G47-48, C. Moutou Sophie Bur et Stéphane Konrad Cours du 23/11

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G47-48, C. Moutou Sophie Bur et Stéphane Konrad
Cours du 23/11/11 de 14h à 16h
M1 Physiopathologie
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Diagnostic pré-implantatoire et biologie moléculaire
Objectifs :
- Contexte
- Les étapes du DPI
- Le cadre législatif
- Les difficultés lors du DPI
- Aspects techniques
- Aspects pratiques
- Résultats
I. LE CONTEXTE
Définition : C’est une technique qui s’adresse à des couples qui ont un risque de transmettre une
maladie génétique d’une particulière gravité à leurs enfants.
Elle consiste à faire le diagnostic avant même que la grossesse ne commence, c’est-à-dire en période
pré-implantatoire. On fait appel à la fécondation in vitro (FIV) pour avoir des embryons en dehors du
corps de la femme.
Quand un couple est à risque de transmettre une maladie, il y a plusieurs solutions :
- Grossesse puis diagnostic prénatal (choriocentèse vers 11 SA ou amniocentèse). Si le fœtus
est atteint (1 chance sur 4 à 1 chance sur 2), on peut proposer l'IMG.
- Recours à l'adoption
- Recours aux dons de gamètes (spermatozoïdes ou ovocyte) ou d'embryon (procréation
médicalement assistée)
- Le diagnostic pré-implantatoire (DPI). On fait le test avant la grossesse.
A. La procédure
Après une stimulation ovarienne, on va réaliser une FIV (J0), que le couple soit fertile ou non. Ensuite,
on réalise l'analyse génétique à J3. Cette analyse commence par une étape de biopsie embryonnaire,
puis on fait une analyse génétique (qui diffère selon la maladie).
Puis on transfère les embryons sains ou porteurs sains (dans le cas des maladies récessives) dans
l’utérus de la patiente.
Ce transfert peut se faire dès l’obtention des résultats (à J3). Actuellement, beaucoup de centres
transfèrent à J4 et de plus en plus à J5 quand l’embryon a atteint le stade de blastocyste.
B. Objectifs
- Détection de l'anomalie avant le début de la grossesse
- Eviter le diagnostic prénatal et les interruptions médicales de grossesses (IMG)

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II. LES ETAPES DU DPI
Rappels chronologiques
La fécondation a lieu dans les trompes, puis l’embryon se divise (2, 4, 8 cellules). Puis il y a formation
de la morula et du blastocyste qui va aller s’implanter dans la muqueuse utérine vers le 6ème jour.
Le DPI va se dérouler à J3 alors que toutes les cellules de l’embryon sont encore totipotentes, c’est-à-
dire qu’elles peuvent donner n’importe quel type de cellules de l’embryon ou des annexes.
A ce stade de développement embryonnaire, on peut enlever jusqu’à ¼ de la masse embryonnaire
sans altérer son développement futur.
A. FIV
But : obtenir plusieurs embryons en-dehors de l’utérus pour en avoir au moins un sain à transférer.
Les étapes de la FIV :
- On commence par une stimulation ovarienne afin d’obtenir plusieurs ovocytes
- Ensuite on réalise une ponction ovocytaire
- Puis on réalise la FIV. Dans le cas du DPI on fait une ICSI (Injection Intra-Cytoplasmique de
Spermatozoïde).
- Enfin on met les embryons en culture jusqu'au 3ème jour où on réalise le DPI.
 FIV classique
Principe : mettre en contact l’ovocyte recueilli avec des spermatozoïdes. 1 seul spermatozoïde doit
rentrer dans l’ovocyte pour le féconder. Les autres restent autour de l’embryon.
Problème : on se trouve avec des millions de spermatozoïdes autour de cet ovocyte. Lorsque l’on veut
ponctionner une cellule du zygote, on risque de prendre des spermatozoïdes avec et donc d’analyser
l’ADN paternel. Afin d’éviter cette contamination, on fait une ICSI.
 ICSI
1 seul spermatozoîde est injecté dans l’ovocyte à l’aide d’une micropipette. Il n’y a pas d’autre
spermatozoïde autour.
B. Biopsie embryonnaire
But : obtenir du matériel biologique à analyser.
Elle peut se faire à différents moments :
- Biopsie de 1er globule polaire (qui est le complément génétique de l’ovocyte) : permet de
déduire de quel allèle maternel l’ovocyte a hérité. Intérêt uniquement quand la mère risque de
transmettre la maladie. On l’utilise dans des pays où il est interdit de toucher à l’ovocyte.
Les laboratoires font souvent une biopsie de 2ème globule polaire (produit de la 2ème division de
méiose) pour confirmer ce résultat.
- Biopsie au stade de clivage à J3 (90% des DPI)
- Biopsie au stade blastocyste (permet d’avoir plus de matériel génétique mais il faut savoir
cultiver les embryons plus longtemps et les congeler afin d’éviter qu'ils se débarrassent de la
zone pellucide).
 Technique la plus classique, à J3
 Il faut d'abord perforer la zone pellucide. Pour cela il y a différentes techniques :
- Perforation mécanique
- Technique chimique : acide de tyrode qui rogne la zone pellucide
- Laser, pour réaliser un petit trou dans la zone pellucide
 Ensuite, on prélève 1 à 2 blastomères avec un micromanipulateur (sous microscope)
 On remet l'embryon en culture jusqu’au moment du transfert
 On prépare les blastomères pour l'analyse
Il faut bien vérifier que la cellule qu'on prélève possède un noyau.

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C. L'analyse génétique
En général, on prélève 1 ou 2 cellules selon la fiabilité du test. Chacune est analysée de manière
indépendante.
- Amplification par PCR (polymerase chain reaction) quand on cherche une maladie
monogénique (biologie moléculaire)
- Hybridation par FISH (fluorescent in situ hybridisation) quand on cherche une maladie
chromosomique (cytogénétique moléculaire)
D. Le transfert
Il a lieu à J4/J5. Il se fait sous échographie.
On transfère les embryons sains ou porteurs sains (dans les maladies récessives) qui ont évolué (1 à
3).
En général, on évite d'implanter plus d'un embryon, sauf si les chances de réussite sont faibles
(dépend notamment de l'âge maternel, au-delà de 38 ans, les chances deviennent vraiment faibles).
Il y a jusqu'à 4 tentatives remboursées par la Sécurité Sociale.
S'il reste des embryons, on peut les congeler. On pourra s'en servir pour une nouvelle tentative ou
pour un nouvel enfant si cela a marché. Les embryons congelés puis décongelés après DPI résistent
moins bien.
Les embryons atteints ou en mauvais état sont détruits ou réanalysés. C'est important de réanalyser,
car on n’a aucun moyen de contrôler ce qu'on a diagnostiqué.
15 jours après le transfert, on fait une prise de sang avec dosage hormonal de β-HCG.
III. LE CADRE LEGISLATIF (EN FRANCE)
Dans certains pays, il n’y a aucune loi sur ce sujet. Dans d’autres pays (Suisse, Autriche), le DPI est
strictement interdit.
En France, la pratique est très encadrée. La loi qui a autorisé la pratique du DPI est la loi de
bioéthique de 1994 :
L94-654 relative au don et à l’utilisation des éléments et produits du corps humain, à l’assistance
médicale à la procréation et au diagnostic prénatal.
Le DPI est assimilé à un DPN très précoce en France, alors que d'autres pays parlent plutôt de
recherche sur l'embryon.
Les décrets d'application sont sortis en 1998.
Les 1ers agréments pour la pratique du DPI ont été délivrés en 1999 (en 1989 pour le Royaume-Uni
par exemple).
La loi de bioéthique est révisée tous les 5 ans normalement : 2004 la première fois (5 ans de retard),
ensuite 2011 (2 ans de retard).
La loi française dit :
Le diagnostic biologique effectué à partir de cellules prélevées sur l’embryon in vitro :
- Autorisé qu’à titre exceptionnel
- Un médecin d’un centre de DPN pluridisciplinaire atteste de l’indication
- Forte probabilité de donner naissance à un enfant atteint d’une maladie génétique d’une
particulière gravité reconnue comme incurable au moment du diagnostic

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- La ou les anomalie(s) responsable(s) doivent être préalablement identifiées
- Consentement écrit du couple
- Recherche uniquement de cette anomalie
- Les moyens de la prévenir et de la traiter
- Etablissement spécifiquement autorisé après avis de la CNMBRDPN/Agence de la
Biomédecine (révision 2004)
Révision du 06/08/2004
- Anomalie préalablement identifiée chez l’un des parents « ou l’un de ses ascendants
immédiats dans le cas d’une maladie gravement invalidante, à révélation tardive et mettant
prématurément en jeu le pronostic vital »
- A titre expérimental, lorsque les conditions suivantes sont réunies : un enfant atteint d’une
maladie génétique entraînant la mort dès les premières années de la vie et reconnue comme
incurable au moment du diagnostic
- Le pronostic vital peut être amélioré, de façon décisive, par l’application sur celui-ci d’une
thérapeutique ne portant pas atteinte à l’intégrité du corps de l’enfant né du transfert de
l’embryon in utéro.
- Le diagnostic a pour seul objet de rechercher la maladie génétique ainsi que les moyens de la
prévenir et de la traiter, et de permettre l’application de la thérapeutique mentionnée d’autre
part
- Consentement écrit
- Autorisation de l’Agence de la Biomédecine
 Les centres de DPI en France
3 centres en France :
- Paris (Béclère – Necker)
- Montpellier (Arnaud de Villeneuve)
- Strasbourg (CHU – CMCO)
Depuis 2011, l'hôpital de Nantes a reçu une partie des agréments (pas les 3), alors que l'hôpital de
Grenoble n'a pas l'autorisation (mais les agréments).
Il y a un seul groupe de travail sur le DPI, au sein de l'agence de Biomédecine.
Cela permet d'être plus fort pour demander des moyens. Cela permet également de partager les
expériences et de se répartir les pathologies. En effet, il y a beaucoup de pathologies orphelines. Un
seul centre s'occupe d'une maladie donnée.
Il y a un consortium européen qui collecte des données de tous les centres européens, tous les ans.
Cela permet de donner des statistiques et de suivre l'évolution de l'activité.
IV. DIFFICULTES DU DPI
A. Difficultés pour le couple
- Le risque de transmettre une maladie génétique. Souvent, c'est déjà le cas (enfant malade ou
décédé). Parfois, il y a eu plusieurs fausses couches ou IMG.
- Il faut passer par la FIV, alors que les couples ne sont pas forcément stériles
- Il y a donc de faibles taux de grossesses (25 à 35% en moyenne)
- Tous les couples n'ont pas la possibilité d'avoir un DPI (pas assez de moyen, mais c'est de
moins en moins vrai). Ou alors il n'existe pas de tests concernant une certaine maladie
génétique.

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B. Arrêt possible à chaque étape
- Stimulation ovocytaire : arrêt à partir de là, dans 20 à 30% des cas, car la réponse est
insuffisante, inexistante, ou trop importante
- Ponction ovocytaire : parfois, pas d'ovocytes ponctionnés, c'est ce qu'on appelle une
ponction blanche (exceptionnel : 2/511)
- ICSI : les ovocytes doivent être assez matures : s’ils ne sont pas matures, la fécondation ne se
fera pas (très rare : 8/511)
- Biopsie embryonnaire : il faut plus de 6 cellules. Si on en a 6 ou moins, déjà l'embryon ne
semble pas de très bonne qualité et le fait d'enlever 1 ou 2 cellules a de fort risque de
l'endommager (8/511)
- Transfert : pas d'embryon sain ou pas d'évolution entre la biopsie et le moment où l'on veut
les implanter (23 % des cas)
Il y a quasiment un facteur de 10 entre ce qu'on a ponctionné et ce qu'on obtient au final.
C. Difficultés pour le biologiste
- Peu de matériel biologique disponible : 2 cellules max. En général, on a 10 000 à
20 000 fois plus de matériel quand on fait une analyse sur une prise de sang par exemple.
- Manipulation de la cellule délicate
- Manque de temps : 24h pour donner le résultat
- Nombre et qualité des embryons : si peu d'embryons ou en mauvais état, très peu de chances
de réussite
- Problème lors de la PCR, spécifiques aux faibles quantités d'ADN. Amplification préférentielle
d'un allèle. Un allèle sera plus fort qu'un autre à cause de la PCR. Parfois, à l'extrême, on aura
un allèle qui ne sera pas amplifié, alors qu'il est présent. (ADO = Allèle Drop Out). Cela peut
être dangereux, car cela peut fausser les analyses. Il y a le risque de transférer un embryon
atteint.
Exemple : On a une maladie dominante. Le père a l'allèle sain et malade, la mère 2 sains. Si
on amplifie l'allèle malade, pas un grand problème. Mais si l'allèle sain est amplifié, on
transfère un embryon atteint.
- Le danger majeur en cas de PCR est le risque de contamination. Il suffit d'une cellule pour
contaminer. En général, c'est un individu sain qui risque de contaminer, donc on conclura à tort
que l'embryon est sain.
D. Sources de contamination
- Spermatozoïdes autour ou dans la zone pellucide
- Cellules maternelles de la Corona radiata (autour de la zone pellucide)
- Cellules du manipulateur