Toxicologie Génétique : Essai de Mutation Létale Dominante chez le
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478 LIGNE DIRECTRICE DE L’OCDE POUR LES ESSAIS DE PRODUITS CHIMIQUES Adoptée : 4 avril 1984 « Toxicologie Génétique : Essai de Mutation Létale Dominante chez le Rongeur » 1. I N T R O D U C T I O N • Connaissances requises – – – – – – – Etat physique de la substance d'essai : solide, liquide, vapeur ou gaz Identification chimique de la substance d'essai Degré de pureté (impuretés) de la substance d'essai Caractéristiques de solubilité Point de fusion/point d'ébullition pH (le cas échéant) Données relatives à la pression de vapeur (si elles sont disponibles) • Documents de référence Il n'existe pas de normes internationales à ce sujet. 2. M É T H O D E A. INTRODUCTION, OBJET, PORTÉE, INTÉRÊT, APPLICATION ET LIMITES DE L'ESSAI Les effets létaux dominants (LD) provoquent la mort de l'embryon ou du fœtus. L'apparition d'un phénomène létal dominant à la suite d'une exposition à une substance chimique indique que cette substance a affecté le tissu germinal de l'espèce étudiée. On admet en général que les effets létaux dominants sont le résultat d'aberrations chromosomiques (anomalies structurales et numériques), mais les mutations géniques et les effets toxiques ne peuvent pas être écartés. Les utilisateurs de cette ligne directrice doivent consulter la préface en particulier les paragraphes 3, 4, 7 et 8. 478 page 2 • « Toxicologie Génétique : Essai de Mutation Létale Dominante chez le Rongeur » Définitions Une mutation létale dominante est une mutation qui se produit dans une cellule germinale et qui n'entraîne pas de dysfonctionnement du gamète, mais qui est mortelle pour l'œuf fécondé ou pour l'embryon en cours de développement. • Substances de référence Exemples de types de substances qui pourraient être utilisées comme témoins positifs : – triéthylène mélamine – cyclophosphamide – méthanesulfonate d'éthyle • Principe de la méthode En général, des animaux mâles sont exposés à la substance d'essai, puis accouplés avec des femelles vierges non traitées. On peut tester séparément l'effet sur les différentes étapes de la formation des cellules germinales en utilisant différents intervalles d'accouplement. Les femelles sont sacrifiées après une période de temps appropriée et le contenu de l'utérus est examiné afin de déterminer le nombre d'embryons implantés, ainsi que celui des embryons vivants et morts. Le calcul de l'effet létal dominant repose sur la comparaison du nombre d'embryons implantés vivants par femelle dans le groupe traité et dans le groupe témoin. L'augmentation du nombre d'embryons implantés morts par femelle dans le groupe traité par rapport au groupe témoin reflète la perte après implantation. La perte après implantation est calculée en déterminant le rapport du nombre d'embryons implantés morts au nombre total d'embryons implantés dans le groupe traité et en le comparant au rapport du nombre d'embryons implantés morts au nombre total d'embryons implantés dans le groupe témoin. La perte avant implantation peut être évaluée par comptage des corps jaunes ou par comparaison du nombre total d'implants par femelle dans le groupe traité et dans le groupe témoin. B. MODE OPÉRATOIRE Plusieurs programmes de traitement sont disponibles. Celui qui est le plus largement utilisé fait appel à une administration unique de la substance d'essai. D'autres programmes de traitement, 478 « Toxicologie Génétique : Essai de Mutation Létale Dominante chez le Rongeur » page 3 tel qu'un traitement sur cinq jours consécutifs, peuvent être utilisés si le chercheur en donne les raisons. Des mâles identifiés sont accouplés successivement avec des femelles vierges, à des intervalles appropriés. Le nombre d'accouplements après le traitement est régi par le programme de traitement et il doit assurer une couverture adéquate de la période de maturation des cellules germinales. Les femelles sont sacrifiées au cours de la seconde moitié de la gestation et le contenu de l'utérus est examiné afin de déterminer le nombre total d'embryons implantés ainsi que le nombre d'embryon vivants et morts. • Préparations Substances d’essai Le cas échéant, les substances d'essai doivent être dissoutes ou mises en suspension dans de l'eau ou dans une solution saline isotonique. Les substances insolubles dans l'eau peuvent être dissoutes ou mises en suspension dans des véhicules appropriés. Normalement, on doit employer des solutions ou des suspensions fraîchement préparées de la substance d'essai. • Animaux d'expérience Choix des espèces On utilise généralement le rat ou la souris dans cette expérience. Des animaux sains et sexuellement matures sont choisis au hasard et répartis entre les groupes de traitement et les groupes témoins. Il est recommandé d'utiliser des souches présentant une faible létalité dominante de base, une fréquence de gestation importante et des nombres élevés d'embryons implantés. Nombre d’animaux Un nombre adéquat d'animaux doit être utilisé, en tenant compte de la variation spontanée des caractéristiques biologiques qui sont évaluées. Le nombre doit être choisi en fonction de la 478 page 4 « Toxicologie Génétique : Essai de Mutation Létale Dominante chez le Rongeur » sensibilité de détection et de la puissance statistique préalablement déterminées. Par exemple, dans une expérience type, le nombre de mâles dans chaque groupe doit être suffisant pour produire entre 30 et 50 femelles gravides par intervalle d'accouplement. Conditions d’encagement et d’alimentation Les conditions d'environnement doivent répondre aux besoins de l'espèce étudiée, conformément aux bonnes pratiques d'élevage des animaux. • Conditions d'essai Voie d’administration L’administration se fait d’ordinaire par voie orale ou par injection intrapéritonéale. D'autres voies peuvent se révéler appropriées. Niveaux des doses Normalement, on doit utiliser trois niveaux de dose. La dose la plus élevée doit provoquer des signes de toxicité (par exemple une fertilité légèrement réduite). Cependant, pour une évaluation initiale de la létalité dominante, une dose élevée unique peut être suffisante. Les substances non toxiques doivent être testées jusqu'à une dose de 5 g/kg ou, si ce n'est pas possible, à la dose la plus élevée qu'on puisse atteindre. Témoins En général, chaque expérience doit comprendre, parallèlement aux groupes traités, des groupes témoins positifs et négatifs (avec véhicule le cas échéant). Quand on dispose de résultats positifs acceptables à la suite d'expériences réalisées récemment (dans les douze derniers mois) avec des témoins positifs dans le même laboratoire, on peut utiliser ces résultats au lieu de constituer un groupe témoin positif en même temps que les groupes traités. 478 « Toxicologie Génétique : Essai de Mutation Létale Dominante chez le Rongeur » page 5 Les substances témoins positives doivent être utilisées à une dose qui démontre la sensibilité de l'essai. • Exécution de l'essai Des mâles identifiés sont accouplés successivement à des intervalles appropriés prédéterminés avec une ou deux femelles vierges. Les femelles doivent être laissées avec les mâles au moins pendant la durée d'un cycle œstral ou bien jusqu'à ce que l'accouplement ait eu lieu, ce qu'indique la présence de sperme dans le vagin ou la présence d'un bouchon vaginal. Le nombre d'accouplements faisant suite au traitement est régi par le programme de traitement et doit assurer une couverture adéquate de la période de maturation des cellules germinales. Les femelles sont sacrifiées au cours de la seconde moitié de la gestation et le contenu de l'utérus est examiné afin de déterminer le nombre d'embryons implantés ainsi que le nombre d'embryons vivants et morts. Les ovaires peuvent être examinés afin de déterminer le nombre de corps jaunes. 3. R É S U L T A T S E T R A P P O R T • Traitement des résultats Les résultats doivent être présentés sous forme d'un tableau qui indique le nombre de mâles, le nombre de femelles gravides et le nombre de femelles non gravides. Les résultats de chaque accouplement, comprenant l'identité de chaque mâle et de chaque femelle, doivent être mentionnés individuellement. Pour chaque femelle, on doit indiquer l'intervalle d'accouplement, le niveau de la dose reçue par les mâles et le nombre d'embryons implantés vivants et morts. La perte, après implantation, est calculée en déterminant le rapport du nombre d'embryons implantés morts au nombre total d'embryons implantés dans le groupe traité et en le comparant au rapport du nombre d'embryons implantés morts au nombre total d'embryons implantés dans un groupe témoin. La perte avant implantation peut être calculée comme étant la différence entre le nombre 478 page 6 « Toxicologie Génétique : Essai de Mutation Létale Dominante chez le Rongeur » de corps jaunes et le nombre d'embryons implantés ou la réduction du nombre moyen d'embryons implantés par femelle par comparaison avec les accouplements témoins. Quand la perte avant implantation a été évaluée, elle doit être mentionnée. Les résultats sont évalués selon des méthodes statistiques appropriées. Avant de faire des comparaisons entre les groupes traités et les groupes témoins, on doit prendre en compte les différences qui existent entre les animaux à l'intérieur des groupes traités et des groupes témoins. • Evaluation des résultats Il existe plusieurs critères qui permettent de déterminer si un résultat est positif ; l'un d'entre eux consiste en une augmentation liée à la dose et statistiquement significative du nombre des effets létaux dominants. Une substance d'essai est considérée comme non mutagène dans le système étudié si elle n'entraîne pas d'augmentation liée à la dose et statistiquement significative du nombre des effets létaux dominants. Dans l'évaluation, il faut prendre en compte à la fois la signification biologique et statistique. • Rapport Le rapport d'essai doit également contenir les renseignements suivants : – espèce, souche, âge et poids des animaux utilisés, nombre des animaux de chaque sexe dans les groupes traités et témoins – substance d'essai, véhicule utilisé, niveaux des doses et explication du choix des doses, témoins négatifs (véhicule) et positifs – observations expérimentales, comprenant les signes de toxicité – voie et durée d'exposition 478 « Toxicologie Génétique : Essai de Mutation Létale Dominante chez le Rongeur » page 7 – programme d'accouplement – méthodes utilisées pour déterminer si l'accouplement a eu lieu (le cas échéant) – moment du sacrifice – critères permettant d'évaluer les effets létaux dominants – relation dose-réponse, le cas échéant. • Interprétation des résultats Un essai positif de létalité dominante suggère que, pour l'espèce étudiée, la substance chimique étudiée peut se révéler génotoxique pour les cellules germinales du sexe traité. Un résultat négatif suggère que, dans les conditions de l'essai et pour l'espèce étudiée, la substance d'essai peut ne pas être génotoxique pour les cellules germinales du sexe traité. 4. B I B L I O G R A P H I E 1. A.J. Bateman, Handbook of Mutagenicity Test Procedures (edited by B.J. Kilbey et. al.) pp. 235-334, Elsevier, Amsterdam (1977). 2. J.G. Brewen, H.S. Payne, K.P. Jones and R.J. Preston, Mutation Res. 33, 239-250 (1975). 3. Y. Clermont, C.P. Leblond and B. Messier, Arch. Ant. Micr. 48, 37-55 (1959). 4. U.H. Ehling, L. Machemer, E. Buselmaier, D. Dycka, H Frohberg, J. Kratochvilova, R. Lang, D. Lorke, D. Muller, J Pheh, G. Rohrborn, R. Roll, M. Schulze- Schencking and H. Wiemann, Arch. Toxicol. 39, 173-185 (1978). 5. D.A. James and D.M Smith, Mutation Res. 99, 303-314 (1982). 6. W.K. Metcalf and X. Moffatt, J. of Anatomy 103, 410 (1968).
