partie 1 - Institut Grand Ducal

CHIMIE DES SIDÉROPHORES
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
CHIMIE DES SIDEROPHORES :
VERS DE NOUVELLES MOLECULES POUR
UNE SANTE DE FER ?
I. STRATEGIES INNOVANTES POUR
LA CONCEPTION D’ANTIBIOTIQUES
SABRINA NOEL, FREDDY RIVAULT, ISABELLE J. SCHALK, GAËTAN L.A. MISLIN
Equipe « Transports Membranaires Bactériens »,
UMR7242 CNRS/Université de Strasbourg, ESBS,
Boulevard Sébastien Brant, F-67400 Illkirch, France ([email protected])
Résumé : Le fer est un élément chimique constitutif de nombreuses biomolécules. Ce métal
ubiquitaire intervient ainsi dans des processus vitaux essentiels à la grande majorité des êtres
vivants et les bactéries n’échappent pas à cette règle. Pseudomonas aeruginosa et Burkholderia
cepacia sont deux pathogènes nosocomiaux responsables d’infections graves chez les patients
atteints de mucoviscidose. Ces deux microorganismes utilisent un sidérophore appelé
pyochéline pour subvenir à leur besoins en fer. Notre connaissance du système d’assimilation
du fer dépendant de la pyochéline nous a conduit à développer des stratégies antibiotiques
innovantes ciblant spécifiquement ces microorganismes. Dans ce contexte deux stratégies ont
été plus particulièrement étudiées : d’une part, la synthèse de conjugués pyochéline-antibiotique
dans le cadre d’une approche de type prodrogue et, d’autre part, la conception d’inhibiteurs
potentiels d’un récepteur de membrane externe FptA, spécifique de la pyochéline. Le présent
article a la double ambition de vulgariser les connaissances actuelles sur le transport du fer chez
les bactéries en donnant, de plus, un aperçu sur les données collectées par notre équipe dans le
domaine de la mise au point de nouveaux antibiotiques. Cet article fait suite à la présentation
d’une conférence organisée par l’Institut Grand-Ducal du Luxembourg – Section des Sciences,
le 5 mai 2008.
Mots-clés : fer, sidérophore, bactérie Gram-négative, pyochéline, antibiotique, fluoroquinolone,
inhibiteur
Abstract : Iron is a chemical element constituent of a huge number of biomolecules. This
ubiquitous metal is involved in metabolic processes crucial for the wide majority of living beings
and bacteria are not an exception. Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia are two
nosocomial pathogens responsible of severe infections especially for cystic fibrosis affected
patients. These two microorganisms synthesize and excrete a siderophore called pyochelin in
order to promote iron acquisition. Thus, our knowledge of the pyochelin-dependant iron uptake
system led to the development of new antibiotic strategies targeting iron assimilation systems
of pathogenic microorganisms. In this context, two strategies were especially explored: on one
hand, the synthesis of pyochelin-antibiotic conjugates used in a prodrug approach and, on the
other hand, the design of potential inhibitor targeting FptA, the specific outer membrane receptor
of pyochelin. The two main goals of the present article are to popularize the more recent data
121
CHIMIE DES SIDÉROPHORES
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
available on bacterial iron uptake systems and giving, at one and at the same time, an overview
on all the data collected in our group during the development of new antibiotic strategies.
This article is based on the conference given the May 5th 2008 to the Institut Grand-Ducal du
Luxembourg – Section des Sciences.
Keywords : iron, siderophore, Gram-negative bacteria, pyochelin, antibiotic, fluoroquinolone,
inhibitor
1. Préambule : il fallait le fer…
L’histoire qui lie les métaux et les molécules du vivant est presque aussi ancienne
que cette planète. Les planètes telluriques, comme la Terre, sont essentiellement
constituées de métaux et d’autres éléments lourds. La structure interne de notre
planète, en couches concentriques de nature et de richesse variable en métaux est à
l’origine des ceintures électromagnétiques de VAN ALLEN, qui en agissant comme
des déflecteurs contre les rayonnements délétères venus du cosmos ont fortement
contribué à l’apparition et la multiplication des premières formes de vie. S’il existe
actuellement de nombreuses controverses sur les origines et le développement de la
Vie sur notre planète. Une chose est cependant acquise pour tous les chercheurs, les
premières formes de vie sont apparues et ont évolué au sein d’un milieu primordial
extrêmement minéral et très riche en métaux. Dans ce contexte, il est surprenant de
constater que toutes les théories actuelles négligent la part des éléments chimiques
autre que le carbone, l’hydrogène, l’azote, l’oxygène, le phosphore et le soufre dans la
chimie pré-biotique. Il est pourtant très probable que les métaux et certains éléments
minéraux se soient mêlés très tôt, et de façon très intime, aux molécules de la vie
pour en promouvoir à la fois l’évolution et la complexification. Du microorganisme
à l’être humain en passant par les plantes, les métaux participent aux transformations
métaboliques de toutes les espèces vivantes qui peuplent actuellement la biosphère.
Parmi ces métaux certains ne sont nécessaires qu’à un nombre restreint d’espèces
alors que d’autres éléments métalliques sont quasiment ubiquitaires. A ce titre,
le fer est probablement le plus important de ces métaux, car de la photosynthèse
à l’oxygénation des tissus vivants, il a participé à l’émergence et à la pérennité du
monde aérobie tel que nous le connaissons.
2. Introduction
2.1. Le fer, un nutriment essentiel mais faiblement biodisponible
Le spirochète Borrelia burgdorferi, agent pathogène responsable de la maladie de Lyme
(POSEY & GHERARDINI, 2000), et Lactobacillus (WEINBERG, 1997) n’ont pas besoin
de fer pour prospérer et se multiplier. Exception faite de ces deux microorganismes, le
fer constitue un nutriment vital pour les êtres vivants. La prédominance de la chimie
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CHIMIE DES SIDÉROPHORES
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
du fer dans une multitude de transformations métaboliques est probablement liée
au fait que ce métal est capable d’exister sous plusieurs degrés d’oxydation avec la
capacité de catalyser efficacement une grande variété de réactions redox. Le fer est
l’un des constituants principaux de la croûte terrestre et malgré cette abondance, à pH
neutre et en milieu aérobie, le fer existe principalement au dégré d’oxydation (III)
sous forme d’hydroxydes insolubles. Dans ces conditions, la concentration en fer libre
a été estimée à 10-9 M (RATLEDGE & DOVER, 2000 ; CHIPPERFIELD & RATLEDGE,
2000), cette concentration diminuant même à 10-18 M dans un hôte où la plus grande
partie du fer est en général stockée dans des protéines. Il est communément admis
que les bactéries ont besoin d’une concentration en fer de 10-7 M au minimum pour
une croissance optimale. Au cours de l’évolution, ces microorganismes ont mis au
point des systèmes d’assimilation du fer permettant de subvenir efficacement à leurs
besoins en fer. Ce métal peut être absorbé par les microorganismes sous différentes
formes. Ainsi, certaines voies d’assimilation intègrent directement le fer issu des
ferriprotéines de stockage de l’hôte (GOMEZ et al., 1998) alors que d’autres systèmes
récupèrent uniquement le fer héminique (WANDERSMAN & STOJILJKOVIC, 2000).
Plus rarement et en conditions anaérobies, certains microorganismes sont même
capables d’assimiler le fer ferreux (KAMMLER et al., 1993; CARTRON et al.,
2006). Même si ces systèmes de transport sont loin d’être anecdotiques, dans la
grande majorité des cas, les microorganismes aérobies synthétisent puis excrètent
des molécules de faible poids moléculaire (300-2000 Da) appelées sidérophores qui
solubilisent le fer avant de le transporter à l’intérieur de la cellule via des transporteurs
membranaires (PATTUS & ABDALLAH, 2000).
2.2. Les sidérophores
Les sidérophores sont des métabolites secondaires riches en hétéroatomes notamment
oxygénés et azotés susceptibles d’interagir avec l’ion métallique. Les ions fer(III)
sont hexacoordinés et les hétéroatomes du sidérophore impliqués dans la sphère
de coordination sont positionnés aux angles d’un octaèdre. Les hétéroatomes sont
en général appariés pour former des fonctions bidentates comme les catécholates,
les hydroxamates et les hydroxyacides carboxyliques. Il faut par conséquent trois
fonctions bidentates pour satisfaire aux règles de coordination de l’ion Fe(III).
Ces fonctions bidentates sont associées à un squelette carboné, parfois de nature
peptidique, qui permet d’asservir les motifs chélatants en termes d’angle et/ou de
distance pour une complexation optimale de l’ion métallique. Les quelque 500
sidérophores recensés jusqu’ici présentent une très grande diversité structurale. Ainsi
certains sidérophores sont extrêmement simples comme la pyochéline 1 (Pseudomonas
aeruginosa, Burkholderia cepacia), la cépabactine 2 (Burkholderia cepacia) ou
l’acide rhodotorulique 4 (Rhodotorula pilimanae) alors que d’autres présentent
des architectures moléculaires nettement plus complexes comme la pyoverdine 3
(Pseudomonas aeruginosa). Certains sidérophores possèdent trois groupes chélatants
123
CHIMIE DES SIDÉROPHORES
Chimie des sidérophores
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
plus complexes
comme des
la catéchols
pyoverdine
3 (Pseudomonas
aeruginosa).
Certains coli,
sidérophores
identiques,
dans
le cas de l’entérobactine
(Escherichia
Klebsiellapossèdent troi
groupes chélatants
identiques,
deshydroxamates
catéchols dans
de l’entérobactine
pneumoniae)
5 ou des
pourlelecas
ferrichrome
6 (Ustilago(Escherichia
sphaerogena).coli, Klebsiell
pneumoniae) Cependant,
5 ou des hydroxamates
pour
le ferrichrome
(Ustilago
sphaerogena).
la majorité des
sidérophores
sont 6mixtes,
c’est-à-dire
pourvusCependant,
de groupesla majorité de
sidérophores bidentates
sont mixtes,
pourvuscomme
de groupes
bidentates3 de
différente
commeunla pyoverdine
dec'est-à-dire
nature différente
la pyoverdine
parnature
exemple
qui contient
par exemple qui
contient
un et
motif
deux groupes(Fig.
hydroxamates
(Fig. 1).
motif
catéchol
deuxcatéchol
groupesethydroxamates
1).
Fig. 1 : Structures de quelques sidérophores bactériens représentatifs. Les
dans la
complexation
de l’ion ferrique
sont colorés
rouge.
Fig. hétéroatomes
1 : Structuresimpliqués
de quelques
sidérophores
bactériens
représentatifs.
Les en
hétéroatomes
impliqué
dans la complexation
de
l’ion
ferrique
sont
colorés
en
rouge.
Cette diversité structurale est à l’origine d’une large palette de stœchiométries
de complexation ligand/Fe(III). Ainsi, bien évidemment, des sidérophores comme la
Cettepyoverdine
diversité 3,
structurale
est à5 l’origine
d’une large
palettetrois
de groupes
stœchiométries
de complexatio
l’entérobactine
ou le ferrichrome
6 possèdant
bidentates,
ligand/Fe(III).sont
Ainsi,
bien
évidemment,
des
sidérophores
comme
la
pyoverdine
3,
l’entérobactine
5 ou l
capables de lier l’ion ferrique avec une stoechiométrie 1:1 (ALBRECHT-GARY
ferrichrome 6etpossèdant
trois
groupes
bidentates,
sont
capables
de
lier
l’ion
ferrique
avec
une
stoechiométrie
1:
al., 1994). Il faut par contre deux pyochélines 1 ou trois cépabactines 2 pour
ARY et al.,un
1994).
Il
faut
par
contre
deux
pyochélines
1
ou
trois
cépabactines
2
pour
complexer
u
(ALBRECHT-Gcomplexer
ion Fe(III). L’acide rhodotorulique 4 est un cas plus complexe car trois
ion Fe(III). L’acide
rhodotorulique
4
est
un
cas
plus
complexe
car
trois
ligands
doivent
s’associer
pou
ligands doivent s’associer pour complexer deux ions Fe(III) (BOUKHALFA et al.,
et al.,
2000). choisis,
Comme l’évolution
le montrentaces
choisis,
complexer deux
ionsComme
Fe(III) (B
2000).
le OUKHALFA
montrent ces
exemples
faitexemples
apparaître
une l’évolution
fait apparaîtremultitude
une multitude
de
structures
différentes
qui
ont
pourtant
une
fonction
commune
de structures différentes qui ont pourtant une fonction commune : solubiliser : solubiliser e
chélater fortement
le
pour former
des former
complexes
très stables.trèsLestables.
complexe
sidérophore-Fe(III) o
et chélater fer
fortement
le fer pour
des complexes
Le complexe
ferrisidérophore,
une
fois
formé,
doit
rentrer
à
l’intérieur
du
microorganisme,
or
la
limite d’exclusion pa
sidérophore-Fe(III) ou ferrisidérophore, une fois formé, doit rentrer à l’intérieur
diffusion passive par les porines bactériennes est en général inférieure à 500 Da. Les ferrisidérophores ont, dan
leur grande majorité, une masse supérieure à cette limite, aussi les microorganismes ont-ils développé de
systèmes de transport actif capables d’assurer la translocation de ces molécules de grande taille au travers de
124
membranes.
2.3. Le transport du fer médié par les sidérophores chez les bactéries à Gram négatif
CHIMIE DES SIDÉROPHORES
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du microorganisme, or la limite d’exclusion par diffusion passive par les porines
bactériennes est en général inférieure à 500 Da. Les ferrisidérophores ont, dans leur
grande majorité, une masse supérieure à cette limite, aussi les microorganismes ont-ils
développé des systèmes de transport actif capables d’assurer la translocation de ces
molécules de grande taille au travers des membranes.
2.3. Le transport du fer médié par les sidérophores chez les bactéries à Gram
négatif
Ces systèmes d’assimilation du fer dépendant des sidérophores sont loin d’être
parfaitement connus. Cependant, les études menées actuellement, notamment sur les
bactéries à Gram-négatif, permettent d’accroître progressivement nos connaissances
sur les mécanismes permettant à ces microorganismes d’assimiler les quantités de fer
nécessaires à leur prolifération. L’enveloppe des bactéries à Gram négatif est constituée
de deux membranes, l’une externe et l’autre cytoplasmique. Ces deux membranes
sont séparées par l’espace périplasmique (ou périplasme) pouvant représenter jusqu’à
40% du volume total de la bactérie et qui contient le peptidoglycanne qui, comme la
carcasse radiale d’un pneu, permet de conserver la forme de la bactérie en résistant
à la pression osmotique. C’est donc véritablement trois barrières physiques, avec
des propriétés chimiques et mécaniques très différentes, que doivent traverser les
ferrisidérophores pour atteindre le cytoplasme. La diversité structurale qui prévaut
parmi les sidérophores implique que les mécanismes d’incorporation peuvent être
sensiblement différents d’une espèce bactérienne et/ou d’un sidérophore à l’autre.
Cependant les travaux effectués sur divers microorganismes permettent de dégager
un processus général.
Les sidérophores sont synthétisés dans le cytoplasme (GEORGES & MEYER,
1995) et le périplasme puis sont exportés vers le milieu extracellulaire, probablement
grâce à des pompes d’efflux. Les sidérophores complexent alors le fer disponible
dans le milieu extracellulaire et le ferrisidérophore ainsi formé est reconnu par un
récepteur spécifique enchâssé dans la membrane externe de la bactérie. La structure
tridimensionnelle des récepteurs spécifiques FepA de l’entérobactine 5 (BUCHANAN
et al., 1999), FhuA du ferrichrome 6 (LOCHER et al., 1998; FERGUSON et al.,1998),
FecA du citrate (FERGUSON et al., 2002), FpvA de la pyoverdine 3 (COBESSI et
al., 2005) et enfin FptA de la pyochéline 1 (COBESSI et al., 2005) ont été décrits
dans la littérature. Ces structures présentent une organisation commune en deux
parties principales : un tonneau β, constitué de 22 brins antiparallèles, forme un pore
transmembranaire alors que la partie N terminale de la protéine se replie pour obturer
le pore en formant un « bouchon » (Fig. 2).
125
ortés
xportés
versvers
le milieu
le milieu
extracellulaire,
extracellulaire,
probablement
probablement
grâce
grâce
à des
à des
pompes
pompes
d’efflux.
d’efflux.
LesLes
sidérophores
sidérophores
nt
exent
alors
alors
le fer
le disponible
fer disponible
dansdans
le milieu
le milieu
extracellulaire
extracellulaire
et leetferrisidérophore
le ferrisidérophore
ainsiainsi
formé
formé
est reconnu
est reconnu
par par
eur
epteur
spécifique
spécifique
enchâssé
enchâssé
dansdans
la membrane
la membrane
externe
externe
de la
de bactérie.
la bactérie.
La La
structure
structure
tridimensionnelle
tridimensionnelle
des des
et al.,
et al.,
1999),
1999),
FhuA
FhuA
du ferrichrome
du ferrichrome
6 (L6OCHER
(LOCHER
et et
seurs
spécifiques
spécifiques
FepA
FepA
de l’entérobactine
de l’entérobactine
5 (B5UCHANAN
(BUCHANAN
et al.,1998),
et al.,1998),
FecA
FecA
du citrate
du citrate
(FERGUSON
(FERGUSON
et al.,
et al.,
2002),
2002),
FpvA
FpvA
de la
depyoverdine
la pyoverdine
3 (C3OBESSI
(COBESSI
et et
98;
FERGUSON
FERGUSON
et al.,
et al.,
2005)
2005)
ont ont
été été
décrits
décrits
dansdans
la littérature.
la littérature.
CesCes
structures
structures
05)
et enfin
et enfin
FptA
FptA
de la
depyochéline
la pyochéline
1 (C1OBESSI
(COBESSI
CHIMIE DES SIDÉROPHORES
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
ttent
uneune
organisation
organisation
commune
commune
en en
deux
deux
parties
parties
principales
principales
: un: un
tonneau
tonneau
β, constitué
β, constitué
de de
22 22
brins
brins
èles,
rallèles,
forme
forme
un pore
un pore
transmembranaire
transmembranaire
alors
alors
queque
la partie
la partie
N terminale
N terminale
de la
de protéine
la protéine
se replie
se replie
pourpour
rpore
le pore
en formant
en formant
un «unbouchon
« bouchon
» (Fig.
» (Fig.
2). 2).
Fig.Fig.
2 : Vues
2 : Vues
en ruban
en ruban
de la
destructure
la structure
tridimensionnelle
tridimensionnelle
du récepteur
du récepteur
FpvA
FpvA
de la
depyoverdine
la pyoverdine
3 chargé
3 chargé
β est
β est
coloré
coloré
en vert,
en vert,
le bouchon
le bouchon
en rouge,
en rouge,
la partie
la partie
périplasmique
périplasmique
en en
n ferripyoverdine.
en ferripyoverdine.
Le tonneau
Le tonneau
Fig. 2 : Vues
desuivant
la structure
tridimensionnelle
du récepteur FpvA de la
leu,
bleu,
et laetferripyoverdine
la ferripyoverdine
est en
colorée
estruban
colorée
suivant
la nomenclature
la nomenclature
standard.
standard.
pyoverdine 3 chargé en ferripyoverdine. Le tonneau β est coloré en vert, le bouchon
en rouge, la partie périplasmique en bleu, et la ferripyoverdine est colorée suivant la
Après
Après
l’étape
l’étape
de de
reconnaissance
reconnaissance
spécifique,
spécifique,
uneune
modification
modification
de de
la la
structure
structure
du du
nomenclature
standard.
teur,
r, ouvrant
ouvrant
probablement
probablement
le le
pore
pore
central,
central,
permet
permet
ensuite
ensuite
au au
ferrisidérophore
ferrisidérophore
de de
Après l’étape de reconnaissance spécifique, une modification de la structure du
rrser
la membrane
la membrane
externe.
externe.
Cette
Cette
modification
modification
de de
structure
structure
est est
liéeliée
à l’intervention
à l’intervention
de de
la la
récepteur, ouvrant probablement le pore central, permet ensuite au ferrisidérophore de
ine
TonB
TonB
parpar
ailleurs
ailleurs
impliquée
impliquée
dans
dans
le
transport
le
transport
d’autres
d’autres
nutriments
nutriments
essentiels
essentiels
comme
comme
traverser la membrane externe. Cette modification de structure est liée à l’intervention de
mine
tamine
B12B(B
RADBEER
(Bprotéine
RADBEER
, 1993).
, 1993).
Cette
Cette
protéine,
protéine,
associée
avec
avec
ExbB
ExbB
et et
ExbD,
ExbD,
fournit
fournit
12 la
TonB
par ailleurs
impliquée
dans
leassociée
transport
d’autres
nutriments
essentiels
ergie
nécessaire
nécessaire
au au
passage
du du
nutriment
en en
couplant
couplant
l’ouverture
l’ouverture
du du
pore
pore
avec
avec
la etforce
la force
, 1993).
Cette
protéine, associée
avec
ExbB
comme
lapassage
vitamine
B12nutriment
(BRADBEER
ExbD,
fournit
l’énergie
nécessaire
au passage
du nutriment
couplant
l’ouverture
du
RAUN
, 1995;
, 1995;
MOECK
MOECK
&C
&OULTON
COULTON
, 1998;
, 1998;
HIGGS
HIGGS
etenal.,
et
al.,
1998;
1998;
HIGGS
HIGGS
et al.,
et al.,
motrice
n-motrice
(BRAUN
(B
pore
avec
la
force
proton-motrice
(B
RAUN
,
1995;
M
OECK
&
C
OULTON
,
1998;
H
IGGS
Le
). Le
ferrisidérophore
ferrisidérophore
est est
ensuite
ensuite
prispris
en en
charge
charge
parpar
la la
protéine
protéine
périplasmique
périplasmique
d’un
d’un
et al.,
1998;
H(ATP
IGGS et al., 2002). Le ferrisidérophore est ensuite pris en charge par la
porteur
teur de de
type
type
ABC
ABC
(ATP
Binding
Binding
Cassette)
Cassette)
dont
dont
le rôle
le rôle
est est
d’exporter
d’exporter
le complexe
le complexe
protéine périplasmique d’un transporteur de type ABC (ATP Binding Cassette) dont
que
versvers
le cytoplasme
le le
cytoplasme
(QUIOCHO
(QUIOCHO
&L
&EDVINA
LEDVINA
, 1996;
, 1996;
SPRENCEL
SPRENCEL
et al.,
et al.,
2000;
2000;
KÖSTER
KÖSTER
, ,
rôle est d’exporter le complexe ferrique vers le cytoplasme (QUIOCHO & LEDVINA,
Ce
). Ce
transporteur
transporteur
est
est
en
en
fait
fait
constitué
constitué
de
de
trois
trois
protéines
protéines
distinctes
distinctes
dont
dont
la
la
protéine
protéine
1996; SPRENCEL et al., 2000; KÖSTER, 2001). Ce transporteur est en fait constitué de
mique,
lasmique,
la protéine
latrois
protéine
constituant
constituant
ledont
pore
le pore
enfin
et enfin
la protéine
la protéine
qui
qui
lie lie
puis
puis
hydrolyse
hydrolyse
l’ATP
l’ATP
protéines
distinctes
la et
protéine
périplasmique,
la protéine
constituant
le pore
et enfin
la protéine
lie
puis hydrolyse
pour le
fournir
l’énergie
nécessaire
au
urnir
fournir
l’énergie
l’énergie
nécessaire
nécessaire
auqui
au
transport.
transport.
Dans
Dans
lal’ATP
cellule,
la cellule,
fer
le fer
peut
peut
ensuite
ensuite
êtreêtre
libéré
libéré
transport.
Dans
la
cellule,
le
fer
peut
ensuite
être
libéré
soit
par
une
digestion
partielle
par
uneune
digestion
digestion
partielle
partielle
du du
sidérophore
sidérophore
(HENING
(HENING
et al.,
et al.,
2005)
2005)
et/ou
et/ou
parpar
un un
processus
processus
du
sidérophore
(HENING
et al., 2005)
par
un al.,
processus
réductif
la, 1992;
ctif
permettant
permettant
la transition
la transition
Fe(III)→Fe(II)
Fe(III)→Fe(II)
(COOPER
(Cet/ou
OOPER
et al.,
et
1978;
1978;
HALLE
HALLE
&permettant
M
&EYER
MEYER
, 1992;
transition Fe(III)→Fe(II) (COOPER et al., 1978; HALLE & MEYER, 1992; MIES et al.,
al.,
et al.,
2006).
2006).
Dans
Dans
ce ce
deuxième
deuxième
cas,cas,
le ligand
le ligand
intact
intact
pourrait
pourrait
êtreêtre
recyclé
recyclé
en en
étant
étant
re- re2006). Dans ce deuxième cas, le ligand intact pourrait être recyclé en étant re-excrété
par
té par
la bactérie
la bactérie
(Fig.
3). 3).
par (Fig.
la bactérie
(Fig. 3).
126
CHIMIE DES SIDÉROPHORES
Chimie des sidérophores
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
Fig. 3 : Processus général du transport du fer dans une bactérie à Gram négatif par
tridentate.
L’ion Fe3+
orange)
chélaté àpar
le sidérophore
Fig. un
3 : sidérophore
Processus général
du transport
du(sphère
fer dans
une bactérie
Gram
négatif parestun sidérophore
3+
reconnu
puis
transporté
à
travers
la
membrane
externe
par
un
récepteur
spécifique.
transporté à travers
tridentate. L’ion Fe (sphère orange) chélaté par le sidérophore est reconnu puis
Ce
transport
requiert
un
transducteur
d’énergie
:
le
complexe
TonB-ExbB-ExbD
qui d'énergie : le
la membrane externe par un récepteur spécifique. Ce transport requiert un transducteur
permet
de
coupler
ce
transport
à
la
force
proton-motrice.
Une
protéine
périplasmique
complexe TonB-ExbB-ExbD qui permet de coupler ce transport à la force proton-motrice. Une protéine
(PP) permet
transport
à traversàletravers
périplasme
jusqu’à un
transporteur
périplasmique
(PP)ensuite
permetleensuite
le transport
le périplasme
jusqu’à
un transporteur ABC
ABC,
responsable
de
l’entrée
du
ferrisidérophore
dans
le
cytoplasme
où
complexe
responsable de l’entrée du ferrisidérophore dans le cytoplasme où le complexeleest
dissocié.
est dissocié.
Ce schéma général est en fait un résumé des connaissances actuelles sur les
Ce schéma
général
en fait un des
résumé
des d’assimilation
connaissances
surdes
les différentes
différentes
étapes est
et composants
systèmes
du actuelles
fer dépendant
étapes et composants
des
systèmes
d’assimilation
du
fer
dépendant
des
sidérophores.
Ainsi
sidérophores. Ainsi, dans la réalité, en fonction de l’espèce bactérienne étudiée et du
sidérophore
considéré,
processus bactérienne
mis en jeu est étudiée
une déclinaison
ce mécanismeconsidéré, le
dans la réalité,
en fonction
delel’espèce
et du de
sidérophore
très schématique.
En outre,
pour nombre
des flèches rouges
processus mis
en jeu est une
déclinaison
de de
cesidérophores,
mécanismecertaines
très schématique.
En outre, pour
pourraient
être
assorties
de
points
d’interrogations.
Ces
mécanismes
de
transport
nombre de sidérophores, certaines des flèches rouges pourraient être assorties de points
extrêmement performants permettent aux bactéries de subvenir efficacement à
d’interrogations.
Ces mécanismes de transport extrêmement performants permettent aux
leurs besoins en fer même si elles sont en compétition avec l’hôte ou d’autres
bactéries demicroorganismes.
subvenir efficacement à leurs besoins en fer même si elles sont en compétition
avec l’hôte ou d’autres microorganismes.
3. Les systèmes d’assimilation du fer chez les bactéries : une piste
dans le développement de nouveaux antibiotiques pour les patients
atteints
de mucoviscidose
3. Les systèmes
d’assimilation
du fer chez les bactéries : une piste dans le développement
de nouveaux
antibiotiques
pour
les patients
atteints
de sidérophore-dépendantes
mucoviscidose
A l’heure actuelle, les voies
de transport
du fer
de
microorganismes pathogènes pour l’être humain sont les plus étudiées. Ces en effet
A l’heure actuelle, les voies de transport du fer sidérophore-dépendantes de microorganismes
pathogènes pour l’être humain sont les plus étudiées. Ces systèmes d’assimilation
127 permetten
en effet aux bactéries d’accéder à un nutriment indispensable et sont donc à ce titre des cibles
thérapeutiques potentielles. Ainsi avec le soutien financier répété de l’association « Vaincre la
Mucoviscidose », notre groupe s’intéresse aux mécanismes d’assimilation du fer chez deux
pathogènes opportunistes nosocomiaux Pseudomonas aeruginosa et Burkholderia cepacia
CHIMIE DES SIDÉROPHORES
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
aux bactéries d’accéder à un nutriment indispensable et sont donc à ce titre des cibles
thérapeutiques potentielles. Ainsi avec le soutien financier répété de l’association
«Vaincre la Mucoviscidose», notre groupe s’intéresse aux mécanismes d’assimilation
du fer chez deux pathogènes opportunistes nosocomiaux Pseudomonas aeruginosa
et Burkholderia cepacia, responsables d’infections graves, souvent létales, chez les
patients atteints par la mucoviscidose.
3.1 Mucoviscidose et infections à Pseudomonas aeruginosa et Burkholderia
cepacia
La mucoviscidose est l’une des maladies génétiques les plus répandues puisque elle
représente une naissance sur 3300 dans la population caucasienne. Cette maladie est
due à un dysfonctionnement d’une protéine canale appelée CFTR (Cystic Fibrosis
Transmembrane Conductance Regulator) permettant la sécrétion des ions chlorure
tout en contribuant à la réabsorption des ions sodium. Un mauvais fonctionnement
du CFTR perturbe la composition ionique, le volume et la viscosité de certains
fluides corporels notamment au niveau des poumons. Dans cet organe, la production
massive d’un mucus très épais constitue un terrain qui favorise l’installation d’agents
pathogènes opportunistes. Au nombre de ces derniers, Pseudomonas aeruginosa et
le complexe Burkholderia cepacia, bactéries à Gram négatif, sont connues pour être
les principaux responsables des infections nosocomiales contractées par ces patients
en milieu hospitalier. Les infections chroniques qui affectent ces patients entraînent
une inflammation permanente des tissus épithéliaux des voies aériennes inférieures,
mais aussi, à plus long terme, des épithéliums artériels qui finissent par se nécroser.
Dans un stade plus avancé de la maladie, et en l’absence de greffe cardio-pulmonaire,
les patients décèdent en général suite à une insuffisance cardio-pulmonaire ou à
des septicémies, formes ultimes et généralisées des infections pulmonaires liées à
la présence de Pseudomonas aeruginosa et/ou Burkholderia cepacia. Qu’ils soient
sous forme planctonique ou inclus dans des biofilms, ces microorganismes sont peu
perméables aux antibiotiques et mutent rapidement pour conduire à des souches
multirésistantes. Ceci explique que les infections ayant pour origine de telles bactéries
sont de plus en plus difficiles à combattre par les antibiothérapies classiques (AARON
et al., 2000; LEDSON et al., 1998).
Ces deux bactéries synthétisent et excrètent plusieurs sidérophores pour subvenir
à leurs besoins en fer. Pseudomonas aeruginosa utilise ainsi la pyoverdine 3 et la
pyochéline 1 (voir Fig. 1) alors que Burkholderia cepacia utilise la pyochéline 1,
la cépabactine 2 et les ornibactines (STEPHAN et al., 1993). La pyochéline 1 est
donc un sidérophore commun aux deux espèces pathogènes que nous souhaitons
combattre (DARLING et al., 1998). Aussi, une stratégie thérapeutique fondée sur des
molécules structuralement proches de la pyochéline doit nous permettre d’atteindre
efficacement et sélectivement les deux microorganismes ciblés, en laissant intactes
les populations bactériennes nécessaires au bon fonctionnement du corps humain.
128
CHIMIE DES SIDÉROPHORES
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
C’est sur ce postulat que se sont fondées nos recherches sur de nouveaux antibiotiques
contre Pseudomonas aeruginosa et Burkholderia cepacia.
3.2. Pyochéline : rôles biologiques et données chimiques
La pyochéline 1 est un sidérophore isolé et caractérisé pour la première fois à la fin
des années soixante-dix (LIU & SHOKRANI, 1978). Dès sa découverte, la pyochéline
fut immédiatement décrite comme un sidérophore présentant une faible affinité pour
le fer(III) : la constante d’affinité déterminée était alors de l’ordre de 2 x 105 M-1 dans
le méthanol (COX, 1980; COX et al., 1981). La stoechiométrie apparente du complexe
ferrique de la pyochéline a été établie à deux ligands pour un ion fer(III) bien que des
études physicochimiques et cristallographiques viennent régulièrement remettre en
doute cette propriété en suggérant des rapports ligand/métal différents (CUPPELS et
al., 1987; SCHLEGEL et al., 2006; TSENG et al., 2006). Cette incertitude est liée d’une
part à la méconnaissance des hétéroatomes impliqués dans la chélation et d’autre part
à la faible stabilité du complexe ferrique, qui rendent plus hasardeuses les études
par titration directe. L’existence d’un motif 2-hydroxyphényl-thiazoline au sein de
la pyochéline procure à ce sidérophore des propriétés de fluorescence (HOEGY et al.,
2005). Cette fluorescence est inhibée par la complexation de certains métaux, dont le
fer(III). La propriété biologique principale de la pyochéline est la complexation des
ions fer(III) dans le milieu extracellulaire et leur transport à l’intérieur de la bactérie.
Ainsi, à l’instar des autres sidérophores excrétés par les Pseudomonas, la pyochéline
est considérée comme l’un des principaux facteurs de virulence de cette famille de
bactéries.
Dès la découverte de la pyochéline, les chimistes ont essayé de synthétiser
ce sidérophore efficacement et de façon stéréocontrôlée. Plusieurs approches ont
permis d’obtenir la pyochéline (RINEHART et al., 1995; ANKENBAUER et al., 1988;
ANKENBAUER et al., 1994; INO et al., 1998; INO & MURABAYASHI, 1999; INO et al.,
1999; ZAMRI & ABDALLAH, 2000; INO & MURABAYASHI, 2001). A l’heure actuelle
nous utilisons le protocole de synthèse suivant mis au point au laboratoire. Les deux
substrats de départ, le 2-hydroxybenzonitrile 7 et la D-cystéine 8, sont condensés
dans un tampon phosphate à pH 6,4 (ZAMRI & ABDALLAH, 2000). La thiazoline
résultante 9 est recristallisée à deux reprises. L’amide de Weinreb 10 est ensuite obtenu
en couplant la fonction carboxylique de la thiazoline 9 avec la N,O-diméthylhydroxylamine en présence de l’hydrochlorure de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3éthylcarbodiimide (EDCI). L’utilisation de cet agent de couplage ne modifie en
rien l’excès énantiomérique et facilite grandement les étapes de purifications. La
réduction de l’amide de Weinreb 10 par l’hydrure mixte d’aluminium et de lithium
dans le tetrahydrofurane (THF) conduit à la formation de l’aldéhyde 11 (FEHRENTZ &
CASTRO, 1983). Ce dernier est condensé avec la (R)-N-méthylcystéine (BLONDEAU
et al., 1967) pour conduire à la pyochéline 1 (Sch. 1).
129
L’amide de Weinreb 10 est ensuite obtenu en couplant la fonction carboxylique de la
thiazoline 9 avec la N,O-diméthylhydroxylamine en présence de l’hydrochlorure de 1-(3diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (EDCI). L’utilisation de cet agent de couplage ne
modifie en rien l’excès énantiomérique et facilite grandement les étapes de purifications. La
réduction de l’amide de Weinreb 10 par l’hydrure mixte d’aluminium et de lithium dans le
tetrahydrofurane (THF) conduit à la formation de l’aldéhyde 11 (FEHRENTZ & CASTRO, 1983).
DES SIDÉROPHORES
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
et al., 1967) pour conduire
Ce dernier CHIMIE
est condensé
avec la (R)-N-méthylcystéine (BLONDEAU
à la pyochéline 1 (Sch. 1).
Sch. 1 : Synthèse de la pyochéline : i. D-Cystéine.HCl, K2CO3, MeOH/tampon
Sch.phosphate
1 : Synthèse
de lapH
pyochéline
: i.puis
D-Cystéine.HCl,
K2COii.3, CH
MeOH/tampon
phosphate
0,1M, pH 6,4,
0,1M,
6,4, 60°C
recristallisation.
ONHCH3.HCl,
DIPEA,
3
.HCl, -40°C
DIPEA,
EDCI, CH
60°CEDCI,
puis recristallisation.
ii. CH
2Cl2, 0° à 20°C. iii LiAlH4, THF, CH2Cl2, 0° à 20°C.
iii3ONHCH
LiAlH4 , 3THF,
à -20°C.
iv. N-(R)-méthylcystéine.
40°CHCl,
à -20°C.
iv. EtOH/H
N-(R)-méthylcystéine.
HCl, AcOK, EtOH/H2O, 20°C.
AcOK,
O, 20°C.
2
Ce protocole est utilisé couramment au laboratoire pour synthétiser la pyochéline
Ce protocole
est utilisé
laboratoire
pour permet
synthétiser
la pyochéline
avec
avec un rendement
de couramment
60% sur quatreau
étapes.
Ce protocole
d’accéder
à des
un rendement
de 60%
sur quatre
étapes.
Ceplusieurs
protocole
permet
d’accéder
à des
quantités de
quantités
de sidérophore
allant
jusqu’à
grammes
et cela
rapidement
(quatre
et jusqu'à
à partir de
produits grammes
de départ commerciaux
fort peu onéreux.
outreetceà partir de
sidérophorejours)
allant
plusieurs
et cela rapidement
(quatre En
jours)
protocole
de
synthèse
a
ouvert
la
voie
pour
la
synthèse
d’analogues
de
la
pyochéline
produits de départ commerciaux fort peu onéreux. En outre ce protocole de synthèse a ouvert
visée
thérapeutique.
Dans cede
contexte,
deux approches
été privilégiées.
D’une
la voie pourà la
synthèse
d’analogues
la pyochéline
à viséeont
thérapeutique.
Dans
ce contexte,
part
la
préparation
de
conjugués
antibiotique-sidérophore
capables
d’adresser
deux approches ont été privilégiées. D’une part la préparation de conjugués antibiotiquesélectivement/efficacement la molécule active aux microorganismes ciblés. D’autre
sidérophore capables d’adresser sélectivement/efficacement la molécule active aux
part le développement d’inhibiteurs des récepteurs de membrane externe de
microorganismes
ciblés. Ces
D’autre
part le seront
développement
d’inhibiteurs
récepteurs
de
ferrisidérophore.
deux approches
abordées successivement
dans des
la suite
de
membrane cet
externe
ferrisidérophore.
deux approches
serontpyochéline.
abordées successivement
article de
en prenant
l’exemple deCes
nos travaux
sur le sidérophore
dans la suite de cet article en prenant l’exemple de nos travaux sur le sidérophore pyochéline.
3.3. Synthèse de conjugués antibiotique-pyochéline
La de
résistance
bactérienne
aux antibiotiques peut avoir trois origines : la faible
3.3. Synthèse
conjugués
antibiotique-pyochéline
perméabilité membranaire aux xénobiotiques, l’existence de pompes d’efflux et
l’expression
massive
capables
de dégrader
l’antibiotique.
le cas perméabilité
de
La résistance
bactérienne
auxd’enzymes
antibiotiques
peut
avoir trois
origines :Dans
la faible
Pseudomonas aeruginosa et de Burkholderia cepacia, la succession des trois barrières
membranaire aux xénobiotiques, l’existence de pompes d’efflux et l’expression massive
physiques que sont la membrane externe, le périplasme et la membrane cytoplasmique
d’enzymes explique
capablesla de
dégrader
l’antibiotique.
Dansdeleces
casmicroorganismes.
de Pseudomonas
aeruginosa et de
faible
perméabilité
aux antibiotiques
La stratégie
Burkholderia
cepacia,
la
succession
des
trois
barrières
physiques
que
sont
lalamembrane
prodrogue permet d’accroître la quantité d’antibiotique traversant les membranes de
externe, le bactérie.
périplasme
et la membrane
cytoplasmique
explique
lamédicamenteuses
faible perméabilité aux
Une prodrogue
est un composé
bioactif dont les
propriétés
antibiotiques
de ces microorganismes.
La stratégie
prodrogue permet
d’accroître
indésirables
(manque de spécificité,
faible biodisponibilité,
instabilité
chimique,la quantité
solubilité) sont « masquées » de façon réversible par couplage avec d’autres entités
chimiques. Une variante de cette stratégie consiste à faire pénétrer dans la cellule à
130
Chimie des sidérophores
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
d’antibiotique traversant les membranes de la bactérie. Une prodrogue est un comp
bioactif dont les propriétés médicamenteuses indésirables (manque de spécificité, fa
CHIMIE DES
SIDÉROPHORES
Arch.
Nat. Phys.»Math.
NS 46 réversible
biodisponibilité,
instabilité
chimique, solubilité) sont
« Sci.
masquées
de façon
couplage avec d’autres entités chimiques. Une variante de cette stratégie consiste à f
pénétrer dans la cellule à détruire, une molécule cytostatique (ou dans notre cas
antibiotique)
sous
en (ou
utilisant
une cas
voie
transportsous
naturelle
détruire,
une forme
moléculeinactive
cytostatique
dans notre
un de
antibiotique)
forme de la cel
inactive
en
utilisant
une
voie
de
transport
naturelle
de
la
cellule.
Cette
démarche
est : la cellul
Cette démarche est souvent, de façon très imagée, comparée au cheval de Troie
souvent,
de
façon
très
imagée,
comparée
au
cheval
de
Troie
:
la
cellule
va
internaliser
internaliser le conjugué puis les enzymes autochtones ou les conditions physiologiques
le conjugué puis les enzymes autochtones ou les conditions physiologiques vont alors
alors démasquer
l’activité antibiotique du composé (Fig. 4).
démasquer l’activité antibiotique du composé (Fig. 4).
Fig.
: Fonctionnement
d’une
prodrogue
type
chevaldedeTroie
Troie
: laprodrogue
prodrogueest constituée
Fig.
4 :4Fonctionnement
d’une
prodrogue
de de
type
cheval
: la
est
constituée
d’un
sidérophore
(croissant
bleu
ciel),
connecté
à
un
antibiotique
sidérophore (croissant bleu ciel), connecté à un antibiotique (carré vert) par un bras espaceu
(carré vert)
par unlebras
conjugué dans
complexe
le fer (sphère
métallisée)
conjugué
complexe
fer espaceur.
(sphère Le
métallisée)
le milieu
extracellulaire
permettant ains
dans
le
milieu
extracellulaire
permettant
ainsi
sa
reconnaissance
par
le
récepteur soit au nivea
reconnaissance par le récepteur de membrane externe et le transport du conjugué
de membrane
externe et
le transport
duconditions
conjugué soit
au niveau du
périplasme
soit
périplasme
soit jusqu’au
cytoplasme.
Les
physiologiques
(présences
d’enzymes,
condition
jusqu’au
cytoplasme.
Les
conditions
physiologiques
(présences
d’enzymes,
conditions
pH, etc.) vont alors permettre de cliver le bras espaceur pour libérer la molécule active (carré rouge
deainsi
pH, etc.)
vont sa
alors
permettre
de cliver
le bras
espaceur
pour libérer la molécule
peut
atteindre
cible
biologique
et induire
la mort
bactérienne.
active (carré rouge) qui peut ainsi atteindre sa cible biologique et induire la mort
bactérienne.
Des
pyochélines fonctionnalisées peuvent ainsi servir de structure de base pou
préparation Des
de prodrogues
ciblées sur lapeuvent
voie de
transport
fer pyochéline-dépendante
pyochélines fonctionnalisées
ainsi
servir de du
structure
de base pour
la
préparation
de
prodrogues
ciblées
sur
la
voie
de
transport
du
fer
effet la pyochéline est un sidérophore commun à toutes ces souches etpyochélineà la plupart des sou
dépendante.
En effet
pyochéline est munies
un sidérophore
à toutescomme
ces souches
et de spécif
de B. cepacia.
Ainsi,
desla prodrogues
de lacommun
pyochéline
motif
à
la
plupart
des
souches
de
B.
cepacia.
Ainsi,
des
prodrogues
munies
de
la
pyochéline
devraient adresser l’antibiotique spécifiquement aux bactéries exprimant le récepteur FptA
la pyochéline. Dans notre projet les « chevaux de Troie » sont constitués d’une pyoché
fonctionnalisée en position C5. Cette position a été choisie dans une première approche ca
131
fonctionnalisation est aisée d’un point de vue synthétique. En outre nous avons montré qu
présence de substituants en C5 n’altère pas les propriétés chélatantes du sidérophore.
fonction amine localisée à l’extrémité d’une extension propylique souple ou propargyl
rigide permet de connecter les sidérophores à l’antibiotique par l’intermédiaire de
CHIMIE DES SIDÉROPHORES
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
comme motif de spécificité devraient adresser l’antibiotique spécifiquement aux
bactéries exprimant le récepteur FptA de la pyochéline. Dans notre projet les «
chevaux de Troie » sont constitués d’une pyochéline fonctionnalisée en position C5.
Cette position a été choisie dans une première approche car sa fonctionnalisation est
aisée d’un point de vue synthétique. En outre nous avons montré que la présence de
substituants en C5 n’altère pas les propriétés chélatantes du sidérophore. Une fonction
amine localisée à l’extrémité d’une extension propylique souple ou propargylique
rigide permet de connecter les sidérophores à l’antibiotique par l’intermédiaire de
adaptés. L’antibiotique choisi dans une
première
approche
la NS 46
Chimiebras
desespaceurs
sidérophores
Arch.
Sci. Nat.
Phys.estMath.
norfloxacine, une molécule de la famille des fluoroquinolones, connues pour être
de puissants inhibiteurs des topoisomérases bactériennes (MITSCHER, 2005). Cette
particulièrement
efficace contre
les microorganismes
de les
la famille
des Pseudomonas
(F
famille d’antibiotiques
est particulièrement
efficace contre
microorganismes
de
la
famille
des
Pseudomonas.
Au
cours
de
travaux
antérieurs,
des
conjugués
entre
la
Au cours de travaux antérieurs, des conjugués entre la pyoverdine, un autre sidéropho
pyoverdine,aeruginosa
un autre sidérophore
Pseudomonas aeruginosa
et des antibiotiques
de
Pseudomonas
et desdeantibiotiques
de la classe
des fluoroquinolones
on
la
classe
des
fluoroquinolones
ont
été
préparés
et
testés.
Le
motif
de
reconnaissance
préparés et testés. Le motif de reconnaissance spécifique, la pyoverdine, était alors
spécifique, la pyoverdine, était alors fixé à l’antibiotique soit par un bras non
l’antibiotique
soit par un bras non hydrolysable soit par un bras labile hydrolysable in v
hydrolysable soit par un bras labile hydrolysable in vivo. Il a ainsi été montré que les
a ainsiconjugués
été montré
qued’un
les bras
conjugués
équipés
d’un bras
labile avaient
une
activité antibio
équipés
labile avaient
une activité
antibiotique
supérieure
à ceux
supérieure
ceux
munis
d’un bras (H
non
hydrolysable
(HENNARD
et al.,
2001). Compte ten
munisàd’un
bras
non hydrolysable
ENNARD
et al., 2001).
Compte tenu
des résultats
résultats
encourageants
avec la pyoverdine,
été appliqué
trèstrès
encourageants
obtenusobtenus
avec la pyoverdine,
cette stratégiecette
a été stratégie
appliquée àa la
pyochéline
et
des
conjugués
munis
d’une
part
de
bras
hydrolysables
in
vivo
(composés
pyochéline et des conjugués munis d’une part de bras hydrolysables in vivo (compos
de ou
typede
12)bras
ou de
bras succinate
(composés
de type
stabledans
dans les
les conditions
conditions physiolog
type 12)
succinate
(composés
de type
13)13)
stable
physiologiques ont été synthétisés (Fig. 5).
ont été synthétisés (Fig. 5).
Fig. 5 : Structure des conjugués norfloxacine-pyochéline de type 12 et 13.
132
Fig. 5 : Structure des conjugués norfloxacine-pyochéline de type 12 et 13.
La synthèse de ces conjugués a débuté par la préparation des pyoch
CHIMIE DES SIDÉROPHORES
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
La synthèse de ces conjugués a débuté par la préparation des pyochélines
fonctionnalisées. Le 2-cyanophénol commercial 7 est traité par le N-iodosuccinimide
en présence d’acide tétrafluoroborique pour conduire au 5-iodo-2-hydroxybenzonitrile
14. Ce composé est mis en réaction avec la monopropargylamine protégée par un
groupe Boc, dans les conditions de couplage de type Sonogashira. Le 2-cyanophénol
acétylénique 15 recherché est ainsi isolé avec un rendement de 86% sur deux étapes.
Une réduction de la triple liaison par hydrogénation catalytique permet d’obtenir le
2-cyanophénol de type 16. Les 2-cyanophénols fonctionnalisés 15 et 16 ont ensuite
servi de produits de départ pour la synthèse des pyochélines fonctionnalisées 17 et
18 en utilisant le schéma de synthèse mis au point au laboratoire pour préparer la
pyochéline naturelle 1 moyennant quelques modifications mineures de protocole. Les
pyochélines fonctionnalisées 17 et 18 ont ainsi été isolées en quatre étapes avec des
rendements de 70% en moyenne (RIVAULT et al., 2006; RIVAULT et al., 2007) (Sch.
2).
Sch. 2 : Synthèse des pyochélines fonctionnalisées 17 et 18. i : NIS, HBF4.Et2O,
CH3CN, -10°C. ii : Pd(PPh3)4, CuI, BocNHCH2C≡CH, DMF, 20°C. iii. H2, Pd/C 10%,
EtOH, 20°C. iv. Cystéine, tampon phosphate pH 6.4/MeOH, 50°C. v. MeONHMe.
HCl, DIPEA, EDCI, CH2Cl2, 0°C à 20°C. vi. LiAlH4.THF, THF, -40°C à -20°C. vii.
(R)-N-Méthylcystéine, AcOK, EtOH/H2O, 20°C.
Dans un deuxième temps nous avons procédé à la synthèse des blocs bras
espaceur-antibiotique. La norfloxacine 19 est mise en réaction avec l’anhydride
succinique dans le DMSO en présence de pyridine conduisant ainsi à l’adduit 20.
La fonction acide de la molécule 20 est ensuite estérifiée par le pentafluorophénol en
présence d’EDCI (SCHUELLER et al., 1996) et l’ester activé 21 est ainsi isolé avec un
rendement de 75 % sur les deux étapes. Afin d’obtenir la norfloxacine couplée à un
bras espaceur hydrolysable in vivo, l’antibiotique 19 est tout d’abord mis en réaction
avec le chloroformiate de chlorométhyle. Le chlorure 22 ainsi formé est traité par
l’hémisuccinate de tert-butyle en présence de carbonate d’argent, conduisant ainsi
à la formation de l’ester 23. Ce dernier est ensuite déprotégé en présence d’acide
trifluoroacétique (TFA) et l’acide carboxylique résultant est transformé en l’ester de
pentafluorophénol 24 ainsi obtenu en quatre étapes avec un rendement de 40% à partir
de la norfloxacine 19 (Sch. 3).
133
CHIMIE DES SIDÉROPHORES
Chimie des sidérophores
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
Arch. Sci. Nat. Phys. Math. NS 46
Sch. 3 : Synthèse des blocs norfloxacine-bras espaceur : i. anhydride succinique,
pyridine, DMSO, 95°C. ii. C6F5OH, EDCI, dioxanne, 90°C. iii. ClCH2OCOCl,
bis-diméthylaminonaphtalène,
CHCl3, 20°C.
iv.: i.tBuOOCCH
CH2COOH,
Ag2CO3,
Sch. 3 : Synthèse des blocs norfloxacine-bras
espaceur
anhydride succinique,
pyridine, DMSO,
2
F5OH, EDCI,
dioxanne,
90°C. iii. ClCH2OCOCl, bis-diméthylaminonaphtalène, CHCl3,
DMF, 95°C.
90°C.ii. v.C6TFA/CH
Cl
5%,
20°C.
2
2
20°C. iv. tBuOOCCH2CH2COOH, Ag2CO3, DMF, 90°C. v. TFA/CH2Cl2 5%, 20°C.
Avant de pouvoir construire les prodrogues en greffant les substances bioactives
sur les analogues fonctionnalisés de la pyochéline, les fonctions amines de ces derniers
Avant de pouvoir construire les prodrogues en greffant les substances bioactives sur
devaient
êtrefonctionnalisés
libérées. L’utilisation
d’un mélange
à 6% de
TFAde
dans
dichlorométhane
les
analogues
de la pyochéline,
les fonctions
amines
ceslederniers
devaient
s’est
révéléeL’utilisation
être une méthode
très efficace
les amines
être
libérées.
d’un mélange
à 6% de permettant
TFA dans led’obtenir
dichlorométhane
s’est attendues
révélée
sansune
dégradation
deefficace
la structure
de la d’obtenir
pyochéline.
Les pyochélines
17 dégradation
et 18 présentant
être
méthode très
permettant
les amines
attendues sans
de
laune
structure
de laamine
pyochéline.
et 18 présentant
uneavec
fonction
amine libre
ont 21
fonction
libre Les
ontpyochélines
ensuite été17mises
en réaction
les esters
activés
ensuite
en réaction
avec
les esters activés
21 ouen
24présence
dans la DMF
anhydreDans
à
ou 24 été
dansmises
la DMF
anhydre
à température
ambiante
de DIPEA.
température ambiante en présence de DIPEA. Dans ces conditions, les conjugués 25, 26 et 27,
ces conditions, les conjugués 25, 26 et 27, 28 dérivés des analogues 17 et 18 de la
28 dérivés des analogues 17 et 18 de la pyochéline ont été isolés avec un rendement de 80%
pyochéline
ont été inhibitrice
isolés avec
rendement
de 80% (Fig. 6.A.).
inhibitrice
(Fig.
6.A.). L’activité
desunconjugués
pyochéline-antibiotique
25,L’activité
26 et 27, 28
sur la
des conjugués
pyochéline-antibiotique
26 et 27,
28 sur
la croissance
bactérienne a
croissance
bactérienne
a été testée sur une25,
période
de 24
heures
sur des Pseudomonas
aeruginosa
souche
PAOde
cultivés
en milieu
minimum.
Dans le cadre
de ces expériences,
été testée de
surlaune
période
24 heures
sur des
Pseudomonas
aeruginosa
de la souche
les
bactéries
sont
mises
en
présence
des
complexes
ferriques
des
composés
25, 26 et bactérienne
27, 28 en
PAO cultivés en milieu minimum. Dans la culture témoin, la croissance
utilisant comme témoin une culture de bactéries mises en présence de ferripyochéline. Dans la
se déroule normalement. En présence des conjugués munis d’un bras espaceur stable
culture témoin, la croissance bactérienne se déroule normalement. En présence des conjugués
25 (code
et 27stable
(code25LC069),
cette et
croissance
n’est que
faiblement
munis
d’un FR051)
bras espaceur
(code FR051)
27 (code LC069),
cette
croissanceinhibée.
n’est
Lorsque
ces expériences
sontces
menées
en présence
des prodrogues
26 (code
FR064)
que
faiblement
inhibée. Lorsque
expériences
sont menées
en présence des
prodrogues
26 et
(code
FR064)
et 28 (code
LC067),
un bras hydrolysable
in vivo, la croissance
28 (code
LC067),
possédant
un possédant
bras hydrolysable
in vivo, la croissance
bactérienne
bactérienne
est totalement
(Fig. 6.B.)
(RIVAULT
et al.,2007).
2007). Ce
Ce résultat
ainsi
et al.,
résultatvalide
valide
ainsi
est totalement
inhibée inhibée
(Fig. 6.B.)
(RIVAULT
notre approche prodrogue utilisant la pyochéline pour vectoriser un antibiotique et
notre approche prodrogue utilisant la pyochéline pour vectoriser un antibiotique et
promouvoir son passage au travers des membranes bactériennes.
promouvoir son passage au travers des membranes bactériennes.
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