et al - Master Pathologie Humaine

Les microARN (miRNA, miR)
1. Introduction
2. Synthèse des miRNA
3. miRNA et régulation de l’expression de gènes :
dans le cytosol
4. miRNA et régulation de l’expression de gènes :
dans le nucléoplasme
5. Régulations de la synthèse des miRNA
6. Rôles en Biologie et pathologies
Master
Tronc
commun
Novembre
2009
Pierre Cau
INSERM U910 Faculté de Médecine
Laboratoire de Biologie Cellulaire, Hôpital La Timone
Marseille
[email protected]
siRNA (small interferent) et miRNA (micro) :
1. Introduction
Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. 1993. The C. elegans heterochronic gene lin-4
encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell, 75, 843.
Nobel
Physiologie
Médecine 2006
Andrew Z. Fire
Craig C. Mello
« Pour leur découverte de l’ARN interférence, l’inhibition de
l’expression (silencing) de gènes par un ARN double brin »
http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/
1. Introduction
Une animation sur le site web de Nature :
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html
2. Synthèse
1. gènes de miRNA
2. pré-miRNA
3. 1er clivage
(Drosha)
4. exportation
5. 2ème clivage
(Dicer)
6. complexe RISC
7. P bodies
Cau et Seïte, 2007
Cours de Biologie cellulaire
Editions Ellipses
Figure 12/12
1.
Organisation génomique des miRNA :
2. Synthèse
• 20% avec promoteur indépendant
• 40% dans introns (gènes codant ou non pour protéines)
avec ± la même orientation que le gène dans lequel le gène miR est inclus
• 10% dans exons
• Environ 10% dans séquences répétées Alu du génome
Zhao et Srivastava, 2007, TIBS, 32, 189
2. Synthèse
Basé sur les 232 miRNA
de mammifères dans la
base de données
Sanger (en 2004)
Rodriguez et al., 2004,
Genome Res., 14, 1902
2. Synthèse
Certains gènes de
miRNA sont organisés
en clusters
Le cluster en 14q.32.31
est soumis à l’empreinte
génomique parentale :
expression maternelle
Williams, 2008, Cell.
Mol. Life Sci., 65, 545
2. Synthèse
2. Transcription par ARN Pol II
avec épingle à cheveu
(ARN Pol III pour miR dans séquences
répétées Alu)  pré-miRNA
1-2 Kb avec
• coiffe en 5’
• et polyA en 3’
Zhao et Srivastava, 2007, TIBS, 32, 189
2. Synthèse
3. Premier clivage  ≈ 70 nt par complexe
comportant RNase de type III (Drosha)
+ protéine DGCR8 (délétée dans une forme
de syndrome de DiGeorge, 0MIM 188400)
(5’ phosphate, 3’ : 2 nt dépassent)
Nomenclature des domaines :
Saunders et al., 2007, PNAS, 105, 3300
4. Exportation au travers du pore
nucléaire grâce à exportine 5
(+ protéine G Ran)
Zhao et Srivastava, 2007, TIBS, 32, 189
2. Synthèse
5. Deuxième clivage par Dicer
Ribonucléase de type III avec domaine
hélicase  ≈ 19-23 nt double brin :
5’ phosphate, 3’ : 2 nt dépassent
(KO de Dicer léthal chez l’embryon.
KO conditionnel viable)
6. Association dans complexe RISC :
RNA-Induced Silencing Complex :
• un seul brin, l’autre (MIR*) dégradé
• protéines argonaute dont Ago2
dénomination à partir de la forme de
Arabidopsis thaliana (avec mutation
du gène Ago) ressemblant au nautile
(céphalopode)
Zhao et Srivastava, 2007, TIBS, 32, 189
2. Synthèse
8 gènes codant pour protéines
Ago chez l’homme :
seule Ago2 = RNase
(souris KO : arrêt développement à E5,5)
• reconnaissance du 5’ phosphate et des 2
nucléotides qui dépassent en 3’
• nombreuses protéines associées :
≈ 20 pour Ago2 (voir tableau 2,
Peters et Meister, 2007, Mol. Cell, 26, 611)
dont FRX1 et 2 (Fragile X related protein)
(Ago dans toutes les cellules sauf
germinales : protéines PIWI)
Ago (archaebactérie)
Seto et al., 2007, Mol. Cell, 26, 603
Ago2 humain
Höck et Meister, 2008, Genome Biol., 9, 210
1/ 2 ou 3 Rôles des miRNA dans le cytosol :
3. miR cytosol
• Dégradation de l’ARNm par clivage
• Inhibition de la translation par action sur le ribosome : mécanisme ?
-Ago = initiateur de la
translation = elF-2C2
-de l’élongation,
-détruit les peptides
naissants
• ± Déadénylation,
enlèvement de la
coiffe et dégradation
de l’ARNm déstabilisé
Höck et Meister, 2008, Genome Biol., 9, 210
L’accessibilité du miRNA au 3’ UTR de son ARNm cible :
rôle des nt 2 à 7 en 5’ = seed
3. miR cytosol
Zhao et Srivastava, 2007,
TIBS, 32, 189
• Dégradation d’ARNm + : miR (10a) se fixe sur la région 5’ non-codante
d’ARNm codant pour des protéines ribosomales et en augmente la traduction :
Ørom et al., 2008, Mol. Cell, 30, 460
3. miR cytosol
Remarques :
• 2 mécanismes de dégradation
des ARNm chez eucaryotes :
- enlèvement de la coiffe en 5’
et digestion de 5’  3’
(XNR1 =5’-3’ exoribonucléase
- déadénylation (3’) et digestion
de 3’  5’
(Exosome + …)
Localisation dans P bodies
Eulalio et al., 2007, Nat. Rev.
Mol. Cell Biol., 8, 9
3. miR cytosol
2/ P bodies :
- Complexe protéiques cytosoliques contenant Ago2, LSM2, GW182 (anticorps
disponibles)…
- Plusieurs rôles : sites de…
• destruction « en vrac » (bulk) des ARNm (déadénylation et digestion 5’  3’)
• destruction des ARNm avec codon stop : Premature Termination Codon (PTC)
par le mécanisme NMD (Non-sense Mediated RNA Decay)
• silencing de gènes via miRNA
Höck et Meister, 2008, Genome Biol., 9, 210
3/ miRNA et leurs ARNm cibles :
3. miR cytosol
Un site web dédié : 695 miRNA (septembre 2008) humains
http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml
Environ 35000 gènes cibles des miRNA (septembre 2008) chez l’homme :
un même miRNA peut cibler plusieurs ARNm !
Programme de recherche de cibles sur le web :
• Sanger :
http://microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/targets/v5/search.pl
• TargetScan :
http://www.targetscan.org/
• miRanda :
http://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl
• Diana MicroT :
http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/micro_t.cgi
• RegRNA :
http://regrna.mbc.nctu.edu.tw/html/prediction.html
http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml
http://microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/targets/v5/search.pl
Choisir le miRNA
Choisir le
génome
ou le gène
http://www.targetscan.org/
miRanda :
http://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl
http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/micro_t.cgi
http://regrna.mbc.nctu.edu.tw/
html/prediction.html
3. miR cytosol
4/ Effet des miRNA au niveau protéique :
2 articles montrent un effet faible mais sur plusieurs centaines de protéines :
• Baek et al., 2008, Nature, 455, 64
Spécificité de la réponse ???
• Selbach et al., 2008, Nature, 455, 58 :
- surexpression de 5 miR dans cellules HeLa,
ou KO de miRNA endogènes
- marquage des protéines par méthode SILAC
(Stable Isotope Labeling with Aminoacids in Culture) :
culture témoin : marquage des lysines avec 12C (light)
HeLa transfectées avec miRNA ; lysines marquées avec 13C (heavy)
- digestion trypsique, spectrométrie de masse :
analyse de ≈ 5000 protéines : les peptides marqués au au 13C sont plus
lourds de 6 Da par rapport aux peptides marqués au 12C
Résultats :
- surexpression de miRNA  baisse de environ 30% des protéines
- KO  surexpression de protéine : ex : Dicer  après KO de miR let-7b
Méthode
SILAC :
Stable Isotope
Labeling
with
Aminoacids in
Culture
12C
et
13C
Ong et Mann,
2006,
Nature
Protocols, 1,
2650
3. miR cytosol
4. miR noyau
Les miRNA sont importés dans le nucléoplasme et agissent sur la
transcription des gènes et l’épissage des ARNm (1):
1/ Importation de miRNA (siRNA) dans le nucléoplasme :
Guang et al., 2008, Science, 321, 537 : C. elegans
En présence de siRNA, la protéine Argonaute NRDE-3 se fixe au siRNA
dans le cytosol, l’importe dans le nucléoplasme (signal de localisation
nucléaire NLS…),  blocage de pré-ARNm dans le nucléoplasme.
Berezhna et al., 2008, PNAS, 103, 7682 :
• pénétration dans le nucléoplasme de siRNA (sens et antisens marqués
aavec fluorochromes rouge et vert)
vert dirigés contre ARN 7SK
• pénétration ou non (selon type cellulaire et durée d’incubation) de siRNA
dirigés contre le réplicon du virus de l’hépatite C (HCV). Si pénétration
nucléaire, élimination du brin sens.
4. miR noyau
siRNA sens
siRNA antisens
DAPI
Cible :
ARN 7K
Hépatome
HU-7
2h après
transfection
Cible :
ARN
HCV
Berezhna et al., 2008, PNAS, 103, 7682
4. miR noyau
Les miRNA sont importés dans le nucléoplasme et agissent sur la
transcription des gènes et l’épissage des ARNm (2):
2/  Transcription de gènes :
Place et al., 2008, PNAS, 105, 1608 :
• miR-373 se fixe sur le promoteur des gènes E-cadhérine et CDC2 (Cold
Shock domaine containing protein 2 = Pippin)
• Cellules PC3 (cancer prostate) : transfection de miR-373   mRNA des 2
gènes
E-cadhérine
ADN
brin sens
Séquence du miR-373 complémentaire de celle de l’ADN
4. miR noyau
miR-373 et dsEcadh-640 (complémentaire du site cible de miR-373) :
•  ARNm E-Cadhérine x 7
•  protéine E-Cadhérine
• Pas d’effet additif des deux dsRNA
RT-PCR
immunoblot
qRT-PCR
2 autres papiers antérieurs :
4. miR noyau
des RNA double brin (dsRNA) artificiels ciblant le promoteur
induisent l’expression de gènes
= phénomène de RNAa = RNA activation
•E-cadhérine
•p21
•VEGF
PNAS, 2006, 103, 17337-17342
•Récepteur
de la
progestérone
Nature Chemical Biology, 2007, 3, 166-173
4. miR noyau
Les miRNA sont importés dans le nucléoplasme et agissent sur la
transcription des gènes et l’épissage des ARNm (3):
3/  Transcription de gènes :
Kim et al., 2008, PNAS, 105, 16230 :
• le gène miR-320 localisé dans le promoteur du gène POLR3D
(sous-unité de l’ARN polymérase III)
• miR-320 bloque la transcription du gène POLR3D
4/ Régulation de l’épissage :
Boutz et al., 2007, Gene Develop., 21, 71 :
miR-133 et miR-1/206   facteur d’épissage nPTBP (Polypyrimidine trac
binding protein, développement, muscle)
Makeyev et al., 2007, Mol. Cell, 27, 435 :
miR-124  différenciation neuronale par régulation d’un épissage alternatif
cerveau-spécifique via PTBP
(Revue : Makeyev et Maniatis, 2008, Science, 319, 1789)
1/ L’expression des gènes de miRNA est régulée comme
celle de gènes plus classiques (1) :
5. Régulations miR
• Régulation par des voies de signalisation intercellulaire :
TGF-bêta, BMP4 induisent (via SMAD) miR21 contrôlant via l’ARNm
PDCD4 (Programmed cell death 4) la différenciation de cellules
musculaires lisses de parois vasculaires
Davis et al., 2008, Nature, 454, 56
• La nicotine induit miR-140 qui cible l’ARNm de la dynamine 1 :
endocytose pour récupération de membrane après exocytose
Huang et Li, 2008, Int. J. Neuropsychopharmacol., 10 octobre, 1-10
• Monocytes : NF-κB induit miR-146 en réponse à des endotoxines
bactériennes :
Taganov et al., 2006, PNAS, 103, 12481
• Régulations génomiques (Copy Number Variants) et épigénétiques
(méthylation ADN, acétylation des histones) dans le cancer de
l’ovaire humain : Zhang et al., 2008, PNAS, 105, 7004
1/ L’expression des gènes de miRNA est régulée comme
celle de gènes plus classiques (2) :
5. Régulations miR
• SNP dans gènes codant pour les miR :
Saunders et al., 2007, PNAS, 104, 3300
65 SNP dans 49 pré-miRNAs, soit densité de 1,3 SNP/kB
(un peu plus faible que régions voisines)
Localisation des SNP dans les domaines
Hu et al., 2008, J. Clin. Invest., 118, 2600
Correlation entre SNP dans gènes de miRNA et survie de cancers non à
petites cellules du poumon
• miRNA et Copy Number Variants (CNV) :
Wong et al., 2007, Am. J. Hum. Genet., 80, 91 (CGH microarray)
• RNA éditing des miRNA : adénosine (A)  inosine (I)
Amariglio et Rechavi, 2007, Blood Cells, 39, 151
5. Régulations miR
Distribution des Copy
Number Variants (CNV)
miRNA
cancer
3
4
5 individus
Wong et al., 2007,
Am. J. Hum. Genet., 80, 91
5. Régulations miR
miRNA et Copy Number Variants (CNV)
Wong et al., 2007,
Am. J. Hum. Genet., 80, 91
2/ Les cellules pourraient échanger/échangent
des miRNA (signalisation intercellulaire) (1) :
5. Régulations miR
• Découvertes d’abord dans C. elegans, deux protéines SID-1 et 2
ont des homologues dans le génome humain :
SID-1 = perméase (11 domaines transmembranaires) permettant la traversée
de la membrane plasmique par des dsRNA
Feinberg et Hunter, 2003, Science, 301, 1545
Winston et al., 2002, Science, 295, 2456.
Duxbury et al., 2005, Biochem Biophys Res
Commun. 331, 459
Jose et Hunter, 2007, Ann. Rev. Genet., 41,
305
SID-2 = un seul domaine transmembranaire
indispensable aussi (C. elegans)
Winston et al., 2007, PNAS, 104, 10565
2/ Les cellules échangent des miRNA
(signalisation intercellulaire) (2) :
5. Régulations miR
• Nouveau mécanisme de communication intercellulaire par transfert,
via les exosomes,
d’ARNm fonctionnels (traduits dans les cellules qui ont incorporé les
exosomes (endocytose, fusion ?)
et de miRNA (fonctionnels ?) :
chaque miRNA pourrait interagir avec 200 ARNm différents
5. Régulations miR
Attention : problème de nomenclature (!!!) :
Exosome = complexe enzymatique de dégradation des ARNm (3’  5’)
Exosome = vésicule générée dans les endosomes tardifs = corps
mutivésiculaires = MVB (MultiVesicular Bodies)
• 3 types de mastocytes (humains, murins) produisent des exosomes
• ces exosomes contiennent des ARNm et des microARN
(en plus de protéines membranaires et cytosoliques)
• les exosomes sont « captés » par des cellules « cibles »
(endocytose, fusion ?)
• le contenu des exosomes passe dans le cytosol des cellules cibles
• les ARNm sont traduits en protéines (homme/souris !)
Les exosomes sont produits dans les endosomes tardifs et exocytés :
Endosomes et présentation des antigènes par le CMH de type II
aux lymphocytes T CD4+ dans les cellules " présentatrices d'antigènes "
< 100 nm
Cau et Seïte, 2007
Cours de Biologie cellulaire
Editions Ellipses
Figure 10/39
Protéines membranaires (CMH II…)
+ cytosol de la cellule productrice
5. Régulations miR
• Nouveau mécanisme de communication intercellulaire
par transfert via les exosomes,
d’ARNm fonctionnels (traduits dans la cellule « cible ») :
- 1300 ARNm (8% des 16 000 présents dans cellule source)
- 270 ARNm présents dans exosomes et non dans cellule source
et de miRNA (fonctionnels ?) :
chaque miRNA pourrait interagir avec 200 ARNm différents
Attention :
• « Contamination » de cultures cellulaires (sérum…)
Revue sur les exosomes : Schorey et Bhatnagar, 2008, Traffic, 9, 871
3/ Des miRNA dans la circulation sanguine
(signalisation intercellulaire) (3) :
5. Régulations miR
Mitchell et al., 2008, PNAS, 105, 10513
• Cancer de la prostate
• expression de plusieurs miR retrouvé dans la circulation sanguine :
de 9000 copies/µl (miR-15b) à 133 000 copies/µl (miR-24)
• protégé de la dégradation par les Rnases endogènes
• Détection du cancer ?
Quelques exemples significatifs
6. Rôles Biol./Pathol.
1/ Développement :
• Autorenouvellement et pluripotence de cellules souches
Facteur de régulation de la transcription REST (RE1-Silencing Factor) :
Répression de l’expression de gènes neuronaux dans cellules non neuronales
REST exprimé dans cellules ES souris : REST   expression de miR-21
Singh et al., 2008, Nature, 453, 223
• Système nerveux (developpement et au stade adulte) : C. elegans
Fiore et al., 2008, BBA, 1779, 471
2/ Pathologies acquises :
• Maladies neurodégénératives :
Bushait et Cohen, 2008, C.O. Neurobiol., 18, 292
• Démence fronto-temporale et SNP dans la région 3’ UTR d’un gène
(progranuline) cible de miR-659:
Rademakers et al., 2008, Hum. Mol Genet., 17, 3631
6. Rôles Biol./Pathol.
Blocage de l’expression des
Gènes neuronaux dans cellule
non-neuronale (REST)
Différenciation neuronale
Fiore et al., 2008, BBA, 1779, 471
Fonctionnement neuronal dans organisme adulte :
•morphogenèse des épines dendritiques
•plasticité synaptique
6. Rôles Biol./Pathol.
Inactivation de miR-134
en réponse au BDNF
Transport des miR ou des précurseurs ?
Fiore et al., 2008, BBA, 1779, 471
3/ Cancer :
• La protéine p53 régule plusieurs miRNAs :
Hermeking, 2007, Cancer Cell, 12, 414
6. Rôles Biol./Pathol.
• Anomalies génomiques (SNP, CNV) dans cancers de l’ovaire :
Zhang et al., 2006, PNAS, 103, 9136
• SNP de gènes cibles  résistance aux traitements :
-Dihydrofolate réductase et méthotrexate (lymphomes…): miR 24
Mishra et al., 2007, PNAS, 104, 13513
-p27 (régulateur du cycle cellulaire) et tamoxifène (cancer sein) :
Miller et al., 2008, J. Biol. Chem., 283, 29897
-Récepteur des œstrogènes ERα et tamoxifène (cancer sein)
Zhao et al., 2008, J. Biol. Chem., 283, 31079
• miRNA, cancer et diagnostic ?
Deng et al., 2008, Cell Cycle, 7, 2643
Barbarotto et al., 2008, Int. J. Cancer, 122, 969
6. Rôles Biol./Pathol.
• Le répertoire des
miRNA exprimés dans
les adénocarcinomes du
poumon pourrait avoir
une valeur pronostique :
Courbes de Kaplan Meier
Yanaihara et al., 2006,
Cancer Cell, 9, 189
6/10/08
Nobel de Médecine 2008
Harald
zur Hausen
Virus Papilloma
(cancer du col utérin)
Françoise
Barré-Sinoussi
Luc Montagnier
Virus du SIDA
Cancer (suite)
• Cancer du col de l’utérus :
6. Rôles Biol./Pathol.
- Environ 70 gènes de miRNA dérégulés :
Lee et al., 2008, Clin. Cancer Res., 14, 2535
- Surexpression de gènes portés par le chromosome 5 dont Drosha :
Scotto et al., 2008, Mol. Cancer, 7, 58
4/ Le génome de virus codent pour des miR actifs sur les cellules cibles :
• Sarcome de Kaposi : Samols et al., 2007, PLoS Pathogens, 3, e65
• herpès : Stern-Ginossar et al., 2007, Science, 317, 376
• Papilloma : Martinez et al., 2008, Oncogène, 27, 2575
Une revue : Berkhout et Jeang, 2007, J. Biol. Chem., 282, 26641
5/ Des bactéries modifient la réponse miRNA de plantes :
Navarro et al., 2007, Science, 321, 964.
A quand un effet comparable chez l’homme ?
Fin
Merci
Fine
Grazie
Ende
Danke
The end
Koniec
Thanks
Dziekujeę