Fonctions, diversité et évolution des petits ARN non-codants Vincent CASTRIC 2011 L’évolution des micro-ARN 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Généralités sur le contrôle de l’expression des gènes Découverte du premier micro-ARN Importance de ces microARN Diversité de leurs modes d’action Origine et biogenèse chez les plantes Patrons d’évolution et de conservation Un cas d’étude: dominance dans les systèmes d’auto-incompatibilité « Une des découvertes scientifiques les plus importantes de ces dernières années » Régulation de l’expression: différents niveaux Le modèle classique de régulation de la transcription Nestler & Hyman 2002 Le modèle classique de régulation de la transcription Cellule A Cellule B - Présence du facteur de transcription … régulation du gène codant pour ce FT ! - Activation par signaux environnementaux (activation par la chaleur des Heat Shock TF) - Signaux externes à la cellule : hormones stéroides (intracell.) ou peptidiques (à mb) - Signaux externes à l’organisme Diversité des FT: - Protéines à doigts de Zinc - Protéines Helix-Turn-helix - Protéines leucine zipper - Protéines helix-loop-helix - récepteurs stéroides Le modèle classique de régulation de la transcription Intégration de plusieurs facteurs sur une même cible Nestler & Hyman 2002 Le modèle classique de régulation de la transcription Intégration des signaux sur des cibles différentes Nestler & Hyman 2002 L’évolution des micro-ARN 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Généralités sur le contrôle de l’expression des gènes Découverte du premier micro-ARN Importance de ces microARN Diversité de leurs modes d’action Origine et biogenèse chez les plantes Patrons d’évolution et de conservation Un cas d’étude: dominance dans les systèmes d’auto-incompatibilité 1993: découverte du premier microRNA (Laboratoire de Victor Ambros) Coenorhabditis elegans (www.wormatlas.org) • • • • • 0,1mm 4 stades larvaires: L1 à L4 Ambros isole un mutant qui « réitère » le stade L1 Ce mutant présente une délétion du gène lin-4 Lorsqu’on insère dans un animal transgénique un fragment d’ADN contenant le gène lin-4, on retrouve le phénotype normal Curieusement lin-4 ne code pas pour une protéine mais un ARN de 22nt D’après Gautheret IGM Orsay www2.lifl.fr/SEQUOIA/Arena/Presentations/Gautheret.ppt Lin-4 et lin-14 • Ambros découvre que la répression a besoin de: – Un lin-4 intact – Une séquence intacte de l’UTR 3’ du gène protéique lin-14 Transcrit de lin 4 UTR 5’ stop start UTR 3’ ORF Transcrit de lin-14 D’après Gautheret IGM Orsay www2.lifl.fr/SEQUOIA/Arena/Presentations/Gautheret.ppt Répression par reconnaissance de l’UTR 3’ • Plusieurs fragments de l’UTR 3’ de lin-14 sont complémentaires à lin-4 • En mutant lin-4 ou l’UTR, on est capable d’abolir ou restaurer la répression du gène lin-14 D’après Gautheret IGM Orsay www2.lifl.fr/SEQUOIA/Arena/Presentations/Gautheret.ppt Principales étapes de la régulation par lin-4 • Synthèse à partir d’un précurseur • Excision du fragment de 22nt • Appariement imparfait en plusieurs points de l’UTR • Blocage de la traduction par complexe RISC (He & Hannon, Nature reviews, 2004) D’après Gautheret IGM Orsay www2.lifl.fr/SEQUOIA/Arena/Presentations/Gautheret.ppt La découverte s’amplifie • Plusieurs gènes-cibles de lin-4 découverts • En 2000: découverte de let-7, un autre ARN (21nt) qui gouverne le passage L4->adulte • On trouve des homologues de let-7 chez les mollusques, oursin, mouche, souris, homme – Présent chez tous les métazoaires! – Suggère un rôle fondamental D’après Gautheret IGM Orsay www2.lifl.fr/SEQUOIA/Arena/Presentations/Gautheret.ppt Généralisation Les microRNA existent chez les plantes et les animaux Taille entre 21 et 25nt >1100 microRNA décrits chez l’homme >717 chez la souris >387 chez le rat >186 chez la drosophile >233 chez C. elegans Chaque microRNA est capable de réprimer l’expression de plusieurs dizaines de gènes • Jusqu’à 60% des gènes humains régulés par petits ARN. • • • • • • • • D’après Gautheret IGM Orsay www2.lifl.fr/SEQUOIA/Arena/Presentations/Gautheret.ppt Les microRNA s’expriment spécifiquement • Plusieurs miRNA sont fortement sur/sousexprimés dans des tumeurs (He & Hannon, Nature reviews, 2004) D’après Gautheret IGM Orsay www2.lifl.fr/SEQUOIA/Arena/Presentations/Gautheret.ppt Un miRNA peut réprimer plus de 100 transcrits – Injection de miR-1 (coeur + muscle) et miR-124 (cerveau) dans des cellules humaines – Suivi de l’expression par puce ADN – ~200 gènes réprimés – Le miRNA de cerveau réprime des gènes qui ne doivent pas s’exprimer dans le cerveau en temps normal. – IDEM pour miRNA de coeur. D’après Gautheret IGM Orsay www2.lifl.fr/SEQUOIA/Arena/Presentations/Gautheret.ppt Les gènes réprimés ont un motif commun dans leur 3’ UTR Séquence de 7-8nt « seed » essentielle pour la reconnaissance de la cible D’après Gautheret IGM Orsay www2.lifl.fr/SEQUOIA/Arena/Presentations/Gautheret.ppt … la « matière noire » du génome ? 90% du génome des vertébrés est transcrit ! Intergenic DNA Introns, UTRs Transcription: T Satellite DNA T? T T T Transposable elements Coding regions: 1.5% tRNA, rRNA D’après Gautheret IGM Orsay www2.lifl.fr/SEQUOIA/Arena/Presentations/Gautheret.ppt Les ARN traditionnels D’après bio.phys.unm.edu/50005/MicroRNA.ppt Diversité des ARN • Acide Ribonucleique – Ribonucleotides (Ribose, base, & phosphate) • Types – Codant: ARN messager (mRNA) – Non-codant: • • • • • • • • Ribosomal RNA (rRNA) Transfer RNA (tRNA) Small nuclear RNA (snRNA) Small nucleolar RNA (snoRNA) Interference RNA (RNAi) Short interfering RNA (siRNA) Piwi-interacting RNA (piRNA) Micro RNA (miRNA) Les micro ARN Les micro ARN • ARN non-codant de 21-22 nucleotides • Produits par un gène qui code pour un transcrit initial d’~70 nucleotides • Ce transcrit “pre-miRNA” a la capacité à former une structure tige-boucle • Ce pre-miRNA est ensuite traité en un ARN non-codant de 21-22 nucleotides par une enzyme appelée Dicer Les micro ARN - 60% exprimés indépendamment - 15% en clusters - 25% dans des introns Les micro ARN • La vaste majorité d’entre eux régule d’autres gènes en se liant à une séquence complémentaire du gène cible • Complementarité parfaite dégradation du mRNA du gene cible • Complementarité imparfaite inhibition de la traduction en protéine d’importants acteurs de la régulation des gènes Processus de maturation des miARN D’après bio.phys.unm.edu/50005/MicroRNA.ppt Processus de maturation des miARN RISC (RNA induced silencing complex) associé au petit ARN monocaténaire est responsable de l’inhibition de la traduction d’ARNm spécifiques. Les protéines Argonaute (AGO) du complexe RISC Argonaute proteins in RISC Le mécanisme de régulation dépend - de quelle protéine argonaute forme le complexe RISC - de la complémentarité entre le siRNA et sa cible. Siomi & Siomi Nature 457, 396, 2009 Acteurs principaux • Drosha et Pasha (DGCR8) composent le complexe protéique “Microprocessor” (~600-650kDa) • Drosha et Dicer sont des enzymes RNase III • Pasha est une protéine de liaison à dsRNA • Exportin 5 est un membre de la famille des FT karyopherines nucleocytoplasmiques • Argonautes sont des enzymes de la famille des RNase H et composent le complexe RISC (RNA-induced silencing complex). Ils contiennent deux domaines: PAZ (liaison au miARN) et PIWI (liaison à la cible) L’évolution des micro-ARN 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Généralités sur le contrôle de l’expression des gènes Découverte du premier micro-ARN Importance de ces microARN Diversité de leurs modes d’action Origine et biogenèse chez les plantes Patrons d’évolution et de conservation Un cas d’étude: dominance dans les systèmes d’auto-incompatibilité Diversité des modes d’action : 1. atténuation de la traduction doi:10.1016/S0092-8674(02)00863-2 Copyright 2002 Cell Press. Diversité des modes d’action : 2. dégradation des ARNm Diversité des modes d’action : 3. contrôle de la transcription par méthylation Diversité des modes d’action Transposon repression Heterochromatin formation Defense against viruses Transposon repression Heterochromatin formation Regulation of gene expression D’après Christophe ANTONIEWSKI, Institut Pasteur L’évolution des micro-ARN 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Généralités sur le contrôle de l’expression des gènes Découverte du premier micro-ARN Importance de ces microARN Diversité de leurs modes d’action Origine et biogenèse chez les plantes Patrons d’évolution et de conservation Un cas d’étude: dominance dans les systèmes d’auto-incompatibilité Apparition d’un nouveau micro-ARN: 1. via évolution spontanée Voinnet 2009 Voinnet 2009 Apparition d’un nouveau micro-ARN: 2. via duplication inversée en tandem Axtell et Bowman 2008 Apparition d’un nouveau micro-ARN: 2. via duplication inversée en tandem Perte du miRNA Perte de la cible Apparition d’un nouveau micro-ARN: 3. dérivé d’un ancien élément transposable MITE= Miniature Repeat TE Voinnet 2009 Retrotransposons • Représentent 42% génome humain ! • Des éléments génétiques mobiles égoistes qui peuvent s’amplifier eux-memes et modifier la taille du génome • Méchanisme – Se copier en ARN – Se rétro-trancrire en AND via a reverse transcriptase éventuellement encodée part le retrotransposon – S’intègre dans le génome à une autre position •https://eapbiofield.wikispaces.com/Ch+21+Genomes+and+Their+Evolution+LE W?f=print « Ping-pong » moléculaire entre rétrotransposon et piRNA Aravin et al. Science 2007 L’évolution des micro-ARN 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Généralités sur le contrôle de l’expression des gènes Découverte du premier micro-ARN Importance de ces microARN Diversité de leurs modes d’action Origine et biogenèse chez les plantes Patrons d’évolution et de conservation Un cas d’étude: dominance dans les systèmes d’auto-incompatibilité Evolution à l’échelle des angiospermes 21 miRNA sont tres conservés / 392 décrits chez A. thaliana 13 d’entre eux régulent des FT impliqués dans le contrôle du développement La plupart de ceux qui ne sont pas conservés montrent une forte similarité de séquence avec leur gène cible: suggère mécanisme de création récente. dynamique rapide d’apparition/extinction ? Axtell & Bowman (2008) Evolution entre A. lyrata et A. thaliana 91 familles de miRNA décrites chez A. thaliana Fahlgren et al. 2010 Evolution entre A. lyrata et A. thaliana Environ 1-3 nouveaux miRNA par million d’année. Une évolution rapide Fahlgren et al. 2010 Evolution entre A. lyrata et A. thaliana Apparition d’un nouveau micro-ARN: 2. via duplication inversée en tandem 79% 21% Fahlgren et al. 2010 L’évolution des micro-ARN 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Généralités sur le contrôle de l’expression des gènes Découverte du premier micro-ARN Importance de ces microARN Diversité de leurs modes d’action Origine et biogenèse chez les plantes Patrons d’évolution et de conservation Un cas d’étude: dominance dans les systèmes d’auto-incompatibilité Dominance dans les systèmes d’auto-incompatibilité Auto-incompatibilité: système génétique de reconnaissance et de rejet du soi. SCR SRK Système clé-serrure Dominance dans les systèmes d’auto-incompatibilité Tarutani et al. 2010 Dominance dans les systèmes d’auto-incompatibilité Tarutani et al. 2010 Dominance dans les systèmes d’auto-incompatibilité Dominance dans les systèmes d’auto-incompatibilité Shiba et al. 2006 Dominance dans les systèmes d’auto-incompatibilité Tarutani et al. 2010 Dominance dans les systèmes d’auto-incompatibilité Tarutani et al. 2010 In pollen Dominance dans les systèmes d’auto-incompatibilité 15 Highy dominant BAC BAC 13 20 4 Dominant 2 10 BAC 3 Intermediate Recessive 8 BAC 28 1 SRK SCR SA (dominant) SB (dominant) S13 (dominant) sRNA SCR SRK sRNA exon1 S14 (intermediate) exon2 SRK SCR S1 (recessive) Bilan • Les petits ARN non-codants sont des acteurs majeurs de la régulation de l’expression des gènes • Ils agissent via une diversité de mécanismes à différents niveaux de l’expression • Ils peuvent évoluer rapidement ou être très conservés • Ils co-évoluent avec leur cible • Leur découverte et la compréhension de leurs mécanismes a mené à des applications très concrètes… Une application majeure: l’interférence ARN Une application majeure: siRNA • Un nouvel outil pour la recherche: – Abolition de l’expression d’un gène d’intérêt – Contrôle de l’expression à différents niveaux – Expression stable ou transitoire – Différentes méthodes d’expression