus faible qu’en absence de CPE, minimisant ainsi les effets de l'accroissement de concentration de la solution interstitielle. Au niveau des membranes cellulaires séchées, des sucres comme le tréhalose et le saccharose peuvent remplacer les molécules d'eau dans leur liaison avec les groupes polaires des phospholipides empêchant ainsi les dommages durant la réhydratation (LESLIE et al., 1995). Le tréhalose et le saccharose stabilisent la structure des protéines intracellulaires par ce phénomène de remplacement de l'eau (CARPENTER et al., 1993). D'autres études ont montré que les cryoprotecteurs étaient indispensables lors de la congélation quelles que soient les courbes de refroidissement. Tous les cryoprotecteurs ne pénètrent pas dans les cellules. Il est d'usage de les séparer en cryoprotecteurs non diffusants (la plupart des sucres ajoutés) et diffusants (le glycérol, l'éthylène glycol, par exemple) (PEGG et DIAPER, 1988). Les cryoprotecteurs diffusants vont se substituer à une partie de l'eau intracellulaire et permettre ainsi une déshydratation partielle des cellules en plus de limiter la formation de cristaux de glace intracellulaire. Ils réduisent également la vitesse de croissance de ces cristaux, abaissent la température de solidification de l'eau intracellulaire, tel un « antigel », et modifient la forme des cristaux de glace (HEY et MACFARLANE, 1998 ; PALASZ et MAPJETOFT, 1996). Quand aux cryoprotecteurs pénétrants, ils protègent aussi au cours de la congélation et de la décongélation en réduisant la taille des cristaux de glace et en induisant des formes de cristaux moins traumatisantes. Ils permettent, via l'augmentation de la viscosité du milieu, la diminution de la rapidité des mouvements de l'eau et de chocs osmotiques importants. De plus, ils permettent, via l'augmentation de la pression osmotique, la réduction de la quantité de cryoprotecteurs pénétrants, nécessaires à une bonne conservation (MERYMAN, 1974). 21 II Matériel et méthodes Matériel et méthodes 2.1 Matériel d’étude 2.1.1 Lait de chèvre Les prélèvements de lait proviennent de troupeaux de chèvres localisés à Bamindil dans la région d'Ouargla. Ainsi trois prélèvements à partir de trois chèvres d'un troupeau et deux prélèvements à partir de deux chèvres d'un autre troupeau de la même race ont fait l'objet de ce travail. Un nettoyage correct de la mamelle est effectué avant la traite. Il est indispensable pour éviter les contaminations de lait. Le lait est recueilli dans des flacons stériles de 250 ml, conservé et transportés, dans une glacière au laboratoire. 2.1.2 Milieux utilisés 2.1.2.1 Milieu d'isolement, purification (M17) La composition de ce milieu de culture est indiquée en annexe n°1. 2.1.2.2 Milieu de conservation Le milieu de conservation est composé de 10g de peptone; 5g de NaCl; 3g d'extrait de viande; 5g d'extrait de levure; 1g de glucose; 4g de Na2HPO4; 1l eau distillée. C'est un bouillon et ne contient pas d'agar-agar (BALLA, 2011). 2.1.3 Appareillage - Microscope optique (Motic, China); - Réfrigérateur (Samsung, Kouria); - Etuve (Memmert, Allemagne); - Four pasteur (Memmert, Allemagne); - Autoclave (Pbi-international, Milano); - Bec benzène; - Bain-marie (Memmert, Allemagne); - pH mètre (Metrohom620, Allemagne); - Densimètre (G-widder, Allemagne); - Spectrophotomètre (WPA, China); - Balance de précision (Denver, Allemagne); - Plaque chauffante (VELP, Europe). 22 Matériel et méthodes 2.1.4 Petit matériel Boites pétri en plastique, tube à essais, pipettes pasteur, erlenemeyer de 250 ml, éprouvettes , fiole jaugée, bécher, pipettes graduées, burette, lames et lamelles, flacon en verre de 250 ml, entonnoir. 2.1.5 Produits chimiques et réactifs Eau physiologique, phénolphtaléine, solution de Soude (1N), bleu de méthylène 1%, violet de gentiane, l'eau distillée, liquide de lugol, alcool, solution de Fuchsine de Ziehl, l'eau distillée stérile, l'eau oxygénée 10 volume, peptone bactériologique, NaCl, HCl et NaOH, Citrate d'ammoniac de Fe+3 (à la place ou Glycérophasphate de sodium), extrait de viande, extrait de levure, Na PO-4, lactose, glucose. Les cryoprotecteurs utilisés dans la présente étude sont les suivants : - Le saccharose à 12% (DENI et PLOY, 2007). - Le glycérol à 10% (DENI et PLOY, 2007). 2.2 Méthodes analytiques 2.2.1 Analyses physico-chimiques du lait 2.2.1.1 Mesure du pH Le pH est déterminé à l'aide d’un pH-mètre étalonné. La valeur est lue directement sur l'écran de l'appareil (AFNOR, 1986). 2.2.1.2 Acidité Dornic Le dosage est effectué par neutralisation de 10 ml de lait avec de la soude N⁄ 9 en présence de phénolphtaléine (BALLA, 2011). 2.2.1.3 Densité La densité est déterminée à l’aide d’un densimètre sur un lait maintenu au repos. Elle consiste à plonger l'appareil dans une éprouvette de 250 ml remplie de lait, lorsqu'il se stabilise, la lecture de la valeur de la densité se fait directement sur l'appareil (SOUID, 2011). 23 Matériel et méthodes 2.2.2 Analyses microbiologiques 2.2.2.1Test de la réductase Le test de la réductase permet d'estimer la charge microbienne des échantillons de lait collectés. Son principe est basé sur la décoloration du bleu de méthylène. La rapidité de cette décoloration est directement proportionnelle au nombre de germes présents(LARPENT, 1997 ; GUIRAUD, 1998). Ce test donne une idée de la quantité de germes présents dans le lait, de leur activité et de leur vitesse de multiplication .La technique est indiquée en annexe n°2. 24 Matériel et méthodes Le lait de Chèvre (mélange) Analyses physico-chimiques (pH, densité, acidité Dornic) Analyses microbiologiques Test de la réductase Isolement de la souche lactocoques Ensemencement dans le milieu M17 (striés d’épuisement) Incubation à 30°C pendant 24h Analyses préliminaires : Etude macro et microscopique, Test de la catalase Pré-identification par des tests physicochimique et biochimiques Purification, repiquages successifs Propagation de la souche: mesure de la DO Numérations des souches avant conservation Conservation des souches dans du bouillons de conservation Conservation à T ambiante Réfrigération Congélation sans cryoprotecteurs Congélation avec cryoprotecteurs (glycérol 10%, saccharose 12%) Figure 2: Procédure Détermination deexpérimentale la densité optique tous les jours J0 jusqu'à J0+20 25 Matériel et méthodes 2.2.2.2 Isolement de la souche Nous avons préparé des séries de dilutions décimales de lait (10-1 à 10-5) effectuées avec du bouillon peptone- sel (1g l-1 peptone bactériologique, 8,5g l-1 NaCl), et le milieu de culture d'isolement est ensemencé à partir de ces dilutions. La technique est indiquée en annexe n°3. 2.2.2.3 Ensemencement dans un milieu sélectif Les boites de pétri coulées par la gélose M17 gélosé, sont ensemencées en surface à 0.1 ml de la dilution effectuée, puis incubées à 30°C pendant 24h. 2.2.2.4 Pré-Identification de la souche La pureté des souches sera contrôlée par des observations, macroscopiques et microscopiques (après double coloration de GRAM), le test de la catalase, et des tests physico-chimiques et biochimiques sont réalisés avant de procéder à la conservation. 2.2.2.4.1 Analyses préliminaires 2.2.2.4.1.1 Etude morphologique 2.2.2.4.1.1.1Observation macroscopique L'examen macroscopique des cultures est le premier effectué après isolement de la souche. Il porte sur la description de: - La taille: approximative; - La forme: caractérisée par l'allure des contours qui peuvent être lisses, dentelés, déchiquetés. La surface (forme en relief) peut être bombée ou plate. Le centre est parfois surélevé, parfois « ombiliqué »ou« creux »; - L'aspect de la surface: qui peut être lisse, brillant (type S «smooth» : lisse), rugueux mate (type R «rough»: rugueux); 26 ou Matériel et méthodes - La coloration : la plupart des colonies n'ont pas de couleur définie. Elles sont jaunâtres, grisâtres, ou blanchâtres mais certaines élaborent un pigment qui donne à la colonie une teinte franche : jaune, rouge, violette; parfois le milieu lui même se colore, cas fréquent d'un pigment bleu- vert. La pigmentation est un caractère d’identification important; - La consistance: les colonies peuvent avoir un aspect muqueux comme elles peuvent être filantes, grasses, crémeuses (qui se mettront facilement en suspension) sèches, pulvérulents (qui se dissocieront mal dans l’eau) (MARCHAL et al., 1982); - L'opacité : les colonies sont dites opaques si elles ne laissent pas passer la lumière, translucides si elles laissent passer la lumière mais on ne voit pas les formes au travers, transparentes, si elles laissent passer la lumière et on voit les formes au travers (MARCHAL et al., 1982). 2.2.2.4.1.1.2 Observation microscopique L'observation microscopique permet de faire une étude morphologique des cellules d'une espèce bactérienne 2.2.2.4.1.1.2.1 Examen à l’état frais Une méthode rapide consiste à observer entre lame et lamelle une suspension bactérienne à l'objectif 40 sans fixation préalable par la chaleur ou l’alcool. Les renseignements obtenus par cette observation concernant principalement la mobilité des bactéries (DENI et PLOY, 2007). 2.2.2.4.1.1.2.2 Examen après double coloration de GRAM La coloration de GRAM a été effectuée selon le protocole décrit par (PRESCOTT et al.; 2003). La technique est indiquée en annexe n°4. 2.2.2.4.1.1.3 Test de la catalase La catalase est une enzyme produite en abondance par les bactéries ayant un métabolisme respiratoire qui détruit le peroxyde d'hydrogène et libère de l'oxygène VÉZINA 27 Matériel et méthodes et LACROIX, 2000). La mise en évidence d'une catalase se fait par contact de la culture microbienne avec une solution fraiche d'eau oxygénée (GUIRAUD, 2003). 2.2.2.4.2 Pré-Identifications physico-chimiques et biochimiques de la souche Les souches isolées subissent des tests pré-identification physico-chimiques et biochimiques. 2.2.2.4.2.1 Tests physico-chimiques des souches 2.2.2.4.2.1.1Croissance à différentes température Du bouillon M17 est ensemencé est incubé à 10 °C pendant 1-7 jours, à 40°C pendant 24 h et à 45°C pendant 24h (SIBOUKEUR, 2011). 2.2.2.4.2.1.2 Tolérance à la salinité Du bouillon M17 à des concentrations de 2%, 4% et 6.5% de NaCl est ensemencés et incubé à 30°C pendant 24 h (SIBOUKEUR, 2011). 2.2.2.4.2.1.3 Tolérance au pH alcalin Du bouillon M17 alcalinisé à pH 9.6 et 9.2 est ensemencés et incubé à 30°C pendant 24h (SIBOUKEUR, 2011). 2.2.2.4.2.2 Tests biochimiques des souches 2.2.2.4.2.2.1Type fermentaire Du bouillon M17 est ensemencé en présence d’une cloche de Durham, et incubé à 30°C pendant 24h (SIBOUKEUR, 2011). 2.2.2.4.3 Purification par repiquage successif La purification des bactéries est réalisée par 6 repiquages successifs dans la gélose M17 par des stries d'épuisement. 2.2.2.5 Propagation de la souche 28 Matériel et méthodes Avant d'être conservées, les bactéries doivent être obtenues en culture pure. Elles doivent, durant la durée de stockage, être dans des conditions de non multiplication en milieu de conservation en absence et présence des agents protecteurs et doivent être prélevées sur une culture récente (DENI et PLOY, 2007). Une colonie de bactérie préalablement purifiée est placée dans 1 ml de bouillon M17 puis incubée à 30°C pendant 24h. On introduit ensuite la culture précédente dans un tube contenant 9 ml de milieu M17, puis on l'incube à nouveau à 30°C pendant 24h (SIBOUKEUR, 2011). Préparer le milieu de conservation dans 5 erlenmeyers de 250 ml. Deux erlenmeyers destinés à la congélation sont additionnés de l'agent cryo-protecteur (glycérol 10%, saccharose 12%) et les trois autres erlenmeyers destinés à être stockés à la température ambiante (témoin), réfrigération et congélation, sans addition de cryo-protecteur. La culture est réalisée dans des erlenmeyers d’une capacité de 250 ml contenant du milieu de conservation, avec la culture précédente (tube de 10 ml) à raison de 10%. L'incubation est effectuée à 30°C pendant 24. La technique est indiquée en annexe n°5. 2.2.2.6 Mesure de la croissance de la souche isolée 2.2.2.6.1 Mesure de la turbidité La croissance bactérienne est suivie par la mesure de la densité optique qui est effectuée à une longueur d’onde de 600nm au spectrophotomètre (BEAL et al ,2008). Dans le cas des dilutions, la turbidité est proportionnelle à la biomasse lorsqu'elle ne dépasse pas la limite 0,5- 0,6 en unité d’absorbance (ONER et ERIKSON, 1986). Lorsqu’une suspension cellulaire dans un milieu limpide est traversée par un faisceau lumineux monochromatique, elle absorbe une quantité de lumière qui est proportionnelle à sa concentration cellulaire selon la loi de Béer Lambert (BOURGEOIS et LEVEAU, 1991). 2.2.2.6.2 Courbe d'étalonnage A partir de la culture à (10%), nous avons réalisé une gamme étalon (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5), à partir de laquelle nous avons tracé la courbe étalon, en mesurant l’absorbance à 600nm. 29 Matériel et méthodes 2.2.3 Conservation des souches isolées Les solutions à 10% (Erlenmeyer) sont réparties dans des tubes en verre, stériles munis d'un bouchon hermétique, de 5,4ml de capacité, puis elles sont conservées selon le protocole indiqué en figure 3. Le tableau II indique la constitution des lots expérimentaux de solutions. Tableau II: Constitution des lots expérimentaux Nature du traitement de Température Réfrigération conservation congélation Ambiante Sans cryoprotecteur Lot Lot 1 Lot 2 Lot 3 Avec cryo-protecteur glycérol saccharose Lot 4 Lot 5 2.2.4 Suivi de la croissance par densité optique La détermination de la souche est suivie chaque cinq jour de J0- J0+20 par la mesure de la densité optique des échantillons, soumis à différentes conditions de stockage. 30 III Résultats et discussion Résultats et discussion 3.1 Qualité physico-chimique du lait Les résultats relatifs aux caractéristiques physico-chimiques du mélange des 5 échantillons du lait caprin, ayant fait l’objet de la présente étude. La moyenne de trois répétitions est portée sur le tableau III. Tableau III : Caractéristiques physico-chimiques de l'échantillon de lait caprin. Paramètres physico-chimiques Moyenne pH 6.79 Acidité Dornic (°D) 15.33 3.1.1 Mesure du pH Densité 1.0233 L'échantillon analysé présente un pH égal à 6,79. Ce dernier est proche celui du lait de vache compris entre 6,6 et 6,8 selon VIGNOLA (2002) et VIERLING (2008). D’autres travaux rapportent des pH de lait de chèvre légèrement plus acide que ceux du lait de vache. L'origine de ces valeurs de pH (5.2 ; 4.6) du lait caprin peut être attribuée à un début d'activité des bactéries lactiques endogènes donc à l'âge du lait. 3.1.2 Acidité titrable L'acidité titrable du lait dépend du nombre de moles d’acides présents dans ce produit. Elle est inversement proportionnelle à son pH (MATHIEU, 1998). Le lait fraîchement trait est selon BADAOUI (2000), légèrement acide. Cette acidité provient essentiellement des caséines, des phosphates, du citrate et du CO2 dissous. Le lait acquiert ensuite une acidité, dite acidité développée car elle est provoquée par l'acide lactique et autres acides issus l'activité fermentaire des micro-organismes (BADAOUI, 2000). L'acidité titrable moyenne de l'échantillon de lait caprin analysé est égale à 15.33°D. Cette valeur se rapproche de celle du lait bovin (15.5 D°) (MOUALEK, 2011). Cette valeur est inférieure à 18°D celles rapportées par BENGUETTAIA et LEMLEM (2013). 31 Résultats et discussion 3.1.3 Densité La densité du lait est en relation directe avec le taux de matière sèche (SIBOUKEUR, 2007). Le taux de matières sèches du lait caprin est plus faible que celui du lait bovin (BENGUETTAIA et LEMLEM, 2013). La densité du lait analysé est égale à 1.0233. Les auteurs (in SIBOUKEUR, 2011) consultés rapportent que le lait caprin est moins dense par rapport au lait bovin 1.0322. Ceci conforte le résultat enregistré dans cette étude. 3.2 Analyse microbiologique 3.2.1 Test de réductase L'épreuve de la réductase n'est pas un moyen d'appréciation du nombre de bactéries mais une épreuve destinée à estimer le degré de la contamination du lait (PETRANSEXIENE, 1981).La décoloration de bleu de méthylène a commencé au delà de 5 heures. Cela signifie que l'échantillon de lait caprin testé présente une bonne qualité hygiénique. Le taux de germes dans ce lait peut être estimé entre 10 5 à 2.105 germes/ml (GUIRAUD ,1998). 3.2.2 Test de catalase Cette enzyme est utilisée en bactériologie systématique pour l'identification des bactéries. Ce caractère indique l’appartenance des bactéries lactiques au genre Lactococcus bactéries à G+ aérotolérantes à ne pas posséder de système respiratoire (ni cytochrome, ni catalase) (DESMAZEAUD et DE ROISSART, 1994). Toutefois, certaines bactéries lactiques possèdent des pseudo-catalases non hémiques, provoquant une effervescence (SIBOUKEUR, 2011) 3.3 Isolement, pré-identification et purification de la souche 3.3.1 Isolement de la souche de lactcoques 32 Résultats et discussion 3.3.1.1 Observations macroscopiques Nous avons pu isoler deux types de colonies qui différent par leur couleur et leur taille. La première de couleur blanche, est de très petite taille (1mm), alors que la deuxième de couleur jaune, est deux fois plus grande (2mm environ). (Photo 1) Photo 1: Colonies isolées sur gélose M17. .3.3.1.2 Observations microscopiques La double coloration de GRAM indique des monocoques, des diplocoques et des chainettes colorés en violet donc G + pour les deux types de colonies isolées. 3.3.2 Pré-identification de la souche 3.3.2.1 Caractéristiques morphologiques, microscopiques, physico-chimiques et biochimiques des deux souches isolées Les caractères morphologiques, microscopiques, physico-chimiques et biochimiques sont regroupés dans le tableau VI. L'absence de dégagement de CO2 dans la cloche de Durham indique que la 1ère souche est homofermentaire. Ce résultat est de nature à indiquer que cette souche appartient au genre lactococcus (SEBASTIEN, 2008). (dégagement de CO2). 33 La 2ème souche est hétérofermentaire Résultats et discussion On observe un trouble dans le bouillon M17 après une incubation à 10°C, 40°C et aucun trouble à 45°C pour les deux souches. Cela indique que les deux souches sont mésophiles, un autre caracère des lactocoques. Un trouble est observé dans des bouillons M17, à 2%, à 4% de NaCl pour les deux souches. La 1ère souche contrairement à la 2ème, ne croit pas à 6.5% de NaCl. Cette inaptitude constitue une des caractéristiques de l'espèce Lactococcus lactis. La 1ère souche se distingue de la 2ème souche par sa croissance à pH=9.6. Ce caractère permet de distinguer l’espèce Lactococcus lactis subsp lactis des espèces Lactococcus lactis subsp cremoris et Lactococcus lactis subsp lactis diacetylactis (GUIRAUD ,1998). Le type fermentaire (homofermentaire), l'absence de croissance à 6.5% de NaCl et à pH=9,6 semblent indiquer que la souche recherchée est la 1ere souche (colonies blanches de 1mm de diamètre). Celle-ci fera l'objectif d'une purification pour la suite de ce travail. Tableau VI : Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques de la souche. Colonie 1: blanche de Colonie 2: jaune de taille petite taille plus grande Monocoque, diplocoques Monocoque, diplocoques et en chaînette et en chaînette Immobile Immobile Gram+ Gram+ Test de catalase Effervescence Effervescence Type fermentaire Homofermentaire Hétérofermentaire Croissance à 10°C + + Croissance à 40°C + + Croissance à 45°C _ _ Tests d'identification Observation microscopique Examen à l'état frais (mobilité) Examen après double coloration de GRAM 34 Résultats et discussion Croissance à 2% d'NaCl + + Croissance à 4% d'NaCl + + Croissance à 6,5% d'NaCl _ + Croissance à pH 9,2 + + Croissance à pH 9,6 - + 3.3.3 Purification Après six repiquages successifs par des stries d'épuisement sur gélose M17, nous avons obtenu des souches pures à partir de la colonie 1. 3.4 Propagation de la souche 3.4.1 Courbe d'étalonnage La gamme nous a permis de tracer une courbe étalon en utilisant le spectrophotomètre visible à 600nm (fig. 4). 0,6 x5,349y = 0,8595= ² R D.O à 600 nm 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 Concentration de la biomasse Figure 4: Courbe d'étalonnage de la souche 1 isolée sur gélose M17 Cette courbe est utilisée pour le suivi de l’évolution de la biomasse durant la conservation de la souche. 35 Résultats et discussion 3.5 Conservation de la souche isolée La courbe étalon permet de déterminer à J0, J0+5, J0+10, J0+15, J0+20 (soit tous les 5 jours), la concentration bactérienne de la culture initiale c'est-à-dire celle à 10%, selon le tableau V: Tableau V : Résultats [ ] de la biomasse bactérienne en % après 5 jours pendant 20jours. Les jours J0 J0+5 J0+10 J0+15 J0+20 9,8 7,1 6,7 4,6 6,3 9,8 5,8 6,1 2,8 4,8 9,8 5 3,2 5,1 5,2 9,8 5 6 0,07 1 9,8 49 43 42 8,4 [ ] de la biomasse bactérienne en % T ambiante [ ] de la biomasse bactérienne en % réfrigération [ ] de la biomasse bactérienne en % congélation sans cryoprotecteur [ ] de la biomasse bactérienne en % congélation (glycérol) [ ] de la biomasse bactérienne en % congélation (saccharose) 36 Résultats et discussion 3.5.1 Température ambiante La figure 5: représente le lot n°1 des échantillons de cultures à 10% (20 tubes de capacité 5.4 ml) stockés à la température ambiante (environ 29-31°C). L'évolution de la [ ] de biomasse bactérienne en (%) biomasse pendant 20 jours. 12 9,75x + 0,95y = 0,6383= ² R 10 8 6 4,6 4 2 0 0J 0+5J 0+10J 0+15J 0+20J durée de consevation en jour Figure 5: Evolution de la biomasse conservée 20J à température ambiante Nous remarquons une diminution de la biomasse qui passe de 10% à 4.6% à J0+15. Ceci est du probablement au fait que le milieu ne convient pas à leur croissance. En effet le milieu utilisé est un milieu de conservation et non un milieu de culture. La lyse cellulaire sous l'action des enzymes protéolytiques endogènes serait à l’origine de cette baisse de concentration cellulaire. Cependant, selon MARIE-MADELEINE (2007), il peut persister une croissance par libération de substances lors de la lyse pendant la croissance cryptique, ce qui semble expliquer la croissance après J0+15. 37 Résultats et discussion 3.5.2 Réfrigération la figure 6: représente le lot n°2 des échantillons de cultures à 10% stockés à 8 °C. [ ] de biomasse bactérienne en (%) L’évolution de la biomasse pendant 20 jours. 12 9,76x + 1,3y = 0,6482= ² R 10 8 6 4 2,8 2 0 0J 0+5J 0+10J 0+15J 0+20J durée de conservation en jour Figure 6: Evolution de la concentration bactérienne de la souche conservée à la réfrigération. La figure 6 présente la même allure que la précédente .Toutefois, la diminution de la biomasse est plus importante puisqu’elle passe de 10% à 2.8 % à J0+15. 3.5.3 Congélation sans cryo-protecteur La figure 7: représente le lot n°3 des échantillons de cultures à 10% conservés dans [ ] de biomasse bactérienne en (%) un congélateur de laboratoire réglé à -20°C. 12 8,39x + 0,91y = 0,3429= ² R 10 8 6 4 3,2 2 0 0J 0+5J 0+10J 0+15J durée de conservation en jour 38 0+20J Résultats et discussion Figure 7: Evolution de la concentration bactérienne de la souche conservée à la congélation sans cryo-protecteur. Nous remarquons une diminution de la biomasse qui passe de 10% à 3.2% à J0+10, donc plus tôt comparativement aux lots 1 et 2. La conservation de ce lot utilisant cette basse température semble nuire aux souches. Le problème lié à la conservation par le froid est celui de la formation de cristaux de glace qui peuvent être très dommageables sur les cellules. Il y a un stress osmotique. Le potentiel de cette formation de glace intracellulaire augmente, si le potentiel osmotique à l'intérieur de la cellule est différent de celui de milieu environnant. Les mécanismes de dommage de glace intracellulaire restent floues, mais peut inclure la destruction physique des membranes, la formation de bulles de gaz et de la perturbation des organites (FULLER, 2004). Par ailleurs, les auteurs évoquent d’autres raisons de la sensibilité des cellules aux traitements de conservation par le froid. Ainsi, les cellules de l'espèce Str. lactis récoltées en phase exponentielle de croissance sont beaucoup plus sensibles à la congélation que les cellules récoltées en début de phase stationnaire (ACCOLAS et AUCLAIR, 1999). 3.5.4 Congélation avec cryo-protecteur 3.5.4.1 Glycérol La figure 8: représente le lot n°4 des échantillons de cultures à 10% stockés à -20 °C en présence de glycérol à 10 %. Celui-ci est susceptible de protéger la membrane cellulaire. 11,133x + 2,253y = 0,8137= ² R [ ] de biomasse bactérienne en (%) 12 10 8 6 4 2 0 2- 0,07 0J 0+5J 0+10J 0+15J durée de conservation en jour 39 0+20J Résultats et discussion Figure 8: Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée à la congélation (-20°C) avec cryo-protecteur Glycérol (10%). Nous remarquons une diminution relativement importante de la biomasse en comparaison avec les lots 1 et 2 puisqu’elle passe de 10% à 0.07 % à J0+15. Par rapport au lot 3, nous constatons une diminution de la biomasse beaucoup plus faible durant les 10 premiers jours, puisque la biomasse passe 10% à 6 % (versus 3.2 %) à J0+10, d'où présence d’une protection relative. Le Glycérol est un soluté poly-hydroxylé avec une forte solubilité dans l'eau, et une faible toxicité lors l'exposition à court terme à des cellules vivantes (FULLER, 2004). En général, on procède à un refroidissement lent et progressif, lors de l’utilisation de cryoprotecteurs pénétrant les cellules tel que le glycérol. Ce dernier, agit en évitant une trop forte déshydratation des cellules lors de la formation primitive de glace extracellulaire puis en évitant la formation secondaire (qui suit la déshydratation consécutive à la formation de glace extracellulaire) de trop nombreux et trop gros cristaux de glace pure intracellulaire. Certains protocoles assurent au contraire un refroidissement très rapide. II s'agit d'obtenir une "vitrification" intracellulaire non destructive (FULLER, 2004). 3.5.4.2 Saccharose La figure 9: représente le lot n°5 des échantillons de cultures à 10% stockés à -20 °C en présence de saccharose à 12 %. Les résultats obtenus semblent être du plutôt à la densité optique anormalement élevée des échantillons additionnés de saccharose. En effet les échantillons du lot n°5 présentaient une consistance de gel (fig.9). Nous ne pouvons donc pas tenir en ligne de compte ces résultats. 40 [ ] de biomasse bactérienne en (%) Résultats et discussion 33,38x + 0,98y = 0,0062= ² R 60 50 40 30 20 10 0 0J 0+5J 0+10J 0+15J 0+20J durée de conservation en jour Figure 9: Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée à la congélation avec cryo-protecteur Saccharose (12%). 41 Conclusion Conclusion Conclusion Conclusion L'objectif de ce travail vise à la conservation d'une souche pure de lactocoques isolée à partir du lait caprin. Après culture sur gélose M17, pré-identifiée par une caractérisation morphologique et des tests physico-chimiques et biochimiques, une purification par six repiquages successifs a permis d’obtenir une souche pure destinée à des essais de conservation. Deux techniques de conservation ont été utilisées : la réfrigération et la congélation sans/avec cryo-protecteur (glycérol 10%, saccharose12%). Un milieu de conservation a servi à l’élaboration des suspensions bactériennes à 10%. Un lot d’échantillons de la suspension bactérienne a été conservé à température ambiante, pour servir de témoin. L’estimation de la biomasse est réalisée par spectrophotométrie en utilisant un courbe étalon (loi de Beer Lambert). L’évolution de la biomasse est suivie par la mesure de la DO à longueur d'onde 600nm de suspensions bactériennes tous les 5 jours durant 20 jours d’entreposage. Les résultats obtenus indiquent une chute de la biomasse comme dans le cas des lots entreposés à la température ambiante (témoin). La biomasse initiale J0 à10%, diminue dans le cas de la réfrigération et de la congélation sans cryo-protecteur jusqu'à la 2.8 % à J0+15 et à 3.2% à J0+10 respectivement. La congélation avec cryo-protecteur (glycérol 10%) atteint 0.07 % à J0+15. Concernant la congélation avec (saccharose à 12%), les résultats n'ont pas été retenus car la lecture a donné des valeurs anormalement élevées, dues à la consistance du gel. Cette étude mérite d’être reprise en utilisant d’autres méthodes de mesure de la biomasse tels que la cellule Malassez ou le dénombrement. Des essais de conservation par lyophilisations sont également intéressants à entreprendre ; La lyophilisation étant une méthode efficace pour la conservation des bactéries. 42 Références bibliographiques Références bibliographiques A ABI AZAR R. (2007). Complexations des protéines laitières par les extraits de gousses vertes de caroubier Propriétés technologiques des coagulums obtenus. Thèse de Doctorat. AgroParisTech Ecole Doctorale Abies ,196p. ACCOLAS J.-P et AUCLAIR J. (1967). Conservation a l'état congeléde suspensions de bactéries lactiques concentées sous faible volume bactéries lcatiques mésophiles. 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Décoloration en Nombre de bactéries/ ml Qualité du lait 5 heures ou plus 100 000-200 000 Bonne 2 à 4 heures 200 000à 2 millions Bonne à passable Moins de 2 heures 2 à 10 millions Insuffisante 54 Annexes Annexe n°3 Préparation des dilutions (SIBOUKEUR, 2011). La dilution est réalisée afin de diminuer le nombre de colonies. Le meilleur résultat (colonies isolées) est statistiquement obtenu pour des boites comportant entre 30 et 300 colonies (MADIGAN et al., 2007). 1ml de lait camelin ou bovin collecté est prélevée aseptiquement à l’aide d’une pipette préalablement stérilisée. On aspire et on refoule le lait au moins une fois dans la pipette, avant d’effectuer le prélèvement. La pipette ne doit pas être plongée de plus de 1 à 2 cm dans le lait. La prise d’échantillon est introduite aseptiquement dans un tube contenant 9 ml de diluant. La pipette ne doit pas entrer en contact avec le diluant. Le tube est agité doucement mais suffisamment pour rendre la dilution homogène. Il faut éviter le barattage survenant au cours d’une agitation trop violente. A d’une nouvelle pipette stérile, aspirer et refouler le mélange à plusieurs reprises et prélever 1 ml de la première dilution (1/10), la pipette plongeant de 1 à 2 cm dans le liquide. Le millilitre de dilution est introduit dans un deuxième tube contenant 9 ml de diluant, on obtient ainsi la dilution au 1/100. Une troisième opération est effectuée de la même manière afin d’obtenir une dilution au 1/1000. Une quatrième opération est réalisée afin d’obtenir une dilution de 1/10000.Une nouvelle pipette stérile est employée pour chaque temps de ces dilutions. Annexe n°4 Coloration de Gram Déposer une goutte d‘eau physiologique stérile sur une lame bien propre ; Prélever un échantillon de colonie et mélanger avec la goutte d’eau, strier et sécher par passage rapide sur la flamme d’un bec benzène ; Couvrir le frottis par du cristal violet pendant 60 secondes ; Laver l’excès du colorant avec de l’eau distillée ; Couvrir de lugol pendant 30 secondes ; Laver à l’eau distillée pendant 5 secondes ; Rincer immédiatement le frottis avec le mélange alcool - acétone en inclinant la lame et par goutte à goutte jusqu’à disparition complète de la coloration violette; Laver à l’eau distillée pendant 5 secondes ; 55 Annexes Couvrir avec de la fuschine pendant 15 secondes Laver à l’eau distillée pendant 10 secondes Déposer une goutte d’huile à immersion sur le frottis et observer au microscope à un fort grossissement. Les cellules G+ absorbent la couleur du cristal violet et demeurent bleues violettes en apparence, contrairement aux cellules Gram- qui apparaissent distinctement 56 Annexes Annexe n°5 Etapes suivies pour conserver la souche isolée et purifiée 1 colonie pure Etape n°1 = = = = Le tube contient 1ml de bouillon M17 Incuber les 05 tubes à température 30°C pendant 24heures Etape n°2 1ml d'inoculum = = = = Le tube contient 9ml de bouillon M17 Incuber les 05 tubes à température 30°C pendant 24heures Etape n°3 Glycérol 10% Verser le tube précédent Erlenemeyer de 250ml contient 90ml de milieu de conservation pour prépare le pourcentage 10% 10%10% = 10% = = Saccharose 12% = 10% 10% Incuber les 05 tubes à température 30°C pendant 24heures 57 Annexes Etape n°4 Mesure de la turbidité à longueur d'onde 600nm et établissement d'un courbe étalonnage avec 10ml de la culture à 10%. Etape n°5: conservation de la souche Sans cryo-protecteur = Réfrigération congélation sans = T ambiante 58 Avec cryo-protecteur = = Glycérol 10% Saccharose 12% Résumé Contribution de l’étude de conservation d’une souche de lactocoques isolée caprin àpartir du lait La conservation de suspensions actives pendant des périodes assez longues permet leur utilisation en technologie, sous forme liquide, congelée ou lyophilisée. Dans ce contexte, cette étude est une contribution à la conservation, d'une souche de lactcoques (lactcoccus lactis) isolée à partir du lait caprin par deux techniques : réfrigération et congélation en l’absence et/ou présence de cryo-protecteur (glycérol 10%, saccharose 12%) des échantillons conservés à la température ambiante servie de témoin. Les résultats obtenus indiquent une chute de la biomasse quelque soit les conditions de conservation. En effet, la biomasse initiale J0 à10%, diminue dans le cas de la réfrigération et de la congélation sans cryo-protecteur jusqu'à la 2.8 % à J0+15 et à 3.2% à J0+10 respectivement. La congélation avec cryo-protecteur (glycérol 10%) atteint. Concernant la congélation avec saccharose à 12%), n’a pas pu. Mots clé : Lait, caprin, lactocoques, conservation, cryo-protecteurs Abstract Contribution to the study of conservation of a strain of Lactococcus isolated from goat milk Conservation of active suspensions for extended periods allows their use in technology, in liquid, frozen or lyophilized form. In this context, this study is a contribution to the conservation of a strain of lactcoques (lactcoccus lactis) isolated from goat milk by two techniques: cooling and freezing in the absence and / or presence of cryo-protective (glycerol 10% sucrose 12%) of the samples stored at room temperature served as control. The results indicate a decline in biomass whatever the storage conditions. Indeed, the initial biomass D0 to 10%, decreases in the case of the refrigerating and freezing cryo-protector without 2.8 to 15% and at day 0 at 3.2% to 10 J0 respectively. Freezing with cryo-protective (10% glycerol) achieved. On freezing with sucrose 12%), the Beer-Lambert law is not verified. Keywords: Milk, goat, Lactococcus, conservation, cryo-protective. الملخص المعزولة من حليب الماعزlactocoques مذخل في دراسة حفظ الساللة , عهً شكم سائم, من أجم انسماح باسخعمانها فٍ انصناعت انغزائُت, دفظ مذهىل بكخُشٌ نشط خالل فخشاث صمنُت طىَهت انمذي راث اننىعlactcoques حهذف هزه انذساست إنً انمساهمت فٍ دفظ انسالنت, فٍ هزا اإلطاس. مثهج او مجفف بانخجمُذ انخخضَن فٍ انبشاد وانخخضَن فٍ انمجمذ بىجىد أو عذو وجىد: بخقنُخُن, انمعضول من دهُب انماعض,(lactcoccus lactis) اننخائج انمخذصم. وانعُناث مذفىظت فٍ دسجت دشاسة عادَت كشاهذ, ) 12% انسكشوص بنسبت,10% انذافظ (انجهُسشول بنسبت نكم من حقنُت حخضَن فٍ انبشاد و حقنُت%3.2 و2.8 إنً غاَت%10 عهُها حىضخ نضول نهكخهت انبكخُشَت انمخضنت باننسبت االبخذائُت )10% أما بما َخعهق بخقنُت حخضَن بىجىد دافظ (انجهُسشول بنسبت, عهً انخشحُبJ0+10 وJ0+15 حخضَن فٍ انمجمذ فٍ انُىو ; أما فٍ ما َخص حقنُت حخضَن بىجىد دافظ من نىعJ0+15 فٍ انُىو0.07 % انً غاَت10 % اننخائج كانج كماَهٍ من . اننخائج انمخذصم عهُها كانج عباسة عن قُاط ننسبت حشكُض انسكشوص فٍ انعُنت انمخضنت12 % سكشوص . انذافظ, حقنُت حخضَن, lactocoques, , انماعض, دهُب:الكلمات المفتاحية