Hélène Puccio - MeetOchondrie
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Mieux comprendre l’ataxie de Friedreich par le développement de modèles cellulaires et murins Hélène PUCCIO [email protected] Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC) Friedreich Ataxia: une maladie mitochondriale Transmission Autosomique Recessive - prévalence 1:50000 : la plus fréquente des ataxies héréditaires - apparition des symptômes < 25 years Maladie neurodégénérative progressive - Atteinte combinée SNC et SNP - Troubles de l’équilibre - Ataxie spinocérébelleuse: perte de la coordination motrice - Abolition des reflexes ostéo-tendineux - Syndrome pyramidal perte des capacités ambulatoires Signes extra-neurologiques - Cardiomyopathie hypertrophique - Diabète ou intolerance au glucose Membres inférieurs Membres supérieurs Extrémité céphalique Instabilité marche Dysarthrie Troubles déglutition Atteinte du SNC dans FRDA Contrôle N Cortex N Thalamus Cerebellum Medulla Clark Column Posterior column N N Dorsal root ganglia Spinocerebellar tracts Sensory neurons Pyramidal tracts Motor neuron Spinal cord Grey matter White matter Pyramidal signs Physiopathologie de FRDA Accumulation de fer: dans le cœur et le noyau dentelé Photo: Dr. A Koeppen Stress oxydant: augmentation des marqueurs de stress oxydant dans les urines et le sang Déficit des enzymes Fe-S: CI-CIII de la chaîne respiratoire + aconitases Physiopathologie: hypothèses jusqu’en 2001 Frataxine Fer Stress oxydant Enzymes mitochondriales (Fe-S) FRDA: le gène de la frataxine ADN Gène FXN (ou FRDA) en 9q21.11 ARNm 1,3 kb - cœur, moelle épinière +++ - pancréas, foie, muscles squelettiques, cervelet (1996) ATG ++ 1,3 kb 1 2 3 1 4 5a 210 aa Protéine mature Domaine hautement conserv é Protéine FRATAXINE (FXN) - signal d’adressage mitochondrial - protéine très conservée - sans similitude avec une protéine de fonction connue Mutation majoritaire: expansion trinucleotide 96 % des patients Homozygotes (GAA)n n ∈ [7-35] n ∈ [36-100] n >100 (GAA)n 9 allèle normal prémutation allèle pathologique 1,3 kb ATG 1 2 3 4 5a ↓ expression du gène FXN, Taux résiduel de frataxine: 5 - 30 % (cellules lymphoblastoïdes) Proportionnel à la taille de la plus petite expansion. Conséquence de l’expansion Expansion GAA ADN en triple hélice Ohshima, 1998 Saveliev, 2003 ↓ élongation de la transcription formation d’hétérochromatine FRATAXINE Micromutations 4 % des patients Hétérozygotes composites • mutations nulles • mutations faux-sens (GAA) n>100 Protéine mature Domaine hautement conserv é 9 I154F W155R W155X L156P L106S L106X (GAA) 100 -1300 Y118X * * 1 1 D122Y * * 2 G130V N146K * * R165C R165P * * * *** 3 W173G * 4 L186R L182H L182F H183R * ** * L198R * 210 aa 5a ATG 1A ! C 1A ! T 2T ! C 2delT 3G ! T 3G ! A 11-12 delTC 104delC 100delG 157insC 157delC 202GTCA ! TTG 118delC 340del13 297insT IVS1+5G ! C IVS3 -2A ! G IVS3+1G ! A IVS4+2T ! G IVS4+3delA 381del4 + IVS3+1del9 Protéine mature Domaine hautement conserv é (GAA) 100 -1300 I154F L106S L106X * W155R W155X L156P Y118X D122Y G130V N146K * R165C R165P * * W173G L186R L182H L182F H183R * L198R del exon5a Conséquence de l’expansion au niveau protéique - Perte de fonction partielle (inhibition transcriptionnelle) Cerebral cortex Cerebellar cortex *C * *C * Frataxin 18 KDa control - Un taux résiduel de frataxine dans tous les tissus La frataxine Protéine mitochondriale Structure globulaire: 2 hélices α et 7 brins β Au coeur: acides aminés hydrophobes Résidus exposés Arrête d’acides aminés chargés négativement α1 β1 (liaison au fer) La fonction de la frataxine dans la mitochondrie La frataxine est un senseur/doneur de fer Les approches de notre laboratoire 1. Iron metabolism 2. Oxidative stress 3. Fe-S biosynthesis FUNCTION THERAPY 1. Large scale drug screen 2. Candidate approach FRIEDREICH ATAXIA FRATAXIN PHYSIOPATHOLOGY Knockout Knockdown Cellular Models 1. 2. 3. Mouse Models Cardiac Neuronal Muscular Hepatic Mechanisms leading to neuronal dysfunction Mechanisms leading to cardiomyopathy Physiopathology of the disease in different tissues Mouse models for Friedreich Ataxia Understand physiopathology of FRDA Unravel function of frataxin Test pharmacological therapy 1. Classical gene replacement knockout (M. Cossée 2000) Total and constitutive frataxin inactivation Embryonic lethal 2. Conditional gene replacement knockout (H. Puccio 2001; H. Seznec 2005) Tissue-specific inactivation Cardiac (MCK), neuronal (NSE), skeletal muscle (HSA) models 3. Inducible conditional gene replacement knockout (D. Simon 2004) Time and tissue-specific inactivation Neuronal (PRP) models Conditional knockout Strategy X 3 4 5 3 4 5 4 3 5 3 5 MCK Cre NSE Cre HSA Cre MCK promoter (muscle creatine kinase) : heart and skeletal muscle NSE promoter (neuron-specific enolase) : nervous system HSA promoter (human skeletal actin) : Skeletal muscle Mutant/transgenic mice Neurological model 3 5 3 5 Mutant Frda/NSE Cardiac or skeletal muscle models 3 4 3 5 3 5 3 5 5 Mutant Frda/MCK or HSA Cardiac model Heart C * * Skeletal muscle C * * Frataxin Tubulin Cardiac hypertrophy (5 weeks) Loss of weight Mitochondrial enlargement/proliferation Iron deposit Reduced life span : 10-12 weeks CII deficiency (Fe-S protein) f f (Puccio, Nature Genetics 2001) Echocardiography on the mouse Parasternal short axis LV Hypertrophic cardiomyopathy with rapid remodelling (dilatation) and reduction of contractility Parasternal Short axis M-mode LV 5 mm 5 mm Control Mutant MCK 100 Mutants * 75 50 CII/CIV activity (% Cont.) 25 4 5 Mito. Iron accumulation (% Cont.) Ejection fraction (%) Cardiac model develops a cardiomyopathy with a primary Fe-S deficit 6 7 8 weeks Phase I Fe-S deficit Phase II Cardiac dysfunction Phase III + Iron Fe deposit by EM (Seznec et al., HMG 2004) Cardiac mouse model (MCK) . Dissection of the molecular and functional events: mitochondrial proliferation birth 2w 4w 6w 8w 10 w 12 w death Fe/S deficiency cardiac dysfunction mitochondrial iron accumulation . No oxidative stress Puccio et al., 2001; Seznec et al., 2005 Inducible neurological models X 3 4 5 3 4 5 4 3 3 5 5 Prp Cre Line 28.4 ERT Line 28.6 Mutant/transgenic mouse Tamoxifen injection Cre activation 3 4 3 5 5 3 5 3 5 Brain Mutant Cerebellar Mutant Les modèles neurologiques présentent une ataxie progressive mixte cerebelleuse et sensitive Contrôle Temps sur la barre (sec) Perte progressive de la coordination et de l’équilibre 160 Mutant Lignée cervelet 120 80 Mutants 40 0 DRG Spinal Cord stimulation Sensory neuron 2 3 2,5 Motor Neuron 4 Atteinte spécifique des fibres et neurones sensitifs de large diamètre = sensibilité profonde H wave intensity (mV) 1 Specific arc reflex response defect by EMG (H wave) 2 1,5 Interneuron Muscle caption 1 0,6 mV (threshold) 0,5 0 15 17 38 Weeks (Simon, J. Neurosc. 2004) Dégénérescence sensitive Dégénérescence des neurones sensitifs des ganglions rachidiens Vacuoles (10 semaines) Réticulum endoplasmique gonflé (10 semaines) Accumulation de matériel Granuleux (20 semaines) Démyélinisation, colonne postérieure et des faisceaux spinocérébelleux Mort des neurones sensitifs par autophagie Autophagosome Membrane (ER or Golgi ?) Cytoplasm Lysosome Autophagolysosome Lysosome with lipofuscin Les modèles murins de FRDA Reproduisent des caractéristiques physiologiques et biochimiques de l’AF • Hypertrophie cardiac progressive • Déficit des activités des protéines Fe-S mitochondriales (complexes I-III de la chaîne respiratoire et les aconitases) • Accumulation mitochondriale de fer • Myopathie mitochondriale • Ataxie spinocerebelleuse et sensitive progressive • Perte de la sensibilité profonde progressive • Absence d’atteinte moteur Frataxin deficit Demontrent Deficit primaire des enzymes Fe-S Accumulation mitochondriale de fer secondaire Neurodégénérescence des DRGs: autophagie Neurones déficient en frataxine survivent pendant plusieurs semaines Fe-S biosynthesis Iron homeostasis Oxidative stress/autophagy Frataxin function within the mitochondrion [2Fe-2S] [4Fe-4S] Fe-S are cofactors of various proteins: - electron transfer - catalytic activity - structural La biosynthèse des noyaux Fe-S: le role de la frataxine La biosynthèse des noyaux Fe-S chez les mammifères Deux sites de synthèse ? Modèles souris FRDA: cytosolic Fe-S machinery les enzymes Fe-S mitochondriales sont affectées Et les protéines Fe-S Fe-S machinery extramitochondriales? Fe-S clusters biosynthesis in mammalian cells In mammalian cells: Martelli, Wattenhofer-Donzé et al., Hum. Mol. Genet. (2007) De novo Fe-S biosynthesis: cytosolic or not cytosolic? IscU isoform (Tong and Rouault, 2000; Cocozza, 2005) Nfs1 isoform (Tong and Rouault, 2000) Extramitochondrial frataxin (Cocozza, 2005; Testi, 2006; Cortopassi, 2007) cytosolic Fe-S machinery Is there any cytosolic IscU and frataxin in Fe-S machinery IscU frataxin Nfs1 mouse tissues? Extra-mitochondrial iron-sulfur cluster machinery? Fractionation experiments on mouse tissues and cell lines m: mitochondrial fraction c: cytosolic fraction IscU and frataxin are detected only in mitochondria Martelli, Wattenhofer-Donzé et al., Hum. Mol. Genet. (2007) Stéphane Schmucker, Hum. Mol. Genet. (2008) Conclusions - un déficit en frataxine induit un déficit dans les protéines à noyau Fe-S mitochondriales et extramitochondriales - de nouvelles pistes sur les voix métaboliques qui contribuent à la maladie (notamment dans la dégénérescence neuronale) Métabolisme ADN/ARN: des nouvelles protéines à Fe-S - DNA polymerase alpha-primase (p58 subunit)) - helicases: XPD (nucleotide excision repair) FancJ (crosslink repair) - glycosylases: Nth1; MutY - endonuclease: rpS3 Le role de la biosynthèse des noyaux Fe-S dans les pathologies humaines Myopathy with ISCU deficiency Adapted from Lill Annual Review Bioch. 2008 Les approches thérapeutiques - Correction des conséquences métaboliques du déficit en frataxine – Antioxydants (analogue du Coenzyme Q10: Idébénone…) – Chélateur de fer (Déferiprone …) - Augmentation du niveau de frataxine – Ligand de l’ADN (polyamines) – Inhibiteurs des histones désacétylase (HDACi) – Erythropoïétine recombinante (rhEPO) – Pliaglitazone (proliferation mitochondriale) Therapeutic assay - IDEBENONE Idebenone : anti-oxydant, coenzyme Q10 analog, e- transfert in RC CH3O CH3O Coenzyme Q10 Idebenone Preliminary study in FRDA patients (Rustin et al., 1999) ventricular mass in 3 patients after 4-9 months of treatment Assess protective effect of idebenone on cardiac model 90 mg/kg/day oral administration administration at 3 weeks until death Idebenone functionally rescues the murine FRDA cardiomyopathy Survival Ejection Fraction (%) Dose : 90 mg/kg/day ** p=0,012 1 0,75 0,5 0,25 0 30 40 50 60 70 80 90 100 Age (days) Controls n=6 Non-treated Mutants Weeks Treated Mutants Treated Mutants n = 15 Placebo Mutants Idebenone is cardioprotective (10% increase survival) No effect on primary Fe-S cluster deficit Validates idebenone (phase III clinical trial at NIH and in EU) (Seznec et al., HMG 2004) Alleviating transcriptional silencing using HDAC inhibitors Current state of development Alleviate heterochromatin in primary FRDA lymphocytes (in vitro) Upregulates both mRNA and protein (up 1.5x) Testing in animal models ongoing- preliminary data are encouraging Toxicity studies ongoing Dr. J. Gottesfeld laboratory Scripps Institut Los Angeles
