Microbiologie Alimentaire et Industrielle
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Mémoire DE MAGISTER EN Microbiologie Alimentaire et Industrielle Thème Utilisations des Bactéries Lactiques pour la fabrication d’un Yaourt probiotique à Partir d’un Lait de Brebis Présenté Par: Mme Henni Nassiba Devant le Jury de : Pr. BELKHOUDJA M Président Université d’Oran Pr. CHEKRROUNE A Examinateur Université d’Oran Dr. BEKKADA Examinateur Université de d’Oran Co-Encadreur Université de Mostaganem A Dr. CHERIGEUNE A Pr. BENSOLTANE A Encadreur 2010 - 2011 Université d’Oran 12 isolats de bactéries lactiques ont été isolées et identifiées en se basant sur leur caractéristiques physiologiques et biochimique à partir de 05 échontillons de lait cru de vache collectés de différente région à savoir. Parmi les isolats, 07 appartenaient au genre Streptococcus soit un taux de 58,33% et 05 au genre Lactobacillus soit un taux de 41,67% .Etant donnée que notre étude porte sur les espèces impliquées dans la fabrication de yaourt,les résultats d’isolement et les tests d’identification ont ciblé les deux souches constituant le levain mixte à savoir Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus . Les souches bactériennes ont été identifiées en se basant sur leur profil macroscopique et microscopique ainsi que par le système Api50. Ces souches présentent des propriétés technologiques variables, à savoir un bon pouvoir acidifiant, par la production d’acide lactique, une activité protéolytique et une résistance aux inhibiteurs comme les antibiotiques. L’acidité exprimée en degré dornic °D après24/h de fermentation était de l’ordre de (79°D et 90°D) chez les espèces Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus respectivement. L’activité protéolytique chez les souches lactiques est importante, évaluée entre 8à11mm chez les Streptococcus thermophilus et 15à22 mm pour les Lactobacillus bulgaricus. Le test de l’antibioresistance des souches permet de signaler généralement leurs sensibilités apparentes aux différents antibiotiques utilisés. L’activité antagoniste des souches lactiques spécifiques du yaourt a révélé que ces souches ont un pouvoir d’inhibition vis-à-vis de St. Aureus et Salmonella sp. Les propriétés technologiques de B. animalis sont déterminées par son aptitude à fermenter le lait de brebis et le lait écrémé en culture pure et en culture mixte en association avec Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus. L’évolution des valeurs de pH dans le lait de brebis et le lait écrémé enrichi après 24 heures est caractérisée par une baisse de pH atteignant les valeurs 4.7 et 4.9 dans le lait écrémé enrichi et le lait de brebis respectivement. Inversement, les teneurs en acidité Dornic augmentent et atteignent 72 °D après 24 heures de fermentation dans le lait écrémé enrichi, alors que dans le lait de brebis, la teneur atteinte en fin de fermentation est de 69 °D. La survie de Bifidobacterium animalis dans les produits fermentés en culture mixte, associée avec Lb. delbrueckii subsp bulgaricus et S.thermophilus(Strp) dans le lait reconstitué écrémé et le lait de brebis stocké à 6°C pendant 21jours (0-4h) durée de fermentation et 7-21jours durée de post-acidification) s’est révélée beaucoup mieux en culture mixte qu’en culture pure dans le lait fermenté de brebis. Mots clé : Lait (vache, brebis), yaourt, bactéries lactiques, Bifidobacterium, culture mixte, fermentation, viabilité. 12 strains of lactic bacteria were isolated and indetified on the basis of their physiological and biochemical caracteristics from 5 samples of raw cow’s milk of different regions. 07 isolates belong to Streptococcus (58.33%) and 05 were Lactobacillus (41.67%). Since this study focuses on the species involved in the manufacture of yogurt, results of isolation and identification tests were therefore, targeted both Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus. Results were confirmed by macroscopic, microscopic and system Api50 studies and species. They present different technological properties such as power of acidity caused by lactic acid production, proteolytic activity and inhibitory resistance to antibiotics. This activity was between 8 to 11mm and from 15 to 22mm in Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus respectively. Acidity after 24h of fermentation, expressed in dornic degre (°D), was 79°D and 90°D with Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus respectively. However, their bioresistance tests enable to have an idea about the sensibility to the studied antibiotics. It was noticed that this two strain have an inhibitory activity towards St. Aureus and Salmonella sp. Technological properties of B. animalis were measured by their ability to ferment sheep milk in both pure and mixed culture combination with Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus. Changes in pH values in both sheep milk and skimmed milk enriched after 24 hours were characterized by a decrease to 4.5 and 4.8 respectively. While Dornic acidity levels were increased to 57 ° D after 24 hours of fermentation in skimmed milk enriched, whereas in the sheep milk,t reached at the end of fermentation 69 ° D. Survival of Bifidobacterium animalis in mixed culture fermented products, associated with Lb. delbrueckii subsp bulgaricus and S.thermophilus reconstituted skim milk and sheep milk stored at 6 ° C for 21 days (0-4h) of fermentation and 7 to 21days of postacidification, revealed better in mixed culture than in pure culture in fermented milk of sheep. Keywords : Milk (cow, sheep), Yogurt, lactic bacteria, Bifidobacterium, Mixed culture, fermentation. 5 Strptococcus 07 .)%41,67 Lactobacillus Lactobacillus Streptococcus Streptococcus L’API Système bulgaricus Lactobacillus 24 bulgaricus Lactobacillus thermophilus Streptococcus 11 8 B. animalis 21 12 05 % 58,33 thermophilus (D°90 – D°79 PH °6 Bifidobacterium Remerciements Initialement, ce projet n’aurait pas été réaliser sans la bénédiction du bon dieux qui m’a permis de m’instruire et qui à récompensé mes prière. Au terme de ce modeste travail, je tiens à adresser mes vifs et sincères remerciements et ma profonde reconnaissance au professeur BENSOLTANE Ahmed ; pour son aide, sa patience, sa disponibilité et ses précieux conseils tout le long de mon travail. J’exprime mes respectueux remerciements à Monsieur BELKOUDJA Moulay d’avoir accepté de présider le jury de soutenance. Je remercie Monsieur CHEKROUN Abdallah, d’avoir accepté d’examiner et juger ce travail. Je remercie vivement Monsieur BEKKADA Ahmed de son aide et ses précieux conseils et de m’avoir fait l’honneur de superviser ma thèse et de faire partie du jury. Je tiens à remercier Monsieur CHERIGUNE Abderrahim de sont aide appréciable le long de ce travail. Ma gratitude ira également au personnel du laboratoire régional vétérinaire de Mostaganem pour leur soutien et leur sympathie. Toutes mes remerciements vont également à léquipe de laboratoire de Microbiologie alimentaire et industrielle Es-Senia : Nassima.M ; Mahi.M ; Wafaa.B ; Soria.S.B et Houssin, pour leur encouragements et leur aide. Enfin, Je remercie toute personne qui à contribué de prés ou de loin à l’élaboration de ce modeste travail. Dédicace Je dédie ce travail: A celui qui m’a indiqué la Bonne voie en me rappelant que la volante fait toujours les grands hommes. A mon père A celle qui à attendu avec patience les fruits de sa bonne éducation. A ma mère A mes chère grands parant pour leur prières que dieux leur présente une bonne sante et une longue vie. A mon époux et mes deux filles NOUR et ZOULIKHA POUR leur engagement, les divers sacrifices et leur soutien. A mes frère et sœurs pour leur disponibilité, vous avez toujours su être présents dans les meilleurs moments comme dans les pires. A mes tantes et à mes oncles. A chaque cousines et cousins. A mes amis qui m’ont soutenus et m’encouragée dans les pires moments surtout : Nassima, Noria et son époux Krimou et Saliha TABLE DES MATIERES -Liste des figures -Liste des tableaux -Liste des abréviations -Résumé - Introduction Partie Théoriques Chapitre I : Lait de brebis I – Lait ............................................................................................................................................. 1 I – 1 – Définition ............................................................................................................................ 1 I – 2 – Les caractéristiques .............................................................................................................. 3 I – 2 – 1- Les Caractéristiques physiques et physico – chimiques ................................................. 3 I – 2 –2– Critère nutritionnels ........................................................................................................ 3 I – 2 – 2 – 1 – Le Lactose ................................................................................................................ 4 I – 2 – 2 – 2 – La Matière grasse laitière ......................................................................................... 4 I – 2 – 2 – 3 – La matière azotée ..................................................................................................... 4 I – 2 – 2 – 4 – Les Minéraux .......................................................................................................... 5 I – 2 – 3 – La Flore microbienne naturelle ...................................................................................... 5 I – 2 – 3 – 1 – Le Lait : un aliment fragile ................................................................................... 5 I – 3 – Les Produits laitiers .............................................................................................................. 6 II – Lait de Brebis............................................................................................................................ 6 II - 1 – Définition ........................................................................................................................... 6 2 – Caractéristique du lait de Brebis .............................................................................................. 7 2 – 1 – Composition physico – chimiques du lait de brebis ........................................................... 7 2 – 2 – Protéine ............................................................................................................................... 8 2 – 3 – Les Caséines ....................................................................................................................... 8 2 – 4 – Les Lipides ......................................................................................................................... 9 2 – 5 – Lactose ............................................................................................................................... 9 2 – 6 – Les Citrates ......................................................................................................................... 9 2 – 7 – Le Cholestérol .................................................................................................................... 9 2 – 8 – Minéraux et oligo – éléments ............................................................................................. 9 2 – 9 – Vitamines ........................................................................................................................... 10 3 – Autre caractéristiques ............................................................................................................... 11 -Propriété organoleptiques.................................................................................................... 11 4 – Facteurs intervenants des la qualité du lait de Brebis................................................................ 11 4 – 1 – L’influence des facteurs alimentaires ................................................................................. 11 4 – 2 – L’influence des facteurs non alimentaire ........................................................................... 11 5 – L’importance du lait de Brebis ................................................................................................. 12 Chapitre II : Bactéries lactiques 1 – Introduction .............................................................................................................................. 13 2 – Définition ................................................................................................................................. 13 3 – Origine et habitat ...................................................................................................................... 13 4 – Propriétés générales................................................................................................................... 16 5 – Mode de fermentation .............................................................................................................. 17 5 – 1 – Bactéries homofermentaires ............................................................................................... 17 5 – 2 Bactéries héterofumentaires .............................................................................................. 17 6 – Voie de dégradation .................................................................................................................. 18 7 – Production d’acides lactique .................................................................................................... 18 8 – Classification (Taxonomie) ...................................................................................................... 18 8 – 1 – Classification classique (Taxonomie classique) ................................................................. 18 8 – 1 – 1 – Groupe des homofermentaires ...................................................................................... 19 8 – 1 – 1 – 1 – Thermobacterien ..................................................................................................... 19 8 – 1 – 1 – 2 – Streptobactérium .................................................................................................... 19 8 – 1 – 1 – 3 – Streptococcus .......................................................................................................... 19 8 – 1 – 2 – Groupes des hétéros fermentaires ................................................................................. 19 8 – 1 – 2 – 1 – Bifido bactérium ............................................................................................... 19 8 – 1 – 2 – 2 – Bétabactérium ......................................................................................................... 19 8 – 1 – 2 – 3 – Bétacoccus .............................................................................................................. 19 8 – 2 – Taxonomie moderne ........................................................................................................... 19 - Les différents genres de bactéries lactiques ................................................................................. 20 1 – Streptococcus ........................................................................................................................... 20 2 – Entérocoques ............................................................................................................................ 22 3 – Streptocoque lactiques .............................................................................................................. 22 3 – 1 – Streptocoques, lactiques mésophile du groupe N ................................................................ 22 3 – 1 -1 – Genre lactococcus .......................................................................................................... 22 3 – 1 – 2 – Streptococcus thermophilus .......................................................................................... 25 4 – Genre leuconostoc .................................................................................................................... 25 5 – Genre lactobacillus .................................................................................................................... 26 6 – Genre pediococcus ................................................................................................................. 28 7 – Bifidobacterium ........................................................................................................................ 29 7 – 1 – Définition ........................................................................................................................... 29 7 – 2 – Ecologique des bifidobacteries ........................................................................................... 29 7 – 3 – Taxonomies ........................................................................................................................ 29 7 – 4 – Propriétés phénotypiques ................................................................................................... 31 7 – 5 – Propriétés physiologiques ................................................................................................... 31 7 – 5 – 1 – Température .................................................................................................................. 31 7 – 5 – 2 – Oxygène et anaérobiose ................................................................................................ 31 7 – 5 – 3 – Le PH............................................................................................................................. 32 8 – Métabolisme des Bactéries Lactiques ...................................................................................... 34 8 – 1 – Glucose ............................................................................................................................... 34 8 – 1 – 1 voie homofermentaire ...................................................................................................... 34 8 – 1 – 2 – Voie hétéro fermentaire ................................................................................................ 34 8 – 1 – 3 – Voie des bifidobacterium .............................................................................................. 36 8 – 2 – Galactose ............................................................................................................................ 36 8 – 3 – Lactose ............................................................................................................................... 38 8 – 4 – Métabolisme du citrate et pyruvate et autres substances carbonés ..................................... 40 8 – 5 – Métabolisme des protéines et des acides aminés ................................................................. 40 8 – 6 – Métabolisme des lipides et des enstères ............................................................................. 41 8 – 7- Métabolisme de l’o2 et l’aérobiose ....................................................................................... 41 9 – Principales utilisations des bactéries lactiques en alimentation ............................................... 41 10 – Rôle en technologie agroalimentaire ....................................................................................... 42 11 – Rôles probiotique bénéfiques des bactéries lactiques sur la santé humaine ........................... 46 Chapitre III : Lait fermenté et Yaourt Introduction ..................................................................................................................................... 49 - Différents laits fermentés ............................................................................................................. 50 - Le yaourt ...................................................................................................................................... 53 1- Intérêt nutritionnel des laits fermentés ....................................................................................... 53 2-Effet de la fermentation sur la composition du lait…………………………………… ……… 54 3- L’effet de la fermentation sur la tolérance au lactose ................................................................ 55 4 – Effet sur la flore intestinale ...................................................................................................... 55 5 – Sensibilité aux infections et réponse immunitaire .................................................................... 56 - Levains lactiques .......................................................................................................................... 56 1 – Introduction .............................................................................................................................. 56 2 – Définition ................................................................................................................................. 56 3 – Rôle des levains ........................................................................................................................ 57 4 – Principaux levains lactiques ...................................................................................................... 57 5 – Différents formes de levains ..................................................................................................... 57 6 – Levains spécifiques du yaourt .................................................................................................. 58 6 – 1 Streptococcus thermophilus .................................................................................................. 58 6 – 2 – Lactobacillus bulgariccus ................................................................................................... 58 7 – Habitat ...................................................................................................................................... 58 8 – Symbiose entre streptococcus thermophilus et lactobacillus bulgariccus ................................ 62 9 – Production de polysaccharides ................................................................................................. 67 10 – Production d’arome ................................................................................................................ 67 11 – Production de bactériocine ..................................................................................................... 69 - Technologie de fabrication de yaourt ........................................................................................... 69 1 – Introduction .............................................................................................................................. 69 2 – Historique ................................................................................................................................. 70 3 – Définition ................................................................................................................................. 70 4 – Classification ............................................................................................................................ 71 4 – 1 – Selon le mode de représentation ......................................................................................... 71 4 – 2 – Selon leur teneur en matière grasse .................................................................................... 71 5 – Technologie de fabrication ....................................................................................................... 72 5 – 1 – Préparation de lait ............................................................................................................... 72 5 – 2 – Homogénéisation ................................................................................................................ 72 5 – 3 – Pasteurisation ...................................................................................................................... 73 5 – 3 – Refroidissement .................................................................................................................. 73 5 – 5 – Ensemencement .................................................................................................................. 73 5 – 6 – Conditionnement ................................................................................................................ 74 5 – 7 – Etuvage ................................................................................................................................ 74 5 – 8 - Refroidissement .................................................................................................................. 74 5 – 9 – Conservation ....................................................................................................................... 75 5 – 10 – Accident de fabrication .................................................................................................... 77 5 – 11 – Valeur nutritionnelle de yaourt ......................................................................................... 79 5 – 12 – Caractéristiques diététique du yaourt ............................................................................... 79 Partie pratique Matériels et Méthodes 1-Lieu de l’étude ............................................................................................................................ 80 2-Origine des souches ......................................................................................................... 80 3-Echantillonnage................................................................................................................ 80 4-Milieux de culture ............................................................................................................ 80 5-Méthodes d’isolement ...................................................................................................... 81 5-1 Les dilutions .............................................................................................................................. 81 5-2 Ensemencement et mise en culture .......................................................................................... 81 53 Purification ................................................................................................................................ 83 6 Conservation des souches ............................................................................................................. 83 a-De courte durée ............................................................................................................................ 83 b-Conservation de longue durée ...................................................................................................... 83 7- Pré-identification des isolats de bactéries lactiques .................................................................... 83 7-1 Etude morphologique ................................................................................................................ 83 a-Examen macroscopique ................................................................................................... 83 b-Examen microscopique .................................................................................................... 83 -Coloration de Gram............................................................................................................ 83 c-Recherche de la catalase................................................................................................... 84 72 Tests d’identification, études physiologiques et biochimiques ...................................... 84 a-Test de croissance à différentes températures .............................................................................. 84 b-Croissance en bouillon hyper salé (Na Cl) ..................................................................... 84 c-Croissance à différentes valeurs de pH ........................................................................... 85 d-Croissance dans le lait de Sherman ............................................................................................. 85 e-Détermination du type fermentaire ............................................................................................. 85 f-Hydrolyse de l’arginine (ADH) : ...................................................................................... 85 g-La recherche de citratase ................................................................................................. 86 h-Production d’acétoine (Acétyl-Méthyl-Carbinol) ............................................................ 86 i-Profil fermentaire : métabolisme des substrats carbonés ................................................. 86 8 Identification des bactéries lactiques en utilisant le système API .................................... 87 81 Préparation de l’inoculum ............................................................................................. 87 82 Préparation des galeries ................................................................................................ 87 83 Lecture et interprétation ............................................................................................... 88 9 Caractérisation technologique ..................................................................................................... 88 9-1-Activité protéolytique .............................................................................................................. 88 9-2 Détermination du pH au cours de la fermentation ................................................................... 88 9-3 Détermination de l’acidité titrable ........................................................................................... 88 10 Etude de l’antibiorésistance .......................................................................................... 89 11 Etude des interactions entre bactéries lactiques isolées et les bactéries pathogènes ..... 89 12 Etude des caractères technologiques des bifidobactéries .......................................................... 90 121 La souche de Bifidobacterium ..................................................................................... 90 12-2 Préparation de l’inoculum .......................................................................................... 91 12-2-1 Préparation de lait reconstitué écrémé ................................................................................ 91 12-2-2 Inoculum des Bifidobactérium ............................................................................................ 91 12-2-3 Inoculum des ferments lactiques ......................................................................................... 91 12-3 Etude du pouvoir acidifiant de bifidobacterium en culture pure dans le lait de brebis et le lait reconstitué écrémé ......................................................................................... 91 12-3-1 Détermination de l’acidité titrable .......................................................................... 91 12-3-2Détermination du PH au cours de la fermentation .................................................. 92 12-4Etude des pouvoir acidifiant de bifidobacterium en culture mixte ......................................... 92 12-5Analysephysico-chimique dulait de Brebis.............................................................................. 92 12-5-1 Mesure de l’acidité dornic ................................................................................................. 92 12-5-2 Mesure de pH ...................................................................................................................... 92 12-6Analyse microbiologique ........................................................................................................ 93 Résultats et Discussion -Caractéristique et identification des bactéries lactiques ................................................................ 94 1-Pré-identification des souches ......................................................................................... 94 1-1Caractérisation morphologique .................................................................................................. 94 a)-Aspect macroscopique .................................................................................................... 94 b)-Aspect microscopique .................................................................................................... 94 1-2-Caractérisation physiologique et biochimique ......................................................................... 97 a)-Identification des souches ....................................................................................................... 97 1-3 -Caractérisations technologiques ............................................................................................ 102 a)- Evolution de pH ....................................................................................................................... 102 b) Evolution d’acidité titrable ........................................................................................................ 104 c)Activité protéolytique ...................................................................................................... 105 d) Antibiorésistance ............................................................................................................ 106 e)Interaction bactérienne ................................................................................................................. 107 1-4 Analyse physico-chimique du lait de brebis ............................................................................. 109 2-Aptitude technologique des bifidobactéries ................................................................................ 109 2-1- Étude du pouvoir acidifiant et du pH chez Bifidobacterium en culture pure dans le lait de brebis et dans le lait écrémé enrichie ....................................................................... 109 211 Mesure du pH et l’acidité Dornic de Bifidobactérium dans le lait de brebis et le lait écrémé enrichi ........................................................................................................................ 109 2-2Étude du pouvoir acidifiant de Banimalis en culture mixte avec (L bulgaricus et S thermophilus) dans le lait de brebis et le lait reconstituée écrémé .......................................... 111 2-3Evolution de la flore lactique et des bifidobacterium……………………………………….113 Discussion ....................................................................................................................................... 117 Conclusion………………………………………………………………………………….……. 128 Références bibliographique Annexe Liste des figures Figure 1 : Différents isomères de l’acide lactique .......................................................................... 18 Figure 2 : Diagramme de la classification de Bergey (1986) des bactéries lactiques ..................... 21 Figure 3 : voie homofermentaire et hétérofermentaire des bactéries lactiques ............................... 35 Figure 4:la fermentation du galactose chez lactococcus lactis : les deux voies de Pénétration et les deux types de métabolisme .................................................................. 37 Figure 5 : voie d’utilisation du lactose par les ferments du yaourt ................................................. 39 Figure 6 : Métabolisme complémentaire des Streptococcus thermophilus et des Lactobacillus bulagaricus dans le lait .............................................................. 65 Figure 7: Facteurs stimulants la coopération interéspéce entre Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulagaricus ................................................................. 66 Figure 8 : Voie de conversion de méthionine en acétaldéhyde par Streptococcus Thermophilus .................................................................................. 68 Figure 9: Diagramme de fabrication des yaourts ........................................................................... 76 Figure 10:Schéma récapitulatif des différentes étapes d’isolement des bactéries lactiques ............ 82 Figure 11 : Schéma récapitulatif du test d’interaction .................................................................... 90 Figure 12 : Aspect macroscopique des souches de Streptococcus (St) .......................................... 95 Figure 13 : Aspect microscopique après coloration de Gram de la souche de St ............................ 95 Figure 14 : Aspect macroscopique des souches de Lactobacillus (Lb) ...................................... 96 Figure 15: Aspect microscopique après coloration de Gram de la souche de Lb............................ 96 Figure 16 : Test de lait de Sherman à 01% et 03% Chez les Streptocoques .................................. 97 Figure 17 : Test du type fermentaire des souches isolées ............................................................... 98 Figure 18 : Profil fermentaire de la souche Streptocoque .............................................................. 98 Figure 19 : Profil fermentaire de la souche lactobacille ................................................................. 98 Figure 20 : Test d’hydrolyse d’arginine Témoin ............................................................................. 98 Figure 21 : Test ADH des souches de Streptocoques Steptocoques ............................................... 98 Figure 22 : Test d’ADH de la souche de Lactobacilles ................................................................... 99 Figure 23 : Profil fermentaire (API50CHL) d’une souche de Sth après 48h d’incubation ............ 102 Figure 24 : Profil fermentaire (API50CHL) d’une souche de Lb delbruckii subsp bulgaricus après 48 h d’incubation .................................................................................................................................. 102 Figure 25 : Evolution du pH en fonction du temps chez Streptococus thermophilus ................... 103 Figure 26 : Evolution de l’acidité titrable (°D) en fonction du temps chez S the etLb.................... 104 Figure 27: Zones claires traduisant les activités protéolytiques de S thermophilus ........................ 105 Figure 28 : Antibiogramme de la souche Lactobacillus bulgaricus............................................. 106 Figure 29 : Antibiogramme de la souche Streptococcus thermophiIus ........................................... 106 Figure 30 : Inhibitions obtenues par la méthode de Barefoot (1983) par les souches de S thermophilus contre Saureus (A) et Salmonella sp (B) ................................... 108 Figure 31 : Inhibitions obtenues par la méthode de Barefoot (1983) par les souches de Lbulgaricus contre Saureus (A) et Salmonella sp (B) ......................................... 108 Figure 32 : Observation microscopique des formes (Y, V) de Bidobacterium animalis .............. 109 Figure 33 : Cinétique d’évolution d’acide (D°) et du pH chez le Bifidobacterium Animalis ........................................................................................................................................ 110 Figure 34 : Evolution d’acide lactique (D°) chez les Bifidobactérium en culture mixte................. 112 Figure 35 : Evolution du pH chez les Bifidobactérium en culture mixte ........................................ 113 Figure 36: Evolution de la flore lactique ......................................................................................... 115 Figure 37: Evolution de la flore lactique et des bifidobacterium en souche mixte ......................... 115 Figure 38 : Evolution de la flore lactique et des Bifidobacterium………………………...116 Liste des tableaux Tableau 1 : Principales propriétés physicochimiques du lait .......................................................... 3 Tableau 2 : Composition du lait chez divers mammifères .............................................................. 4 Tableau 3 : Composition minérale moyenne ................................................................................... 5 Tableau 4 : Principaux pays producteurs de lait de brebis ............................................................. 7 Tableau 5 : Caractéristiques physico-chimiques des laits de diverses espèces animales ................ 7 Tableau 6 : Composition moyenne en g/litre et distribution des protéines dans le lait de diverses espèces animales ...................................................................... 8 Tableau 7 : Présente quelques indications sur la composition comparée du lait de brebis, de vache et de chèvre ................................................................................... 9 Tableau 8 : Teneurs en minéraux et en oligo-éléments des laits de diverses espèces Animales................................................................................................................. 10 Tableau 9 : Teneurs en vitamines des laits de diverses espèces animales (mg/litre) ...................... 10 Tableau10 : Milieux d’isolement des bactéries lactiques ............................................................... 15 Tableau 11 : Caractéristiques distinctives des espèces de lactococcus ........................................... 23 Tableau 12 : Caractéristiques conventionnelles distinctives des espèces de Streptocoques lactiques .......................................................................................... 24 Tableau 13 : Principaux caractères des Leuconostoc ................................................................. 26 Tableau 14 : caractéristique de quelques espèces de Lactobacilles................................................. 28 Tableau 15 : Caractéristiques distinctives du genre Bifidobacterium ............................................. 33 Tableau 16: Différentes utilisations des bactéries lactiques en alimentation .................................. 42 Tableau 17 : Quelques caractéristiques des bactéries lactiques utilisées dans les produits laitiers ......................................................................................................................... 45 Tableau 18 : les caractères physiologiques et biochimiques de Sth ............................................... 59 Tableau 19 : Les caractères physiologiques et biochimiques des Lactobacilles ............................ 61 Tableau 20 : le profil fermentaire de Streptococcus thermophilus ............................................... 64 Tableau 21 : Milieux utilisés et conditions d’incubation pour l’isolement des BL ........... 81 Tableau 22 : Fiche technique des différentes souches utilisées....................................................... 92 Tableau 23 : Résultats des observations morphologiques des bactéries lactiques .......................... 94 Tableau 24 : Récapitulatif des Caractères physiologiques et biochimiques des souches .............. 99 Tableau 25 : Profils fermentaires des Lactobacilles et des Streptocoques .......................... 100 Tableau 26: Evolution du pH des souches lactiques isolées ........................................................... 103 Tableau 27 : Evolution de l’acidité titrable (°D) des souches lactiques ......................................... 104 Tableau 28: Activité protéolytique des espèces lactiques sur milieu YMK ................................... 105 Tableau 29 :Evaluation de la sensibilité des souches vis-à-vis des antibiotiques utilisés .............. 106 Tableau 30: Caractéristiques physicochimiques du lait de brebis pasteurisé .................................. 109 Tableau 31 : Résultats du pH et de l’acidité de Bifidobacterium animalis ..................................... 110 Tableau32: Evolution du pH et du pouvoir acidifiant de Bifidobactérium en culture mixte112 Tableau 33: Evolution de la flore lactique et des bifidobacterium (N104) ...................................... 114 Liste des abréviations C° : Dégré Celsius D° : Dégré dornic Mg : milligramme T : temps Mn: minute h: heure p: poids Lab: lactic acid bacteria FIL: fédération international du lait UFC : unité formant colonies Strp: Streptococcus theromphilus Lb: Lactobacilus delbrueckii ssp bulgaricus PH: potentiel d’hydrogène ml : millilitre Introduction Générale En Algérie, une quantité considérable du lait de transformation est récoltée, sert à la fabrication de produits laitiers, comme les fromages, les yaourts et laits fermentés, mais une meilleure connaissance des bactéries lactiques permettrait de créer ces produits. C’est bien connu, les Algérien en général, comme tout d’ailleurs aux quatre coins du monde, sont des grands consommateurs ; mais peu d’entre eux ont conscience de la richesse qui peut apporter ces produits laitiers fermentés et dérives ; ce sont des aliments très riches en principaux composants (glucides, protéines et lipides) essentiels en alimentation humaine. Les bactéries lactiques qui sont au cœur de se résultat, sont largement impliquées dans la fabrication de produits laitiers fermentés, tel que le yaourt, qui est obtenu par l’action des deux bactéries spécifiques à savoir : Streptococcus termophilus et Lactobacillus bulgaricus qui doivent être ensemencées simultanément et se trouver vivantes dans le produit fini, à raison d'au moins 10 millions de bactéries par gramme, à la date limite de consommation (Codex Stan 243-2003),et interviennent à bien des niveaux , par leur métabolisme et leur activité enzymatique variée, elles déterminent dans une large mesure l’arôme, la saveur et la texture des produits. De plus, les bactéries lactiques jouent également un rôle essentiel dans la conservation et l’innocuité de ces aliments, par la production des acides organiques et d’autres composés antimicrobiens, comme les bactériocines qui inhibent la croissance des germes pathogènes ou de contamination. On sait aussi que la transformation du lactose par les ferments lactiques et l’activité de leurs enzymes hydrolytiques améliore la digestibilité des principaux composants constitutifs des produits. Par tout, la fermentation du lait sous l’action des ferments lactiques explique l’excellente réputation des laits fermentés qui en apportant les ingrédients du lait naturel, du calcium et des protéines, des lipides, glucides, ainsi des vitamines de groupe A, B2 et B12 et une bonne conservation, On trouve d’autres types de laits fermentés, entre autres les bio-yoghourts qui sont des laits fermentés à base du lait de vache ou de chèvre ou de brebis ou d’autres laits selon les régions, fermentes par des bifidobactéries ou /et par les lactobacilles (Lb. acidophilus, Lb.casei), souvent en association avec les ferments du yaourt qu’ils lui donnent une saveur assez douce. Ce type de lait fermenté est dans la catégorie des produits probiotiques (GulerAkin et Akin ,2007). Les probiotiques sont des microorganismes vivants, qui lorsqu’ils sont consommés en quantités adéquates, ont un effet bénéfique sur la santé de l’hôte (Guarner et Schaafsma, 1998). En alimentation humaine, les genres microbiens les plus utilisés comme probiotiques sont Lactobacillus, Bifidobacterium et Streptococcus (Holzapfel et al, 1998 ; Mercenier et al, 2003) Les bifidobactéries sont des habitants naturels de la flore intestinale humaine. Ces microorganismes sont les bactéries intestinales majeures chez les bébés nourris au lait maternel (Rasic et Kurmann ,1983). Les bifidobactéries sont des bactéries probiotiques exerçant différents effets bénéfiques sur la santé de l’hôte. En effet, parmi ces effets, on note le contrôle de la flore intestinale et l’inhibition de la croissance de nombreux pathogènes et bactéries purifiantes (Shah, 1999 ;Gopal et al., 2001), la régulation du transit intestinal, l’amélioration de l’intolérance au lactose (DeVrese et al. , 2001) et des allergies alimentaires (Isolauri et al., 2000), certaines propriétés anti-cancérigènes (Yoon et al., 2000) et anti-diarrhéiques (Shah, 2006), ainsi qu’une stimulation du système immunitaire (Heyman et Heuvelin, 2006). Les atouts nutritionnels et thérapeutiques combinés du lait de brebis et des bactéries probiotique nous ont conduit à l’idée d’élaborér un lait fermenté probiotique (bio-yoghourt) dont l’objectif de ce travail expérimental consiste à étudier les caractéristiques microbiologiques et biotechnologiques correspondantes à la flore spécifique pour la fabrication d’un lait fermenté type yaourt (Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgariccus) combiné avec un probiotique (Bifidobactérium). Chapitre I Lait de Brebis I- Le lait : I-1-Définition : Le lait est le produit élaboré par les glandes mammaires des femelles de mammifères après la naissance du jeune (FAO, 1998). C’est le produit intégral de la traite totale et interrompue d’une femelle laitière bien portante, bien nourrie et non surmené. Il doit être recueilli proprement et ne doit contenir de colostrum (Hoden et coulon, 1991). Aussi selon la définition adoptée par le 1er congrès international pour la répression des fraudes alimentaires en 1908 (Roger Veisseyre-Grignon, 1975).Il ne doit être en outre collecté dans de bonnes conditions hygiéniques et présenter toutes les garanties sanitaires. (Romain et al ; 2008). Le décret du 25 mars 1924, dans son article premier précise : la dénomination « LAIT » sans indication de l’espèce animale de provenance était réservée au lait de vache. Tout lait provenant d’une femelle laitière autre que la vache doit être désigné par la dénomination « LAIT » suivie de l’indication de l’espèce animale dont il provient : « lait de chèvre »,…etc. Aujourd’hui la réglementation européenne a aussi défini la dénomination « LAIT ». Le règlement (C.E.E) n° 1989/87 du conseil du 2 juillet 1987 précise que ce terme « est réservé exclusivement au produit de la sécrétion mammaire normale obtenu par une ou plusieurs traites sans aucune addition ou soustraction ». Le lait est un liquide opaque blanc mat, légèrement bleuté ou plus ou moins jaunâtre, deux fois plus visqueux que l’eau, de saveur légèrement sucrée et d’odeur peu accentuée, sécrété après parturition par glande mammaire des animaux mammifères (Marcel et al ; 2002) L’Algérie est le premier consommateur de lait au Maghreb, avec un marché annuel estimé à 107 milliards de litres ; dont 60% provient de l’élevage bovin, 26% de lait de brebis et 13% de lait de chèvre. La production laitière cameline n’est pas prise en compte. Un taux de croissance de 8% et une consommation moyenne de l’ordre de 100 à 110/habitant/an. Cette consommation augmente encore régulièrement et devrait atteindre au moins 115 litres par habitant et par an en 2010. Le volume de la collecte a néanmoins régressé de manières significatives (18%) pour atteindre le niveau de 107 millions de litres, soit un taux de collecte de 10%, selon des statistiques du ministère de l’agriculture et du développement rural. 1 Chapitre I Lait de Brebis En effet, ce qu’il faut savoir c’est que l’industrie laitière algérienne se distingue par un marché en croissance constante, due à une forte demande qui s’explique aussi par la croissance démographique estimée à 1.6% par an, l’urbanisation et l’amélioration du pouvoir d’achat du citoyen qui recourt de plus en plus à la consommation du lait. Par ailleurs, la consommation des produits dérivés (leben, yaourt et fromage, glaces), croit aussi fortement grâce ç la qualité des produits et à la stabilité des prix sur le marché, mais aussi la diversité de la production. En outre, et dans le même sens, la distribution et la couverture des besoins sont assurées par trois sources : primo le lait cru local essentiellement autoconsommé ou distribué par le secteur informel et artisanal, secundo, le lait pasteurisé recombiné en sachet polypropylène, base de la consommation des ménages urbains, tertio, le lait transformé et conditionné sous emballage divers (bouteille, UHT), de longue conservation.(Le Maghreb,18-08-2008). Le lait peut être commercialisé en l’état frais mais le plus souvent après avoir subi des traitements de standardisation lipidique et d’épuration microbienne pour limiter les risques hygiéniques et assurer une plus longue conservation. L’évolution des processus technologiques, des techniques de conservation et de distribution a permis l’élaboration d’une large gamme de lait de consommation qui se distingue par leur composition, leur qualité nutritionnelle et organoleptique et leur durée de conservation. Les laits destinés à la consommation humaine peuvent être classés actuellement en deux catégories : 1-Lait non traité thermiquement : lait cru ou micro filtré. 2- Lait thermiquement pasteurisé ou stérilisé. Ces laits ne subissent que des traitements physiques tels que la standardisation en matière grasse et/ou protéines, minéraux et vitamines, l’homogénéisation pour éviter le problème de crémage, le chauffage pour détruire tout ou partie de la flore ou la microfiltration pour réduire la charge microbienne. Le lait et les produits laitières pouvant contenir des micro-organismes pathogènes pour l’homme peuvent être des agents de transmission de maladies contagieuses. Les germes contenus dans le lait peuvent être à l’origine de toxi-infections alimentaires en infectant l’organisme des consommateurs, le lait peut ainsi être le vecteur de Mycobactrium tuberculosis, Brucelle abortus, Corynebacterium diphteriae, Salmonella, Streptocoques du groupe A, ou encore des virus de la poliomyélite. 2 Chapitre I Lait de Brebis En pratique, le lait est rarement à l’origine de toxine infections alimentaires de par la surveillance sanitaire des animaux et les mesures d’hygiène au niveau de la traite. Les micro-organismes qui s’y développent préférentiellement sont les bactéries lactiques qui transforment le lactose en acide lactique, le lait non traité thermiquement contient des substances inhibitrices contre certains germes pathogènes (Guiraud, 1988). I-2 Les caractéristiques : I-2-1 les caractèristiqueses physiques et physico-chimiques : Le lait constitue un édifice et physico-chimique très complexe dont la connaissance parfaite est indispensable à quiconque désire comprendre les principes du traitement et de la transformation du produit (Roger Veisseyre-Grignon, 1975) (Tableau N°01) Tableau01 : Principales propriétés physicochimiques du lait. (Adapté d’après Fox et Mc SWEENEY, 1998). Pression osmotique Activité de l’eau Point d’ébullition Point de congélation Indice de réfraction Masse volumique (à 20°C) Conductivité spécifique Force ionique Tension inter faciale (à 20°C) Viscosité (lait non homogénéisé) Conductibilité thermique (à 20°C) (lait à 3% de matière grasse) Diffusivité thermique (15-20°C) Chaleur spécifique pH (à 20°C) Acidité titrable Coefficient d’expansion thermique (273K-333K) Potentiel oxydoréduction (20°C, pH6, 6 et en équilibre avec l’air). 700.103 pas 0.993 100,15°C -0.53°C 1,3440-1,3485 1030Kg.m-3 0,0050ohm-1.cm-1 0.08M 47-53N.m-1 2,0.10-3 0,56w.m-1.K-1 1,25.10-7m.s-1 3900j.Kg-1.K-1 6,6-6,8 15-17°D 0,0008m3.m-3K-1 +0,25à+035V I-2-2 Critères nutritionnels : Le lait contient tous les éléments nutritifs nécessaires à la croissance du jeune mammifère. Exemple : un litre de lait d’origine bovine contient 50g de lactose, 32g de protéine et 40g de matière grasse. Le potentiel énergétique d’un litre est respectivement de 2720 Kj et 1460Kj suivant qu’il est entier, demi écrémé ou écrémé. 3 Chapitre I Lait de Brebis Le lait n’est cependant un aliment complet, car carencé en fer et acides aminés soufrés (méthionines, cystéine) (Roman et al ; 2008) La composition moyenne du lait est différenciée selon les espèces et les races des animaux mammifères, et son état physiologiques (stade de lactation, gestation, à son état sanitaire et à la conduite du troupeau. (Thomas et al ; 2008) (Tableau N°2) Tableau N°2 : Composition du lait chez divers mammifères (en g/l). Lait maternel Vache Chèvre Brebis Composition moyenne du lait en g/l Protéines Eau Extra Matière Totales caséines it sec grasse (MS) 905 117 35 12-14 10-12 albumines 900 900 860 130 140 190 35-40 40-45 70-75 30-35 35-40 55-60 27-30 30-35 45-50 (FAO, 1998) Glucides Lactose Matières minérales 4-6 65-70 3 3-4 6-8 8-10 45-50 40-45 40-45 8-10 8-10 10-12 I-2-2-1 Le lactose : Le lactose est le constituant majeur de la matière sèche du lait, sa concentration est relativement constante et peu sujette aux variations saisonnières. Le lactose a un pouvoir sucrant faible ; six fois moins élevé que celui du saccharose il a un rôle dans l’élaboration du système nerveux, et est hydrolysé en glucose et galactose par la lactase. (Romain et al ; 2008) I-2-2-2 La matière grasse laitière : La matière grasse se trouve dans le lait sous la forme d’une émulsion de petits globules sphériques ou légèrement ovoïdes, dont le diamètre varie de 2 à 10 µm selon l’espèce et la race (Roger Veisseyre-Grignon, 1975 ; Thomas et al ; 2008) I-2-2-3 La matière azotée : Les protéines 95% de l’azote du lait offrent une extrême complexité (Adrian, 1973). La matière azoté se compose en protéine vraies 94 - 95% et azote non protéique 5 - 6 %. Les protéines vraies, insolubles dans uns solution de l’acide trichloracétique à 12%, elles sont composées de caséines pour 77 à 78 % et de protéines du lactosérum pour 17 à 18 % ces dernières sont des protéines solubles. L’azote non protéique soluble dans l’acide trichloracétique peut atteindre 9/10% en fonction du type d’alimentation de la vache, cette fraction non négligeable, au plan technologique est composée d’urée pour environ la moitié, le reste étant petites molécules 4 Chapitre I Lait de Brebis azotées dont des acides aminés libres, des peptides, des bases organiques (François et al ; 2005) I-2-2-4 Les minéraux : La fraction mineur est de 7% de matière sèche, les minéraux du lait ont un rôle important tant au plan physicochimique que technologique et nutritionnelle, ils participent à l’organisation micellaire des caséines, ils conditionnent un certain nombre de propriétés du lait et tout particulièrement son aptitude à l’élaboration d’une très grande diversité de textures fromagères (Thomas et al ; 2008) (Tableau N°3). Tableau N°3 : Composition minérale moyenne (Thomas et al ; 2008) Calcium Phosphore Potassium Sodium Chlore Magnésium Rapport Ca/p Lait de vache 1200 920 1500 450 1100 110 1.3 Lait de chèvre 1260 970 1900 380 1600 130 1.3 Lait de brebis 1950 1500 1400 460 1100 180 1.3 Lait humain 320 150 550 200 450 40 2.1 I-2-3 La flore microbienne naturelle : Le lait contient peu de micro-organisme lorsqu’il est prélevé dans de bonne conditions a partir d’un animale sain (moins de 103 germes/ml),il s’agit essentiellement de germes saprophytes du pis et des canaux galactophores, les streptocoques lactiques (Lactococcus et Lactobacilles). Le lait cru est protégé contre les bactéries par lacténines (active durant 1 h). (Guiraud, 1998). I-2-3-1 Le lait ; un aliment fragile : Le lait est un aliment dont la durée de vie est très limitée. En effet, son pH, voisin de la neutralité, le rend très facilement altérable par les micro-organismes et les enzymes. Sa richesse et sa fragilité en font un milieu idéal ou de nombreux micro-organismes comme les moisissures, les levures et les bactéries se reproduisent très vite. Ses vitamines et ses matières grasses peuvent se transformer sous l’influence de la lumière, de l’oxygène. Il est déconseillé de boire du lait non bouilli, ou chauffé à température insuffisamment élevée, et de manger des produits réalisés avec ce type de lait car ils peuvent contenir des agents pathogènes, responsables de maladies telle que la brucellose. 5 Chapitre I Lait de Brebis Les bactéries présentes dans le lait caillé : le l’ben, le yaourt, les fromages augmentent la qualité d’acide lactique du lait en lui donnant un gout aigrelet (parfois recherché). Cette acidification du lait frais, provoque une coagulation spontanée caillage ; le lait ainsi caillé est souvent consommé tel quel. L’augmentation d’acidité empêche un certain temps la prolifération d’autres bactéries nocives (Encyclopédie de L’agora, 1994) I-3 Les produits laitiers : Les produits dérivés exclusivement du lait concernent des produits dont la date limite de consommation est inférieure ou égale à 30 jours (avis de 1988 du centre national de la consommation sur l’utilisation du terme frais). Ils sont fabriqués principalement à base de lait de vache (Malek et al ; 2001) au quel peuvent être ajoutés d’autres ingrédients laitiers ou non (François et al ; 2005) ; ils regroupent : Laits de boissons : lait cru, laits traités thermiquement (lait pasteurisé conditionné et lait de longue conservation), laits concentrés (lait concentré non sucré et lait concentré sucré) et lait spéciaux (infantiles, supplémentés, modifiés, biologie et boissons lactées). Laits fermentés : yaourt, crème dessert frais et les fromages frais. Beurre. Glaces et crèmes glacées. (Michel et al ; 2000) II-Lait de brebis : 1- Définition : Le lait de brebis a été toujours considéré comme un lait ayant des caractéristiques spécifiques et, dans certains cas, comme étant un produit plus noble que les autres laits. (Luquet, 1986) Comme pour les autres ruminants laitiers, la production et la composition du lait des brebis laitières sont principalement conditionnées par les facteurs génériques, le stade de lactation, le système de traite et l’aliment. (Luquet, 1986) Ce type de lait a des caractéristiques différentes que les autres laits, grâce à sa forte viscosité impliquant sa richesse. Comme il présente une opacité blanche plus marquée que celle des laits de vache et de chèvre et il est particulièrement riche en composants fromagers. On prépare en moyenne deux fois plus de fromage avec du lait de brebis qu’avec du lait de vache (Luquet, 1986). 6 Chapitre I Lait de Brebis La production de lait de brebis est concentrée dans les pays où la production de lait de vache est limitée, mais elle concerne également des pays de grande tradition fromagère comme la France (Tableau N°4). Par ses caractéristiques, le lait de brebis présente de grandes similitudes avec le lait de chèvre ; il est donc très différent du lait humain. (Koroleva ; 1988) Tableau N°4 : Principaux pays producteurs de lait de brebis (FAO, 1990). Pays producteurs de lait de brebis France Turquie Iran Grèce Italie Chine Monde Production laitière (milliers de tonnes) 1080 893 735 650 628 575 8470 2-Caractéristiques du lait de brebis : 2-1 Compositions physico-chimiques du lait de brebis : Selon le tableau 05, la densité du lait de brebis ainsi que celle des races de chèvre à lait gras est plus élevée que celle du lait de vache. De même la viscosité du lait de brebis est élevée. L’apport en énergie d’un litre de lait différencié les espèces animales considérés et est susceptible de large variation à l’intérieur d’une même espèce. Cela étant bien entendu, lié à la teneur en lipides du lait. L’apport énergétique est en moyen 1100 Kcal/litre pour le lait de brebis et plus faible pour celui de chèvre (FAO, 1995) Tableau N°5 : Caractéristiques physico-chimiques des laits de diverses espèces animales. (FAO, 1998) (Kurdjian et Gabrielian, 1962 ; Juarez et Ramos, 1986 ; Haenlein et Wendorff, 2006). Constante Energie (Kcal/lite) Densité du lait entier à 20°C Point de congélation (°C) pH-20°C Acidité titrable (°Dornic) Tension superficielle du lait entier à 15°C (dynes cm) Conductivité électriques à 25°C (siemens) Indice de réfraction Viscosité du lait entier à 20°C (centipoises) Vache 705 1.028-1.033 0.520-0.550 6.60-6.80 15-17 50 Chèvre 600-750 1.027-1.035 -0.550- -0.583 6.45-6.60 14-18 52 Brebis 1100 1.034-1.039 -0.570 6.50-6.85 22-25 45-49 45 10-4 43-56 10-4 38 10-4 1.45-1.46 2.0-2.2 1.35-1.46 1.8-1.9 1.33-1.40 2.86-3.93 7 Chapitre I Lait de Brebis 2-2 Protéines : Le lait de brebis est plus riche en protéines que les autres laits ; en particulier, il contient beaucoup d’α-caséine. On trouve d’avantage de phosphore et de calcium dans la phase colloïdale, autant dans la phase soluble que dans le lait de vache. Ces différences impriment à ces laits des caractéristiques différentes de coagulation : le lait de brebis coagule plus vite et donne un coagulum plus ferme que le lait de vache. C’est pourquoi il est très utilisé en fromagerie (Chillirad et bocquier, 1993). La richesse du lait de brebis en protéines sériques est surtout marquée par une teneur élevée de la béta-lactoglobuline et des immunoglobulines (Tableau06). L’azote non protéique (de 6 à 8 pour cent de l’azote total) est distribué un peu différemment de celui du lait de vache : plus d’urée et d’acide urique et moins d’acides aminés libres. L’apport en énergie d’un litre est lié à la teneur en lipides du lait. L’apport énergétique du lait de brebis de 1100 Kcal/litre (FAO, 1998). Tableau N°06 : Composition moyenne en g/litre et distribution des protéines dans le lait de diverses espèces animales (FAO, 1998). Protéine α-lactabumine β-lactoglobuline Albumine sérique Immunoglobulines Protéose-peptone Total des protéines solubles (100%) Vache 1.5 (45%) 2.7 (25%) 0.3 (5%) 0.7 (12%) 0.8 (13%) 6.0 (100%) Chèvre 2.0 (25%) 4.4 (55%) 0.6 (7%) 0.5 (6%) 0.6 (7%) 8.10 (100%) Brebis 1.3 (10%) 8.4 (67%) 0.6 (5%) 2.3 (18%) 12.6 (100%) Caséine α-S Caséine β Caséine Ќ Caséine γ Total des caséines (100%) 12.0 (46%) 9.0 (36%) 3.5 (13%) 1.5 (6%) 26.0 (100%) / / / / 26.0 (100%) 21.0 (47%) 16.1 (36%) 4.5 (10%) 3.0 (6%) 44.6 (100%) Protides totaux 32.0 34.1 57.2 2-3 Les caséines : La caséine est un complexe protéinique instable à l’état natif, elle est combinée à des sels de calcium. Le lait de brebis coagule plus vite, et donne un coagulum plus ferme que le lait de vache, c’est pourquoi il est utilisé en fromagerie (FAO, 1995). 8 Chapitre I Lait de Brebis 2-4 Les lipides : Le lait de brebis est nettement plus riche en lipides que le lait de vache. La matière grasse subit les plus grandes amplitudes de variation et elle présente certaines constantes physiques et chimiques qui permettent de la caractériser (Luquet, 1986). 2-5 Lactose : Il fait partie du 3ème groupe d’éléments quantitativement important dans le lait de brebis, on le trouve d’un taux moyen se situant entre 45 et 50 au Kg (FAO, 1995). 2-6 Les citrates : Tableau N°7 : Présente quelques indications sur la composition comparée du lait de brebis, de vache et de chèvre. Espèce Vache Chèvre Brebis Moyenne g/Kg 1.7000 1.100 2.000 Extrème g/Kg 0.9 – 2.00 0.4 – 1.40 1.6 – 3.00 On remarque que : les taux moyens observés en lait de brebis sont un peu plus élevés que pour les autres laits. 2-7 Le cholestérol : Sa teneur évaluant avec la richesse en matière grasse des laits. Il est limité dans le lait de brebis. Les valeurs extrêmes relevées à Roquefort vont de 15 à 30 mg pour ml de lait (Leveau ; Bouix et Deroissart, 1991). 2-8 Minéraux et oligo-éléments : Dans le lait de brebis. On trouve d’avantage de calcium d’une grande teneur. Le tableau 08 regroupe les données concernant ces éléments, la teneur élevée du chlore dans le lait de chèvre (elle est à l’origine d’acides hyper-chlorémiques observées chez les nourrissons exclusivement alimentés au lait de chèvre), ainsi que la teneur élevée en calcium du lait de brebis. 9 Chapitre I Lait de Brebis Tableau N°8 : Teneurs en minéraux et en oligo-éléments des laits de diverses espèces animales (mg/litre) (FAO ; 1995) Vache Chèvre Brebis 0.37 1.55 1.35 0.14 0.92 2.20 1.10 0.42 1.50 2.0 0.18 1.18 1.08 Minéraux Sodium Potassium Calcium Magnésium Phosphore Chlore Acide citrique 0.50 1.50 1.25 0.12 0.95 1.00 1.80 Vache Fer Cuivre Zinc Manganèse Molybdène Aluminium Iode Chèvre Oligo-éléments 0.20 – 0.50 0.55 0.10 – 0.40 0.40 3–6 3.20 0.010 – 0.030 0.06 0.070 / 0.6 – 1 / / / Brebis 0.2 – 1.5 0.3 -1.76 1 -10 0.08 – 0.36 / / / Notes : Les valeurs exprimées sont des valeurs moyennes ou dans quelques cas des valeurs extrêmes. Le signe / indique que les données font défaut ou sont sujettes à caution. 2-9 Vitamines : Il convient de remarquer la richesse du lait de brebis dans presque toutes les vitamines, par rapport au lait de vache (FAO, 1998). Tableau N°9 : Teneurs en vitamines des laits de diverses espèces animales (mg/litre). Vitamines B1 B2 B6 B12 Acide nicotinique Acide folique C A β-carotènes Vache 0.42 1.72 0.48 0.0045 0.92 0.053 18 0.37 0.21 10 Chèvre 0.41 1.38 0.60 0.0008 3.28 0.006 4.20 0.24 <0.10 Brebis 0.85 3.30 0.75 0.006 4.28 0.006 47.0 0.83 0.02 Chapitre I Lait de Brebis 3-Autres caractéristiques : Le lait de brebis se distingue du lait de vache et de chèvre par des traits caractéristiques, les uns sont directement observables, les autres liés à ses particularités physicochimiques. A l’observation visuelle, il est d’une couleur blanche nacré ou porcelaine et représente une opacité blanche plus marquée que celle des autres laits (Luquet et al ; 1985). Propriétés organoleptiques : Le lait de brebis est un liquide jaunâtre (très riche en crème) ; dans l’état normal ; son gout est agréable, aromatique et douceâtre, avec une saveur caractéristique, il peut aussi prendre un gout légèrement salé au fur et à mesure de l’avancement de la lactation du fait de l’augmentation du taux de chlorure. L’odeur est agréable quant il est frais et piquant après coagulation. Le lait normal présente donc des propriétés organoleptiques propres pouvant se modifier sous l’influence d’un certains nombre de facteurs. Les modifications de ces propriétés se font généralement dans le sens d’une dépréciation de la qualité du lait (Boudhaim, 2002). 1- Facteurs intervenants dans la qualité du lait de brebis : 4-1 L’influence des facteurs alimentaires : Les teneurs en nutriments des différents laits sont susceptibles de variations, liées par exemple à la durée de la lactation ou à l’alimentation (type de fourrage utilisé) (BOCQUIR et al ; 1995). Variabilité des facteurs interindividuelle : L’influence propre de chacun des paramètres de variabilité est difficile à identifier. Ce sont les facteurs raciaux, liés aux effets de la sélection, et les facteurs alimentaires qui ont les conséquences les plus importantes sur le lait au plan nutritionnel, technologique et économique (FAO, 1998). 4-2 L’influence des facteurs non alimentaires : Des fluctuations notables subsistent qui sont sous la dépendance de facteurs d’ordre génétique (race) physiologique (nombre de vêlages, époque de lactation, moment de la traite), et zootechnique (mode de traite, fourrage) et, enfin, climatique. Le type d’aliments fournis à la brebis, influence fortement la composition de son lait (Blanc, 1981). D’une façon générales, il est toujours économiquement préférable de réduire le plus possible les variations de composition qualitatives, ce qui justifie un ensemble de pratiques (régularisation des vêlages et de l’alimentation, sélection des races, mélange des laits et incitations économiques) (Murata et Zabik, 1977 ; Luquet et al ; 1979). 11 Chapitre I Lait de Brebis 2- L’importance du lait de brebis : Les productions réalisées à partir de lait de brebis montrent une qualité microbiologique particulièrement élevée. Les prélèvements effectués dans les unités de production fournissent une qualité moyenne supérieure par rapport aux fromages prélevés dans le circuit de distribution (Vivegnis et al ; 1998). Le lait est adapté aux besoins et à la croissance du petit, soit les comportements alimentaires innés ou les réserves propres pallient les carences nutritives du lait (FAO, 1998). Par comparaison, il est possible d’en déduire la valeur d’un lait animal en nutrition humaine. Cette conformation reste très théorique (des moyennes sont comparées entre elles) et est, de plus, entachée d’erreurs, car le taux d’un nutriment dans le lait ne présume pas de sa biodisponibilité : certains minéraux sont plus ou moins fortement liés à des protéines porteuses. Ces comparaisons permettent surtout de suspecter des insuffisances dans les laits animaux (acides gras essentiels, vitamines oligo-éléments) (OMS, 1987). Le lait représente l’aliment idéal pour le jeune de l’espèce, mais pour un temps limité et dans certaines conditions seulement d’état des réserves initiales, de comportement, de milieu de vie. Son intérêt nutritif se retreint encore s’il est destiné aux membres d’une autre espèce. C’est sur ces lacunes que doit porter l’attention en nutrition humaine, non pas pour déprécier les autres laits, mais pour les utiliser avec discernement (FAO, 1998). 12 Chapitre II Bactéries Lactiques 1. Introduction : Depuis l’aube de l’humanité, les bactéries lactiques sont employées pour la fabrication et la conservation des aliments. L’essor de ces germes a commencé il y’a 65 millions d’années, il s’est accentué lorsque l’homme est passé du statut de chasseur cueilleur à celui d’éleveur ou il a tenté de contrôler le phénomène d caillage du lait par le biais des micro-organismes qui dégrade le lactose pour donner l’acide lactique Ces bactéries ubiquistes sont aptes à se développer sur différents substrats autres que le lait, étaient donc probablement présents bien avant la naissance de l’homme et les mammifères. Aujourd’hui, les bactéries lactiques sont utilisées dans un grand choix de laitages fermentés à commencer par le kéfir jusqu’au yaourt, elles ne se réduisent pas uniquement à leur importance économique mais aussi au rôle important qu’elles jouent dans l’entretien et l’amélioration de la santé humaine. 2. Définition : Les bactéries lactiques sont des micro-organismes hétérogènes, selon leur morphologie, leur structure, leur physiologie et leur nutrition. Ce sont des cellules vivantes, procaryotes et chimio-organotrophes. (De Roissart, 1986) Ce sont des bactéries de fermentation alimentaire, gram (+), anaérobies caractérisées par leur faculté de synthétiser de l’ATP grâce à la fermentation lactique des glucides. (Luquet, 1986) Les bactéries lactiques sont dépourvues de cytochromes et par conséquent inaptes à toute respiration aérobie ou anaérobie. Ce sont des bactéries anaérobies facultatives, capables de fermentation en aérobiose comme en anaérobiose (Leveau et Bouix, 1996) Micro aérophiles et relativement aérotolérantes. Elles sont également mésophiles ou thermophiles, selon que leur température optimale de croissance soit respectivement voisine de 30°C ou 40°C. (Desmazeaud et De Roissart ; 1994) 3. Origine et Habitat : La découverte de leur action sur le lait fut probablement accidentelle mais leur utilisation fut perpétuée sous forme de levains. Les bactéries et autres micro-organismes responsables de la transformation étaient évidemment inconnus des utilisateurs et la réussite de ces opérations soumise à fluctuations et erreurs. (Stiles et Holzapfel, 1997) 13 Chapitre II Bactéries Lactiques Grâce à leur souplesse d’adaptation physiologique, elles sont présentes dans plusieurs milieux riches en principaux nutriments à savoir (produits laitiers, carnés de pèches et végétaux). (Desmazeaud, 1992) Très souvent les bactéries lactiques n’interviennent pas seules, mais associes à d’autres fermentations lors des hydrolyses enzymatiques, voire des réactions purement chimiques (Tableau N°10) Mais certaines espèces semblent être adaptées à un environnement spécifique et ne semblent guère se retrouver ailleurs que dans leur habitat naturel (Deroissart ,1986 ; Luquet, 1994 et Bourgoies, 1996). Les espèces du genre Lactococcus, Streptocuccus, Leuconostoc se rencontrent surtout chez les hommes, animaux, oiseaux ou dans la peau des animaux et des matières fécales. (Hermier et al, 1992 ; Deroissart et Luquet, 1994) Par contre les espèces du genre Pediococcus ne se rencontrent que sur les plantes. (Lenoir et Hermier ,1992) Par ailleurs, les espèces du genre Lactobacillus sont plus répandues dans la nature, elles se trouvent associées aux plantes, au niveau de l’intestin des animaux et de l’homme, ou à partir des cavités naturelles de l’homme. (Larpent et Gourgand, 1990 ; Desmazeaud, 1992 et Deroissart, 1996). Pour les espèces du genre Bifidobacterium, elles sont découvertes exclusivement chez l’homme et les animaux. TABLEAU N°10.Mistouka, 1989 et Novel, 1993. 14 Chapitre II Bactéries Lactiques Tableau N°10 : Milieux d’isolement des bactéries lactiques ( Eddebi, 1998). Milieux d’isolement Espèce Lactococcus Lc lactis subsp.lactis Lc.Lactis subsp.dacetylactis Lc Lactic subsp. Cremoris Lc.Raffinolactis Lait crus, lait fermenté, végétaux et flore minoritaire du rumen. Végétaux ; lait Uniquement lait Lait caillé Lc.Graviae Lait de mammites Lc.Plantarum Poids congelés Lc.Hordniae Cicadelle nommée hordiniae Streptococcus Sc. Thermophilus Lait chauffé 45-50°C, lait pasteurisé, yaourt et levains artisanaux. Leuconostoc L.oenos Pediococcus Lait, produits laitiers, fruits, betteraves, choucroute. vin Pc.Pentosaceus PC.Acidilactici PC.Halophilus Végétaux en décomposition. Matières végétales. Lait, produits laitiers, saucisson, anchois salés Lactobacillus Lb. Delbrueckii subsp.Bulgariecus Lb.Casei subsp .Casei Lb. Plant arum Lb. Curvatus Lb. Brevis Lb. Kefir Lb.Bravaricus Lb. Sanfransisco Yaourt Lait Plante Lait, fromage Ensilage Lait fermenté, kéfir Végétaux fermentés Produits de panification 15 Chapitre II Bactéries Lactiques Ces bactéries furent et sont encore utilisées sous la forme de levains artisanaux, mais le développement de l’industrie de transformation, en particulier de l’industrie laitière ; a conduit à la production de ferments industriels capables d’assurer a la fois la qualité et la constance du produit. (Stiles et Holzapfel, 1997) Malgré leur importance économique, les bactéries lactiques n’ont pas toujours reçu l’attention nécessaire ni de la part des microbiologistes ni de celles des industriels. Depuis quelques années, elles deviennent un sujet d’étude privilégié de par le monde. (Stiles et Holzapfel, 1997) 4. Propriétés générales: Les bactéries lactiques apparaissent au microscope sous forme cocci, ou bacille à gram(+) ; généralement immobiles, asporulés, oxydase(-), réductase (-) ou pseudo catalase(-). Il existe chez les bactéries lactiques deux types morphologiques bien distincts, les coques et les bacilles. Les premières de 0.50 à 1.5 m diamètre les seconds de 0.50 à 2 m et de 1.5 à environ10 m de long. Chez les genres Streptococcus et Lactococcus, la division cellulaire donne des sphères ovoïdes groupées en paires ou en chainettes, dans un seul plan. Le genre Leuconostoc présente des cellules de forme lenticulaire groupées en paires ou en chainettes courtes. Le genre Pediococcus donne des sphères groupées en paires ou en tétrades dans deux plans. Le genre Lactobacillus recouvre des espèces de morphologie plus variée, les cellules sont des bâtonnets plus ou moins allongés, groupés en paires ou en chainettes (Desmazeaud ; 1992). Ce sont des bactéries en général aérotolérantes, sauf que certaines espèces habitant par exemple le tube digestif des animaux sont anaérobies strictes même en présence d’O2 ; elles sont incapables de réaliser des phosphorylations oxydatives. Ceci est d’ailleurs, corrélé à leur incapacité à synthétiser les cytochromes et les enzymes à noyau hème. Ce pendant grâce à des flavoproteines oxydases ou peroxydases, elles peuvent réaliser des oxydations limitées non phosphorililantes. Leur capacité de biosynthèse est faible, ce qui explique leur poly auxotrophes pour divers acides aminés, de bases nucléiques, les vitamines et (Eddebi, 1998). 16 des acides gras Chapitre II Bactéries Lactiques L’absence de catalase est caractéristique chez ces bactéries, mais centaines espèces présentent une pseudo-catalase, sans hème avec manganèse dont la faible activité pourrait en aérobiose prolonger la vie des cultures stationnaires en les protégeant de la toxicité à l’oxygène (Bourgeois et al, 1996). 2Mn 2 2O2 2Mno2 Mo2 O2 Mn 2 Certaines de ces espèces peuvent hydrolyser faiblement les caséines ; alors qu’aucune des souches n’est capable de produire d’acides volatils ayant plu de deux atomes. Par contre, d’autres donnent sur milieu hypersaccharosé des capsules volumineuses de «dextrane»; c’est le cas de Leuconostoc mesenteroides. (Gason et Devos, 1994) En outre, les bactéries lactiques ne possèdent pas de nitrate réductase, et ne liquéfient pas la gélatine et ne produisent pas d’hydrogène sulfureux H2S et peuvent produire des quantités abondantes d’acides lactique. Les bactéries lactiques peuvent tolérer des pH acides, très inférieurs à 5 ou parfois moins, d’où leur utilisation dans la conservation des aliments (produits laitiers) (Lenoir, Hermier et Weber, 1992) Mais plus le milieu devient très acide plus de nombreuses de ces espèces sont inhibées. (Gasson et Devos, 1994) 5-Mode de fermentation : Depuis 1920, ORLA-JENSEN a montré que les bactéries lactiques peuvent se subdiviser en 2 groupes biochimiques, homofermentaires et hétéro fermentaires. La différence entre ces deux groupes est détectable par une différence de dégagement métabolique de CO2. 5.1. Bactéries Homofermentaires( voie des hexoses phosphates) : Les bactéries se présentent en paires ou en tétrades et en forme de chainettes, chez certaines espèces comme streptocoque. Le glucose est dégradé chez ces espèces en formant l’acide lactique 85-95% comme seul produit final. (Deroissart et Luquet, 1994) Ce type de dégradation a eu lieu aussi bien dans des cellules d’animaux supérieurs, en particuliers les mammifères. 5.2. Bactéries Hétéroferment aires (Voie des hexoses mono phosphates) : Les cellules bactériennes se présentent en paires ou en chainettes. ( Garvie, 1981) Le glucose est transformé par ce groupe de bactéries en éthanol 20-25%, en acide lactique 50% et en CO2 25-50%. Ce type de dégradation est très retrouvé chez Clostriduim acétobutylicum transformant : 17 Chapitre II Bactéries Lactiques 2 glu cos e 1bu tan ol 1acétone 4 H 2 5CO2 (Deroissart et Luquet, 1994) 6. voie de dégradation : La voie d’Embden Meyerhof Parnas (EMP) dans laquelle le catabolisme du glucose est à l’origine exclusive d’acide lactique : C’est l’homofermentation. Par contre la voie des pentoses phosphates, dans laquelle le catabolisme du glucose donne autre que l’acide lactique, le CO2 et l’éthanol : C’est l’hétérofermentation. (ORLA. JENSEN, 1919) 7. Production d’acide lactique : L’acide lactique est un acide organique incolore de la famille des acide-alcools également appelé lactate formé au cours des fermentations lactiques et a pour formule CH 3CHOHCOOH .Les bactéries lactiques présentent la faculté d’excréter l’acide lactique sous différentes formes (D(-), L(+) ou DL) (Pelmont,1995) (Figure 1) COOH COOH HO C H H C OH CH 3 CH 3 Lévogyre L( ) Dextrogyre D() Figure 1 : Différents isomères de l’acide lactique (Pelmont et al, 1995). Les bactéries produisent l’un ou l’autre des isomères, parfois les deux à la fois ; tout dépend de leur contenu en lactate- déshydrogénase. 8- Classification (Taxonomie) Les bactéries lactiques sont représentées par plusieurs genres et leur classification a été l’objet d’intérêt de plusieurs chercheurs. (ORLA JENSEN, 1919 ; Sneath et al, 1986 ; Novel, 1993 et Leclerc et al, 1995) 8-1. Classification classique (Taxonomie classique) C’est une classification basée sur les caractères morphologiques, biochimiques et physiologiques (mode de fermentation du glucose et l’acide lactique produit, température de croissance). (ORLA JENSEN, 1919) 18 Chapitre II Bactéries Lactiques Ce sont soit des coques (streptococcus) mais aussi (lactococcus, entérococcus, leuconostoc, pediococcus), soit des bacilles (lactobacillus) qui se distinguent en plus par leur type de fermentation : hétéro lactique ou homolactique. A ces genres ; a été ajouté récemment le genre bifidobacterium. (Kandler et Weiss, 1986) 8-1-1. Groupe des homo fermentaires : D’ont la production d’acide lactique est de 90-97%. Ce groupe est divisé en trois sous groupes : 8-1-1-1- Thermobacterium : De forme bâtonnet long ; thermophiles, très acidifiantes et de température de croissance située entre 40-50°C. 8-1-1-2- Streptobacterium : Représenté par les lactobacilles mésophiles de forme bâtonnet court, d’acidité lente et de température optimale de croissance de 30°C 8-1-1-3. Streptococcus : De forme sphérique, organisées en chainettes et de faible acidité. 8 1-2 Groupes des hétérofermentaires : Ce groupe de bactéries est capable de produire de l’éthanol, de l’acide acétique, du CO2, de l’acide lactique et comporte trois sous groupes : 8-1-2-1 Bifidobacterium : De forme bâtonnet court, fourchus au bout, dont le résultat de fermentation est l’acide lactique et acétique. 8-1-2-2. Betabacterium : De forme bâtonnet court et dont la fermentation produit de l’acide succinique ainsi que des gaz. 8-1-2-3. Betacoccus : Présentent une forme sphérique, produisent peu d’acide lactique et des substances visqueuses de nature poly saccharidiques. 8-2 Taxonomie moderne : Elle s’appuie principalement sur les techniques d’électrophorèse des protéines et des études des acides nucléiques, la définition de pourcentage CG de l’ADN, ce qui permet de définir une souche bactérienne du point de vue de la taxonomie moléculaire (importante pour son caractère d’exclusion). 19 Chapitre II Bactéries Lactiques La taxonomie actuelle investie le progrès de la génétique (hybridation ADN-ADN, ADN- ARN…) de l’écologie (découverte de bactéries de milieu externe), elle incluse d’identification, des banques de données informatisées (Bugnicourt ; 1995). Les différents genres de bactéries lactiques : Les bactéries lactiques sont représentées par plusieurs genres d’importance d’ailleurs différentes. Selon la morphologie, ce groupe peut être divisé en deux formes (voir figure N°2) Coques : C’est le cas de Streptococcus, mais aussi de Lactococcus. Entérococcus, Leuconostoc, et Pediococcus. Bacilles : représentés par le genre Lactobacillus. Ils se distinguent en plus par leur type fermentaire : homolactique ou hétéro lactique. (Kandler et Weiss, 1986) Le développement de la biologie moléculaire a conduit à une nouvelle classification fondée sur la présence de leurs génomes, les avantages de cette nouvelle taxonomie reposent sur la stabilité du génome, sur la possibilité de définir des relations physiogéniques entre des groupes lactiques. (Garvie, 1986) 1) Streptococcus : Ce sont des coques Gram + ; dont le diamètre varie de 0.50 à 1 m , non sporulés, immobiles, dépourvus de catalase et d’oxydase, ne réduisant pas les nitrates et résistants aux aminosides. Ils sont souvent en chainettes plus ou moins longues et parfois en diplocoques. Ils sont classés en. : 1- Le groupe des pyogènes : Streptococcus pyogènes ou streptocoques -hémolytiques du groupe A. Streptococcus agalactiae : streptocoques -hémolytiques du groupe B. Streptococcus -hémolytiques des groupes C, G ou L. 2- le groupe des streptocoques oraux autrefois dénommés viridans. 3- Streptococcus pneumoniae ou pneumocoques. 4- Le groupe des streptocoques du groupe D dont l’espèce Streptococcus thermophilus. 20 Chapitre II Bactéries Lactiques Bactéries Lactiques Coques Gram positif Asporulales Anaérobie Peptococcaceae Bacilles Gram positif Asporulales Aérobie ou anaérobie Facultatif Aérobie ou anaérobie Facultatif Streptococcacea Peptococcus Lactococcus Peptostreptococcus Leuconostoc Rumiococcus Pediococcus Lactobacillacea Lactobacillus Homo-fermentaire strict Hétéro-fermentaire facultatif Hétéro-fermentaire strict Sarcina Figure N°2 Diagramme de la classification de Bergey (1986) des bactéries lactiques. 21 Chapitre II Bactéries Lactiques 2) Entérocoques : Les entérocoques, comme les streptocoques D, possèdent l’antigène D. la principale différence phénotypique entre les deux genres est que, contrairement aux streptocoques, les entérocoques se développent dans un milieu hypersalé (6.5% de NaCI). Ils constituent 10% de la flore aérobie de l’intestin. Ils sont recherchés comme témoins d’une contamination fécale éventuelle de l’eau et / ou des aliments (Garvie, 1986). Ils ne sont désormais plus considérés comme des streptocoques, mais comme un groupe à part entière. 3) Streptocoque lactiques : Les espèces de ce genre appartiennent à la famille des streptococcaceae et se présentent comme des cellules ovoïdes, sphériques ou quelques fois allongées. Ce sont des bactéries homofermentaires (voie des hexoses mono phosphates). Organisée en paires ou en chainettes, productrices d’acide lactique L (+), catalase (-) et renferment notamment les espèces suivants : streptococcus Lactis et Streptococcus thermophilus. Ces espèces diffèrent entre elles par la présence d’un antigène de groupe dit « antigène de Lance Field » et leur capacité de croître à des températures extrêmes 45 !) C pour les thermophiles, et 10°C pour les mésophiles (Jones, 1990). Les streptococcus lactiques se composent en fait de deux groupes distinct : Streptocoques mésophiles possédant l’antigène N d’où leur nom streptocoque du groupe N et l’espèce Streptococuus thermophilus ne possédant pas d’antigène de Lance Field. 3-1 Streptocoques lactiques mésophile du groupe N : 3-1-1 Genre Lactococcus : Traditionnellement, les streptocoques regroupent deux espèces (streptococcus lactis, et streptococcus cremoris) (Garvie et Farrow, 1982) ont proposé de rassembler sous le nom collectif Sc, lactis trois sous espèces, Sc.lactis subsp lactis, Sc.lactis subp diacetylactis et Sc.lactis subsp cremoris. (Mundt, 1986) complète ce groupe en ajoutant l’espèce Sc.Raffinolactis définie par (Garvie, 1978). Ce sont des bactéries de forme cocoide disposées en chainettes, homo fermentaires (acide lactique L(+)) ; commune par leur caractère non pathogène et la présence de l’antigène N de Lance Field, absence de l’hémolyse mais parfois présentent de hémolyse, de température de croissance optimale moyenne 20-30°C et minimale 10°C, présentent une faible thermorésistante et de viabilité perdue après 30min à 63°C. 22 Chapitre II Bactéries Lactiques (Scheifer et al ; 1985) se fondât sur des critères moléculaires, ont proposé de séparer les streptocoques lactiques mésophiles du genre Streptococcus et créer le genre Lactococcus (Tableau N°11) Tableau n°11 : Caractéristiques distinctives des espèces de Lactococcus. (Schleifer et al, 1985, Schleifer ,1987) Type de peptidoglycane Lc.LActus Lc.LActus Lc.LActus subsp. subsp subsp LACTIS Cremoris Hordniale Lys-D-Asp Lys-D-Asp Lys-D-Asp Lc. cariaie Lys-AlaGly-Ala Lc. Planta .UM Lys-serAla Lc.Raffinqla ctis Lys-Thr-Ala Ménaquinones majeures Croissance à 40° MK9, MKB +(v) MK9, MKB - MK8, MKB9 - - - + V - Présence de NaCl 4% Fermentation + - - + + - Amygdaline V - - + (+) v Galactose + + - + - + Lactose + + - + - + Maltose + + - +(v) + + Mélibiose - - - V - + Mélézirtose - - - - - + Raffinose - - - - - -(v) Ribose + - - + + + Selicine +(v) -(v) + + + - Sorbitol - - - - + - Saccharose V - + V + - Théhalose + -(v) (+) + + - Hydrolyse de l’arginine + - + + - - (v) + : croissance positive ; - croissance négatif ; v : croissance selon les souches; (+) croissance faiblement positive; + (v) croissance positive pour la plupart des souches mais occasionnellement négative ; - (v) : croissance négative pour la plupart des souches mais occasionnellement positive. 23 Chapitre II Bactéries Lactiques Tableau n°12 : Caractéristiques conventionnelles distinctives des espèces de Streptocoques lactiques. (Jones ,1978 ; Garvie, 1984 ; Schleifer et al, 1985) Streptococus loctis .lactis Streptococcus lactis Subsp.diocety lactis Streptococcus lactis Subsp cremorls Streptococcus raffinolactis Streptococcus thermophilus Groupe sérologique N Croissance à 10°C 39°C 40°C + + + 45°C Ph9.2 + Ph9.6 - +NaCl 2% +NaCl 4% +NaCl +Bile40 Utilisation 6.5% % Citrate Hydrolyse Larginne + + - + - - N + + + - + - + + - + + + N + - - - - - + - - + - - N + - - ? ? + + - - ? - - - + + - - - - - - - - + GLU LAC GAM FERMENTATION SAC MAL MTL XYL ARA RIB DEX ESC SAL MLZ TRE RAF MEL GLY TRE + + + V + V V V + V + V - V V - - Streptococcus lactis subsp.Diocetylactis Streptococcus lactis subsp cremorls + + + V + V V V + + V V - V V - - + + + - - - - - - - - V - V - - - Streptococcus raffinolactis Streptociccus thermophilus + + + - + V V V V + + + V + + + + + + - + - - - - - - - - - - - - - 24 Chapitre II Bactéries Lactiques 3-1-2 Streptococcus thermophilus : Cette espèce reste dans le genre Streptococcus, se distingue par sa croissance thermophile avec un optimum de42-43 °C, ne présente pas d’antigène du groupe N, sa thermo résistance est observée à une température de (60°C à 65°C durant 30 minutes), d’activité à une température de sucres, et elle est sensible au NaCl. (Garvie ,1983 et Hardi ,1986) 4- Genre Leucomostoc : Les espèces de ce genre sont de forme cocoide souvent lenticulaire associés en paires ou en chainettes hétérofermentaires produisant l’acide lactique D(-), l’éthanol et du CO2 (optimum 20-30°C) elles sont caractérisées par la production à partir du citrate du lait, de diacétyle et parfois de dextranes. (Novel, 1993) Aussi, elles sont exigeantes en de nombreux facteurs nutritionnelles et se distinguent par leur croissance sur bouillon citrate et malate, à pH bas et par leur tolérance à l’éthanol et leur résistance au nancomycine. (Elvar et Bonis, 1993 ; Bourgeois et Larpent, 1996) Les leuconostoc sont ; soit acidifiantes, soit aromatisantes et elles peuvent inhiber leurs micro-organismes contaminant acido-sensibles dans le milieu. (Tableau 13) (Bourgeois et Larpent, 1996) Le genre comprend les espèces suivantes : Ln. mesenteroides Ln. paramesenteroides Ln.lactis Ln.oenos Cependant, l’espèce Ln.mesenteroides a été subdivisée en 3 sous espèces Ln.mesenteroides subsp.mesenteroides Ln.mesenteroides subsp dextranicum Ln. mesenteroides subsp cremoris. L’isolement se fait soit sur gélose M17 (Terzaghi et Sandine, 1975), soit sur gélose MSE (Mayeux et al, 1962). Ce milieu sélectif permet la recherche et le dénombrement des Leuconostocs dans le lait, les produits laitiers et les aliments sucrés. 25 Chapitre II Bactéries Lactiques Tabelau N°13 : Principaux caractères des Leuconostoc (Novel, 1993, Larpent, 1996) Caractères Biochimiques Culture à10°C Ln. Msenteroides ssp. Mesenteroides Dextranicum Cremoris + + + Ln. Paramesenteroides Ln.lactis + + Culture à 37°C Culture à 39°C Culture à 45°C Hétérofermentation Citratase Formation de dextrane + + + + + + + + - + + - + + + + - Arginine dihydrolase - - - - - 5- Genre Lactobacillus : Ce genre appartient à la famille des Lactobacillaceae, de forme bâtonnet ou coccobacilles, souvent groupées en chaines, présentent une forte exigence en facteurs de croissance, immobiles ou mobiles, asprogènes, anaérobies facultatifs, microaéophiles, ne réduisent pas les citrates, n’hydrolisent pas la gélatine, et acidophiles (Garvie, 1984). Les espèces de ce genre soit caractérisées par l’hétérogénéité de la composition de l’ADN le taux de GC varie de 32 à 53%.(Kandler et Weiss, 1986) Originellement elles ont été classées en 3 groupes par (ORLA- JENSEN, 1919) Thermobacterium : homofermentaire et thermophile. Streptobacterium : homofermentaire et mésophile. Bétabactrium : hétérofermentaire, soit mésophile soit thermophile. Les résultats de la taxonomie moléculaire, la détermination du type du péptidoglycane (PTG), les propriétés de certains enzymes, la détermination de l’isomère de l’acide lactique (Botazzi,1988) , la taille du génome et l’hybridation ADN-ADN, (Sriran Ganathan et al, 1985) ont permis a (Kandler et Weiss,1986) de diviser les lactobacilles en 3 groupes qui se retrouvent sous de nouvelles définitions, les groups d’ORLA-JENSEN. Groupe1 : (Lactobacilles homofermentaires obligatoires) : C’est des cellules longues droites souvent en palissades, incapables de fermenter les pentoses et le gluconate (Bottazzi, 1988), fermentent les hexoses par la voie D’EMBDER MEYERHOF en produisant du lactate jusqu'à 85% à partir du glucose (Novel, 1993). Les espèces les plus connues sont : Lb.lactis, Lb.bulgaricus, Lb.leichmani et peuvent produire jusqu’à 18g/l d’acide lactique D(-) 26 Chapitre II Bactéries Lactiques Groupe 2 : (groupe hétérogène lactobacillus homofermentaires facultatifs) : Se présentent comme étant des cellules courtes, souvent arrangées en filaments (Boutazzi, 1988), fermentent les hexoses par la voie homofermentaires (parfois hétéro fermentaire) et fermentent les pentoses et le gluconate par la voie hétéro fermentaire et produisent peu d’acides lactiques 3 à 13 g/l (Kandler et Weiss, 1986). Les espèces les plus connues sont : Lactobacillus Lactobacillus .casei Lactobacillus.rhamonosus Groupe 3: (Lactobacillus hétérofermentaires obligatoires): Ce groupe renferme des espèces très diverses, malgré parfois un GC% très voisins entre elles, les cellules bactériennes sont courtes droites et séparées (Bouttazzi, 1988), fermentent les hexoses en produisant du lactate, de l’acide acétique, de l’éthanol, du CO2 dans le rapport 1:1:1 et fermentent les pentoses en produisant du lactate et de l’acétate. (Kandler et Weiss, 1986) Leur production est faible ; 5 g/l de lactate de type DL. (Novel ,1993) Les espèces les plus connus sont : Lb.buchneni, Lb.brevis, Lb.renteri, Lb. fermentum et Lb. bifermentans (Tableau N°14). 27 Chapitre II Bactéries Lactiques Tableau N°14 : caractéristique de quelques espèces de Lactobacilles. (Adapté de Bouttazzi, 1988) Groupe I II III Espèce Lb delbrueckii subsp.delbrueckii Lb delbrueckii subsp.bulgaricus Lb delbrueckii subsp.lactis Lb.acidophilus Lb.gasseri Lb.helveticus Lb.casei subsp casei Lb.casei .pseucoplantarum Lb.casei subsp.tolerans Lb.casei subsp rhamnosus Lb.sake, Lb cuvatus Lb bavaricus Lb plantarum Lb.bilermentans Lb.brevis B, buchnen B, keir Lb. Reuten Lb.fermentum Lb. Confisus Lb.viridescens Lb.sanfrancisco ADN GC% 49-51 Type de PéptidoGlycane Lys-Asp Acide lactique D Habitat Végétaux 49-51 Lys-Asp D Yaourt, fromage 49-51 Lys-Asp D Fromage 34-37 33-35 38-40 45-47 45-47 Lys-Asp Lys-Asp Lys-Asp Lys-Asp Lys-Asp DL DL DL L DL Bouche, vagin Bouche, vagin Fromage Rumen Fromage, fourage 45-47 Lys-Asp L Bouche, vagin 45-47 Lys-Asp L Tractus intestinal 42-44 42-44 44-46 44-46 45-47 44-46 40-42 4-42 Lys-Asp Lys-Asp Mésro- DAP Lys-Asp Lys-Asp Lys-Asp Lys-Asp Lys-Asp DL L DL DL DL DL DL DL végétaux végétaux Végétaux, fromage Fromage Végétaux, fromage Végétaux, fromage keir Tractus intestinal 52-54 45-47 45-47 36-38 Lsp-Asp Lys-Ala Lys-Ala6Ser Lys-Ala DL DL DL DL Végétaux, fromage végétaux Produits carnés Pain, panattone 6-Genre Pediococcus : Les germes appartenant à ce genre se trouvent dans les habitats naturel se présentent comme étant des cellules de forme sphérique en paire ou en tétrades jamais en chaines, homofermentaires, et l’acide lactique du type DL ou L(+) est le seul produit résultant de leur dégradation des sucres. (Novel, 1993) C’est des bactéries exigeantes, de faible activité protéolytique et chez la plupart des espèces leur incapacité à utiliser le lactose ne leur permettent pas d’acidifier et de coaguler le lait (Garvie, 1986). 28 Chapitre II Bactéries Lactiques Leur activité catabolique et leur tolérance à l’O2 sont variables, les températures de croissance varient entre 25-40 °C, leur contenu en GC varie entre 35-44%, et sont souvent responsables d’accidents de fabrication, notamment en brasserie (Leveau et Bouix, 1980) La taxonomie moléculaire permet de distinguer par hybridation ADN-ADN 8espèces : Pediococcus dextranicum, Pediococcus halophilus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus inopinatus, Pediococcus pentosacens Pediococcus dammosus Pediococcus uriinacequi Pediococcus parvulus (Dellaglio et al, 1989) 7- Bifidobacterium : 7-1 Definition : Les Bifidobactérries ont été découvertes pour la première fois, par Tissier 1900. Ils ont été isolés à partir de selles d’enfants nourris au lait maternel. Tissier avait alors décrit ces organismes comme des bactéries anaérobies, Gram positif en forme de bâtonnet Ces bactéries avaient alors reçu le nom de bacillus bifidus cormmunis. Au même moment, en Italie, Moro découvrit des bactéries semblables qu’il a identifiées comme des lactobacillus (Balllongue et al, 1993) 7-2 Ecologique des bifidobactéries : Les bifidobactéries font partie de la flore prédominante de l’intestin chez les humains et les animaux à tous les stades de vie. La composition de la flore dominante chez l’humain change au cours des différents stades de vie. Chez un jeune enfant nourri au lait maternel, la flore intestinale est composée de 85-99% de bifidobactéries et les principales espèces retrouvées sont bifidobacterium infants et B.bifidum. Les entérocoques, les coliformes et les lactobacilles représentent environ 1-15% de la flore fécale alors que les bactéroides et les clostridies sont absents (Rasie et Kurmann, 1983). 7-3 Taxonomies : Pendant plusieurs années, les bifidobactéries ont été classées parmi les bactéries du genre Lactobacillus. C’est d’ailleurs sous ce nom que sont retrouvées les bifidobactènes dans les quatre premières éditions du manuel Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Apres 1965, suite à l’apparition de nouvelles technologies génétiques, deux équipes de recherche (Sebald et al, 1965, Werner et al, 1966) ont démontré, grâce au % G+C que les 29 Chapitre II Bactéries Lactiques bifidobactéries étaient différentes des lactobacilles, des crynébactéries ainsi que des propionibactéries. Ces équipes ont démontré que le %G+C était de60.1% pour les bifidobactéries alors qu’il était de67.6% pour les propionibactéries, de 54.7% pour les corynébactéris et se situait entre 33 et 49% pour les lactobacilleses (Sebald et al, 1965 ; Werner et al, 1966) Scardovi et Trovatelli (1965) et De Vries et Stouthamer (1967) ont découvert une nouvelle voie de fermentation des hexoses chez les bifidobacteies, qui ne se trouve dans aucune des espèces du genre Lactobacillus, L’enzyme principale de cette voie est une fructose-6-phosphate phosphoketolase qui clive le fructose-6-phosphate en érythrose-4phosphate et en Acétyle-phosphate. En 1970, Scardovi et al, ont commencé à appliquer intensivement le procédé d’hybridation ADN-ADN afin d’évaluer la validité des espèces de bifidobactéries décrite et pour identifier de nouveaux groupes de séquences ADN homologique parmi les souches qu’ils isolaient dans des diverses niches écologiques. A partir de 1974, le genre Bifidobacterium a été reconnu par les éditeurs 8ème édition du Bergey’sManual et à ce moment là, le genre Bifidobacterium était composée de 11 espèces.Une autre correction à la classification a été apportée après l’introduction de l’électrophorèse des protéines cellulaires solubles sur le gel de polycrylammide (Biavati et al ,1992). Selon Crociani et al, (1996) les bifidobactéries sont répertoriées de 32 espèces ,12 seraient d’origine humaine ,3 proviendraient de l’abeille, 14 seraient d’origine animale à sang chaud et 2 proviendraient des eaux usés. En outre les espèces de Bifidobacterium ne cessent d’augmenter, l’équipe de Crociani et al (1996) ont pu isoler une nouvelle espèce B.lactis à partir des produits laitiers. Stackebrant et al (1997), par l’analyse de RNAr16S, ont proposé, une structure hiérarchique rassemblant le genre Bifidobacterium avec le genre Gardnerella dans une seule famille Bifidobacteriaceae dans l’ordre de Bifidobacteriales. De nos jours cette famille comporte 6 genres : Aeriscardovia, Alloscardovia, bifidobacterium, Gardnerella, Parascardovia et Scardovia (Euzéby, 2007). Selon Euzéby (2007), le nombre d’espèces citées est de 35 provenant de diverses origines. 30 Chapitre II Bactéries Lactiques 7-4 Propriétés phénotypiques (Morphologie) : Le genre Bifidobacterium montre des formes bacillaires qui développent des ramifications donnant des formes en V, Y, X, non mobiles et non-sporulantes à Gram (+). Leurs extrémités sont effilées, bifurqués ou spatulées elles peuvent se présenter aussi sous forme de petits bacilles réguliers. (Rasic et Kurmann, 1983 ; Scardovi, 1986, Gavini et al, 1990) Cependant, leur polymorphisme dépend principalement du milieu de culture des conditions de croissance. Les colonies des bifidobactéries sont d’apparence très variable selon les souches elles sont : lisses, convexes ; crèmes ou blanches, muqueuses et scintillante à contours réguliers. (Scardovi, 1986) 7-5 Propriétés physiologiques : 7 5-1 Température : Les espèces de Bifidobacterium d’origine humaine montre une croissance à une température variant entre 36° et 38°C par contre les espèces d’origine animales peuvent croitre a des températures plus élevée qui varie entre 41° et 43°C, aucune croissance ne se produit en- dessous de 20°C (scardovi, 1986 ; Martin et Chou ,1992). A l’exception de B.thermacidophilum, B.thermophilum pousse à une température plus élevée 49.5°C (Scardovi et al, 1979 ; Dong et al, 2000, ZHU et al, 2003) et B.psychraerophilum croit à température de 4°C. (Simpson et al, 2004) 7-5-2 Oxygène et anaérobiose : Microorganismes anaérobies (Scardovi, 1984), mais la sensibilité à l’oxygène varie entre les espèces humaine ou animale (De Vries et Stouthamer 1967). Les espèces qui tolèrent l’oxygène : B.lactis, B.aerophilum (Simpson et al, 2004) présentent une faible activité catalytique qui élimine les traces du oxyde d’hydrogène formées (H2O2) ou par me fait que me NADH oxyde de ces souches ne forme pas de H2O2, alors l’accumulation d’ H2O2 inhibe l’activité de F6PPK. Pour les souches extrêmement sensibles à l’oxygène, n’accumulent pas l’H2O2 et l’oxygène bloque la multiplication bactérienne par l’intermédiaire d’un potentiel d’oxydoréduction trop élevé. (Scardovi, 1986 ; Romond et al, 1992, Schell et al, 2002, Ventura et al, 2004). 31 Chapitre II Bactéries Lactiques 7-5-3 le pH : Considérées comme acidophiles, mais ne supporte pas les ph plus bas que 4 et les ph plus élevé que 9 (Biaviti et al, 1992). A l’exception de B.animals subsp.lactis et B.animals subsp.animals résiste à un pH =3.7 (Meile et al ,1997) . La production maximale d’acide lactique et acétique chez les bifidobactéries exige un ph optimal initial proche de la neutralité qui varie entre 6-7. (Collins et Hall, 1984, Scardovi, 1986). 32 Chapitre II Bactéries Lactiques Tableau N°15 : Caractéristiques distinctives du genre Bifidobacterium. (Adapté de SCARDOVI, 1986). %G+C Type PTG 58 A 1 B.bifidum 2 3 4 B.longum B.infiantis B.breve 58 58 58 A A E 5 B.adolescentis 58 C 6 B.angulatum 59 7 8 9 10 B.Catenalum B.pseudocatenulatum B.dentium B.globosum 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Origine Homme, veau Homme Homme Homme D- L- Las Cel Mlz Raf Stl Any glcn Rib Ara + + + + + - + + + V + V + + + V - - + + + + + + V + + C Homme, animaux Homme + + + - - + V + V 55 57,5 61 64 D D C B Homme Homme Homme Animaux + + + + + + + V + + + + + V + - + - + + + + + V - + + + V V - B.pseudolongum B.cuniculi B.chenium B.animals B.thermophilum B.boum B.magnum B.pullorum B ;suis B.minimum 60 64 66 60 60 60 60 67 62 61.5 B A A A H G D C A F Animaux Lapin Porc Animaux Animaux Animaux Lapin Poulet Porc Egout + + + + - + + + + + + - V + + V V + + - V V V V - V V V V - + + + + + + + + - - + + + + + + + - B.subitile B.coryneforme B.asteroides B.indicum 61.5 C C E C Egout Abeille Abeille Abeille + + + + + + - - + + + + - + + + + + + - + - + + V + 59 60 Symboles : comme dans le tableau 2 : en plus, Amy : amidon, Cel : celloboise ; glcn : gluconate ; Stl : sorbitol Types de PTG : A :orn(lys)-Ser au début ; B :Orn (Lys)-Ala2-3 ; C :lys (Orn)-D-Asp ; D/Lys(Orn)-Ala2 Ser0.2-1.0 ; E : Lys-Gly ; F :Lys-Ser ; G :Lys-D-Ser-D-Glu ; H :Orn(Lys)-DGlu. 33 Chapitre II Bactéries Lactiques 8- Métabolisme des Bactéries Lactiques : A la production de l’acide lactique suite à une fermentation du lactose et à un fort abaissement du pH, ce qui est recherché pour la fabrication des produits alimentaires s’ajoute plusieurs voies métaboliques concernant les principaux composants du milieu ou les bactéries lactiques vivent. (Desmazeaud, 1996) 8-1 Glucoses : 8-1-1 Voie homofermentaire : Les bactéries lactiques homofermentaires convertissent le glucose du milieu presque en totalité en lactate supérieur à 90%. Le glucose (ou lactate dans le lait) est tout d’abord transporté par un système actif, et selon les espèces peut être phoshorylé lors du transport à travers la membrane cellulaire. Les lactocoques mènent en jeun un système phosphotransférase (PTS) au dépend du phosphore énol pyruvate(PEP) Comme le PEP est à la fois un produit et un réactif de la fermentation des sucres, ce donneur de haute énergie phosphorylé joue un rôle clé dans les étapes du transport et du métabolisme des sucres. Les genres homofermentaires EMP dans la dernière étape de la glycolyse convertissent le pyruvate en lactate et régénèrent ainsi du NAD+ à partir du NADH formé auparavant ; c’est une étape clé catalysée par un lactate déshydrogénase. (LDH) (Figure 3) 8-1-2 Voie hétéro fermentaire : Les genres hétéro fermentaires utilisent les voies tagatose 6-phosphate et du glucose, mais aussi celle des pentoses-phosphate. Ainsi chez ces bactéries la fermentation lactique conduit à la formation des quantités équimoléculaires de lactate, éthanol et de CO2 De plus, une production de formate et d’acétate peut avoir lieu, notamment en aérobiose. (Figure 3). 34 Chapitre II Bactéries Lactiques Voie homofermentaire Voie hétérofermentaire Lactose Milieu extérieur NAD+ Membrane PE P/PTS PEP/PTS Milieu intérieur Lactose 6-P Lactose 6-P (1) Glucose ATP Galactose 6-P Lactose(2) 6-P ADP Glucose6-P Glucose ATP ADP 6-P Glucose Tagatose 6-P ATP NADH ADPFructose 6-P NAD+ 6 phosphogluconate Tagatose 1.6-diP Fructose 1- 6-P Ribulose 5-P (4) (7) CO2 Xylulose 5 -P (8) Diydroxyacétone -P Glycéraldeyde NAD+ Acétyl-P COASH Pi (9) NADH 1,3 Diphosphoglycérate ADP NADH Acétyl-COA COASH 3- Phosphoglycérate ATP 2- Phosphoglycérate Posphoénol pyruvate (5) Pyruvate NADH (6) + NAD Acé taldéhyde NADH NAD+ Ethanol N AD+ Lactate Figure3 : voie homofermentaire et hétérofermentaire des bactéries lactiques (LOONES, 1989 ; NOVEL,1993). 35 Tagatose-6-phosphate kinase ; (4) Tagatose-1,6diphosphate (1)Phospho-B-galactosidase ;(2) Tagatose-6-phosphate isomérase ;(3) aldolase ; (5) Pyruvate kinase ; (6) Lactate déshydrogénase ;(7) Fructase1, 6diphosphate aldolase ;(8) Pentose-5-Phosphte cétolase ; (9) Ethanol déshydrogénase Chapitre II Bactéries Lactiques 8-1-3 Voie des Bifidobacterium Le métabolisme du glucose chez ces bactéries produit 1 mole de lactate, et 1.5 d’acétate mais aucune mole de CO2 n’est formée. Ils mettent en œuvre une voie d’utilisation des sucres différente des voies homofermentaire Cette voie est caractérisée par l’absence d’aldolase et des taux très faibles en phosphofructokinase et par la présence d’une enzyme clé le fructose 6-phosphocétolase. 8-2 Galactose : Le galactose produit par l’hydrolyse du lactose n’est pas (ou peu) fermenté par la plupart des souches (Somkuti et Steinberg, 1979 ; TINSON et al, 1982) et serait excrété par la cellule et au moins lorsque le lactose n’est pas en quantité limitante. Cette excrétion peut avoir lieu aussi bien avec des souches galactose (+) et galactose (-). (Thomas et Crow ,1987). En cultivant des souches galactose (-) en limitation de lactose, on peut obtenir des cellules galactose (+) capable d’utiliser le galactose grâce à une activité induite de toutes les enzymes de la voie de LELOIR. (Thomas et Crow, 1987) Le glucose ou ses métabolites ultérieurs pourraient donc régler la synthèse des enzymes de la voie de Leloir ou de leur activité (Thomas et Crow, 1987), car dans un mélange de (glucose + galactose) c’est le glucose qui est utilisé en 1er même si les cellules sont préalablement adaptées au galactose (Figure 4). 36 Chapitre II Bactéries Lactiques Galactose Galactose Perméase PEP_PTS Glucose -6-P Galactose Gala ctose-6-P 2 Tagatose-6-P 10 Fructose-6-P Galactose-1-P 3 A Tagatose-1.6-diP Fructose-1,6-diP Glucose-1-P 4 Glycéraldényde-3-P Dihydroxyacétone- P + NAD Pyruvate TPP NADH Lactate 6 11 12 Acétyl-CoA NAD+ Formiate NADH Acétyl-P ATP Acétaldéhyde 13 NADH 9 Acétate ADP Éthanol NAD+ Figure4: la fermentation du galactose chez lactococcus lactis : les deux voies de pénétration et les deux types de métabolisme. (Thomas et Crow, 1987) Même légende que pour la figure 2 ; en addition : (10) Galactokinase ; (11) : pyruvate formlate lyase (12) : pyruvate déshydrogénase ; (13) acétate kinase. 37 Chapitre II Bactéries Lactiques 8-3 Lactose : Les Streptocoques thermophiles, les Lacrtobacilles et les Leucomostoc transportent le lactose sous forme libre par l’intermédiaire d’un système perméase, puisque la présence systématique d’une B galactosidase a été démontrée (Desmaezaud, 1996). Le lactose est fermenté selon deux voies à savoir (homofermentaire et hétéro fermentaire). Par ailleurs, les espèces galactose (-) n’utilisent que la moitié glucose. (Figure 5). 38 Chapitre II Bactéries Lactiques LACTOSE Polysacchride Membrane Cytoplasmique Lactose Galactose Lactose-P glucose galactose-P ADP NAD Cytoplasme Format CO2 Format CO2 ATP NADH Pyruvate NAD Acétyl-CoA NADH NADH Acetaldehyde Diacétyl Acétoine Acétone 2-3 Butanédiol Lactate Membrane Cytoplasmique Acetaldehyde Diacétyl Acétoine Acétone 2-3 Butanédiol Lactate Figure 5 : voie d’utilisation du lactose par les ferments du yaourt (Danone, 1994) 39 Chapitre II Bactéries Lactiques 8-4 Métabolisme du citrate et pyruvate et autres substances carbonés : Les bactéries lactiques en dehors de leur pouvoir d’acidification et d’assainissement sont aussi recherchées pour leur capacité aromatisante. L’acide citrique peut être utilisé par de nombreuses espèces des genres Streptococcus,Lactococcus, Entrérococcus, Pediococcus, Leucomostoc et Lactobacillus. Dans les produits laitiers fermentés : le Co-métabolisme sucre fermenté cible/acide citrique est considéré comme un principal précurseur de l’arome du beurre (le diacétyle) Par ailleurs, le pytuvate peut aussi être hydrolysé par le pyruvate formiate lyase en acétate et formate chez les Bifidobactéries. En outre, les Pediococcus halophilus produisent uniquement de l’acide formique et l’acide formique à partir du pyruvate (Desmazeaud, 1996) Pour le glycérol en fin, un petit nombre de bactéries lactiques peuvent le fermenter (cas de Pediococcus halophilus). Il est dégradé en quantités égales de trimethylène et glycol et d’acide B-hydroxxypropionique. Ce schéma métabolique en présence d’une forte concentration de glycérol peut conduire à la production d’une substance antimicrobienne, la neuturine actuellement commercialisée pour luter contre les bactéries pathogènes dans certain produits alimentaires ). 8-5 Métabolismes des protéines et des acides aminés (protéolyse) : Les bactéries lactiques exigent la fourniture exogène d’acides aminés pour leur croissance. Une partie de leur besoin en acides aminés et satisfaite par les acides aminés libres et utilisent des peptides courts. Le problème que rencontrent les souches lactiques est celui du transport à travers les enveloppes bactériennes de ces acides aminés et peptides chez différents genres Lactobacilles, Leuconostoc, Lactocoques, c’est une protéase liée aux enveloppes cellulaires grâces aux ions ca+2 qui assure ce transport. (Desmaezeaud, 1996) En premier lieu, les protéases extracellulaires dégradent les protéines en peptides assez petits pouvant atteindre la membrane et poursuivent ensuite leur dégradation en de petits peptides de 2 à 6 résidus d’acides aminés libres. Apres avoir pénétrer dans le cytoplasme par des systèmes de transport spécifiques ; les petits peptides subissent un fractionnement- par des peptidases intra cellulaires, et les acides aminés libres ainsi formé peuvent intervenir dans la biosynthèse des constituants cellulaires. (Desmazeaud, 1996) Les protéines ont été mises en évidence chez toutes les espèces étudiées mais leur nombre et leur combinaison sont très variables. 40 Chapitre II Bactéries Lactiques L’activité protéolytique globale des bactéries lactiques est considérée comme faible comparée à celle de Bacilles ou Pseudomonas De plus, grâce à son équipement enzymatique complexe, ils participent efficacement à la maturation de certains produits alimentaires. 8-6- Métabolisme des lipides et des éstères / Lipolyse et estérolyse : L’activité lipolytique des Lactocoques dans le lait serait fidèle mais pourrait contribuer à la faveur des fromages affinés. Cependant, les bactéries hydrolysent plus facilement les mono et diglycérides que les triglycérides du lait. (Desmazeaud, 1992) Les triglycérides contenant des acides gras à chaines courtes sont les plus facilement hydrolysés, le système enzymatique intervenant dans ce processus est optimale à pH neutre et à une température de 40-50°C selon les espèces. Par ailleurs, lorsque l’agitation du lait est forte, l’activité lipolytique peut se produire, mais la présence d’acide gras à forte concentration constitue un facteur d’inhibition pour les activités acidifiantes ou protéolytique des bactéries. (Desmazeaud, 1996) 8-7- Métabolisme de l’O2 et l’Aérobiose : La relation des bactéries lactiques avec l’O2 est complexe et leur sensibilité à l’O2 peut être très variable selon les souches : d’anacrobies strictes à aérotolérantes voir insensibles. (Condon, 1987) Dans les conditions d’aérobiose, chez la plupart des bactéries lactiques les molécules NAD réagissent avec l’O2 pour former du peroxyde d’hydrogène H2O2 ou une molécule d’eau grâce à des NADH : H2O2 ou NADH : H2O oxydases. En aérobiose, les enzymes de l’O2 sont aussi candidates pour l’oxydation, cette compétition avec l’état d’anaérobiose peut modifier le spectre ferment aire de ces bactéries. (Condon, 1987) 9- Principales utilisations des bactéries lactiques en alimentation : 9-1 Introduction : C’est à partir des années 1900, que le développement des industries de transformation a conduit à la production industrielle des bactéries lactiques adaptées aux différents produits. Ces bactéries sont des espèces déterminées et leur activité globale caractérise le ferment, l’acidification, la protéolyse, la formation d’arome, l’obtention d’une texture…etc. (Tableau 16).Par ailleurs, ces souches recombinées naturellement sont déjà utilisées (Sanders et al, 1986) et celles modifiées par génie génétique sont actuellement en plein essor. 41 Chapitre II Bactéries Lactiques Tableau16: Différentes utilisations des bactéries lactiques en alimentation (Desmazeaud, 1996). Produits laitiers : fromages, yaourts, laits, fermentés, kéfirs. Lactococcus lactis subsp, lactis et blovar diacetylactis Lc .Lactis subsp cremoris, Leucoonostoc mesenteroides , Leuc,Lactis Lactobacillus helveticus,Lb.delbrueckii subsp .Bulgaricus et subsp. Lactis Lb.Acidophilus,Lb.Casei, Lb.Kefir,Lb.Hilgradii Bifidobactérium bifibum ,Bf.Langum. Fermentation des végétaux : « pickles », choucroute, « miso », « gari », olives Loctobacillus plantarum, Lb.Bervis, Leuconostoc mesenteroides Pediiciccus pentosaceus, Pd.Damnosus Pains spéciaux aux levains. Lactobacillus plantarum,Lb.brévis, Lb.fermentum, Lb.Sanfrancisco Fermentation des produits carnés Carnobactérium divergens , Cb.Piscicola Lactobacillus sake, Lb.Curvatus. Fermentation des produits de la pêche. Pediococcus halphilus, lactobacillus buchenri, Lb. Brevis Leuconostoc mesenteroides Boissons : vin, bière, cidres Leuconostoc oenos(Oenococcus oeni), Lactobacillus delbrueckii 10-Rôle en technologie agroalimentaire 10-1- Fermentation des produits d’origine végétale : Sous l’action des bactéries lactiques l’acide lactique inhibe les fermentations indésirables. Cette opération est conjuguée avec un salage ou un saumurage en condition d’aérobie. Au départ dans de nombreux cas, après lavage de la matière première les bactéries lactiques sont peu nombreuses, elles appartiennent généralement aux espèces : Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus lacibrevis, Lactobacillus plantarum et Pedediococcus damnous. L’adition du sel aux végétaux fait apparaître une phase liquide par plasmolyse, celle-ci va réaliser une certaine anaérobiose et contenir les éléments solubles indispensables à une bonne croissance des ferments lactiques. Ainsi, le chou est fermenté en choucroute (en France), et différents légumes ainsi que végétaux sont transformés en Pikles (USA), Kimchi (Corée), le Miso(Japan) et (Afrique) (Desmazeaud, 1996). 42 Gari Chapitre II Bactéries Lactiques 10-1-1- Aliments fermentés : La fermentation lactique des végétaux (choux, manioc, concombre, olive, betteraves rouge, carotte, navet, haricot vert, céleris, oignons, tomate verte) est une technique largement utilisée dans les pays ne bénéficiant d’une structure industrielle car elle peut être effectuée avec des moyens locaux très simples. Dans la fabrication du pain spécial dit « aux levains » les bactéries lactiques sont utilisées pour leur production d’acide lactique et acétique ainsi que d’acide aminé , d’acide propionique, d’isobutyrique, d’isovalérique, et d’acide butyrique qui confèrent au produit un gout caractéristique. La fabrication des ferments industriels bactériens dans l’industrie de la panification est encore en plein étude. (Desmazeaud, 1996) En effet, un levain industriel ne comprenant qu’une seule espèce : Lactobacillus sanfransisco est utilisé aux usa pour la fabrication du « pain Français » aux levains. Par ailleurs, une culture de Lactobacillus plantarum et Candida tropicalis a été mise au point en France. (Desmazeaud, 1996) 10-2- Produits carnés : Les Pédiococcus ou Lactobacillus souvent utilisés dans les produits carnés inhibent particulièrement les contaminations aux salmonelles, aux Staphylococcus et aux Clostridium botulicum lors de la fabrication des saucisses. Apparemment, l’adition de diverses bactéries à la viande fraiche permet une meilleure conservation. (Gibbs, 1987) Aussi, pour obtenir des produits de qualité, il est utilisé en Europe des ferments sélectionnés composés essentiellement de Micrococcus Staphylococcus et Lactobacillus. La dégradation des lipides par les Lactobacillus est faible, en revanche, on recherche une certaine protéolyse, parce que les peptides et acides aminés sont des précurseurs d’aromes dans ces produits. Par ailleurs, les Lactobacillus produisent des peroxydes et de l’eau oxygène qui s’accumulent dans le milieu malgré la présence des catalases tissulaires et microbiennes. Ces composés ont une action antimicrobienne contre Staphylococcus aureus et Pseudomonas. Les Lactobacilles produisent aussi des bactériocines actives contre les germes potentiellement pathogènes comme listeria monocytogénèse. En, effet, les Pédiocoques produisent la pédiocine, lorsque la Lactobacillus plantarum sécrète la plantaricine et Lactobaciullus Sake synthétise son tour la sakacine (Desmazeaud, 1996). 43 Chapitre II Bactéries Lactiques 10-3- Produits de pêches : La plupart de ces produits sont obtenus par des pratiques ancestrales empiriques notamment en Asie ou les bactéries lactiques n’interviennent pas seules mais associées à d’autres fermentations. Ainsi, les sauces obtenues à partir de poissons (nutoc-nam, vietnamien, namplat thaïlandais, pathis philippin, frenk-trei cambodgien et budu malien) représentent des volumes consommés considérablement dans ces pays. Dans ces pâtes de poisson asiatiques, on met en avant l’activité fermentaire de Lactobacillus platarum, Pediococcus damnosus ou Pediococcus halophilus et Leuconostoc mesenteroides (Desmazeaud, 1996). 10-4- Produits laitiers : Les ferments lactiques commerciaux sont généralement, cultivés sous forme de levains servant à ensemencer les cuves de fabrication; une des techniques récentes : les ferments concentrés congelés ou lyophilisés permettent en ensemencement direct des cuves. (Gilliland, 1985). Les bactéries lactiques sont à la base de la fabrication des fromages, des yaourts fermentés et du kéfir. Selon les types de fromage, la coagulation du lait est obtenue par les actions conjuguées des enzymes coagulantes et des bactéries lactiques Lactocoques essentiellement et ou Leuconostoc pour les fromages à pâte moelle ou à pâte pressée, Streptocoques thermophiles et Lactobacillus thermophiles pour les fromages à pâte cuite, comme on peut utiliser ces bactéries associées à des levures (dans le cas du kéfir) ou à des Bifidobactérium. Le rôle principal de ces bactéries est l’abaissement du pH du lait ou des caillés, selon les cinétiques spécifiques à chaque fabrication. En plus, du rôle fondamental d’acidification responsable de la formation du gel, puis du caillé, les bactéries lactiques interviennent dans la production des composés d’aromes ou de leurs précurseurs Dans les fromages affinés, l’activité des enzymes protéolytiques des bactéries lactiques est fondamentale, car elle complète l’action de la présure, et celle de la plasmine (protéase naturelle du lait) (Desmazeaud, 1996). Certaines souches de Lactobacillus lactis subsp lactis et de Lactobacillus produisent des bactériocines actives contre des bactéries contaminantes et parfois contre des souches pathogènes (Tableau 17). 44 Chapitre II Bactéries Lactiques Tableau17 : Quelques caractéristiques des bactéries lactiques utilisées dans les produits laitiers (Danone, 1994 ; NOVEL, 1993). Genres Forme Fopt* Espèces Streptocuccus Cocci 40-44°C S-thermopoplus Produits majeurs lactaseL(+) Lactobacillus Bacille 40-44°c L.b.Bularicus Lactase D(-) L.b.Helvetcus D L Lactate L .b Lactis D(-) Lactate L.b. Acodophlus DL Lactate Lb. Casei L(+) Lactate Lb.Kefir DL Lactate Lc. Lactis L(+) Lactate Lc. Cremoris L(+) Lactate Lc.Diacetylactis L(+) lactate, Acetaldhyde, diaceryle et Acetoine, CO2 25-30°c Lactococeus Pedioccus Leuconostoc Cocci 25-30°C Cocci 25-30°c Avoide 25-30°c Bifidobacterium Bacille P.acidolactici Ln.Cremoiris Produits secondaires G C% Acetaldeglyde Acétone, 34-46 Acetoine, Diacetyle et ethonal. Acetaldeglyde Acétone, 32-53 Acetoine, Diacetyle et ethonal. Acetaldeglyde Acide, Acétique, Diastyle et ethonal. Acetaldeglyde Acetone, Diastyle et ethonal. Acide Acetaldehyde et Ethanol Acide acétique et ethanol Acide acétique acetaldehyde , ethanol et CO. Acetaldeglyde Acétone, 34-46 Diacetyle et ethonal Acetaldeglyde Acétone, Diacetyle et ethonal Acétone et ethonal DL lactate Acetione, et Diacetyle 34-42 D(-) Lactate et Ethanol Acetoine, acide Ln. Dextranicum Acétique Diacetyle Ln.LActis Diacetyle, CO2 35-38°c B.Breve L(+) Lactate et Acide acétique B.Bifidum Acide formique ; Acide succenique, B-longum Acetaldehyde, Acetone, Acetoine, B-infanits Diacetyle et ethanol * : Température optimale de croissance. 45 Chapitre II Bactéries Lactiques 11- Rôles probiotiques bénéfiques des bactéries lactique sur la santé humaine : C’est vraisemblablement Eli Merchnikoff qui le premier vers 1908 a suggéré d’utiliser les laits fermentés contenant une souche de Lactobacilles capable de vivre dans le tractus intestinal, comme composant d’une alimentation utile à la santé humaine et pour qu’elle puisse avoir un rôle bénéfique, il faut qu’elle garde une certaine activité, voire une viabilité lors du transit intestinal. 11-1- Effet sur le transit et sur la flore intestinale : La consommation du lait riche en Lactobacillus acidophilus vivant facilite le transit intestinal, combat la constipation et stimule la muqueuse intestinale qui à son tour excite la couche musculaire sous- jacente. Ainsi, les laits acidifiés sont utilisés pour lutter contre les diarrhées notamment chez les jeunes enfants, en particulier ceux qui seraient, de plus mal nourris. L’ingestion de ferments lactiques peut rencontrer des effets d’une prolifération de certaines espèces de souches pathogènes comme E.Coli et ceci par divers mécanismes : production de substance (H2O2, acide lactique et acétique) directement inhibitrice d’E.Coli. Abaissement du pH par les acides produits Détoxication par dégradation des entérotoxines Prévention de la synthèse d’amines toxiques Fixation sur le tube digestif empêchant la colonisation, de germes pathogènes ou effet barrière par compétition métabolique. Ainsi s’il n’y a pas d’attachement le Lactobacillus bulgaricus ne s’implante pas dans le tube digestif et y suivit difficilement à cause de sa faible tolérance aux sels biliaires (Desmazeaud, 1996). 11-2- Amélioration de l’intolérance au lactose : Chez les adultes, les symptômes digestifs d’intolérance au lactose sont principalement des douleurs abdominales, crampes et flatulences. Chez les jeunes enfants, l’importance clinique est une plus grande avec des diarrhées acides et celles contenant des sucres réducteurs. Il a été clairement démontré que le yaourt permet l’absorption du lactose chez les sujets déficients de lactase, il faut noter que ces effets bénéfiques disparaissent lorsque le yaourt subit un traitement thermique. Ceci signifie que l’action favorable n’existe que si les bactéries sont vivantes et leur Bgalactosidase est active (Desmazeaud, 1996) 46 Chapitre II Bactéries Lactiques 11-3- Effet sur la réponse immunitaire : L’ingestion par 202 volontaires de bactéries du yaourt lyophilisé pendant 28 jours, augmente la concentration protéique du sérum, la fréquence de lymphocytes B ainsi que la concentration d4Ig et d’interféron Y. Cette action intervient en stimulant, à plusieurs niveaux la défense antibactérienne de l’organisme. Dans les mécanismes généraux intervient l’immunité spécifique par lymphocytes T4 et à l’interleukine 1, avec l’activation des lymphocytes T8 cytotoxique et lymphocytes B producteurs d’anticorps. Par ailleurs, l’immunité non spécifique intervient par phagocytose par les monocytes macrophages. Il a été constaté que Lactobacillus acidophillus associée à des Bifidobacterium entraine une augmentation de la réponse anticorps vis-à-vis du vaccin oral atténué contre Salmonella Typhi Ty21 a. (Desmazeaud ; 1996) 11-4- Rôle anti-tumeur : D’une façon générale, le yaourt présente un effet inhibiteur sur la prolifération des cellules cancéreuses. Plusieurs facteurs ont été suggérés et peuvent contribuer à expliquer les propriétés antitumeurs des produits fermentés : a) Inactivation ou inhibition de la formation des composés carcinogènes dans le tractus gastro-intestinal. b) Suppression de l’apparition de cancers grâce à la stimulation ou à l’augmentation de la réponse immunitaire de l’hôte. c) Diminution à l’activité des enzymes des bactéries fécales (Bglucoruridase, azoréductase, nitroréductase) qui peuvent activer des composés carcinogènes en convertissant les proscarcinogènes en carcinogènes. (Desmazeaud, 1996). 11-5 Influences sur l’absorption du calcium et des minéraux : Les minéraux contenus dans un lait fermenté par des bactéries lactiques sont pratiquement aussi disponibles que ceux dans le lait. Les effets étudiés chez l’homme beaucoup plus contradictoires. On peut noter une amélioration de l’absorption des minéraux lors d’un régime complet par le yaourt ou, au contraire aucune variation d’absorption du calcium. 47 Chapitre II Bactéries Lactiques Les problèmes d’interprétation chez l’homme viennent du fait que l’alimentation couvre en général tous les besoins calciques et qu’il devient alors difficile d’évaluer l’absorption du calcium excédentaire. L’incorporation du yaourt au régime alimentaire habituel (céréales) améliore sensiblement l’efficacité alimentaire certains paramètres osseux (contenu total en cendres, plusieurs caractères morpho métriques), mais surtout la résistance à la rupture des tibias, indiquent un effet favorable du yaourt, sur la minéralisation osseuse. (Desmazeaud, 1996) 11-6 Influences sur la cholestérolémie : Les probiotiques possèdent une activité anticholesterolémiante. Selon (Novel, 1993) les acides organiques sont vraiment des agents hypocholestérolémiants et les acides hydroxyméthyl et oratique abaissent le cholestérol sérique ; par contre l’acide urique inhibe la synthèse du cholestérol. (Desmazeaud, 1996) Par ailleurs, l’ingestion de Lactobacillus acidophilus diminue le taux de cholestérol dans le sérum sanguin. (Desmazeaud, 1996) Le rôle de ces bactéries dans l’espèce humaine n’est pas encore bien établi. La littérature sur le rôle bénéfique de bactéries lactiques est en abondante mais parfois contradictoires car certains rapports manquent de précision scientifique. D’autres études préliminaires montrent que ces bactéries pourraient être utilisées dans la prévention du colon et dans le traitement des infections urogénitales, mais ces effets sont hypothétiques et nécessitent des recherches plus rigoureuses. (Brassart, 1997) 48 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts Introduction : On rassemble sous ce terme (laits fermentés) différents produits obtenus par fermentation du lait par des bactéries lactiques et éventuellement d'autres micro-organismes, notamment des levures. Ils se différencient des fromages frais obtenus par coagulation lactique par l'absence d'égouttage du gel. La fermentation modifie les composants du lait et les caractères organoleptiques de celuici. Certaines de ces transformations sont communes aux divers laits fermentés; c'est le cas de l'acidification et de la gélification. D'autres sont spécifiques de chaque type de lait fermenté, comme la formation de composés aromatiques, de gaz, d'éthanol et l'hydrolyse des protéines. Les laits fermentés se différencient les uns des autres par: leur état final: coagulum (ou gel) plus ou moins ferme; crème plus ou moins visqueuse, liquide. Le produit peut aussi être mousseux; l'origine du lait: celui-ci peut provenir d'une seule espèce (vache, bufflonne, chèvre, brebis, jument, chamelle, yack, etc.) ou de plusieurs: la composition du lait en matière grasse et en matière sèche; il peut être: Plus ou moins écrémé ou enrichi en matière grasse. Utilisé en l'état ou dilué ou concentré par différents procédés (chauffage à feu nu ou en vacuum, ultrafiltration, addition de lait en poudre ou de concentrés protéiques pulvérulents tels que caséine ou caséinates). Les caractères de la flore lactique et de la flore éventuelle d'accompagnement. La température d'incubation. Les traitements technologiques. Les additifs: sucre, fruits, confitures, arômes naturels, colorants, etc. Les laits fermentés sont préparés depuis une époque très lointaine en Asie centrale, dans les pays méditerranéens et dans la plupart des régions d'élevage où ils constituent un mode de protection et de conservation du lait grâce à l'abaissement du pH en même temps qu'ils sont un aliment apprécié pour sa saveur. Longtemps restés traditionnels, certains de ces produits connaissent depuis quelques années un développement considérable grâce, d'une part, à l'intérêt qu'y trouvent les consommateurs sur le plan organoleptique, nutritionnel, voire thérapeutique et, d'autre part, à la mise en œuvre de procédés de fabrication industriels et aux progrès de la distribution. Enfin, l'attrait pour ces produits est renforcé par leur diversification et par de puissantes campagnes publicitaires. (FAO, 1998 Mahaut et al, 2000). Ces produits présentent un grand intérêt dans les pays en développement en raison de leur acidité qui en fait des aliments hygiéniques, sans inconvénients pour les consommateurs 49 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts intolérants au lactose. De plus, ils présentent une bonne valeur nutritionnelle, des qualités organoleptiques généralement très bien acceptées ainsi qu'une relative facilitée de préparation et de distribution. I. Différents laits fermentés Il existe un grand nombre de laits fermentés qui diffèrent par leur matière première, leur flore microbienne, leur technologie, leur texture, leur goût et leur durée de conservation. Certains sont voisins, mais présentés sous des noms variés. Beaucoup d'entre eux contiennent l'une ou les deux bactéries spécifiques du yaourt associées d'autres micro-organismes. Depuis plusieurs années, des fabricants cherchant de nouveaux débouchés ont repris, avec l'aide de scientifiques, l'idée émise par Metchnikoff au début du XXème siècle que la consommation des laits fermentés peut avoir un effet favorable sur la santé et constituer une «bactériothérapie lactique». C'est ainsi que sont apparus des produits contenant des bactéries intestinales comme des bifidobactéries en association avec des bactéries lactiques. On trouvera ci-après un bref résumé des technologies des principaux laits fermentés, fabriqués depuis une époque très ancienne ou récente. a- Lait à l'acidophile Le lait entier ou écrémé est soumis à un traitement thermique. Selon les fabricants il est: Soit pasteurisé à 95 °C pendant 30 secondes. Soit chauffé pendant 1 heure à une température proche de l'ébullition. Soit chauffé deux fois de suite pendant 1 heure à 90 °C. Soit stérilisé sous pression à 115 °C. Soit traité par UHT (quelques secondes à 141-145 °C). Après refroidissement à 37 °C, il est ensemencé avec 1 à 5 % d'une culture pure de Lactobacillus acidophilus. Ce germe est isolé de selles de nourrissons au sein ou d'excréments de jeunes veaux. Le lait est ensuite généralement mis en bouteille et maintenu à 36-37 °C jusqu'à ce qu'il coagule, ce qui demande de 20 à 24 heures. Il est alors mis au froid (vers 5 °C) jusqu'à sa consommation, qui doit être rapide afin d'éviter une acidification excessive (supérieure à 1,8 pour cent d'acide lactique) et une baisse de la teneur en bactéries vivantes. Le produit se présente comme une crème d'odeur légère et de saveur acidulée particulière. Dans certains pays, il est apprécié comme aliment hygiénique. Il existe un lait fermenté préparé à l'aide de levain yaourt associé au Lactobacillus acidophilus. 50 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts b-Laits fermentés aux bifidobactéries : Ce sont des laits fermentés à l'aide de bifidobactéries associées à diverses bactéries. Il en existe plusieurs types: Type levain yaourt + bifidobactéries + Lactobacillus acidophilus; Type levain yaourt + bifidobactéries, soit d'origine humaine, soit d'origine animale. Les produits faits avec une bifidobactérie d'origine animale, essentiellement Bifidobacterium animalis, sont actuellement les plus répandus. Leur technologie est celle du yaourt (incubation entre 42 et 45 °C) à la condition de choisir des souches de B.animalis capables de résister en milieu acide (pH 4,5-4,2) et en anaérobiose relative. Les produits faits avec une bifidobactérie d'origine humaine, essentiellement Bifidobacterium longum, demandent de profondes modifications de la technologie du yaourt: les souches de levain yaourt doivent être capables d'acidifier le lait à 37 °C; l'acidification doit être lente et modérée; la fermentation et le conditionnement en anaérobiose relative sont nécessaires; la résistance relative au pH de B.Iongum impose une variation de 4,8 à 4,4 durant la conservation du produit. Ces contraintes demandent, d'une part, une grande maîtrise du procédé de fabrication et, d'autre part, une sélection des microorganismes accompagnant la bifidobactérie de façon à obtenir un produit de goût et de texture agréables et une bonne survie du B. longum. c-Laits fermentés alcoolisés : Les deux plus connus sont le kéfir et le koumis. d-Kéfir : Originaire du Caucase, ce produit s'est largement répandu, notamment dans l'ex-URSS, où il est fabriqué industriellement. Il peut être préparé avec le lait de différentes espèces (vache, chèvre, brebis). e-Koumis : Ce produit originaire des steppes de l'Asie centrale est fabriqué avec du lait de jument. Un produit très voisin est préparé avec du lait de chamelle et quelquefois d'ânesse. Il existe des imitations industrielles faites avec du lait de vache additionné de 2,5 à 5 pour cent de sucre. Comme pour le kéfir, la fermentation résulte d'une flore mixte et complexe faite de bactéries lactiques et de levures. Il s'agit d'un liquide laiteux, consommé abondamment comme boisson par les éleveurs lors de la saison de production. Le coagulum, finement dispersé, est peu perceptible lors de la dégustation. Fabrication du koumis reste très traditionnelle en raison des faibles quantités de 51 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts lait de jument ou de chamelle disponibles. La méthode de préparation ci-après pour un koumis imitation au lait de vache est transposable à d'autres laits. f-Le leben: Un lait acidifié largement consommé dans les pays chauds et en particulier en Afrique du nord et au Moyen-Orient est le Leben ou Lben. Il est préparé à l'aide de lait le plus souvent partiellement ou totalement écrémé. Dans les pays où la production laitière est faible, on utilise fréquemment du lait reconstitué (I kg de poudre de lait écrémé pour 101 d'eau). Après pasteurisation et dégazage éventuel, le lait est refroidi à 20-22 °C et ensemencé au moyen de 2,5 à 3 pour cent d'une culture de bactéries lactiques mésophiles. La fermentation se poursuit pendant 18 à 20 heures environ jusqu'à coagulation et obtention d'une acidité de 0,65 à 0,70 % d'acide lactique (de 65 à 70 ° Dornic). Le caillé est alors plus ou moins finement divisé et brassé en même temps qu'il est refroidi vers 4-5 °C. Il est ensuite mis en conditionnement de vente ou vendu en vrac. Au froid, ce produit légèrement acide et au goût agréable peut se conserver 1 semaine. Il peut être préparé avec des laits de diverses espèces (brebis, chèvre). La fermentation faite généralement avec des bactéries lactiques mésophiles l'est aussi avec des thermophiles; certaines souches sont recherchées pour leur propriété qui consiste à rendre le produit visqueux et filant. g-Le Babeurre : Dans certains pays producteurs de beurre, le babeurre issu du barattage est consommé comme boisson ou utilisé en cuisine. Lorsque la quantité de babeurre est insuffisante, on fabrique du cultured buttermilk à partir d'un lait acidifié. On part d'un lait écrémé ou à faible teneur en matière grasse (de 0,1 à 0,8 %) et additionné de 0, l pour cent de sel pour relever le goût. La matière sèche peut être augmentée par apport de 1 à 2 pour cent de lait écrémé en poudre. Le lait est chauffé en cuve pendant 20 à 30 minutes à 8090°C ou pasteurisé à 90-95 °C pendant un temps variable (de 1 à 5 minutes). Ce chauffage poussé a pour but d'améliorer la viscosité et la stabilité du produit. Le lait refroidi à 21-23°C est ensemencé à l'aide de 0,5 à 3 % d'un levain associant diverses espèces de bactéries lactiques mésophiles. Après 14 à 16 heures d'incubation à 22 °C, on obtient un coagulum dont l'acidité est voisine de 0,8 pour cent d'acide lactique (pH 4,74,6). (FAO ,1998) h-Le fromage : La dénomination fromage est réservée, selon le décret n°88-1206 du 30 décembre 1988, au produit fermenté ou non affiné ou non, obtenu à partir de matière d’origine exclusivement laitière (lait entier, lait partiellement ou totalement écrémé, crème, matière 52 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts grasse, babeurre), utilisées seules ou en mélange, coagulées en totalité ou en partie avant égouttage ou après élimination partielle de leur eau. Le mot fromage vient du latin « formaticum »signifiant qu’il est fabrique dans une forme appelée moule. I- Le Yaourt : Le yaourt ou yoghourt est le lait fermenté le plus consommé. Il résulte de la fermentation du lait par deux bactéries lactiques thermophiles: Streprococcus salivarius, subsp. thermophilus (anciennement dénommé Str. thermophilus), et Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (anciennement dénommé L. bulgaricus). Cette fermentation conduit à la prise en masse du lait. Le coagulum obtenu est ferme, sans exsudation de lactosérum. Il peut être consommé en l'état ou après brassage lui donnant une consistance crémeuse ou liquide. Il peut aussi être congelé et consommé comme une glace. Le Code des principes FAO/OMS a publié deux normes relatives aux yaourts: la norme n° A- 11 (a) (1975) pour le yaourt et le yaourt sucré; la norme n° A- 11 (b) (1976) pour le yaourt aromatisé et les produits traités thermiquement après fermentation. Le Codex Alimentarius, norme n° A- 11 (a) (1975) définit ainsi le yaourt: «Le yaourt est un produit laitier coagulé obtenu par fermentation lactique grâce à l'action de Lactobacillus Bulgaricus et de Streptococcus thermophilus à partir du lait frais ainsi que du lait pasteurisé (ou concentré, partiellement écrémé, enrichi en extrait sec) avec ou sans addition (lait en poudre, poudre de lait écrémé, etc.). Les micro-organismes du produit final doivent être viables et abondants.» La législation de nombreux pays exige que les bactéries du yaourt soient vivantes dans le produit mis en vente. D'autres pays admettent qu'à la suite d'un traitement thermique destiné à améliorer la durée de conservation, le produit ne contienne plus de bactéries vivantes. Cette pratique n'est pas recommandable, car elle modifie les propriétés du yaourt. 1. Intérêt nutritionnel des laits fermentés : La fermentation du lait conduisant à la formation d'acides organiques, notamment d'acide lactique, entraîne une acidification du lait. Ces laits fermentés peuvent résulter d'ensemencements spontanés à température ambiante, ou d'ensemencements par une flore et à une température contrôlée. Ce contrôle porte sur le choix des espèces et des souches en fonction de leur intérêt technologique (texture du produit) ou organoleptique. 53 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts Ces produits laitiers fermentés ajoutent leurs propriétés propres aux qualités nutritionnelles du lait utilisé. En particulier, l'acidification constitue du point de vue hygiénique un atout majeur. En effet, elle prévient la croissance de la plupart des germes pathogènes et assure, par des moyens qui peuvent être très simples, la conservation du lait. De très nombreuses souches et espèces de bactéries lactiques sont utilisées pour la fabrication des laits fermentés (streptocoques et lactobacilles). Depuis peu, on utilise aussi des bactéries d'origine intestinale telles que les bifidobactéries. Certaines levures sont aussi utilisées, en association avec des bactéries, par exemple pour le kéfir. Par contre, les moisissures sont rarement utilisées dans la fabrication des laits fermentés traditionnels. Traditionnellement, et plus particulièrement depuis les travaux de Metchnikoff sur le yaourt au début de ce siècle, les produits laitiers fermentés jouissent d'une image positive quant à leurs relations avec la santé. Cependant, il aura fallu attendre les années 80 pour que des faits scientifiques établissent certaines de ces propriétés. La plupart de ces travaux ont porté sur le yaourt, produit répandu, de flore simple et bien connue, pour laquelle il a été rapidement montré qu'elle était capable de survivre pendant son passage dans l'intestin, sans toutefois s'y implanter. (FAO, 2002). 2. Effets de la fermentation sur la composition du lait : L'effet majeur de la fermentation lactique sera l'hydrolyse des glucides du lait. Le lactose, quantitativement le principal composant solide du lait, est présent dans le yaourt hydrolysé à raison de 30 pour cent environ pour donner, pour chaque molécule, une molécule de galactose et deux molécules d'acide lactique. Il ne faut guère plus de trois heures à 45 °C pour que les bactéries transforment un lait en yaourt qui contiendra environ 1 pour cent d'acide lactique sous les formes racémiques L (+) et D (-) en proportions variables selon les conditions de fabrication et de stockage. La production d'acide lactique au cours de la fermentation conduit à un abaissement du pH qui aura pour effet de cailler le lait. L'homme métabolise les deux formes, la forme D (-) plus lentement que la forme L (+). Selon le comité ad hoc FAO/OMS de 1973, la situation est différente chez le nouveau-né: l'immaturité du foie ne lui permettrait pas de métaboliser complètement la forme D (-), entraînant ainsi un risque d'acidose. Pour cette raison, le comité recommande de ne pas donner d'aliments contenant de l'acide lactique D (-) avant l'âge de trois mois. Les autres sources énergétiques, les lipides et les protéines du lait, sont peu modifiées par la fermentation, hormis la formation d'un coagulum. Il existe une protéolyse modérée et les acides aminés libérés sont importants pour assurer la croissance symbiotique des bactéries 54 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts du yaourt. Il faut noter par ailleurs que, pour la fabrication du yaourt, il peut être d'usage d'enrichir le lait en poudre de lait. C'est ainsi qu'en France, le yaourt est le plus souvent plus riche que le lait en divers nutriments (protéines, calcium, etc., et parfois même en lactose). D'autre part, ces produits peuvent être plus ou moins sucrés. Leur teneur en saccharose varie alors de 7 à 15 pour cent. La teneur vitaminique du lait de départ est modifiée par la fermentation; certaines vitamines sont consommées par les bactéries, d'autres sont produites. Les travaux publiés à ce jour sont souvent contradictoires. Il ressort, cependant, une augmentation importante de la teneur en acide folique du yaourt. Des travaux récents et précis peu nombreux tendent à montrer d'importantes différences dans la digestion des protéines selon la technologie subie par le lait. Ainsi, selon Scanff et al. (1990), avec le lait, il se forme rapidement un caillot de caséine dans l'estomac, celle-ci étant évacuée lentement sous forme de peptides. Avec le yaourt, il ne se forme pas de coagulum et, très rapidement, la caséine est évacuée sous forme dégradée et même sous forme non dégradée. Il a été aussi montré que le temps de transit du yaourt dans l'intestin est plus long que celui du lait. (FAO, 2002). 3. Effets sur la tolérance au lactose : Parmi les causes d'intolérance au lait, la mieux connue est certainement celle liée au lactose. Par défaut de lactose (ou ß-galactosidase) dans la bordure en brosse de la muqueuse intestinale, le lactose n'est plus hydrolysé; il n'est donc plus absorbé dans l'intestin grêle et va atteindre le colon, où il sera fermenté par la flore intestinale en donnant naissance à des gaz et tout particulièrement à de l'hydrogène. Les symptômes de l'intolérance au lactose sont brièvement présentés au chapitre Le plus souvent, chez l'enfant, l'intolérance au lactose est due à un déficit en lactase intestinale secondaire à une entéropathie. Chez l'adolescent et l'adulte, la malabsorption du lactose est le plus souvent primaire. Une réponse à l'intolérance au lactose pourrait consister en l'utilisation de laits délactosés. Cependant, on verra au chapitre 9 que les laits fermentés et, en particulier, le yaourt sont susceptibles d'apporter une solution simple et peu onéreuse. (FAO, 2002). 4. Effets sur la flore intestinale : Un certain nombre de travaux chez l'animal montrent que l'ingestion de laits fermentés est susceptible de modifier la flore intestinale de l'hôte, en particulier de diminuer la quantité de germes indésirables. On dispose, par contre, de très peu d'informations sur son effet chez 55 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts l'homme. Plusieurs études depuis les années 50 indiquent que l'ingestion de lait fermenté par Lactobacillus acidophilus est susceptible de réduire le nombre d'Escherichia coli dans les selles qui contiennent alors considérablement plus de L.acidophilus qui, par ailleurs, fait partie de la flore intestinale humaine. Cette propriété semble avoir été utilisée avec succès dans le cas d'enfants souffrant de diarrhées à E. coli. Parmi les activités métaboliques de la flore, on s'est particulièrement intéressé à des activités enzymatiques qui sont associées, chez l'animal de laboratoire et chez l'homme, à la formation de substances cancérogènes. L'ingestion de différents laits fermentés fait baisser l'activité de ces enzymes chez l'animal. Toutefois, il faut noter qu'il n'a pas été démontré chez l'homme de relation entre l'activité de ces enzymes et la survenue de cancers du colon. . (FAO, 2002). 5. Sensibilité aux infections et réponse immunitaire : L'ingestion de laits fermentés semble entraîner des modifications des défenses immunitaires à plusieurs niveaux. C'est ainsi que l'on a suggéré la possibilité d'une augmentation de certaines immunoglobulines après ingestion de yaourt ou de Lactobacillus acidophilus ou encore de L casei, ainsi qu'un rôle dans la migration des macrophages périphériques vers le foie. (De Simone et al. 1988) D'autres recherches concernent une possible stimulation de la production de cytokines, protéines importantes dans la régulation du système immunitaire ainsi que pour leur action antibactérienne et antivirale, parmi lesquelles figurent les interférons. (Solis et Lemonnier, 1991 et 1992) Levains lactiques : 1. Introduction: Les levains traditionnels sont encore employés lors de la fabrication de fromage, yaourt et d'autres laits fermentés. Les bactéries constituant ces ferments sont des espèces déterminées et leur activité globale caractérise le ferment: l'acidification, la protéolyse, la formation d'arômes et l'obtention d'une texture. Actuellement les souches commercialisées ont été isolées du lait ou des produits laitiers et en particulier des levains artisanaux. 2. Définition: Un levain est une culture de souche permettant à stimuler une fermentation dans un milieu. (In Idoui , 1994) Le levain est capable de transformer l'aliment (ex: Le lait) en un " nouveau produit 56 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts possédant des propriétés définies et constantes et permettre Une bonne conservation de l'aliment en le défendant en particulier contre la détérioration par d'autres micro-organismes. 3- Rôle des levains: Les principales fonctions sont: Transformation du lactose en acide lactique avec un abaissement du pH et une augmentation de l'acidité dornic. Conférer au produit final des propriétés définies et constantes à savoir un goût acidulé résultant de la production de composés aromatiques et des polysaccharides responsables de la viscosité. Permettre une bonne conservation de l'aliment par la production de bactériocines. 4- Principaux levains lactiques : 4-1- Levains naturels : Ce sont des ferments constitués par des mélanges dont la composition exacte est indéterminée, il est distingué des thermophiles et des mésophiles. (Luquet, 1994) 4-2- Levains sélectionnés: Ce sont des levains mixtes constitués d'un mélange de souches pures" dotées de bonnes propriétés acidifiantes, aromatisants et épaississantes. (Luquet, 1994) 5-Différentes formes de levains: 5-1- Cultures liquides: Elles sont constituées de micro-organismes actifs et assurent une croissance rapide après ensemencement et se présentent sous une concentration de 109 germes/ml. . 5-2- Cultures lyophilisées : A partir de culture liquide, les cultures lyophilisées sont préparées par addition d'un substrat protecteur, en utilisant le séchage par sublimation. Elles peuvent être conservées à température ambiante. 5-3- Cultures concentrées: C'est des cultures liquides concentrées par centrifugation jusqu'à atteindre des taux de 10 à 10 bactéries / ml. 5-4-Cultures concentrées lyophilisées: A partir des cultures liquides, les cultures concentrées lyophilisées sont obtenues en utilisant la concentration par centrifugation suivie d'une lyophilisation. 57 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts 6- levains spécifiques du yaourt : La fabrication du yaourt est due à la fermentation conjointe du lait par les Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus. 6-1- Streptococcus thermoplilus Elle se distingue essentiellement des autres streptocoques lactiques par sa croissance thermophile avec un optimum autour de 42-43°C, l'absence de tout antigène de groupe et sa thermo résistance à 60°C (parfois 65°C) durant 30 minutes. (Garvie, 1986) Elle est caractérisée par une activité homofermentaire, le plus souvent réduite à quelques sucres (glucose, lactose, saccharose) et une forte sensibilité au Nacl. (Hardie, 1986) Elle se présente sous forme sphérique en chaîne, la GC% de son ADN varie de 37 -40 %, et le pont peptidique du PTG est de type L -Tys -L- ala (Farrow et Collins, 1990) (Tableau N°18) 6-2-Lactobacillus bulgaricus : C'est des bactéries lactiques homofermentaires à Gram(+), thermophiles, de forme bâtonnets avec une croissance optimum à 45°C et un optimum de température de production d'acide variant de 43-46°C. Elles sont thermotolérantes, avec une relative activité protéolytique, et supportent un milieu acide (pH = 4-4,5). (Anonyme ,1998) Leur activité acidifiante se limite sur la fermentation de galactose et glucose seulement. (Accola, 1982) Elles ont un rôle essentiel dans le développement des qualités organoleptiques, hygiéniques et peut-être pro biotique des aliments et le taux de GC de son ADN est de 50%. (Tableau N°19) 7-Habitat : On peut les isoler du lait chauffé à 45 -50°C ou du lait pasteurisé, (Hardie ,1986), des produits laitiers (du yaourt et du matériel de laiterie) et des levains artisanaux (Jones ,1978). 58 - - - + + - + - - - - + + - + - - - + + - + - - + + - + - + + - + + + - + + + Thermorésist ance à 63) c/ 30min Réductase - Production CO2 - de Streptococcus thermophilus Caractères biochimiques Recher Productio che de n citrate d’acétoine VP RM Production d’extrane + Croissance à PH - Croissance à PH 9.6 + catalase + 45° c - Tableau N°18 : les caractères physiologiques et biochimiques Caractères physiologiques Croissance Croissance au lait de à bouillon sherman hypersalé 3% 1% 4 6.5 % % + + + 10 °c code Genre streptococcu s thermophilu s streptococcus St1 thermophilus streptococcus St2 thermophilus streptococcus St3 thermophilus streptococcus St4 thermophilus streptococcus St5 thermophilus streptococcus St6 thermophilus streptococcus St7 thermophilus streptococcus St8 thermophilus streptococcus St9 thermophilus streptococcus St10 thermophilus streptococcus St11 thermophilus streptococcus St12 thermophilus Laits Fermentés et Yaourts Arginine ADH Chapitre III + - - + - Homo + - - - - + - Homo +c - - - - + + - Homo - - - + + - - + - Homo + + + - - + - - + - Homo +c - + + - - + - - + - Homo - - - + + - - + - - + - Homo +c + - - - - - + + - - + - Homo + - + - - + + - - - - - + - Homo +c - - + - + - - - - + - - + - Homo +c + + - + + + - - - + + - - + - Homo + + + - + - - - - - - - - - + - Homo + 59 Chapitre III streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus Laits Fermentés et Yaourts St13 - + - + - - - - - + + - - + - Homo +c St14 - + - + - - - - - - - - - + - Homo +c St15 + + - + - - + - - - + - - - + Homo + St16 + + - + - - + + - - - - - + - Homo + St17 + + - + - - + - - - + - - - - Homo + St18 - + - + - - + - - - + - - + - Homo - St19 - + - + - - + - - - + - + + - Homo + St20 + - - + - - + + - - + - + - + Homo + St21 - + - + - - + - + + + - - + - Homo + 60 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts + - + + + - - - - + + - - + Homo + + + - + - - + + + + + + - + - Homo + - + - - - - - - + + + + + +++ - Homo +- + - - + - - - - - - + - - + - Homo +- - - - + - - + + - + - - - + - Homo +- + - - + + + + + - - + + + + - Homo + - - - + - - - - - + + + - - + Homo + + + - - - - + - - + + + - - - Homo - 1% 4% 6.5 % Croissance à PH 9.6 - 45 °c Thermorési stan ce à 63 ° c /30 min Croissance à PH 5.5 Recherche de citrate Arginine ADH Production d’extrane Product ion d’acétoi ne Caractères biochimiques Production CO2 Catalasa Lactobacillus Lb1 delbrueckii ssp belbrueckii Lactobacillus Lb2 delbrueckii ssp belbrueckii Lactobacillus Lb3 plantarum Lactobacillus Lb4 delbrueckii ssp belbrueckii Lactobacillus Lb5 delbrueckii ssp lactis Lactobacillus Lb6 helveticus Lactobacillus Lb7 acetoleranc Groupe II Lactobacillus Lb8 intestinalis + : réaction positive - : réaction négative Caractères physiologique Croissance Croissance à au lait de bouillon sherman hypersalé 3% 10° c Genre lactobacillus et bifidobacterium Code Tableau N° 19 : Les caractères physiologiques et biochimiques des Lactobacilles VP RM ++ : production moyen de l’acétoine +++ : production très importante de l’acétoine c : coagulation positive homo : homofermentaire 61 Réd ucta se Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts 8- Symbiose entre Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgariccus : II existe une interaction favorable entre les Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus pendant la production du yaourt. Cette interaction est dite protocoopération auparavant appelée symbiose. (Guyot, 1992) (Figure 6) La température optimale de ces deux espèces étant voisine, la croissance en association est possible entre 41°C et 43 °C. (Marshall et Law, 1984) Les interactions résultant de l'association des deux souches spécifiques du yaourt jouent un rôle prépondérant dans la fabrication de ce produit. L'acidification dépend dans une large mesure des relations symbiotiques, qui s'établissent entre les deux souches présentes est connu que l'association du Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus se traduit par un effet synergique notable sur l'activité acidifiante. Les Lactobacillus bulgaricus libèrent certains acides aminés (valine, histidine, glycine), ces acides amines exercent un effet stimulant pour la croissance des souches Streptococcus thermophilus. La souche Lactobacillus bulgaricus stimule la production d'acides par la souche streptococccus thermophilus. Le gain en production d'acides résulte vraisemblablement de l'action protéolytique du germe stimulant sur les protéines du lait car on peut obtenir un effet analogue en ajoutant au lait différentes combinaisons d'acides aminés, la souche Streptococcus thermophilus est stimulée par Méthionine, Glycine et histidine. (Figure 7) (Article MAI 97 Etude Des Interaction Entre Lactobeillus bulgarieus ET Streptoeoeeus thermophilus fournie à l'industrie laitière marocaine) 1ère phase: Caractérisée par la croissance rapide des Streptococcuus thermophilus ; la tolérance à l’O2 et le pH du lait voisin à 6,6 favorisent le développement des Streptococcus thermophilus utilisant des faibles quantités d'acides aminés et peptides présents dans le lait permettant d'assurer le démarrage de leur croissance, en produisant l'acide lactique jusqu'à atteindre un pH = 4,2 à 4,3. 2ème phase: Le pH acide 4,2 et 4,3 et le CO2 libéré par les Streptococcus thermophilus lors de décarboxylation de l'urée présente naturellement dans le lait stimulent la croissance des 62 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts Lactobacillus bulgaricus en utilisant certains composés issus de la fermentation des hydrates de carbone à savoir l'acide formique, acide pyruvique produite par les Streptococcus thermophilus.(Ebenezer et Vedamuthu ,1991) Les Lactobacillus bulgaricus dégradent les caséines du lait en libérant les peptides nécessaires à la croissance des Streptococcus thermophilus, les Streptococcus thermophilus dominent le début de la fermentation (pH = 6,6) aussitôt que le pH, diminue à 5,2 les Lacobacillus bulgaricus commence à croître rapidement. (Ebenezer et Vedamuthu, 1991) (Tableau N°20) Cette coopération est achevée lorsque le pH= 4,4 où seules les, Lactobacillus bulgaricus se développent .Le résultat de cette symbiose entre les deux espèces est l'amélioration de la flaveur et la texture des produits finis. (Ebenezer et Vedamuthu, 1991) 63 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts Tableau N° 20 : le profil fermentaire de Streptococcus thermophilus Genre streptococcus thermophilus Code ARA LAC XYL DUL GAL GLYC SACC GLY RAF RHA MANI streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus streptococcus thermophilus St1 + + + - + - -+ + + - - St2 + + + - + - + + + - + St3 - + + V + - -+ +- - - + St4 - + - - + - +- + - - + St5 - + - V + - - + - - - St6 - - + - + - +- +- - - - St7 - + - V + - + - - - +- St8 - + - - + - + - - - - St9 - + - + + - - + - - +- St10 - - + V + - +- + - - + St11 - + - - + - + + + - +- St12 + + + + + - + + - - +- St13 - + - - + - + + - - +- St14 - + - - + - + + + - + St15 - + - - + - + + - - + St16 ** + - - + - + + - - +- St17 - + - - + - + + - - +- St18 + + + - + - + + + - + St19 + + + - + - + + - - + St20 - + + - + - + + + - - St21 - + - - + - + + - - - 64 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts Acide lactique Acide formique CO2 petits peptides (Acides aminés) S. thermophilus L. bulgaricus Lactose Production Inhibitation Stimulation Figure N° 6. Métabolisme complémentaire des Streptococcus thermophilus et des Lactobacillus bulagaricus dans le lait (Driessen, 1982) 65 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts Streptococcus thermophilus lactobacillus bulagaricus Acide aminés + Peptides protéine du lait CO2 Acide Formique Urée du lait Lait Figure N°7: Facteurs stimulants la coopération interéspéce entre Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulagaricus (Driessen et al ,1992) 66 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts 9- Production de Polysaccharides : Après croissance dans le lait, les deux souches, Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgariccus sont considérées comme responsables de la viscosité du yaourt. Cette viscosité est attribuée - à la production d'EPS par les souches utilisées. Le caractère visqueux développé par ces deux souches est instable et la démonstration de leur contribution à la viscosité du produit qui n'a pas été démontrée... Les Lactobacillus bulgaricus produisent en phase exponentielle précoce des EPS solubles en présence de divers substrats carbonés et sont formés de fructose et de glucose (2/1); avec des liaisons a (1/4) et à (1/6). Par contre celui des Streptococcus thermophilus est formé de galactose, de glucose ainsi que de mannose. (Desmazeaud ,1992) 10- Production d'arôme: Pendant la fermentation, les deux souches du yaourt produisent des composés de flaveur qui contribuent à l'arôme du yaourt tel que l'acétaldéhyde Acétone, acétone, diacétyl, éthanol qui proviennent en majorité de la transformation de certains acides aminés ainsi que de la dégradation du citrate. (Bourgeois et al, 1989 ; Lenoir et al, 1992) La méthionine est souvent utilisée pour la production d'acétaldéhyde qui est le principal produit responsable de l'arôme des yaourts. (Alvarez et al, 1998) Thréonine CH3CHOH - CHNH2-COOH NH2CH2COOH + CH3CHO Aldolase Glycine Acétaldéhyde Les Lactobacillus bulgaricus le produisent en utilisant la thréonine (à pH = 5) qui donne au yaourt sa saveur caractéristique. Les Streptococcus thermophilus produisent un diacétyle qui confère au yaourt une flaveur crémeuse. (William et al, 1984) En culture mixte (Streptococcus thermophilus + Lactobacillus bulgaricus) l'acétaldéhyde est produit en grandes quantités. Tandis qu'en culture seule le Lactobacillus bulgaricus le secrète d'avantage que Streptococcus thermophilus (Des Mazeaud, 1992) 67 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts Acide aspartique B – aspartyle phosphate Méthionine S – adénostyle – homocysteine l- Homocystéine Aspartique – B- semialdehyde Cystathionine l-Homosérine Homosérine phosphate Thréonine Glvcine + Acétaldéhyde Figure N°8 : Voie de conversion de méthionine en acétaldéhyde par Streptococcus. Thermophilus 68 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts 11- Production de bactériocine : Les bactéries lactiques sont de très bons producteurs de substances antibactériennes de nature peptidique ou protéique chez les Lactocoques ; c'est la nisine qui est la bactériocine la plus décrite. Elle présente la caractéristique d'inhiber en plus les bactéries lactiques différentes bactéries à Gram +, notamment Clostridium , Bacllus, Listéria monocytogenes, pédiocine ,chez pédiococcus .Sakacine chez Lb. Sake et même plantaricine chez Lb.plantarum. Les bactériocines des bactéries lactiques présentent un spectre d'activité qui n'est pas toujours conféré aux bactéries de la même espèce ou du même genre. En revanche, il n'a pas été. Caractérisé de bactériocines actives en vers Gram (-). Les inhibitions peuvent parfois être dues à un ensemble d'autres facteurs agissant avec une certaine synergie: l-production d'acide lactique et acide acétique, de peroxyde d'hydrogène. 2-stress chimique ou du pH. 3- compétition en vers les nutriments du milieu. Pour que ces substances inhibitrices puissent trouver un réel développement autant qu'additif industriel, elles devraient présenter les caractères suivants: Avoir un spectre d'activité étendu sur Gram (+)et Gram(-)et certaines bactéries sporulées Avoir une action bactéricide et pas seulement bactériostatique. Présenter une bonne activité et une bonne stabilité dans toute la gamme des pH et de température à différents stades de fabrication. Ne pas perturber les cinétiques d’acidification des levains acidifiants destinés à la production d'arôme. Présenter une bonne innocuité pour les consommateurs. (Desmazeaud, 1996). Technologie de fabrication du yaourt : 1- Introduction: C'est l'histoire d'une magie lactée, où le lait se transforme et s'enrichit sous l'action de micro organismes pour devenir cet aliment lacto-fermenté particulièrement original. Le hasard des bactéries lactiques d'une plante sur un ustensile en peau de bête ou en bois dans le quel étant conservé du lait puis une fermentation... voilà sans doute le point de départ du 1er yaourt. Les laits fermentés ont une caractéristique commune ; ils sont tous obtenus par la 69 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts multiplication de bactéries lactiques dans une préparation du lait, l'acide lactique coagule ou épaissit le lait et lui confère une saveur acide plus au moins prononcée. Les caractéristiques propres des différents laits fermentés sont dues à la variation particulière de certains facteurs comme la composition du lait, la température d’incubation, la flore lactique ou la flore microbienne autre que lactique. 2- Historique : La croyance dans les vertus du lait fermenté est partagée depuis des temps immémoriaux, des temps préhistorique. Le yaourt est un produit de la fermentation du lait, procédé très ancien, probablement à l'époque où l'homme a commencé à domestiquer les espèces laitières et à utiliser leurs laits. Les bactéries lactiques du sol ou des plantes avaient dû contaminer le lait et s'y étaient développées. De même elles avaient dû se répandre et s'installer dans les récipients à recueillir et à conserver le lait qu'ils furent en bois puis en peau. Cette contamination accidentelle ne permettait sûrement pas d'avoir des produits ayant des saveurs définies et stables mais elle avait indéniablement l'avantage de prévenir le développement de la flore pathogène. Ce produit est d'origine bulgare; mais a pris un développement considérable dans les steppes d'Asie, dans les pays méditerranéens, en moyen orient et dans la plus part des régions d'élevage. De tout temps, il est reconnu pour ses pouvoirs bien faisant. 3-Définition : Le yaourt ou yoghourt: ces deux appellations désignent un même aliment à base de lait qui a subi des transformations grâce à l'emploi de micro organismes particuliers origine de bactéries lactiques associées: Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus. Selon la F.A.O et O.M.S (1977), le yaourt est un lait coagulé obtenu par la fermentation lactique acide due à ces deux bactéries du lait pasteurisé ou concentré avec ou sans addition de lait en poudre. Les micros organismes du produit final doivent être viables et abondants. Les ferments doivent être au minimum de 10 millions de germes par gramme de yaourt (Syndifrais ,1994). Certains pays admettent qu'à la suite d'un traitement thermique destiné à améliorer la durée de conservation, le produit ne contient plus de bactéries vivantes Cette pratique n'est pas recommandable car elle modifie les propriétés du yaourt. (FAO et INPH, 1998), à l'exclusion de tout autre traitement thermique, il est alors prêt à être consommé. 70 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts Ces produits doivent être posés à température comprise entre 0 et 6 °C jusqu'à la consommation afin de maintenir les bactéries lactiques en vie. (Mission Scientifique de Syndifrais ,1977) 4-Classification : 4-1- Selon le mode de représentation : II existe deux types de yaourts, c'est en 1925 que le mot yaourt ou yoghourt ont fait leur entrée officielle dans le petit Larousse; le premier est d'origine grecque et le second est d'origine turque. . Les deux termes sont reconnus par la législation européenne, ils ne peuvent en venir qu'à un lait fermenté avec des bactéries caractéristiques Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus. Certes, les termes varient selon les aires culturelles Dehbi en indien, Leben en égyptien, Mayzoom en arménien, Mast en ersan , Rhaib ou Laban en arabe. . . sans oublier les boissons voisines telle le Koumiss( avec du lait de jument) dans les steppes de Sibérie ou le KéfIT (avec des grains) en Caucase. 4-1-1- Yaourt ferme ou étuvé: (dit traditionnel) Ce sont généralement des yaourts natures ou et aromatisés dont la fermentation a lieu en pots à une température comprise entre 42- 44°C pendant 4 heures. (Assche ,1996) Dans le cas des yaourts sucrés, aromatisés aux fruits, miel... etc., l'apport des additifs se fait avant que la fermentation ne débute. (VeisseyrE ,1979) 4-1-2- Yaourt à caillé brassé ou brassé plus liquide: A la différence du précédent sa fermentation s'effectue en vrac dans des cuves, le caillé est ensuite brassé puis refroidi avant d'être conditionné en pots, qui seront stockés en chambre froide. Ce sont généralement des yaourts veloutés nature ou à la pulpe de fruit ou yaourt avec morceau de fruits. (Assche, 1996) Le yaourt à boire liquide : sa texture "est liquide, après avoir été brassé, il est battu dans les cuves avant d'être conditionné. 4-2- Selon leur teneur en matière grasse : On distingue trois types de yaourt : 4-2-1- Yaourt maigre: Ce type de yaourt renferme moins de 1 % de matière grasse son apport énergétique est de 44 Kcal 71 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts 4-2-2- Yaourt partiellement écrémé: Contenant entre 1 et 3% de matière grasse et son apport en énergie est estimé à 50 Kcal 4-2-3- Yaourt entier: Ce type de yaourt contient au maximum 3 à 3,5 % de matière grasse. 5-Technologie de fabrication 5-1- Préparation du lait: La matière première peut être soit du lait frais, soit du lait recombiné (à partir de lait en poudre écrémé et de matière grasse laitière anhydre), soit du lait reconstitué (à partir du lait en poudre maigre) dans tous les cas, il doit être de bonne qualité microbienne et parfaitement homogénéisé. L'extrait sec du lait de fabrication est un facteur important dans la fabrication car il conditionne la consistance et la viscosité du produit. Les protéines tout en améliorant la texture masquent aussi l'acidité, les matières grasses donnent une valeur plus douce et plus crémeuse et un arôme meilleur. Pour augmenter l'extrait sec du lait on peut procéder de diverses manières, couramment on procède à une adjonction de poudre de lait ou à la concentration. 5-1-1- Adjonction de poudre: Si l'on utilise de la poudre de lait écrémé, l’adjonction se fait à des taux de 2 à 3% pour arriver à un extrait sec dégraissé (E.S.D) final de l'ordre de 14 à 16 %. (Bourgeois et Larpent ,1996). 5-1-2- Concentration du lait: La concentration s'effectue directement par évaporation sous vide. (Hermier et Accolas ,1990) 5-2- Homogénéisation : Actuellement simultanément à la pasteurisation on utilise 1 'homogénéisation. Ce traitement permet pour les yaourts gras une stabilisation de l'émulsion grasse et évite ainsi la remontée de crème au cours de l'incubation (Veisseyre, 1973) et obtenir- des gels visqueux avec une capacité de rétention d'eau plus grande, il a aussi comme avantage une meilleure digestibilité des graisses et donc moins sujet à la synérèse. (Roloinson ,1985) Pour les yaourts maigres, le lait peut être homogénéisé deux à trois fois, ce qui améliore sa consistance (effet sur la caséine). (Veisseyre, 1979) 72 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts Pour Kurman, la température ne doit pas être trop élevée lors de l'homogénéisation (55-60°C) et la pression doit se situer à environ 200 atmosphères, mais maintenant on travaille à des températures plus élevées (8590°C) avec des pressions d'homogénéisation proche de 250 atmosphères. L’homogénéisation peut s'effectuer pendant la montée en température avant la section de pasteurisation mais elle peut aussi se faire après la pasteurisation; elle permettrait alors une meilleure consistance du yaourt mais avec des risques de recontamination. (Lemoinier et al ,1989) 5-3- Pasteurisation: Le lait enrichi va subir ensuite un traitement thermique, ce dernier a pour but: La destruction des germes pathogènes et une grande partie de la flore banale originelle ou simplement indésirable" pour la conservation du produit. Il permet aussi la destruction éventuelle de certaines substances inhibitrices naturelles en favorisant aussi la croissance de la flore lactique spécifique. Le troisième effet est de favoriser la précipitation d'une fraction des albumines, il dénature environ 80 % des protéines solubles du lait, ce qui entraînera une meilleure rétention d'eau et une amélioration de la consistance. Grâce à cette dénaturation, la capacité à fixer de l'eau est multipliée par un facteur de trois, en comparaison de celle du lait non chauffé .En outre, les protéines dénaturés se fixent à .la surface des micelles de caséine. Ces deux phénomènes "ont une répercussion directe sur les propriétés rhéologiques du gel formé après l’acidification. L’effet de dénaturation recherché est obtenu par un chambrage du lait avant son refroidissement. La plus couramment utilisé est une pasteurisation à 90-95°C (avec chambrage de 3 à 5 minutes). Une pasteurisation trop poussée (plus de 5 minutes à 92°C) aura un effet néfaste sur le produit. (Luquet, 1990) Cependant, la pasteurisation peut être remplacée par une stérilisation soit par injection directe de vapeur soit par un chauffage indirect (quelques secondes à 135 - 140°C) .Dans ce cas, on constate une viscosité plus faible dans le produit. 5-4- Refroidissement : Généralement, l'abaissement de la température à un degré qui avoisine les 45°C donnent un corps doux et uniforme. 5-5- Ensemencement: L'ensemencement c'est l'inoculation des deux germes spécifiques du yaourt: 73 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus. L'ensemencement du lait doit se faire à un taux suffisamment élevé, il est d'ailleurs préférable d'ensemencer avec une quantité trop grande plutôt que trop faible car on aura l'assurance d'une acidification correcte, les bactéries pourront mieux surmonter les conditions défavorables (manque de facteur de croissance, résidus d’antibiotiques, phase de latence trop longue). On évite aussi le défaut' d'une texture sableuse et éventuellement la synérèse en cas de ralentissement d'acidification. Un dernier critère à ne pas négliger: l’ensemencement doit être homogène, c'est à dire que l'on doit avoir une répartition des germes bonne et régulière dans le lait. L'ensemencement c'est l'inoculation d'un levain mais en plus de l'apport de germes actifs c'est aussi un apport d'acide et de lait caillé (l'acidité du levain est d'environ 85 - 90 °D). 5-6- Conditionnement: C'est la phase ultime de la fabrication, c'est après l'ensemencement que se différencient les technologies particulières des yaourts étuvés ou brassés, le mélange lait / ferment est soutiré et conditionné en pots. Les yaourts sont généralement conditionnés dans deux types d'emballage: les pots en verre et les pots en plastique. En effet, les pots en carton paraffiné ont pratiquement disparu au profit des pots en plastique. (Vernier, Barthelemy et Rathe, 1990) La mise en pots de verre ou de plastique s'effectue automatiquement, le dosage, la fermeture,' impression de la date limite de consommation sont réalisés par des machines. (Assehe, 1996) 5-7- Etuvage: La phase d'incubation correspond au développement de l'acidité dans le yaourt, elle est sous la dépendance de deux facteurs: la température et la durée. On choisi souvent une température proche de la température optimale de développement des Streptococcus thermophilus soit 42-45°C plutôt qu'une température proche de l'optimum du Lactobacillus bulgaricus (47–50 °C) car il est préférable que les Streptococcus thermophilus assurent le départ de la fermentation lactique. Cette température voisine de 42-45°C est d'ailleurs la température symbiotique optimum. (Luquet, 1990) 5-8 Refroidissement Lorsque l'acidité atteint un certain seuil (70 - 80 D°) dans le cas des yaourts étuvés (100 - 120 D°) dans le cas des yaourts brassés, il est nécessaire de bloquer l'acidification en inhibant le développement des bactéries lactiques. 74 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts Pour cela la température des produits est abaissée considérablement; c'est la phase dite de. Refroidissement ou Arrêt de fermentation. Elle est conduite différemment selon le type de produits : les yaourts traditionnels à la sortie de l'étuve sont mis à refroidir dans des chambres froides fortement ventilées ou comme c'est le cas de plus en plus fréquemment, passent dans des tunnels de refroidissement avant d'être stockés en chambre froide à + 2 à +4°C. Pour les yaourts brassés, le refroidissement est effectué par passage dans des échangeurs-refroidisseurs à plaques tubulaires ou même à surface raclée car en tank le refroidissement serait très lent et conduirait à une sur acidification du milieu. 5-9- Conservation: Au cours de sa commercialisation, le yaourt est conservé au froid à une température. Ne devant pas dépasser 8 Cependant 24 jours au plus. Dans ces conditions, les bactéries du yaourt ne se multiplient pas mais conservent néanmoins une activité métabolique. C'est ainsi que l'acide lactique est encore produit à partir du lactose, ce qui abaisse légèrement le pH augmente la saveur acide du yaourt. Les enzymes Protéolytiques continuent à hydrolyser les protéines et peuvent ainsi entraîner une diminution de la viscosité ou de la rigidité du gel et surtout faire apparaître des peptides à saveur amère. (Hermier et Accolas, 1990) (Figure N°9) 75 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts Préparation du levain Lait Standardisation en Matière grasse Ferments lactiques Entretien des souches Concentration ou Addition de poudre Multiplication 1 er stade Traitement thermique Homogénéisation Multiplication 2ème stade Refroidissement Levains Ensemencement Conditionnement Fermentation En cuves Fermentation chambres chaudes Brassage du coagulum Refroidissement Refroidissement Conditionnement Stockage réfrigéré Stockage réfrigéré Yaourt ferme yaourt brassé Figure N° 9 : Diagramme de fabrication des yaourts (Doc . SYNDIFRAIS ) 76 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts 5-10- Accident de fabrication Les principaux défauts rencontrés chez le yaourt : défaut de goût, défaut d'apparence, défaut de texture. 5-10-1 Défauts de goût : Nature Origine Amertume Trop longue conservation Activité protéolytique trop forte des ferments Contamination par des germes protéolytiques Goût levuré, fruité, alcool Contamination par des levures Goût de moisi Contamination par des moisissures Contamination par des moisissures Fruits de mauvaises qualités pour les yaourts aux fruits Goût plat, absence d'arôme Mauvaise activité des levains (déséquilibre de la flore, trop de streptocoques, incubation trop courte ou à trop basse température) Matières sèches trop faibles Manque d'acidité Mauvaise activité des levains (taux d'ensemencement trop faible, incubation trop courte ou à trop basse température inhibiteurs dans le lait, bactériophages) Trop d'acidité Mauvaise conduite de la fermentation (taux d'ensemencement trop fort, incubation trop longue ou à température trop Elevée).Refroidissement pas assez poussé, trop lent Conservation à 1rop haute température Mauvaise conduite de la fermentation (taux d'ensemencement trop fort, incubation trop longue ou à température trop Elevée).Refroidissement pas assez poussé, trop lent Conservation à 1rop haute température Rancidité Contamination par des germes lipolytiqes et traitements thermiques trop faibles Goût farineux, de poudre Poudrage trop poussé Goût oxydé Goût de cuit; de Brûlon Mauvaise protection contre la lumière (pots en verre surtout) Présence de métaux (fer, cuivre) Traitement thermique trop sévère Goût aigre Mauvaise conduite des levains (contamination par une flore lactique sauvage - coliformes) Goût graisseux Teneur en matière grasse trop élevée 77 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts 5-10-2 Défauts d'apparence Nature Décantation, synérèse Décantation, synérèse Causes Sur acidification ou post acidification (mauvaise conduite de la Fermentation : température trop élevée pendant le stockage, Conservation trop longue) Refroidissement trop faible. Agitation trop poussée et admission exagérée d'air (pour les yaourts brassés). Mauvaise adjonction des fruits Agitation des yaourts (yaourts fermes) Teneur en matière sèche trop faible Production de gaz Contamination par des levures ou coliformes Colonies en surface Contamination par des levures ou moisissures Couche de crème Produit sur le couvercle Mauvaise ou absence d'homogénéisation Mauvaise manutention Produit non homogénéisé Mauvaise agitation (dans le cas des yaourts aux fruits) 5-10-3 Défauts de texture : Décarottage Agitation ou vibration pendant le transport faisant suite à un refroidissement mal conduit en chambre froide (pour les yaourts fermes) Manque de fermeté (pour Ensemencement trop faible Yaourt traditionnel) Mauvaise incubation (temps et / ou température trop faible) Agitation avant complète coagulation Matière sèche trop faible Trop liquide (pour yaourt Brassage trop violent brassé) Mauvaise incubation (temps trop faible) Matière sèche trop faible .Mauvais ferments (pas assez filant sou épaississants) Fruits et arômes pas assez concentrés Trop filant Mauvais ferments (trop filants) Température d'incubation top faible Texture sableuse Chauffage du lait trop important Homogénéisation à température trop élevée Foudrage trop fort Mauvaise brassage Acidification irrégulière et trop faible Texture granuleuse Mauvais brassage Teneur en matière grasse trop élevée Mauvais choix dans les ferments (LUQUET, 1990) 78 Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts 5-11- Valeur nutritionnelle du yaourt : Yaourt nature classique (100 g) : 49 k calories (205 k Joules), 4,4 g de protéines, 1,2 g de lipides. Yaourt maigre (100 g) : 38 k calories (160 k Joules), 4,5 g de protéines, 0,3 g de lipides. Yaourt au lait entier (100 g) : 64 k calories (268 k Joules), 4,2 g de protéines, 3,5 g de lipides. . Yaourt aux fruits (100 g) : 100 à 115 kcal (420 à 480 k Joules), 4,8 g de protéines, 2 à 2,7 g de lipides. L'apport énergétique du yaourt est lié à sa teneur en matières grasses et à la présence de sucre et de fruits : Un pot de 125 g de yaourt nature "classique" : 61 k calories (+ 40 kcal pour 2 cuillères. à café de sucre). Yaourt maigre: 47 k calories. Son apport énergétique est modéré, et ses teneurs en calcium et en protéines restent très intéressantes. Yaourt aux fruits : 125 à 145 k cal. 5-12- Caractéristiques diététiques du yaourt: Le yaourt apporte du calcium bien assimilé par l'organisme (200 mg par pot, soit plus de 20 % de l'Apport Quotidien Recommandé) et des protéines d'excellente qualité (5,2 à 6 g par pot, autant que dans 150 à 175 g de lait), très bonne source de vitamine B2 (un yaourt = 12 % de l'AQR). Toutes les autres vitamines B sont bien représentées. Le taux de matière grasse du yaourt classique est très modéré (1,2 %, soit moins que dans le lait demi-écrémé: 1,6 %). Le yaourt "maigre" est pratiquement dépourvu de lipides, le yaourt au lait entier en contient 3,5 %. Les ferments lactiques vivants jouent un rôle bénéfique dans l'équilibre microbien intestinal et stimulent sans doute les défenses immunitaires. 79 . Matériels et méthodes Matériels et méthodes 1. Lieu de l’étude Cette étude a été menée au niveau du service d’hygiène alimentaire du laboratoire régional vétérinaire de la wilaya de Mostaganem et le laboratoire de microbiologie alimentaire et industrielle de l’université d’Oran. 2. Origine des souches Le lait cru constitue un habitat naturel pour les bactéries lactiques, il représente une source de nouvelles souches de bactéries lactiques (De Roissart, 2000) Les souches de bactéries lactiques utilisées dans cette étude ont été isolées à partir du lait cru de vache de race locale collecté dans une ferme privée de la région de la wilaya de Mostaganem. Les souches lactiques de référence d’un levain commercial isolées d’un yaourt de marque Danone ont été utilisées. Les souches pathogènes utilisées Staphylococcus aureus et Salmonella sp ont été procurés au niveau du laboratoire de microbiologie de l’hôpital de Mostaganem. 3. Echantillonnage Les prélèvements ont été réalisés dans des conditions d’asepsie rigoureuses en tenant compte des recommandations suivantes : Désinfecter les mains et les pis de la mamelle de l’animal avec l’eau javellisée puis sécher avec une lingette stérile. Jet des premières gouttes du lait. Mettre le lait prélevé dans des flacons en verre stérile de 100 ml. Mettre les échantillons dans une glacière (+4°C), puis transportés immédiatement au laboratoire pour analyse microbiologique. 4. Milieux de culture Selon les exigences nutritionnelles des bactéries lactiques qui varient d’une souche à une autre, deux milieux sélectifs sous forme liquides ou solides ont été utilisés pour l’isolement des Lactobacilles et des Streptocoques (annexe). Il s’agit de : MRS (De Man, Rogosa et Sharpe, 1960), pour la culture des Lactobacilles M17 (Terzaghi et sandine, 1975), pour la culture des Streptocoques. Les milieux sont stérilisés par autoclavage à 120°C pendant 15-20min. 80 . Matériels et méthodes 5. Méthodes d’isolement Les échantillons de lait de vache cru sont incubés à 45°C jusqu'à coagulation. Cet enrichissement sert à favoriser le développement de la flore lactique endogène thermophile. Une fois le lait est coagulé, on homogénéise le coagulum par l’utilisation d’un agitateur « vortex » ou par simple agitation puis on réalise les dilutions. 5-1 Les dilutions Des dilutions décimales de 10-1 jusqu’à 10-6 sont réalisées séparément à partir de 1 ml pour chaque échantillon dans une solution Ringer stérile (à raison de 9ml/tube) 5-2 Ensemencement et mise en culture A partir des dilutions de 10-4 à 10-6 nous avons procédé à l’isolement des différentes bactéries lactiques comme suit : Après homogénéisation, l’ensemencement consiste à déposer ou à porter aseptiquement 0.1ml de chaque dilution en profondeur dans les milieux spécifiques de dénombrement (MRS, M17). Les boites de pétri sont ensuite incubées dans une jarre d’anaérobiose à 45°C pendant 24h à 48h voir jusqu’à 72 h pour l’isolement des Lactobacilles. Le choix de la température d’incubation est dicté par le fait que les deux espèces recherchées Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus sont thermophiles ce qui constitue un des premiers critères de sélection. Tableau N°21 : Milieux utilisés et conditions d’incubation pour l’isolement des bactéries lactiques Micro- Milieux T° optimale C° organismes Lactobacillus MRS 45°C Durée Condition d’incubation (h) d’incubation 24 - 72h aéro-anaerobie facultatif Streptococcus M17 45°C 24 - 48h aéro-anaerobie facultatif 81 . Matériels et méthodes 10-1 10-2 1ml 1ml 1ml 10-3 10-4 1m l 1ml 10-5 1ml 10-6 1ml 10-7 1ml 10-8 1ml Echantillon solution mère 9 ml d’eau physiologique dans chaque tube A partir des dilutions 10-4 - 10-6 Ensemencement en surface de 0.1ml MRS anaérobie 45°C M17 anaérobie 45°C Figure N° 10 : Schéma récapitulatif des différentes étapes d’isolement des bactéries lactiques 82 . Matériels et méthodes 5.3. Purification Les isolats de souches lactiques sélectionnées selon leur Gram (+) et catalase (-) ont fait l’objet de repiquages successifs et alternés sur milieux liquides (bouillon : MRS, M17) et solides (gélose MRS et M17) jusqu'à l’obtention de cultures homogènes, ce qui permettra d’assurer leur pureté (Sharpe, 1979). 6. Conservation des souches a) De courte durée : elle est réalisée sur milieu MRS solide incliné, préalablement ensemencé et incubé à 37°C pendant 48h. Les souches sont ainsi conservées à 4°C pour une durée de quelques semaines (max 4sem). D’une façon générale les bactéries en phase de croissance sont conservées quelques semaines à 4°C sur gélose inclinée (Accolas et al. 1977). b) Conservation de longue durée : A partir de cultures jeunes de 24 à 48 h sur milieux liquides (MRS et M17), on ajoute du lait écrémé stérile à un taux de 70% et 15 % de glycérol. Les cultures sont ensuite conservées à -20°C pour une période de quelques mois (Mathot et al., 1994). 7. Pré-identification des isolats de bactéries lactiques L’identification des bactéries lactiques au stade genre est réalisée en deux étapes : - La première partie consiste à tester tous les isolats par la coloration de Gram et la production de catalase - La deuxième est basée sur l’étude morphologique (macroscopique et microscopique) et le type de fermentation. 7-1 Etude morphologique a) Examen macroscopique Il s’agit d’une observation à l’œil nu ou par la loupe binoculaire les colonies présumées de Streptocoques et de Lactobacilles afin de déterminer l’aspect, la taille, la forme, le contour et la couleur des colonies des cultures bactériennes obtenues sur milieu solide. b) Examen microscopique c) Coloration de Gram Il permet de décrire la forme des cellules, leur mode d’association tout en vérifiant la pureté des isolats après préparation d’un frottis coloré selon les étapes décrites de la coloration de Gram (annexe). 83 . Matériels et méthodes Les cellules qui retiennent le violet de gentiane après traitement par le lugol et l’alcool sont dites Gram (+) et celles qui prennent la coloration rose de la fuchsine sont dites à Gram (-). Toutes les bactéries lactiques sont à Gram positif. d) Recherche de la catalase La catalase est une enzyme respiratoire produite par les bactéries aérobies strictes ou facultatives. Cette enzyme dégrade le peroxyde d’hydrogène (H2O2) en eau (H2O) et en oxygène (O2) selon la réaction : 2 H 2 O2 O2 2 H 2 O Pour mettre en évidence la production de cette enzyme, on prélève une colonie bien isolée, qu’on étale avec l’anse sur une lame et on ajoute une goutte d’eau oxygénée à 10%. La présence de catalase se manifeste par une effervescence qui indique une formation de bulles d’air, dues à la dégradation de l’eau oxygénée (Guiraud, 1998 ; Prescott, 2003). Les bactéries lactiques sont catalase négatives. 7.2 Tests d’identification, études physiologiques et biochimiques Nous nous sommes intéressés dans le cadre de cette étude à l’identification particulière des bactéries lactiques impliquées dans la fabrication du yaourt à savoir Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus selon les tests suivants : a) Test de croissance à différentes températures Ce test est important car il permet de confirmer l’appartenance des souches isolées aux bactéries lactiques thermophiles. Après inoculation en milieux liquides (M17, MRS) une culture pure des isolats à tester, les tubes sont incubés à 15°C pendant 07 jours et à 45°C et 50°C pendant 24 à 48h. La croissance se traduit par l’apparition de troubles dans les milieux (Leveau et Bouix, 1980 ; Guiraud, 1998). b) Croissance en bouillon hyper salé (Na Cl) Tester la croissance en présence de différentes concentrations de chlorure de sodium donne des renseignements précieux pour l’identification. En général, les bactéries lactiques ne poussent pas dans des bouillons hypersalés, pour le confirmer, la croissance des souches ensemencées dans les milieux MRS ou M17 additionnés de NaCl à différentes concentrations a été observé après 2 à 3 jours d’incubation à 37°C. 84 . Matériels et méthodes Les isolats ont été testé aux concentrations de 4% et 6.5% de Na Cl (Shlufer et al., 1985 ; Samelis et al., 1994 ; Carr et al., 2002). c) Croissance à différentes valeurs de pH L’habilité à croitre sur les milieux MRS et M17 en bouillon à différentes valeurs de pH à été observée pendant 2 à 3 jours d’incubation à 37°C. Les isolats ont été testés à pH 5.5 et 9.6. Le pH fortement basique permet de différentier S.thermophilus des entérocoques qui poussent en milieu alcalin (Carr et al., 2002). d) Croissance dans le lait de Sherman On teste l’aptitude des bactéries à pousser en présence d’un inhibiteur tel que le bleu de méthylène à 0.1% et 0.3% ; pour obtenir un lait à 0.1% de bleu de méthylène, on ajoute 1ml de bleu de méthylène à 1% stérilisé pendant 20min à 120°C à 9ml de lait écrémé stérilisé en tube. Le lait à 0.3% de bleu de méthylène est obtenu en ajoutant 1ml de bleu de méthylène à 3% stérilisé à 9ml de lait écrémé stérilisé. Ce test est surtout intéressant pour différencier les Streptocoques des Lactocoques. Les Streptocoques fécaux se développent en présence de 0.1% de BM quant à Streptococcus thermophilus, elle est très sensible à ce colorant (Guiraud, 1998). e) Détermination du type fermentaire Ce test permet de classer les bactéries en espèces homo ou héterofermentaires, il consiste à mettre en évidence la formation de gaz (CO2), il est réalisé en inoculant le germe étudié dans 10ml de milieu MRS ou M17 bouillon contenant une cloche de Durham. La présence ou l’absence de gaz dans les cloches après 48h à 37°C d’incubation nous indique le type fermentaire (Bourgeois et Leveau, 1980 ; Larpent, 1990). f) Hydrolyse de l’arginine (ADH) : La mise en évidence de cette enzyme est intéressante pour la caractérisation des bactéries lactiques. Cette enzyme libère l’ammoniac et la citruline à partir de l’arginine ; ce test nécessite le milieu Moèller (Harrigan and Mc cance, 1976). Le milieu d’arginine est obtenu en ajoutant 10g d’arginine. La répartition est faite en tube profonds stérilisé 15min à 120°C pour chaque souche isolée ensemencé : - 1 tube témoin : Moèller sans arginine - 1 tube de bouillon Moèller + arginine. Les tubes sont incubés à 37°C pendant 48heures, la lecture des résultats se traduit par la croissance des bactéries à tester sur milieu Moeller sans arginine qui se manifeste par un 85 . Matériels et méthodes virage au jaune du milieu du au métabolisme de glucose, tandis que les bactéries à tester sur milieu Moèller avec arginine, leur développement se traduit par la dégradation de l’arginine et la libération d’ammoniac qui empêche le virage au jaune, la couleur Leuconostoc devient violette. g) La recherche de citratase La citratase est mise en évidence en ensemençant le milieu Kempler et McKey avec une culture jeune, les boites de Pétri sont incubées à 37°C pendant 72 h. Les souches dites citratase (+) sont caractérisées par la formation des colonies de couleur bleue. Cette enzyme est prépondérante chez Lactococcus lactis subsp lactis et certaines espèces du genre. h) Production d’acétoine (Acétyl-Méthyl-Carbinol) Il s’agit d’éliminer par des tests simples, les souches responsables de gros défauts organoleptiques. La production d’acétoine est testée sur le milieu « Clark et Lubs » après ensemencement des souches à tester, puis incubation à 37°C pendant 24h à 48h. La production de l’acétoine est testée par la réaction de Vogues-Proskauer (VP) et s’applique de la manière suivante : Dans un tube à essai, on introduit 1 ml de la culture à tester, on ajoute 0.5 ml de réactif α-naphtol à 6% dans l’alcool absolu et 0.5 ml d’une solution de soude (NaOH) à 16% dans l’eau distillée. On agite soigneusement les tubes et on laisse reposer 5 à 10 min à température ambiante. La production d’acétoine se traduit par l’apparition d’un complexe rose (Zourari et al., 1992). i) Profil fermentaire : métabolisme des substrats carbonés Il s’agit d’apprécier l’aptitude des souches à métaboliser divers composés carbonés en particulier les sucres. On réalise une galerie d’identification à l’aide d’un milieu de culture liquide de MRS et M17 sans sucre, le glucose est remplacé par le composé à tester, filtré sur une membrane et introduit en solution à la concentration finale de 1% en présence du pourpre de Bromocrésol (BCP) comme indicateur de pH. Avant l’ajout de la culture bactérienne, celle-ci est centrifugée à 3000 tours / min pendant 10 à 15 min. Le culot est récupéré, puis recentrifugé une 2ème fois dans l’eau physiologique stérile, puis introduit aseptiquement dans le tube contenant le milieu MRS et M17 avec un sucre bien déterminé, l’incubation est effectuée à 37°C pendant 48h. 86 . Matériels et méthodes La fermentation d’un sucre donné par la souche bactérienne testée se traduit par la formation d’acide qui se manifeste par le virage de la coloration violette au jaune. 8. Identification des bactéries lactiques en utilisant le système API L’identification rapide est possible grâce à l’emploi des galeries biochimiques d’identification d’API 50 CHL (Ref 50410, BioMérieux, France). Ce dispositif se présente sous la forme d’une plaque en plastique que l’on utilise selon le mode d’emploi sur le catalogue (voir annexe). Ce test permet l’identification des bactéries lactiques jusqu’au stade d’espèce en se basant sur le profil fermentaire et enzymatique. L’API 50 CHL est un système standardisé associant 50 tests biochimiques formé de 50 microtubes permettant l’étude de la fermentation des substrats correspondant à leurs la famille des glucides et leurs dérivés (hétérosides, polyalcools, acides uroniques). Le premier tube sans principe actif sert de témoin négatif. La fermentation des 49 sucres se traduit par un virage de la couleur du milieu au jaune. L’utilisation de la galerie consiste à préparer l’inoculum, l’inoculation des galeries puis incubation à 37 °C selon les étapes suivantes : 8.1. Préparation de l’inoculum La souche est cultivée sur le milieu à une température adaptée à sa croissance, après 24h d’incubation, une culture très dense apparaissant sur le milieu est récupérée et centrifugée à 4000 tours/mn pendant 10 mn. Le culot est homogénéisé dans 2 ml d’eau distillée, puis centrifugé une seconde fois à 4000 tours/mn pendant 10 mn. Le culot est suspendu à nouveau dans 2 ml d’eau distillée, un nombre (n) de gouttes de cette suspension est introduit dans 5 ml d’eau distillée stérile de façon à obtenir une opacité de 2 sur l’échelle de Mc Ferland. On prélève alors à l’aide d’une pipette pasteur 2n gouttes de la suspension est initiale (2 ml) que l’on introduit dans 10 ml de milieu API 50 CHL. 8.2. Préparation des galeries Environ 10 ml d’eau distillée sont réparties dans les alvéoles du fond de la boite de la galerie formé de 5 bandes comprenant chacune 10tubes numérotés (0-9,10-19,30-329,40-49) la galerie est inoculée en répartissant la suspension bactérienne supplémentée par 2n gouttes à l’aide d’une pipette pasteur. 87 . Matériels et méthodes Les cupules sont remplies avec de l’huile de paraffine, enfin, la galerie est incubée à la température optimum de croissance du microorganisme étudié. 8.3. Lecture et interprétation La lecture des galeries est réalisée après 24 et 48h et comparées aux profils standards en utilisant le logiciel 9. Caractérisation technologique Trois critères sont à prendre en compte pour les souches lactiques en industrie laitière : - La quantité d’acide lactique produite liée au métabolisme fermentaire - La vitesse de production de l’acide lactique - Production d’enzymes protéolytiques 9-1-Activité protéolytique Elle a été déterminée selon la méthode de Huggin and Sandine ,1984 et Veullemard et al. 1986, ce test est basé sur l'hydrolyse de la caséine sur milieu YMA Yeast Milk agar). On prépare le milieu YMA solide, coulé dans des boites de pétri, après solidification du milieu, nous avons ensemencé en touches les souches à tester. L’activité protéolytique se traduit par un halo clair autour de la souche ensemencée en touche du à la dégradation de la caséine. La mesure de la dimension du halo permet de quantifier d’une manière relative l’activité protéolytique des souches les unes par rapport aux autres. Les résultats sont lus et quantifiés après incubation à 37°C pendant 24h. 9-2 Détermination du pH au cours de la fermentation Les niveaux de pH ont été mesurés pendant la fermentation à 0h, 2h, 4h, 6h, 8h, 24h à l’aide d’un pH-mètre en utilisant les tampons de pH 4.00 et de pH 7.00 normes décrites par l’AOAC, (2000). 9-3 Détermination de l’acidité titrable Principe : Il correspond à la neutralisation de l’acidité totale par une solution de soude de titre N/9 en présence d’un indicateur coloré phénolphtaléine à 1% Les mesures de pH et d’acidité titrable devront s’effectuer stérilement, chaque souche à tester est ensemencée dans un flacon de 100ml de lait écrémé stérile et incubée à 37°C. Le dosage de l’acidité se fait en versant les 100ml dans un bécher puis on effectue la mesure de pH. Ensuite on ajoute dans le bécher 3 à 5 gouttes de phénolphtaléine à 1% et on titre avec de la soude dornic (N/9) jusqu'à ce que la couleur blanche de lait sous agitation vire 88 . Matériels et méthodes au rose pale et reste constante, on note alors le volume de la soude (LUCA et REYROLLE, 1989). Les résultats sont exprimés en degré Dornic (D°), qui traduit l’acidité développée dans le lait après transformation du lactose en acide lactique selon la formule suivante : acidité (D°) = le volume de NaOH 10 1D°= 0.1g d’acide lactique dans 1 litre de lait (Guiraud, 1998). 10. Etude de l’antibiorésistance Elle permet de déterminer la sensibilité ou la résistance des souches à étudier à certains antibiotiques en utilisant la méthode de diffusion en milieu solide. A l’aide d’une pipette pasteur stérile, on prélève un nombre suffisant de colonies qu’on met dans un tube contenant 10ml d’eau physiologique ; on agite pour obtenir une suspension bactérienne. On ensemence par écouvillonnage (à l’aide des écouvillons) sur le milieu MH (Muller Hinton) ou sur le milieu solide M17ou MRS Déposer les disques d’antibiotiques à raison de 6 à 7 disques par boite, après incubation à 37°C pendant 24 à 48H. La lecture des résultats est basée sur l’existence ou pas de zones d’inhibition, par convention, nous avons considéré que pour un diamètre inférieur à 15mm la souche est résistance et pour un diamètre supérieur ou égal à 15 mm la souche est sensible. 11. Etude des interactions entre bactéries lactiques isolées et les bactéries pathogènes Les souches pathogènes utilisées ont été procurées au laboratoire de microbiologie de l’hôpital de la wilaya de Mostaganem et identifiées comme suit : - Staphylococcus aureus - Salmonella sp La détection de l’activité antibactérienne des souches lactiques contre les souches pathogènes est réalisée selon la méthode des puits de Barefoot et Klaenhammer, 1983) Les bactéries lactiques sont repiquées dans le milieu MRS ou M17 liquide et incubées pendant une période de 18h à 30°C. Après incubation, une centrifugation réfrigérée (4°c) est réalisée à 4000 tours/mn pendant 15 mn. Des puits de 5 mm de diamètre sont creusés stérilement à l’aide d’un emporte-pièce (cloche de durham) sur la gélose nutritive inoculée au préalable par 0.5 ml de la souche 89 . Matériels et méthodes indicatrice (pathogène) et seront remplies avec 10µl du surnageant de culture ou d’extrait cellulaire. Les boites de pétri sont mises à une température de +4°C/4h pour permettre la bonne diffusion de la substance antibactérienne. Les boites sont incubées à 37°C et la présence de zones d’inhibition formées autour des puits est examinée après 24h d’incubation. Figure N°11 : Schéma récapitulatif du test d’interaction (Barefoot et Klaenhammer, 1983) 12. Etude des caractères technologiques des bifidobactéries 12.1 La souche de Bifidobacterium La souche utilisée dans ce travail a été isolée et identifiée à partir d’un yaourt au niveau du laboratoire de microbiologie alimentaire Es-senia d’Oran (Abdelmalek, 2008) Dans le cadre de cette étude, la souche est utilisée en culture pure et en culture mixte (association de Lactobacillus, Streptococcus et la souche probiotique Bifidobacterium) ensemencés dans le lait de brebis et le lait reconstitué écrémé (enrichie avec 0.5% d’extrait de levure et de 0.05% de cystéine -HCI), dans le but de connaitre et comparer les performances de ces souches en culture pure et mixte. 90 . Matériels et méthodes La revivification de la souche Bifidobacterium animalis a été faite sur le bouillon MRS- cystéine (Martin-Diana et al., 2003) incubée à 37°C pendant 24-48h puis ensemencée sur gélose MRS-cystéine et ré-incubée à 37°C pendant 48 à 72 heures en anaérobiose. Les bactéries sont de formes bacillaires polymorphes à Gram(+) positif et catalase (–) négative. 12.2 Préparation de l’inoculum 12.2.1 Préparation de lait reconstitué écrémé Du lait reconstitué écrémé à été préparé à partir d’une poudre de lait écrémé mélangée dans de l’eau distillée à 10% (p/v) et autoclavé à 120C° pendant 10min (Martin-Diana et al, 2003). 12.2.2 Inoculum des Bifidobacterium Des colonies isolées sur le milieu MRS-Cystéine sont transférées sur le milieu MRSCystéine en bouillon et incubées à 37°C pendant 24h.1ml de cette suspension à été ensemencé dans 10ml de lait écrémé à 10% (p/v) stérile, additionné de 0.5% (p/v) d’extrait de levure et de 0.05% (p/v) de Cystéine-HCI et ré-incubé à 37°C pendant 18 à 24h, suivi d’une préculture dans le lait de brebis pasteurisé incubé à 37°C pendant 24h (Frank et al, 1993). 12-2-3 Inoculum des ferments lactiques Des cultures jeunes des souches de Lactobacillus delbruekii subp bulgaricus et Streptococcus thermophilus isolées au préalable à partir du lait de vache ont été repiquées dans le lait reconstitué écrémé suivi d’une pré culture dans le lait de brebis. L’incubation a lieu à 42°C durant 48h. 12.3. Etude du pouvoir acidifiant de Bifidobacterium en culture pure dans le lait de brebis et le lait reconstitué écrémé. 12.3.1. Détermination de l’acidité titrable L’acidité produite pendant la fermentation à été titrée à 2, 4, 6, 8 et 24h d’intervalle à 37°C à partir d’échantillon fermentés. 10ml est placé dans un bécher en présence de 0.1ml de phénophtaléine à 1% dans l’alcool à 95% puis titré par la soude N/9 jusqu'au virage au rose de l’échantillon (la couleur doit persister au moins 10 secondes) l’acidité est exprimée en degré (D°) (Guiraud, 1998). 91 . Matériels et méthodes 12.3.2. Détermination du pH au cours de la fermentation Les niveaux de pH ont été mesurés pendant la fermentation des laits de brebis et écrémés à 2, 4, 6, 8 et 24h d’intervalle à 37°C à l’aide d’un pH-mètre (Tampon utilisés pH 4.00 et pH 7.00). 12.4. Etude des pouvoir acidifiant de Bifidobacterium en culture mixte Préparation des laits fermentés : (procédé de fabrication des yaourts expérimentaux) Le ferment est ensemencé dans les laits destinés à la fabrication des yaourts expérimentaux à un taux de 3% (v/v). Les laits ont été incubés à 42°C jusqu'à l’obtention d’un pH compris entre 4.2 et 4.7 (pH d’un lait fermenté) environ 4h selon les indications du tableau N° ci-dessous : Tableau N°22 : Fiche technique des différentes souches utilisées Souche mixte Témoin Lait de brebis St + lac +bif Lac + St Lait écrémé St +lac + bif Lac + St Température 42°C 42°C Taux d’ensemencement 3% 3% L’arrêt de la fermentation est effectué par un refroidissement rapide à 4°C des échantillons. Enfin les laits fermentés expérimentaux sont conditionnés à 6°C pendant 21 jours (période de post- acidification). Les analyses physico- chimiques et microbiologiques ont été effectuées en triple essais, toutes les 2 heures au cours de la fermentation, tandis que durant la phase de postacidification, les analyses sont effectuées hebdomadairement pendant une période s’étalant sur 21 jours. Le dénombrement de ces bactéries à été faite au cours de ces périodes. 12.5. Analyse physico-chimique du lait de Brebis 12.5.1. Mesure de l’acidité dornic L’acidité exprimée en degré Dornic est déterminée par titration de 10ml d’une prise d’échantillon par la soude Dornic (N/9) en présence d’un indicateur coloré, le phénophtaléine 1% (annexe). 12.5.2. Mesure de pH La variation des valeurs de pH dans les laits contenant les cultures mixte a été suivie durant les 2 périodes (fermentation et post-acidification). 92 . Matériels et méthodes 12.6. Analyse microbiologique L’analyse microbiologique consiste à dénombrer essentiellement la flore lactique probiotique à savoir Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus et les Bifidobactérium sur leur milieux spécifiques. 93 Résultats et discussions Résultats A partir des 05 échantillons de lait cru de vache, 12 isolats de bactéries lactiques ont été retenus dont 07 appartenant au genre Streptococcus soit un taux de 58.33% et 05 au genre Lactobacillus soit 41.67%. Etant donné que notre étude porte sur les espèces impliquées dans la fabrication de yaourt, les résultats d’isolement et les tests d’identification ont donc ciblé les deux souches constituant le levain mixte à savoir Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus. Caractéristiques et identification des bactéries lactiques 1- Pré-identification des souches 1-1 Caractérisation morphologique a) Aspect macroscopique L’observation macroscopique des colonies développées sur le milieu M17 montre que celles-ci sont de couleur blanche laiteuse, bien rondes à bords lisses et réguliers de petite taille avec un diamètre entre 0.5 à 1.5mm (figure 12). Par ailleurs, l’examen macroscopique des cultures obtenues sur milieu MRS nous a permis de retrouver les critères relatifs aux Lactobacilles, soient des colonies de taille d’environ 1 à 2 mm de diamètre de couleur blanchâtre à crémeuse, circulaires et régulières avec une surface lisse (figure 14) (Tableau 23). Tableau N°23 : Résultats des observations morphologiques des bactéries lactiques spécifiques b) Les souches Aspect morphologique Streptocoques Colonies bien rondes lisses, couleur blanche laiteuse Lactobacilles Colonies à bord régulier, lisses blanchâtres à crémeuses Aspect microscopique Sphériques, petite taille disposées en paires, en courtes chainettes Bâtonnets plus ou moins longs, isolés, en paires et en chaînettes Diamètre 0.5-1 mm 1-2 mm Aspect microscopique L’aspect microscopique après coloration de Gram a révélé la présence de bactéries à Gram positif avec deux formes de cellules, des coques et des bâtonnets. Les coques correspondant aux Streptocoques sont disposées en paires ou en courtes chainettes, alors que les bâtonnets sont plus ou moins longs, isolées, en paires ou en chainettes soit l’aspect typique des Lactobacilles (Franz et Holzapfel, 2004) (figures 13,15). 94 Résultats et discussions Aspect macroscopique de la souche Aspect macroscopique de la souche de référence isolée du yaourt isolée du lait cru de vache Figure N°12 : Aspect macroscopique des souches de Streptococcus (St) Figure N°13 : Aspect microscopique après coloration de Gram de la souche de Streptococcus (St) (Gr x100) 95 Résultats et discussions Aspect macroscopique de la souche Aspect macroscopique de la souche de référence isolée du yaourt isolée du lait cru de vache Figure N°14 : Aspect macroscopique des souches de Lactobacillus (Lb) Figure N°15: Aspect microscopique après coloration de Gram de la souche de Lactobacillus (Lb) (Gr x100) 96 Résultats et discussions 1-2-Caractérisation physiologique et biochimique a) Identification des souches L’identification des souches de Streptocoques et de Lactobacilles au stade genre bactérien a été obtenue par les tests de type fermentaire, d’ADH, de croissance en milieux hostiles (lait de Sherman de 0.1% et de 0.3%, bouillon hypersalé à 4 et 6%) suivis par le test de la fermentation des sucres par comparaison aux souches de référence commerciales. Les résultats obtenus ont montré que tous les isolats de Streptocoques (St) sont de type homofermentaire, dépourvus de catalase, elles sont sensibles au milieu alcalin (pH de 9.6), ne poussent ni à 4 ni à 6.5% de NaCl, n’ont pas d’action sur l’arginine et peuvent croître aux températures de 45°C et 50°C. De plus, aucun de ces isolats ne pousse à 0.1 ou à 0.3% de bleu de méthylène. Ces souches semblent appartenir à Streptococcus thermophilus Par ailleurs, les isolats appartenant au groupe des Lactobacilles (Lb) indiquent qu’elles sont également de type homofermentaire. Le test de croissance à différentes températures nous a permis de différencier les souches de lactobacilles en bactéries thermophiles pouvant croître à 45°C et à 50°C mais pas à 15°C des mésophiles qui poussent à 15°C mais non à 45°C ou 50°C, elles sont catalase(-), ne dégradent pas l’arginine et contrairement aux souches de Streptocoques, elles poussent encore à pH acide de 4.8. Pour la confirmation de nos résultats, une comparaison a été faite aux souches commerciales de référence isolées des yaourts. Les figures N° 16, 17, 18, 19, 20, 21, et 22 résument un certain nombre de tests d’identification des souches lactiques isolées du lait cru de vache. Témoin 0.1%BM Témoin 0.3%BM Figure N°16 : Test de lait de Sherman à 0.1% et 0.3% Chez les Streptocoques 97 Résultats et discussions Figure N° 17 : Test du type fermentaire des souches isolées GL- LA - FR - SA- MN –RF –XL - ML GL- LA - GA - FR- MN - RA -XL-RB Figure N° 18 : Profil fermentaire de la souche Streptocoque Figure N°19 : Profil fermentaire de la souche lactobacille Figure N°20 : Test d’hydrolyse d’arginine FigureN°21 : Test ADH des souches de Streptocoques Témoin Streptocoques 98 Résultats et discussions Figure N°22 : Test d’ADH de la souche de Lactobacilles Tableau 24 : Récapitulatif des Caractères physiologiques et biochimiques des souches de Streptocoques et de Lactobacilles Caractères Morphologie Gram Catalase Citratase Acétoine Croissance à 15°C Croissance à45C° Croissance à 50°C Type fermentaire Lait de Sherman0.1% Lait de Sherman 0.3% Croissance Na cl 4% Croissance Na cl 6,5% pH=4.8 pH=9.6 ADH Glucose Lactose Galactose Saccharose Fructose Mannitol Xylose Raffinose Maltose Ribose (+) : réactions positives Streptocoques Coque + + + homo + + + + + (-) : réactions négatives 99 Lactobacilles Bacille + + + Homo + + + + v + - Résultats et discussions L’identification des souches bactériennes lactiques au stade de l’espèce selon la méthode des galeries biochimiques d’identification ou bien la galerie API50CHL (figures 23.24) a montré que l’ensemble des isolats de Streptocoques et de Lactobacilles ont été identifiées par comparaison aux souches de référence mentionnées dans la clé d’identification de Bergey (Mathara et al., 2004 ; Lee et al., 2006) comme appartenant aux espèces Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus ce qui confirme les résultats des tests physiologiques et biochimiques (tableau 24). TableauN°25 : Profils fermentaires des Lactobacilles et des Streptocoques 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Les souches CONTROL(Témoin) Glycérol ERYthritol D ARAbinose L ARAbinose RIBose D XYLose L XYLose ADOnitol β Methyl-D-Xyloside GALactose GLUcose FRUctose MANnose SORbose RHAmnose DULcitol INOsitol MANnitol SORbitol Methyl-D-Mannoside Methyl-D-Glucoside N-Acetyl-Glucosamine AMYgdalin ARButin ESCulin SALicin CELlobiose MALtose LACtose MELibiose Sucrose TREhalose INUlin Lb + + + + + + + + + v + v + + + + v + + 100 St + + + + + + + + v + v + v + + + + + + + - Résultats et discussions 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 MeLeZitose RAFfinose Starch GLYcoGen XyLiTol GENtiobiose D TURanose D LYXose D TAGatose D FUCose L FUCose D ARabitoL L ARabitoL GlucoNaTe 2-Keto-Gluconate 5-Keto-Gluconate + + + + - Lb : Souches de Lactobacillus + v + v - St : Souches de Streptococcus (+) : réaction positive (-) : réaction négative (v) : réaction variable 101 Résultats et discussions Figure N°23 : Profil fermentaire (API50CHL) d’une souche de Streptococcus thermophilus après 48h d’incubation Figure N°24 : Profil fermentaire (API50CHL) d’une souche de Lactobacillus delbruckii subsp bulgaricus après 48h d’incubation 1-3 Caractérisations technologiques a)- Evolution de pH L’évolution de pH pendant 24h de fermentation par les souches de Streptocoques et de Lactobacilles est présentée dans le tableau suivant N°26 : 102 Résultats et discussions Tableau N° 26: Evolution du pH des souches lactiques isolées Streptococcsus thermophilus Lactobacillus bulgaricus 0H 6.5 6.5 2H 5.9 4H 5.7 5.6 6H 5.6 4.8 8H 5.5 4.5 24H 5.2 4.5 pH 6.0 7 6 5 4 3 Streptococcsus thermophilus 2 Lactobacillus bulgaricus 1 0 0H 2H 4H 6H 8H 24H Temps Figure N°25 : Evolution du pH en fonction du temps chez Streptococus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus L’évolution du pH durant 24h de fermentation par les souches est représentée par la figure N° 25. Les valeurs de pH atteinte après 4h de fermentation chez les souches de Streptococus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus sont de l’ordre de 5.7 et 5.6 respectivement, cependant après 24h de fermentation les valeurs sont nettement différentes elles sont de l’ordre de 5.5 et 4.5 respectivement. 103 Résultats et discussions b) Evolution d’acidité titrable L’évolution de l’acidité exprimée en degré dornic (D°) au cours de 24h de fermentation est présentée dans le tableau qui suit N° 27. Tableau N° 27 : Evolution de l’acidité titrable (°D) des souches lactiques Streptococcsus thermophilus Lactobacillus bulgaricus 0H 40 40 2H 52 50 4H 74 80 6H 78 85 8H 79 90 24H 79 90 °D 100 90 80 70 60 50 Streptococcsus thermophilus 40 30 Lactobacillus bulgaricus 20 10 0 0H 2H 4H 6H 8H 24H Temps Figure N° 26 : Evolution de l’acidité titrable (°D) en fonction du temps chez Streptococus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus Les valeurs portées sur le tableau N°27 représentent l’acide lactique produit par les souches S. thermophilus et L. bulgaricus. L’évolution des teneurs en acidité est inversement proportionnelle par rapport à ceux du pH. Après 02 h de fermentation, c’est l’espèce de Streptococcus thermophilus qui produit plus d’acide lactique comparativement à 104 Résultats et discussions Lactobacillus bulgaricus soit une différence de 2°D, cependant, la production d’acide lactique a tendance à devenir plus importante chez. L.bulgaricus que S.thermophilus à partir de 04 h de fermentation. La différence des concentrations en acide lactique chez les deux espèces se poursuit durant toute la période d’essai mais à une vitesse réduite car cela coïncide vraisemblablement avec les phases de ralentissement de la croissance et la phase de déclin. C’est ainsi qu’après 24 h de fermentation les teneurs en acide lactique exprimées en degré Dornic sont de l’ordre de 79 et 90 °D chez S.thermophilus et L.bulgaricus respectivement c)Activité protéolytique Les résultats d’hydrolyse des protéines par les souches lactiques isolées et cultivées sur le milieu YMA sont représentés dans le tableau N°28. La lecture des résultats consiste à mesurer les diamètres des halos clairs autour des colonies bactériennes qui traduisent une activité protéolytique. On constate que l’ensemble des isolats des bactéries lactiques ont été capables de se développer sur le milieu YMK, se traduisant par l’apparition de zones claires autour des colonies comme le montre la figure 27, néanmoins une faible activité protéolytique a été notée chez les Streptocoques par rapport aux Lactobacilles. Les valeurs du diamètre des zones d’hydrolyse varient 8 à 11 mm et de 15 à 22 mm chez S. thermophilus et L. bulgaricus respectivement. Tableau N°28: Activité protéolytique des espèces lactiques sur milieu YMK Diamètre (mm) Code Souches Evaluation de protéolyse Strp Streptococcus thermophilus 8 à 11 ++ Lb Lactobacillus bulgaricus 15 à 22 +++ Figure N° 27: Zones claires traduisant les activités protéolytiques de S.thermophilus (à gauche) et L.bulgaricus (à droite) 105 la Résultats et discussions d) Antibiorésistance L’évaluation de la sensibilité ou de la résistance des souches lactiques isolées vis a vis des antibiotiques testés sont regroupés dans le tableau N°29. Il ressort à travers ces résultats que les deux espèces lactiques sont sensibles au Nitroxolamine et à la Pénicilline mais résistantes vis-à-vis de la Tétracycline et d’Oxacyline. Cependant leur comportement diffère par rapport à l’Erytromycine et à la Colistine, S.thermophilus étant résistant au premier et sensible au second, alors que L. bulgaricus est sensible au premier et résistante au second (Figures 28 et 29). TableauN°29 :Evaluation de la sensibilité des souches vis-à-vis des antibiotiques utilisés. Les souches Streptococcus thermophilus Antibiotiques Lactobacillus bulgaricus Strp Erythromycine Colistine Nitroxolamine Tetracycline Oxacyline R S S R R Lb S R S R R Penicilline S S Figure N°28 :Antibiogramme de la souche Lactobacillus bulgaricus Figure N°29 : Antibiogramme de la souche Streptococcus thermophiIus 106 Résultats et discussions e) Interaction bactérienne La détection de l’activité antibactérienne des souches lactiques spécifiques du yaourt contre les souches pathogènes Staphylococcus aureus et Salmonella sp réalisée par la méthode des puits se traduit par l’apparition d’une zone d’inhibition sous forme d’un halo clair autour des puits (Figures N°30 et 31). Les diamètres des zones d’inhibition varient de 7 à 12 mm en moyenne pour S.aureus contre 6 à 8 mm en moyenne pour Salmonella sp, alors que ceux obtenus avec l’espèce L.bulgaricus, les valeurs de diamètre sont de l’ordre de 8 à 12 mm et 6 à 9 mm en moyenne pour respectivement S.aureus et Salmonelle sp. 107 Résultats et discussions (A) (B) Figure N° 30 : Inhibitions obtenues par la méthode de Barefoot (1983) par les souches de S. thermophilus contre S.aureus (A) et Salmonella sp (B). Figure N° 31 : Inhibitions obtenues par la méthode de Barefoot (1983) par les souches de L.bulgaricus contre S.aureus (A) et Salmonella sp (B). 108 Résultats et discussions 1-4 Analyse physico-chimique du lait de brebis Tableau 30: Caractéristiques physicochimiques du lait de brebis pasteurisé Paramètres pH à 20°C Lait de brebis pasteurisé 6,70 Normes (Pellegrini et al., 1987 6,5 - 6,85 et FAO, 1995) Acidité Titrable Matière grasse Matière sèche 23,5°D 52,4g/l 173,50 g/l 22 – 25°D 7.1% 18,3% 2-Aptitude technologique des bifidobactéries En vue de connaitre les performances de nos souches, nous avons procédé à l’association en culture mixte des bactéries lactiques isolées au préalable à partir du lait de vache Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus à la souche probiotique Bifidobacterium animalis dans le lait de brebis pour la fabrication d’un lait fermenté type yaourt. Un autre essai a été réalisé avec Bifidobacterium animalis en culture pure dans le lait reconstitué écrémé enrichie avec 0,5 % d’extrait de levure et de 0,05% de cystéine-HCL, ceci afin de comparer et d’estimer les performances technologiques de cette souche. Figure N°32 : Observation microscopique des formes (Y, V) de Bidobacterium animalis (Gr x 100) 2.1- Étude du pouvoir acidifiant et du pH chez Bifidobacterium en culture pure dans le lait de brebis et dans le lait écrémé enrichie 2.1.1 Mesure du pH et l’acidité Dornic de Bifidobacterium dans le lait de brebis et le lait écrémé enrichi L’évolution des valeurs de pH dans le lait de brebis et le lait écrémé enrichi est caractérisée par une légère baisse de 6.5 à 6 soit une différence de 0.5 unités pH après 8 109 Résultats et discussions heures de fermentation. Cependant après 24 heures, le pH diminue davantage atteignant les valeurs 4.7 et 4.9 dans le lait écrémé enrichi et le lait de brebis respectivement. Inversement, les teneurs en acidité Dornic augmentent légèrement de 40°D à 52°D après 08 heures et atteignent 72°D après 24 heures de fermentation dans le lait écrémé enrichi, alors que dans le lait de brebis, la teneur atteinte en fin de fermentation est de 69°D (Tableau N°31). Tableau N°31: Résultats du pH et de l’acidité de Bifidobacterium animalis Lait écrémé enrichi Lait de brebis Temps 0H 2H 4H 6H 8H 24H Acidité (D°) pH Acidité (°D) pH 40 40 45 45 52 72 6.5 6.5 6.4 6.3 6 4.7 40 40 52 52 54 69 6.5 6.5 6.4 6.4 6 4.9 80 70 60 °D 50 lait écrémé enrichi°D 40 Lait écrémé enrichi pH 30 Lait de Brebis°D 20 Lait de Brebis Ph 10 pH 0 0H 2H 4H 6H 8H 24H Temps Figure N°33 : Cinétique d’évolution d’acide (D°) et du pH chez Bifidobacterium animalis 110 Résultats et discussions 2-2.Étude du pouvoir acidifiant de B.animalis en culture mixte avec (L. bulgaricus et S. thermophilus) dans le lait de brebis et le lait reconstituée écrémé L’étude du pouvoir acidifiant de Bifidobacterium animalis dans les produits fermentés en culture mixte, associée avec Lb. delbrueckii subsp bulgaricus (Lb) et S.thermophilus(Strp) dans le lait reconstitué écrémé et le lait de brebis conservé à 6°C pendant 21jours (0-4h durée de fermentation et 7-21jours durée de post-acidification a été étudiée et les résultats sont présentés dans le tableau suivant N°32. On constate que l’évolution des valeurs de pH semble s’abaisser davantage chez le témoin constitué par uniquement par S.thermophilus et Lactobacillus bulgaricus, les valeurs atteintes après 04 heures de fermentation sont de l’ordre de 5.6 et 5.5 dans respectivement le lait fermenté de brebis et le lait fermenté reconstitué écrémé. Cependant en associant la souche probiotique de Bifidobactérium aux deux souches de bactéries lactiques, on remarque que les valeurs de pH enregistrées sont beaucoup plus basses durant la période de post-acidification par rapport au témoin et cela quelque soit la nature du lait. Les valeurs moyennes notées après 21 jours de conservation sont de l’ordre de 4.4 et 4.5 dans respectivement le lait fermenté de brebis et le lait fermenté reconstitué écrémé. Etant donné la relation inversement proportionnelle entre la variation du pH et celle de l’acidité Dornic, les résultats mentionnés dans le tableau N°32 indiquent que les plus hautes teneurs en acidité ont été obtenues en associant la souche de Bifidobacterium aux deux espèces lactiques soient des valeurs moyennes de l’ordre de 112 et 109°D dans les laits fermentés respectifs de brebis et celui reconstitué écrémé. 111 Résultats et discussions Tableau N°32: Evolution du pH et du pouvoir acidifiant de Bifidobacterium en culture mixte Témoin Lait Souche mixte fermenté Lait de brebis D° fermenté Lait reconstitué écrémé pH D° fermenté Lait de brebis pH D° fermenté reconstitué écrémé pH D° pH 0H 39.33 6.5 35 6.6 39 6.5 40 6.5 4H 76.66 5.6 77.66 5.5 50 6.1 50 6.0 7J 83.33 5.3 91.33 5.1 90 5.3 80 5.5 14J 91.66 5.1 93 5.0 95 4.6 94 5 21J 102 4.7 96 4.6 112 4.4 109 4.5 1-Souche mixte: S.thermophilus + L.bulgaricus +Bifidobacterium 2-Souche témoin: S.thermophilus + L.bulgaricus °D 120 Témoin Lait fermenté de brebis D° 100 80 Témoin Lait fermenté reconstitué écrémé D° 60 40 Souche mixte Lait fermenté de brebis °D 20 Souche mixte Lait fermenté reconstitué écrémé D° 0 0H 4H 7J 14J 21J Temps Figure N°34 : Evolution d’acide lactique (D°) chez les Bifidobactérium en culture mixte 112 Résultats et discussions pH 7 6 Témoin Lait fermenté de brebis pH 5 Témoin Lait fermenté reconstitué écrémé pH 4 3 Souche mixte Lait fermenté de brebis pH 2 1 Souche mixte Lait fermenté reconstitué écrémé pH 0 0H 4H 7J 14J 21J Temps Figure N°35 : Evolution du pH chez les Bifidobacterium en culture mixte 2.3 Evolution de la flore lactique et des bifidobacterium : Selon les résultats mentionnés dans le tableau N°33, on remarque d’une manière générale que le nombre des bactéries lactiques (Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus) constituant le témoin est beaucoup plus important lorsqu’elles sont cultivées dans le lait de brebis contrairement au lait reconstitué écrémé. Le nombre des Streptocoques et des lactobacilles enregistré dans le lait de brebis après 02 heures de fermentation est de 58.104UFC/ml et 42.104UFC/ml respectivement contre 49.104UFC/ml et 35.104 UFC/ml dans le lait reconstitué écrémé. Le nombre des deux espèces lactiques continue à augmenter dans les deux types de lait à des vitesses variables, mais globalement les différences en faveur du lait de brebis sont maintenues pratiquement durant toute la période de fermentation et de post-acidification. En associant la souche probiotique de Bifidobacterium aux bactéries lactiques (souches mixtes), les mêmes constatations ont été observées à savoir une prédominance des Lactobacilles, des Streptocoques et des bifidobactérium dans le lait de brebis par comparaison au lait reconstitué écrémé. Les valeurs notées après 02 heures de fermentation sont de l’ordre de 160.104UFC/ml, 50.104UFC/ml et 13.104UFC/ml dans le lait de brebis pour respectivement les Streptocoques, les Lactobacilles et les bifidobactérium contre les valeurs 113 Résultats et discussions de 49.104UFC/ml, 40.104UFC/ml et 11.104UFC/ml notées dans le lait reconstitué écrémé. On s’aperçoit également que durant toute la période de fermentation le nombre des espèces de Lactobacilles et de Streptocoques étant plus important lorsqu’elles sont cultivées en association avec la souche de bifidobactérium que lorsqu’elles sont seules dans le témoin. Par ailleurs, il faut noter que dans les deux lots au-delà du 7 em jour de conservation, les nombre moyen des différentes espèces diminuent particulièrement les Streptocoques à cause de l’acidité excessive développée dans les laits fermentés. Tableau N° 33: Evolution de la flore lactique et des Bifidobacterium (N.104) Témoin Lait fermenté de brebis Souche mixte Lait fermenté Lait fermenté de Lait fermenté reconstitué brebis reconstitué écrémé écrémé 2H Strp : 58 Lb : 42 49 35 4H Strp : 173 Lb : 138 135 181 7J Strp : 61 Lb : 580 99 280 14J Strp : 420 Lb : 480 81 348 21J Strp : 16 Lb : 500 41 250 Strp : 160 Lb : 50 Bif : 13 Strp : 200 Lb : 200 Bif : 238 Strp : 80 Lb : 300 Bif : 125 Strp : 200 Lb : 300 Bif : 79 St1 :54 Lb : 180 Bif : 39 114 49 40 11 140 175 118 70 200 98 50 150 68 25 90 28 Résultats et discussions UFC/ml 600 Témoin Lait fermenté de brebis Strp 500 400 Témoin Lait fermenté de brebis Lb 300 Témoin Lait fermenté reconstitué strep 200 100 Témoin Lait fermenté reconstitué Lb 0 2H 4H 7J 14J 21J Temps Figure N°36: Evolution de la flore lactique UFC/ml 300 Souche mixte lail fermenté de brebis Strp 250 Souche mixte lait fermenté de brebis Lb 200 Souche mixte lait de brebis Bif 150 100 Souche mixte lait fermenté reconstitué écrémé Strp 50 Souche mixte Lait fermenté reconstitué écrémé Lb 0 2H 4H 7J 14J 21J Temps Souche mixte Lait fermenté reconstitué écrémé Bif Figure N°37: Evolution de la flore lactique et des Bifidobacterium en souche mixte 115 Résultats et discussions UFC/ml Témoin Lait fermenté de brebis Strp 600 Témoin Lait fermenté de brebis Lb Témoin Lait fermenté reconstitué strep 500 Témoin Lait fermenté reconstitué Lb 400 Souche mixte lail fermenté de brebis Strp Souche mixte lait fermenté de brebis Lb 300 Souche mixte lait de brebis Bif 200 Souche mixte lait fermenté reconstitué écrémé Strp Souche mixte Lait fermenté reconstitué écrémé Lb 100 Souche mixte Lait fermenté reconstitué écrémé Bif 0 2H 4H 7J 14J 21J Temps Figure N°38 : Evolution de la flore lactique et des Bifidobacterium 116 Résultats et discussions Discussion 1. Isolement et identification des souches lactiques Sur le plan expérimental, cette étude a été entamée par l’isolement des bactéries constituants le levain du yaourt Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus à partir du lait cru de vache. De nombreux travaux de recherche ont été menés dans ce sens notamment ceux de Cheriguene et al., 2006, Chograni et al ., 2008. L’isolement de ces bactéries nécessite certaines conditions liées à leurs exigences nutritionnelles, ce qui nécessite l’emploi de milieux de cultures spécifiques, en plus d’un atmosphère d’anaérobiose (Pilet et al., 2005). Plusieurs facteurs sont importants lors de l’isolement de Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbruckii subsp bulgaricus, parmi les quels des conditions physico-chimiques favorables et un milieu de culture adéquat (facteurs nutritionnels). La condition d’anaérobie pour les Lactobacilles est assurée par une jarre et une bougie. Les milieux de culture utilisés étant le MRS acétique pour les Lactobacilles et le M17 pour les Streptocoques. L’identification phénotypique conventionnelle basée sur l’étude des principaux caractères morphologiques (observations macroscopiques et microscopiques), biochimiques et physiologiques nous ont permis de déterminer les deux espèces dominée relativement par Lactobacillus bulgricus ( %). A l’échelle macroscopique, les souches de L.bulgaricus donnent sur milieu MRS solide des colonies bombées, circulaires, à surface lisse et de couleur blanche (Terzaghi et Sandine, 1975). L’aspect microscopique des souches après coloration de Gram a révélé des bacilles associés en paires ou en courtes chaines, à Gram(+), ces résultats sont en accord a ceux de Klein et al., 1998 ; Axelsson, 2004 ; Hammes et Hertel,2006 ; Tabasco et al.,2007. Sur milieu M17, ont été révélées des colonies irrégulières, érodées, de couleur crème. L’observation après coloration de Gram indique qu’il s’agit de coques ovoïdes à Gram (+) disposées en paires ou en chainettes (Novel, 1993). L’identification des souches basée sur les tests biochimiques et physiologiques indiquent que les Streptocoques sont dépourvus de toute activité catalase, sont homofermentaires et capables de pousser à température élevée, elles fermentent la majorité des sucres sauf le ribose, le xylose, le mannitol et l’inuline. Par ailleurs, l’identification des Lactobacilles a montré qu’ils sont dépourvus de catalase, de type homofermentaires, thermophiles, ne 117 Résultats et discussions fermentent pas l’arabinose, le xylose, le mannitol et l’inuline. Ces résultats sont analogues à ceux rapportés par Leveau et Bouix., 1991. 2. Activité protéolytique L’activité protéolytique à été estimée par la culture des souches dans le milieu Y.M.K (Yeast Milk Agar) solide et mesure la croissance, les souches sont ensemencées en touche. La protéolyse se traduit par l’apparition d’un halo clair autour des souches ensemencées après24h d’incubation due à la dégradation de la caséine. La mesure de la dimension du halo permet de quantifier d’une manière relative l’activité protéolytique des souches. D’après les résultats obtenus de l’activité protéolytique, on remarque que les Lactobacilles ont un pouvoir protéolytique élevé, contrairement aux Streptocoques. Ces résultats sont compatibles à ceux de Cheriguene et al., 2007 et de Chougrani et al., 2008. Cependant, l’activité protéolytique des souches lactiques isolées est assez faible L’action protéolytique des bactéries lactiques dans les produits laitiers améliore considérablement leur qualité organoleptique. Selon Desmazeaud, (1992), les enzymes protéolytiques des bactéries lactiques succèdent à l’action de la présure sur le caillé en catalysant les réactions conduisant à des précurseurs pour de nombreux produits de flaveur et d’arôme durant l’affinage de certains fromages. La part des enzymes protéolytiques des bactéries lactiques durant l’affinage est beaucoup plus importante dans certains types de fromage comme le Comté, contrairement au fromage de type Saint-Paulin où c’est l’action de la présure qui est dominante (Lenoir et al., 1983). Par ailleurs, le choix des souches microbiennes est un facteur important, c’est le cas des Streptocoques organismes dominants des levains lactiques dont l’aptitude à la protéolyse est très variable car celle-ci influe non seulement sur les proportions de peptides et d’acides aminés libres du fromage affiné, mais aussi sur les risques du développement d’amertume (Lenoir et al., 1983 ; Johnson et al., 1995). L’activité protéolytique a été observée chez l’ensemble des souches lactiques isolées S.thermophilus et L.bulgaricus. Les bactéries lactiques du yaourt possèdent des enzymes protéolytiques de nature différente (protéases, péptidases)(Desmazeaud, 1996). Cependant cette activité protéolytique reste relativement faible par comparaison aux espèces lactiques impliquées dans la fabrication de certains fromages, le cas de Lactococcus lactis subsp lactis (Griponet et al., 1975 ; Salvadori, 1988 ; Novel, 1993). 118 Résultats et discussions 3. Activité antibactérienne Les bactéries lactiques jouent un rôle fondamental dans l’inhibition des flores non lactiques, dont certaines sont pathogènes ou nuisibles à la qualité des aliments (Desmazeaud, 1998). Les deux souches lactiques Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus sont connues également par leur pouvoir dans l’acidification, les processus d’interaction entre elles de façon symbiotique leur permettent d’inhiber la croissance des autres micro-organismes par la production des composés antimicrobiens tels que les bactériocines jouant un rôle dans la conservation des produits laitiers tels que le yaourt. Le test d’inhibition réalisé par la méthode des puits a montré que les souches lactiques du yaourt S.thermophilus et L. bulgaricus reconnues par leur pouvoir acidifiant important, possèdent un effet bactériostatique voir bactéricide vis-à-vis des germes pathogènes testés. Vaughan et al., (1994) démontrent que les bactéries lactiques isolées du lait cru de vache inhibent la croissance de nombreux germes pathogènes parmi les quels Staphylococcus aureus. En effet contrairement à Salmonella sp, un meilleur effet inhibiteur a été obtenu contre S.aureus par les deux souches lactiques. Selon Onda et al., (2003), les bactéries pathogènes à Gram (+) sont généralement plus sensibles à l’effet inhibiteur exercé par les bactéries lactiques en produisant des bactériocines pouvant perturber les fonctions cellulaires au niveau de la membrane cytoplasmique. Des résultats similaires ont été rapportés par Aymerich et al., (2000).Cependant, Song et Richard, (1997) ont montré que Listeria sp bactérie à Gram (+)présente une résistance contre certaines bactériocines à cause de la différence dans la composition de la membrane cytoplasmique par rapports aux bactéries sensibles. Par ailleurs, selon Thuault, (1990), l’inhibition exercée vis-à-vis des germes pathogènes serait plus prononcée en présence de deux acides organiques dans le milieu, l’acide lactique et l’acide acétique. Dans les travaux rapportés par Medouakh et al., (2010), il a été montré que l’effet inhibiteur des souches de Lactobacilles sélectionnées visà-vis de l’espèce pathogène Hélicobacter pylori était du dans la majorité des cas à l’acide lactique produit. Cette faculté de produire l’acide lactique par les lactobacilles en agissant comme inhibiteur de la croissance d’autres bactéries pathogènes a été mis en évidence par de nombreux auteurs ( Lorca et al., 2001 ; Budde et al., 2003). Enfin, la production de peroxyde d’hydrogène dans certaines conditions pourrait inhiber certaines souches (Premi et Bottazi, 1972). 119 Résultats et discussions 4. Test d’antibiorésistance La pénicilline s’avère être l’antibiotique le plus actif sur les bactéries lactiques. Sa présence à la concentration de 0.01 UI/ml dans un milieu de culture provoque le ralentissement de l’acidification, alors qu’à la concentration de 0.1 à 0.2 UI/ml, l’acidification est complètement arrêtée (De Roissart, 1986). ). Selon Chopard et al., 2001, les souches de Streptococcus thermophilus présentent une grande sensibilité vis-à-vis la famille des bétalactamines en général et la pénicilline en particulier. Globalement, des résultats similaires ont été rapportés par la bibliographie particulièrement dans les travaux de Tamime et al., 1983 et Chougrani et al., 2008. En revanche, selon Avril et Plaisance, (1980), l’apparition de souches de Streptococcus résistantes à l’action des antibiotiques utilisées classiquement comme les macrolides et certains bétalactamines devrait exiger une surveillance très attentive de ces cas de résistance. Par ailleurs, la sensibilité des souches lactiques aux antibiotiques constitue un réel problème pour l’industrie de transformation laitière à cause de la présence de résidus d’antibiotiques dans le lait suite aux traitements thérapeutiques des troupeaux laitiers. Notons également que la présence de ces résidus et la résistance des souches aux antibiotiques peut également entraîner des risques pour la santé publique comme les allergies, les risques de toxicité de certains antibiotiques et le phénomène résistance que pourraient acquérir certains germes pathogènes. 5. Traitement de lait de brebis Quelque paramètres physicochimiques du lait de brebis ont été mesurés à savoir le pH, l’acidité titrable, la matière grasse et l’extrait sec selon les normes de l’AOAC (2000). Les résultats obtenus sont indiqués dans le tablau30. Il apparait que l’acidité titrable mesurée est légèrement faible et n’excèdent pas 23.5°D. Quant a la valeur de pH, elle a était estimé a 6.70. On observe aussi que le lait de brebis renferme 17.35% d’extrait sec, ainsi qu’un taux de matiere grasse de 5.24%. Les valeurs de pH, l’acidité titrable, la matière grasse et l’extrait sec ; que nous avons trouvez, concordent avec celles déjà rapportées pour le lait de brebis étudié par Chougrani et al.,(2008). 120 Résultats et discussions L’importance variabilité observée et obtenue dans notre échantillon de lait de brebis et les normes dictés par (Revemal, 1982 ; Pellegrini et al., 1987 et FAO,1985) révèle qu’ils existent certains facteurs influant sur sa composition et ceci peut être expliqué par : la nature de l’aliment ingéré, conditions climatiques, la races, l’état physiologique de l’animal, de même que la méthode de dosage utilisée. 6. Cinétique d’acidification des souches lactiques isolées Globalement, les deux souches spécifiques du yaourt, L.bulgaricus et S.thermophilus sont caractérisées par un fort pouvoir acidifiant. Cette acidité développée résulte inéluctablement de la fermentation par voie homolactique du lactose constitutive du lait en le transformant en acide lactique. . Ce fort pouvoir acidifiant est le résultat de l’effet symbiotique entre Lactobacillus.bulgaricus et Streptococcus.thermophilus. En effet selon Luquet et Corrieu, (2005), les souches de Streptococcus thermophilus ont une faible activité protéolytique, c’est pourquoi leur pouvoir acidifiant reste parfois limité lorsqu’elles sont cultivées en culture pure à cause de la faible teneur en peptides et en acides aminés nécessaires pour le démarrage de leur croissance. L’industrie laitière fait appel aux cultures mixtes afin de pallier à ce problème en combinant Lactobacillus.bulgaricus subsp bulgaricus et Streptococcus.thermophilus (Roy, 2005). Des résultats similaires du pouvoir acidifiant de certaines souches de Streptococcus thermophilus isolés de différents laits fermentés Algériens ont été obtenus par Slimane et al., (2010). Par ailleurs Medouakh et al., ( 2010) ont pu isolés 14 souches de Lactobacilles dont Lactobacillus delbrueckii sp bulgaricus à partir de différents laits, ayant toutes un pouvoir acidifiant important avec quelques variations d’une souche à l’autre à l’intérieur de la même espèce. Les valeurs atteintes sont conformes aux normes admises et analogues à celles rapportées par William et al. (1984) et Fezel, (1997). 7. Aptitude technologique des bifidobactéries Les propriétés les plus importantes pour l'utilisation commerciale des ferments lactiques composée de souches probiotiques incluent la croissance et l'acidification rapide du lait, et la bonne tolérance à l’acidité et à l'oxygène (Rasic et kurmann, 1983). De même, il est important de considérer les caractéristiques des produits crus, la sécurité du produit, la capacité d'exercer un effet bénéfique et les caractéristiques désirées du produit final (Gomes et Malcata, 1998). 121 Résultats et discussions Les sélections des souches afin de disposer d’un ferment lactique qui permette d’obtenir un lait fermenté à caractéristiques organoleptiques bien définies sont orientés vers des souches de Streptococcus et Lactobacillus (pour leur pouvoir acidifiant, pouvoir protéolytique, activité aromatique et la production des exopolysaccharides) (Pernoud et al., 2005). Les souches de Bifidobacterium animalis ( subsp. animalis ou subsp. lactis) sont les plus utilisées dans la production des laits fermentées au caractères probiotiques (Masco et al., 2005), parce que ces deux sous-espèce sont connus pour être relativement oxygène tolérantes (Meile et al., 1997 ; Masco et al., 2004). De nombreux paramètres influencent la croissance des bifidobacteries dans le lait.Parmi ces paramètres on a : la température de croissance, le lait utilisé, l’état physiologique des souches utilisé et leur concentration et les ingrédients ajouté (par ex. les facteurs bifidogènes). 8. Cinétique d’acidification et croissance de Bifidobacteium animalis dans le lait reconstitué écrémé enrichie et dans le lait de brebis en culture pure Plusieurs auteurs ont constaté que le lait et ses dérives ne constituent pas un milieu optimal de croissance pour les bifidobactéries (Murti et al., 1992; Zbikowski et Ziajka,1986:Rasic et Kurmann, 1983). La fermentation du lait par B.animalis conduit à la production d’une acidité qui détermine les propriétés technologiques de cette bactérie. En revanche la production de l’acidité dépend de plusieurs paramètres tels que la température d’incubation, l’état physiologique de la bactérie, la concentration de l’inoculum et le lait utilisé (Hadadji, 2007). La croissance de Bifidobacterium animalis dans le lait écrémé reconstitué est stimulée par l’addition au milieu de (0,5%) d’extrait de levure et de (0,05%) de la cystéine. L’extrait de levure est considéré comme un facteur bifidogène qui stimule la croissance des bifidobacteries (Roy et al., 1990). La cystéine est un agent réducteur et est un acide aminé essentiel exigé pour la croissance des bifidobactéries (Ravula et Shah, 1998). Cet ingrédient peut être utilisé dans la production des laits fermentés probiotiques. Guler-Akın et Akın (2007), ont produit un lait fermenté probiotique (bio yogourt) à partir du lait de chèvre en utilisant les ferment du yaourt (St. thermophilus et L.delbrueckii subsp. bulgaricus) et des probiotiques (L. acidophilus, Bifidobacterium bifidumBB12 et Lactobacillus paracasei subsp. casei), avec ou sans l'addition de cystéine (0,5%). 122 Résultats et discussions Ces auteur ont constaté que la concentration des bifidobactéries est plus fort dans les bioyogourt complétés avec de la cystéine que dans bio-yogourt sans la cystéine. Le pH atteint la valeur de 4.9 au bout de 24H pour le lait de brebis alors qu’il est de 4.7 pour le lait écrémé enrichie, soit respectivement une concentration d’acidité de 69°D et de 72°D. La production d’acide par la souche Bifidobacterium dans le lait écremé à37°C atteint45°D après 6h, 52°D après 8H et72°D après24H La production d’acide par la souche Bifidobacterium dans le lait de brebis à37°C atteint52°D après 6h,54°D après 8H et 69°D après24H Ceci s’explique par le taux élevée en protéines dans lait de brebis (61,5g/L),Car les bifidobactéries ont une activité protéolytique très faible pour dégrader les protéines du lait comparé de celle des bactéries lactiques (Shihata et Shah, 2000). En effet, Bifidobacterium diminue lentement le pH du lait et sa croissance est lente et ceci peut etre due aux substances azotés difficilement assimilable (Hadadji, Bensoltane, 2006 ;Mahi et al.,2006). Plus récemment, différentes hypothèses ont été proposées pour expliquer le comportement des bifidobactéries dans le lait de brebis. Certaines d’entre elle elles s’appuyant sur la concentration plus élevée de β-lactoglobuline, α-lactalbumine et des complexes de vitamines B (acide pantothénique, biotine et la riboflavine) (Gomes et Malcata, 1998 ; Kehagias et al., 2008). Ces composés sont considérés comme des bons facteurs de croissances pour les bifidobactéries (Petschow et Talbott, 1990 ; 1991 ; Ibrahim et Bezkorovainy, 1994 ; Poch et Bezkorovainy, 1988). Malgré ça, le suivi de l’évolution de l’acidité titrable a montré un une vitesse d’acidification très lent dans les deux laits fermentés. Cette faible acidification par lesBifidobacterium en culture pure à été signalé par plusieurs auteurs (Bennama, 1999; Samona et al., 1996 ; Mahi et al., 2006; Chekroune et al., 2006 ; Hadadji et Bensoltane , 2006). Ceci peut être attribué au fait que les bifidobactéries produisent deux molécules d’acides lactiques et trois molécules d’acides acétiques à partir de deux molécules de glucose (DeVries et Stouthamer, 1968). Il arrive même que le pyruvate soit clivé en acide formique et en acétyle-1-phosphate plutôt qu'en acide lactique (Ruas-Madiedo et al., 2005). 123 Résultats et discussions 9. Cinétique d’acidification et croissance de Bifidobactérium animalis dans le lait reconstitué écrémé enrichie et dans le lait de brebis en culture mixte Les résultats signalés dans les deux types de lait (écrémé enrichi et de brebis) confirment que les Bifidobacteriums sont des faibles producteurs d’acide lactique comparativement aux souches lactiques spécifiques du yaourt L.bulgaricus et S.thermophilus, d’ailleurs selon Stanier et al., (1987) cité par Tamime et al., (1995), les bifidobactéries produisent davantage d’acide acétique que d’acide lactique et que leur pouvoir acidifiant est intimement lié à la concentration initiale de l’inoculum. Une production lente de l’acide lactique a comme conséquence un temps prolongé de fermentation. L'industrie laitière fait face à ce problème en employant les cultures combinées des bifidobacteries et d'autres bactéries lactiques. La majorité des fabricants utilisent les Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Roy, 2005). L'avantage d'employer une culture mélangée contenant des bactéries de bifidobactérie et de ferment du yaourt est non seulement la réduction du temps de fermentation, mais également l'action d'éviter d'autres défauts des produits contenant seulement les bifidobactéries peut avoir, comme la séparation de petit lait, texture arénacée ou gluante, goût trop léger, goût de levure ou aigre ou trop peu d'arome (Rasic et Kurmann, 1983). En outre, l'addition aux produits bifidus des ferments de yaourt peut améliorer leur valeur diététique (Gilliland, 1991).Par ailleurs, selon Désjardins et al. (1990), l’initiation d’une fermentation lactique par une culture pure de bifidobactéries dépend extrêmement de l’utilisation d’une concentration d’inoculum très élevée. En revanche, ces résultats indiquent une faible croissance de la souche de bifidobactérium dans les laits. De nombreux travaux de recherche expliquent ce comportement par le fait que les Bifidobacterium exigent certains facteurs bifidigènes comme le fos (Fructo-oligosaccharide) ou l’inuline (Modler et al., 1990 ; Franck et al., 1993). Cependant en culture mixte et dans les deux types de lait, l’acidité développée est très importante, de même que la biomasse de Bifidobacterium où le taux de croissance a considérablement augmenté. La culture mixte par l’emploi des bactéries lactiques stimule la croissance des bifidobactéries dans le lait (Samona et al. 1996). En effet, certain auteurs ont mentionné qu’il existe une synergie active entre les souches en culture mixte (Bensoltan et al., 2004 ; Chekroune et al., 2006 ; Cheriguene et al., 2006 ; 2007). 124 Résultats et discussions Klaver et al. (1993) ont aussi démontrés que le taux de croissance des bifidobactéries dans le lait pouvait être augmenté par la présence de souches protéolytiques telles que Lactobacillus acidophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus ou L. casei.. Par ailleurs, dans une autre étude (Rodrigues et al., 2009) sur les laits fermentés conventionnel et biologique (teneurs en protéines et en fer plus élevées) ensemencés par une souche de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis en association avec Lactobacillus bulgaricus LB340 et Streptococcus thermophilus TA040, il a été remarqué que la vitesse d’acidification était significativement plus importante dans le lait biologique par rapport au lait conventionnel. Il en est de même concernant la croissance des souches utilisées largement supérieure dans le lait biologique. Globalement nos résultats sont en accord avec ceux obtenus par Ait abdesalam et al., 2008. L’utilisation de l’assocition B. animalis en association avec Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus dans la fermentation est benifique pour les trois souches. Cela s’explique par les exigences differentes en facteurs de croissance des trois espèces. Les souches de Streptococcus thermophilus et de bifidobactérie sont souvent moins proteolytique (Shihata et Shah, 2000 ; Chekroune, 2005). De ce fait, leur croissance est limitée, les acides aminés et les péptides présent initialement dans le lait étant insuffisants pour couvrir leurs besoins. En revanche, Lb. delbrueckii subsp.bulgaricus possède une protéase membranaire qui va permettre la libération d’acides aminés est de petits peptides à partir des caséines du lait ceux-ci étant ensuite utilisables par Streptococcus thermophilus et de bifidobactérie dotés de peptidase intracellulaires (Shihata et Shah, 2000 ; Marshall, 1987). Quant à Streptococcus thermophilus, cette espèce a la capacité à utiliser l’oxygène dissous dans le lait de la sorte à réduire ça concentration un taux très faible, mais non nulle, permettant ainsi d'augmenter la viabilité des bifidobactéries. Streptococcus thermophilus aussi produire de l’acide formique et du dioxyde de carbone stimulant la croissance de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus (Veringa et al., 1968 ; Radke-Mitchell et Sandine, 1984). 10. Evolution de la flore lactique et des bifidobacterium : La survie de la flore lactique et des bifidobacterium dans un lait fermenté doit être assurée jusqu'à la consommation du produit puisqu'on doit y dénombrer plus de 105-106 UFC/ml dans du lait fermenté pour exercer des effets probiotiques (Shah, 1997). 125 Résultats et discussions Selon les résultats mentionnés dans le tableau N°33, on remarque d’une manière générale que le nombre des bactéries lactiques (Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus) constituant le témoin est beaucoup plus important lorsqu’elles sont cultivées dans le lait de brebis contrairement au lait reconstitué écrémé.Le nombre des Streptocoques et des lactobacilles enregistré dans le lait de brebis après 02 heures de fermentation est de 58.104UFC/ml et 42.104UFC/ml respectivement contre 49.104UFC/ml et 35.104 UFC/ml dans le lait reconstitué écrémé.Le nombre des deux espèces lactiques continue à augmenter dans les deux types de lait à des vitesses variables, mais globalement les différences en faveur du lait de brebis sont maintenues pratiquement durant toute la période de fermentation et de post-acidification. En associant la souche probiotique de Bifidobacterium aux bactéries lactiques (souches mixtes), les mêmes constatations ont été observées à savoir une prédominance des Lactobacilles, des Streptocoques et des bifidobactérium dans le lait de brebis par comparaison au lait reconstitué écrémé. Les valeurs notées après 02 heures de fermentation sont de l’ordre de 160.104UFC/ml, 50.104UFC/ml et 13.104UFC/ml dans le lait de brebis pour respectivement les Streptocoques, les Lactobacilles et les bifidobactérium contre les valeurs de 49.104UFC/ml, 40.104UFC/ml et 11.104UFC/ml notées dans le lait reconstitué écrémé. On s’aperçoit également que durant toute la période de fermentation le nombre des espèces de Lactobacilles et de Streptocoques étant plus important lorsqu’elles sont cultivées en association avec la souche de bifidobactérium que lorsqu’elles sont seules dans le témoin. Par ailleurs, il faut noter que dans les deux lots au-delà du 7 em jour de conservation, les nombre moyen des différentes espèces diminuent particulièrement les Streptocoques à cause de l’acidité excessive développée dans les laits fermentés. Cette perte de viabilité des bifidobactéries probiotiques ont été précédemment rapporté par plusieurs auteurs (Dave et Shah, 1997; Gueimonde et al., 2004 ;Gilliland et al., 2002; Medina et Jordano, 1994; Micanel et al., 1997; Rosenthal et Bernstein,1998; Shin et al., 2000). La viabilité des bifidobactéries en culture mixte est particulièrement affectée suite à la post-acidification des laits fermentés par les bactéries lactiques. Ce phénomène est connu surtout chez Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus qui développe une acidité supplémentaire pendant l'entreposage au froid, ce qui abaisse légèrement le pH et augmente la saveur acide du lait fermenté (Accolas et al., 1977 ; Bouillanne et Desmazeaud, 1980 ; 1981 ;Donkor et al., 2006). D'autres facteurs stressant comprenant 126 Résultats et discussions l'oxygène, l'épuisement nutritif et les métabolites autres que les acides organiques produits pendant la fermentation peuvent aussi influencées la survie des bifidobactéries en lait fermenté pendant l'entreposage Le taux de survie est beaucoup mieux dans le lait fermenté de brebis que dans le lait reconstitué écrémé fermenté .Ceci peut s’expliqué par la teneur importante en protéines du lait de brebis (61,5g/L) qui ont un pouvoir tampon élevé selon Mietton et al., (2004) et Salaun et al., (2005). D’un autre coté les bifidobactéries sont bien protégés par les protéines du lait de brebis qui ont un effet protecteur contre l’acidité du lait fermenté (Lönnerdal, 2003). 127 Conclusion Durant notre étude, nous avons isolé des Lactobacilles et des Streptocoques à partir d’un lait de vache cru acidifier. L’utilisation des milieux et des conditions de cultures qui répondent aux exigences de ces bactéries, nous ont permis de les bien isoler et purifier. Nous avons même constaté leur forme typique .Les études macroscopique et microscopique ont montré que les Streptocoques forment des petites colonies blanchâtres, sphériques ou ovoïdes, associées en chainettes et parfois en amas alors que les Lactobacilles sont des colonies punctiformes, blanchâtres sous forme de bâtonnets courts, disposées par paires et en chaines. L’étude physiologique a été réalisée afin de connaitre les conditions optimales de la croissance des Lactobacilles et des Streptocoques et a montré que les deux souches sont thermophiles et capables de pousser à une température supérieure ou égale à45°C. L’identification en utilisant le système API 50 CHL nous a permis de confirmer les genres et les espèces pré identifiés par les tests physiologiques et biochimiques. La souche Lactobacille appartient à l’espèce Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus et la souche Streptocoque appartient à l’espèce Sreptococcus thermophilus (les ferments classiques dans la production des laits fermentés et les yaourts). Sur le plan biotechnologique, les deux souches ont révélé de bonnes performances technologiques telles que l’activité protéolytique, le pouvoir acidifiant et l’activité antagoniste. Au cours de la deuxième partie expérimentale nous avons étudié l’association de Lactobacilles et Streptocoques à la souche probiotique Bifidobacterium. Les propriétés technologiques de B. animalis sont déterminées par sa croissance et son aptitude de fermenté le lait de brebis et le lait reconstitué écrémé en culture pure et culture mixte en association avec St. thermophilus et Lb. delbrueckii subsp. Bulgaricus. Le suivie de la cinétique de croissance et l’évolution de l’acidité et de pH au cours de la fermentation a révélé que B. animalis se développe mieux en culture mixte (en association avec St. thermophilus et Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus dans le lait le brebis que en culture pure. Le taux de létalité B. animalis pendant le stockage au froid à 6°C pendant 21jours dans le lait fermenté de brebis (en culture pure et en culture mixte) est moins important que celui observé dans le lait reconstitué écrémé (dans les deux cultures). Perspectives Les résultats présentés dans cette étude nous ont permis de conclure que les bactéries lactiques en général sont non pathogènes, ce qui permet d’améliorer les conditions de conservation dans l’industrie alimentaire, bien comprendre quelques mécanismes pour le développement d’un lait de brebis fermenté probiotique, ces avantages ouvre les volets d’une éventuelle continuité de ce travail afin de mieux le compléter, par d’autres aptitudes biotechnologiques. A.O.A.C., 2000.Assosiation of Official Analytical Chemists. Official methoders of Analysis Arlington,VA , USA Abdelmalek, A.2008. Etude de performance des bifidobactéries isolées d’un yaourt fabriqué en Algérie. Thèse de magister, département de biologie, Faculté de sciences, Université d’Oran, Algérie. Abdelmalek, A., Bey, F., Gheziel, Y.; Krantar, K. Ait Abdessalam, A.; Meribai, A.; Medouakh, L. and Bensoltane, A. (2009) Viability and resistance to acidity of Bifidobacteria sp in Algerianés bio-yogurts. 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Solution de lactose Lactose Eau distillée (qsp) 10,00g 100,00ml La stérilisation est faite par filtration sur membrane millipore (0,45µm) ou stérilisation à l’autoclave: 120°C pendant 20 minutes. Milieu MRS (De Man; Rogosa et Sharpe, 1960) (Lactobacillus sp., Leuconostoc sp. et Pediococcus sp.) Extrait de levure 4,00g Extrait de viande 8,00g Peptone Acétate de sodium 10,00g 5,00g Annexes Citrate d’ammonium Glucose 2,00g 20,00g Phosphate dipotassique (K2HPO4) 2,00g Sulfate de magnésium (MgSO4) 0,25g Sulfate de manganèse (MnSO4) 0,05g Tween 80 1,00ml Agar-agar Eau distillée (qsp) 18,00g 1000,00ml pH=6,8 Stérilisation à l’autoclave: 120°C pendant 20 minutes. Test de l’arginine dihydrolase : 1/ Milieu Möller à l’arginine Peptone pepsique de viande 5,00g Extrait de viande 5,00g Pourpre de bromocrésol 0,01g Rouge de crésol 0,005g Glucose 0,50g Pyridoxal 0,005g Arginine 10,00g Eau distillée (qsp) 1000,00ml pH=6,8 Stérilisation à l’autoclave: 120°C pendant 15 minutes. Lait écrémé (milieu de conservation) Lait en poudre Eau distillée Glycérol 12.5g 100ml 15ml Eau physiologie Utilisée pou la préparation des dilutions Chlorure de sodium 9g Annexes Eau distillée Autoclavage à 120C° pendant mn Milieu TPY (scardovi, 1986) Tryptone 10 g Phytone peptone 5 g Glucose 5 g Extrait de levure 2, 5 g Tween 80 1 ml Cystéine Hydrochloride 0, 5 g K2HPO4 2 g MgCL2.6H2O 0, 5 g ZnSO4.7H2O 0, 25 g CaCl2 0, 15 g FeCl3 Traces Agar 15 g Eau distillée 1000 ml pH=7,4 Autoclavage : 120°C pendant 20 minutes Solution de Ringer cystéine diluée au ¼. NaCl 2, 25 g KCl 0, 10 g CaCl2 0, 12 g Na2CO3 0, 05 g Cystéine HCl. 0, 3 g Eau distillée 1000 ml pH 7 Autoclavage : 120°C pendant 20 minutes 1000ml Annexes Coloration de Gram : Technique � Préparer un frottis d’une culture bactérienne pure ; � Recouvrir le frottis avec de cristal violet ; laisser agir une minute ; rincer à l’eau distillée ; � Verser du Lugol et le laisser agir pendant une minute ; rincer à l’eau distillée ; � Décolorer à l’alcool à 950 entre 15 et 30 secondes ; rincer à l’eau distillée ; � Recolorer avec de la fuchsine phénique ; pendant 10 seconde si elle est concentrée ou 1 minute si elle est diluée. Rincer à l’eau distillée ; � Sécher au dessus de la flamme d’un bec Bunsen ; � Observer à l’objectif à immersion (objectif x 100) et à pleine lumière. Les bactéries « Gram-positif » apparaissent en violet foncé, les bactéries« Gram négatif » en rose ou rouge. Recherche d’une catalase : Exposer une culture sur boite à l’air pendant 30 min. Prélever alors quelques colonies, les émulsionner dans une goute d’eau oxygénée à 10 vol. La formation de bulles est due à la catalase du germe. Résumé 12 isolats de bactéries lactiques ont été isolées et identifiées en se basant sur leur caractéristiques physiologiques et biochimique à partir de 05 échontillons de lait cru de vache collectés de différente région à savoir. Parmi les isolats, 07 appartenaient au genre Streptococcus soit un taux de 58,33% et 05 au genre Lactobacillus soit un taux de 41,67% .Etant donnée que notre étude porte sur les espèces impliquées dans la fabrication de yaourt,les résultats d’isolement et les tests d’identification ont ciblé les deux souches constituant le levain mixte à savoir Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus . Les souches bactériennes ont été identifiées en se basant sur leur profil macroscopique et microscopique ainsi que par le système Api50. Ces souches présentent des propriétés technologiques variables, à savoir un bon pouvoir acidifiant, par la production d’acide lactique, une activité protéolytique et une résistance aux inhibiteurs comme les antibiotiques. L’acidité exprimée en degré dornic °D après24/h de fermentation était de l’ordre de (79°D et 90°D) chez les espèces Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus respectivement. L’activité protéolytique chez les souches lactiques est importante, évaluée entre 8à11mm chez les Streptococcus thermophilus et 15à22 mm pour les Lactobacillus bulgaricus. Le test de l’antibioresistance des souches permet de signaler généralement leurs sensibilités apparentes aux différents antibiotiques utilisés. L’activité antagoniste des souches lactiques spécifiques du yaourt a révélé que ces souches ont un pouvoir d’inhibition vis-à-vis de St. Aureus et Salmonella sp. Les propriétés technologiques de B. animalis sont déterminées par son aptitude à fermenter le lait de brebis et le lait écrémé en culture pure et en culture mixte en association avec Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus. L’évolution des valeurs de pH dans le lait de brebis et le lait écrémé enrichi après 24 heures est caractérisée par une baisse de pH atteignant les valeurs 4.7 et 4.9 dans le lait écrémé enrichi et le lait de brebis respectivement. Inversement, les teneurs en acidité Dornic augmentent et atteignent 72 °D après 24 heures de fermentation dans le lait écrémé enrichi, alors que dans le lait de brebis, la teneur atteinte en fin de fermentation est de 69 °D. La survie de Bifidobacterium animalis dans les produits fermentés en culture mixte, associée avec Lb. delbrueckii subsp bulgaricus et S.thermophilus(Strp) dans le lait reconstitué écrémé et le lait de brebis stocké à 6°C pendant 21jours (0-4h) durée de fermentation et 7-21jours durée de post-acidification) s’est révélée beaucoup mieux en culture mixte qu’en culture pure dans le lait fermenté de brebis. Mots clé : Lait de vache; Lait de brebis; Lait fermenté; yaourt; Bactéries lactiques; Bifidobacterium; Culture pure; Culture mixte; Fermentation; Viabilité.
