Étude de l`impact des conditions de culture in vitro sur l`expression

ISABELLE CÔTÉ
,
ETUDE DE L'IMPACT DES CONDITIONS DE
CULTURE IN VITRO SUR L'EXPRESSION
GÉNÉTIQUE EMBRYONNAIRE CHEZ LE BOVIN
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures de l' Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en sciences animales
pour l' obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc)
DÉPARTEMENT DES SCIENCES ANIMALES
FACULTÉ DES SCIENCES DE L ' AGRICULTURE ET DE L ' ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LA V AL
QUÉBEC
2007
© Isabelle Côté, 2007
RÉSUMÉ
En utilisant une méthode à haut rendement, les micropuces, nous avons pu établir le
profil d'expression génétique d'embryons produits in vivo et in vitro. Suite à
l'établissement de ces profils génétiques, nous les avons comparés pour déterminer le
traitement in vitro qui fournit le profil embryonnaire le plus proche de ceux in vivo. En
général, tous les traitements contenant du sérum en maturation et/ou en développement ont
obtenu un profil similaire à celui des in vivo, tandis que ceux qui évoluaient en co-culture,
en milieu semi-défini et défini ont un profil qui dévie largement par rapport à celui des in
vivo. Les résultats obtenus suggèrent, entre autre, que le sérum a un impact plutôt positif
sur l'expression génétique embryonnaire et que l'utilisation de milieux complètement
définis est très nocif pour 1'embryon de même qu'un ajout de sérum en fin de
développement.
11
REMERCIEMENTS
Voilà la fin de deux, presque trois, belles années de travail. Je suis fière de pouvoir
dire que j'ai tenniné avec succès mes études de deuxième cycle. Ces deux années ont été
ponctuées d'événements personnels difficiles, mais c'est grâce au soutien et à la
collaboration de plusieurs personnes que je les ai sunnontés.
En tout premier lieu, j'aimerais remercier mes parents, Chantal et Serge ainsi que
mon frère Jean-Philippe, qui m'ont toujours encouragée à me dépasser et qui ont tout fait
pour que je réussisse.
Aussi, il est important de souligner que ces deux années n'auraient pas été ce
qu'elles ont été si ce n'est des équipes de recherche de Claude Robert et de Marc-André
Sirard. Encore merci !
111
AVANT-PROPOS
Au chapitre II est présenté un article qui sera soumis ultérieurement dans un journal
scientifique. À l'intérieur de ce dernier on y retrouve la portion matériel et méthodes
requises pour l'atteinte de mes objectifs de départ pour mon projet de maîtrise. On y
retrouve en plus, les résultats qui découlent des expériences effectuées ainsi qu'une
discussion et une conclusion.
L'écriture de cet article a été rendu possible grâce à la collaboration de plusieurs
personnes. Dans un premier temps, il est important de mentionner que c'est moi qui a
effectué la totalité des expériences présentées dans l'article. De plus, j'ai entièrement rédigé
cet article. Mon directeur de recherche, Dr Claude Robert, m'a toutefois donné de judicieux
conseils et a corrigé mon manuscrit. Aussi, mon co-directeur de recherche, Dr Patrick
Blondin, a été très important puisqu'il nous a fourni les embryons produits in vivo.
Finalement, mentionnons la collaboration d'Aurélie Labbe et de Catherine Gravel qui ont
respectivement travaillé sur la normalisation des données et sur la fabrication des
micropuces utilisées.
IV
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• "'••••••••••••••••••••••••• 11..
REMERCIEMENTS, ......................................................................................................... 111
AVANT-PROPOS ,.......................................................................................................... 1V
TABLE DES MATIÈRES ................................................................................................. v
, LISTE DES FIGURES,...................................................................................................... VIII
LISTE DES ABRÉVIATIONS ......................................................................................... iv
CHAPITRE 1 : REVUE DE LITTÉRATURE ............................................................... .
1.1 Anatomie et histologie de l' ovaire ..........................................................................2
1.2 Physiologie de l' ovaire............................................................................................ 3
1.2.1 La folliculogénèse ........................................................................................... 3
1.2.2 L' atrésie folliculaire ........................................................................................ 6
1.2.3 Régulation du cycle oestral ............................................................................. 7
1.2.4 L'ovogenèse .................................................................................................... 9
1.3 La production d'embryons in vitro (PlV) .............................................................. .13
1.3.1 Généralité ........................................................................................................ 13
1.3 ~ 2 Principes de la PlV.......................................................................................... 14
1.3.2.1 La maturation (MIV)............................................................................. 14
1.3.2.2 La fécondation (FIV)____o ...................................................................... 16
1.3.2.3 Le développement (DIV) ...................................................................... 18
1.4 Les milieux de culture.............................................................................................21
1.4.1 Généralité ........................................................................................................ 21
1.4.2 Principe du « retour à la nature »....................................................................25
1.4.2.1 Liquide folliculaire: milieu de maturation ovocytaire in vivo ............. 25
1.4.2.2 Liquide tubaire: milieu de fécondation et du développement précoce,26
1.4.3 Caractéristiques principales de chacunes des composantes
majeures d'un milieu de culture embryonnaire............................................ 28
1.4.3.1 La source d'énergie ...........·............................................................... ,29
1.4.3.2 Les acides aminés............................................................................. ,30
1.4.3.3 Les osmolytes........................................................................................ 30
1.4.3.4 La L-Glutamine..................................................................................... 31
v
1.4.3.5 Un tampon pour maintenir le pH,.......................................................... 31
1.4.3.6 Les chélateurs d'ions............................................................................. 31
1.4.3.7 Le sérum................................................................................................ 32
1.5 Impact du milieu de culture sur l'embryon............................................................. 33
1.5.1 Changements morphologiques ......................................................................... 33
1.5.1.1 Le ratio ICM/TE.................................................................................... 33
1.5.1.2 Le contenu lipidique.............................................................................. 34
1.5.1.3 La vitesse de clivage ............................................................................. 34
1.5.1.4 Le ratio mâle/femelle_ ...................................................................... 35
1.5.2 Changements moléculaires.............................................................................. 35
1.5.3 Conséquences potentielles à long terme sur les embryons ............................. 37
1.6 Concept de la qualité embryonnaire........................................................................38
1..1 Les objectifs principaux du mémoire......................................................................39
1.8 Références ...............................................................................................................40
CHAPITRE II: MANUSCRIPT ...................................................................................... 44
2.1 Résumé....................................................................................................................45
2.2 Introduction.............................................................................................................46
2.3 Matériel et méthodes ...............................................................................................49
2.4 Résultats ..................................................................................................................56
2.5 Discussion ...............................................................................................................60
2.6 Conclusion...............................................................................................................66
2.7 Remerciements........................................................................................................67
2.8 Références ............................................................................................................... 68
2.9 Figures..................................................................................................................... 70
2.9.1 Description du dispositif expérimental............................................................70
2.9.2 Photo illustrant la totalité des points allumés par la référence ........................ 71
2.9.3 Photo illustrant la spécificité de l'hybridation des sondes d'ARNa
pour les zones blastocystes spécifiques......................................................................... 72
2.9.4 Classification de type ST (sample tree) représentant le degré de
similitude_entre les traitements in_vivo et sof/sof ainsiqu'entre les réplicats
biologiques et techniques d'un même traitement................................................................. 73
VI
2.9.5 Graphique représentant le résultat du test Figure Of Merit (FOM)
pour le traitement sojlsof. ..................................................................................................... 74
2.9.6 A), B), C), D), E) Illustration représentant une classification de
type KMC pour le traitement sojlsof....................................................................................75
2.10 Tableaux ...............................................................................................................79
2.10.1 Tableau illustrant la qualité relative (grosseur, couleur, taux) des
blastocystes pour chaque traitement..................................................................................... 79
2.10.2 Tableau mettant en évidence les transcrits significativement
différemment exprimés des traitements in vitro par rapport à ceux in vivo en
association avec des exemples de gènes surexprimés et sous-exprimés.............................. 80
2.10.3 Tableau mettant en évidence les divers processus biologiques affectés
par les gènes significativement différemment exprimés par les traitements de culture....... 81
CHAPITRE III : CONCLUSIONS GÉNÉRALES......................................................... 82
vu
LISTE DES FIGURES
Figure 1. :
Illustration des différentes parties du système reproducteur femelle bovin.3
Figure 2 :
Illustration des différents stades de croissance folliculaire .......................... 5
Figure 3 :
La croissance folliculaire.............................................................................. 8
Figure 4 :
Illustration schématique du cycle oestral bovin,........................................... 9
Figure 5 :
Schéma illustrant les principales étapes de la vie de l'ovocyte, depuis
la cellule germinale primordiale jusqu'à la fécondation.............................. .12
Figure 6 :
Schéma illustrant les différentes parties d'un spermatozoïde humain,......... 17
Figure 7 :
Schéma du moment où se déroule la MZT chez le bovin,............................20
Figure 8 :
Photo d'embryons bovins ............................................................................. 20
Figure 9 :
Diagramme de Venn illustrant les classes de composantes qui doivent se
retrouver dans un milieu de culture embryonnaire défini ............................ ,24
VIl1
LISTE DES ABRÉVIATIONS
ADN : acide désoxyribonucléique
ADNc: ADN complémentaire
Ala: alanine
ALCAM: activated leukocyte cell adhesion molecule
AMPc : adénosine monophosphate cyclique
ADN: acide désoxyribonucléique
ARN: acide ribonucléique
Asn: asparagine
Asp: acide aspartique
ATP: adénosine triphosphate
ATP5Al: ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial FI complex, alpha subunit 1, cardiac muscle
Bax: BCL2-associated X protein
BfGf: fibroblast growth factor 2
Bmp4 : bone morphogenetic protein 4
Bmp8 : bone morphogenetic protein 8
BRL: buffalo rate liver
BSA: albumine bovine sérique
BWS: syndrome Beckwith Wiedemann
CamK2 : Calcium/calmodulin-dependant protein kinase 2
CCR4-NOT: CCR4-NOT transcription complex
Cdc2: proteine kinase cdc2
Cdc25: protein kinase cdc25
CdK2: cyclin-dependant kinase 2
CGPs : cellules germinales primordiales
C-MOS: oocyte maturation factor Mos
CSF: facteur cytostatique
CuSOD: superoxide dismutase 2 (Cu)
Cx31: connexine 31
Cx43: connexine 43
ix
Cys: cystéine
DIV: développement in vitro
DNAJB6: Dnal (Hsp40) homolog, subfamily B, member 6
DOTIL: DOTI-like, histone H3 methyltransferase
E2: oestradiol
EDTA: acide éthylène-diamine-tétracétique
EGF : epidermal growth factor
Emi2: endogenous meiotic inhibitor 2
FGF2 : fibroblast growth factor 2
FIV : fécondation in vitro
FOX03A: forkhead box 03A
FSH : hormone folliculostimulante
G6PD: glucose-6-phosphate deshydrogenase
GDF9 : growth differenciation factor 9
GIn: glutamine
Glu: acide glutamique
Glut-3: solute carrier family 2, member 3
Glut-4: solute carrier family 2, member 4
Glut-5: solute carrier family 2, member 5
Gly: glycine
GnRH : gonadolibérine
GnSAF : gonadotrophin surgeattenuating factor
GV: vésicule germinale
GVBD : germinal vesicle breakdown
H19: H19, imprinted maternally expressed untranslated rnRNA
HGF : hepatocyte growth factor
His: histidine
HMGB 1: high-mobility group box 1
HSP70.1: heat shock 70 kD prote in 1
ICM : masse cellulaire interne
ICSI: injection intra cytoplasmique
x
IGF: insulin-like growth factor
IGFI : insulin-like growth factor 1
IGF2 : insulin-like growth factor 2
IGFB7: insulin-like growth factor binding protein 7
IGFBP2 : insulin-like growth factor binding protein 2
IGFBP4: insulin-like growth factor biQding protein 4
IGFBP5 : insulin-like growth factor binding protein 5
IGF-lR:insulin-Iike growth factor receptor
IL-2: interleukine-2
IL-6: interleukine-,6
Ile: isoleucine
INFT: interféron-tau
.
K+ : potassIum
KGF: keratinocyte growth factor
Leu: leucine
LH : hormone lutéinisante
LIF: facteur d'inhibition de la leucémie
Lys: lysine
Met: méthionine
MIV : maturation in vitro
MMP2 : matrix metallopeptidase 2
MMP9 : matrix metallopeptidase 9 '
MnSOD: superoxide dismutase 2 (Mn)
MPF : M-phase-promoting factor
MZT: maternaI to zygotic transition
P4: progestérone
PDGF-A: platelet derived growth factor A
PDGF-B: platelet derived growth factor B
Phe: phénylalanine
PlV: production in vitro
PKCs : protéine kinase C
Xl
- - - - --
-
------
-~- -
~ ~------------------.
Pro: proline
PVA: alcool polyvinylique
RA: reproduction assistée
Ser: sérine
SNCT: somatic cell nuclear transfer
SNRPN: small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N
SOX: SOX (mammalian SRY box) family
TE: trophectoderme
TGFa: transforming growth factor alpha
TGF~
: transforming growth factor beta
Thr: thréonine
Trp: thryptophane
Tyr: tyrosine
Val: valine
Vero: lignée cellulaire continue de reins de singe
ZnSOD: superoxide dismutase (Zn)
xii
CHAPITRE 1
REVUE DE LITTÉRATURE
1. REVUE DE LITTÉRATURE
1.1 Anatomie et histologie de l'ovaire
Les ovaires sont les gonades femelles. Elles se situent dans la cavité pelvienne, en
dessous des trompes de Fallope (aussi appelées oviductes) et de part et d'autre de l'utérus
. (Figure 1) [1]. Ils sont maintenus à cet endroit par différentes structures :
1. Le ligament ovarien
2. Le ligament suspenseur qui les rattachent à la paroi pelvienne
3. Le mésovarium qui les rattachent au ligament large
On distingue trois parties distinctes à l'ovaire: (Figure 2)
1. L'épithélium germinatif: c'est la couche externe de l'ovaire. Elle est très épaisse et
constituée d'un épithélium simple cubique ou pavimenteux i.e. : une seule couche
de cellules de forme cubique ou pavimenteuse [2, 3].
2. L'albuginée: cette partie est située sous l'épithélium germinatif. Elle est constituée
de tissus conjonctifs denses [2, 3].
3. Le stroma: cette zone se divise en deux pour former le cortex du stroma (couche
externe) et la médulla du stroma (couche interne). Le cortex est un tissu de soutien
formé de tissu conjonctif et de cellules du stroma. Ces cellules forment des amas
denses et sont disposées en spirales. Quand à la médulla, elle se compose
d'ovocytes et de cellules folliculaires [2, 3].
C'est dans le cortex du stroma que se déroule l'activité folliculaire. Dans la médulla,
on y retrouve beaucoup de vascularisation qui se fait par les artères ovariennes [2].
2
Vessie
1
i
1
1
1
1
J 1
l , JI'
1
Figure 1 : Illustration des différentes parties du système reproducteur femelle bovin. Tirée
de http://academicos.cualtos .udg. mx/Dip lomadoCalidadLecheldata/tdg/FREPR01 ch 1. pdf .
1.2 Physiologie de l'ovaire
1.2.1
La folliculogénèse
Le follicule est une structure en forme de sac, formée par un amas de cellules
mésodermiques, entourant une cellule ou un autre ensemble de cellules [1].
La folliculogénèse se définit comme étant l'évolution des follicules dans l'ovaire.
À l'âge adulte, chez les mammifères, les ovaires contiennent plusieurs follicules,
lesquels sont à différents stades de croissance et de maturation. Seulement une minorité de
ces follicules vont se rendre jusqu'à l'ovulation; les autres vont dégénérer par un processus
appelé .atrésie folliculaire [4]. La croissance et la maturation des follicules sont dirigées par
deux hormones gonadotropes d'origine hypophysaire soit 1'hormone folliculo-stimulante
(FSH) et 1'hormone lutéinisante (LH) [5]. La production de FSH et de LH est, quant à elle,
modulée par diverses hormones ovariennes; l'oestradiol, la progestérone et l' inhibine [1].
Le niveau de ces hormones est contrôlé par différentes molécules. Il a été rapporté que
l'a2-macrobuline et l' a2-M récepteur sont des substances qui semblent avoir un rôle
3
paracrine ou autocrine important sur les cellules de ·la granulosa pour que ces dernières
produisent de l'oestradiol [6]. Aussi, la GnSAF (gonadotrophin surge-attenuating factor)
est un autre facteur qui a pour fonction de réguler négativement la sécrétion pulsatile de LH
lors de la première moitié de la phase folliculaire [7].
Chaque follicule contient un ovocyte entouré d'une ou plusieurs couches de
cellules. Si une seule couche de cellules est présente, on appelle ces cellules: cellules
folliculaires. Par contre, s'il y a plusieurs couches cellulaires, les cellules vont porter le
nom de cellules granuleuses, communément appelées cellules de la granulosa [1].
L'évolution folliculaire est caractérisée par plusieurs stades de follicules :
1. Le follicule ovarien primordial: ce type de follicule est caractérisé par le fait que
l'ovocyte qu'il contient n'est entouré que d'une seule couche de cellules [1].
2. Le follicule ovarien primaire: ce type de follicule se caractérise par le fait que
l'ovocyte qu'il contient est entouré de deux ou plusieurs couches de cellules [1].
Les cellules de la granulosa sont liées entre elles par des jonctions perméables,
communément appelées gap-jonctions [8]. Ce sont des jonctions ouvertes qui
laissent passer des ions, des métabolites et des molécules de signalisation. Un des
signaux transmis de la granulosa à l'ovocyte est responsable du déclenchement de la
maturation de ce dernier [8].
3. Le follicule ovarien secondaire: rendu à ce stade, des espaces remplis de liquide
apparaissent entre les cellules granuleuses et s'associent pour former une cavité
nommée l'antrum folliculaire. La présence de cet antrum folliculaire est la
caractéristique distinctive de ce type de follicule. Aussi, il y a formation de cellules
thècales : une couche de tissu conjonctif qui se forme autour du follicule. Il y a
collaboration entre les cellules granuleuses et les cellules thècales pour produire les
oestrogènes [1]. En effet, les cellules de la thèque produisent des androgènes que la
granulosa transforme en œstrogène.
4. Le follicule ovarien mûr: ce type de follicule ressort à la surface l'ovaire et
chaque mois, lors de l'ovulation, un ovocyte est expulsé [1].
4
Mésovarium et
vaisseaux sangu ins
Corps jaune en
dégénérescence
Épithélium
Follicules germi1natif
ovariques
primordiaux
----:...;'-,---- Antrum folliculaire
~"'--~~
Ovocyte
Zone pellucide
ligament
propre
de l'ovaire
Médulla
de l'ovaire
Corps jaune
Corona
radiata
Corps jaune en voie
de développement
Figure 2 : Illustration des différents stades de croissance folliculaire. Tirée et adaptée de
[1 ].
Le temps requis pour qu'un follicule primordial parvienne au stade de follicule préovulatoire s'estime en terme de mois chez la vache et chez l'Homme [5]. Le follicule doit
obligatoirement subir une maturation pré-ovulatoire (phase folliculaire) pour le rendre apte
à répondre à la décharge ovulante qui induira la rupture folliculaire, la libération d'un
ovocyte mûr et la transformation du follicule en corps jaune [9]. L'initiation de la
croissance des follicules dépendrait, entre autre, du système Kit (système paracrine
constitué de deux protéines, le récepteur kit et son ligand kit) activé par l' AMPc.
L'augmentation d'AMPc serait quand à elle, induite par l'action de facteurs locaux [9]. Kit
ligand, est aussi régulé par GDF-9 (growth differentiation factor 9). De plus, la FSH agirait
avec des facteurs locaux comme: EGF (epidermal growth factor), activin A, GDF9, TGF~
(transforming growth factor beta), FGF2 (fibroblast growth factor 2), KGF (keratinocyte
growth factor) et HGF (hepatocyte growth factor) pour stimuler la croissance des divers
follicules [9].
5
1.2.2 L' atrésie folliculaire
Selon plusieurs études, pas moins de 99% des follicules qui entrent en croissance
dégénèrent. Pourquoi cette dégénérescence? Plusieurs scientifiques tentent d'élucider ce
mystère. Jusqu'à maintenant, les causes de cette dégénérescence, appelée atrésie
folliculaire, ne sont pas toutes connues, cependant plusieurs hypothèses ont été proposées
dont: 1) Le follicule est prédestiné dès sa formation à ovuler ou à dégénérer. 2) Le
processus d' atrésie s'opère à chaque stade de développement au hasard, par tirage au sort
dans un pool de follicules ayant tous les mêmes potentialités [10].
Les causes de l' atrésie folliculaire ne sont pas encore bien connues, mais les
symptômes de ce processus sont nombreux et beaucoup mieux connus. Cette
dégénérescence est le résultat d'un processus apoptotique [11]. Le premier signe d' atrésie
se manifeste par la dégénération des cellules de la granulosa. L' ovocye n'est affecté que
vers les derniers stades du processus d'atrésie folliculaire [12]. L'apoptose mas'sive des
cellules de la granulosa marque à coup sûr l' atrésie des follicules à antrum. Cependant la
présence de quelque cellules apoptotiques (taux < 0,2%) dans la granulosa est observée
dans la presque totalité des follicules en croissance [13]. Plusieurs marqueurs d' atrésie ont
été découverts. Notamment, il y a, relativement à la granulosa, une perte précoce de la P450
aromatase, une perte tardive des récepteurs FSH et LH, une diminution progressive de la
connexine 43, une augmentation des récepteurs de l'IGF 2/mannose 6 phosphate, une
augmentation tardive de la lamine, de la fibronectine, du collagène IV ainsi que des
héparane sulfate protéoglycanes [10]. Du côté de la thèque folliculaire, on dénote une
diminution tardive de la P450 17a-hydroxylase, de la C17-20 lysase, une augmentation de
l'IGFBP-2 et -4 de même qu'une perte précoce des récepteurs de l'IGF 2/mannose 6
phosphate et une perte précoce de la fibronectine cellulaire [10]. Quant au liquide
folliculaire, les changements fonctionnels observés au cours de l' atrésie des follicules sont
une chute précoce des oestrogènes, une augmentation des androgènes, une augmentation
progressive de l'IGFBP -2, -4, -5, une augmentation précoce et progressive des
6
métalloprotéases MMP-2 et MMP-9 et finalement une augmentation de l'héparane sulfate
protéoglycanes et de la prorénine [10].
1.2.3
Régulation du cycle oestral
Le cycle ovarien débute par la phase folliculaire, laquelle est caractérisée par la
croissance simultanée de plusieurs follicules [14]. À l'intérieur des follicules en croissance,
les ovocytes grossissent et sont entourés, graduellement, de plusieurs couches cellulaires
[14]. Chez la vache, comme chez l'Homme, un seul follicule par mois arrive à maturité. Le
follicule qui a ovulé se transforme ensuite en corps jaune. C'est le corps jaune qui sécréte
les hormones durant la dernière phase du cycle, la phase lutéale [15].
Cinq hormones participent à la régulation du cycle ovarien [14]:
1. La GnRH (gonadolibérine) produite par 1'hypothalamus
2. La FSH (hormone folliculo-stimulante)
3. La LH (hormone lutéinisante)
4. L'œstrogène (hormone sexuelle propre à l'ovaire)
5. La progestérone (hormone sexuelle propre à l'ovaire)
Durant la phase folliculaire du cycle ovarien, l'hypothalamus sécrète la GnRH, ce qui
va stimuler la libération, par l' adénohypophyse, de faible quantité de FSH et de LH. À cet
instant, comme les cellules des follicules de l'ovaire ont uniquement des récepteurs FSH,
seule cette dernière va pouvoir exercer son effet, celui de stimuler la croissance des
follicules [16].
7
sé ec t
do
et
t'at'o
de'
a c o~ssar ce
,. c a e
tilt
--
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•
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a ce
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s
-+
III
2 c y c e:s oest a
..
Figure 3 : La croissance folliculaire. Tirée et adaptée de [5].
À mesure que les follicules croissent, les cellules folliculaires, surtout les cellules de
la granulosa, se munissent de récepteurs à LH et peuvent alors réagir à cette dernière et
transférer leur dépendance à la FSH contre une dépendance à la LH permettant ainsi aux
follicules de poursuivre leur croissance [5]. L'augmentation de LH entraîne la maturation
finale du follicule dominant. Chez la vache, vingt-quatre heures après le pic de LH survient
. l'ovulation [16]. Durant la phase luté ale du cycle ovarien, il se produit une transformation
tissulaire du follicule qui a ovulé; il se transforme en corps jaune [15, 17]. Cette
modification est due à la forte concentration de LH. En réponse à la LH, le corps jaune va
produire une hormone stéroïde, la progestérone [15, 17]. Arrivé à pleine maturité le corps
jaune va commencer à dégénérer dû à la chute de LH provoquer par un mécanisme de rétroinhibition [15, 17] et dû au largage de PGF 2oc • Les fortes concentration d'oestrogènes et de
progestérone vont mettre fin à la sécrétion de GnRH, donc de FSH et de LH [17]. Cela
signifie que vers la fin de la phase lutéale, les concentrations en oestrogènes et en
progestérone sont très basses [15, 17]. La diminution de ces hormones va supprimer l'effet
de la rétro-inhibition sur l'hypothalamus et l' adénohypohyse. L' adénohypophyse va alors
sécréter la bonne quantité de FSH pour qu'un nouveau cycle ovarien puisse s'amorcer [17].
8
Il est impératif de noter que chez la vache, la croissance folliculaire est caractérisée
par des vagues folliculaires. Une vague folliculaire se définit comme étant le
développement synchrone d'un groupe de follicules à des temps différents et est engendrée
par des pics de FSH. C'est la baisse de FSH qui conduit à l'apparition du follicule dominant
ainsi qu'à l'apparition du récepteur de LH sur celui-ci. Pendant la folliculogénèse
terminale, la cohorte sera réduite au nombre d'ovulation caractéristiques de l'espèce, soit 1
chez la vache (espèce monoovulatoire). [17]
Estr og e n
p r ogest:erone
LH
FSH
Figure
4:
Illustration
schématique
du .
cycle
oestral
bovin.
Tirée
de http://www.cvm.okstate.edu/instruction/mmcurr/histology/fr/HiFRpI5 .htm .
1.2.4
L' ovogénèse
L'ovocyte est la seule cellule connue capable de reprogrammer un noyau de cellule
somatique et d'initialiser le développement embryonnaire via la parthénogénèse [18]. Seul
un ovocyte compétent est apte à réaliser ce travail. Cette compétence, il l' obtient grâce à un
processus nommé ovogenèse.
9
On entend par ovogenèse la formation des gamètes femelles, aussi appelés ovules,
de même que la maturation de ces derniers. L'ovogenèse se déroule dans les ovaires et
débute durant la vie embryonnaire [1].
Formation des gamètes femelles
Chez la souns, les ancêtres des cellules germinales sont induites à partir de
l'épiblaste proximal du cylindre ovocytaire au jour embryonnaire 6.5 en réponse à Bmp4
(bone morphogenetic protein 4) et Bmp8 (bone morphogenetic protein 8b) [18]. Au jour 7,
c'est une population d'environ 45 cellules germinales primordiales (CGPs) qui donnent
naissance aux cellules germinales proprement dites, soit les ovocytes [18].
En tout premier lieu, il y a la migration des cellules germinales primordiales, aussi
appelées CGPs. Chez le bovin, les CGPs apparaissent après 30 jours de gestation. Ce sont
des cellules d'origine extra-embryonnaire qui migrent vers les ovaires en exécutant des
mouvements améboïdes [19].
En second lieu, il y a la différenciation des cellules germiales primordiales en
ovogonies. Les ovogonies sont des cellules germinales diploïdes se multipliant rapidement
par mitose [1]. En fait, les ovogonies sont formées à partir des quelques CPGs colonisées
dans les ovaires qui se mettent à se diviser de façon synchronisée grâce à des ponts cellaires
entre eux. C'est. la phase ovogoniale. On se retrouve, une fois les divisions terminées, avec
5 à 7 millions d'ovogonies [19]. Quelques unes des ovogonies vont se transformer en
ovocytes de premier ordre, les autres vont dégénérer durant le développement fœtal. Un
ovocyte de premier ordre est en fait un ovocyte entouré d'une couche de cellules
folliculaires plates, aussi appelées cellules du cumulus. Les ovocytes de premier ordre vont
débuter leur première division méiotique sans la compléter; celle-ci va se bloquer en
prophase 1. "Jusqu'ici, toutes les étapes de l'ovogenèse décrites précedemment se
déroulaient dans l'embryon femelle; les subséquentes surviendront lorsque le nouveau-né
aura entamé sa puberté [1].
10
La puberté enclenchée, plusieurs ovocytes de premIer ordre seront activés
mensuellement chez les espèces mono-ovulantes. Cette activation a pour but de terminer la
méiose 1, laquelle s'était arrêtée en prophase 1. Une fois la méiose 1 terminée, on se
retrouve avec l'ovocyte de deuxième ordre [1]. Cet ovocyte va débuter une seconde méiose,
mais il ne la complètera pas, il va s'arrêter en métaphase 2 jusqu'à ce qu'il soit expulsé lors
de l'ovulation. Lors de l'ovulation, c'est-à-dire lorsque la membrane du follicule mature se
rompt et libère l'ovocyte, il peut y avoir fécondation ou non. S'il n'y a pas fécondation,
l'ovocyte va dégénérer et il va y avoir apparition des menstruations chez la femme, mais
s'il y a fécondation, l'ovocyte va terminer sa deuxième méiose ce qui va donner naissance à
un ovule [1].
Il
Noyau
Ovoc e
Ovai e
lon- anon
'el
Vie fœtale
je
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BI~ge
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Diplotène- .
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Il
as.e U
Finœ m• .ios.
Figure 5 : Schéma illustrant les principales étapes de la vie de l'ovocyte, depuis la cellule
germinale primordiale jusqu'à la fécondation. Tirée de [8].
La régulation de la maturation ovocytaire
La reprise de la méiose 1 (GVBD pour germinal vesicle breakdown), lorsqu'il y a
ovulation, est une étape critique. Elle correspond au passage du stade G2 au stade M du
cycle cellulaire [8]. Cette reprise de la méiose repose sur l'activation du M -phasepromoting factor (MPF) [8]. Il s'agit d'un hétérodimère composé de la protéine p34
cdc2
et
d'une cycline B [8]. L'activation du MPF est possible grâce à la formation du complexe
12
p34
cdc2
p34
cdC2
-
cycline B et à la déphosphorylation des résidus thréonine 14 et tyrosine 15 de la
[8]. La déphosphorylation est dépendante des produits des gènes wee1 et cdc25 [8].
Le MPF est aussi responsable de la phosphorylation de l' ARN polymérase 2 et de facteurs
d'élongation; cela signifie qu'il est probablement impliqué dans la synthèse protéique de
novo lors de la reprise méiotique [8]. Il est à noté que le mécanisme d'activation du MPF
diffère selon les espèces [8].
Il s'en suit la transition de la première méiose avec la seconde méiose. Cette
transition est assurée par CdK2 (cyclin-dependant kinase 2). Chez le porc, un blocage de
l'activité de Cdk2 résulte entre autre en une mauvaise induction de la seconde méiose [20].
L'arrêt en métaphase 2 de la seconde méiose est dû à un facteur cytostatique (CSF) connu
comme dépendant de l'hétérodimère Cycline BI p34cdc2 du complexe MPF. Il y a aussi la
protéine C-MOS (oocyte maturation factor Mos) qui est impliquée dans l'arrêt en
métaphase 2 avec le CSF [21]. De plus, récemment, il a été mis en évidence chez xénopus
que Emi2 (endogenous meiotic inhibitor 2) agirait lui aussi pour maintenir l' arrrêt
cytostatique en métaphase 2 [22]. Finalement, la reprise de la seconde méiose est attribuée
aux PKCs (prote in kinase C). Toutefois, il est suggéré que la reprise de la seconde méiose
soit dûe à l'activité de CamK2 (calcium/calmodulin-dependent protein kinase 2). Son
activité, qui nécessite un niveau élevé de calcium, serait maintenue par la voie des PKCs
[23].
1.3 La production d'embryon in vitro (PlV)
1.3.1
Généralité
La PlV est la procédure selon laquelle on complète la maturation des ovocytes et on
combine les ovocytes et les spermatozoïdes à l'extérieur du corps. Les zygotes résultant de
cette conception sont cultivés quelques jours et ensuite transférés dans l'utérus de la
receveuse. On utilise cette procédure chez l'Homme et aussi chez les animaux. Chez
l'Homme, cette technique est de mise pour contrer l'infertilité. Louise Brown, le premier
bébé conçu par PlV, est né le 25 juillet 1978, au Royaume-Unis. C'est en 1981 que les
13
Etats-Unis ont commencé à mettre en pratique cette nouvelle technique et même que
d'autres pays ont emboîté le pas et depuis, plus d'un million d' enfants sont nés par FIV
dans le monde [24]. Du point de vu agronomique, la PlV est intéressante concernant la
production de masse d'embryons à faible coût pour le transfert embryonnaire, pour le
diagnostique embryonnaire, pour le clonage embryonnaire et pour la production
transgénique de même que pour la recherche sur les mécanismes de fécondation et
d'embryogénèse.
1.3.2
Principes de la PlV
1.3.2.1 La maturation (MIV)
C ' est dû à un manque d'ovocytes fécondables que des scientifiques ont développé la
maturation d'ovocyte in vitro (MIV) [4] . Comme des ovules immatures sont utilisés, une
maturation ovocytaire est de mise pour mimer celle qu'y a lieu durant l'ovogenèse. La
durée de la maturation in vitro varie selon l'espèce. La MIV a un taux de succès de plus de
80% chez la vache [25, 26].
Cette maturation ovocytaire se caractérise par deux étapes distinctes que doit
franchir l'ovocyte pour devenir compétent. S'il acquiert sa pleine compétence, il aura tous
les atouts nécessaires pour subir une fécondation. Ces deux étapes sont :
-la maturation nucléaire qui culmine par l'émission du 1er globule polaire.
-la maturation cytoplasmique est complexe et
se distingue par 3 étapes distinctes: la
croissance, la capacitation et la maturation pré-ovulatoire [27].
Ce sont des ovules au stade de vésicule germinale (GV) qui sont utilisés pour la
maturation in vitro. Chez le bovin, ces ovules proviennent, dans la plupart des cas,
d' ovaires d'abattoir. Ils sont ensuite mis dans un milieu leur permettant de reprendre leur
première méiose spontanément [8]. Ensuite, ils entament leur deuxième méiose, laquelle
s'arrêtera au stade de métaphase. Généralement, après 24hrs de culture, la majorité des
14
ovocytes sont rendus à ce stade. Il semble que ce soit la maturation cytoplasmique qui soit
en cause concernant le faible taux (30-40%) [28] de développement embryonnaire [26].
Durant la période de maturation cytoplasmique, les ovocytes passent d'un diamètre
de 30
~m
(dans follicules primordiales) à un diamètre de 130
~m
(dans follicules tertiaires)
[27] ce qui correspond à une augmentation de volume de 300X [8]. Des changements
moléculaires et structuraux surviennent dans le cytoplasme ovocytaire. Dans le follicule
primaire et secondaire, l'ovocyte se fait des réserves d' ARN, de protéines, de lipides et de
carbohydrates pour une utilisation future [27]. Aussi, certains organelles font leur
apparition: l'appareil de Golgi, le réticulum endoplasmique, les mitochondries et les
gouttelettes lipidiques. Il s'en suit la capacitation ovocytaire [27]. Cette étape se caractérise
par des changements au sein de l'ovocyte du moment où ce dernier est sélectionné pour la
dominance jusqu'au pic de LH pré-ovulatoire [27]. Pendant ce stade il se produit une
localisation des différents ·organelles, une plus grande production de gouttelettes lipidiques
ainsi qu'une migration des granules corticaux autour de la membrane plasmique [27]. In
vivo, la dernière étape, la période pré-ovulatoire, est initiée par le pic de LH menant à
l'ovulation, vingt-quatre heures plus tard [27]. Elle est caractérisée par un arrêt du contact
entre les projections des cellules du cumulus et l'ovocyte, un plus grand emmagasinage de
lipides et de protéines et la reprise de la méiose (GVBD) [27]. Pour mimer toutes ces
étapes, des hormones gonadotropes, de l'EGF et de l'IGF-I, sont incorporées au milieu de
culture lors de la maturation in vitro [8].
Des études ont démontré que lors de la MIV ce sont les ovocytes provenant des gros
. follicules qui sont les plus compétents [8, 26]. De plus, le temps entre la collecte des
ovaires et la mise en maturation des ovocytes a un impact positif sur la compétence
ovocytaire [26]. Il a été mis en évidence que les conditions de culture de maturation
pouvaient influencer l'expression de différents transcrits. Lonergan et al, en 2003, [26] ont
effectué une expérience portant sur la maturation in vitro versus in vivo. Ils ont recensé 12
transcrits différentiellement exprimés dont GDF -9 qui est plus exprimé chez les embryons
in vitro en comparaison avec les in vivo [26].
15
1.3.2.2 La fécondation (FIV)
L'étape de la fécondation est celle qui permet la rencontre du gamète mâle
(spermatozoïde) et du gamète femelle (ovocyte) et qui aboutit à la formation d'une cellule
unique, le zygote. In vivo, la fécondation a lieu dans l' ampou~e de l'oviducte chez les
mammifères [29]. Une foule de conditions doivent être mises en place pour que la
fécondation réussisse. Les spermatozoïdes et les ovocytes doivent être sélectionnés puis
réunis dans des conditions qui permettent la capacitation des spermatozoïdes ainsi que la
réaction acrosomique et qui ne favorisent pas la polyspermie et finalement qui permettent la
viabilité des gamètes.
Sélection des spermatozoïdes
Suite à la réception de l'échantillon de sperme fourni par le donneur, voici les
critères pris en considération lors de la caractérisation de la semence et de la sélection des
spermatozoïdes lors d'une FIV chez l'Homme [30, 31]:
1. volume (entre 2 et 6 mL)
2. couleur (opaque et blanchâtre)
3. pH (entre 7,2 et 8,0)
4. liquéfaction à 20 minutes
5. viscosité
6
6. concentration des spermatozoïdes (40-100 X 10 /mL)
7. motilité (statiques, non progressifs, progressifs lents, progressifs rapides)
8. vitesse de progression
9. index de linéarité
10. amplitude des mouvements de la tête
Il. analyse morphologique des spermatozoïdes (anomalies de la tête, de la pièce
intermédiaire et du flagelle)
16
M em br sne pl asmi que
Gaine protéique
du flagelle
Mi tochondri es
Acrosome : rôle dans
la fusion des gam ètes
Noyau à 23 chromosomes
F1 agelle : 45 à 60 IL
Pièce interm édiaire : 10 à 12 IL
Tête : 8 à 10 IL
Sp ermatozoïde humain en ME. T. (microscope électronique à transmission)
Figure 6: Schéma illustrant les différentes parties d'un spermatozoïde humain. Tirée
de http://svt.prepabac.s.free.fr/VocabulaireN oca5.html .
Capacitation des spermatozoïdes
On entend par capacitation un ensemble de modifications que doit subir le
spermatozoïde pour qu'il devienne éventuellement hyperactif et apte à subir la réaction
acrosomique [32].
In vivo, la capacitation est accomplie par les spermatozoïdes durant l'ascension du
tractus génital. Il s'agit d'un processus de maturation physiologique de la membrane des
spermatozoïdes [32].
Dans les conditions in vitro, la capacitation des spermatozoïdes bovins est possible
, grâce à l'ajout d'héparine au milieu de culture [33].
Réaction acrosomique
La réaction acrosomique est le terme employé lorsque le contenu de l' acrosome des
spermatozoïdes est libéré vers l'extérieur. Le contenu enzymatique de l'acrosome libéré
dans les environs des ovocytes permet un relâchement local de la zone pellucide ce qui
permet au spermatozoïde de passer à travers la zone pellucide pour aller féconder l' ovocyte.
17
Plusieurs enzymes sont libérés lors de la réaction acrosomique, les plus connues sont
l 'hyaluronidase et l' acrosine [34]. L' acrosine, une enzyme protéolytique est responsable du
passage du spermatozoïde à travers la zone pellucide [34].
Polyspermie
La polyspermie signifie qu'un ovocyte a été fécondé par plus d'un spermatozoïde.
De ce fait, le zygote résultant, a trop de chromosomes pour donner un rejeton viable. Il faut
donc empêcher tout autre spermatozoïde d'entrer dans un ovocyte déjà fécondé. In vivo,
pour contrer ce phénomène, des modifications ont lieu sur la membrane de l'ovocyte ainsi
qu'au niveau de la zone pellucide de l'ovocyte. Le premier mécanisme à intervenir pour
assurer la monospermie est la dépolarisation de la membrane de l'ovocyte. Cette
dépolarisation se produit lorsque la membrane plasmique d'un spermatozoïde entre en
contact avec la membrane de l'ovocyte. Des canaux à sodium s'ouvre et du sodium sous
forme ionique diffuse dans l'ovocyte provoquant ainsi une dépolarisation de la membrane.
Ce phénomène électrique empêche d'autres spermatozoïdes de fusionner avec la membrane
de l'ovocyte. Aussi, suite au phénomène électrique a lieu la réaction corticale. Cette
réaction faire en sorte que les granules corticaux, situés sous la membrane plasmique,
répendent leur contenu dans l'espace extracellulaire, sous la zone pellucide. Le contenu des
granules corticaux se lie tranquillement à l'eau, provoquant ainsi le détachement des
spermatozoïdes qui sont encore en contact avec les récepteurs de l'ovocyte. [1].
1.3.2.3 Le développement (DIV)
In vivo, après la fécondation, le zygote doit migrer des oviductes jusqu'à la cavité
utérine. Pendant sa migration, .il débutera sa segmentation qui constitue une suite de
divisions cellulaires.
Le développement in vitro (D IV),
pa~allèlement
au in vivo, vise à permettre au
zygote de se développer jusqu'au stade de blastocyste pour ensuite pouvoir être implanté
18
dans un utérus pour le développement subséquent. C'est l'étape la plus critique du système
de PlV puisque c'est ,celle qui détermine la qualité embryonnaire [26, 36].
Chez la souris, seulement 6 hrs (32 hrs chez le bovin) après la fécondation a lieu une
séries d'étapes déterminantes menant au développement embryonnaire. Il y ad' abord la
première division, dont le moment précis où elle se déroule est déterminant pour le
développement subséquent de l'embryon, il serait relié au statut de polyadénylation de
plusieurs gènes important pour le développement [26]. Il est clairement démontré que la
vitesse de clivage a un gros impact sur la capacité d'un ovocyte à se rendre jusqu'au stade
de' blastocyste. En effet, ceux qui clivent plus rapidement ont de meilleures chances de s'y
rendrent que ceux qui clivent plus tardivement [26]. Il s'en suit l'activation du génome
embryonnaire (MZT) au stade de 8-16 cellules chez le bovin [37], la compaction de la
morula au jour 5 et finalement, la formàtion dublastocyste au jour 6 et 7, impliquant la
différenciation de deux types cellulaires, le trophectoderme (TE) et la masse cellulaire
interne (ICM) [26]. Il est important de mentionner que le développement précoce
embryonnaire est largement dépendant des ARN m et des protéines synthétisées durant
l' ovogénèse. La MZT est un événement essentiel qui survient à un moment espèce
spécifique après la fécondation. En l'absence de la MZT, l'embryon meurt puisqu'il ne
peut, à lui seul, subvenir au besoin du développement embryonnaire « tardif» [37].
19
ARNm
embryonnaire
ARNm maternel
-24h
•
Oh
Maturation Fécondation
46h
4 calI.
62h
8 cell.
16 cell.
Blastocyste
Figure 7 : Schéma du moment où se déroule la MZT chez le bovin. Tirée et adaptée de la
présentation Power Point du séminaire de Marina Mourot.
L'œuf va passer de 4 cellules Gour 2 du développement) à 8 cellules Gour 3 du
développement) à 16 cellules jusqu'à 64 cellules sans qu'il n'y ait grossissement de l'œuf.
C'est seulement à partir du stade de morula que l'œuf commence à grossir (200 Jlm) [38].
Figure 8 : Photos d'embryons bovins. Tirées
de http://www.ciz.it/index.aspx?m=53&did= 152 .
20
Les cellules trophoblastiques contribueront à la formation du placenta et d'autres
structures de soutien [39]. Des études ont montré que la protéine BMP4, membre de la
superfamille des transforming growth factor-B (TGF-B), serait à l' origine de la
différentiation des cellules souches embryonnaires en cellules trophoblastiques [40] .
L'autre groupe cellulaire faisant partie intégrante du blastocyste, la masse cellulaire interne
ou bouton embryonnaire, donnera littéralement naissance au corps proprement dit du
nouveau-né [39].
Des différences notables, tant au niveau morphologique que génétique, entre un
embryon in vitro et in vivo ont été répertoriées [41]. D'un point de vu morphologique, on
dit des blastocystes in vitro qu'ils ont un cytoplasme plus foncé, un contenu lipidique plus
important, une zone pellucide plus fragile, une communication intracellulaire réduite ainsi
qu'une incidence plus accrue pour les anormalités chromosomiques que les blastocystes in
vivo [25]. On leur attribue aussi une moins bonne résistance à la cryopré servati on et une
ultrastructure différente des embryons in vivo [42].
1.4
Les milieux de culture
1.4.1
Généralités
Pour tansférer les embryons issus de la PlV, ces derniers doivent être cultivés
jusqu'au stade de morula ou blastocyste (notamment chez le bovin; chez l'humain, on
transfert des embryons au stade de 8 cellules, de morula et de blastocyste). Cela implique
que l'on doit les cultiver dans des milieux de culture conçus pour un développement
embryonnaire prolongé. Toutefois, l'ajustement de la composition des milieux de culture
n'est pas une mince affaire : les besoins des embryons varient constamment. Il en résulte
donc un développement embryonnaire in vitro associé avec un retard de clivage (il est à
noter que l'ajout de sérum au milieu de culture a un effet biphasique sur le développement
embryonnaire bovin, il inhibe le premier clivage mais stimule la formation de blastocystes
[43]), des blocages espèces spécifiques ainsi qu'une réduction de la viabilité (faible taux de
développement [43]) chez l'Homme ainsi que chez les animaux domestiques, ce qui laisse
21
sous entendre que les milieux des cultures présentement utilisés sont sous optimaux. En
effet, la capacité de l'embryon à se rendre au stade de blastocyste dépend de la qualité de
l'ovule, tandis que la qualité des embryons est sous l'influence directe des milieux de
culture. utilisés suite à la fécondation [44].
Il existe deux grandes catégories de milieux de culture utilisés pour la PlV: les
milieux définis et non-définis. Les milieux définis sont constitués d'une solution saline
supplémentée par du pyruvate, du lactate ou du glucose comme source d'énergie tandis que
les milieux non-définis sont, quant à eux, ceux désignés pour la
co-c~lture
avec des lignées
de cellules somatiques comme BRL ou Vero souvent supplémentés avec du sérum [45]. Il a
été mis en évidence qu'en co-culture, les cellules provenant de sources reproductives ou
non comme l'utérus, l'ovaire, le rein, la rate et le cumulus ont présenté un effet positif
concernant la viabilité des embryons in vitro [46]. Cet effet bénéfique pourrait être dû au
fait que les cellules ont la capacité d'éliminer les facteurs indésirables présents dans le
milieu de culture dû à l'activité antioxydante des cellules somatiques, à la libération de
facteurs de croissance ainsi que d'autres agents embryotrophiques par les cellules
somatiques et finalement simplement dû au contact cellules-cellules avec l'embryon [46].
Les milieux de culture utilisés aujourd'hui pour la PlV tendent à être plus simples dans leur
formulation en comparaison avec ceux utilisés pour la culture de cellules somatiques de
façon à minimiser l'impact des divers constituants des milieux sur les embryons en
développement. La maj orité de ces milieux sont basés sur de simples solutions salines
enrichies de substrats énergiques et d'une source protéique [47]. Les milieux et les
conditions les plus fréquemment utilisés sont:
1. TCM-199: Un milieu non défini dont la composition est proche de celle du plasma
sanguin [1 7] .
2. SOF, B2-Ménézo : Deux milieux que l'on classe dans la catégorie définie dont la
composition rappelle celle des sécrétions tubaires [17].
3. Coculture: Ce n'est pas un milieu, mais un type de culture qui utilise des milieux
conditionnés de culture d'épithélium tubaire et utérin, de cellules BRL ou de
cellules V éro [1 7].
22
4. Séquentiel: Ce n'est pas un milieu, mais un type de culture dont la composition
des milieux de culture utilisés varie selon que l'embryon se trouve au stade de
segmentation ou au stade de morula compactée-blastocyste [17].
La considération de la physiologie embryonnaire, du moment où l'on débute la
culture, jusqu'à la toute fin est très importante dans l'élaboration de tel milieu de culture. Il
est connu que l'étape englobant le clivage embryonnaire est caractérisée par de faibles
niveaux de biosynthèse, de faibles taux respiratoires et par une capacité limitée à utiliser le
glucose comme source d'énergie. Au contraire, la post-compaction est caractérisée par une
hausse des taux de biosynthèse, par une augmentation de la capacité respiratoire ainsi que
par la capacité d'utiliser le glucose [48].
De plus en plus, ce sont les milieux chimiquement définis qui sont utilisés [49].
Pourquoi? Pour des raisons pragmatiques: ils sont reproductibles à différents temps, dans
différents laboratoires;' ils peuvent être variables d'une manière contrôlée; et ils sont
exempts de toute activité biologique inconnue,- comme des enzymes et des facteurs de
croissances qui peuvent affecter les réponses étudiées [50].
Deux problèmes surviennent lors de l'élaboration de milieux de culture: le premier
concernant la sélection des composantes à inclure dans le milieu; et en second, la
détermination des concentration de chacun des composantes choisies [50]. Pour résoudre le
premier problème, on peut se fier au diagramme de Venn qui illustre trois classes de
composantes qui doivent se retrouver dans un milieu défini pour la culture embryonnaire
[50].
23
Constituants
/ChimiQues
~--+------
Constituants
corporel
Constituants
du fluide de l' oviducte
Constituants
du milieu
Figure 9: Diagramme de Venn illustrant les classes de composantes qui doivent
se retrouver dans un milieu de culture embryonnaire défini. Tirée et adaptée de [49].
Lors de l'élaboration du milieu de culture, on peut utiliser peu de composantes
(moins de 12), ce qui formera un milieu défini simple, ou plus de 12 composantes, ce qui
formera un milieu défini complexe [50].
Pour ce qui est du choix de la concentration de chacune des composantes du milieu
de culture, rien n'est simple puisque la concentration intrinsèque de chacune dans la
mixture a un impact sur les autres. Deux approches sont utilisées pour déterminer la
concentration .des constituants requis dans les milieux de culture: le principe disant « c'est
l'embryon qui choisit» et le principe du « retour à la nature» [50].
« C'est l'embryon qui choisi» est un principe selon lequel on teste à l'aveugle
différentes concentration et on regarde comment l'embryon réagit tandis que le principe du
« retour à la nature» tente de mimer les concentrations auxquelles l'embryon est exposé
dans la nature [5 0] .
24
1.4.2
Principe du « retour à la nature»
Pour mimer le milieu naturel du développement embryonnaire, on doit en connaître
toutes les composantes. Ce n'est pas une mince tâche puisque la maturation ovocytaire a
lieu dans le liquide folliculaire, à l'intérieur d'un follicule ovarien, tandis que la
fécondation et le développement ont lieu dans l'oviducte et dans l'utérus [17] (le
développement tardif s'effectuant dans l'utérus ne sera pas traité ici).
1.4.2.1 Liquide folliculaire: milieu de maturation ovocytaire in vivo
Le liquide folliculaire est constitué d'une multitude de composantes, les plus
importantes étant: les protéines (comme l ' albumine), les acides aminées, les carbohydrates
ainsi que les lipides [1 7].
Les acides aminés qUI le composent varient d'une espèce à l'autre, toutefois,
plusieurs aminogrammes ont été faits pour plusieurs espèces. Ils sont des précurseurs de la
biosynthèse, une source d'énergie, des régulateurs du métabolisme énergétique, des
osmolytes, des tampons du pH intracellulaire et des chélateurs de métaux lourds. Chez tous
les animaux, c'est la glutamine et la glycine qui sont les constituants majeurs [17].
Le glucose est quand à lui le carbohydrate le plus présent, soit à 75% dans le liquide
folliculaire; c'est la principale source d'énergie des ovocytes en maturation. Les autres sont
le fructose ainsi que le lactate [1 7].
Concernant la teneur en lipides dans le liquide folliculaire de la femme ou de
l'animal, on remarque que cette dernière est plus faible que celle du sérum. Cependant, la
teneur en acides gras estérifiant semble être approximativement la même que celle du
sérum [17].
Bien évidemment, d'autres composés sont présents dans le liquide folliculaire. Il y a
l 'hypoxanthine et l'adénosine qui sont importantes pour maintenir l'ovocyte au stade GV
25
[17]. Les hormones comme l'estradiol (E2), la progestérone (P4), la FSH, la prolactine,
l'inhibine et les vitamines [17]. De plus, un grand nombre de protéines sériques sont
présentes dans le liquide folliculaire mais en concentration moindre [17]. Cette
concentration est variable d'un follicule à l'autre, tout dépendant de la taille de ce dernier:
plus il est gros, plus il est perméable aux protéines et aux macromolécules [17]. Des
facteurs de croissances (TGFB, TGFa, PDGF-A, PDGF-B, EGF, IGF, ...), des cytokines et
interférons IL-2, IL-6, LIF, CSF, ... font aussi partie du cocktail cependant, on ne connaît
pas vraiment leur rôle [17]. On suppose peut-être un rôle dans la régulation de l' adénylation
des ARN messagers, mais ça reste à vérifier. Finalement, un grand nombre d' enzymes
(hyaluronidases, peptidases, protéases, ... ) ont été recensés, mais leur fonction est plutôt
associée aux follicules et non aux ovocytes [17].
1.4.2.2 Liquide tubaire: milieu de fécondation et du développement
précoce
Le liquide tubaire se retrouve dans les conduits de l'oviducte, un organe non
homogène [17]. En effet, on distingue trois différentes parties, l'ampoule, la jonction
isthme-ampoule et l'isthme, qui chacune contient ses propres sécrétions [17]. Il faut aussi
considérer que la présence de l'embryon dans ce conduit peut en modifier l'environnement
[17].
De façon générale, on s'accorde pour dire que sa pression osmotique est de 290
mOsm/kg, ce qui est semblable à celle du sérum. On y retrouve une viscosité de 1,8
mPa/sec, un potentiel redox de -0,1 mV assuré par des composés réducteurs tel que le
gluthation réduit, la cystéine, le lactate et l 'hypotaurine ainsi qu'un pH alcalin variant entre
7,2 et 7,6 dû à une forte activité anhydrase carbonique. L'embryon qui baigne dans de telles
conditions doit s'assurer d'être en homéostasie avec son environnement en tout temps. Pour
ce faire, il dispose, entre autre, d'un échangeur HC0 3-/Cr pour réguler son pH interne et
d'un système antiport Na+/H+ pour se défendre contre les stress oxidatifs [17].
26
Les composantes du liquide tubaire sont, les électrolytes, les carbohydrates, les
acides aminés, les vitamines, les lipides, les précurseurs d'ADN et d' ARN ainsi que les
protéines. Voici un peu plus de détails sur chacune d'entre elles:
Comme électrolytes, on retrouve dans l'oviducte divers ions tels le Na2+, Mg2+,
cr
dont la concentration est assez semblable dans toutes les sections de l'organe. Le potassium
et le bicarbonate sont aussi présents, mais leur concentration est beaucoup plus importante
dans l'ampoule [1 7].
En terme de carbohydrates, les composés majeurs sont le glucose, le lactate et le
pyruvate. Ces derniers proviennent en grande partie du sérum et un peu de la synthèse des
cellules tubaires. Les études ont clairement démontré qu'avant l'activation génomique,
l'embryon utilisait surtout le pyruvate et le lactate comme source d'énergie [49]. Le glucose
ne semble pas un constituant indispensable. Il est peu utilisé au début du développement
embryonnaire à cause du blocage d'une enzyme glucolytique, la phosphofructokinase [51].
Rendu au stade de compaction et de blastulation le blocage de la phosphofructokinase est
enlevé alors le glucose contenu dans le milieu peut contribuer à augmenter la production
d'A TP, un régulateur clé dans le développement embryonnaire in vitro [49]. Souvent, le
glucose est considéré toxique par différents auteurs tandis que certains le défendent en
affirmant que cette « toxicité» serait dûe à son métabolisme plus facilement perturbable.
Toutefois, on reconnaît que tout excès de glucose mène à une augmentation de radicaux
libres lesquels entraînent des pathologies métaboliques dont les effets peuvent être ressentis
pendant la gestation et même suite à la parturition [17].
Les acides aminés sont aussi bien présents dans le liquide tubaire. On sait que tout
déséquilibre du milieu en acides aminés peut entraîner de graves problèmes au niveau de la
synthèse protéique de l'embryon. La majorité des études classent les acides aminés en deux
catégories: essentiels et non-essentiels. Cette classification semble absurde puisque tous les
acides aminés sont présents in vivo. Les acides aminés souffrés protègent les embryons
contre les radicaux libres oxygénés, la cystéine et la méthionine agissent de paire pour
synthétiser l'hypotaurine et la taurine, la cystéine est aussi un précurseur de la cystéamine
27
et du glutathion. Ces substances serviront ensuite de tampons pour que l'embryon puisse
maintenir son potentiel redox [1 7].
Les vitamines sont peu présentes dans le liquide tubaire. On a quand même recensé
la vitamine A et E qui seraient des protecteurs contre les radicaux libres [17].
Il est important d'assurer une
synthèse membranaire tout au cours . du
développement embryonnaire, c'est là le rôle des lipides. Dans l'oviducte, on retrouve des
phospholipides, des triglycérydes, des acides gras libres, du cholestérol libre et du
cholestérol estérifié. Le cholestérol est important pour assurer les divisions jusqu'au stade
de blastocyste. Il a été démontré qu'en incorporant un inhibiteur de cholestérol au milieu de
culture, la transition morula/blastocyste ne se faisait pas [17].
Des précurseurs d'ADN et d'ARN sont aussi présents dans l'oviducte bien que
l'embryon soit capable de synthétiser des bases libres. Dès le stade de 1 cellule on note une
activité transcriptionnelle chez la souris, cependant, cette dernière augmente énormément
après l'activation du génome embryonnaire (2 cellules chez la souris, 8 cellules chez
l' Homme et la vache) [1 7].
La teneur en protéine du liquide tubaire se veut plutôt faible si on la compare à celle
du sérum. La majorité des protéines qui la compose sont d'origine plasmatique. Les plus
abondantes sont l'albumine, la transférine et l'immunoglobuline G [17]. On y retrouve
aussi certains facteurs de croissance mais ils semblent agir uniquement dans l'utérus.
1.4.3
Caractéristiques principales de chacune des composantes majeures d'un.
milieu de culture pour embryons in vitro
On vient de voir la composition générale du liquide folliculaire et du liquide tubaire.
Si l'on suit la théorie du « retour vers la nature », il faut créer un milieu de culture avec les
composantes · et les concentrations appropriées selon chaque étape respective soit la
maturation ou le développement.· Pourtant ceci ne fonctionne pas. En effet, si, par exemple,
28
la même concentration de l'ion K+ que l'on retrouve in vivo est ajoutée à notre milieu in
vitro, les embryons vont dégénérer. Aussi, certaines substances sont plus difficiles à
intégrer au milieu de culture que d'autres, notamment les vitamines A et E qui se
solubilisent extrêmement mal. Il faut donc combiner la théorie du « retour vers la nature» à
celle qui dit « c'est l'embryon qui choisit ». La composition d'un milieu idéal est donc très
difficile à définir. Voici une brève ·description des ingrédients majoritairement retrouvés
dans les divers milieux de culture pour embryons [50] :
1.4.3.1 La source d'énergie (carbohydrates)
Dans les premiers milieux élaborés pour la culture embryonnaire, on croyait que le
glucose était à même de supporter le développement durant toute la période de
préimplantation. C'est dans les années 1950 que Whittens a suggéré que le glucose n'était
pas capable de supporter le développement embryonnaire avant le stade de 8 cellules. Il a
été mis en évidence chez la souris que le pyruvate est la source d'énergie préférée de
l'ovocyte mature, du zygote jusqu'à l'embryon de 8 cellules. Ensuite, c'est le glucose qui
devient la source énergétique favorite [50]. Il a été démontré que si l'on mettait du glucose
dans le milieu de culture avant la compaction ou le stade de blastocyste chez la souris et la
vache, cedemier allait inhiber le développement embryonnaire [52]. C'est une découverte
un peu paradoxale quand on sait que l'oviducte, siège du développement préimplantatoire
embryonnaire, en contient énormément. Chez le porc, dans les premiers stades du
développement (1 cellule à 4 cellules), les embryons utilisent le glucose via la voie des
pentoses phosphates [53]. Durant les stades plus tardifs, l'utilisation du glucose se fait
majoritairement à partir de la voie de la glycolyse [52]. Toutefois, même s'il est métabolisé
dans tous les stades du développement chez le porc, une étude a démontrée qu'une trop
grande exposition à de trop forte concentration en glucose mène à un retard dévelopemental
[52]. Pour tenter d'expliquer cette toxicité du glucose au début du développement
embryonnaire une équipe de recherche a suggéré que cette substance cause un stress
oxydatif sur l'activation du génome ce qui a pour impact une incapacité de l' embryon
porcin à passer par dessus le blocage à 4 cellules (la MZT porcine s'effectue au stade de 4
cellules) [52]. Il a aussi été proposé que ce soit la toxicité du méthylglycoxal, un dérivé de
29
la glycolyse, qui soit en cause dans l'inactivation de la peroxidase glutathion intracellulaire
responsable pour la capture des radicaux libres oxygénés [52].
1.4.3.2 Les acides aminées
En culture embryonnaire, on classe les acides aminés en deux catégories, essentiels
et non-essentiels. Les acides aminés essentiels sont: Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val,
Arg, Cys, GIn, His, Tyr. Les non essentiels sont: Ala, Ser, Gly, Asp, Asn, Glu, Pro [54].
La majorité des milieux de culture inclue des acides aminés. Il est important de
savoir que tous les acides aminés ne ,sont pas nécessaires pour un développement
préimplantatoire complet. Toutefois, l'augmentation de la quantité des 20 acides aminés
dans le milieu favorise la hausse du pourcentage de blastocystes éclos et accroît le nombre
de cellules présentent dans l'ICM et dans le trophectoderme [50].
Les
stratégies
employées jusqu'à maintenant pour déterminer la bonne
concentration de chaque acide aminé ne tient pas compte des interactions possibles entre
chacun d'eux. Il n'existe donc aucun milieu avec une concentration optimale d'acides
aminés [50].
1.4.3.3 Les osmolytes
Comme son nom l'indique, un osmolyte est une substance extracellulaire qui affecte
l'osmose de façon à maintenir les fonctions intracellulaires ainsi que le volume cellulaire.
En culture embryonnaire, il est primordial d'ajouter des osmolytes au milieu de culture
pour mimer la pression osmotique du liquide folliculaire qui est> 360 mOsmol [48]. Il a
été démontré que sans ajoutd'osmolytes au milieu, le développement embryonnaire est .
, significativement affecté tandis que lorsque que l'on ajoute de la glycine au milieu, un
accroissement du développement embryonnaire est observé [48]. Des études subséquentes
ont montré que l'ajout de glutamine, taurine et betaine étaient utilisés par les embryons au
début du développement embryonnaire comme osmolyte [48].
30
1.4.3.4 La L-Glutamine
La glutamine (GIn) fait partie de tous les milieux de culture défini. On l'utilise pour
ses fonctions d' osmolyte organique, d'acide aminé glucogénique, de précurseur
métabolique et de source d'azote [50]. Si la glutamine est ajoutée au milieu de culture à
trop forte concentration (2:3 mmolll), on observe une inhibition du développement
embryonnaire. La concentration idéale est de 1mmolll. Avec une telle concentration, on
peut constater une augmentation du nombre de cellules dans l'ICM et dans le
trophectoderme [50].
1.4.3.5 Un tampon pour maintenir le pH
Avant la compaction, les acides aminés non-essentiels de même que la glutamine
incorporés au milieu de culture aide à minimiser les variations de pH intracellulaire lorsque
l'embryon est exposé à une importante augmentation d'acide. Toutefois, la concentration
optimale d'acides aminés à ajouter n'a pas été déterminée [48].
1.4.3.6 Les chélateur d'ions
Le chélateur d'ions le plus employé pour la culture embryonnaire est l'EDTA, un
séquestreur de cations divalents. L 'EDTA incorporé au milieu de culture augmente la
capacité de développement embryonnaire en chélatant des ions de métaux lourds toxiques
présents dans le milieu. Alors que l'EDTA stimule le début du développement
embryonnaire, il réduit le développement embryonnaire s'il est incorporé au milieu après la
compaction. Des études suggèrent que l'EDTA inhiberait le développement de l'ICM en
inhibant la glycolyse, la voie par laquelle les cellules vont puiser la majeure partie de leur
production d'énergie [48].
31
1.4.3.7 Le sérum
Le sérum est un complément commun de plusieurs milieux de culture
embryonnaire. Toutefois, le fluide de l'oviducte n'est pas un dérivé du sérum. Il est formé à
partir de l'épithélium des
pa~ois
de l'oviducte tandis que le sérum est issu du sang. La
composition du sérum est très variable. Elle dépend de plusieurs facteurs dont le jour du
cycle, le régime alimentaire, etc. Des études récentes chez le mouton ont démontré que le
sérum pouvait affecter le développement embryonnaire à différents niveaux: formation du
blastocèle, stockage des lipides, structure mitochondriale anormale, perturbation du
métabolisme, faible cryotolérance [44] de même qu'une association avec le syndrome du
gros mouton (large offspring syndrome). De plus, la présence de sérum dans le milieu de
culture durant le développement augmente le niveau de certain transcrits et en diminue
d'autres [44]. Parmis ceux qui sont plus exprimés, notons MnSOD et SOX qui sont
impliqués dans le stress oxidatif, Bax qui est important pour l' apoptose de même que LIF et
LR-~
qui jouent un rôle au niveau de l'implantation embryonnaire [44]. Quant à ceux dont
le niveau est abaissé, il y a Cx43, lequel est associé aux jonctions communicantes ainsi que
l'INF-T, le facteur de reconnaissance de grossesse maternelle produit par le trophectoderme
[44]. Même s'il cause plusieurs désavantages, le sérum a ses avantages: chélateurs de
toxines embryonnaires, tampon pour le pH et protecteur lors du clivage embryonnaire [48].
Toutefois, les études ont montré que le sérum n'était pas requis pour la culture de
zygotes de mammifères jusqu'au stade de blastocystes éclos. On peut remplacer le sérum
par du sérum-albumine ou tout autre macromolécule physiologique comme du PVA ou du
hyaluronate en association avec un milieu désigné pour la culture embryonnaire [48]. Il faut
quand même faire attention à l'albumine que l'on ajoute au milieu car même si elle
provient du milieu commercial et qu'elle est faite pour la culture embryonnaire, il se peut
qu'elle contienne des lipides peroxydés qui sont du vrai poison pour les cellules [17, 55].
Aussi, si une trop grande quantité de sérum-albumine est ajoutée au milieu de culture, les
mêmes effets que ceux chez les embryons cultivés avec sérum sont observés mais ils sont
moins prononcés [41]. Lorsque le BSA est remplacé par du PVA dans les milieux de
32
culture, on note un bon taux de clivage mais un plus faible rendement de blastocystes de
même qu'une formation de plus petits blastocystes [41].
1.5
Impact du milieu sur l'embryon
Il est maintenant clair que les milieux de culture ont un impact direct sur la qualité
embryonnaire. En effet, des études ont démontré que des concentrations inappropriées
d'ingrédients présents dans un milieu de culture peuvent causer des modifications
morphologiques [56] ainsi que des changements génomiques et épigénétiques, altérer les
signaux intracellulaires, produire du stress métabolique, moduler l' apoptose et influencer la
prolifération cellulaire [54].
1.5.1
Changements morphologiques
1.5.1.1 Le ratio ICM/TE
Les embryons produits in vitro ont un plus faible ratio du nombre de cellules
formant l'ICM par rapport au
nom~re
de cellules formant le TE comparativement aux in
vivo [57]. Les embryons in vitro on aussi un lCM moins compact que les in vivo [57]. Une
expérience faite par Boni et al. a démontré que les embryons in vitro sont associés avec une
transcription défectueuse de la connexin 43, un transcrit associé aux jonctions
communicantes, lesquelles sont impliquées dans la régulation du développement [57]. C'est
la faible densité des jonctions dans l'lCM des embryons in vitro qui pourrait être
responsable de la piètre compaction des morulas [57]. Selon l'étude de Boni et al, les
jonctions se retrouvent un peu partout dans l' lCM des embryons in vivo et rarement dans le
TE de ces derniers tandis que chez les embryons in vitro ils ont mesuré une faible quantité
de ces canaux dans l'lCM et une absence totale dans le TE.
33
1.5.1.2 Le contenu lipidique
Une accumulation de lipides dans le cytoplasme des embryons cultivés dans un
milieu contenant du sérum [43] et/ou de grandes concentrations de BSA a été recensée [44].
Il est proposé que cette accumulation provienne de l'incorporation des lipoprotéines
contenues dans le sérum [43] et/ou du BSA. Cette trop grande incorporation serait, quant à
elle, dûe à un mauvais fonctionnement des mitochondries. En effet, il a été démontré que
ces dernières, au lieu d'être de forme . allongée, sont plutôt de forme ovoïde ce qui sous
entend qu'elles sont immatures [43]. D'autres études qui ont observé les accumulations de
gouttelettes lipidiques chez les embryons in vitro ont montré que les vésicules lipidiques
étaient situées préférentiellement à l'intérieur des cellules trophoblastiques plutôt qu'à
l'intérieur des cellules de l'ICM [58]. Finalement, cette accumulation de lipides
cytoplasmiques pourrait avoir un impact négatif sur la sensibilité des embryons à la
cryopréservation [43].
1.5.1.3 La vitesse de clivage
La majorité des études scientifiques s'accordent pour dire que les zygotes qUI
clivent le plus rapidement après la fécondation sont ceux qui ont le plus de chance
d'atteindre le stade de blastocyste par rapport à ceux qui clivent plus tardivement [59]. Le
moment où se produit le premier clivage est relié à la polyadénylation de plusieurs gènes
importants pour le développement; toutefois, les facteurs contrôlant ce premier clivage ne
sont pas bien identifiés. Il existe une relation entre la rapidité de développement des
embryons in vivo ou in vitro et le patron d'expression transcriptionnel. En effet, les
embryons ayant un développement lent et les embryons in vitro expriment plus de SOX,
MnSOD, BAX, IF-t et G6PD, soit tous des gènes dont l'expression est facilement
modulable par le stress [59]. Ils ont aussi démontré que les embryons au développement
rapide et les embryons produits in vivo contiennent plus de transcrits des gènes reliés au
métabolisme, à la croissance et à la différenciation: Glut-5, Cx43, IGF-2, IGF-IR [59]. Ces
. deux résultats confirment donc que les embryons au développement lent sont de mauvaise
qualité.
34
1.5.1.4 Le ratio mâle/femelle
Chez le bovin, on rapporte beaucoup plus de naissances de mâles à la suite d'IVF
[28]. Effectivement, de façon générale, les embryons produits in vitro se développent plus
rapidement que les femelles in vitro ce qui suggère que l'expression génétique reliée au
sexe affecte le développement des embryons tôt après l'activation du génome [28]. De plus,
le sérum contenu dans certains milieux de culture a pour effet d'augmenter le biais associé
au ratio mâle/femelle (54% versus 46%) [28]. L'étude menée par Gutierrez-Adan et al. en
2000 [60] suggère que ce soit les composantes des milieux de culture qui affectent la survie
des femelles en culture in vitro et conséquemment altèrent le ratio sexuel. Selon cette étude,
les gènes codant pour des enzymes métaboliques et des protéines nucléaires seraient de
bons candidats de .gènes reliés au sexe à investiguer [61]. Aussi, le gène Ped
(preimplantation embryo development), lequel possède un allèle dominant, fast et un allèle"
low, est connu pour jouer un rôle dans le contrôle du clivage hâtif embryonnaire et devrait
être considéré comme candidat potentiel dans le biais du ratio mâle/femelle [61].
1.5.2 Changements moléculaires
En plus d'être différents d'un point de vue morphologique, les embryons conçus in
vitro sont différents des in vivo du point de vue moléculaire. Il existe cependant peu
d'études ayant effectué des comparaisons exhaustives concernant les différents taux
d'expression génique sur des blastocystes produits in vitro vérsus in vivo. La majorité de
ces études portent sur un mince éventail de transcrits et elles utilisent pour la plupart le
PCR quantitatif.
Une de ces études a comparé des blastocystes provenant de différents milieux de
culture en présence ou en absence de sérum et avec différentes concentrations de B SA avec
des blastocystes produits in vivo [44]. Il en ressort que les embryons in vitro présentent une
hausse de certains transcrits par rapport aux in vivo. Parmi ces transcrits on mentionne:
INF-t, Cx-43, des gènes reliés à l'apoptose, Sox, Lif et
LR-~
[44]. De plus, ils ont
remarqué que lorsque du sérum est ajouté au milieu, les transcrits MnSOD, Cx-31 et Bax
35
s'ajoutent à la liste des gènes surexprimés [44]. D'autres transcrits comme HSP70.1,
Cu/ZnSOD, Glut-3, Glut-4, BfGf et IGFI-B sont eux aussi associés à l'ajout de sérum au
milieu ou encore à l'ajout de trop grande quantité de BSA [26]. De plus, Zhen et al en 2006
[62] ont montré que chez le singe Rhesus la voie de signalisation de WNT, constituée d'un
grand nombre de molécules sécrétées hautement conservées régulant les intéractions
cellules-cellules durant l'embryogénèse [63], est différemment régulée chez les embryons
in vitro et in vivo suggérant que les blastocystes cultivés in vitro ont une plus faible
capacité à établir des intéractions utéro-embryonnaires [62]. En plus de tout cela s'ajoute
une liste de gènes sous-régulés chez les embryons in vitro par rapport aux in vivo [64]. Les
gènes sous-régulés trouvés dans cette étude font partie de la machinerie de transcription et
de traduction. Il s'agit de HMG2, DOTIL, FOX03A, CCR4-NOT et PABPNI. Cela laisse
supposer que la diminution de la qualité embryonnaire est due à une déficience au sein de la
machinerie de transcription et de traduction [64]. Une grande quantité de gènes impliqués
dans la compaction et dans la cavitation sont eux aussi moins exprimés chez les
blastocystes in vitro que in vivo [65].
Utilisant une technologie plus récente, permettant d'identifier à grande échelle des
gènes différemment exprimés, une équipe de recherche [66] a comparé, entre autre, des
embryons in vivo versus in vitro au stade de blastocyste à l'aide de micropuces d'ADNc.
Ils ont montré une diminution de HMGBI (indicateur direct de la quantité d'ADN dans les
blastocystes), d' ATP5A 1 (illustrant un métabolîsme plus lent pour les blastocystes in vitro),
de cortistatin, de bikunin, d'INF-y et d'IGFB7 [66]. Ils ont toutefois noté une augmentation
des transcrits DNAJB6 et ALCAM chez les in vitro [66].
Il n'y a pas seulement le patron d'expression génique qui diverge, mais le patron
« d'imprinting» de certains gènes est lui aussi affecté par les différentes conditions de
culture [67]. Des méthylations aberrantes de l'ADN et d'histones ont été recensés sur les
régions des gènes Igf2 et H19 [68] de même qu'une erreur de méthylation sur le gène LIFI
[67]. Ces modifications ne sont pas sans importance puisqu'elles sont une des signatures du
syndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS) [68]. Une autre région est très sensible à une
perte d' «imprinting », il s'agit de la région du gène SNRPN au locus 15qll-13 [68]. Cette
36
perte d' «imprinting» n'est pas sans conséquence, elle serait associée au syndrome
d'Angelman, dont l'incidence est accrue suite à la reproduction assistée (RA) [68].
1.5.3
Conséquences potentielles à long terme sur les embryons
Depuis Louise Brown en 1978, plus d'un million d'enfants à travers le monde sont
nés des suites des technologies de la RA [24]. Il Y a des évidences qui suggèrent que la RA
est associée à des risques plus élevés d'anormalités à la naissance, de faibles poids à la
naissance (pas uniquement dû aux nombre de grossesses multiples), de désordres
génétiques et de cancers (rétinoblastomes) [24]. En effet, une étude faite par Kurinczuk en
Australie montre qu'il y a 4% d'anormalités à la naissance chez des enfants conçus
naturellement et que cette incidence augmente à 9% chez les enfants issus de RA [24]. Les
anormalités observées sur les nouveaux nés in vitro sont surtout d'ordre épigénétique i.e. :
des méthylations de l'ADN sur des résidus cytosines, des modifications des protéines
d'histones ainsi que des modifications de complexes protéiques régulateurs sur l'ADN [69].
Ces modifications du génome sont très importantes, surtout au début de l' embryogénèse,
pour la mise en place du profil lors de la MZT [69]. Il a été rapporté que plusieurs
embryons issus de SNCT (somatic cell nuclear transfer) et d'IVF avaient une
hyperméthylation générale de l'ADN, laquelle est associée avec une surcroissance des
fœtus [70]. Chez l'Homme, deux syndromes ont été recensés comme étant directement
associés à des défauts d' « imprinting », il s'agit du syndrome de Beckwith-Wiedemann et
d'Angelman [24]. Pas moins de 4% des enfants atteints du syndrome de Beckwith
Wiedemann proviennent de PlV [69]. En fait, les enfants issus de PlV ont neuf fois plus de
risque d-' être atteint du BWS que la population en générale [69]. Le BWS est caractérisé par
des nouveaux nés plus gros que la normale, ayant des organes plus gros ainsi qu'un plus
grand risque de développer certains cancers [24]. Il a été démontré que l' imprinting du gène
IGF2 est directement impliqué dans cette maladie. [24] Une hypométhylation du locus
KVDMRI maternelle est aussi associée au BWS [69]. Le BWS est similaire au syndrome
du gros veau recensé chez le bovin [24]. Quant au syndrome d'Angelman, on mentionne
que son incidence est très rare, mais qu'elle augmente significativement chez les enfants
issus d'injection intra cytoplasmique (ICSI) [24]. Des changements, aussi subtils soient-ils,
37
dans les ingrédients des milieux de culture peuvent altérer dramatiquemerit l'activité
« d' imprinting » des gènes [24].
Les technologies de la reproduction étant assez récentes, il se peut que les enfants
découlant de ces techniques aient une prévalence plus importante pour développer des
cancers plus tard dans leur vie [24]. Une étude faite par Mc Evoy et al., en 1998 sur des
nouveaux-nés bovins de poids anormaux, indique que les ' effets dûs à la PlV sur le
programme .développemental persiste plus d'une année après la naissance [69]. La
croissance des enfants issus de PlV est retardée par rapport à celle des enfants issus d'une
conception normale durant les trois premières année de vie [71] et les singletons de 5 ans
provenant d'lCSl ou de PlV, ont un plus grand besoin des services de santé que les enfants
conçus naturellement [69].
1.6
Concept de la qualité embryonnaire
Suite à tous ces constats d'anormalité chez les nouveaux nés issus de PlV, les
scientifiques tentent en vain de définir un concept de qualité embryonnaire visant à choisir
le meilleur embryon, celui capable d'induire une gestation, à mener à terme cette gestation
ainsi qu'à produire des nouveaux-nés en santé. L'implantation d'un système de contrôle de
la qualité n'est pas seulement souhaitable pour l'accréditation de la PlV humaine dans les
laboratoires, mais aussi pour son succès [72]. Jusqu'à ce jour, le choix des embryons à
transférer repose surtout sur la qualité morphologique des embryons. Cette qualité
morphologique a été établie par la Société de transfert embryonnaire. Elle classe les
embryons en quatre catégories :
Code 1 : Excellent ou bon. Une masse embryonnaire symétrique et sphérique
dont les blastomères individuels (cellules) sont de la taille, de la couleur et de
densité très uniformes. L'embryon correspond au stade de développement
prévu. Les irrégularités sont très mineures et au moins 85% du matériel
cellulaire doit constituer un bouton embryonnaire viable et intacte. Ce jugement
doit être fondé sur le pourcentage de cellules embryonnaires représenté par le
matériel refoulé dans l'espace périvitellin. La zone pellucide doit être aussi lisse
et ne présenter aucune surface plate ou concave qui puisse permettre à
l'embryon d'adhérer à la boite de Pétri ou à la paillette.
38
Code 2 : Moyen. La masse embryonnaire présente de légères irrégularités au
niveau de sa forme ainsi qu'au niveau de la taille, de la couleur et de la densité
des cellules individuelles. Au moins 50% du matériel cellulaire doit constituer
un bouton embryonnaire viable et intacte.
Code 3 : Pauvre. La masse embryonnaire présente d'importantes irrégularités
au niveau de la forme ainsi qu'au niveau de la taille, de la couleur et de la
densité des cellules individuelles. Au moins 25% du matériel cellulaire doit
constituer à un bouton embryonnaire viable et intacte.
Code 4: Mort ou dégénéré. Des embryons, des ovocytes ou des embryons
unicellulaires dégénérés: non viables [73].
Cette technique pour choisir les embryons est subjective et n'est pas idéale puisque
des taux d'avortements spontanés élevés sont recensés de même qu'une plus grande
incidence pour diverses malformations ou syndromes chez les nouveaux-nés. Il y a donc
une urgence quant au développement de technologies moléculaires pouvant
servi~
à
identifier le bon embryon à implanter, celui qui mènera la grossesse à terme et qui donnera
un nouveau-né en bonne santé.
1.7
Objectifs principaux du mémoire
Les obj ectifs du présent mémoire sont :
1) Déterminer le patron d'expression génique d'embryons produits in vivo.
2) Déterminer le patron d'expression génique d'embryons produits dans
différentes conditions de culture.
3) Effectuer une analyse comparative des traitements ·de PlV.
4) Évaluer l'impact du sérum sur le profil embryonnaire.
39
1.8
Références
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43
CHAPITRE II
MANUSCRIPT
ÉTUDE DE L'IMPACT DES CONDITIONS DE CULTURE IN VITRO SUR
L'EXPRESSION GÉNÉTIQUE EMBRYONNAIRE CHEZ LE BOVIN
CLAUDE ROBERT, ISABELLE CÔTÉ, CATHERINE GRA VEL, AURÉLIE LABBE, PATRICK
BLONDIN
2.1 RÉSUMÉ
Il est connu que les embryons bovins in vivo sont d'une plus grande qualité que les
em~ryons
produits in vitro. En effet, des différences aux niveaux morphologique et
moléculaire ont été recensées. Il a été rapporté que les milieux de culture utilisés pourraient
être en cause; toutefois, seul un mince éventail de transcrits ont été ciblés pour vérifier cette
hypothèse. Le développement embryonnaire étant régulé par une grande quantité de gènes
nous avons voulu utiliser une approche plus globale, à plus haut rendement, pour valider
cette hypothèse. Le but de l'étude est donc d'identifier les conditions de culture in vitro qui
affectent le moins le patron d'expression génique global des embryons chez le bovin. Pour
ce faire, nous avons établi le profil d'expression génique de plus de 1200 gènes en utilisant
des micropuces. Nous avons effectué une analyse comparant les niveaux d'ARNm
d'embryons produits in vitro selon 10 conditions différentes. Le profil d'embryons produits
in vivo a été utilisé comme standard de normalité. En général, tous les traitements
contenant du sérum en maturation et!ou en développement on obtenu un profil similaire à
celui des in vivo, tandis que ceux qui évoluaient en co-culture, en milieu semi-défini et
défini ont un profil qui dévie largement de celui des in vivo. Les processus biologiques
affectés par les conditions de culture sont variés et incluent notamment le métabolisme
énergétique, la signalisation cellulaire, la ségrégation chromosomale, le cycle cellulaire et
la réparation de l'ADN pour n'en nommer que quelques-uns. Concernant les gènes
significativement différemment exprimés, notons Cul1,DDX25, JMJD1B, XIST, GPX4,
SUDS3, SHFM1, TGIF et TP-1. D'autres gènes démontrent aussi un patron d'expression
différent que ceux in vivo. Les résultats obtenus suggèrent, entre autre, que le sérum n'ait
pas un impact si négatif qu'anticipé sur l'expression génétique embryonnaire et que
l'utilisation de milieux complètement définis est à l'inverse très perturbant pour l'embryon.
45
2.2 INTRODUCTION
La production embryonnaire in vitro (PlV) chez le bovin a été développée au début
des années '80. L'intérêt de la PlV a été motivé par l'objectif de pallier à l'infertilité
pathologique et non génétique de certaines vaches de haut potentiel génétique. Depuis,
comparativement au transfert embryonnaire qui implique d'avoir effectué la stimulation
ovarienne suivie de l'insémination artificielle et de la récolte des embryons dans l'utérus, la
PlV représente le système le plus efficace,en termes de production embryonnaire par vache
par année. En effet, il a été démontré que la PlV à partir d'ovocytes immatures suivie de
transferts
embryonnaires
permet
de
multiplier par 4
le
nombre
de
gestations
comparativement aux autres méthodes [1]. Ainsi, la PlV représente présentement
'l'approche la plus efficace pour disséminer la génétique de vaches ayant un potentiel
génétique supérieur.
Le potentiel de maximiser la dissémination du matériel génétique des femelles est
par contre assombri par l'observation de phénotypes indésirables soupçonnés de résulter
des conditions de PlV. L'observation de ces phénotypes anormaux associés à la PlV
implique que le stress causé par la PlV influence la qualité des embryons et a des impacts
néfastes à court et à long terme. Parmi ces impacts indésirables on compte le syndrome du
gros veau qui est caractérisé par le développement d'un foetus de taille anormalement
élevée ce qui augmente la fréquence de parturitions difficiles qui nécessitent une
césarienne. D'autres impacts de la PlV incluent une fréquence élevée de malformations
congénitales, un développement placentaire anormal ou une gestation plus longue [2]. À
court terme, l'impact sur la qualité des embryons se perçoit également par un biais dans le
ratio mâles ' (56%) : femelles (44%) [3] et en causant une capacité réduite à survivre à la
cryoconservation
comparativement
aux
embryons
produits
ln
VIVO
[4].
Morphologiquement, les embryons in vitro sont plus fon~és puisque les vésicules lipidiques
contenues dans le cytoplasme des blastomères sont plus nombreuses et plus grosses que
celles trouvées dans les embryons produits in vivo [4].
46
Au nIveau des procédés, la PlV comprend trois étapes i.e. la ' maturation des
ovocytes, la fécondation et la culture des embryons. Dans les conditions établies chez le
bovin, les deux premières étapes durent respectivement 22 h et 18 h alors que la culture
embryonnaire s'effectue sur une période de 7 à 9 jours. Malgré cette différence marquée
dans la durée des étapes, il est présentement proposé que la capacité de supporter le
développement embryonnaire ( appelée compétence) découle de la maturation de l'ovocyte
alors que la qualité de l'embryon résulte de la culture embryonnaire [5], [[6].
De plus, les études démontrent qu'une grande partie des embryons in vitro (>50%)
[7] n'atteignent jamais le stade de blastocyste et que cela pourraient être dû aux milieux de
culture utilisés. Présentement, au niveau moléculaire, les causes et la nature exactes des
déviations que le stress de la PlV occasionne ne sont pas encore connues. Les pistes
actuelles mises en évidence à l'aide d'études comparatives utilisant une poignée de gènes
candidats ont aussi montré que les embryons exposés à différents milieux de culture ont un
patron d'expression génique et une empreinte génomique parentale (<< imprinting »)
différents de ceux des embryons in vivo [8], [9], [10], [2]. Par contre, le recensement des
gènes affectés demeure très limité et il en est d'autant plus difficile d'en apprécier la valeur
physiologique. En effet, la majorité des différences actuellement rapportées le sont à des
niveaux marginaux et il n'est pas clair si, par exemple, une augmentation du double de la
quantité d'un ARNm particulier affecte réellement la qualité de l'embryon. L'identification
des voies métaboliques affectées que seul un profil global permet de cibler efficacement
devient ainsi une indication potentiellement plus informative.
L'étude comparative des différents systèmes actuellement utilisés devient une
opportunité d'étudier et de comprendre les impacts de la PlV. Il existe plusieurs variétés de
milieux de culture utilisées pour la production embryonnaire. À l'origine, la majorité des
recettes ont été développés pour la co-culture qui nécessite de faire croître des cellules
somatiques en même temps que les embryons. On pense que ces cellules ont la capacité de
détoxifier le milieu de culture générant alors un meilleur environnement pour les embryons.
Pour maintenir la croissance des cellules somatiques, il faut nécessairement supplémenter
le milieu de culture avec du sérum. Au niveau de la cinétique du développement, la
47
présence de sérum accélère le développement embryonnaire et modifie le ratio cellules de
la masse interne Vs cellules du trophectoderme [11]. Puisque le sérum est un mélange
complexe d'éléments non-définis dont la composition est variable d'un lot à l'autre,
l'utilisation de milieux sans sérum est nécessaire afin de comprendre l'impact des
constituants du milieu et leurs contributions dans le développement des phénotypes
aberrants résultant de la PlV. En ce sens, les plus récents milieux de culture tentent de
mimer la composition du liquide tubaire des oviductes (<< Synthetic OviductalFluid »).
La présente étude compare l'expression génétique globale d'embryons bovins au
stade de blastocyste produits in vitro selon diverses conditions de PlV. Les patrons
d'expression des embryons in vivo ont été utilisés comme standard de normalité. Les
conditions de PlV comparées ont été choisies parce qu'elles représentent celles qui sont les
plus utilisées commercialement ou retrouvées dans la littérature.
48
2.3 MATÉRIEL ET MÉTHODES
Dispositif expérimental
À des fins de comparaison, des blastocystes ont été produits in vitro selon dix types
de conditions différentes. La liste des diverses conditions utilisée lors de l'étape de la
maturation des ovocytes ou de l'étape de la culture embryonnaire est schématisée à la .
Figure 2.9.1. Dans tous les cas, les conditions de fécondation in vitro sont les mêmes.
Ainsi, les blastocystes in vitro ont été produits à partir de différents milieux de maturation
après quoi ils ont été fécondés et mis en culture dans leur milieu respectif. Des blastocystes
in vivo provenant de vaches superovulées ont été utilisés comme contrôles.
Tous les produits chimiques proviennent de chez Sigma-Aldrich Chemical
(Milwauke, Wl, EU) sauf lorsque mentionné.
Production des zygotes
Les présumés zygotes bovins ont été produits suivant une maturation (MlV) et une
.fécondation (FlV) in vitro. Brièvement, les complexes ovocyte-cumulus (COCs) ont été
obtenus par aspiration de follicules bovins de 3 à 6 mm provenant d'ovaires d'abattoir
maintenus entre 30-33°C dans une solution saline additionnée d'antibiotiques et
d'antimycotiques. Ensuite, les COCs collectés étaient lavés deux fois dans le BFF (fluide
folliculaire bovin) et trois fois dans le milieu Tyrode Hepes (TLH) contenant 3% de BSA
(sans acide gras (FAF)), du pyruvate (40 mM) et de la gentamicine (50 mg/mL). Après ces
lavages, les COCs ont été classés très sommairement et les COCs de classe 4 (Blondin et
Sirard, 1995) ou dénudés ont été laissés de côté. Des groupes de 10 COCs ont été placés à
l'intérieur de gouttes de 48 JlL constituées de milieu de maturation, le tout recouvert d'huile
minérale et cultivés pour 24 heures à 38,5 oC sous une atmosphère composée de 5% C02,
5% O2 avec un maximum d'humidité. Les milieux de maturation étaient:
49
1. TCM-199 additionné de 10% (v/v) de sérum de veau foetal (FCS), de 0,2 Ilg/mL de
FSH et de 1 ilL/mL d'estradiol.
2. SOF additionné de 10% (v/v) de sérum de veau foetal (FCS), de 0,2 Ilg/mL de FSH
et de lilL/mL d'estradiol.
3. SOF additionné de BSA, de 0,2 Ilg/mL de FSH et de 1 ilL/mL d'estradiol.
4. SOF additionné de 2 Ilg/mL de FSH et de 1 ilL/mL d'estradiol.
Concernant la fécondation, les COCs ont été lavés deux fois dans un milieu TLH
contenant du BSA (FAF) (30 mg/IO mL) et dans le milieu -de fécondation avant -d'être
transférés -en groupe de 5 à l'intérieur de gouttelettes de 48 ilL du milieu de fécondation
(milieu Tyrode contenant du BSA (FAF)) auxquelles 2 ilL d'une solution de 2 mMol
penicillamine (#cat P4875), l mMol hypotaurine (#cat PHI384), 250 IlMol epinephrine
(#cat E4250) (les composantes du PHE proviennent de Sigma) étaient additionnés à la suite
de l'ajout des spermatozoïdes bovins.
Des spermatozoïdes motiles ont été obtenus par la centrifugation de la semence
congelée-décongelée (semence provenant de 5 taureaux du Centre d'Insémination
Artificielle-du Québec (CIAQ, St-Hyacinthe, Qc) sur un gradient de Percoll de densité
discontinue (Percoll 45% sur du Percoll 90%) pendant 30 minutes à 700 g à température
pièce. Les spermatozoïdes viables, ceux se retrouvant au fond du tube, ont été lavés dans un
milieu TL (TL sperm medium) et centrifugés à 250 g pendant 5 minutes à température
pièce. À la fin de ce lavage, le surnageant a été éliminé. Le culot de la centrifugation a été
dilué avec du milieu de fécondation afin d'obtenir une concentration de 25 X 106 s/mL
après quoi 2 ilL de la dilution a été ajoutée à l'intérieur de chaque gouttelette pour une
concentration finale de l X 106 s/mL. Les COCs et les spermatozoïdes ont été incubés
ensemble pour 18 heures à 38,5°C.
Culture des embryons
Après approximativement 18 heures suivant la fécondation, les présumés zygotes
produits suite à la MIV et à la FIV ont été placés dans un épendorff de 500 ilL contenant du
50
TLH additionné de BSA et de gentamicine pour y être dénudés par pipetage successif.
Après, les zygotes ont été lavés dans une solution de PBS sans calcium ni magnésium
contenant 3% de BSA et de la gentamicine. Suite à ce lavage, les zygotes ont été divisés à
l'intérieur de différents groupes dépendamment du traitement. Les milieux de culture
utilisés sont : .
1. SOF avec 8% de BSA FAF
2. SOF additionné de 10% (v/v) de sérum de
v~au
foetal
3. SOF sans BSA
4. TCM-199 additionné de 10% (v/v) de sérum de veau foetal
5. SOF avec 8% de BSA sans acide gras (5 premiers jours); SOF additionné avec 10%
(v/v) de sérum de veau foetal (2 demi ers jours)
6. Co-culture avec cellule BRL (Buffalo rat liver cells)
2
2
La culture in vitro a été effectuée dans une atmosphère de 5% C0 , 7% 0 avec un
maximum d'humidité pour 7 jours à 38,5°C (sauf pour les traitements #4 et #6 qui étaient
placés dans une atmosphère de 5% C0 2 avec un maximum d'humidité), après quoi les
blastocystes ont été collectés et congelés à -80°C. Il est important de mentionner qu'après
les trois premiers jours de culture, un changement de gouttes était effectué.
Production de blastocystes in vivo
Des blastocystes bovins in vivo provenant de vaches superovulées ont été utilisés
comme contrôle. Le protocole utilisé pour la production d'embryons in vivo est décrit par
Durocher et collaborateurs [12].
Description des micropuces de cDNA
Les mlcropuces de cDNA utilisées dans cette étude contiennent des transcrits
provenant de 4 différentes librairies soustraites (ovocytes-cellules somatiques; ovocytes-
51
blastocystes;
blastocystes-cellules
somatiques;
blastocystes-ovocytes)
construites
préalablement en utilisant la technique d'hybridation soustractive (SSH) [13] , [14].
Brièvement, l' ARN total provenant d'un groupe de tissus somatiques était soustraite à
l'ARN total provenant d'ovocytes pour générer, dans ce cas ci, une librairie enrichie en
transcrits spécifiques aux ovocytes. Les trois autres librairies ont été produites de façon
similaire en utilisant les tissus appropriés.
Il Y a au total 1153 EST représentés sur la micropuce. Chaque transcrit était déposé
4 fois pour un total de 4928 dépôts.
Il est important de noter que les librairies ne sont pas uniquement composées de
séquences uniques, en effet, il est possible que plus d'une même copie de séquence soient
présente sur la micropuce. Des contrôles négatifs et positifs ont été aléatoirement distribués
sur la micropuce afin de vérifier la qualité et la spécificité d'hybridation de cette dernière.
Deux différents Spot Report Alien cDNA Array Validation System (Stratagen, La Jolla,
CA) (n=32) et des dépôt avec la solution sans ADN (n=64) étaient utilisés comme contrôles
négatifs, de même que des dépôts d'ubiquitine (n=16), de tubuline (n=16), d'actine (n=16),
d'H 2 0/DMSO (n=100), de GFP (n=56), de plante (n=16) utilisés comme contrôles positifs.
Fabrication de l' ARN de référence
Toutes les micropuces ont été cohybridées avec un ARN de référence afin de
prendre en compte les variations de signaux causées par l'hybridation et la lecture de la
puce. La référence était composée d'ARN de différents tissus bovins provenant de COCs,
de GV, d'ovocytes, de blastocystes, de rate, du foie, de muscle et de reins. Le choix des
cellules à inclure dans la référence a été influencé par la source des différents clones
imprimés sur la micropuce. L'objectif de la référence était d'aller rechercher le maximum
de points présents sur la micropuce.
L ' ARN provenant de la rate, du foie, des muscles et du rein a été extrait en utilisant
le Trizol (Invitrogen, Ontario, CA) en suivant les instructions
du manufacturier. Quant à
52
l'ARN total provenant des COCs, des ovocytes au stade de GV et des blastocystes, il a été
préparé par le Absolutely RNA Microprep kit (Stratagene, La Jolla, CA) en suivant les
instructions du manufacturier. Après l'isolation de l'ARN sur le filtre de la minicolonne,
l'ARN était élué dans de l'eau sans Rnase (Ambion, Ontario, CA).
L'ARN extrait provenant des différentes sources a été groupé pour ensuite subir
deux séries d'amplifications globales par transcription in vitro utilisant l' ARN polymérase
T7 à l'aide du RiboAmp kit (Arcturus, Sunnyvale, EU). Pendant la 2e réaction de
transcription in vitro, l'IVT Master Mix a été remplacé par l'Aminoallyls Mix du kit
Paradise (Arcturus, Sunnyvale, EU) afin d'incorporer des nucléotides couplés à un
groupements amino-allyl qui ont servi pour marquer la sonde . .
Finalement, l'ARN anti-sens (ARNa) amplifié a été marqué en couplant par réaction
chimique le groupement amino-allyl avec le fluorochrome Alexa Fluor 555 (Molecular
Probe, Burlington, ON, CA) selon les instructions du manufacturier. L'ARNa marqué a été
aliquoté dans des ependorffs et conservé à -80°C jusqu'à l'usage.
Extraction, amplification et marquage des sondes d'ARNa
L'ARN total a été extrait de groupes de 10 embryons (blastocystes) en suivant les
instructions du manufacturier fournies avec le Picopure Extraction kit (Arcturus,
Sunnyvale, EU ) pour ensuite être amplifié en utilisant la même méthode d'amplification
globale b,,:sée sur la transcription in vitro effectuée par l' ARN polymérase T7. Une suite de
deux réactions d'amplification a été effectuée en suivant les instructions du manufacturier
pour le RiboAmp kit (Arcturus,
Sunnyvale, EU).
Pour la deuxième réaction
d'amplification, l'IVT Master Mix a été remplacé par l'Aminoallyls Mix du kit Paradise
(Arcturus, Sunnyvale, EU). Pour chaque hybridation, 5Jlg d'ARNa amplifié a été marqué
en incorporant le fluorochrome Alexa 647 en utilisant le protocole de Molecular Probe
(Burlington, ON, CA).
· 53
La sonde résulta!lte a été purifiée avec le RNA Clean Up Rneasy Minikit (Qiagen,
Mississauga, ON, CA) et finalement une précipitation à l'isopropanol a été effectuée sur
l'échantillon marqué. Les sondes marquées et purifiées étaient resuspendues dans un
volume de 5 JlL d'eau sans Rnase (Ambion, Ontario, CA).
Préparation des micropuces
Chaque micropuce a été incubée en présence des sondes marquées (référence et
échantillon de blastocystes) dans une station d'hybridation Slidebooster ' (Advalytix,
Allemagne). Un volume de 80 flL de solution d'hybridation (hybridization solution #1,
Ambion, Ontario, CA) contenant les sondes marquées avec les fluorochromes Alexa Fluor
555 et 647 a été inséré sous une lamelle et incubé à 50°C pendant 21 heures.
Le jour suivant, la lamelle a été retirée en utilisant une solution de lavage de faible
stringence (2X SSC + 0,5X SDS). Ensuite, les micropuces ont été lavées deux fois 15
minutes dans une solution de faible stringence (2X SSC + 0,5X SDS) et deux fois 15
minutes dans une solution de forte stringence (0,5X SSC + 0,5X SDS). Afin d'enlever les
résidus de SDS, elles ont subies un dernier lavage rapide dans du 1,25X SSC et elles ont été
centrifugées pendant 5 minutes à 1200 g à température pièce. Chaque micropuce hybridée a
été lue en utilisant un Virtek ChipReader scanner et le Versarray ChipReader system (Biorad, Philadelphia, EU). Une fois la lecture terminée, les images ont été traitées par le
logiciel ArrayPro Analyser version 4.5 (Media Cybe~etics, Silver Spring, Maryland, EU).
Normalisation des données
Les données ont été normalisées ·en deux étapes en utilisant le logiciel R. Dans un
premier temps, il s' agissàit de la normalisation des effets aléatoires prenant en
considération l'effet spatial pour les colonnes et les rangées des grilles incluant également
un effet "pin" du robot d'impression. De plus, le design expérimental, incluant l'utilisation
d'une référence unique a servi à normaliser les effets associés à l'hybridation. Donc, dans
54
un deuxième temps, la nonnalisation de la référence s'est fait par rapport à la médiane de
cette dernière.
Analyse
Les données nonnalisées ont été analysées et visualisées en utilisant le logiciel
TMeV (http://www.tm4.org/mev.html). Les gènes significativement différemment exprimés
ont été identifiés suite à un T -test. Les paramètres utilisés pour le T-test étaient:
Design: between subject
Variance égale
Confiance (1-a)=95%
P -value basé sur les pennutations
1000 pennutations par gènes
Faux positifs::; 0,05
Un profil d'expression des différents gènes significatifs a été effectué en utilisant le
K-means clustering (KMC). Aussi, les gènes significativement
diff~remment
exprimés ont
été catégorisés par rapport au processus biologiques qu'ils affectaient en utilisant le
GeneOntology (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.govD.
55
2.4 RÉSULTATS
Production embryonnaire
Aucune sélection des complexes ovocyte-cumulus n'a été faite autre que d'enlever
les COCs avec le cumulus en expansion complète (classe 4) et les COCs partiellement ou
totalement dénudés. Cette sélection large permet de maximiser la production d'embryons
mais ne permet pas de recueillir des données précises au sujet des taux de blastocystes
produits. À titre comparatif les taux ~e production de blastocystes ne peuvent être
qu'interprétés que qualitativement. Dans le Tableau 2.10.1, la qualité des blastocystes est
classée selon l'aspect extérieur de ceux-ci (+ représente un embryon ayant une apparence
acceptable, relativement aux critères établis, soient la couleur, la grosseur, la pleine
expansion et l'aisance à produire les blastocystes dans le traitement en question; tandis
qu'un «-» représente un embryon ayant une apparence médiocre qui n'est pas conforme
aux critères établis). Donc, un bel embryon devait être pas trop foncé, pas trop petit et se
rendre au stade de blastocyste avec assez d'aisance.
Micropuces d'ADNc
Un total de 33 microopuces a été hybridé. Le dispositif expérimental choisi fait
intervenir une référence, laquelle offrè plus de flexibilité, nous permettant de comparer un
grand nombre de traitements entre eux; un . dispositif de comparaisons 2 par 2 aurait
demandé une trop grande quantité d'embryons in vivo. Cette référence a été construite de
façon à produire des signaux sur un maximum de dépôts présents sur la micropuce (Figure
2.9.2), nous permettant ainsi de prendre en considération les imprécisions techniques
associées à l'hybridation et à la lecture des biopuces. Aussi, il est important de dire que la
puce présente une spécificité d'hybridation. La puce contient environ 1200 candidats
provenant de librairies créées à partir de la technique SSH. Certaines de ces librairies visent
56
à identifier des candidats qui sont spécifiquement exprimés dans le blastocyste alors que
d'autres sont spécifiquement présents dans l'ovocyte. Lors de la fabrication des biopuces,
le positionnement des candidats plus spécifiques au blastocystes occupe le haut de la métagrille tandis que les candidats plus spécifiques à l'ovocyte occupent le bas de la méta-grille.
Puisque la sonde utilisée est constituée d' ARN de blastocystes, la section contenant des
séquences tirées de blastocystes devait générer une quantité plus importante de signaux que
la section contenant les séquences tirées d'ovocytes. Les résultats confirment cette
spécificité d'hybridation (Figure 2.9.3). Concernant le bruit de fond, il est juste de dire qu'il
était relativement bas. En effet, l'intensité de signal relatif ~u bruit de fond varie entre 400500 pour Cye3 et 600-800 pour Cye5 ce qui est acceptable. Finalement, il est intéressant de
noter que pour chaque traitement, l'intensité du signal était relativement similaire entre les
réplicats.
Normalisation
Avant de procéder à l'analyse des résultats, pour s'assurer de la qualité de
l 'hybridation sur chacune des lames, nous avons utilisé l' ARN de référence pour normaliser
chacune des lames entre elles par rapport à une valeur d'intensité médiane pour chacun des
spots. En plus, nous avons normalisé les données pour contrer l'effet colonne et l'effet
rangé (l'effet spatial). On dit qu'il y a 'un effet colonne et un effet rangé lorsqu'un gradient
d'intensité du signal est visible sur les colonnes et/ou les rangées. Les données aberrantes
provenant de défauts de dépôt lors de la fabrication de la biopuce ou causées par la
présence de poussière ont été retirées du fichier de données pour chaque hybridation.
Classification de type Sample Tree (ST)
On a voulu s'assurer de la répétabilité des résultats en évaluant la similitude des
réplicats par traitement et entre les différents traitements. Pour ce faire, nous avons utilisé
une classification de type ST (sample tree), laquelle nous informe sur le pourcentage de
similitude des réplicats entre eux, pour chacun des traitements versus le standard in vivo.
Dans notre cas, nous avions 6 réplicats par traitement: 3 biologiques et 3 techniques. La
57
Figure 1 présente un exemple de la classification ST pour le traitement in.vivo comparé au
SOF/SOF. Comme on peut le voir dans la Figure 2.9.4, les deux traitements forment des
groupes bien distincts.
Résultats de l'expression des micropuces
Comme le montre le Tableau 2.10.~ ci-dessous, les traitements contenant du sérum
en maturation et/ou en développement sont ceux qui ont le moins de transcrits
significativement différemment exprimés par rapport aux blastocystes in vivo. Voici, pour
chacun des traitements le nombre de transcrits différemment exprimés: sof/sof (110),
sof/sofsérum (4), sofsérum/sofsérum (1), sofsérum/sof (11), tcm/tcm (9), tcm/sof (39),
tcm/co-culture (97), sof/co-culture (59), sof/sof(5)+sérum(2) (195) et sofseul/sofseul
(271). La condition de culture en milieu complètement défini, sofseuVsofseul, est celle qui
a le plus grand nombre de transcrits significativement différemment exprimés par rapport
aux in vivo. Le traitement dans lequel on avait ajouté du sérum en fin de culture, sof/sof(5)
+ sérum(2), montre aussi une grande quantité de transcrits significativement différemment
exprimés. Ce traitement a été testé pour évaluer si la présence de sérum en fin de
développement, lorsque les cellules acquièrent un phénotype de plus en plus de type
somatique, pouvait aider les embryons à atteindre le stade de blastocyste. Il est clair que
l'ajout de sérum lors des deux derniers jours de culture a causé un profond stress aux
embryons.
Par contre, dans cette étude, il est clair, en regardant les résultats obtenus, que
l'ajout de sérum en maturation et/ou tout au long du développement montre un effet positif.
Le sérum semble apporter quelque chose de plus que le BSA puisque les traitements ayant
seulement eu du BSA en maturation et en développement divergent encore plus du patron
d'expression génique obtenu à partir d'embryons produits in vivo. Pour ce qui est des deux
conditions de co-culture, elles semblent relativement similaires entre elles si on se base sur
le nombre d,e transcrits significativement différemment exprimés et représente une situation
intermédiaire entre les pires et les meilleurs traitements.
58
Regroupement K-Means
Un regroupement K-Means a été effectué pour chacun des traitements (Figure
2.9.6). Cela a permis de classer les gènes à l'intérieur de groupes similaires en se basant
uniquement sur le patron d'expression. Le nombre de cluster pour chacun des traitements a
été défini par un autre test, le FOM (Figure Of Merit) que l'on peut visualiser à la Figure
2.9.5. Pour chacun des 10 différents traitements, le résultat du FOM a été sensiblement
identique, c'est pourquoi les gènes sont tous groupés en 5 différents « clusters ». Comme
on peut le constater en regardant la Figure 2.9.6, les
~
clusters se ressemblent, toutefois, il
est intéressant de voir que la majorité des transcrits significativement différemment
exprimés est surexprimée chez les embryons produits in vitro et que chacun des cluster
diffère des autres simplement de par le niveau de surexpression. En plus de permettre de
voir comment les divers gènes varient dépendamment de la condition de culture dans
laquelle ils se sont développés (in vivo vs in vitro), le KMC nous permet de visualiser les
fluctuations d'iritensité entre les réplicats d'un même traitement. En effet, ces fluctuations
sont représentées par les zigzags dans le graphique. À titre d'exemple, on peut remarquer à
la Figure 2.9.6 que pour le traitement sof/sof, les réplicats des traitements in vivo sont
toujours plus stables, moins fluctuants que ceux des in vitro.
Processus biologiques
En utilisant le logiciel GeneOntology disponible gratuitement sur le site du NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), nous avons établi la liste des processus biologiques affectés
par les différents traitements (Tableau 2.10.3). Les données n'ont pas été représentées sous
la forme de pointe de tarte parce que le nombre de candidats différentiellement exprimés
pour certains traitements est faible ce qui déséquilibre la représentativité et l'interprétation
des pourcentages utilisés pour la proportion de la tarte. Comme on peut le constater en
regardant le tableau 3, plusieurs processus biologiques sont affectés par un même
traitement. Pour la plupart des traitements, les mécanismes touchant la transcription, la
traduction, les modifications et biosynthèses de protéines, le développement et le cycle
cellulaire sont affectés.
59
2.5 DISCUSSION
Les étapes impliquées dans la production d'embryons bovins sont sensiblement
toujours les mêmes entre les laboratoires. Par contre, il existe une multitude de milieux de
culture différents qui peuvent être supplémentés d'une large gamme d'additifs [15], [16],
[17]. Historiquement, le développement des milieux de culture embryonnaire s'est fait par
essaie/erreur en utilisant le rendement en blastocystes comme balise. De façon
complémentaire, la qualité des embryons produits par ces méthodes a été déterminée de
façon empirique à l'aide de caractères subjectifs tels la couleur et l'uniformité cellulaire
[18]. Certains de ces critères sont assurément utiles pour déterminer le potentiel de
l'embryon à induire une gestation mais ils demeurent imprécis alors que plusieurs rapports
indiquent clairement que l'évaluation morphologique n'est pas gage de succès [19]. La
description au niveau moléculaire des embryons produits par différentes conditions a le
potentiel de permettre de mieux comprendre la plasticité embryonnaire à faire face à ces
stress environnementaux. De plus, la description moléculaire des embryons produits dans
diverses conditions permettra également de définir le concept de normalité embryonnaire.
Pour le moment la définition d'un bon embryon est un concept flou.
Tel que mentionné, il existe plusieurs systèmes différents de PlV qui ont toutes
plusieurs variantes. Il est possible de classer les différentes méthodes en fonction de la
présence de sérum, de cellules somatiques ou de BSA. Le développement des procédures
de PlV a subi une évolution constante depuis ses débuts dans les années 1980. À l'origine,
l'ajout de cellules somatiques était utilisé pour conditionner le milieu dans lequel les COCs
ou les zygotes étaient mis en culture [20], [5]. L'ajout de sérum était alors nécessaire pour
supporter la croissance des cellules somatiques. La présence de cellules somatiques
représentant une source de contamination potentielle (virus et autres), des méthodes ont été
développées en absence de ces cellules tout en conservant le sérum dans les milieux.
L'observation de différents phénotypes aberrants tel le syndrome du gros veau, le biais
dans le ratio males: femelles, une plus forte prévalence de malformations congénitales ont
menés les scientifiques à étudier la source de ces problèmes en effectuant des études
comparatives entre les embryons produits in vivo et ceux produits in vitro. Au niveau
60
cellulaire, la vitesse accrue de la cinétique de division cellulaire, [21] ou l'abondance de
lipides dans les embryons produits in vitro [22] a résulté à suspecter le sérum d'être
responsable
des
déviations observées.
De plus,
basé
sur les
mêmes
critères
morphologiques, l'absence de sérum permettait de produire des embryons moins foncés
ayant une cinétique développementale plus normale [3], [21]. Le retrait du sérum des
milieux de PlV pennettait également d'enlever un élément complexe de
composi~ion
inconnue. En simplifiant le milieu, il est alors envisageable de mieux comprendre l'effet de
chaque molécule lorsqu'on les ajoute une à une. Comme le démontre les résultats obtenus,
le développement embryonnaire in vitro peut se faire à partir d 'une
si~ple
solution saline
avec carbohydrates ou à partir d'une solution très complexe avec l'addition de sérum ou
d'une couche de cellules somatiques. Toutefois, comme on peut le voir dans.le Tableau 1,
tous les traitements ne produisent pas des embryons de la même qualité.
L' obj ectif principal de la présente étude est d'analyser l'impact des différents
traitements de production in vitro sur le patron d'expression génique global embryonnaire
chez le bovin. Or, c'est lors de la maturation de
r ovocyte
que celui-ci acquiert la
compétence au développement qui lui permet de soutenir le développement embryonnaire
précoce jusqu'à l'activation du génome embryonnaire qui s'effectue au stade de 8 cellules
chez le bovin [23]. La qualité de l'embryon est quant à elle fortement influencée par les
conditions de culture embryonnaire donc post fécondation [24]. Il existe dans la littérature
plusieurs articles qui comparent l'abondance de certains transcrits entre des embryons
produit~
in vivo ou ayant subi divers traitements in vitro. La portée de ces études est par
contre limitée puisque seul une poignée de candidats sont pris en considération. D'un point
de vue fonctionnel, il n'est pas clair quel est l'impact réel de retrouver un peu plus d'un
certain type d'ARNm dans une des conditions étudiées d'autant plus que les différences
rapportées ne sont généralement pas majeures [25], [4], [26], [27], [28]. Par contre, nous
croyons que l'utilisation d'une approche globale possède un avantage certain par rapport à
l'approche par gènes candidats en ce sens qu'elle permet d'identifier des voies
métaboliques sans les cibler à priori. Ceci assure une objectivité relative dans la
comparaison des traitements et permet d'identifier les voies qui sont plus fortement
affecter. Aux fins d'interprétation, si plusieurs candidats impliqués dans une même voie
61
métabolique sont affectés, il est alors d'autant plus probable que son impact soit réellement
physiologique.
En utilisant une approche globale visant à déterminer le traitement qui affecte le
moins le patron d'expression génique embryonnaire, nous avons réussi à déterminer, en
plus de la condition de culture qui semblait affecter le moins le développement
embryonnaire, les gènes touchés par les différentes conditions de culture ainsi que les
processus biologiques qui leur sont attribués. À la base du projet de recherche, les
hypo~hèses
de départ concernant l'utilisation du sérum dans les milieux de culture étaient
les suivantes:
1) la présence de sérum induit une déviation de l'expression génique
2) le milieu complètement défini pourrait limiter l'impact négatif du sérum
3) la présence de sérum pourrait être nécessaire à la fin de la période de culture
Les profils globaux tels que décrits par le nombre de gènes affectés ont généré des résultats
inattendus. En effet, si on s'entend pour dire que la meilleure qualité d'embryon est celle de
ceux produits in vivo, on est à même de constater que le traitement qui s'en éloigne le plus
est le sofseul/sofseul, avec 271 transcrits significativement différemment .exprimés. Cela
n'est pas surprenant puisqu'il s'agit d'un milieu très pauvre constitué d'une simple solution
saline supplémentée de carbohydrates. Les embryons qui réussissent à survivre dans de tels
conditions luttent en essayant de tirer un maximum de profit du milieu nutritif (aussi pauvre
soit-il) ce qui signifie que la machine transcriptionnelle fonctionne à plein et expliquerait le
fait que la totalité des transcrits significativement différemment exprimés soit surexprimée.
Plusieurs gènes affectés par cette condition de culture suscite un grand intérêt; mentionnons
simplement: SUDS3, Cu11, PTTG1, DDX25, SHFM1, NPM2. Il s'agit de gènes impliqués
dans divers processus biologiques importants dont: la modification de la chromatine, la
transcription, le cycle cellulaire, l'apoptose, l'ubiquitinylation, le métabolisme de l'ADN, la
réparation de l'ADN, l'organisation chromosomale, la ségrégation chromosomale, la
mitose, la transcription, la protéolyse et la traduction. Si autant de processus biologiques
62
sont affectés par ces gènes, il est juste d'affirmer que les embryons qui se sont développés
dans ce milieu sont de mauvaises qualités.
Le traitement qUI se rapproche le plus de la condition ln VIVO est le
sofsérum/sofsérum avec 1 seul transcrit différemment exprimé. Ce résultat est très
surprenant puisque ce traitement contient du sérum, une substance souvent pointée du doigt
par les recherches précédentes comme étant la cause principale de l'émergence du
syndrome du gros veau. Comment expliquer ce résultat inattendu? La première hypothèse
est que le sérum comble un manque. En effet, les embryons ont besoin d'une multitude de
constituants pour croître. Le sérum, de par sa complexité, est à même de fournir aux
embryons une grande variété de protéines, d,e molécules de hauts et de faibles poids
moléculaire, d'hormones et de facteurs d'attachements qui les aident à se développer. La
deuxième hypothèse est celle selon laquelle le sérum facilite le développement
embryonnaire, ce qui a pour cause de permettre aux moins bons embryons de se développer
en plus des bons embryons, augmentant ainsi l'écart-type et réduisant le nombre de
transcrits
statistiquement
différemment
exprimés.
Le
transcrit
détecté
comme
significativement différemment exprimé code que pour une séquence nucléotidique non
caractérisée. Toutefois, en effectuant une recherche d'homologie de séquence à travers
toutes les espèces de mammifères, on a trouvé que la séquence se rapprochait beaucoup de
celle codant pour Morn repeat containing 3, un gène conservé depuis le genre bactérien
mais très peu étudié.
Concernant l'utilisation du Tcm au lieu du Sof, il semblerait que cela n'induit pas
une différence si marquée en terme de transcrits significativement différemment exprimés.
Bien que le Tcm (composé d'une vingtaine de sels) soit beaucoup plus complexe que le Sof
(composé de trois sels), la différence reste minime . Le Tcm, lequel est toujours employé
avec du sérum, semble avoir le même effet que les traitements avec du sofsérum.
Les traitements tcm/co-culture et sof/co-culture ont donnés des résultats
intermédiaires avec, respectivement, 97 et 59 transcrits significativement différemment
exprimés. Ceci n'est pas un résultat surprenant puisque la co-culture est reconnue pour
63
avoir des impacts positifs mais aussi néga'tifs sur la croissance embryonnaire. En effet, la
couche de cellules sur laquelle les embryons croissent a un pouvoir de détoxification et de
contamination du milieu de culture. De plus, le système de co-culture de fait intervenir
l'ajout de sérum. Le sérum est bien connu pour varier d'un lot à l'autre. Dans tous les
autres systèmes que nous avons utilisés, nous avons toujours travaillé avec le même lot de
sérum sauf pour ces deux traitements, ce qui fait que nous ne pouvons que les comparer
entre eux et pas vraiment avec les autres traitements. Concernant les gènes affectés par ces
deux traitements, il s'agit de gènes surexprimés et codant pour des processus biologiques
extrêmement importants. Mentionnons: ACAT2, XIST, SHFMl, PTGS2, TKDP1, BTG4,
BUB3. Ce sont des gènes impliqués dans divers processus dont: la modification de la
chromatine, la transcription, l'inactivation du chromosome X, la protéolyse, la ~otilité
cellulaire, la voie des cyclooxygénases, la biosynthèse des acides gras, la différenciation
cellulaire, la biosynthèse des prostaglandines, la régulation de la réponse inflammatoire, le
cycle cellulaire, la prolifération cellulaire, la différenciation neuronale et la mitose. Autant
de gènes touchés n'ont d'autre choix que d'affecter les embryons. Bien que ces systèmes de
culture soient encore utilisés, il faut jeter un regard critique vis-à-vis leur utilisation.
Nous avons aussi testé une condition de culture pour laquelle on a ajouté du sérum
en toute fin de la période de culture. Ce traitement a été élaboré en se basant sur
l'observation que les blastocystes produits dans un milieu sans sérum sont plus petits et
éclosent plus difficilement. Donc, avec l'ajout d'un petit extra d'éléments nutritifs à la fin
du développement, on croyait que les embryons combleraient leurs besoins. Le résultat
obtenu ne va pas du tout en ce sens. En effet, les embryons provenant de ce traitement ont
195 transcrits dont l'expression diffère de celle des in vivo. Comment expliquer ce résultat?
Il s'explique très facilement. L'embryon qui évoluait dans un milieu pauvre à soudain été
soumis à un milieu riche, plein de nutriments. Comme il était en manque, il a absorbé tout
ce qui était à sa disposition pour tenter de survivre, ce qui a déréglé son bon
fonctionnement et qui a modifié son expression génique. Cela signifie que l'embryon en
développement doit avoir tout ce qu'il a besoin pour croître au fur et à mesure de son
développement et ce au bon moment. Si on lui donne trop tard ou trop tôt il ne saura pas
quoi en faire.
64
Concernant toutes les VOles métaboliques mentionnées précédemment, il est
important de garder en tête qu' elles ont étés retenues grâce au profil d'expression génique
généré par des embryons produits in vivo et in vitro dans différentes conditions de culture.
Sachant que le profil protéique ne correspond pas nécessairement au profil génétique, il est
impératif de mettre un bémol sur toutes les conclusions apportées jusqu'ici, des études plus
approfondies en protéomique sont à faire. Comment dire alors que la qualité embryonnaire
est affectée? Je crois que, de part la quantité importante de transcrits différentiellement
exprimé en comparaison à ceux des embryons in vivo, il est juste croire que la qualité
embryonnaire est affectée et sonner·1'alarme. Tant mieux si le profil protéique n ' est pas si
altéré que le profil génétique, mais on est en droit de se poser des questions.
65
2.6 CONCLUSION
En conclusion, la caractérisation du patron global de l'abondance des ARNm de
blastocystes produits in' vitro et in vivo a permis de mettre en évidence de remarquables
différences entre ces deux catégories. Le niveau d'expression est plus élevé pour la majorité
des gènes provenant d'embryons produits in vitro comparativement à ceux produit in vivo.
Les processus biologiques des différents gènes recensés ont été identifiés. Toutefois, une
étude plus approfondie des différents gènes pourrait faire l'objet d'un projet de recherche
future. Concernant les meilleures conditions de culture à utiliser en maturation et en
développement, nous croyons au développement de meilleurs processus de PlV par. le
monitoring des impacts à l'aide des patrons globaux de l'abondance de ARNm. Pour
minimiser les chocs entre les transitions entre les différentes étapes de la PlV, l'utilisation
. de chambrettes couplées à des canaux microfluidiques permettra peut-être d'établir les
gradients nécessaires permettant ainsi de fournir les éléments nutritifs au moment précis où
les embryons en ont besoin tout en minimisant le stress.
Enfin, le stade blastocyste correspond à une étape importante dans l'établissement
des marques épigénétiques influençant la dif(érentiation des lignées cellulaires. Il a été
démontré, par l'étude de gènes ayant normalement une empreinte parentale (<< imprinted
genes »), qu'au niveau de la méthylation de l'ADN, la PlV générait des patrons aberrants
[10], [29]. Un des prochains défis sera de faire le lien entre ces patrons d'expression
génétique anormaux et ces marques épigénétiques qui peuvent avoir des impacts à très long
terme potentiellement même transgénérationnels.
66
2.7 REMERCIEMENTS
J'aimerais remercier tout particulièrement mon directeur de recherche, Dr. Claude .
Robert, sans qui cette article n'aurait jamais vu le jour. De plus, il est impératif de
remercier mon co-directeur, Dr. Patrick Blondin, qui a fournit les embryons produits in
vivo et qui m'a permis de produire des embryons en co-culture. Aussi, mentionnons
Aurélie Labbe, qui a effectué toutes les étapes de normalisation de données et Catherine
Gravel, qui a produit les micropuces.
67
2.8 RÉFÉRENCES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Il.
12.
13.
14.
15.
16.
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69
2.9 Figures:
Groupe 1
Groupe 2
Groupe 3
Groupe 4
Groupe 5
Groupe 6
Groupe 7
Groupe 8
Groupe 9
Groupe 10
Sot
Sot
Sot
Sot-sérum
Sot-sérum
Sot-sérum
1
Sot
Sot-sérum 1
1
Sot
1
1
1
1
1
Sot
1
Sot eJ BSA
TCM-199
TCM-199
TCM-199
Grou pe 11
Sot eJ BSA
Sot
rCM-199
co-culture
Co-culture
1
Sot (5jours)
1
Sot-sérum (2 jours)
ln vivo
CI)
Ovocyte
Zygote
2 cell.
4 cell. 8 cell. 16 cell. Morula Blastocyste
2.9.1 : Description du dispositif expérimental. Chaque groupe représente un traitement.
La première section détermine le milieu de maturation et la seconde section détermine le milieu de développement. L'étape de la
fécondation n'a pas été l'objet de modifications.
70
2.9 Figures:
Ovocyte spécifique
Blastocyste spécifique
Ovocyte spécifique
Blastocyste spécifique
Figure 2.9.2: Photo' illustrant la totalité des points de la micropuce allumés par la référence.
71
Ovocyte spécifique
_
Blastocyste spécifique
Ovocyte spécifique
Blastocyste spécifique
Figure 2.9.3: Photo illustrant la spécificité de l'hybridation des sondes d'ARNa pour les zones blastocystes spécifiques.
72
Cl
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0
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Sof-Sof rep3 bas
Sof-Sof rep3 haut
Sof-Sof rep 1 bas .
Sof-Sof rep 1 haut
Sof-Sof rep2 haut
Sof-Sof rep2 bas '
Invivo rep3 bas
Invivo rep3 haut
Invivo rep2 bas
Invivo rep2 haut
Invivo rep 1 haut
Invivo rep bas
Figure 2.9.4 : Classification de type ST (sample tree) représentant le degré de similitude_entre les traitements in_vivo et sof/sof ainsi
qu'entre les réplicats biologiques et techniques d'un même traitement.
73
Mea n Adju sted FOM values
(±
SD) vs. Nunl ber of Clu sters
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Figure 2.9.5 : Graphique représentant le résultat du test Figure Of Merit (FOM) pour le traitement sof/sof Le nombre de cluster à utiliser pour le
test KMC est défini par le point d'inflexion de la courbe, ici 5.
74
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In vivo
In vitro
22 Gene s;
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(Il
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Figure 2.9.6 : Illustration représentant une classification de type KMC pour le traitement sof/sof La somme des transcrits des divers clusters ne
correspond pas au nombre de transcrits différemment exprimés du tableau no 01. Cela s'explique par le fait que les gènes flagués ont été enlevés
après le T-test.
79
2.10 Tableaux:
TRAITEMENTS
QUALITÉ DES BLASTOCYSTES
Sof/Sof
+
SofseullSofseul
+
Sofsérum/Sofsérum
+
Sofsérum/Sof
+
Tcm/Tcm
-
Tcm/sof
++
lcm/co-culture
++
Sof/co-culture
++
Sof/Sof(5) + sérum (2)
+
Sof/Sofsérum
+
Invivo/lnvivo
+++
Tableau 2.10.1 : Tableau illustrant la qualité relative (grosseur, couleur, taux) des blastocystes pour chaque traitement
79
Nom du traitement
Nb de transcrits affectés
Sof/Sof
110
Sof/Sofsérum
4
Sofsérum/Sofsérum
1
Sofsérum/Sof
Il
NAD4L
SUDS3 , NPM2, ACAT2, TKDP1
Tcm/Tcm
9
PA2G4, DNASE2
Candidats non caractérisés
(RIKEN)
Tcm/Sof
39
Tcm/co-culture
97
Sof/co-culture
59
FIGLA, GALK2, PTTG1 , NPM2,
NPM1 , CRIP1 , PTGS2,
AOP2, TKDP1 , BTG4,
TGIF
Sof/Sof(5) + sérum (2)
195
CuH, DDX25 , TMP3 , UBE2D3,
BMP15 , PTTG1 , GDP5 ,
JMJD1B, SHFM1, XIST,
PTGS2, AURKA, SOX4,
TGIF, GALK2
Sofseul/Sofseul
271
SUDS3, ACAT2, FIG LA, MLHl ,
CuH , PICALM, DDX25 ,
FH, TMP3 , BBS2" PTTG1 ,
MYF, SHFM1 , NPM2
Gènes surexprimés
Gènes sous exprimés
SUDS3 , ACAT2, CENPF,
DDX25 , XPEL5 , SCARB2,
YPEL5 , JMJD1B, BMPI5 ,
PTGS2, MSX1 , HAVCR1 ,
XIST, FAU, TP-1
EFIA, RlKEN
NM 029112
(Mom repeat containing 3)
RIKEN,
TGF~ ,
CUL1 , XIST
SUDS3, GRPEL1 , MAD2,
ALOX15
. SUDS3, ACAT2, XIST,
SMARCA5, SHFM1 ,
ALDOA, PTGS2, TPT1 ,
GPX4, MAD2, BUB3,
BTG4, FADS1
Tableau 2.10.2 : Tableau mettant en évidence les transcrits significativement différemment exprimés des traitements in vitro par rapport à ceux
in vivo en association avec des exemples de gènes surexprimés et sous-exprimés.
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SofiSofsérum
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Tableau 2.10.3 : Tableau mettant en évidence les divers processus biologiques affectés par les gènes significativement différemment exprimés
par les traitements de culture.
81
CHAPITRE III
CONCLUSIONS GÉNÉRALES
3. CONCLUSIONS GÉNÉRALES
Le but des expériences menées lors de ce mémoire visait à identifier les conditions
de culture in vitro qui affectent le moins le patron d'expression génique des embryons chez
le bovin. Pour mener à bien ces expériences, c'est une technique utilisant les micropuces
pour établir les différenciations d'expression génétique qui a été privilégié. La technique du
PCR quantitatif est fréquemment utilisée pour détenniner des différences d'expression
génique toutefois, l'utilisation des micropuces est une technique de choix puisqu'elle
pennet de cibler une plus grande quantité de gènes. Dans ce mémoire, l'utilisation des
micropuces a servi à établir le patron d'expression génique des différents embryons issus
des différentes conditions de culture et a servi à établir les comparaisons entre les
différentes conditions de culture in vitro et in vivo.
Les hypothèse de travail étaient, en premier lieu, d'identifier les voies métaboliques
fautives affectées par les différentes conditions de culture et second lieu, d'identifier le
système de culture qui produit des embryons plus similaires à ceux produits in vivo. Dans
la littérature on y retrouve qu'un mince éventail de trapscrits étudiés. Des transcrits reliés
au stress (SOX, Bax, GDP6), au métabolisme (Glut-5, IGF-2, IGF-IR, ATP5Al), à
l'implantation embryonnaire (Lif,
LR-~),
aux jonctions communicantes (Cx43), à la
transcription et à la traduction (HMG2, DOTIL, FOX03A). Grâce à l'utilisation des
micropuces, nous avons pu étudier un vaste éventail de transcrits affectés par les conditions
de culture in vitro. Les transcrits affectés touchent plusieurs processus biologiques.
L'utilisation des Go tenns nouS a pennis de constater qu'en plus des processus décrit
précédemment, le mécanisme d'épissage, la ségrégation chromosomale, la modification de
la chromatine, l'ubiquitinylation, le cycle cellulaire ainsi que la communication cellulaire
sont affectés par les différents milieux de culture.
De plus, dans les études antérieures, les chercheurs s'accordent pour dire que le
sérum a un impact négatif sur la qualité embryonnaire. En effet, on s'entend pour dire que
le sérum, à n'importe quelle concentration que ce soit, affecte l'embryon d'un point de vue
morphologique et moléculaire. De notre côté, les expériences .effectuées ne vont pas en ce
83
sens. Il en ressort que le meilleur traitement au point de vue du nombre de transcrits
significativement différemment exprimés par rapport au in vivo est le traitement
sofsérumlsofsérum. Aussi, si on regarde de façon globale les résultats obtenus, on constate
que toutes les conditions de culture dans lesquelles il y avait du sérum ont un profil
d'expression génique plus proche de celui des in vivo. Un résultat étonnant qui peut
s'expliquer par deux choses: 1) d'un point de vu global, le sérum n'est pas si nocif et
comble un manque ou 2) le sérum est trop permissif, il permet à trop d' embryons de
survivre, ce qui augmente la variabilité entre les profils génétiques des différents embryons
et donc l'écart' type.'
Finalement, cette recherche a permIS d'établir le profil génétique embryonnaire
bovin in vivo et in vitro. La comparaison des profils provenant d'embryons au stade de
blastocystes issus de 10 différentes conditions de culture à ceux in vivo est une première.
En effet, un travail d'une aussi grande ampleur n'avait pas encore été réalisé. Les réponses
que cette recherche nous a fournies a débouché sur de nouveaux questionnements. Comme
les expériences antérieurs qui portaient sur l'impact des milieux de culture, celle-ci va de le
même sens: il existe une déviation majeure, non-négligeable, du patron génétique
embryonnaire bovin comparativement au patron in vivo, ce qui sous-entend que les milieux
de culture utilisés sont sous-optimaux. Il est utopique de penser qu'un embryon produit in
vitro pourrait avoir exactement le même profil qu'un embryon in vivo. Toutefois, lorsque
l'on regarde les gènes affectés, on se rend compte que trop de processus biologiques sont
touchés. Devant ce constat, la communauté scientifique doit continuer de chercher à trouver
des milieux de culture pouvant subvenir de façon optimale aux embryons.
84
85