Mémoire MASTER ACADEMIQUE Thème Contribution à l`étude de

UNIVERSITE KASDI MERBAH, OUARGLA
FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
ET SCIENCES DE LA TERRE ET DE L'UNIVERS
DEPARTEMENT DES SCIENCES AGRONOMIQUES
Mémoire
MASTER ACADEMIQUE
Domaine: Sciences de la nature et de la vie
Filière: Biologie
Spécialité: Microbiologie appliquée
Présenté par: DECHACHE Aicha
MOFRADJ Zitouna
Thème
Contribution à l’étude de conservation d'une souche de lactocoques
isolée à partir du lait caprin
Soutenu publiquement
Le : 09/06/2014
Devant le jury:
Président: KHALLEF Sakina
M.A.A
UKM Ouargla
Encadreur: SIBOUKEUR Oumelkheir Professeur
UKM Ouargla
Co-encadreur: SIBOUKEUR Amina
M.A.B
UKM Ouargla
Examinateur: BOURICHA M'Hamed
M.A.B
UKM Ouargla
Examinatrice: BALLA Asma
M.A.B
UKM Ouargla
Année université: 2013/2014
Remerciements
Avant tout, nous remercions Dieu le tout puissant, le Miséricordieux, de nous avoir
donné le courage, la force, la santé et la persistance.
Nous remercions notre promotrice Professeur SIBOUKEUR Oumelkheir et Mme
SIBOUKEUR Amina Maître
Assistante B du Département des Sciences Biologiques ; Faculté des Sciences de la
Nature et de la Vie, Université Kasdi Merbah d’Ouargla, pour l’honneur qu’elles
nous ont fait en dirigeant ce travail, pour leurs aide, leurs conseils, tout au long de
l’élaboration de ce modeste travail
A Mme KHALLEF Sakina Maitre Assistante A, du Département des Sciences
Biologiques ; Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, Université Kasdi
Merbah d’Ouargla, nous adressons nos remerciements les plus sincères pour
l’honneur qu’elle nous fait en acceptant de présider ce jury.
A Mr. BOURICHA M’Hamed et Melle BALLA Asma, Maitres-assistants B, du
Département des Sciences Biologiques ; Faculté des Sciences de la Nature et de la
Vie, Université Kasdi Merbah d’Ouargla pour l’honneur qu’ils nous font en
acceptant de bien vouloir juger ce travail.
A Mr. Le Professeur CHEHMA Abdelmadjid, Directeur du Laboratoire Bioressource, nous adressons notre profonde gratitude pour nous avoir permis d’accéder
à son laboratoire.
Au personnel des laboratoires, surtout Mr. BEGARI El Aich, Premier Responsable
des laboratoires pédagogiques, Mme KACI Safia, Magister en Sciences
Agronomiques et Melle KHAMGAOUI Amina Responsable du laboratoire
pédagogique de microbiologie, nous adressons notre profonde reconnaissance pour
leur soutien et leur infini gentillesse.
Que Mesdemoiselles SOUID Wafa et BOUDERHEM Amel, Maitres- Assistantes du
Département des Sciences Biologiques ; Faculté des Sciences de la Nature et de la
Vie, Université Kasdi Merbah d’Ouargla trouvent ici l’expression de notre gratitude
pour leurs conseils et orientations.
Enfin, nous remercions, tous ceux qui de près ou de loin, ont contribué à la
réalisation de ce travail.
Dédicace
Grace à Allah …
Je dédie ce modeste travail à :
Ma chère mère Massaouda, pour l’affection et l’amour qui m’ont donné le
courage et la force dans les moments les plus difficiles.
Mes chères sœurs : Nissa, Fatima, Fatiha, Sarah, sans que j’oublie mes deux
nièces : Randa et chaima
Mon frère unique : Mohammed
Toutes mes amies, surtout ; Zekri Maria, Djalabi Fatima el-zohra, Boukhloua
Samia, Gharbal aldjia, et particulièrement, ma binôme Dechache Aicha.
J’aimerai bien leur dire : que suis très heureuse de passer tous ces années avec
eux, des liens crées, de nouvelles amitiés, ainsi que, pour tous les moments
passés ensemble et ceux encore à venir.
En fin je dédie ce travail à toute la promotion 2èmeMaster Microbiologie
Appliquée 2014.
Zitouna
Dédicaces
Je dédie ce mémoire à :
Ma très chère mère : Halima ;
A mon père : Mohamed ;
A mes sœurs : Fatima, Dalila, Massaouda
A mes frères : Djamel, Aissa, Khaled ;
A ma belle binôme : Zitouna;A mon
A toute ma famille ;
A tous mes chers amis surtout : Meriem, Samiha
Aicha
Liste des abréviations
Ca
Calcium
CPE
Cryo-protecteur extracellulaire
°D
Degré Doric
DO
Densité optique
G+
GRAM positif
H2O2
Le peroxyde d'hydrogène
IgG
Immunoglobuline G
IgM
Immunoglobuline M
L(+)
L'acide lactique
Lc
Lactococcus
OSCN-
L'hypothiocyanate
P
Phosphate
SCN
Thiocyanate
T
Température
TB
Le taux butyreux
TP
Le taux protéique
Liste des figures
Figures
Intitulé
page
Dégradation du glucose par les bactéries lactiques (De
1
ROISSART et LUQUET, 1994)
12
2
Procédure expérimentale
25
3
Etapes suivies pour conserver la souche isolée et purifiée
31
Courbe d'étalonnage de la souche 1 isolée sur gélose M17
4
5
36
Evolution de la biomasse conservée 20J à la T. ambiante
38
Evolution de la concentration bactérienne de la souche conservée à
6
la réfrigération
39
Evolution de la concentration bactérienne de la souche conservée à
7
la congélation sans cryo-protecteur
39
Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée
8
à la congélation avec cryo-protecteur Glycérol (10%)
40
Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée
9
à la congélation avec cryo-protecteur Saccharose (12%)
41
Liste des tableaux
N°
I
II
III
Intitulé
Germes typiques de la flore du lait cru (JAKOB et al., 2009)
Constitution des lots expérimentaux
Caractéristiques physico-chimiques de l'échantillon de lait caprin
page
15
30
31
Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques
VI
de la souche de lactocoque
35
Résultats [ ] de la biomasse bactérienne en % après 5 jours pendant
V
20jours.
37
Table des matières
Remerciements
Dédicace
Liste des abréviations
Liste des tableaux
Liste des figures
Introduction
01
Synthèse bibliographique
1.1 Généralités
1.1.1 Chèvre
1.1.2 Avantages de l'élevage caprin
1.1.3 Exigence de l'élevage caprin
1.1.4 principales races de l'élevage caprin algérienne
1.1.4.1 L'arabia
1.1.4.2 La Makatia
1.1.4.3 La chèvre du M'zab
1.1.4.4 La chèvre Kabyle (naine de kabyle)
1.1.4.5 La montagnarde des Aurès
1.1.5 La production laitière caprine
1.2 Le lait de chèvre
1.2.1Compositions et propriétés physic-chimiques du lait
1.2.2 Propriétés médicales
1.2.2.1 Immunoglobulines
1.2.1.2 Lactoferrine
1.2.2.3 Lactoperoxydase
1.2.3 Technologiques fermière du lait caprin
1.3 Bactéries lactiques
1.3.1 Définition et caractéristiques des bactèries lactiques
1.3.2 Applications des bactéries lactiques
1.3.3 Propriétés fonctionnelles et technologiques recherchées
1.3.3.1 Activité acidifiante
1.3.3.2 Production de métabolites d'intérêt
1.3.3.3 Propriétés enzymatiques
1.3.3.4 Propriétés spécifiques aux probiotiques
1.3.3.5 Critères de performance
1.3.4 Microbiologie du lait chèvre
1.3.5 Caractéristique de Lactococcus lactis
1.3.5.1 Habitat
1.3.6 Utilisation industrielle des ferments lactiques
1.3.7 Avantages de l’utilisation des ferments concentrés
1.4 Conservation et formes commerciales des ferments lactiques
1.4.1 Congélation
1.4.2 Réfrigération
03
03
03
03
04
04
05
05
05
05
05
06
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08
08
09
10
10
13
13
13
14
14
14
14
14
16
17
17
18
18
18
19
1.5 Cryoprotection des bactéries lactiques
1.5.1 Mécanisme d’action des cryoprotecteurs
19
20
II- Matériel et méthodes
2.1 Matériel d’étude
2.1.1 Lait de chèvre
2.1.2 Milieux de culture
2.1.2.1 Milieu d'isolement, purification (M17)
2.1.2.2 Milieu de conservation
2.1.3 Appareillage
2.1.4 Petit materiel
2.1.5 Produits chimiques et réactifs
2.2 Méthodes analytiques
2.2.1 Analyses physico-chimiques du lait
2.2.1.1 Mesure du pH
2.2.1.2 Acidité Dornic
2.2.1.3 Densité
2.2.2 Analyses microbiologiques
2.2.2.1Test de réductase
2.2.2.2 Isolement de la souche
2.2.2.3 Ensemencement dans un milieu sélectif
2.2.2.4 Pré-identification de la souche
2.2.2.4.1 Analyses préliminaires
2.2.2.4.1.1 Etude morphologique
2.2.2.4.1.1.1Observation macroscopique
2.2.2.4.1.1.2 Observation microscopique
2.2.2.4.1.1.2.1 Examen à l'état frais
2.2.2.4.1.1.2.2 Examen après double coloration de GRAM
2.2.2.4.1.1.2.3 Test de catalase
2.2.2.4.2 Pré-identification physico-chimiques et biochimiques
2.2.2.4.2.1 Tests physico-chimiques des souches
2.2.2.4.2.1.1 Croissance à différentes temperature
2.2.2.4.2.1.2 Tolérance à la salinité
2.2.2.4.2.1.3 Tolérance au pH alcalin
2.2.2.4.2.2 Tests biochimiques des souches
2.2.2.4.2.2.1Type fermentaire
2.2.2.4.3 Purification par repiquage successif
2.2.2.5 Propagation de la souche
2.2.2.6 Mesure de la croissance de la souche isolée
2.2.2.6.1 Mesure de la turbidité
2.2.2.6.2 Courbe d'étalonnage
2.2.3 Conservation des souches isolées
22
22
22
22
22
22
23
23
23
23
23
23
23
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24
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26
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27
27
28
28
28
28
28
28
28
28
28
29
29
29
30
2.2.4 Suivi de la croissance par densité optique
30
III- Résultats et discussion
3.1 Qualité physico-chimique du lait
31
3.1.1 Mesure du pH
31
3.1.2 Acidité titrable
31
3.1.3 Densité
32
3.2 Analyses microbiologiques
32
3.2.1 Test de réductase
32
3.2.2 Test de catalase
32
3.3 Isolement, pré-identification et purification de la souche
33
3.3.1 Isolement de la souche
33
3.3.1.1 Observations macroscopiques
33
3.3.1.2 Observations microscopiques
33
3.3.2 Pré-identification de la souche
33
3.3.2.1 Caractéristiques morphologiques, microscopiques, physico-chimiques et
biochimiques des deux souches isolées
33
3.3.3 Purification
35
3.4 Propagation de la souche
36
3.4.1 Courbe d’étalonnage
36
3.5 Conservation de la souche isolée
36
3.5.1 Température ambiante
37
3.5.2 Réfrigération
38
3.5.3 Congélation sans cryo-protecteur
39
3.5.4 Congélation avec cryo-protecteur
40
3.5.4.1 Glycérol
40
3.5.4.2 Saccharose
41
Conclusion
42
Références bibliographiques
43
Annexes
Introduction
Introduction
Introduction
Le lait est un aliment de couleur généralement blanchâtre produit par les mammifères
femelles (KECHAOUI, 2013).
L'intérêt nutritionnel du lait réside dans sa richesse en nutriments de base (MOULEK,
2011), comme les protéines de qualité, contenant les acides aminés essentiels c'est-à-dire des
acides aminés que l'Homme doit se procurer par son alimentation car incapable de les
synthétiser lui-même (FICOW, 2010). Les lipides
représentant une source importante
d'énergie, car ils sont métabolisés dans la mitochondrie des cellules qui récupèrent leur
énergie chimique pour synthétiser de l'ATP (DESJEUX, 1993), et les glucides. Le sucre
principal du lait est le lactose, c'est le composé prépondérant d e la matière sèche totale.
Le lait contient un certain nombre de minéraux. Leur concentration totale est inférieure à
1% du poids total. Les sels les plus importants sont les sels de calcium, de sodium, de
potassium, et de magnésium. Les sels de potassium et de calcium sont les plus abondants dans
le lait ordinaire (KEBCHAOUI, 2013). Le lait est également riche en vitamines A, B, D et
E, des vitamines liposolubles liées à sa matière grasse (FICOW, 2010).
En Algérie, il y a une spécialisation des zones Agro-écologiques en matière d'élevage. Les
parcours steppiques sont le domaine de prédilection de l'élevage ovin et caprin avec plus de
24 millions de têtes qui y vivent entrainant une surexploitation de ces pâturages. L'élevage
caprin vient en seconde position avec 4.7 millions de têtes, c'est-à-dire 14% comprenant 50%
de chèvres. Il se trouve concentré essentiellement dans les zones montagneuses, les hauts
plateaux et les régions arides (MAMI, 2013).
Le lait de chèvre est considéré comme étant l'un des plus complets et des mieux équilibrés
parmi les laits (AMROUN‐LAGA ET ZERROUKI, 2011).
Le lait est l'un des rares aliments qui convient pour les différentes tranches d'âge où il peut
être consommé tel quel à l'état frais ou transformé, notamment en fromage ou en yaourt
(MOULEK, 2011). Dans cette transformation, les bactéries lactiques composant la
microflore du lait cru, participe de façon importante à l'élaboration des caractéristiques
organoleptiques des produits laitiers fermentés. De nombreuses études montrent que les
produits laitiers préparés traditionnellement à partir du lait cru ont des saveurs typiques et des
qualités nutritionnelles de plus en plus recherchées par le consommateur (BALLA, 2011).
Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans la fermentation de différents aliments.
Leur capacité à produire des acides organiques accompagnés de l'abaissement du pH est le facteur
majeur par lequel ces dernières inhibent la croissance des autres microorganismes concurrents
1
Introduction
D'autres métabolites tels que le peroxyde d'hydrogène, l’alcool et le diacetyl synthétisés par les
bactéries lactiques peuvent aussi contribuer à la conservation des produits agro-alimentaires.
L'existence d'un souchier au niveau d'une usine de transformation du lait permet d'assurer une
meilleure régularité des fabrications et une réalisation en routine de l'ensemencement direct
du lait. Il existe plusieurs méthodes de conservation des souches. Toutefois celles-ci affectent
souvent la viabilité des souches d'intérêt, en l'occurrence les souches acidifiantes et/ou les
souches aromatisantes, si certaines précautions ne sont pas prises. Parmi les nombreux
facteurs qui interviennent efficacement sur la survie des souches, l'addition de cryoprotecteurs au milieu de conservation. Ces substances permettent aux cellules bactériennes de
mieux supporter les basses températures lors des traitements de conservation et/ou lors du
stockage (BALLA, 2011).
L'objectif de ce travail, vise à la conservation d’une souche de lactocoques isolée à partir
du lait caprin cru, en suivant les étapes:

Isolement de la souche sur milieu sélectif;

Pré-identification, par des tests physico-chimiques et biochimiques;

Repiquages successifs afin de la purifier;

Conservation de la souche dans un milieu de conservation sous différentes conditions:
T. (Température) ambiante (témoin), réfrigération, congélation sans cryo-protecteur, et
congélation avec cryo-protecteur (Glycérol 10% et Saccharose 12%).
2
I Synthèse bibliographique
Synthèse bibliographique
1.1 Généralités
1.1.1 Chèvre
Les chèvres ont de tout temps joué divers rôles, dans la religion, l’économie, la nutrition,
les coutumes, et même l’habillement de l’Homme. Les chèvres ont ainsi
été utilisées pour
différentes raisons, comme la production de lait, de viande, de fibres, de cuir…etc (DUBEUF
et al., 2004).
Elle appartient au genre Capra à la sous famille des Caprinés, de la famille des Bovidés. Ces
derniers dérivent du sous-ordre des ruminants, classe des mammifères pourvus d’un placenta
(sous classe Placentaires) et qui se regroupent dans l’embranchement des vertébrés du règne
animal (MANALLAH, 2012).
La chèvre domestique dont le nom scientifique est Capra hircus appartient:
Domestiquée, il y plus de 10.000 ans avant Jésus-Christ, la chèvre (Capra Hircus) est réputée
pour sa rusticité. C’est un animal adapté aux conditions rudes et à la sécheresse (SHKOLNIK
et al., 1980).
1.1.2 Avantages de l'élevage caprin
La chèvre représente pour le petit paysan un certain nombre d'avantages:
- Animal de petite taille ;
- Coût relativement bas ;
- Elevage comportant moins de risques ;
- Facile à nourrir ;
- Relativement plus féconde ;
-
Adaptée aux régions arides et semi arides ;
-
Résistante à certaines maladies (maladie du sommeil) (CARL et KEES VAN, 2004).
1.1.3 Exigence de l’élevage caprin
Le bien être et la productivité de la chèvre dépendent dans une large mesure de son
alimentation.
3
Synthèse bibliographique
Une alimentation conforme doit :

Favoriser l’ingestion durant les phases aux besoins élevés, d’un fourrage de bonne
qualité ;

Adapter l’apport en nutriment et en minéraux aux différents phases du cycle de
production, telles que la gestation et la période d’allaitement ;

Permettre l’accès au pâturage dès que les conditions le permettent ;

Etre composée d’au moins 60% de la ration journalière en fourrage grossiers ;

Pouvoir
L’apport
améliorer le profil d’acides gras du lait et donc celui du fromage.
de l’herbe verte et du foin d’augmente la teneur
en acides gras
polyinsaturé et diminue celle des acides gras saturés (LEGARTO et PALHIERE,
2013).
1.1.4 Principales races caprines algérienne
L'espèce caprine se présente en Algérie sous la forme d'une mosaïque de populations
très variées appartenant toutes à des populations traditionnelles. Elle comprend en plus de ces
populations locales, à sang généralement Nubien, des animaux mélangés aux sangs issus de
races standardisées. La population caprine d'Algérie renferme 05 types majeurs, l’Arabia, la
Makatia, la chèvre du M'zab, la chèvre Kabyle (naine de kabyle), la montagnarde des Aurès
(TEJANI, 2010).
1.1.4.1 L'Arabia
La plus dominante de ces populations est la chèvre arabe dite population Arabomaghrébine. Elle se localise en zones steppiques ou semi steppiques et présente un format peu
développé, brun foncé et dépourvue de corne. Au niveau phénotypique, elle manifeste des
caractères plus homogènes: Robe noire à long poils, pattes blanches au dessus du genou, raies
blanches et fauves sur le visage, tâches blanches à l'arrière des cuisses. Cet animal est
parfaitement adapté aux contraintes des parcours et semble posséder de bonnes aptitudes de
reproduction. La chèvre est principalement élevée pour la viande de chevreaux même si son
lait, produit en faible quantité, représente un intérêt indéniable (TEJANI, 2010).
4
Synthèse bibliographique
1.1.4.2 La Makatia
Aux caractères assez hétérogènes, robe polychrome aux poils courts, oreilles
tombantes, elle semble être le produit de multiples croisements réalisés à partir de races
méditerranéennes. Elle est peu résistante sur les parcours et son intérêt réside dans sa
production laitière et son adaptation à l'environnement. Ces animaux sont également
saisonnés (TEJANI, 2010).
1.1.4.3 La chèvre du M'zab
Elle se trouve surtout dans le sud et serait un noyau de l'Ombrine qui est une bonne
laitière et très féconde. Cette race est très appréciée dans l'Est méditerranéen pour sa capacité
laitière et fait partie du rameau Nubio-Syrien (TEJANI K, 2010).
1.1.4.4 La chèvre Kabyle (naine de kabyle)
C'est une chèvre autochtone qui peuple les massifs montagneux de la Kabylie et des
Aurès. Elle est robuste et massive, de petite taille, de couleur noirâtre ou blanchâtre avec de
longs poils. C’est une mauvaise laitière et est appréciée plutôt pour sa viande (TEJANI,
2010).
1.1.4.5 La montagnarde des Aurès
C’est une chèvre qui ressemble au type de Kabylie. Elle est très appréciée pour la
quantité et la longueur de ses poils. Elle se distingue des autres populations par la longueur
des oreilles allongées, constituant une défense contre les effets de la sécheresse et par la
longueur des poils qui est à la base d'une industrie artisanale (TEJANI, 2010).
1.1.5 Production laitière caprine
Le consommateur recherche de plus en plus des produits particuliers en matière
d’origine et de goût. C’est pourquoi les produits à basede lait de chèvre sont très recherchés et
la production a fortement augmenté
au cours de ces dernières années. Alors que de
nombreuses chèvres sont détenues en petits troupeaux et que leur élevage représente souvent
une activité accessoire, 20.000 tonnes de lait de chèvre au France, sont transformée chaque
année, en fromage et en d’autres produits à base de lait. Afin de pouvoir garantir la qualité et
5
Synthèse bibliographique
la sécurité des produits, le besoin de méthodes simples et fiables pour la surveillance de la
qualité du lait de chèvre croît (WALTER, 2007).
1.2 Le lait de chèvre
Le lait de chèvre est un liquide blanc ou mât, due à l’absence de β-carotène
contrairement au lait de vache. Il a une odeur assez neutre. Parfois en fin de lactation, une
odeur caprine apparait et après stockage au froid il acquiert
une saveur caractéristique
(BOSSET et al, 2000). Il donne une impression bien homogène c'est-à-dire ni trop fluide ni
trop épais. Du point de vue de ses qualités nutritives et digestives, le lait de chèvre possède
une bonne valeur nutritionnelle.
Ces qualités diététiques sont la conséquence d'un certain nombre de caractéristiques
physico-chimiques et microbiologiques (MONTEL, 2003).
1.2.1 Composition et propriétés physico-chimiques du lait
Le lait de chèvre a une composition et des caractères physico-chimiques particuliers
qui les différencient nettement du lait de vache (ABI AZAR, 2007). Le lait sécrété par les
différentes espèces de mammifères présentent des caractéristiques communes, et contient les
mêmes catégories de composantes : eau, matière grasse, lactose, minéraux
et protéines
(CHILLIARD et SAUVANT, 1987).
Le pH du lait normal varie de 6,2 à 6,8. La majorité des laits ont un pH situé entre 6,4
et 6,6 et l'acidité entre 14 - 18° Dornic. Sa densité à 15°C est de l’ordre de 1.027-1.035 et son
point d’ébullition de l’ordre 100.5°C. Le point de congélation varie entre - 0,550 et - 0,583°C
(ANSART, 1995). Sa teneur en eau égale à 87% (AMIOT et al., 2002).
La matière grasse représente une source importante d’énergie. Elle se présente sous
forme de
triglycérides, pauvres en acides gras polyinsaturés qui sont nécessaires au
métabolisme humain (TOUHAMI, 1996). Le lait caprin est aussi plus difficile à écrémer que
le lait de vache du fait que les globules gras caprins se démarquent par leur petite taille
(HOLMES et al, 1945 ; JEAN AMIOT et al., 2002). Il se caractérise par la présence,
d’acides gras à chaîne relativement courte (dont les acides caproïque et caprylique) qui
peuvent être absorbés par un mécanisme plus simple que celui des acides gras à chaîne longue
(DESJEUX, 1993).
6
Synthèse bibliographique
Le lactose est le glucide le plus important du lait, d’autres glucides peuvent provenir
de l’hydrolyse du lactose (glucose, galactose). Certains glucides peuvent se combiner aux
protéines, formant des glycoprotéines ou peuvent se trouver sous forme libre (HOLMES et
al, 1945 ; AMIOT et al., 2002). Il constitue ainsi de source d’énergie et un apport de
galactose pour le développement du système nerveux central (MAHE, 1996).
Le lait de chèvre est moins riche en lactose, par rapport au lait humain (70g/l), avec
une variation allant de 40.6 à 42.7 g/l. Sa teneur en ce nutriment est proche de celle du le lait
de vache (44.13g/l) (MOUALEK, 2011 ; SIBOUKEUR, 2007).
Le lait contient tous les minéraux considérés comme essentiels pour la nutrition
humaine (KEBCHAOUI, 2013). La composition minérale du lait de chèvre est proche de
celle du lait de vache. Il est légèrement plus riche en Calcium (Ca) et phosphate (P) et
nettement plus riche en Magnésium, Potassium et Chlore (GUEGUEN, 1996).
Le lait de chèvre est pauvre en carotène et en acide folique (B9) (AMIOT et al.,
2002).
Le taux de caséine totale est un peu plus faible dans le lait de chèvre que dans le lait
de vache. Il représente 75% de matière protéique contre et 78 % dans le lait de vache (G
RICORDEAU, 1993 ; ABI AZAR, 2007 ; KEBCHAOUI, 2013).
De plus l'équilibre entre les différentes fractions caséiniques est très différent et se
caractérise par deux proportions 20 et 50 % de caséine Kappa et β alors qu'elle est de 13 et
34% dans le lait de vache (RICORDEAU, 1993 ; ABI AZAR, 2007 ; KEBCHAOUI,
2013). La taille moyenne des micelles du lait de chèvre est inférieure à celle du lait de vache
(HENNANE, 2011).
Le lait de chèvre est plus riche en protéines solubles que le lait de vache soit, 8.10
% contre 6.0 %. La β- lactoglobuline est la protéine majeure du lactosérum du lait caprin.
Elle représente environ 55% soit plus de 4.4g/l de lait contre 25% pour le lait bovin (FAO,
1998).
1.2.2 Propriétés médicinales
7
Synthèse bibliographique
Le lait de chèvre est supposé porteur de vertus diététiques et thérapeutiques qui en font
un produit de qualité. Il aurait une meilleure influence sur la prévention de l’ostéoporose et
l’athérosclérose. Il préviendrait la prévention les inflammations des artères, et toutes les
maladies dans lesquelles le stress oxydatif joue un rôle : inflammations, vieillissement,
fertilité réduite chez l’homme, schizophrénie, cancer, maladies cardio-vasculaires. Les
oligosaccharides dans le lait de chèvre protègent contre les bactéries pathogènes dans les
intestins, et stimulent la croissance des bifido-bactéries dans le tractus gastro-intestinal
(FRANK, 2003).
Il existe également un nombre important d’espèces quantitativements mineures, dont
certaines jouent un rôle essentiel dans la protection du petit. C’est le cas des
immunoglobulines, la lactoferrine, la lactoperoxydase (DORA, 2007).
1.2.2.1 Immunoglobulines
D’une grande hétérogénéité, les immunoglobulines constituent un groupe protéique
complexe et différent significativement des autres protéines sériques (EIGEL et al, 1984).
Sur les 5 classes d’immunoglobulines seules les IgG, IgA et IgM se retrouvent dans le lait
caprin (PARK et al, 2007). La fonction protectrice de ces protéines, s’exprime à travers le
lait d’une part par la protection des glandes mammaires et d’autre part par celle du nouveau
né (DE WIT, 1998 ; MARSHALL, 2004).
1.2.2.2 Lactoferrine
Métallo glycoprotéine fixatrice du fer (HURLEY et al, 1993 ; MARSHALL, 2004),
la lactoferrine joue le rôle de promoteur dans l’absorption intestinale de celui-ci (HURLEY et
al, 1993). De plus, du fait de son homologie avec la transferrine, elle est souvent qualifiée de
lactotransferrine (VOJTECH et al, 2008).
Vu ses propriétés bactériostatiques (SHUSTER et HARMON, 1990), par
ferriprivation (MAYNARD et al, 1989), sa concentration dans le lait est un indice de
résistance des glandes mammaires à l’implantation d’une infection bactérienne (SHUSTER et
HARMON, 1990 ; RIBADEAU-DUMAS, 1991).
1.2.2.3 Lactoperoxydase
8
Synthèse bibliographique
Enzyme la plus abondante du lait (RIBADEAU-DUMAS et GRAPPIN, 1989), la
lactoperoxydase est connue pour son caractère bactéricide du fait qu’elle est le catalyseur de
l’oxydation par le peroxyde d’hydrogène (H2O2) du thiocyanate (SCN) donnant naissance à
l’hypothiocyanate (OSCN-) (RIBADEAU-DUMAS et GRAPPIN, 1989 ; RIBADEAUDUMAS, et al, 1991). L’hypothiocyanate est un puissant antibactérien. Du fait de cette
caractéristique bactéricide, la lactoperoxydase est utilisée comme agent protecteur du lait cru
en particulier dans les régions tropicales (RIBADEAU-DUMAS et GRAPPIN, 1989).
1.2.3 Technologie fermière du lait caprin
Traditionnellement, la production fermière de fromages à partir du lait de chèvre se
base sur l’action des bactéries lactiques (LEFRILEUX et al., 2009). Ces dernières
interviennent dans de nombreuses transformations du lait en crème maturée, en laits
fermentés,
en
yaourts,
en
fromages
frais
et
affinés (DESMAZEAUD,
1998).
L'ensemencement est assuré par le repiquage du lactosérum issu de la fabrication précédente
(technique de pieds de cuve) (LEFRILEUX et al., 2009). Le lait de chèvre est plus pauvre
en caséines que le lait de vache. Son rendement fromager est par conséquence plus faible. Ce
sont les spécificités de la composition de sa matière grasse qui donnent au fromage de chèvre
son goût caractéristique. Le lactose, et surtout les l’équilibre minéral (Ca, P), facteurs de
variations qui sont:la race et la conduite d'élevage (nutrition, reproduction, saisonnalité) sont à
l’origine des particulaires de ce lait (ZELLER, 2005). Même si un certain nombre de
recherches ont permis de faire le point sur les facteurs alimentaires influant par exemple sur le
taux butyreux (TB) ou le taux protéique (TP) du lait caprin, ainsi que leurs effets sur l'aptitude
à la coagulation, le lien entre l'alimentation des animaux et la composition azotée et minérale
du lait et des produits laitiers a fait l'objet de peu de travaux concernant cette espèce. A partir
de données collectées dans des exploitations caprines, un lien entre l'alimentation des chèvres
et le profil des courbes d'acidification en technologie lactique a été mis en évidence. La
présence d'urée en excès dans le lait de cette espèce a été suspectée dans l’apparition de
défauts de caillage en technologie lactique, ou dans un ralentissement de l’acidification en
technologie pâte pressée non cuite (LEFRILEUX et al., 2009). Il existe deux procédés de
fabrication du fromage de chèvre. Le plus répandu utilise des bactéries lactiques pour la
coagulation. C’est un procédé naturel, lent qui donne un caillé friable et perméable. L’autre
technique consiste à ajouter de la présure et on obtient assez rapidement un caillé ferme et
imperméable (ZELLER, 2005).
9
Synthèse bibliographique
1.3 Bactéries lactiques
Bien avant que l'on soit conscient de l'existence des bactéries lactiques, elles avaient
été utilisées dans la conservation des aliments à base de lait, de viande, de poissons, de
légumes et de fruits (PAUL ROSSE et al., 2002). Pour trouver la cause de la coagulation acide
du lait, les chercheurs ont conclu que la présence de bactéries lactiques était responsable de
l’acidification du lait et de la maturation de la crème (De ROISSART et LUQUET, 1994 ;
VALERIE et al, 2003).
1.3.1 Définition et caractéristiques des bactéries lactiques
Les bactéries lactiques sont des cellules vivantes, procaryotes, hétérotrophes et
chimio-organotrophes. Elles forment un groupe hétérogène composé de coques et de bacilles,
dont la principale caractéristique est la production d'acide lactique à partir de la fermentation
des sucres. Non pathogènes, à quelques exceptions près, la majorité de bactéries lactiques ces
sont GRAM positives (G+), immobiles, asporulée. Elles sont anaérobies facultatives mais
aérotolérantes. Elles
ne produisent pas de catalase mais certaines souches possèdent une
pseudo-catalase. Elles sont
nitrate réductase, et
cytochrome oxydase négative. Elles
colonisent des milieux naturels variés tels que la surface des végétaux et les muqueuses des
mammifères (intestin, bouches, vagin et surface de la peau). Elles ont des exigences
nutritionnelles nombreuses (acides aminés, peptides, sels, acides gras et glucides) (HOGG,
2005; BADIS et al., 2005).
Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans la fermentation de différents
aliments. Leur capacité à produire des acides organiques responsables de l’abaissement du pH
leur permet d’inhiber la croissance des autres microorganismes concurrents. D’autres
métabolites tels que le peroxyde d’hydrogène, l’alcool et le diacetyl synthétisés par les
bactéries lactiques peuvent aussi contribuer à la conservation des produits alimentaires par
l’inhibition de la croissance de la flore indésirable.
De plus ces dernières peuvent synthétiser des composés inhibiteurs de nature
protéique appelés bactériocines (SIBOUKEUR, 2011 ; SOUID, 2011).
Toutes les bactéries lactiques ont un métabolisme fermentaire strictement
saccharolytique qui, en utilisant les glucides, peuvent produire soit de:
10
Synthèse bibliographique
-
L'acide lactique exclusivement (bactéries homolactiques strictes), (Fig.1)
-
L'acide lactique et de l'acide acétique (bactéries hétérolactiques facultatives),
-
L'acide lactique, de l'acide acétique ou de l'éthanol et de CO2 (bactéries
hétérolactiques strictes) (VANDAMM et al., 1996). (Fig.1)
Certaines espèces ou certaines souches peuvent en outre produire de l'acide formique
ou de l'acide succinique.
Parmi les nombreux genres
de bactéries lactiques (Aerococcus, Alloiococcus,
Atopobium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus,
Pediococcus…) le genre Lactococcus joue un rôle important dans
l’industrie agro-
alimentaire.
Toutefois, il est important de souligner, l’appartenant du genre Bifidobacterium aux
bactéries lactiques du fait de son effet probiotique et de son utilisation dans le secteur
alimentaire.
11
Synthèse bibliographique
Figure 1 : Dégradation du glucose par les bactéries lactiques (De ROISSART et
LUQUET, 1994
12
Synthèse bibliographique
1.3.2 Applications des bactéries lactiques
Les bactéries lactiques présentent des activités métaboliques assez diversifiées et une
capacité d'adaptation à différents environnements (SALMINEN et VON WARTGHI, 2012).
Cette diversité est responsable de leur large gamme d'applications à l'échelle industrielle.
Dans l'industrie alimentaire, ces microorganismes permettent la conversion d'une grande
variété de matières premières, conduisant ainsi à de nombreux produits. Les saucissons, les
laits fermentés et les fromages représentent des produits fabriqués à partir de matières
premières d'origine animale, tandis que la choucroute, les olives et certains vins (fermentation
malolactique) sont des exemples de transformation de matières premières d'origine végétale.
Parmi ces applications, l'industrie laitière est, sans doute, le plus grand consommateur de
ferments lactiques commerciaux, pour la production de laits fermentés, fromages, crèmes et
beurres (EGON, 2002). La fermentation du lait par les bactéries lactiques est à l'origine d’un
nombre important de produits différents, chacun possédant des caractéristiques spécifiques
d’arôme, de texture et de qualité (MAYRA-MAKINEM et BIGRET, 1998). Les bactéries
lactiques sont également utilisées dans l'industrie chimique (production d’acide lactique),
dans le domaine médical (notamment pour le traitement de dysfonctionnements intestinaux)
et dans l’industrie des additifs alimentaires (production d'exo polysaccharides et de mannitol)
(RUAS-MADIEDO et al., 2002 ; WISSELINK et al., 2002). Elles sont aussi utilisées pour
la production de bactériocines (RODRIGUEZ et al., 2003), et pourraient être impliquées
dans la production de protéines thérapeutiques ou comme vecteurs de vaccins (LANGELLA
et al., 2001).
1.3.3 Propriétés fonctionnelles et technologiques recherchées
L’utilisation des bactéries lactiques pour une application industrielle donnée, est
déterminée par leurs propriétés fonctionnelles et technologiques, telles que l’activité
acidifiante, la production de métabolites d’intérêt, et propriétés enzymatiques.
1.3.3.1 Activité acidifiante
La transformation du lactose ou d’un autre sucre assimilable en acide lactique, conduit
à l’acidification du produit. Cette acidification accroît sa durée de vie en limitant sa
contamination par les microorganismes d’altération ou pathogènes (FRANK et HASSAN,
1998 ; MAYRA-MAKIEN et BIGRET, 1998).
13
Synthèse bibliographique
1.3.3.2 Production de métabolites d’intérêt
Selon les espèces et selon les souches, les bactéries lactiques sont capables de
produire des métabolites tels que l’acide acétique, l’éthanol, des arômes (diacétyle,
acétaldéhyde…), des bactériocines (activité antimicrobienne), des exo-polysaccharides, des
enzymes (protéases, peptidases, lipases…) et du CO2 responsable de la formation
d’ouvertures dans les fromages (MAYRA-MAKIEN et BIGRET, 1998; FRANK et
HASSAN, 1998 ; BEAL et al., 2008).
1.3.3.3 Propriétés enzymatiques
Les activités protéolytiques et peptidasique sont importantes car elles déterminent la
capacité des bactéries lactiques à utiliser la fraction azotée du milieu. L’activité lypolytique
présente, de plus, un intérêt pour les applications fromagères (BEAL et al., 2008).
1.3.3.4 Propriétés spécifiques aux probiotiques
En plus des activités précédentes, les souches probiotiques doivent être résistantes aux
acides gastriques et aux sels biliaires rencontrés lors de leur passage dans l’estomac, le
duodénum et l’intestin (DORA ANGELICA., 2007 ; OUWEHAND et al., 2002 ;
NOUSIAINEN et al., 2004).De plus, elles présentent des propriétés thérapeutiques
spécifiques à chaque souche, principalement en termes d’activités immunostimulantes et antidiarrhéiques.
1.3.3.5 Critères de performance
Indépendamment de la propriété fonctionnelle envisagée, les bactéries lactiques
doivent être résistantes aux bactériophages, aux traitements mécaniques, à la congélation et ou
à la lyophilisation. Elles doivent également être tolérantes aux inhibiteurs de croissance (tels
que l’antibiotiques, l’acidité, l’éthanol, le chlorure de sodium) (BEAL et al., 2008).
1.3.4 Microbiologie du lait chèvre
Des analyses microbiologiques de lait de chèvre, ont montré que les genres bactériens
rencontrés étaient représentés par six genres de bactéries lactiques: Lactobacillus,
Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Weissella, et Pediococcus. Les espèces de
Lactobacillus et Lactococcus dominent cette microflore lactique (BADIS et al., 2004 ;
14
Synthèse bibliographique
BADIS et al., 2005). Aujourd’hui, il n’existe pas de normes et de valeurs limites reconnues
d'une manière générale au niveau international pour définir la qualité bactériologique du lait
de chèvre. Ainsi, pour le contrôle de la qualité de ce lait, seul le dénombrement des germes
totaux et dans quelques cas isolés
celui des staphylocoques à coagulase positive
(Staphylococcus aureus) fréquents dans ce lait, sont effectués.
Toutefois, une bonne hygiène au niveau de l'exploitation et de la traite ainsi qu’un
refroidissement du lait directement pendant et après la traite, permettent d'éviter des teneurs
en germes trop élevées. (MAURER et al,. 2013). Concernant l’aptitude à la transformation
du lait caprin, la charge globale en germes, et la composition de la flore sont déterminants.
Des analyses concernant des germes ou des groupes de germes spécifiques se justifient.
Cependant seulement pour des germes problématiques, la composition de la flore du lait,
fournit aussi des informations précieuses au sujet de l'origine des germes et aussi concernant
de possibles sources de contamination (voir tableau I) (JAKOB et al., 2009).
Tableau I: Germes typiques de la flore du lait cru (JAKOB et al., 2009).
Germes GRAM positives
Source de contamination
Germes sporulés aérobies
Terre, poussière, foin (très répandu )
Germes sporulés anaérobies(Clostridies)
Ensilage, fourrage vert ou non (Clostridies)
fermentation, bourbe
Entérocoques
Fèces, résidus de lait
Staphylocoques
Peau, muqueuses
Microcoques
Peau, résidus de lait
Bactéries propioniques
Peau, résidus de lait, fourrage vert en
fermentation, ensilage
Bactéries lactiques
Plantes, ensilages, résidus de lait, Muqueuses
Bactéries corynéformes
Peau, sol
Germes GRAM negatives
- Colibactéries (E. coli)
Fècès, eaux usées
- Entérobactéries
Plantes, fécès, eaux usées
Pseudomonas
Eau, sol (très répandu)
Acaligenes, Flavobacterium, etc.
Eau, sol (très répandu)
Levures
Sol, plantes, résidus de lait (très
répandues)
15
Synthèse bibliographique
1.3.5 Caractéristiques de Lactococcus lactis
Les bactéries appartenant au genre Lactococcus se présentent sous forme de coques
rassemblées en chaines de longueur variable. Elles appartiennent au groupe N de la
classification de Lancefield. Elles sont faiblement α-hémolytiques et non β-hémolytiques
(DELLAGLIO et al, 1994).
Le genre Lactococcus comporte plusieurs espèces et sous espèces, dont les plus
importants sont les espèces suivantes: Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp.
cremoris, Lactococcus lactis ssp .lactis biovar diacetylactis (TEUBER, 1995).Ces sousespèces et biovariants se différencient selon certains caractères biochimiques, telle la
production de diacétyle à partir du citrate, la désamination de l'arginine, la capacité à croitre
en présence de 4% de sel, à pH 9,2 et à 40° C. (BADIS et al, 2004).
Les deux sous espèces de Lc. lactis : Lc. lactis ssp. lactis et Lc. lactis ssp. cremoris se
distinguent essentiellement par leur capacité acidifiante et leur sensibilité à la température. La
sous espèce Lc. lactis ssp. cremoris est incapable de pousser au- dessus de 37°C. Le biovar
Lc. lactis ssp .lactis var diacetylactis, utilise le citrate, produit du diacétyle, de l’acétoine et du
CO2 (BADIS et al, 2005).
L’espèce Lactococcus lactis subsp lactis est une bactérie à GRAM positif, à catalase
négative aéro-anaérobie facultative. Elle se trouve en forme de coques disposées en chaines
de longueur variable. Les cellules sont ovoïdes ou sphériques de 0.5 à 1 μm de diamètre. Elle
possède un métabolisme homofermentaire et produit exclusivement de l’acide lactique L(+).
Le genre lactococcus, se caractérise par la présence d’antigène du groupe N, par son
caractère faiblement α hémolytique et non β-hémolytique, par sa température de croissance
minimale inférieure ou égale à 10° C et optimale voisine de 30°C, par sa thermosensibilité et
son inaptitude à croitre en présence de 6.5% de NaCl et à pH 9,6. Des travaux ont montré que
l’espèce Lactococcus lactis subsp lactis était résistance à l’acidité, à la bile, au sel et à la
congélation (KIM et al., 1999; TEUBER et GEIS, 2006). Elle présente aussi des propriétés
inhibitrices envers la flore d’altération et envers la flore pathogène du fromage, grâce à la
production de métabolites tels que les acides organiques, le péroxyde d’hydrogène et les
bactériocines ou à sa compétition écologique vis-à-vis des nutriments (O’SULLIVAN et al.,
2002 ; DORTU et al.,2009).
16
Synthèse bibliographique
1.3.5.1 Habitat
Les bactéries du genre lactococcus sont les bactéries lactiques les plus importantes
d'un point de vue commercial. Cependant, on peut également les isoler des plantes
(SANDINE et al ,1972), ainsi que de la peau de certains animaux, et il semble que la
contamination qui a lieu au cours de la traite ait pour origine principale, le fourrage
(RAYNAUD, 2006). Les habitats les plus importants des Lactococcus lactis demeurent le
lait, les laits fermentés et les fromages, où on les trouve en quantité dominante
(DELLAGLIO et al, 1994).
1.3.6 Utilisation industrielle des ferments lactiques
Les ferments lactiques ont été produits pour la première fois sous forme concentrée et
congelée au cours des années 1965-1970, et commercialisés, sur le marché américain par les
compagnies Boll-Hansen et Marshall-Miles (MARUEJOULS et CAIGNIET, 1983),
permettant ainsi l’ensemencement semi-directe ou directe des cuves de fabrication. Ce type de
ferment a commencé à être produit, en France à partir de 1978 par les sociétés BOLLHANSEN et EUROZYME (MARUEJOULS et CAIGNIET, 1983).
L’utilisation industrielle des ferments lactiques se faisait autrefois grâce à la technique
du « pied de cuve », où une partie du produit fermenté était conservée pour ensemencer les
fermentations suivantes. La nécessité d’un contrôle plus précis du procédé de fabrication et de
la qualité finale du produit, ajoutée à une meilleure connaissance des propriétés
technologiques des souches, a permis de développer, à partir des années 1920, la méthode
d’ensemencement par précultures (LEJARD et al., 1994). A partir d’un échantillon liquide et
en respectant les étapes successives de propagation, le ferment est multiplié jusqu’au volume
nécessaire pour l’inoculation du produit. Cette méthode a permis une amélioration
significative dans la conduite du procédé et la standardisation du produit final, par
comparaison à la méthode du pied de cuve. Par contre, elle présente des inconvénients,
concernant le risque de contamination des cultures et de mutation des souches. De plus, son
coût est élevé, car elle nécessite un personnel spécialisé ainsi que des installations permettant
de faire le « scale up » des précultures (BEAL et al., 2008 ; SMITH, 2001 ; TAMIME et
ROBINSON, 1999). De plus, selon (TAMIME et ROBINSON, 1999), cette méthode n’est
pas appropriée dans le cas d’utilisation de cultures mixtes, car le maintien des proportions est
17
Synthèse bibliographique
difficile à conserver. Actuellement, les producteurs de ferments font appel à leur
concentration.
1.3.7 Avantages de l’utilisation des ferments concentrés
Les avantages de l'utilisation des ferments concentrés se résument ainsi :
-
simplicité de leur utilisation ;
-
amélioration du contrôle de la fabrication ;
-
obtention de produits plus réguliers, due à la standardisation des cinétiques
d’acidification, la régularité et la reproductibilité des productions ;
-
limitation des risques de contamination et des infections phagiques ;
-
flexibilité de l’organisation de la fabrication ;
-
réduction et meilleure maîtrise des coûts de production ;
-
possibilité de réalisation de mélanges précis entre les souches (MAYRA-MAKIEN et
BIGRET, 1998 ; BEAL et al., 2008).
1.4 Conservation et formes commerciales des ferments lactiques
La préparation en laiterie des levains de bactéries lactiques destinés à la fabrication
des produits laitiers fermentés tels que: fromages, beurre et laits fermentés, est une opération
délicate et coûteuse. Elle constitue pour les laiteries une charge importante en investissements
(matériel, cuves à levains) et en main-d'œuvre spécialisée, aussi bien au stade de l'entretien
des souches qu’au laboratoire de la laiterie. Lors de la préparation proprement dite du levain à
l'usine, des « accidents » peuvent se produire: contaminations diverses et attaques de
bactériophages. Ils ont pour résultat un mauvais développement des bactéries du levain et
éventuellement des fabrications défectueuses.
C’est pour cela qu’il existe plusieurs laboratoires étrangers étudiant actuellement ce
problème. On trouve aux Etats- Unis des suspensions concentrées et congelées de bactéries
lactiques utilisables pour la fabrication des produits laitiers (ACCOLAS et AUCLAIR,
1967).
18
Synthèse bibliographique
1.4.1 Congélation
La congélation est actuellement la technique de conservation des bactéries lactiques la
plus utilisée dans le domaine agro-alimentaire. Une bonne maîtrise de cette opération est
nécessaire pour éviter ou minimiser les pertes de viabilité liées à l'abaissement de la
température et à la formation de glace au cours de la congélation. Cependant, elle induit aussi
des pertes de viabilité, inégalement maîtrisées jusqu'à présent. De plus, les ferments congelés
nécessitent une attention spéciale par rapport au maintien de la chaîne du froid lors de leur
transport et leur stockage. Il est aussi préconisé que les bactéries congelées soient stockées à
des températures inférieures à -45 °C, afin d’assurer la stabilité de la qualité et de l'activité des
ferments (STREIT, 2008). Cependant la congélation à une température de – 20°C permet une
conservation de la plus part des microorganismes pendant 1 à 2 ans et le métabolisme de ces
derniers en dessous de -18°C est totalement inhibé (LARPENT, 1997).
1.4.2 Réfrigération
La conservation à basse température réduit la croissance et l'activité des bactéries à
l'origine de la dégradation et prolonge la durée de conservation du lait. La conservation à des
températures en dessous du minimum de croissance entraîne une prolongation continue de la
phase de latence jusqu’à ce que la multiplication cesse et la croissance du microorganisme
s’arrête (DOYLE et al, 1997).
D’autre part, aux températures comprises entre 0 et 10°C des changements mineurs
dans les conditions physico-chimiques ont de grands effets sur la croissance bactérienne
(KORKEALA et al, 1989). Toutefois la réfrigération ne tue pas ou n’élimine pas une
contamination microbienne. Elle permet la croissance, le développement aux seuls
microorganismes psychrophiles capables de croître sur le lait à des températures en dessous
de 15 à 20°C (RUTHERFORD et al, 2007). La réfrigération du lait dès la ferme et son
stockage pendant un temps plus ou moins long sélectionne des bactéries psychrotrophes qui
peuvent devenir alors une flore dominante. Parmi ces bactéries le genre Pseudomonas est le
plus fréquent (MIRANDA et GRIPON, 1986).
1.5 Cryoprotection des bactéries lactiques
Il existe des substances protectrices qui permettent aux cellules de mieux supporter
une congélation ou une décongélation lentes et un stockage à température supérieure à - 50°C,
19
Synthèse bibliographique
appelées cryoprotecteurs (FONSECA et CORRIEU, 2001). Ces substances, qui doivent être
peu volatiles, solubles dans l’eau et n’avoir aucun caractère toxique, ont des origines diverses
: polyols (glycérol, sorbitol), sucres (lactose, saccharose), protéines laitières (lait écrémé,
caséines), acides aminés (glutamate), antioxydants (acrobates) ou macromolécules
(maltodextrines) (BEAL et al., 2008).
Les bactéries contiennent naturellement des cryoprotecteurs : les sucres (sucrose et le
tréhalose), chez les bactéries G+ (BERT et al., 1998) ; les polyols (glycérol, sorbitol, et
mannitol), que l'on retrouve chez les algues, les champignons, les levures, les plantes et
certaines bactéries (KETS et al., 1996; HANS et al., 1995), les acides aminés et dérivés
(bétaïne et carnitine), chez plusieurs groupes de bactéries (CSONKA, 1989) et l'acide
tetrahydroxypyrimidine carboxylique (hydroxyectoïne) chez les bactéries halophiliques
(DELMORAL et al., 1994), le glutamate, la glutamine, la proline et l’alanine chez
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas et d'autres micro-organismes
(JEWELL et al., 1991) et les acides aminés bêta chez les bactéries méthanogènes (LAI et
al., 1991).
Les cryoprotecteurs sont groupés en deux classes :
 Cryoprotecteurs intracellulaires
Ce sont des substances de faible poids moléculaire (< 100) qui pénètrent à l'intérieur
de la cellule. Ils sont utilisés à une concentration de l’ordre de mol/l et agissent
principalement lors d’une congélation lente. Le plus important représentant de cette catégorie,
est le glycérol, mais on trouve aussi le diméthyle sulfoxide, méthanol éthanol, polyéthylène
oxyde, diméthylacétamide1-2 propanediol.
 Cryoprotecteurs extracellulaires
Ce sont des substances de haut poids moléculaire (>10.000) qui se concentrent à
l'extérieur de la cellule. Ils sont utilisés à une concentration plus faible, de l'ordre de la millimole/l, et sont indiqués lors des congélations rapides. Parmi les molécules les plus utilisées de
cette catégorie se trouvent le lactose, le saccharose, le tréhalose, la maltodextrine, polyvinyl
pyrolidone, le dextrane et l'amidon (STREIT, 2008).
20
Synthèse bibliographique
1.5.1 Mécanisme d’action des cryoprotecteurs
Les mécanismes de la cryoprotection sont l'objet de nombreuses études de nos jours.
Les modes d'action les plus probables sont : un accroissement du volume de la phase liquide
interstitielle, à une température donnée, par dépression du point de congélation commençante
et donc réduction des effets liés à un refroidissement lent, une diminution de la taille des
cristaux de glace par abaissement de la température de nucléation et une réduction de leur
vitesse de croissance et une stabilisation de la configuration native des protéines (LESLIE et
al., 1995). Lorsque les premiers cristaux de glace apparaissent, les CPE se concentrent
uniquement à l'extérieur des cellules, contrairement aux autres solutés qui se concentrent à
l’intérieur et l’extérieur des cellules. La perte d'eau des cellules conduit donc à une
concentration en autre soluté, plus faible qu’en absence de CPE, minimisant ainsi les effets de
l'accroissement de concentration de la solution interstitielle. Au niveau des membranes
cellulaires séchées, des sucres comme le tréhalose et le saccharose peuvent remplacer les
molécules d'eau dans leur liaison avec les groupes polaires des phospholipides empêchant
ainsi les dommages durant la réhydratation (LESLIE et al., 1995). Le tréhalose et le
saccharose stabilisent la structure des protéines intracellulaires par ce phénomène de
remplacement de l'eau (CARPENTER et al., 1993). D'autres études ont montré que les
cryoprotecteurs étaient indispensables lors de la congélation quelles que soient les courbes de
refroidissement. Tous les cryoprotecteurs ne pénètrent pas dans les cellules. Il est d'usage de
les séparer en cryoprotecteurs non diffusants (la plupart des sucres ajoutés) et diffusants (le
glycérol, l'éthylène glycol, par exemple) (PEGG et DIAPER, 1988). Les cryoprotecteurs
diffusants vont se substituer à une partie de l'eau intracellulaire et permettre ainsi une
déshydratation partielle des cellules en plus de limiter la formation de cristaux de glace
intracellulaire. Ils réduisent également la vitesse de croissance de ces cristaux, abaissent la
température de solidification de l'eau intracellulaire, tel un « antigel », et modifient la forme
des cristaux de glace (HEY et MACFARLANE, 1998 ; PALASZ et MAPJETOFT, 1996).
Quand aux cryoprotecteurs pénétrants, ils protègent aussi au cours de la congélation et de la
décongélation en réduisant la taille des cristaux de glace et en induisant des formes de
cristaux moins traumatisantes. Ils permettent, via l'augmentation de la viscosité du milieu, la
diminution de la rapidité des mouvements de l'eau et de chocs osmotiques importants. De
plus, ils permettent, via l'augmentation de la pression osmotique, la réduction de la quantité de
cryoprotecteurs pénétrants, nécessaires à une bonne conservation (MERYMAN, 1974).
21
II Matériel et méthodes
Matériel et méthodes
2.1 Matériel d’étude
2.1.1 Lait de chèvre
Les prélèvements de lait proviennent de troupeaux de chèvres localisés à Bamindil
dans la région d'Ouargla. Ainsi trois prélèvements à partir de trois chèvres d'un troupeau et
deux prélèvements à partir de deux chèvres d'un autre troupeau de la même race ont fait l'objet de ce
travail. Un nettoyage correct de la mamelle est effectué avant la traite. Il est indispensable pour éviter
les contaminations de lait. Le lait est recueilli dans des flacons stériles de 250 ml, conservé et
transportés, dans une glacière au laboratoire.
2.1.2 Milieux utilisés
2.1.2.1 Milieu d'isolement, purification (M17)
La composition de ce milieu de culture est indiquée en annexe n°1.
2.1.2.2 Milieu de conservation
Le milieu de conservation est composé de 10g de peptone; 5g de NaCl; 3g d'extrait de
viande; 5g d'extrait de levure; 1g de glucose; 4g de Na2HPO4; 1l eau distillée. C'est un
bouillon et ne contient pas d'agar-agar (BALLA, 2011).
2.1.3 Appareillage
-
Microscope optique (Motic, China);
-
Réfrigérateur (Samsung, Kouria);
-
Etuve (Memmert, Allemagne);
-
Four pasteur (Memmert, Allemagne);
-
Autoclave (Pbi-international, Milano);
-
Bec benzène;
-
Bain-marie (Memmert, Allemagne);
-
pH mètre (Metrohom620, Allemagne);
-
Densimètre (G-widder, Allemagne);
-
Spectrophotomètre (WPA, China);
-
Balance de précision (Denver, Allemagne);
-
Plaque chauffante (VELP, Europe).
22
Matériel et méthodes
2.1.4 Petit matériel
Boites pétri en plastique, tube à essais, pipettes pasteur, erlenemeyer de 250 ml,
éprouvettes , fiole jaugée, bécher, pipettes graduées, burette, lames et lamelles, flacon en verre
de 250 ml, entonnoir.
2.1.5 Produits chimiques et réactifs
Eau physiologique, phénolphtaléine, solution de Soude (1N), bleu de méthylène 1%,
violet de gentiane, l'eau distillée, liquide de lugol, alcool, solution de Fuchsine de Ziehl, l'eau
distillée stérile, l'eau oxygénée 10 volume, peptone bactériologique, NaCl, HCl et NaOH,
Citrate d'ammoniac de Fe+3 (à la place ou Glycérophasphate de sodium), extrait de viande,
extrait de levure, Na PO-4, lactose, glucose.
Les cryoprotecteurs utilisés dans la présente étude sont les suivants :
-
Le saccharose à 12% (DENI et PLOY, 2007).
-
Le glycérol à 10% (DENI et PLOY, 2007).
2.2 Méthodes analytiques
2.2.1 Analyses physico-chimiques du lait
2.2.1.1 Mesure du pH
Le pH est déterminé à l'aide d’un pH-mètre étalonné. La valeur est lue directement sur
l'écran de l'appareil (AFNOR, 1986).
2.2.1.2 Acidité Dornic
Le dosage est effectué par neutralisation de 10 ml de lait avec de la soude N⁄ 9
en présence de phénolphtaléine (BALLA, 2011).
2.2.1.3 Densité
La densité est déterminée à l’aide d’un densimètre sur un lait maintenu au repos. Elle consiste
à plonger l'appareil dans une éprouvette de 250 ml remplie de lait, lorsqu'il se stabilise, la
lecture de la valeur de la densité se fait directement sur l'appareil (SOUID, 2011).
23
Matériel et méthodes
2.2.2 Analyses microbiologiques
2.2.2.1Test de la réductase
Le test de la réductase permet d'estimer la charge microbienne des échantillons de lait
collectés. Son principe est basé sur la décoloration du bleu de méthylène. La rapidité de cette
décoloration est directement proportionnelle au nombre de germes présents(LARPENT, 1997
; GUIRAUD, 1998). Ce test donne une idée de la quantité de germes présents dans le lait, de
leur activité et de leur vitesse de multiplication .La technique est indiquée en annexe n°2.
24
Matériel et méthodes
Le lait de Chèvre
(mélange)
Analyses physico-chimiques
(pH, densité, acidité Dornic)
Analyses microbiologiques
Test de la réductase
Isolement de la souche lactocoques
Ensemencement dans le milieu M17 (striés
d’épuisement)
Incubation à 30°C pendant 24h
Analyses préliminaires : Etude macro et microscopique, Test de la catalase
Pré-identification par des tests physicochimique et biochimiques
Purification, repiquages successifs
Propagation de la souche: mesure de la DO
Numérations des souches avant conservation
Conservation des souches dans du bouillons de conservation
Conservation
à T ambiante
Réfrigération
Congélation
sans
cryoprotecteurs
Congélation avec
cryoprotecteurs
(glycérol 10%,
saccharose 12%)
Figure
2: Procédure
Détermination
deexpérimentale
la densité optique tous les jours J0 jusqu'à J0+20
25
Matériel et méthodes
2.2.2.2 Isolement de la souche
Nous avons préparé des séries de dilutions décimales de lait (10-1 à 10-5) effectuées avec du
bouillon peptone- sel (1g l-1 peptone bactériologique, 8,5g l-1 NaCl), et le milieu de culture
d'isolement est ensemencé à partir de ces dilutions.
La technique est indiquée en annexe n°3.
2.2.2.3 Ensemencement dans un milieu sélectif
Les boites de pétri coulées par la gélose M17 gélosé, sont ensemencées en surface à
0.1 ml de la dilution effectuée, puis incubées à 30°C pendant 24h.
2.2.2.4 Pré-Identification de la souche
La pureté des souches sera contrôlée par des observations, macroscopiques et
microscopiques (après double coloration de GRAM), le test de la catalase, et des tests
physico-chimiques et biochimiques sont réalisés avant de procéder à la conservation.
2.2.2.4.1 Analyses préliminaires
2.2.2.4.1.1 Etude morphologique
2.2.2.4.1.1.1Observation macroscopique
L'examen macroscopique des cultures est le premier effectué après isolement de la
souche. Il porte sur la description de:
- La taille: approximative;
- La forme: caractérisée par l'allure des contours qui peuvent être lisses, dentelés,
déchiquetés. La surface (forme en relief) peut être bombée ou plate. Le centre est parfois
surélevé, parfois « ombiliqué »ou« creux »;
- L'aspect de la surface: qui peut être lisse, brillant (type S «smooth» : lisse), rugueux
mate (type R «rough»: rugueux);
26
ou
Matériel et méthodes
- La coloration : la plupart des colonies n'ont pas de couleur définie. Elles sont jaunâtres,
grisâtres, ou blanchâtres mais certaines élaborent un pigment qui donne à la colonie une teinte
franche : jaune, rouge, violette; parfois le milieu lui même se colore, cas fréquent d'un
pigment bleu- vert. La pigmentation est un caractère d’identification important;
- La consistance: les colonies peuvent avoir un aspect muqueux comme elles peuvent être
filantes, grasses, crémeuses (qui se mettront facilement en suspension) sèches, pulvérulents
(qui se dissocieront mal dans l’eau) (MARCHAL et al., 1982);
- L'opacité : les colonies sont dites opaques si elles ne laissent pas passer la lumière,
translucides si elles laissent passer la lumière mais on ne voit pas les formes au travers,
transparentes, si elles laissent passer la lumière et on voit les formes au travers (MARCHAL
et al., 1982).
2.2.2.4.1.1.2 Observation microscopique
L'observation microscopique permet de faire une étude morphologique des cellules
d'une espèce bactérienne
2.2.2.4.1.1.2.1 Examen à l’état frais
Une méthode rapide consiste à observer entre lame et lamelle une suspension
bactérienne à l'objectif 40 sans fixation préalable par la chaleur ou l’alcool. Les
renseignements obtenus par cette observation concernant principalement la mobilité des
bactéries (DENI et PLOY, 2007).
2.2.2.4.1.1.2.2 Examen après double coloration de GRAM
La coloration de GRAM a été effectuée selon le protocole décrit par (PRESCOTT et
al.; 2003). La technique est indiquée en annexe n°4.
2.2.2.4.1.1.3 Test de la catalase
La catalase est une enzyme produite en abondance par les bactéries ayant un
métabolisme respiratoire qui détruit le peroxyde d'hydrogène et libère de l'oxygène VÉZINA
27
Matériel et méthodes
et LACROIX, 2000). La mise en évidence d'une catalase se fait par contact de la culture
microbienne avec une solution fraiche d'eau oxygénée (GUIRAUD, 2003).
2.2.2.4.2 Pré-Identifications physico-chimiques et biochimiques de la souche
Les souches isolées subissent des tests pré-identification physico-chimiques et
biochimiques.
2.2.2.4.2.1 Tests physico-chimiques des souches
2.2.2.4.2.1.1Croissance à différentes température
Du bouillon M17 est ensemencé est incubé à 10 °C pendant 1-7 jours, à 40°C pendant 24 h et
à 45°C pendant 24h (SIBOUKEUR, 2011).
2.2.2.4.2.1.2 Tolérance à la salinité
Du bouillon M17 à des concentrations de 2%, 4% et 6.5% de NaCl est ensemencés et incubé à
30°C pendant 24 h (SIBOUKEUR, 2011).
2.2.2.4.2.1.3 Tolérance au pH alcalin
Du bouillon M17 alcalinisé à pH 9.6 et 9.2 est ensemencés et incubé à 30°C pendant 24h
(SIBOUKEUR, 2011).
2.2.2.4.2.2 Tests biochimiques des souches
2.2.2.4.2.2.1Type fermentaire
Du bouillon M17 est ensemencé en présence d’une cloche de Durham, et incubé à 30°C
pendant 24h (SIBOUKEUR, 2011).
2.2.2.4.3 Purification par repiquage successif
La purification des bactéries est réalisée par 6 repiquages successifs dans la gélose
M17 par des stries d'épuisement.
2.2.2.5 Propagation de la souche
28
Matériel et méthodes
Avant d'être conservées, les bactéries doivent être obtenues en culture pure. Elles doivent,
durant la durée de stockage, être dans des conditions de non multiplication en milieu de
conservation en absence et présence des agents protecteurs et doivent être prélevées sur une
culture récente (DENI et PLOY, 2007).
Une colonie de bactérie préalablement purifiée est placée dans 1 ml de bouillon M17
puis incubée à 30°C pendant 24h. On introduit ensuite la culture précédente dans un tube
contenant 9 ml de milieu M17, puis on l'incube à nouveau à 30°C pendant 24h
(SIBOUKEUR, 2011). Préparer le milieu de conservation dans 5 erlenmeyers de 250 ml.
Deux erlenmeyers destinés à la congélation sont additionnés de l'agent cryo-protecteur
(glycérol 10%, saccharose 12%) et les trois autres erlenmeyers destinés à être stockés à la
température ambiante (témoin), réfrigération et congélation, sans addition de cryo-protecteur.
La culture est réalisée dans des erlenmeyers d’une capacité de 250 ml contenant du
milieu de conservation, avec la culture précédente (tube de 10 ml) à raison de 10%.
L'incubation est effectuée à 30°C pendant 24. La technique est indiquée en annexe n°5.
2.2.2.6 Mesure de la croissance de la souche isolée
2.2.2.6.1 Mesure de la turbidité
La croissance bactérienne est suivie par la mesure de la densité optique qui est effectuée
à une longueur d’onde de 600nm au spectrophotomètre (BEAL et al ,2008).
Dans le cas des dilutions, la turbidité est proportionnelle à la biomasse lorsqu'elle ne
dépasse pas la limite 0,5- 0,6 en unité d’absorbance (ONER et ERIKSON, 1986).
Lorsqu’une suspension cellulaire dans un milieu limpide est traversée par un faisceau
lumineux monochromatique, elle absorbe une quantité de lumière qui est proportionnelle à sa
concentration cellulaire selon la loi de Béer Lambert (BOURGEOIS et LEVEAU, 1991).
2.2.2.6.2 Courbe d'étalonnage
A partir de la culture à (10%), nous avons réalisé une gamme étalon (10-1, 10-2, 10-3,
10-4, 10-5), à partir de laquelle nous avons tracé la courbe étalon, en mesurant l’absorbance à
600nm.
29
Matériel et méthodes
2.2.3 Conservation des souches isolées
Les solutions à 10% (Erlenmeyer) sont réparties dans des tubes en verre, stériles
munis d'un bouchon hermétique, de 5,4ml de capacité, puis elles sont conservées selon le
protocole indiqué en figure 3.
Le tableau II indique la constitution des lots expérimentaux de solutions.
Tableau II: Constitution des lots expérimentaux
Nature du
traitement de
Température
Réfrigération
conservation
congélation
Ambiante
Sans cryoprotecteur
Lot
Lot 1
Lot 2
Lot 3
Avec cryo-protecteur
glycérol
saccharose
Lot 4
Lot 5
2.2.4 Suivi de la croissance par densité optique
La détermination de la souche est suivie chaque cinq jour de J0- J0+20 par la mesure de
la densité optique des échantillons, soumis à différentes conditions de stockage.
30
III Résultats et discussion
Résultats et discussion
3.1 Qualité physico-chimique du lait
Les résultats relatifs aux caractéristiques physico-chimiques du mélange des 5
échantillons du lait caprin, ayant fait l’objet de la présente étude. La moyenne de trois
répétitions est portée sur le tableau III.
Tableau III : Caractéristiques physico-chimiques de l'échantillon de lait caprin.
Paramètres physico-chimiques
Moyenne
pH
6.79
Acidité Dornic (°D)
15.33
3.1.1 Mesure du pH
Densité
1.0233
L'échantillon
analysé présente un
pH égal à 6,79. Ce dernier est proche celui du lait de vache compris entre 6,6 et 6,8 selon
VIGNOLA (2002) et VIERLING (2008). D’autres travaux rapportent des pH de lait de
chèvre légèrement plus acide que ceux du lait de vache. L'origine de ces valeurs de pH (5.2 ;
4.6) du lait caprin peut être attribuée à un début d'activité des bactéries lactiques endogènes
donc à l'âge du lait.
3.1.2 Acidité titrable
L'acidité titrable du lait dépend du nombre de moles d’acides présents dans ce produit.
Elle est inversement proportionnelle à son pH (MATHIEU, 1998). Le lait fraîchement trait
est selon BADAOUI (2000), légèrement acide. Cette acidité provient essentiellement des
caséines, des phosphates, du citrate et du CO2 dissous. Le lait acquiert ensuite une acidité,
dite acidité développée car elle est provoquée par l'acide lactique et autres acides issus
l'activité fermentaire des micro-organismes (BADAOUI, 2000). L'acidité titrable moyenne de
l'échantillon de lait caprin analysé est égale à 15.33°D. Cette valeur se rapproche de celle du
lait bovin (15.5 D°) (MOUALEK, 2011). Cette valeur est inférieure à 18°D celles rapportées
par BENGUETTAIA et
LEMLEM (2013).
31
Résultats et discussion
3.1.3 Densité
La densité du lait est en relation directe avec le taux de matière sèche (SIBOUKEUR,
2007). Le taux de matières sèches du lait caprin est plus faible que celui du lait bovin
(BENGUETTAIA et LEMLEM, 2013).
La densité du lait analysé est égale à 1.0233. Les auteurs (in SIBOUKEUR, 2011)
consultés rapportent que le lait caprin est moins dense par rapport au lait bovin 1.0322. Ceci
conforte le résultat enregistré dans cette étude.
3.2 Analyse microbiologique
3.2.1 Test de réductase
L'épreuve de la réductase n'est pas un moyen d'appréciation du nombre de bactéries
mais
une épreuve destinée à
estimer le
degré
de la
contamination du lait
(PETRANSEXIENE, 1981).La décoloration de bleu de méthylène a commencé au delà de 5
heures. Cela signifie que l'échantillon de lait caprin testé présente une bonne qualité
hygiénique. Le taux de germes dans ce lait peut être estimé entre 10 5 à 2.105 germes/ml
(GUIRAUD ,1998).
3.2.2 Test de catalase
Cette enzyme est utilisée en bactériologie systématique pour l'identification des
bactéries. Ce caractère indique l’appartenance des bactéries lactiques au genre Lactococcus
bactéries à G+ aérotolérantes à ne pas posséder de système respiratoire (ni cytochrome, ni
catalase) (DESMAZEAUD et DE ROISSART, 1994).
Toutefois, certaines bactéries lactiques possèdent des pseudo-catalases non hémiques,
provoquant une effervescence (SIBOUKEUR, 2011)
3.3 Isolement, pré-identification et purification de la souche
3.3.1 Isolement de la souche de lactcoques
32
Résultats et discussion
3.3.1.1 Observations macroscopiques
Nous avons pu isoler deux types de colonies qui différent par leur couleur et leur
taille. La première de couleur blanche, est de très petite taille (1mm), alors que la deuxième de
couleur jaune, est deux fois plus grande (2mm environ). (Photo 1)
Photo 1: Colonies isolées sur gélose M17.
.3.3.1.2 Observations microscopiques
La double coloration de GRAM indique des monocoques, des diplocoques et des
chainettes colorés en violet donc G + pour les deux types de colonies isolées.
3.3.2 Pré-identification de la souche
3.3.2.1 Caractéristiques morphologiques, microscopiques,
physico-chimiques et
biochimiques des deux souches isolées
Les caractères morphologiques, microscopiques, physico-chimiques et biochimiques
sont regroupés dans le tableau VI.
L'absence de dégagement de CO2 dans la cloche de Durham indique que la 1ère
souche est homofermentaire. Ce résultat est de nature à indiquer que cette souche appartient
au genre lactococcus (SEBASTIEN, 2008).
(dégagement de CO2).
33
La 2ème
souche est hétérofermentaire
Résultats et discussion
On observe un trouble dans le bouillon M17 après une incubation à 10°C, 40°C et
aucun trouble à 45°C pour les deux souches. Cela indique que les deux souches sont
mésophiles, un autre caracère des lactocoques.
Un trouble est observé dans des bouillons M17, à 2%, à 4% de NaCl pour les deux
souches. La 1ère souche contrairement à la 2ème, ne croit pas à 6.5% de NaCl. Cette inaptitude
constitue une des caractéristiques de l'espèce Lactococcus lactis.
La 1ère souche se distingue de la 2ème souche par sa croissance à pH=9.6. Ce caractère
permet de distinguer l’espèce Lactococcus lactis subsp lactis des espèces
Lactococcus lactis subsp cremoris et Lactococcus lactis subsp lactis diacetylactis
(GUIRAUD ,1998).
Le type fermentaire (homofermentaire), l'absence de croissance à 6.5% de NaCl et à
pH=9,6 semblent indiquer que la souche recherchée est la 1ere souche (colonies blanches de
1mm de diamètre). Celle-ci fera l'objectif d'une purification pour la suite de ce travail.
Tableau VI : Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques de la souche.
Colonie 1: blanche de
Colonie 2: jaune de taille
petite taille
plus grande
Monocoque, diplocoques
Monocoque, diplocoques
et en chaînette
et en chaînette
Immobile
Immobile
Gram+
Gram+
Test de catalase
Effervescence
Effervescence
Type fermentaire
Homofermentaire
Hétérofermentaire
Croissance à 10°C
+
+
Croissance à 40°C
+
+
Croissance à 45°C
_
_
Tests d'identification
Observation
microscopique
Examen à l'état frais
(mobilité)
Examen après double
coloration de GRAM
34
Résultats et discussion
Croissance à 2% d'NaCl
+
+
Croissance à 4% d'NaCl
+
+
Croissance à 6,5% d'NaCl
_
+
Croissance à pH 9,2
+
+
Croissance à pH 9,6
-
+
3.3.3 Purification
Après six repiquages successifs par des stries d'épuisement sur gélose M17, nous
avons obtenu des souches pures à partir de la colonie 1.
3.4 Propagation de la souche
3.4.1 Courbe d'étalonnage
La gamme nous a permis de tracer une courbe étalon en utilisant le spectrophotomètre
visible à 600nm (fig. 4).
0,6
x5,349y =
0,8595= ² R
D.O à 600 nm
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
Concentration de la biomasse
Figure 4: Courbe d'étalonnage de la souche 1 isolée sur gélose M17
Cette courbe est utilisée pour le suivi de l’évolution de la biomasse durant la conservation de
la souche.
35
Résultats et discussion
3.5 Conservation de la souche isolée
La courbe étalon permet de déterminer à J0, J0+5, J0+10, J0+15, J0+20 (soit tous les 5
jours), la concentration bactérienne de la culture initiale c'est-à-dire celle à 10%, selon le
tableau V:
Tableau V : Résultats [ ] de la biomasse bactérienne en % après 5 jours pendant 20jours.
Les jours
J0
J0+5
J0+10
J0+15
J0+20
9,8
7,1
6,7
4,6
6,3
9,8
5,8
6,1
2,8
4,8
9,8
5
3,2
5,1
5,2
9,8
5
6
0,07
1
9,8
49
43
42
8,4
[ ] de la biomasse
bactérienne en % T
ambiante
[ ] de la biomasse
bactérienne en %
réfrigération
[ ] de la biomasse
bactérienne en %
congélation sans
cryoprotecteur
[ ] de la biomasse
bactérienne en %
congélation (glycérol)
[ ] de la biomasse
bactérienne en %
congélation
(saccharose)
36
Résultats et discussion
3.5.1 Température ambiante
La figure 5: représente le lot n°1 des échantillons de cultures à 10% (20 tubes de
capacité 5.4 ml) stockés à la température ambiante (environ 29-31°C). L'évolution de la
[ ] de biomasse bactérienne en
(%)
biomasse pendant 20 jours.
12
9,75x + 0,95y = 0,6383= ² R
10
8
6
4,6
4
2
0
0J
0+5J
0+10J
0+15J
0+20J
durée de consevation en jour
Figure 5: Evolution de la biomasse conservée 20J à température ambiante
Nous remarquons une diminution de la biomasse qui passe de 10% à 4.6% à J0+15.
Ceci est du probablement au fait que le milieu ne convient pas à leur croissance. En effet le
milieu utilisé est un milieu de conservation et non un milieu de culture. La lyse cellulaire
sous l'action des enzymes protéolytiques endogènes serait à l’origine de cette baisse de
concentration cellulaire.
Cependant, selon MARIE-MADELEINE (2007), il peut persister une croissance par
libération de substances lors de la lyse pendant la croissance cryptique, ce qui semble
expliquer la croissance après J0+15.
37
Résultats et discussion
3.5.2 Réfrigération
la figure 6: représente le lot n°2 des échantillons de cultures à 10% stockés à 8 °C.
[ ] de biomasse bactérienne
en (%)
L’évolution de la biomasse pendant 20 jours.
12
9,76x + 1,3y = 0,6482= ² R
10
8
6
4
2,8
2
0
0J
0+5J
0+10J
0+15J
0+20J
durée de conservation en jour
Figure 6: Evolution de la concentration bactérienne de la souche conservée à la réfrigération.
La figure 6 présente la même allure que la précédente .Toutefois, la diminution de la
biomasse est plus importante puisqu’elle passe de 10% à 2.8 % à J0+15.
3.5.3 Congélation sans cryo-protecteur
La figure 7: représente le lot n°3 des échantillons de cultures à 10% conservés dans
[ ] de biomasse bactérienne en
(%)
un congélateur de laboratoire réglé à -20°C.
12
8,39x + 0,91y = 0,3429= ² R
10
8
6
4
3,2
2
0
0J
0+5J
0+10J
0+15J
durée de conservation en jour
38
0+20J
Résultats et discussion
Figure 7: Evolution de la concentration bactérienne de la souche conservée à la congélation
sans cryo-protecteur.
Nous remarquons une diminution de la biomasse qui passe de 10% à 3.2% à J0+10,
donc plus tôt comparativement aux lots 1 et 2.
La conservation de ce lot utilisant cette basse température semble nuire aux souches.
Le problème lié à la conservation par le froid est celui de la formation de cristaux de glace qui
peuvent être très dommageables sur les cellules. Il y a un stress osmotique. Le potentiel de
cette formation de glace intracellulaire augmente, si le potentiel osmotique à l'intérieur de la
cellule est différent de celui de milieu environnant. Les mécanismes de dommage de glace
intracellulaire restent floues, mais peut inclure la destruction physique des membranes, la
formation de bulles de gaz et de la perturbation des organites (FULLER, 2004).
Par ailleurs, les auteurs évoquent d’autres raisons de la sensibilité des cellules aux
traitements de conservation par le froid. Ainsi, les cellules de l'espèce Str. lactis récoltées en
phase exponentielle de croissance sont beaucoup plus sensibles à la congélation que les
cellules récoltées en début de phase stationnaire (ACCOLAS et AUCLAIR, 1999).
3.5.4 Congélation avec cryo-protecteur
3.5.4.1 Glycérol
La figure 8: représente le lot n°4 des échantillons de cultures à 10% stockés à -20 °C
en présence de glycérol à 10 %. Celui-ci est susceptible de protéger la membrane cellulaire.
11,133x + 2,253y = 0,8137= ² R
[ ] de biomasse bactérienne
en (%)
12
10
8
6
4
2
0
2-
0,07
0J
0+5J
0+10J
0+15J
durée de conservation en jour
39
0+20J
Résultats et discussion
Figure 8: Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée à la congélation
(-20°C) avec cryo-protecteur Glycérol (10%).
Nous remarquons une diminution relativement importante de la biomasse en
comparaison avec les lots 1 et 2 puisqu’elle passe de 10% à 0.07 % à J0+15.
Par rapport au lot 3, nous constatons une diminution de la biomasse beaucoup plus
faible durant les 10 premiers jours, puisque la biomasse passe 10% à 6 % (versus 3.2 %) à
J0+10, d'où présence d’une protection relative.
Le Glycérol est un soluté poly-hydroxylé avec une forte solubilité dans l'eau, et une
faible toxicité lors l'exposition à court terme à des cellules vivantes (FULLER, 2004). En
général, on procède à un refroidissement lent et progressif, lors de l’utilisation de cryoprotecteurs pénétrant les cellules tel que le glycérol.
Ce dernier, agit en évitant une trop forte déshydratation des cellules lors de la
formation primitive de glace extracellulaire puis en évitant la formation secondaire (qui suit la
déshydratation consécutive à la formation de glace extracellulaire) de trop nombreux et trop
gros cristaux de glace pure intracellulaire. Certains protocoles assurent au contraire un
refroidissement très rapide. II s'agit d'obtenir une "vitrification" intracellulaire non destructive
(FULLER, 2004).
3.5.4.2 Saccharose
La figure 9: représente le lot n°5 des échantillons de cultures à 10% stockés à -20 °C
en présence de saccharose à 12 %. Les résultats obtenus semblent être du plutôt à la densité
optique anormalement élevée des échantillons additionnés de saccharose. En effet les
échantillons du lot n°5 présentaient une consistance de gel (fig.9). Nous ne pouvons donc pas
tenir en ligne de compte ces résultats.
40
[ ] de biomasse
bactérienne en (%)
Résultats et discussion
33,38x + 0,98y = 0,0062= ² R
60
50
40
30
20
10
0
0J
0+5J
0+10J
0+15J
0+20J
durée de conservation en jour
Figure 9: Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée à la congélation
avec cryo-protecteur Saccharose (12%).
41
Conclusion
Conclusion
Conclusion
Conclusion
L'objectif de ce travail vise à la conservation d'une souche pure de lactocoques isolée à partir
du lait caprin. Après culture sur gélose M17, pré-identifiée par une caractérisation
morphologique et des tests physico-chimiques et biochimiques, une purification par six
repiquages successifs a permis d’obtenir une souche pure destinée à des essais de
conservation.
Deux techniques de conservation ont été utilisées : la réfrigération et la
congélation sans/avec cryo-protecteur (glycérol 10%, saccharose12%).
Un milieu
de
conservation a servi à l’élaboration des suspensions bactériennes à 10%.
Un lot d’échantillons de la suspension bactérienne a été conservé à température ambiante,
pour servir de témoin. L’estimation de la biomasse est réalisée par spectrophotométrie en
utilisant un courbe étalon (loi de Beer Lambert). L’évolution de la biomasse est suivie par la
mesure de la DO à longueur d'onde 600nm de suspensions bactériennes tous les 5 jours
durant 20 jours d’entreposage.
Les résultats obtenus indiquent une chute de la biomasse comme dans le cas des lots
entreposés à la température ambiante (témoin).
La biomasse initiale J0 à10%, diminue dans le cas de la réfrigération et de la congélation
sans cryo-protecteur jusqu'à la 2.8 % à J0+15 et à 3.2% à J0+10 respectivement. La congélation
avec cryo-protecteur (glycérol 10%) atteint 0.07 % à J0+15. Concernant la congélation avec
(saccharose à 12%), les résultats n'ont pas été retenus car la lecture a donné des valeurs
anormalement élevées, dues à la consistance du gel.
Cette étude mérite d’être reprise en utilisant d’autres méthodes de mesure de la biomasse tels
que la cellule Malassez ou le dénombrement. Des essais de conservation par lyophilisations
sont également intéressants à entreprendre ; La lyophilisation étant une méthode efficace
pour la conservation des bactéries.
42
Références bibliographiques
Références bibliographiques
A
ABI AZAR R. (2007). Complexations des protéines laitières par les extraits de gousses vertes
de caroubier Propriétés technologiques des coagulums obtenus. Thèse de Doctorat.
AgroParisTech Ecole Doctorale Abies ,196p.
ACCOLAS J.-P et AUCLAIR J. (1967). Conservation a l'état congeléde suspensions de
bactéries lactiques concentées sous faible volume bactéries lcatiques mésophiles. Station
centrale de Recherches laitières et de Technologie des Produits animaux I.N.R.A., Jouy-enJosas, Yvelines. Pp. 253-254.
AFNOR, lait et produits laitiers : méthode d’analyse, AFNOR, Paris, 1986
AMIOT J et LAPOINTE-VIGNOLA C. (2002). Science et technologie du lait :
transformation du lait. Presses intl. Polytechnique.quebec.600.
AMROUN‐LAGA T.T et ZERROUKI N. (2011). influence des saisons et de l'alimentation
sur la composition du lait de chevres bedouines (capra hircus). Le 22ème Forum des Sciences
Biologiques de L’Association Tunisienne des Sciences Biologiques. 4 p.
ANONYME 3. ISO 9232 / IDF 146. Février (2003). Yaourt. Identification des microorganismes caractéristiques (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus et Streptococcus
thermophilus).
ANONYME 4 XP CEN ISO/TS 11133-2 (V 08-104-2). Janvier (2004). Microbiologie des
aliments. Guide pour la préparation et la production des milieux de culture. Partie 2 : Guide
général pour les essais de performance des milieux de culture.
ANSARTM. (1995). Les industries agricoles et alimentaires, progrès des sciences et
techniques, p, 46 in ANDRIATSIDIKANA D.(2010). Projet de création d’une unité de
fabrication semi – industrielle de fromage a partir de lait de chèvre dans la région
d’ambatolampy. Mémoire du diplôme d’ingénieur. Université d’Antananarivo, 135p.
B
BADAOUI DJ. (2000) : Contribution à la connaissance du lait de chamelle : Essai de
caractérisation des protéines par Electrophorèse sur Gel de poly-Acrylamide (PAGE). Thèse
d’Ingéniorat. Institut d’Agronomie Saharienne. Université d’Ouargla, pp 1-65.
BADIS A.;GUETRANI D.; MOUSSA-BOUDJEMA B.; HENNI D.E. et KIHAL M.
(2004).Identification and technological properties of lactic acid bacteria isolated from raw
goat milk of four Algerian races. Food Microbiol.21, pp.579-588.
BADIS A. ; LAOUABDIA-SELLAMI N. ; GUETARNI D. ; KIHAL M. et OUZROUT
R.(2005).caractérisation phénotypique des bactéries lactiques isolées à partir de lait cru de
chèvre de deux populations caprines locales “Arabia et kabyle’’.Sci et Technol. 23 ,pp.30-37.
43
Références bibliographiques
BALLA A.(2011). Effets de quelques cryoprotecteurs sur la conservation d’une souche
d’intérêt isolée à partir du lait camelin. Thème de Magistère. Université d’ouargla.91p.
BEAL C. ; MARIN M. ; FONTAINE E. ; FONSECA F. et OBERT J. P. (2008).
Production et conservation des ferments lactiques et probiotiques. In Corrieu, G. et Luquet,
F.-M. (ed.). Bactéries lactiques, de la génétique aux ferments. Tec&Doc Lavoisier, Paris,pp.
661-785.
BENT MOHAMED A. et MINT SIDI BABA A.(2007 ).Manuel de travaux pratiques de
microbiologie. Université de Nouakchott faculté des sciences et techniques département de
Biologie.27p
BERT P. and GLAASKER E. (1998). Regulation of compatible solute accumulation in
bacteria. Mol. Microbiol., 29, pp. 397- 407.
BOSSET
J-O;
ALBRECHT
B;
BADERTSCHER
R.
(2000).
Caractéristiques
microbiologiques, chimiques et sensorielles de lait, de caillés et de fromage de chèvre de type
Foermlaggini (buexion, robiola) et Foermagella. Péd . LAIT. France: C N R S, 95 (5), pp.546580.
BOURGEOIS C.M. et LEVEAU JY. (1991). Technique d’analyse et de contrôle dans les
industries agroalimentaires : contrôle microbiologique ; 3, Ed Technique et documentation.
523 p.
C
CARL J. ET KEES VAN D. B.(2004). L'élevage de chèvres dans les zones tropciales. 3ème
édition. Fondation Agromisa, Wageningen. Nugi: 835,103p.
CARPENTER J.F.; PRESTRELSKI S.J. et ARAKAWA T. (1993). Separation of
freezing- and drying-induced denaturation of lyophilized proteins using stress-specific
stabilization. I. Enzyme activity and calorimetric studies. Arch. Biochem. Biophys. 303, pp.
456-464.
CHILLIARD Y. et SAUVANT D. (1987). La sécrétion des constituent du lait. In le lait
matière première de l’industrie laitière. INRA-CEPIL, paris. P13-26
CSONKA L.N. (1989). Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress.
Revew. Microbiol., 53, pp. 121-147.
44
Références bibliographiques
D
DE ROISSART H. et LUQUET F.M. (1994). Les bactéries lactiques. Uriage, Lorica,
France, 1. pp. 1-286.
DEL MORAL A.; SEVERIN J.; RAMOSCORLENZANA D.; TRUPER H.G. and
GALINSKI E.A.., (1994). Compatible solutes in new moderately Halophilic isolates. FEMS.
Miccrobiol. Lett., 12,pp. 165-172.
DELLAGLIO F. ; DE ROISSART H. ; TORRIANI S. ; CURK M. C.et JANSSENS D.
(1994). Caractéristiques générales des bactéries lactiques. Dans Bactéries lactiques volume 1.
LORICA : Uriage, pp.25- 116.
DENIS F. et PLOY M.C. (2007). Bactériologie médicale: techniques usuelles Elsevier
Masson, 573 p.
DESJEUX. JF. (1993). Lait de chèvre et santé : Valeur nutritionnelle du lait de chèvre.
lNRA, 73, pp. 573-580.
DESMAZEAUD M. (1998). bactéries lactiques et qualité des fromages. INRA Jouy-enJosas,p. 1.
DESMAZEAUD M.J. et de ROISSART H. (1994). Métabolisme général des bacteries
lactiques in « Bacterie lactique ». de Roissard et Luquet, Tech.Do. Lavoisier, Paris. Vol. 1,
pp. 169-207.
DE WIT J N. (1998). Nutritional and functional characteristics of whey proteins in food
products. Journal of Dairy Science, 81, pp.597-608.
DORA ANGELICA V. (2007). Faisabilité de la production au Mexique de fromages de
chèvre additionné de piment : aspects technologique, sensoriels, sanitaires et économiques.
Thèse de Doctorale. Université élargie. 273p.
DORTU C. et THONART P. (2009). Les bactériocines des bactéries lactiques :
caractéristiques et intérêts pour la bioconservation des produits alimentaires. Biotechnol.
Agron. Soc. Environ., 13(1), pp. 143-154.
DOYLE MP. ; BEUCHAT LR. ; MONTVILLE TJ. (1997). Food Microbiology:
Fondamentals and Frontiers. Washington DC: ASM Press, p.94.
DUBEUF J.P.; MORAND-FEHR P. and RUBINO R. (2004). Situation, changes and
future of goat industry around the world. Small Ruminant Research, 51, pp.165-173.
45
Références bibliographiques
E
EGON B.H.(2002). Commercial bacterial starter cultures for fermente foods of the future.
International Journal of Food Microbiology, 78, pp.119–131.
EIGEL W N.; BUTLER J E.; ERNSTROM C A.; FARRELL JR.;HARWALKAR V R.;
JENNESS R. and WHITNEY R M. (1984). Nomenclature of proteins of proteins of cow’s
milk: fifth revision. Journal of Dairy Science, 67, pp.1599-1631.
F
FAO. (1998). le lait et les produits laitiers dans la nutrition humaine. Collection FAO :
Alimentation et nutrition n°28.Bibliothèque David Lubin. FAO. Rome Italie.
FICOW H. (2010). Lait de chèvre vérités et contrevérités (santé). Filière ovine et caprine
n°34- 4ème trimestre. 6 p.
FONSECA F. et CORRIEU G. (2001). Cryoprotection and freezing influence on
acidification activity of thermophilic lactic acid bacteria. Relationships between biologic and
thermodynamic properties. These de doctorat: Institut national agronomique Paris-Grignon,
Paris (France).
FRANK J. F. et HASSAN A. N. (1998). Starters cultures and their use. In Applied Dairy
Microbiology.Marth, E. H. et Steele, J. L. (ed.). Marcel Dekker, Inc., New York, pp.131-172.
FRANK V. B. (2003). Le lait de chèvre…La santé. 36 p.
FULLER B. J. (2004). Cryoprotectants: the essential antifreezes to protect life in the frozen
state. Cryoletters 25(6), pp.375-388.
G
GUEGUEN L. (1996). La valeur nutritionnelle minérale du lait de chèvre. Intérêts
nutritionnel et diététique du lait de chèvre. Actes du colloque : Le lait de chèvre, un atout pour
la santé, INRA. Niort, France, pp.67-80.
GUIRAUD J.P.(2003). Microbiologie Alimentaire. Tec & Doc, Dunod. Paris.pp. 90-292.
H
HENNANE M. (2011). Lait cru de chèvre en Algérie. - Licence de microbiologie 2011.
Université Abderrahmane Mira de Bejaia, 50 p.
HANS J.B.; DONALD B.E.N.; and RICHARD G.J. (1995). Adaptations to
environemental stresses. Plant. Cell., 7, pp.1099-1111.
HEY J. M. et MACFARLANE D. R. (1998). «Crystallization of ice in aqueous solutions of
glycerol and dimethyl sulfoxide 2: ice crystal growth kinetics». Cryobiology., 37, pp.119-130.
46
Références bibliographiques
HOGG T. (2005). Essential microbiology. John Wiley & Sons, Ltd.pp. 188-190.
HOLMES A D.; LINDQUIST G. and GREENWOOD E K. (1945). Variation in fat,
ascorbic acid and riboflavin content of goat’s milk. Massachusettes Agricultural Experiment
Station, pp.853-858.
HOLMES-PEGLER (1966); BABO (2000); FOURNIER (2006) in MANALLAH I.
(2012). Caractérisation morphologique des caprins dans la région de Sétif. Mémoire de
magister, université Ferhat Abbas SETIF, 107p.
HURLLEY W L.; GRIEVE R C J.; MAGURA C E.;HEGARTY H M. and ZOU S.
(1993). Electrophoretic comparisons of lactoferrine from bovine mammary secretion, milk
neutrophils, and human milk. Journal of Dairy science, 76, pp. 377-387.
J
JAKOB E.; WINKLER H.; HALDEMANN J. (2009). Critères microbiologiques pour la
fabrication du fromage. ALP N° 77 f: p.5.
JEWELL J.B.; AND KASHKET E.R. (1991). Osmotic ally regulated transport of proline
by Lactobacillus acidophilus IFO 3532. Appl. Environ. Microbiol., 57, pp.2829-2833.
K
KEBCHAOUI J. (2013). Le lait compositions et propriétés. 37 p.
KETS E.P.W.; CALINSKI E.A.; WIT M.; DE BONT J.A.M.; and HEIPIEPPER H.J.
(1996a). Mannitol: a novel bacterial compatible solute in Pseudomonas putida S12. J.
Bacteriol., 178, pp.6665-6670.
KETS E.P.W.; CALINSKI E.A.; WIT M.; DE BONT J.A.M. et HEIPIEPPER H.J.
(1996). Mannitol: a novel bacterial compatible solute in Pseudomonas putida S12. J.
Bacteriol., 178, pp.6665-6670.
KIM W.S.; REN J.et DUNN N.W. (1999). Differentiation of Lactococcus lactis subspieces
lactis and subpices cremoris strains by their adaptive response to stresses.FEMS Microbiol
Lett.171(1): pp57-65.
47
Références bibliographiques
KORKEALA H.; ALANKO T.;MÄKELÄ P. and LINDROTH S. (1989). Shelf-life of
vacuum-Packed cooked ring sausage at different chill temperatures. Int. J. Food Microbiol., 9,
pp.237-247.
L
LAI M.C.; SOWERS K.R.; ROBERTSON D.E.;ROBERTS M.F. et GUNSALUS R.P.
(1991). Distribution of compatible solutes in the halophilic methanogenic archaebacteria . J.
Bacteriol., 173, pp. 5352-5358.
LANGELLA P. ; NOUAILLE S. ; COMMISSAIRE J. ; BOLOTINE A. ; GRUSS A. et
LE LOIR Y. (2001). Characterization of host factors affecting heterologous protein secretion
in Lactococcus lactis. Lait 81, pp.19-28.
LARPENT J.P. ; 1997. Microbiologie alimentaire. Tec & doc, Lavoisier. Paris. 1041 P.
LE JARD F. ; BOYAVAL P. ; DE ROISSART H. et MARUEJOULS R. (1994).
Production de ferments concentrés pour ensemencement direct. In De Roissard, H. et Luquet,
F. M. (ed.). Bactéries lactiques. Lorica, Uriage, pp.539-553.
LEFRILEUX Y.; RAYNAUD S.; MORGE S.; BARRAL J.; GAUZERE Y.; DOUTART
E.; LAITHIER C. (2009). Influence de deux systèmes d’alimentation sur la production et la
composition du lait de chèvres hautes productrices et incidences technologiques en fabrication
fermière lactique. Renc. Rech. Ruminants.p. 139.
LEGARTO J. et PALHIERE I. (2013). La composition fine du lait de chèvre en acides gras
: effets des pratiques d’élevage et de la génétique.23p.
LESLIE S.B.; LIGHTHART I.B.; CROWE J.H. et CROWE L.M. (1995). Trehalose and
sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying. Appl. Enviro.
Microbiol., 61, pp.3592-3597.
M
MAMI A. (2013). Recherche des bactéries lactiques productrices de bactériocines à large
spectre d’action vis-à-vis des germes impliqués dans les toxi-infections alimentaires en
Algérie. Thèse de doctorat. Université d’Oran.176p.
MANALLAH I. (2012). Caractérisation morphologique des caprins dans la région de Sétif.
Mémoire de magister, Université Ferhat Abbas–SETIF, 8
MADIGAN M. et MARTINKO J. (2007). Biologie des microorganismes. Edition Pearson
Education, 11èmeédition. Paris. pp.145-146.
48
Références bibliographiques
MAHE S. (1996). Valeur nutritionnelle du lait en alimentation humaine. Intérêts nutritionnel
et diététique du lait de chèvre. Actes du colloque : Le lait de chèvre, un atout pour la santé,
INRA. Niort, France. P. 13.
MARCHAL N. ; OBRE A. ; BUTTION R. ; BOUDON J.L. et RICHARD C.L. (1982).
Les Milieux de Cultures pour l’Isolement et l’Identification Biochimique des Bactéries.
DOIN, 2ème Ed., Paris.482p.
MARIE-MADELEINE R .; ALAIN B. ; SEBASTIEN R. (2007).Micro-biochimie et
alimentation. Ed .Laurence Audent- Verrier. 279 p.
MARSHALL K. (2004). Therapeutic applications of whey protein. Alternative. Medicine
Review, 2, pp.136-156.
MARUEJOULS A. et CAIGNIET A. (1983). Les cultures concentrées congelées. La
Technique Laitière 976, pp.38-43.
MATHIEU J. (1998) : Initiation à la physico-chimie du lait. Tec. Doc., 1éreEd. Lavoisier,
Paris.
MAURER J. ; BERGER T. ; AMREIN R.et SCHAEREN W. (2013). Critères de qualité
pour le lait de chèvre et de brebis: exigences et valeurs indicatives ainsi que propositions pour
un paiement du lait selon des caractéristiques qualitative. ALP forum n° 9:pp. 4-6.
MAYNARD F. ; PIERRE A. et MAUBOIS J.L. (1989). Préparation de lactoferrine et
d’lactalbumine humaines par utilisation de techniques à membranes. Lait, 69,pp.59-69.
MÄYRÄ-MÄKINEN A. et BIGRET. (1998). Industrial use and production of lactic acid
bacteria. In Salminen, S. et Von Wright, A. (ed.). Lactic acid bacteria: microbiology and
functional aspects. Marcel Dekker, Inc., New York, pp.73-102
MERYMAN H. T. (1974). «Freezing injury and its prevention in living cells». Annu Rev
Biophys Bioeng, 3, pp.341- 363.
MIRANDA G. et GRIPON J.C. (1986). Origine, nature et incidences technologiques de la
protéolyse dans le lait. Lait, 66,pp. 1-8.
MONTEL N-C. (2003). Pratiques d'élevage, microflore du lait et qualité des produits laitiers.
Prod. Anim.-France : INRA, 16, (4), pp. 279- 282.
MOUALEK I. (2011). Caractérisation du lait de chèvre collecté localement : séparation
chromatographiques et contrôles électrophorétiques des protéines. Mémoire de magister.
Université Mouloud Mammeri de Tizi Ouzou, 101 p.
49
Références bibliographiques
N
NOUSIAINEN J.; JAVANAINEN P. ; SETALA J. ET WRIGHT A.V. (2004). Lactic acid
bacteria as animal probiotics. In : Lactic acid bacteria: microbiological and functional aspects
(Salminen S., Wright A.V. et Ouwehand A.). 3e Ed., Marcel Dekker, Inc. New York. Pp.547560.
O
ONER M.D. et ERICKSON L.E. (1986). Anaerobic fermentation of Lactobacillus
bulgaricus and Streptococcus thermophilus on 3% non fat dry milk pur and mixed culture,
Biotechnology Bioengeneering; 28,pp. 883-894.
O'SULLIVAN L.; ROSS R.P. et HILL C. (2002). Potential of bacteriocin-producing lactic
acid bacteria for improvements in food safety and quality. Biochimie, 84, pp.593-604.
OUADGHIRI M. (2009). Biodiversité des bactéries lactiques dans le lait cru et ses dérivés «
Lben » et « Jben » d’origine marocaine. Thèse de doctorat en Microbiologie et Biologie
Moléculaire, université mohammed v – agdal faculté des sciences, rabat, 132p .
OUWEHAND A. C. ; SALMINEN S. et ISOLAURI E. (2002). Probiotics: an overview of
beneficial effects. Antonie Van Leeuwenhoek 82, pp.279-289.
P
PALASZ A. T. et MAPJETOFT R. 1. (1996). «Cryopreservation of mammalian embryos
and oocytes: recent advances». Biotechnol Adv., 14, pp.127-149.
PARK W Y.; JUAREZ M .; RAMOS M. and HAENLEIN G. F. W. (2007).
Physicochemical characteristics of goat and sheep milk. Small Ruminant Research.68,pp. 88113.
PAUL ROSS R.; MORGAN S. et HILL C. ( 2002). Preservation and Fermentation: present
and future. Int. J. Food. Microbio. 79, pp.3 – 16.
PEGG D.E. et DIAPER M. P. (1988). «On the mechanism of injury to slowly frozen
erythrocytes». Biophys., 54,pp. 471-488.
PETRANSXIENE D. (1981). Qualité bactériologique du lait et produits laitiers. Analyses et
tests.2 Ed. Tec.& Doc, Paris,228p.
PRESCOTT L.M.; HARLEY J.P. et DONALD A. (2003). Microbiologie, De boeck
université, 2eme édition française. 128, pp.28-29.
50
Références bibliographiques
R
.
RAYNAUD S. (2006). Régulation métabolique et transcriptionnelle de l’auto acidification
chez Lactoccocus lactis. Thése Doctorat.Université Paul Sabatier, Toulouse, France.310p.
RIBADEAU-DUMAS B. (1991). Physicochimie et biochimie des protéines du lait données
récentes. Lait, 71, pp.133-139.
RIBADEAU-DUMAS B.nad GRAPPIN R. (1989). Milk protéine analysais. Lait, 69,
pp.357-416.
RICORDEAU G . (1993). Lait de chèvre en Europe : État des recherches sur le lait de chèvre
en France. INRA, 73, pp. 443-453.
RODRIGUEZ J. M. ; MARTINEZ M. I. ; HORN N. et DODD H. M. (2003).
Heterologous production of bacteriocins by lactic acid bacteria. International Journal of Food
Microbiology 80, pp.101-116.
RUAS-MADIEDO P.; HUGENHOLTZ J. et ZOON P. (2002). An overview of the
functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria. International Dairy
Journal, 12, pp. 163-171.
RUTHERFORD, T. J., MARSHALL, D. L., ANDREWS, L. S., COGGINS, P. C.,
SCHILLING, M. W. and GERARD, P. (2007). Combined effect of packaging atmosphere
and storage temperature on growth of Listeria monocytogenes on ready-to-eat shrimp. Food
Microbiology 24, pp.703-710.
S
SALMINEN S. et VON WARTGHI A. (2012). Lactic acid bacteria: Microbiology and
functional aspects. Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 1-72.
SANDINE WE., RADICH PC., ELLIKER PR. (1972). Ecology of the lactic streptococci.
J. Milk Food Technol., 35, pp.176-184.
SEBASTIEN M. (2008).Caractérisation de bactéries lactiques psychrotrophes en vue de leur
utilisation dans la biopréservation des aliments. Étude physiologique et moléculaire des
mécanismes d’adaptation au froid. Thèse de doctorat. Université de nantes faculté des
sciences et techniques. 189 P.
SHKOLNIK A.; MALTZ E. and GORDIN S. (1980). Desert conditions and goat milk
production. Journal of Dairy Science, 63, pp.1749-1754.
51
Références bibliographiques
SHUSTER D E.; and HARMON R J. (1990). Enzyme immunoassay of bovine lactoferrine
and serum albumin in acid precipitated and ultracentrifugal whey. Journal of Dairy Science,
73, pp.3104-3111.
SIBOUKEUR O. (2007). Etude du lait camelin collecté localement : Caractéristiques
physico-chimiques et microbiologiques ; aptitudes à la coagulation. Thèse de Doctorat,
Institut National Agronomique El-Harrach-Alger, 135 p.
SIBOUKEUR A. (2011). Etude de l’activité antibactérienne des bactériocines (type nisine)
produites par Lactococcus lactis sub sp lactis, isolée à partir du lait camelin. Thème de
Magistère. Université Kasdi Merbah- Ouargla, 113p.
SMITH D. (2001). Provision and maintenance of micro-organisms for industry and
international research networks. Cryo Letters 22, pp. 91-96.
SOUID W. (2011). Effet des bactériocines (type nisine) produites par une souche lactique
isolée a partir du fromage camelin, sur une souche psychrotrophe. Thème de Magistère.
Université Kasdi Merbah- Ouargla, 106p.
STREIT F. (2008). influence des conditions de recolte et de concentration sur l’état
physiologique et la cryotolerance de lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus cfl1. Thèse
Doctorat. L’institut des sciences et industries du vivant et de l’environnement (agro paris
tech). Spécialité : génie microbiologique. 226 p.
T
TAMIME A. Y. et ROBINSON R. K. (1999). Preservation and production of starter
cultures. In Tamime, A. Y. et Robinson, R. K. (ed.). Yoghurt: Science and Technology.
Woodhead publishing limited, Cambridge, England, pp.486-514.
TEJANI K. (2010). Le partial de la nature et l'écologie en Algérie. Revue de web et article
sur l'environnement en l'Algérie. Réseau de competence et de bonne volontés. Outil web de
recherche: Ecologie et environnement en Algérie en Afrique de Nord, en Méditérranée et dans
le reste du monde.
TERZAGHI B.E. et SANDINE W.E. (1975). Improved medium for lactic streptococci and
their bacteriophages. Applied Microbiology, 29, pp.807-813.
TEUBER M. (1995). Les genres de bactéries lactiques: le genre lactococcus volume 2.
Springer.US, pp. 173-234.
TEUBER M. et GEIS A. (2006). The Genus Lactococcus. In «The prokaryotes »3ème
EDITION. A hand book of biology of bacteria. Ed Springer. New York,pp.205-228.
TOUHAMI M. (1996). Intérêt nutritionnel et diététique du lait de chèvre. Intérêt nutritionnel
du lait de chèvre. INRA. Niort, France (les colloques, n°81), p.96.
52
Références bibliographiques
V
VALERIE C.; SEGOLENE D.; MARION B.; MICHELINE G, et JEAU PAUL N.
(2003).Isolation, characterization and identification of lactobacilli focusing mainly on cheeses
and other dairy products, lait 83, Review article,DOI:10.1051.lait : 2003019.269.
VANDAMME P.; POT B.; GILLIS M.; DEVOS P.; KERSTERS K. et SWINGS J.
(1996). Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol. Rev.
60, p.407.
VÉZINA et LACROIX (2000). Tests biochimiques classiques pour l’identification des
Pectobacterium (erwinia pectinolytiques) et des Pseudomonas Fluorescents. Laboratoire De
Diagnostic En Phytoprotection – MAPAQ
VIERLING E. (2008). Aliments et boissons: filières et produits, Editions Doin, 277 p.
VIGNOLA C.L. (2002). Science et technologie du lait: transformation du lait, Fondation de
technologie laitière du Québec , Presses inter Polytechnique, 600 p.
VOJTECH A.; ONDREJ Z.; PETR D.; LADISLAV Z.; ALES H.;JAROMIR H.; JAN
S.; SONA K.; LIBUSE T. and RENE K. (2008). Lactoferrin isolation using monolithic
column coupled with spectrometric or micro-amperometric detector. Sensors, 8, pp.464-487.
W
WALTER S. (2007). Production de lait de chèvre et de brebis: la qualité s'avére payante.
Station de recherche Agroscope Liebefeld-Posieux ALP,actuel: no 29,4p.
WISSELINK H. W.; WEUSTHUIS R. A.; EGGINK G.; HUGENHOLTZ J. et
GROBBEN G. J. (2002). Mannitol production by lactic acid bacteria: a review. International
Dairy Journal, 12, pp.151- 161.
Z
ZELLER B. (2005). Le fromage de chèvre : spécificités technologiques et économiques.
Devant l’Université Paul-Sabatier de Toulouse. P.79.
53
Annexes
Annexes
Annexe n°1
Le milieu M17 (OUADGHIRI, 2009).
-Tryptone........................................................2,50 g
- Peptone pepsique de viande .........................2,50 g
- Peptone papaïnique de soja ..........................5,00 g
- Extrait autolytique de levure.........................2,50 g
- Extrait de viande ...........................................5,00 g
- Lactose ..........................................................5,00 g
- Glycérophosphate de sodium ......................19,00 g
- Sulfate de magnésium ...................................0,25 g
- Acide ascorbique ...........................................0,50 g
- Agar bactériologique....................................15,00 g
Annexe n°2
Test de la réductase (LARPENT, 1997 ; GUIRAUD, 1998).
1) Homogénéiser l’échantillon par 25 agitations manuelles successives.
2) En placer 10 ml de l’échantillon, aseptiquement, dans un tube stérile fermé par un bouchon
stérile.
3) Ajouter alors 1ml d’une solution standardisé de bleu de méthylène à 5 mg pour 100 ml
d’eau.
4) Après fermeture de tube, on le retourne une ou deux fois pour obtenir un mélange
homogène du lait et du colorant.
5) Placer dans un bain d’eau à 37°C et noter le temps de cette immersion (le niveau de l’eau
du bain d’eau doit être supérieur à celui du lait dans le tube).
Décoloration en
Nombre de bactéries/ ml
Qualité du lait
5 heures ou plus
100 000-200 000
Bonne
2 à 4 heures
200 000à 2 millions
Bonne à passable
Moins de 2 heures
2 à 10 millions
Insuffisante
54
Annexes
Annexe n°3
Préparation des dilutions (SIBOUKEUR, 2011).
La dilution est réalisée afin de diminuer le nombre de colonies. Le meilleur résultat
(colonies isolées) est statistiquement obtenu pour des boites comportant entre 30 et 300
colonies (MADIGAN et al., 2007).
1ml de lait camelin ou bovin collecté est prélevée aseptiquement à l’aide d’une pipette
préalablement stérilisée. On aspire et on refoule le lait au moins une fois dans la pipette, avant
d’effectuer le prélèvement. La pipette ne doit pas être plongée de plus de 1 à 2 cm dans le lait.
La prise d’échantillon est introduite aseptiquement dans un tube contenant 9 ml de
diluant. La pipette ne doit pas entrer en contact avec le diluant.
Le tube est agité doucement mais suffisamment pour rendre la dilution homogène. Il
faut éviter le barattage survenant au cours d’une agitation trop violente.
A d’une nouvelle pipette stérile, aspirer et refouler le mélange à plusieurs reprises et prélever
1 ml de la première dilution (1/10), la pipette plongeant de 1 à 2 cm dans le liquide. Le
millilitre de dilution est introduit dans un deuxième tube contenant 9 ml de diluant, on obtient
ainsi la dilution au 1/100.
Une troisième opération est effectuée de la même manière afin d’obtenir une dilution au
1/1000. Une quatrième opération est réalisée afin d’obtenir une dilution de 1/10000.Une
nouvelle pipette stérile est employée pour chaque temps de ces dilutions.
Annexe n°4
Coloration de Gram

Déposer une goutte d‘eau physiologique stérile sur une lame bien propre ;

Prélever un échantillon de colonie et mélanger avec la goutte d’eau, strier et sécher par
passage rapide sur la flamme d’un bec benzène ;

Couvrir le frottis par du cristal violet pendant 60 secondes ;

Laver l’excès du colorant avec de l’eau distillée ;

Couvrir de lugol pendant 30 secondes ;

Laver à l’eau distillée pendant 5 secondes ;

Rincer immédiatement le frottis avec le mélange alcool - acétone en inclinant la lame
et par goutte à goutte jusqu’à disparition complète de la coloration violette;

Laver à l’eau distillée pendant 5 secondes ;
55
Annexes

Couvrir avec de la fuschine pendant 15 secondes

Laver à l’eau distillée pendant 10 secondes

Déposer une goutte d’huile à immersion sur le frottis et observer au microscope à un
fort grossissement.
Les cellules G+ absorbent la couleur du cristal violet et demeurent bleues violettes en
apparence, contrairement aux cellules Gram- qui apparaissent distinctement
56
Annexes
Annexe n°5
Etapes suivies pour conserver la souche isolée et purifiée
1 colonie pure
Etape n°1
=
=
=
=
Le tube contient 1ml de bouillon M17
Incuber les 05 tubes à température 30°C pendant 24heures
Etape n°2
1ml d'inoculum
=
=
=
=
Le tube contient 9ml de bouillon M17
Incuber les 05 tubes à température 30°C pendant 24heures
Etape n°3
Glycérol 10%
Verser le tube précédent
Erlenemeyer de 250ml
contient 90ml de milieu de
conservation pour prépare le
pourcentage 10%
10%10%
=
10%
=
=
Saccharose 12%
=
10% 10%
Incuber les 05 tubes à température 30°C pendant 24heures
57
Annexes
Etape n°4
Mesure de la turbidité à longueur d'onde 600nm et établissement d'un courbe étalonnage avec
10ml de la culture à 10%.
Etape n°5: conservation de la souche
Sans cryo-protecteur
=
Réfrigération
congélation sans
=
T ambiante
58
Avec cryo-protecteur
=
=
Glycérol
10%
Saccharose
12%
Résumé
Contribution de l’étude de conservation d’une souche de lactocoques isolée
caprin
àpartir du lait
La conservation de suspensions actives pendant des périodes assez longues permet leur utilisation en
technologie, sous forme liquide, congelée ou lyophilisée. Dans ce contexte, cette étude est une
contribution à la conservation, d'une souche de lactcoques (lactcoccus lactis) isolée à partir du lait caprin
par deux techniques : réfrigération et congélation en l’absence et/ou présence de cryo-protecteur (glycérol
10%, saccharose 12%) des échantillons conservés à la température ambiante servie de témoin. Les résultats
obtenus indiquent une chute de la biomasse quelque soit les conditions de conservation. En effet, la
biomasse initiale J0 à10%, diminue dans le cas de la réfrigération et de la congélation sans cryo-protecteur
jusqu'à la 2.8 % à J0+15 et à 3.2% à J0+10 respectivement. La congélation avec cryo-protecteur (glycérol
10%) atteint. Concernant la congélation avec saccharose à 12%), n’a pas pu.
Mots clé : Lait, caprin, lactocoques, conservation, cryo-protecteurs
Abstract
Contribution to the study of conservation of a strain of Lactococcus isolated from goat milk
Conservation of active suspensions for extended periods allows their use in technology, in liquid,
frozen or lyophilized form. In this context, this study is a contribution to the conservation of a
strain of lactcoques (lactcoccus lactis) isolated from goat milk by two techniques: cooling and
freezing in the absence and / or presence of cryo-protective (glycerol 10% sucrose 12%) of the
samples stored at room temperature served as control. The results indicate a decline in biomass
whatever the storage conditions. Indeed, the initial biomass D0 to 10%, decreases in the case of the
refrigerating and freezing cryo-protector without 2.8 to 15% and at day 0 at 3.2% to 10 J0
respectively. Freezing with cryo-protective (10% glycerol) achieved. On freezing with sucrose
12%), the Beer-Lambert law is not verified.
Keywords: Milk, goat, Lactococcus, conservation, cryo-protective.
‫الملخص‬
‫ المعزولة من حليب الماعز‬lactocoques ‫مذخل في دراسة حفظ الساللة‬
, ‫ عهً شكم سائم‬, ‫ من أجم انسماح باسخعمانها فٍ انصناعت انغزائُت‬, ‫دفظ مذهىل بكخُشٌ نشط خالل فخشاث صمنُت طىَهت انمذي‬
‫ راث اننىع‬lactcoques ‫ حهذف هزه انذساست إنً انمساهمت فٍ دفظ انسالنت‬, ‫ فٍ هزا اإلطاس‬. ‫مثهج او مجفف بانخجمُذ‬
‫ انخخضَن فٍ انبشاد وانخخضَن فٍ انمجمذ بىجىد أو عذو وجىد‬: ‫ بخقنُخُن‬, ‫ انمعضول من دهُب انماعض‬,(lactcoccus lactis)
‫ اننخائج انمخذصم‬.‫ وانعُناث مذفىظت فٍ دسجت دشاسة عادَت كشاهذ‬, ) 12% ‫ انسكشوص بنسبت‬,10% ‫انذافظ (انجهُسشول بنسبت‬
‫ نكم من حقنُت حخضَن فٍ انبشاد و حقنُت‬%3.2‫ و‬2.8 ‫ إنً غاَت‬%10 ‫عهُها حىضخ نضول نهكخهت انبكخُشَت انمخضنت باننسبت االبخذائُت‬
)10% ‫ أما بما َخعهق بخقنُت حخضَن بىجىد دافظ (انجهُسشول بنسبت‬, ‫ عهً انخشحُب‬J0+10 ‫ و‬J0+15 ‫حخضَن فٍ انمجمذ فٍ انُىو‬
‫ ; أما فٍ ما َخص حقنُت حخضَن بىجىد دافظ من نىع‬J0+15 ‫ فٍ انُىو‬0.07 % ‫ انً غاَت‬10 % ‫اننخائج كانج كماَهٍ من‬
. ‫ اننخائج انمخذصم عهُها كانج عباسة عن قُاط ننسبت حشكُض انسكشوص فٍ انعُنت انمخضنت‬12 % ‫سكشوص‬
.‫ انذافظ‬,‫ حقنُت حخضَن‬, lactocoques, ,‫ انماعض‬,‫ دهُب‬:‫الكلمات المفتاحية‬