Hantavirus (PUU) - Progen Biotechnik

20-267 PR59156 Hanta (PUU) IgG+IgM Elisa frz_V7 1/5
Hantavirus (Puumala)
IgG/IgM-ELISA
Immunoessai enzymatique pour la détermination
des anticorps de type IgG et IgM dirigés contre le
sérotype Puumala du Hantavirus
Référence : PR59156
Conditionnement : 96 déterminations
Conserver à : 2 - 8°C
Instruction sheet / Gebrauchsanweisung / Notice d’instruction / instrucciones de uso / gebruiksaanwijzing / istruzioni per
l'uso / σελίδα οδηγιών / bruksanvisning / modo de emprego: www.progen.de
1. Symptômes cliniques du Hantavi-
rus
La Néphropathie épidémique (NE) est causée par une
infection par le virus de type Puumala (hantavirus). Le
temps d'incubation est de 10 à 20 jours et les premiers
signes de la maladie sont proches des symptômes de
l'influenza. Les autres manifestations cliniques sont des
douleurs abdominales et lombaires, et des fonctions
rénales passagèrement limitées. Les paramètres de
laboratoires typiques sont une thrombocytopénie et une
leucocytose.
Comparée à la fièvre hémorragique avec syndrome rénal
(FHRS) causée par l'infection par le virus serotype Han-
taan, la néphropathie épidémique est une maladie bé-
nigne.
2. Application du Test
Le test Hantavirus (Puumala) IgG/IgM ELISA est appro-
prié pour la détection des anticorps IgG et IgM spéci-
fiques du virus Puumala, dans les cas de suspicion de
néphropathie épidémique (NE). La détection d'infection
par le virus Hantaan ou d'autres hantavirus inconnus est
limitée (voir Interprétation des résultats / Efficacité du
diagnostic).
3. Principe du Test
La plaque de microtitration est recouverte de protéine
recombinante de nucléocapside de virus Puumala. Pour
la détermination des anticorps de type IgM, le sérum du
patient doit être incubé avec un absorbant des IgG avant
de débuter la procédure de test, de façon à éliminer les
réactions non spécifiques causées par les IgG ou le fac-
teur rhumatoïde. Lors de l'incubation de l'échantillon
l'anticorps à mettre en évidence forme des complexes
immuns avec l'antigène recombinant fixé. Après le la-
vage, les anticorps IgG et/ou IgM spécifiques sont détec-
tés avec le conjugué anti-IgG humaines (ou anti-IgM
respectivement) lié à la peroxydase. L'addition de la
solution substrat conduit à une réaction colorée qui est
proportionnelle aux anticorps spécifiquement liés. L'ab-
sorbance est alors mesurée spectrophotométriquement.
4. Matériel et réactif requis mais non
fourni
Eau distillée
Eprouvettes
Tubes pour la dilution des sérums
Pipettes de précision (5 µl, 20 µl, 50 µl, 200 µl, 1000 µl)
Pipettes multi-canaux (100 et 200 µl)
Pointes de pipettes
Lecteur ELISA , avec filtre à 450 nm
Gants
Minuteur
5. Matériel et réactifs fourni
5.1. Contenu du test (PR59156)
MTP, plaque de microtitration de 96 puits, recouverts
d'antigène recombinant Puumala (souche: CG 18-20),
dans un sachet aluminium avec dessicant. Si nécessaire,
des puits unitaires peuvent être obtenus en découpant
les barrettes. Prêt à l'emploi!
PG, contrôle positif IgG, sérum humain avec
stabilisateurs et conservateurs; 1 flacon, 1.5 ml (bou-
chon vert). Prêt à l'emploi!
RG, contrôle de référence IgG, sérum humain avec
stabilisateurs et conservateurs; 1 flacon, 1.5 ml (bou-
chon rouge). Prêt à l'emploi!
PM, contrôle positif IgM, sérum humain avec
stabilisateurs et conservateurs; 1 flacon, 1.5 ml (bou-
chon jaune). Prêt à l'emploi!
RM, contrôle de référence IgM, sérum humain avec
stabilisateurs et conservateurs; 1 flacon, 1.5 ml (bou-
chon bleu). Prêt à l'emploi!
NEG, contrôle négatif, sérum humain avec stabilisateurs
et conservateurs; 1 flacon, 2 ml (bouchon incolore).
Prêt à l'emploi!
IVD

20-267 PR59156 Hanta (PUU) IgG+IgM Elisa frz_V7 2/5
SB 20x , Tampon Echantillon (20x), PBS pH 7.4, con-
tient un détergent et 0.01% de thimérosal, coloré en
rouge, 1 bouteille, 15 ml. Diluer avant emploi!
WASH 20x, Tampon de lavage (20x), PBS pH 7.5,
contient un détergent et 0.01% thimérosal, 1 bouteille,
50 ml. Diluer avant emploi!
CG 20x, Conjugué anti-IgG-peroxydase (20x), 1 flacon,
750 µl (bouchon noir). Diluer avant emploi!
CM 20x, Conjugué anti-IgM-peroxidase (20x), 1 flacon,
750 µl (bouchon blanc). Diluer avant emploi!
S, Substrat, tetramethylbenzidine (TMB); 1 flacon, 12 ml.
Prêt à l’emploi.
STOP, Solution d'arrêt, acide sulphurique 0.5 M,
1 flacon, 12 ml. Prêt à l'emploi!
ABS, Absorbant IgG-Facteur rhumatoïde; anti-IgG hu-
maines avec stabilisateurs et conservateurs; 1 flacon; 1.5
ml. Prêt à l'emploi!
Feuille adhésive; pour recouvrir les barrettes ELISA;
1 pièce.
6. Préparation
6.1. Echantillons et conservation
Le sérum humain doit être utilisé comme échantillon pour
le test Hantavirus (Puumala) IgG/IgM ELISA. Les échan-
tillons peuvent être conservés jusqu'à 6 semaines à 2-
8°C. les échantillons non dilués peuvent être conservés
plusieurs mois à une température de au moins -20°C.
Eviter les congélations/décongélations répétées [9].
6.2. Préparation des réactifs
Laisser le coffret revenir à température ambiante
(20-26°C). Les tampons concentrés peuvent contenir des
cristaux de sels qui se dissolvent rapidement à 37°C.
Laisser les tampons revenir à température ambiante (20-
26°C) avant de commencer le test.
Diluer les volumes requis de réactifs directement avant
usage!
Tampon échantillon prêt à l'emploi, 1+19
Exemple pour 8 puits: Ajouter 1 ml de SB 20x à 19 ml
d'eau distillée.
Tampon de lavage prêt à l'emploi, 1+19
Exemple pour 8 puits: Ajouter 1 ml de Wash 20x à
19 ml d'eau distillée.
Conjugués prêts à l'emploi, 1+19
Exemple pour 8 puits: Ajouter 50 µl de CG 20x ou
CM 20x à 950 µl de tampon de lavage prêt à l'emploi.
Dilution des échantillons de patients, 1+200
IgG: Ajouter 5 µl de sérum à 1000 µl de tampon échantil-
lon prêt à l'emploi.
IgM: Diluer comme pour les IgG. Ajouter 15 µl de ABS à
250 µl de sérum dilué, incuber 30 min à température
ambiante (20-26°C).
7. Stabilité
Conserver le coffret de réactif et les composants à 2-8°C.
Avant ouverture, les réactifs sont stables jusqu'à la date
d'expiration indiquée.
Stabilité après ouverture :
Après ouverture tous les composants sont stables 3 mois
à 2-8°C. Placer les barrettes ELISA non utilisées dans le
sachet aluminium fourni dans le coffret avec le desiccant.
Stabilité après dilution:
Le tampon de lavage et le tampon échantillon prêts à
l'emploi sont stables 1 semaine à 2-8°C. Le solution de
conjugués prête à l'emploi doivent être jetées à la fin du
test.
8. Procédure de test
Incubation des échantillons : Pipeter 100 µl de con-
trôles positif, négatif, de référence non dilué et de sérum
de patient dilué (éventuellement pré-traités avec ABS)
dans les puits appropriés. Recouvrir les barrettes avec la
feuille adhésive. Incuber 45 min à 37°C.
Lavage : Vider les puits et remplir chaque puits avec
200 µl de tampon de lavage prêt à l'emploi. Vider les
puits à nouveau et répéter l'étape de lavage 3 fois. Enle-
ver l'excès de liquide en tapant les barrettes sur du pa-
pier absorbant.
Incubation du conjugué: Pipeter 100 µl de conjugué
prêt à l'emploi (IgG or IgM) par puits. Recouvrir les bar-
rettes avec la feuille adhésive. Incuber 45 min à 37°C.
Lavage : vider les puits et procéder aux étapes de lavage
comme décrit (4 x 200 µl par puits).
Réaction du substrat : Pipeter 100 µl de substrat prêt à
l'emploi par puits. Incuber 10 min à température am-
biante (20-26°C).
Arrêt : Ajouter 100 µl de STOP à chaque puits.
Mesurer l'intensité de la couleur à 450 nm dans les
20 minutes (longueur d'onde de référence à 650 nm).
9. Remarques pour l'utilisateur
Pour usage professionnel.
La précision et la reproductibilité des résultats, dé-
pendent par-dessus tout, des facteurs suivantes :
Les échantillons hémolysés, lipémiques, ictériques ou
contaminés peuvent altérer les résultats du test.
Réaliser les incubations à 37°C et à température am-
biante (20-26°C) respectivement.
Conserver une séquence de pipetage exacte.
Réaliser les tests en double.
Les temps d'incubation ne doivent pas varier de plus de
10%. La période d'incubation démarre après le dernier
pipetage.
Le temps de pipetage des échantillons ne doit pas excé-
der 60 sec pour chaque barrette ELISA.
Le temps de pipetage du conjugué, du substrat et de la
solution d'arrêt ne doit pas excéder 10 sec pour chaque
barrette ELISA.
Notes concernant la sécurité:
La solution d'arrêt (acide sulfurique) et les constituants du
substrat (Methylpyrrolidone) peuvent causer des irrita-
tions de la peau. En cas de contact de l’acide ou du subs-
trat avec les yeux, rincer abondamment à l'eau et consul-
ter un médecin!
Le plasma humain utilisé dans ce réactif a été testé pour
le VIH (VIH 1+2), pour l'hépatite B et C et a été trouvé
négatif. Cependant, tous les produits d'origine humaine
doivent être considérés comme potentiellement infec-
tieux. Respecter les précautions universelles concernant
la manipulation de matériel potentiellement infectieux.
Certains réactifs contiennent des agents conservateurs
(thimerosal). Ne pas avaler, éviter tout contact avec la
peau et les muqueuses.

20-267 PR59156 Hanta (PUU) IgG+IgM Elisa frz_V7 3/5
Les fiches de sécurité sont disponibles sur demande!
Traitement des déchets
Produits: les produits chimiques doivent être jetés selon
les réglementations nationales respectives. La destruc-
tion des constituants biologiques doit être faite selon les
pratiques de destruction existantes employées pour les
échantillons de sérum de patient ou les déchets infec-
tieux.
Emballages: les emballages doivent être traités selon les
règlements spécifiques du pays. Traiter les emballages
contaminés de la même façon que les produits eux-
mêmes. En l'absence de spécifications officielles con-
traires, traiter les emballages non contaminés comme
des déchets domestiques ou recyclables.
Dommages dus au transport
Si un coffret est notablement abîmé, prière de contacter
le fabricant ou le distributeur local. Ne pas utiliser de
coffret notablement endommagé pour une procédure de
test. Conserver ces composants ou ce coffret jusqu'à ce
que la plainte soit traitée.
10. Contrôle de qualité
Les rapports suivant représentent les paramètres de
contrôle de qualité du coffret et doivent être calculés et
correspondre aux critères pour que le test soit valide (A,
absorbance à 450nm) :
A contrôle positif IgG,
A contrôle positif IgM
> 0.8
PG
=
A contrôle positif IgG
> 1.8
RG
A contrôle de référence IgG
NEG
=
A contrôle négatif IgG
< 0.5
RG
A contrôle de référence IgG
PM
=
A contrôle positif IgM
> 2
RM
A contrôle de référence IgM
NEG
=
A contrôle négatif IgM
< 0.5
RM
A contrôle de référence IgM
Si les critères précédent ne sont pas remplis, le test n'est
pas valide et doit être répété.
11. Calcul/Interprétation des résultats
Pour le calcul des résultats, le rapport entre l'absorbance
du patient et le contrôle de référence est déterminé :
A échantillon de patient
= Q
A contrôle de référence
Et interprété comme suit :
a) Pour les anticorps IgG
Q < 1
Négatif: Pas d'anticorps IgG spécifiques du
virus Puumala détectés.
1  Q  1.5
Pas d'interprétation claire possible. Le déve-
loppement de la maladie doit être suivi
après 10 jours.
En cas de suspicion d'infection à hantavirus,
il est recommandé de tester l'échantillon
pour les anticorps IgM et/ou pour les anti-
corps du sérotype Hantaan.
Q > 1.5
Positif: Anticorps IgG spécifiques du virus
Puumala détectés.
b) Pour les anticorps IgM
Q < 1
Négatif: Pas d'anticorps IgM spécifiques du
virus Puumala détectés.
1  Q  2
Pas d'interprétation claire possible. Le déve-
loppement de la maladie doit être suivi
après 10 jours.
En cas de suspicion d'infection à hantavirus,
il est recommandé de tester l'échantillon
pour les anticorps du sérotype Hantaan.
Q > 2
Positif: Anticorps IgM spécifiques du virus
Puumala détectés.
12. Evaluation du Test
a) IgG
L'évaluation du test Hantavirus (Puumala) IgG ELISA en
parallèle avec le test Hantavirus (Hantaan) IgG ELISA,
anticorps Haantan IF, anticorps Puumala IF, anticorps
Seoul IF montre l'efficacité de diagnostic1 suivante:
Seoul IF
n = 38
PUU-IF
n = 29
HTN-IF
n = 56
IF
ELISA
95%
88%
99%
Hantaan IgG
ELISA
(seuil 0.600)
75%
98%
84%
Puumala IgG
ELISA
(seuil 0.600)
La sensibilité et la spécificité du test Puumala IgG a été
déterminée avec 194 sérums de donneurs de sang en
bonne santé et un total de 123 sérums positifs pour les
IgG (29 positifs pour les IgG Puumala en IF). La sensibili-
té était de 99% et la spécificité pour le virus Puumala
était de 97%.
b) IgM
L'évaluation du test Hantavirus (Puumala) IgM ELISA en
parallèle avec le test Hantavirus (Hantaan) IgM ELISA,
anticorps Haantan IF, anticorps Puumala IF, anticorps
Seoul IF montre l'efficacité de diagnostic1 suivante:

20-267 PR59156 Hanta (PUU) IgG+IgM Elisa frz_V7 4/5
Seoul IF
n = 47
PUU-IF
n = 25
HTN-IF
n = 50
IF
ELISA
95%
74%
100%
Hantaan IgM
ELISA
(seuil 0.32)
68%
99%
62%
Puumala IgM
ELISA
(seuil 0.35)
La sensibilité et la spécificité du test Puumala IgM a été
déterminée avec 194 sérums de donneurs de sang en
bonne santé et un total de 122 sérums positifs pour les
IgM (25 positifs pour les IgM Puumala en IF). La sensibili-
té était de 100% et la spécificité de 99%.
13. Références
1. Niklasson B., et al.. Hemorrhagic fever with renal
syndrome: Evaluation of ELISA for detection of Pu-
umala-virus-specific IgG and IgM. Res. Virol. (1990)
141: 637-648
2. Settergren P., Juto P., Trollfors B., Wadell G. and
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3. Grcveska K., Polenakovic M., Oncevski A., Zografski
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tions of acute renal involvement in Puumala virus in-
fection: report of two cases. Clinical Nephrology
(1990) 34: 197-201
4. Gött P., Zöller L., Yang S., Stohwasser R., Bautz
E.K.F., Darai G.. Antigenicity of Hantavirus nucleo-
capsid proteins expressed in E. coli. Virus Res. (1991)
19: 1-16
5. Zöller L., Yang S., Gött P., Bautz E.K.F., Darai G..
Use of recombinant nucleocapsid proteins of the Pu-
umala and Nephropathia epidemica serotypes of Han-
taviruses as immunodiagnostic antigens. J. Med. Vi-
rol. (1993) 39: 200-207
6. Zöller L., Yang S., Gött P., Bautz E.K.F., Darai G.. A
novel µ-capture ELISA based on recombinant pro-
teins allows sensitive and specific diagnosis of hemor-
rhagic fever with renal syndrome. J. Clin. Microbi-
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7. Gött, P., Zöller, L., Darai, G., Bautz, E.K.F.: A major
antigenic domain of hantaviruses is located on the
aminoproximal site of the viral nucleocapsid protein.
Virus Genes, 14 (1):31-40 (1997)
8. Clement J, Heyman P, McKenna P, Colson P, and
Avsic-Zupanc T. The Hantaviruses in Europe: from
the Bedside to the Bench. Emerging Infectious Dis-
eases Vol. 3 No. 2 (April-June 1997).
http://www.cdc.gov/ ncidod/ EID/ vol3no2/ clem-
ent.htm
9. Togni, G. u. a.: Präanalytik. Schweiz. Med. Forum. 6
113-120 (2002)
Fabriqué par:
PROGEN Biotechnik GmbH
Allemagne et international
PROGEN Biotechnik GmbH
Maaßstraße 30
69123 Heidelberg
Germany
Telefon [phone] / 8278 0
Telefax +49 (0) 6221 / 827823
www.progen.de
[email protected]
Date of release: 30.11.2007

20-267 PR59156 Hanta (PUU) IgG+IgM Elisa frz_V7 5/5
Schéma du Protocole
Hantavirus PUU IgG et IgM
Dilution des échantillons, 1+200 1000 µl + 5 µl
Pour IgM ELISA seulement:
Préincuber l'échantillon de patient dilué avec ABS
250 µl sérum dilué + 15 µl de ABS
Incuber 30 min à température ambiante (20-26°C)
NEG, PG,RG, PM, RM non dilués et 100 µl
échantillons dilués
Incuber 45 min à 37°C
Lavage : 4  200 µl de Tampon de lavage
Conjugué dilué 100 µl
Incuber 45 min à 37°C
Lavage : 4  200 µl de Tampon de lavage
S 100 µl
Incuber 10 min à température ambiante (20-26°C)
STOP 100 µl
Lire l'absorbance à 450 nm
(longueur d'onde de référence 650 nm)