Partie 1 - VetAgro Sup

VETAGRO SUP
CAMPUS VETERINAIRE DE LYON
Année 2014 - Thèse n°
ETUDE DU SYSTEME IMMUNITAIRE DE LA TORTUE
CAOUANNE (CARETTA CARETTA) : UTILISATION COMME
OUTIL DIAGNOSTIQUE ET INDICATEUR DE TOXICITE
DES POLYCHLOROBIPHENYLES (PCBs)
THESE
Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I
(Médecine - Pharmacie)
et soutenue publiquement le 28 Novembre 2014
pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire
par
ROUSSELET-RUSSO Estelle
Née le 8 Février 1981
à Grenoble
VETAGRO SUP
CAMPUS VETERINAIRE DE LYON
Année 2014 - Thèse n°
ETUDE DU SYSTEME IMMUNITAIRE DE LA TORTUE
CAOUANNE (CARETTA CARETTA) : UTILISATION COMME
OUTIL DIAGNOSTIQUE ET INDICATEUR DE TOXICITE
DES POLYCHLOROBIPHENYLES (PCBs)
THESE
Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I
(Médecine - Pharmacie)
et soutenue publiquement le 28 Novembre 2014
pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire
par
ROUSSELET-RUSSO Estelle
Née le 8 Février 1981
à Grenoble
2
3
4
REMERCIEMENTS
À Monsieur le Professeur Frédéric BERARD
De la Faculté de Médecine de Lyon,
Qui m’a fait l’honneur d’accepter la Présidence de ce jury de thèse,
Mes hommages respectueux.
À Monsieur le Professeur Michel PEPIN
De VetAgro Sup,
Pour avoir accepté d’encadrer ce sujet de thèse,
Qu’il voit ici le témoignage de ma sincère reconnaissance et de mon
respect le plus profond.
À Monsieur le Professeur Philippe BERNY
De VetAgro Sup,
Qui a eu la gentillesse d’accepter de participer à ce jury de thèse
Qu’il trouve ici l’expression de ma gratitude.
5
6
REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier mes co-auteurs :
Aux docteurs Joseph Flanagan, Maryanne Tocidlowski,
Mmes Erika Ghebard, Kara LaVictoire, le personnel de NOAA Fisheries à
Galveston
Au Docteur Céline Godard-Codding pour avoir initier le projet à mes côtés et
m’avoir accorder sa confiance,
A Mr Benjamin Higgins, pour m’avoir accueilli à bras ouvert, et sans qui ce
projet n’aurait jamais vu le jour,
Aux Docteurs Sylvain DeGuise et Milton Levin, pour leur aide tant logistique
que morale, pour leur confiance, leurs conseils avisés et nos longues
discussions,
Au Docteur Nicole Stacy, mon mentor, mon guide, mon amie, sans qui la
compréhension de l’interprétation de la pathologie clinique des reptiles aurait
été complexe,
Au Docteur Terry Norton, pour sa patience, sa confiance, pour son partage, ce
qu’il m’a transmis et me transmet.
Au Docteur Nancy Mettee, qui sans me connaître a accepté de faire partie du
projet.
Pour toutes les personnes merveilleuses qui m’ont aidé de près ou de loin dans ce projet.
7
8
TABLE DES MATIERES
TABLE DES ILLUSTRATIONS………………………………………………………………………………...13
INDEX DES ABREVIATIONS…………………………………………………………………………………..15
INTRODUCTION…………………………………………………………………………………………………...17
PARTIE 1 : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I.
Histoire naturelle de la tortue caouanne………………………….22
Diagnose d’espèce……………………………………………………....22
Répartition et habitat…………………………………………………….25
1.
Répartition………………………………………………………….25
2.
Habitat……………………………………………………………...27
C.
Biologie………………………………………………………………….30
1.
Les femelles sexuellement matures………………………………...30
2.
Les nouveau-nés……………………………………………………31
3.
Les juvéniles………………………………………………………..31
4.
Adultes néritiques ou océaniques…………………………………..32
A.
B.
II.
Menaces et protections……………………………………………32
A.
B.
Menaces anthropiques…………………………………………………..33
1.
Menaces terrestres………………………………………………….33
2.
Menaces marines…………………………………………………...34
Statut et protection ……………………………………………………...36
III.
Le système immunitaire………………………………………….37
A.
B.
1.
2.
3.
4.
C.
1.
Le système hématopoïétique des reptiles……………………………….37
Les organes lymphoïdes des reptiles……………………………………38
La moelle osseuse…………………………………………………..38
Le thymus…………………………………………………………..39
a.
Anatomie………………………………………………………...39
b.
L’involution thymique……………….…………………………..41
La rate……………………………...……………………………….41
a.
Anatomie…………………………………….…………………..41
b.
Fonction de la rate……………………………………………….43
Agrégations lymphoïdes et structures lymphoïdes accessoires…….43
a.
Le tissu lymphoïde associé aux intestins………………………...44
b.
Les nœuds lymphatiques et autres structures lymphoïdes………44
Le système immunitaire…………………………………………………44
Les mécanismes de défense innée………………………………….46
a.
Revêtements cutanés et muqueux……………………………….46
b.
Les facteurs humoraux non spécifiques…………….…...………46
9
c.
2.
a.
b.
c.
d.
3.
4.
5.
a.
b.
IV.
Les facteurs cellulaires non spécifiques………………………...48
Les mécanismes de défense spécifique…….……………...……….54
Les lymphocytes………………………………………….……..54
Les lymphocytes B et T des reptiles……………………….……58
Les immunoglobulines……………………….………………….61
La réponse immunitaire à médiation cellulaire…………...……..63
Récapitulatif des tests pouvant être utilisés………………………...65
La mémoire immunitaire chez les reptiles…………………………66
Facteurs de variation de la réponse immune……………………….66
La température…………………………………………………..66
La saison et les hormones……….………………………………67
Toxicité des Polychlorobiphényles chez la tortue marine………..70
A.
Les polychlorobiphényles (PCBs)…………………………………….70
1.
Histoire naturelle des polychlorobiphényles……………………….70
2.
Toxicité des PCBs : généralités…………………………………….72
3.
Effets biologiques des PCBs chez les tortues………………………73
a.
Les voies d’entrée……………………………………………….73
b.
Excrétion du sel : les glandes à sel……………………………...74
c.
Toxicité sur les embryons……………………………………….76
d.
Contamination et marqueurs d’exposition………………………77
4.
Effets des PCBs sur le système immunitaire……………………….79
a.
Généralités………………………………………………………79
b.
Les tortues marines……………………………………………...80
B.
Les outils d’étude………………………………………………………..82
1.
L’hématologie et la biochimie……………………………………...82
2.
L’immunité innée…………………………………………………..82
3.
L’immunité acquise………………………………………………...83
V.
Conclusion partielle…………………………………………………84
PARTIE 2 : ETUDE EXPERIMENTALE
I.
Matériel et méthodes………………………………………………86
A.
B.
C.
D.
Sujets d’étude et conditions de captivité………………………………..86
Prélèvement de sang chez les tortues marines………………………….88
Analyse sanguine hématologique et biochimique……………………….89
Fonctionnalité du système immunitaire…………………………………91
1.
Isolement des cellules sanguines mononuclées…………………….91
2.
Prolifération lymphocytaire………………………………………...91
3.
Activité NK cellule tueuse naturelle avec et sans PCBs…………...92
4.
Isolement des sous populations de cellules leucocytaires………….93
5.
Tri cellulaire et caractérisation morphologique……………………94
10
6.
7.
8.
Phagocytose avec et sans PCBs……………………………………94
Explosion respiratoire……………………………………………...95
Préparation des PCBs………………………………………………95
E.
Analyse statistique………………………………………………………96
1.
Etude des paramètres hématologiques et biochimiques……………96
2.
Etude du système immunitaire avec et sans PCBs…………………96
II.
Paramètres hématologiques et biochimiques……………………..97
A.
Résultats…………………………………………………………………97
1.
Morphométrie et hématologie……………………………………....97
2.
Biochimie plasmatique…………………………………………....102
B.
Discussion……………………………………………………………...111
1.
Hématologie………………………………………………………111
2.
Biochimie plasmatique……………………………………………117
III.
Evaluation du système immunitaire d’un point de vue
fonctionnel…………………………………………………….....123
A.
Résultats………………………………………………………………123
1.
Profils obtenus en cytomètre de flux et caractérisation
morphologique des leucocytes du sang périphérique……………..123
2.
Le système immunitaire inné des tortues caouannes……………..126
a.
La phagocytose…………………………………………………126
b.
L’explosion respiratoire…………………………………….......127
c.
L’activité des cellules tueuses naturelles……………………….128
3.
Réponse des lymphocytes de tortue caouanne à une stimulation…129
B.
Discussion……………………………………………………………...130
1.
Fonctions du système immunitaire inné chez les tortues
caouannes………………………………………………………….131
2.
La prolifération lymphocytaire……………………………………133
C.
Conclusion……………………………………………………………...134
IV.
Modulation du système immunitaire inné par les PCBs………...136
A.
Résultats………………………………………………………………..136
1.
Effets des PCBs 105 et 138 sur la phagocytose…………………...136
2.
Effets des PCBs 105, 138 et 169 sur l’activité NK………………..138
B.
Discussion………………………………………………………………139
CONCLUSION……………………………………………………………………………………………………….143
BIBLIOGRAPHIE…………………………………………………………………………………………………..145
ANNEXES…………………………………………………………………………………………………………….163
Annexe 1 : Nomenclature IUPAC des PCBs…………………………………………………163
Annexe 2 : Article 1 : J. Zoo. Wild.Med. 2013. 44(4), 859-874………………………164
11
Annexe 3 : Article 2 : Vet. Immunol. Immunupathol. 2013. 56 (1-2) 43-53
………………………………………………………………………..…………………………….165
Annexe 4 : Article 3 : Short communication (non publiée)…………………………..166
Annexe 5 : Poster Morris animal Foundation, Vet Student scholar Combined
hematology and immunology : a breakthrough to understand immune
functions of stranded sea turtles……………………………………………………..171
12
TABLE DES ILLUSTRATIONS
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Identification des espèces de tortue marine (D'après NMFS/SEFSC)……..23
Figure 2. Mesures de la carapace…………………………………………………….24
Figure 3. Répartition mondiale de la population de tortue caouanne. 2009………….26
Figure 4. Répartition mondiale des sites de nidification de la tortue caouane. 2008...26
Figure 5. Cycle de vie de la tortue caouanne………………………………………...28
Figure 6. Tortue luth adulte prise dans les filets et échouée
(Crédit Aquarium La Rochelle)……………………………………………...35
Figure 7. Turtle Excluder Device, filet permettant la fuite des tortues………………37
Figure 8. Thymus de tortue verte (Chelonia mydas) en position anatomique……….40
Figure 9. Coupes histologiques de thymus de tortue caouanne (Caretta caretta) riche
ou non en tissu lymphoïde……………………….……………...……………40
Figure 10. Structure histologique de splénopancréas de crotale (Crotalus viridis)….41
Figure 11. Structure histologique de rate de tortue caouanne (Caretta caretta)……..43
Figure 12. Photomicrographies des monocytes de testudinidae, réactifs ou non…….49
Figure 13. Photomicrographies d’hétérophiles de reptiles, réactifs ou non………….52
Figure 14. Photomicrographies d’éosinophiles de reptiles, réactifs ou non………….54
Figure 15. Immunité adaptative…………………...…………….…………………...58
Figure 16. Réponse immunitaire en réponse à une infection virale………………….58
Figure 17. Photomicrographie de lymphocyte de boa constrictor…………………...59
Figure 18. Structure générale des polychlorobiphényles…………………………….71
Figure 19. Voies d’entrée et conséquance d’exposition aux toxiques……………….74
Figure 20. Glandes à sel de tortue caouanne (Caretta caretta)………………………75
Figure 21. Prise de sang réalisée dans le sinus cervical dorsal sur une tortue caouanne
juvénile……………………………………………………………………….88
Figure 22. Lecture du PCV (Packed cell volume) comme estimation de l’hématocrite.
……………………………………………………………………………….90
Figure 23. Corrélation entre le poids et la longueur de carapace (SCL) pour les 5
classes d’âge de tortues caouannes…………………………………………...97
Figure 24. Représentation sous forme de boxplots de certains paramètres
hématologiques et biochimiques de la tortue caouanne…………………….101
13
Figure 25. Photomicrographies de cellules sanguines de tortue caouanne
juvénile.……………………………………………………………………...102
Figure 26. Profils de cytométrie de flux et examen cytologique du gradient de
Ficoll….……………………………………………………………………..123
Figure 27. Gradients de Percoll discontinus obtenus après centrifugation………….125
Figure 28. Profils de cytométrie de flux et examen cytologique des gradients de
Percoll……………………………………………………………………….125
Figure 29. Profils de cytométrie de flux et phagocytose associée…………………..127
Figure 30. Explosion respiratoire des leucocytes de tortues caouannes…………….128
Figure 31. Activité cellules tueuses naturelles (NK) des tortues caouannes………..129
Figure 32. Prolifération lymphocytaire consécutive à l’exposition aux mitogènes....130
Figure 33. Profils de cytométrie de flux et activité phagocytaire en présence
du PCB-105………………………………………………………………….137
Figure 34. Activité phagocytaire et effets du PCB-138……………………………..137
Figure 35. Effets des concentrations croissantes du PCBs-105 et PCB-138 sur l’activité
cellules tueuses naturelles (NK)…………………………………...138
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I : Concordance entre stade physiologique, localisation et taille de carapace…
……………………………………………………………………………..…25
Tableau II : Valeurs hématologiques publiées chez les reptiles……………………...60
Tableau III : Divers tests des fonctions du système immunitaire utilisés chez les
reptiles ainsi que leurs limites………………………………………………...65
Tableau IV: Paramètres hématologiques et morphométriques obtenus dans notre
étude…………………………………………………………………………..98
Tableau V: Analytes biochimiques obtenus dans notre étude……………………….105
Tableau VI: Synthèse des paramètres hématologiques et morphométriques de la
littérature…………………………………………………………………….113
Tableau VII: Synthèse des analytes biochimiques de la littérature………………….119
14
INDEX DES ABREVIATIONS
2-ME: 2-mercaptoéthanol
Ac: Anticorps
ANOVA: Analysis of Variance: Analyse de variance
BALT: Bronchus-associated lymphoïd tissue : tissu lymphoïde associé aux bronches
BrdU: 5-bromo-2'-deoxyuridine
CBC: Complete Blood Count ou hémogramme
CCL: Curved Carapace length= longueur courbe de la dossière
CITES ou Convention de Washington: Convention sur le commerce international des
espèces de faune et de flore sauvages menacées d'extinction
ConA : Concanavalin A : lectine extraite du haricot
CPA: Cellules Présentatrices d’Antigène
CR: CRitically endangered : espèce critique d’extinction
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium : Milieu de culture pour cellules
mammifères
DMSO: Diméthylsulfoxide
DPS: Distinct Population Segments: Segment de population disctincte
ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay
EN: ENdangered : Espèce en Danger
FSC: Forward Scatter
FWS: Fish and Wildlife Service
GALT: Gut-associated lymphoïd tissue : tissu lymphoïde associé aux intestins
HEPES: acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique
HBSS: Hank's Balanced Salt Solution
Hct: Hématocrite
IUCN: Union internationale pour la conservation de la nature
K-562: lignée érythroleucémique humaine
LPS : Lipopolysaccharide
NMFS: National Marine Fisheries Service
NPS: Newborn Piglet serum: Sérum de porcelet
NOAA: National Oceanic and Atmospheric Administration
PALS: Periarteriolar lymphoid sheath: Gaines ou manchons lymphoïdes
périartériolaires
PAS: Periodic Acid Schiff
PBMC: Peripheral blood mononuclear cells: leucocytes mononuclés du sang
périphérique
PBS: Phosphate Buffered Saline: tampon phosphate salin
PCV: Packed cell Volume
15
PDB: phorbol 12,13-dibutyrate
PELS: manchon lymphoïde péri-ellipsoïdal
PFC: hemolysin plaque forming cell: plage de lyse
PHA : Phytohémagglutinine : lectine de haricot
PI: iodure de propidium
PMA: phorbol myristate-2 acétate-3
ppt: Part per trillion
PWM: pokeweed: Phytolacca Americana ou raisin d’Amérique
RPMI: Roswell Park Memorial Institute : Milieu de culture pour cellules mammifères
RRBC: Rat red blood cells: erythrocytes de rat
SCL: Straight carapace length: longueur en ligne droite de la carapace
SRBC: Sheep red blood cells: erythrocytes de mouton
SSC: Side scatter
STH: anti-Saitohin
TED: Turtle Excluder Device
TEF: Toxic Equivalent Factor
TEWG: Turtle Expert Working Group
Thy-1: THYmocyte differentiation antigen 1
TWBC: total white blood cell: Numération des leucocytes
VU: VUlnérable risque élevé d’extinction à l’état sauvage
YAC-1: lignée de lymphome murin
16
Introduction
Bien qu’animaux fascinants et chéris de l’opinion publique, empreints d’une forte
symbolique, les tortues marines n’en demeurent pas moins, plus que jamais, menacées
d’extinction. Il existe deux familles, les Dermochelyidae et les Cheloniidae (ordre des
Testudines). Les Cheloniidae sont des tortues à carapace dure, incluant la tortue
caouanne (Caretta caretta), la tortue verte (Chelonia mydas), la tortue imbriquée
(Eretmochelys imbricata), la tortue de Kemp (Lepidochelys kempii), la tortue olivâtre
(Lepidochelys olivacea) et la tortue à dos plat (Natator depressus) que l’on trouve
exclusivement dans les eaux australiennes. L’autre famille des Dermochelyidae est
constituée de la seule tortue luth (Dermochelys coriacea). Mis à part la tortue à dos
plat dont le statut n’est pas connu à ce jour, ces tortues marines figurent toutes sur la
liste rouge de l’IUCN où elles sont menacées d’extinction à des degrés variables.
Ainsi, par ordre croissant de gravité se trouvent la tortue olivâtre (VU), les tortues
vertes et caouannes (EN) et enfin les tortues de Kemp, imbriquées et luth (CR).
Parmi les dangers responsables de cette inéluctable déclin figurent la pêche, le
braconnage, la destruction des habitats et sites de ponte, la pollution qu’elle soit
chimique, biologique ou physique et le changement climatique (Hamman et al.,
2010). Des groupes d’experts (IUCN’s Marine Turtle Specialist Group) se réunissent
régulièrement pour établir les priorités de conservation et de recherche afin d’aboutir
à l’élaboration de stratégies d’action en vue de la préservation de ces espèces.
Décrié depuis de nombreuses années, voire des décennies, l’impact direct de la
pollution anthropogénique sur la santé et le déclin des populations n’est pas trivial. En
2010, un groupe d’étude s’est réuni afin de faire le point sur les connaissances
actuelles ; de toutes les formes de pollutions existantes, la pollution chimique et les
effets physiologiques provoqués par les contaminants sont les moins bien connus. La
difficulté est multiple : d’une part il est difficile d’identifier le toxique mis en cause
car ces animaux ont une longévité importante, parcourent les océans du globe et ce à
différents stades de leur vie ; par conséquent ils sont exposés à un vaste mélange de
polluants. D’autre part, les tortues marines sont protégées par la convention de
Washington (CITES) et figurent sur la liste rouge de l’IUCN ce qui exclut toute
17
possibilité d’expérimentation animale et nécessite l’utilisation de modèles cellulaires
soumise à l’obtention de permis fédéraux, notamment aux Etats-Unis.
Les concentrations de toxiques chimiques sont généralement mesurées à partir
de carcasses d’animaux échoués, d’échantillons de sang lors de campagnes
d’évaluation de la santé des animaux ou directement dans les œufs pondus saccagés.
Le lien entre le toxique chimique et son effet sur la santé de l’animal peut être
matérialisé grâce à l’étude du système immunitaire qui se révèle être à l’interface
entre l’environnement et l’animal. De façon très simplifiée et schématique, tout
dysfonctionnement ou défaillance du système immunitaire aura des répercussions sur
la santé de l’animal. L’étude du système immunitaire chez les reptiles en général et,
plus particulièrement les tortues marines, en est à ses prémices. De plus, face à
l’importance croissante de la conservation des espèces menacées associée à
l’implication des vétérinaires travaillant dans des centres de réhabilitation ou
aquariums, la recherche concernant la pathologie variée des tortues marines est
devenue nécessaire. Les animaux échoués requièrent une prise en charge médicale
spécifique afin d’aboutir à leur rétablissement. Actuellement les paramètres
hématologiques et biochimiques constituent des indicateurs pronostiques de premier
choix afin d’évaluer l’état de santé des animaux y compris lors d’exposition à des
polluants environnementaux (Deem et al. 2009, Casal et al. 2009). Cependant ils ne
permettent pas d’évaluer l’aspect fonctionnel du système immunitaire, ce qui
constituerait un outil diagnostique supplémentaire afin d’aboutir à la compréhension
de son fonctionnement chez les animaux affectés, et à plus long terme aboutir à
l’élaboration d’un traitement médical mieux adapté pour réhabiliter les animaux
échoués.
Ainsi, ce travail résulte d’une volonté d’allier plusieurs disciplines que sont la
toxicologie, l’immunologie et la pathologie de la tortue. Il se situe donc à l’interface
d’une problématique extrêmement complexe et a pour but le développement d’outils
et méthodes permettant l’évaluation de diverses fonctions du système immunitaire et
leur utilisation comme outils indispensables afin de mesurer l’impact des polluants
chimiques tels que les polychlorobiphényles.
Pour la réalisation de ce travail j’ai bénéficié d’une bourse de postdoctorat de
un an de la Fondation Rotary. Ce travail a été effectué aux Etats-Unis, à plusieurs
endroits et avec l’aide de nombreux collaborateurs : Dr Céline Godard-Codding (The
Institute of Environmental and Human Health, Texas Tech University, Lubbock, TX),
18
Drs Joseph Flanagan et Maryanne Tocidlowski (Houston Zoo), Dr Nicole Stacy
(University of Florida, College of Veterinary Medicine, Gainesville, FL), Drs Milton
Levin et Sylvain DeGuise (University of Connecticut, Storrs, CT), Mr Benjamain
Higgins (NMFS, NOAA, Galveston, TX).
Les tortues caouannes incluses dans l’étude sont des animaux du Sea Turtle
Facility, National Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA) (Galveston, TX).
Ces animaux font partie de programmes de recherche, arrivent au centre alors qu’ils
ne sont encore qu’au stade d'embryons et sont relâchés lorsqu’ils atteignent une taille
convenable (généralement au bout de 5 ans).
Dans un premier temps, nous nous familiariserons avec la tortue caouanne,
son habitat et sa biologie, puis nous aborderons les menances auxquelles elles sont
soumises. Ensuite nous rentrerons dans le cœur du sujet en nous intéressant au
système immunitaire des reptiles en général et des chéloniens en particulier. Dans le
dernier chapitre dans cette partie bibliographique, nous traiterons des aspects
toxicologiques et des effets des polychlorobiphényles, polluants organiques
largements répandus et toujours d’actualité malgré son interdiction aux Eetats-Unis
en 1979.
En seconde partie nous nous intéresserons spécifiquement à la tortue caouanne
comme modèle d’étude. Cette partie se déclinera en trois volets :
1/ L’étude de la comparaison des paramètres hématologiques et biochimiques
de cinq classes d’âge de tortues juvéniles captives, afin de mieux appréhender l’état
de santé des animaux sur lesquels nous avons entrepris les études suivantes,
2/ L’étude des fonctions du système immunitaire de la tortue caouanne
juvénile et enfin,
3/ Les effets de PCBs sélectionnés sur certaines des fonctionnalités
précédemment décrites.
19
20
PARTIE 1
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
21
Partie 1: Etude Bibliographique
I. Histoire naturelle de la tortue caouanne
A. Diagnose d'espèce
Décrite par Linné en 1758 sous le nom de Testudo caretta, la tortue caouanne
(Caretta caretta) ou Loggerhead sea turtle en anglais est l’une des six espèces de
tortues de mer à carapace dure, formant la famille des Cheloniidés (Ordre des
Testudines). D’après les analyses génétiques il y aurait deux populations distinctes ;
celle d’Atlantique et celle de l’Indopacifique (Conant et al., 2009).
La tortue caouanne possède un bec et une tête plus grands que les autres
espèces de tortues marines. Sa tête est non rétractile. Chez l’adulte, la tête et la
dossière sont brun rougeâtre, les nageoires sont marron. Le dimorphisme sexuel est
apparent chez les individus adultes dont la longueur de la dossière dépasse 67 cm de
longueur mesurée en ligne droite (Dodd, 1988). Les mâles ont une queue très longue,
qui dépasse nettement le bord postérieur de la dossière ainsi que la présence d’une
griffe plus longue et plus courbée sur les nageoires. La carapace de l’adulte est
épaisse et fortement kératinisée. Elle est longue et cordiforme. Caractère important de
diagnose d’espèce, elle comprend 5 plaques osseuses vertébrales, habituellement 5
paires de plaques costales, 12 ou 13 paires de plaques marginales et une large plaque
nucale qui rejoint de part et d’autre les deux premières plaques costales (Fig. 1).
22
Figure 1. Identification des espèces de tortue marine (D'après NMFS/SEFSC)
23
Les mesures de la dossière s’effectuent de diverses manières. Ces considérations
seront utiles pour la suite de l’exposé (Fig. 2).
- Mesure curviligne de la dossière : CCL: Curve carapace length
- Mesure en ligne droite de la dossière : SCL: Straight carapace length
- SCL min
- SCL max
- SCL notch to tip : de l’encoche nucale à l’extrémité postérieure
Figure 2. Mesures de la carapace (SCL en bas à gauche et CCL en bas à droite, NMFS)
24
Les mesures de longueur de la dossière correspondent à chacun des cinq stades de
développement de la tortue caouanne telles que décrit par le Turtle Expert Working
Group (TEWG, 2009) et présentées dans le tableau ci-contre :
Tableau I : Concordance entre stade physiologique, localisation et taille de carapace.
Stade
Stade
physiologique
Localisation
SCL
1
<1 an
Terrestre à océanique
4,5 à 15 cm
2
Juvénile
Océanique
15 à 63 cm
3
Juvénile
Océaniques ou Néritiques,
41 à 82 cm, max 63 cm
petits juvéniles benthiques
dans l’Atlantique
4
Juvénile
5
Adulte
Océaniques ou Néritiques,
grands juvéniles benthiques
Océaniques ou Néritiques
63 à 100 cm
82 à 100 cm et plus
B. Répartition et habitat
1. Répartition
Les tortues caouannes sont largement répandues dans les eaux tempérées et
tropicales des océans Atlantique, Pacifique et Indien (Fig. 3). La plupart des tortues
caouannes nichent sur les côtes occidentales des océans Atlantique et Indien (Fig. 4),
les sites de nidification les plus importants se trouvant au sud de la Floride, Etats-Unis,
et dans l’île de Masirah, Oman, (Witherington et al., 2009). La limite nord de l’aire de
nidification de l’Atlantique en Amérique du Nord se trouve en Virginie ; la plus
grosse colonie nicheuse se trouve en Floride et regroupe 80% des activités de
nidification des populations de l’Atlantique (NMFS and USFWS 2007). Les tortues
caouannes du Pacifique Nord nichent presque exclusivement au Japon, dans l’est de
25
l’Australie et en Nouvelle-Calédonie (NMFS and USFWS, 2007). Il a été signalé
l’existence d’une aire de nidification de faible importance sur l’archipel Xisha, dans la
mer de Chine méridionale (Chan et al., 2007). Les trois principaux sites de ponte se
trouvent sur l’île Yakushima et sur les plages de Miyazaki et de Minabe, sur les îles
principales du Japon (Conant et al., 2009).
Figure 3. Répartition mondiale de la population de tortue caouanne. 2009 (D’après NMFS)
Figure 4. Répartition mondiale annuelle des sites de nidification (nesting females) de la tortue caouane.
2008 (D’après NMFS).
26
La tortue caouanne compte deux lignées qui ont divergé il y a environ trois
millions d’années. L’une vit dans les océans Pacifique et Indien et l’autre dans
l’Atlantique et la Méditerranée (Conant et al., 2009). Deux transferts matrilinéaires
sont survenus successivement il y a 250 000 et 12 000 ans ce qui a permis le maintien
des deux lignées au sein d’une espèce commune. Des études d’ADN mitochondrial
ont confirmé l’existence d’une forte structure de population au sein des colonies
nicheuses (Conant et al., 2009). Les populations du Pacifique et de l’Atlantique sont
génétiquement et géographiquement distinctes. Il existe à l’échelle mondiale neuf
DPS (Distinct Population Segments) représentant chacun une vaste portion de l’aire
de répartition de l’espèce et un écosystème unique (Conant et al., 2009). Cela tend à
appauvrir considérablement la diversité génétique de l’espèce. Les DPS sont répartis
par le Biological Review Team (BRT) dépêché par le biais du NMFS et FWS (Fish
and Wildlife Service) des Etats-Unis: Pacifique Nord, Pacifique Sud, Nord de l’océan
Indien, Sud-est de la région indo-Pacifique, Sud-ouest de l’océan indien, nord-ouest
de l’Atlantique, mer Méditerranée et Atlantique Sud.
2. Habitat
La tortue caouanne a besoin d’un habitat mixte à la fois terrestre, nécessaire à
la ponte, et marin. Toutefois elle passe la plus grande partie de sa vie en mer. Dès leur
éclosion, les petites tortues quittent les nids creusés sur des plages sableuses pour se
réfugier dans la mer. Les mâles ne reviendront plus jamais sur la terre ferme,
contrairement aux femelles qui y reviendront pour pondre leurs œufs. Les nids sont
habituellement creusés entre la ligne de marée haute et le front dunaire (Witherington
et al., 1986). Les œufs ont besoin d’un substrat très humide permettant un échange de
gaz suffisant ainsi qu'un maintien des températures propices à leur développement
(Miller et al., 2003). Les sites de nidification aus Etats-Unis s'étendent des côtes du
sud de la Virginie, Caroline du Sud, Caroline du Nord, Géorgie jusqu'en Floride. Il en
existe également de la côte mexicaine des Caraïbes, jusqu’en Guyane française, aux
Bahamas, dans les Petites Antilles et dans les Grandes Antilles (NMFS et USFWS,
2007 ; Conant et al., 2009 ; TEWG, 2009).
A chaque étape de son cycle correspond un habitat marin différent. Toutefois,
les changements d’habitat ne seraient pas permanents (Bolten et al., 2003 ; Conant et
27
al., 2009). Les tortues choisiraient individuellement leur habitat, épipélagique,
benthique ou les deux, en fonction de leurs besoins alimentaires (Fig. 5).
Figure 5. Cycle de vie de la tortue caouanne (Foley communication personnelle). Chaque étape
importante est associée à changement d’habitat lui-même lié à un besoin alimentaire spécifique. (1) La
femelle pond puis repart tout en restant près des côtes où la nourriture est abondante. Elle migre ensuite
en vue d’entamer sa migration de reproduction (5) puis son accouplement afin qu’un nouveau cycle
recommence. Elle restera environ 2 semaines près des côtes (6). Une fois les œufs éclos (2), les
nouveaux-nés entament leurs nages frénétiques, puis s’éloignent afin d’atteindre les eaux océaniques
(3). De nombreux aller-retour entre les eaux océaniques et néritiques se succèderont (4) jusqu’à
maturité sexuelle. Le devenir des mâles est peu connu.
Les tortues du nord-ouest de l’Atlantique fraîchement écloses se déplacent
vers le large et s’associent aux colonies dérivantes de sargasses (Witherington et al.,
2002). Elles se réfugient dans les eaux néritiques de la zone peu profonde située sur le
plateau continental ou sur le bord de ce plateau, où la profondeur de l’eau est
inférieure à 200m (Bolten et al., 2003), et gagnent ensuite les eaux océaniques plus
profondes. Dans les zones néritiques, les individus se situent dans des zones de 22 à
49 m de profondeur (Hopkins-Murphy et al., 2003). Les juvéniles restent fidèles à
leurs aires d’alimentation. Dans les zones océaniques, les tortues caouannes passent
75% de leur temps dans la couche supérieure à 5 m de la colonne d’eau (Bolten et al.,
28
2003). Ainsi, quatre-vingts pour cent de leurs plongées ne dépassent pas 5 m, les
autres s’échelonnant dans les 100 premiers mètres avec quelques rares incursions à
des profondeurs supérieurs à 200 m (Bolten et al., 2003). Les juvéniles migrent à
travers les océans, utilisant le tourbillon de l’Atlantique Nord pour se déplacer vers le
nord-est de l’Atlantique et de la Méditerranée, particulièrement Madère et les Açores
puis reviennent en zones néritiques. Les juvéniles de ces zones s’observent de la baie
de Cape Cod (MA, USA) jusqu’au Golf du Mexique.
Les tortues caouannes adultes non pondeuses de la zone néritique sont moins
nombreuses à fréquenter les milieux estuariens fermés et peu profonds qui offrent un
accès à la mer plus limité (Conant et al., 2009). Les eaux estuariennes plus ouvertes
sur la mer (à l’exemple de la baie de Chesapeake) sont fréquentées à la fois par les
juvéniles et adultes (Conant et al., 2009). Les eaux peu profondes débouchant sur de
vastes milieux marins (baie de Floride) offrent l’année durant des aires d’alimentation
importantes pour les mâles et femelles adultes (Conant et al., 2009). Les adultes
vivent principalement dans les eaux du plateau continental, de l’Etat de New York
jusqu’au Golf du Mexique. Il semblerait que les tortues caouannes se déplacent entre
les zones océaniques et néritiques (Bolten et al., 2003 ; Conant et al., 2009 ). A
mesure qu’elles parviennent à maturité, les femelles recherchent la plage où elles sont
nées.
Les aires d’alimentation cruciales pour les individus du Pacifique
comprennent les eaux du centre du Pacifique Nord, y compris les eaux de bifurcation
du courant de Kuroshio (Polovina et al., 2006) et les eaux côtières de la BasseCalifornie du Sud, au Mexique (Peckham et al., 2007). La mer de Chine orientale
constitue un habitat important pour les femelles adultes après la nidification qui
effectuent les migrations saisonnières de reproduction entre les aires d’alimentation et
les plages de nidification (Conant et al., 2009).
Ces considérations sont importantes à connaître dans la mesure où cela va
nous aider à comprendre les tenants et les aboutissants des effets de la pollution à
chaque étape de la vie de l’animal. Le trajet migratoire et l’habitat des adultes matures
et des mâles sont encore très mal connus.
29
C. Biologie
Le cycle de vie biologique des tortues marines est complexe et peut se décliner
en trois schémas (Bolten et al., 2003) en fonction des espèces de tortues marines:
Le premier comprend un développement et une maturation complète au sein
de la zone néritique. Cela concerne uniquement la tortue à dos plat (Natator
depressus).
Le second schéma est caractérisé par un développement initial en zone
océanique suivit d’un changement en zone néritique. Ce changement d’habitat
tendrait à favoriser une croissance maximale alliée à un risque de prédation minimal.
Ce schéma est commun et typique des tortues C. caretta, C. mydas, E. imbricata, L.
kempi, et sporadiquement L. olivacea. Ces changements sont complexes et
réversibles; la taille et l’âge des individus en zone néritique varie en fonction des
espèces. On sait maintenant que le stade océanique est le plus long pour la tortue
caouanne d’Atlantique qui retourne au stade néritique après 7 à 11,5 ans pour une
taille (CCL) variant entre 46 et 64 cm (Bjorndal et al., 2003).
Enfin, le troisième schéma est illustré par D. coriacea et L. olivacea de l’est
Pacifique qui effectuent leur développement au sein de la zone océanique
exclusivement.
Plusieurs stades peuvent être distingués :
1. Les femelles sexuellement matures
Elles ne retournent sur la terre que pour pondre, généralement sur leur plage
natale (Conant et al., 2009), tous les deux à trois ans. Seules deux plages de
nidification de tortues caouannes ont plus de 10 000 femelles par an qui viennent
pondre ; il s’agit de la Floride du Sud (Etats-Unis) et de l’île de Masirah (Oman). Les
estimations aux Etats Unis sont d’environ 68 000 à 90 000 nids par an. Cependant,
des analyses démographiques récentes ont montré que le nombre de nids sur la côte
sud-est de la Floride était en déclin (Index Nesting Beach Survey program). Il en va
de même en Caroline du Nord, du Sud et Georgie. Les îles du Cap-Vert abritent un
nombre de nids plus modeste. En 2000, les chercheurs ont pucé plus de 1000 femelles
30
en nidification sur 5 km de plage de l'île de Boa Vista. Les aires de nidification aux
Caraïbes sont rares. Il y a environ 4000 nids par an au Brésil. En Méditerranée, les
nids sont confinés à la portion est : Chypre, la Grèce et la Turquie. Il a été enregistré
entre 3300 et 7000 nids par saison de ponte (Conant et al., 2009).
La ponte se déroule en général la nuit. Chacune des pontes comprend environ
110 œufs. Les tortues pondent trois à quatre fois et ce à 14 jours d’intervalle (Miller et
al., 1997). Les œufs éclosent au bout de 49 à 90 jours, selon la température du nid
(Miller et al., 1997). Plus le sable entourant le nid est chaud, plus rapide sera le
développement des embryons. La longueur de la période d’incubation, le taux
d’éclosion et la taille des nichées dépendent des conditions d’humidité qui règnent
dans le nid (Conant et al., 2009). La détermination du sexe est également fonction de
la température d’incubation : ainsi les femelles seront majoritaires voir exclusives si
la température dépasse 29°C. Une température inférieure engendrera des mâles
(Miller et al., 2003).
2. Les nouveau-nés
L’éclosion survient pendant la nuit et se déroule sur 1 à 3 jours ; les nouveaunés remontent à l’air libre et émergent du nid sur une période de 2 à 4 jours. Les petits
utilisent la lumière ambiante pour trouver le chemin de l’océan (Witherington et al.,
1997) dans lequel ils entament une période de nage frénétique d’environ une
vingtaine d’heures. Ils s’orientent en fonction de la direction des vagues et du champ
magnétique terrestre (Conant et al., 2009). Ils restent en zone néritique (sur le plateau
continental) pendant plusieurs semaines à plusieurs mois (Bolten et al., 2003) puis se
dispersent en zone océanique en suivant les courants marins. Les individus de la zone
océanique d’Atlantique Nord sont retrouvés près des Açores, les îles Canaries et de
Madère où ils arrivent via le Gulf Stream (Conant et al., 2009).
3. Les juvéniles
Les jeunes tortues caouannes deviennent ensuite largement inactives, les périodes de
nage devenant peu fréquentes et moins énergiques. Elles se nourrissent d’une large
variété de proies flottantes comme les hydroïdes et les copépodes associés aux
sargasses (Witherington et al., 2002). Le stade océanique débute lorsque les juvéniles
31
arrivent pour la première fois dans cette zone. Ils se déplacent en suivant les courants
dominants et y passent plusieurs années avant de retourner aux zones d’alimentation
néritiques et à l’habitat de reproduction (Bolten et al., 2003). La durée du stade
juvénile océanique est variable, et la taille des tortues qui quittent la zone océanique
varie largement (SCL entre 15 à 63 cm ; TEWG, 2009). Lors de leur recrutement en
zones néritiques, les tortues caouannes passent à un régime composé principalement
d’invertébrés benthiques à carapace dure (Conant et al., 2009) : ils deviennent ainsi
des carnivores généralistes. Les individus reviennent dans un habitat proche de leur
plage natale afin d’établir une structure de population. Juvéniles et adultes peuvent
aller et venir entre les zones néritiques et océaniques, et seule la disponibilité de
nourriture déterminera leur habitat (Conant et al., 2009).
4. Adultes néritiques ou océaniques
Les tortues caouannes deviennent adultes à partir d’un SCL de 82 cm et le
sont toutes dès 100 cm (TEWG, 2009). La maturité sexuelle est atteinte tardivement
après 16 ans, cela pouvant aller jusqu’à une trentaine d’années (NMFS and SWFSC,
2008). Carnivores, les adultes se nourrissent de divers crustacés, poissons, calmars,
méduses. Les mâles ne reviennent jamais sur la terre ferme après leur éclosion, et les
connaissances sur leur cycle vital sont incertaines (Conant et al., 2009). Grâce à
l’analyse de l’ADN nucléaire, il semblerait que cette espèce ait une structure de
population complexe caractérisée par un flux génétique sous contrôle mâle (Conant et
al., 2009). Cela s'expliquerait par le fait que les mâles ne reviennent pas à leur plage
natale ou que l’accouplement se déroule dans des aires d’alimentation ou des
corridors migratoires où diverses populations se côtoient.
II. Menaces et protections
La capacité de survie de la tortue caouanne est dépendante de plusieurs
facteurs ; en effet cette espèce est limitée par son faible taux de recrutement dû à une
maturité sexuelle tardive, à une nidification ne survenant que tous les 2 à 3 ans, au
taux élevé de mortalité des œufs et des nouveau-nés et à une sensibilité important des
adultes aux changements chroniques de capacité de survie.
32
A. Menaces anthropiques
1. Menace terrestre
Les menaces pesant sur l’habitat terrestre de la tortue caouanne sont
nombreuses ; parmi les principales nous retiendrons :
- L’aménagement des côtes et la construction modifiant l’habitat des tortues nicheuses
et participant à l’augmentation du nombre de personnes et de véhicules sur les plages
de nidification, entraînant le compactage du sable et le piétinement des nids (Conant
et al., 2009). Le remblayage des plages peut rendre impropre la nidification et
l’incubation des œufs.
- Les ouvrages de défense des côtes qui bloquent l’accès à la zone supérieure des
plages, obligeant les tortues à nicher près de la mer.
- Les sources de lumière artificielle associées aux côtes aménagées qui désorientent
les nouveau-nés et les empêchent de trouver la mer (Witherington et al., 1997).
- Les changements climatiques pouvant entraîner un taux d’érosion plus important en
provoquant une élévation du niveau de la mer ce qui a pour conséquence un risque
d’inondation accru des nids, ainsi qu’une réduction de superficie de l’habitat de
nidification disponible (Baker et al., 2006), et une augmentation de la fréquence des
tempêtes ou une modification des courant dominants (Baker et al., 2006). Les
changements climatiques pourraient enfin influer sur le rapport des sexes de la tortue
caouanne, puisque le sexe des nouveau-nés dépend de la température d’incubation
des œufs (Miller et al., 2003). Ainsi une hausse de température à l’échelle mondiale
pourrait participer à une augmentation de la proportion de femelles (Miller et al.,
2003).
- La récolte des œufs ne constitue plus un problème au Japon (Conant et al., 2009).
Toutefois, il n’en est pas de même dans le nord-ouest du Mexique où les tortues sont
toujours prélevées à visée alimentaire et ce malgré l’interdiction de la chasse et du
commerce de ces animaux par les autorités fédérales (Conant et al., 2009). La récolte
des œufs des tortues vertes et imbriquées constitue la première cause de mortalité
33
dans le monde. Les tortues vertes sont exploitées pour leur chair et cartilage tandis
que les tortues imbriquées sont prisées pour leur magnifique carapace.
2. Menaces marines
Concernant la qualité de l’habitat marin, les points suivants sont les principaux
retenus et ne sont en aucun cas exhaustifs.
- La principale menace est la pêche pélagique à la palangre (Fig. 6) dans les eaux nord
océanique où le nombre d’individus tués annuellement est estimé entre 2600 et 6000
(Lewison et al., 2004). Le dragage des chenaux et l’extraction de sable (Conant et al.,
2009) constituent également de sérieuses menaces. La pêche commerciale constitue la
menace anthropique la plus importante pour la population du Pacifique Nord,
touchant juvéniles et adultes en zone néritique (Conant et al., 2009).
- Prises accessoires lors de la pêche au chalut dans les eaux côtières qui sont des aires
d’alimentation et de reproduction de ces animaux, notamment dans l’ouest du
Pacifique. Le braconnage aux Bahamas, Cuba et Mexique est également un facteur de
déclin.
- Perturbations indirectes de l’habitat par la pollution marine, comprenant les
herbicides, les pesticides, les déversements de divers produits chimiques, le pétrole et
des eaux usées (Lutcavage et al., 1995 ; Conant et al., 2009). L’effet direct des
fertilisants et pesticides est peu connu, toutefois leurs effets indirects tels que la
dégradation de l’habitat via la prolifération d’algues à cause d’un excès de nutriments
semblent plus évidents. Ainsi, les proliférations de Prorocentrum, une espèce de
dinoflagellés sont dangereuses car l’acide okadaïque produit est toxique et peut
induire des tumeurs. L’acide okadaïque a été retrouvée dans divers tissus de tortues
vertes Hawaiiennes souffrant de fibropapilloma (Arthur et al., 2006).
Les tortues marines sont particulièrement vulnérables aux maréees noires à
tous les stades de leur développement. Il existe des effets sur la peau, le sang, les
glandes à sel et les systèmes digestifs et immunitaires (Milton and Lutz., 2003). Il
semble également que les activités liées à la production pétrolière et gazière
extracôtière tels que les rejets opérationnels aient un impact sur les tortues caouannes
(Conant et al., 2009). Les recherches dans ce domaine restent toutefois limitées.
34
- Ingestion de débris marins tels que des morceaux de plastique ou de polystyrène
extrudé (Lutcavage et al., 1997) ; confusion entre ces débris et les proies ayant des
effets létaux (Witherington et al., 2002). Les effets secondaires surviennent dans le
cas où des débris secondaires remplacent les aliments ingérés, diluent l’apport en
nutriments et réduisent de ce fait la croissance somatique et la reproduction (Conant et
al., 2009). Le contenu digestif est tout aussi surprenant qu’écœurant : sacs plastiques,
billes, cordes, fils de pêches, hameçons, charbon, verre, aluminium, cartons, papiers,
ballons, polystyrène, …
Figure 6. Tortue luth adulte prise dans les filets de palangre et échouée (Crédit Aquarium La Rochelle)
- Les changements climatiques modifiant les trajets migratoires et l’augmentation de
la température de la surface des océans qui les accompagne ayant des répercussions
sur l’abondance et la répartition des proies (Conant et al., 2009). L'élévation du
niveau de la mer risque de perturber les individus dans leur milieu marin et
d’entraîner des changements du niveau trophique qui modifierait l'abondance ou la
répartition de leurs proies (Conant et al., 2009). Les femelles ont besoin d'au moins un
an pour constituer leurs réserves de graisses nécessaires à la reproduction ainsi qu’à la
production de l’énergie requise pour la migration. Les milieux océaniques plus froids
sont en général plus productifs ; une baisse de la productivité due à un réchauffement
de température de l’eau pourrait conduire à une diminution des pontes et du
recrutement (Conant et al., 2009).
35
B. Statut et protection
Les efforts de conservation des populations de tortues caouannes au sein d’un
pays peuvent être totalement ruinés par les activités d’un autre. La protection de cette
espèce sur les plages de nidification aux Etats-Unis et dans les eaux territoriales
américaines n’est pas suffisante. C’est pourquoi sa protection requière une
collaboration internationale. La tortue caouanne bénéficie de la protection de la
Endangered Species Act des Etats-Unis (USFWS and NMFS, 1978), de la Convention
interaméricaine pour la protection et la conservation des tortues marines (InterAmerican Convention for the Protection and Conservation of Sea Turtles), du
protocole relatif aux zones et à la vie sauvage spécialement protégées (Protocol
Concerning Specially Protected Areas and Wildlife), de l’annexe I de la Convention
sur le commerce international des espèces de faune et de flore sauvages menacées
d’extinction et de la Convention sur la conservation des espèces migratrices (CITES)
qui interdit le commerce international de ces espèces et de leurs produits dérivés. Elle
est considérée « espèce en danger » par l’Union internationale pour la convention de
la nature (IUCN, 1996) et figure donc sur la liste rouge. Aux Etats-Unis, NOAA
Fisheries et USFWS possèdent une juridiction conjointe afin de régler les
problématiques relatives aux tortues marines. La NOAA est responsable de
l’environnement marin et USFWS régule la politique inhérente aux aires de
nidification. Ces deux agences fédérales ont promulgué des régulations visant à
éliminer ou réduire les menaces dont souffrent les tortues marines. Ainsi, des mesures
concernent les prises accidentelles dans les palangres pélagiques ou de fonds, les filets
maillants d’Atlantique, les filets de la Baie de Chesapeake et les chaluts de crevettes
et de limandes sur la côte sud-est. En étroite collaboration avec l’industrie de la pêche
chalutière à la crevette, NOAA Fisheries a développé des filets permettant d’exclure
les tortues des prises, les dispositifs d’exclusion des tortues ou Turtle Excluder
Devices ou TEDs (Fig. 7). Ceux-ci visent à réduire la mortalité des tortues de mer
capturées incidemment. Les TEDs sont suffisamment grands pour exclure les plus
gros individus, ils sont maintenant rendus obligatoires sur tous les chalutiers de pêche
à la crevette. Toute importation de crevettes pêchée de manière délétère aux tortues
marines est interdite et ce depuis 1989.
36
Figure 7. Turtle Excluder Device, dispositif d’exclusion des tortues leur permettant de fuir. Crédit
NOAA
III. Le système immunitaire
A. Le système hématopoïétique des reptiles
Le sang des reptiles comprend des éléments cellulaires et acellulaires. Le
volume de sang total est variable en fonction des espèces avec par exemple 7,3 ml
pour 100 g de poids vif pour l'alligator et 9,1 ml pour 100 g poids vif pour la tortue à
tempe rouge (Trachemys scripta elegans) (Strik et al., 2007). Les composants
cellulaires comprennent l'hématocrite variant entre 20 et 40% qui est composé
d’érythrocytes, puis de granulocytes, lymphocytes, monocytes, cellules plasmatiques
et thrombocytes. La fraction acellulaire du sang, le plasma, formant entre 60 et 80 %
du volume de sang est soit incolore, ou jaune très pale, ou encore très fortement
pigmenté comprenant des caroténoïdes en fonction des espèces. Au sein du plasma se
trouvent des électrolytes inorganiques ainsi qu’une grande diversité de composés
organiques.
Il existe des variations des centres hématopoïétiques en fonction des espèces
de reptiles et de l’âge de l’animal au sein d’une même espèce. Les organes principaux
responsables de l’hématopoïèse sont la moelle osseuse, le foie et la rate. Bien que les
lignées erythropoïétiques et granulopoïétiques soient produites spécifiquement au sein
de la moelle osseuse, la rate participe également au maintien de cette activité. Les
37
cellules souches myéloïdes sont multipotentes et donnent naissance à tous les types
cellulaires ayant pour origine la moelle osseuse.
Les érythrocytes matures sont nucléés et ovales, les immatures sont ronds avec
un cytoplasme basophile. Les globules rouges séniles sont plus grands que les
érythrocytes matures avec un cytoplasme plus pâle et un noyau pycnotique. Les
dimensions des globules rouges varient à la fois entre espèces et au sein de la même
espèce. Par exemple, pour le lézard arc-en-ciel (Ameiva ameiva), le diamètre moyen
des érythrocytes est de 7,6 µm alors que pour le sphénodon ponctué (Sphenodon
punctatus) le diamètre est de 23,3 µm. De manière analogue, le nombre des
érythrocytes varie de manière intra et interspécifique, en fonction de l’âge, du sexe, de
la saison, de l’altitude, de l’alimentation et des maladies potentielles (Stacy et al.,
2011). Le groupe des globules blancs comprend une variété de cellules ayant une
homologie avec les lignées cellulaires des vertébrés supérieurs. Nous reviendrons sur
ces lignées cellulaires ultérieurement.
B. Les organes lymphoïdes des reptiles
Le système lymphoïde est composé d’organes majeurs et structures
anatomiques tels que la moelle osseuse, le thymus et la rate. Les autres organes
lymphoïdes secondaires incluent les tissus lympoïdes associés aux intestins (GALT)
et aux bronches (BALT).
1. La moelle osseuse
Elle constitue l’un des organes lymphopoïétiques et hématopoïétiques majeurs.
Chez les mammifères, la moelle osseuse est le siège de la lympho-, hémato- et
myélopoïèse. Pour la majorité d’entre eux, elle est également le siège de la maturation
des lymphocytes B. Chez les reptiles, la moelle osseuse est localisée dans les cavités :
1/ de certains os du crâne, 2/ des os longs chez les lézards, chéloniens et crocodiliens,
3/ des côtes et vertèbres des serpents, 4/ du plastron, carapace et pelvis chez les
chéloniens (Origgi et al., 2007). L’activité hématopoïétique de la moelle osseuse des
reptiles en fait un groupe intermédiaire situé entre les amphibiens pour lesquels la rate
est l’organe érythropoïétique majeur et les oiseaux où la moelle osseuse joue ce rôle
38
(Cooper et al., 1985). Chez les tortues, la rate et la moelle osseuse constituent les
organes érythropoïétiques (Origgi et al., 2007).
Chez la tortue du désert (Gopherus agassizii), les prélèvements de moelle
osseuse sont effectués à partir de diverses écailles (nucales, anales, marginales et
supercordes) de la carapace ainsi que des écailles (gulaires, inframarginales,
fémorales, et anales) du plastron (Origgi et al., 2007). La moelle osseuse peut être
prélevée à partir du fémur, de l’humérus et du pelvis. Le stroma est composé d’un
réseau fibreux de cellules réticulées, de graisse, d’artérioles, de veinules, de nerfs
ainsi que de nombreux sinus veineux, à parois fines, bordés de cellules endothéliales.
Au sein des cavités extravasculaires se trouvent également des mélanophores et
mélanocytes ainsi que des granulocytes remplis de granules éosinophiles (hétérophiles
et éosinophiles ne peuvent être distingués), des précurseurs des granulocytes et des
cellules mononuclées. Les précurseurs des érythrocytes peuvent être visualisés dans
les sinus veineux. Les granulocytes contenant des granules éosinophiles forment les
leucocytes majoritaires de la moelle osseuse tandis que les cellules plasmatiques ne
représentent que moins de 1% des cellules.
2. Le thymus
C’est un organe propre aux vertébrés où s’effectue la maturation des
lymphocytes T. Les cellules du thymus joue un rôle critique dans la maturation
fonctionnelle des lymphocytes T chez les mammifères. Chez les reptiles, l'existence
d'un processus similaire est incertain, toutefois, les évidences fonctionnelles de
l’existence du complexe majeur d'histocompatibilité chez les reptiles (Farag and El
Ridi, 1985, 1990) analogue à celui des mammifères suggère qu’une chaîne
d’événements similaires existe.
a. Anatomie
Des différences à la fois embryologiques (Cooper et al., 1985) et
morphologiques ont été objectivées chez les différents groupes de reptiles. Chez les
chéloniens, le thymus est localisé crânialement au cœur, à côté de la bifurcation entre
l’artère sous-clavière et la carotide (Fig. 8).
39
Figure 8. Thymus de tortue verte (Chelonia mydas) en position anatomique. Le thymus est
cranial au coeur. D'après Origgi et al., 2007 (Crédit Bobby Collins).
Le thymus des reptiles est entouré d’une capsule formée de tissu conjonctif
dense. Des septa partent de la capsule et subdivise le thymus des chéloniens en
lobules distincts. Certaines espèces de chéloniens ont des lobules consistant en une
corticale externe et une médullaire interne, tandis que chez d’autres cette subdivision
n’est pas apparente ou varie de manière saisonnière (Cooper et al., 1985). Les
thymocytes et cellules épithéliales sont les types cellulaires les plus courants dans le
thymus des reptiles (Fig. 9). Les cellules épithéliales sont distribuées à la fois dans le
cortex et la médullaire. Les cellules myoïdes forment un autre type cellulaire présent
dans le parenchyme thymique.
Figure 9 Coupe histologique de thymus chez la tortue caouanne (Caretta caretta), coloration Hémalun
& Eosine. Une capsule de tissu conjonctif (CT) entoure le thymus. A gauche, le tissu est normal,
chaque lobule comprend une médullaire (ME) et une corticale (CO). Par comparaison, à droite, le
thymus est en phase d’involution et la distinction corticale / médullaire n'est plus possible. D'après
Origgi et al., 2007.
40
Les kystes épithéliaux forment une structure supplémentaire du thymus
(Cooper et al. 1985). Leurs origines et fonctions ne sont pas très claires. Les kystes
sont toujours associés aux cellules épithéliales et peuvent être intra- ou
extracellulaires.
b. L’involution thymique
L’involution thymique est saisonnière, réversible, cyclique et est associée à
une réduction sévère des cellules lymphoïdes et une augmentation du tissu conjonctif
(Fig. 9 à droite). Cette involution progresse avec l’âge. En effet les populations
lymphoïdes régressent continuellement saison après saison (Origgi et al., 2007). Cette
involution a été décrite chez les animaux malades ou affamés ; elle est réversible
lorsque le facteur de stress est ôté (Cooper et al., 1985).
3. La rate
a. Anatomie
Cet organe a été étudié chez moins de 30 espèces de reptiles sur les 7500
recensées actuellement (Origgi et al., 2007). Elle peut être ovale, sphérique ou
allongée. Elle est localisée dans la cavité abdominale proche du pancréas. Chez
certaines espèces, ces deux organes sont pratiquement indiscernables au point qu’ils
ne forment qu’une unique entité anatomique que l’on nomme le splénopancréas (Fig.
10).
Figure 10. Coupe histologique de splénopancréas (Crotalus viridis), coloration Hémalun & Eosine. Sur
cette coupe, le pancréas exocrine (EX) ainsi que les îlots de Langerhans (IS) sont en continuité avec la
rate. (SP) D'après Origgi et al., 2007.
41
La structure histologique de la rate montre qu’elle est formée d’une capsule de
tissu conjonctif, de travées plongeant dans la pulpe rouge et de la pulpe blanche (Fig.
11). Cette dernière représente la composante immunologique de la rate. Elle est bien
développée et subit les variations saisonnières. La structure générale est similaire chez
les chéloniens, crocodiliens et lézards, avec des différences chez les serpents. Les
rates de plusieurs espèces de chéloniens ont été étudiées (Origgi et al., 2007) incluant
les Trionyx de Chine (Pelodiscus sinensis), les tortues Emydes du Japon (Mauremys
japonica), les tortues alligator, les tortues à tempes rouges, la tortue caspienne et les
tortues-boîte de Chine (Cistoclemmys flavomarginata). Les travées de la capsule se
projettant vers le parenchyme peuvent ou non être présentes. La pulpe blanche est
composée de deux types d’agrégats lymphoïdes entourant les éléments vasculaires.
Les artérioles de la pulpe blanche sont entourées d’un manchon de lymphocytes
appelé manchon lymphoïde péri-artériolaire (PALS). Ils contiennent des cellules
lymphoïdes, des cellules plasmatiques matures et immatures et des cellules
interdigitées. Les artérioles centrales donnent naissance aux capillaires qui sont
entourés d’un tissu de fibres réticulés (ellipsoïde) qui est lui même entouré d’un tissu
lymphoïde, le manchon lymphoïde péri-ellipsoïdal (PELS). La délimitation entre la
pulpe blanche et rouge est difficile à définir car beaucoup de lymphocytes et
granulocytes se situent également dans la pulpe rouge. Aucun centre de germination
n’a été observé dans les rates de chéloniens et ce même après stimulation antigénique
(Origgi et al., 2007). La pulpe rouge entoure la pulpe blanche et est composée de
sinus et de cordons. Les cordons de la pulpe comprennent le tissu intervasculaire et
contiennent des cellules inflammatoires telles que les lymphocytes, macrophages,
cellules plasmatiques, granulocytes et des éléments structuraux tels que les cellules
interstitielles. L’activité érythropoïétique de la rate est toujours controversée. Très peu
d’informations sont disponibles concernant la distribution des lymphocytes B et T
dans la rate des reptiles.
42
Figure 11. Coupe histologique de rate (Caretta caretta), coloration Hémalun & Eosine. Sur cette coupe,
les pulpes rouge et blanche sont entrelacées. La pulpe blanche consiste en des vaisseaux entourés de
tissu lymphoïde. D'après Origgi et al., 2007
b. Fonction de la rate
Il existe très peu d’études portant sur la fonction de la rate chez les reptiles
consécutive à une stimulation antigénique (Origgi et al., 2007). Chez la tortue
hargneuse, une forte réponse proliférative entraînant une augmentation de la masse de
la pulpe blanche a été obtenue suite à une stimulation antigénique avec de
l’hémocyanine de Megathura crenulata. Cette prolifération active a tout d’abord été
observée dans la pulpe blanche (8 à 10 jours après immunisation) puis dans la pulpe
rouge (15 à 20 jours après immunisation). Aucun changement histologique n’a pu être
observé dans la rate des tortues alligator ni des agames après une seconde
immunisation. La pulpe rouge de la couleuvre de Forsskal est soumise aux variations
saisonnières; elle est bien développée en hiver avec un très faible nombre d’agrégats
lymphoïdes dans la pulpe blanche. Au printemps, les agrégats lymphoïdes augmentent
en taille et nombre, pour devenir plus denses et presque coalescents. La réponse
humorale vis à vis de divers antigènes est forte à ce moment là. De fin juin à juillet le
tissu splénique lymphoïde régresse à nouveau, entraînant une réaction humorale plus
faible.
4. Tissus lymphoïdes associés et structures lymphoïdes accessoires.
Les structures lymphoïdes ne faisant pas partie des organes lymphoïdes
majeurs (rate, thymus, moelle osseuse) sont regroupées. Chez les mammifères, ces
structures forment le GALT (gut-associated lymphoïd tissue) et incluent les
43
amygdales, les végétations, et les plaques de Peyer, le BALT (bronchial-associated
lymphoïd tissue) et les nœuds lymphatiques. Ces structures se situent où les cellules
du système immunitaires ont la plus forte probabilité de rencontrer un antigène. Ces
structures ont également été décrites chez les reptiles.
a. Le GALT : Tissu lymphoïde associé aux intestins
Le GALT composé de nombreuses structures lymphoïdes disséminées est
distribué le long du tractus digestif et forme l’organe lymphoïde le plus important du
corps. Les structures constituant le GALT sont situées en majorité dans l’œsophage,
la jonction iléo-caecale, le colon et le cloaque. Elles sont petites, non encapsulées et
s’étendent de la lamina propria (ou lame basale) jusqu’à la sous-muqueuse (Cooper et
al., 1985). Contrairement aux composants lymphoïdes de la rate et du thymus, le
GALT ne semblent pas subir de variations saisonnières (Cooper et al., 1985).
b. Les nœuds lymphatiques et autres structures lymphoïdes
Il n’existe pas de nœuds lymphatiques sensus stricto chez les reptiles
contrairement aux mammifères. Par contre des structures similaires assimilées à un
tissu lymphatique ectopique ont été décrites dans divers organes tels que les poumons,
les reins, la vessie, le pancréas et les testicules (Cooper et al., 1985). Ces structures
ont également été décrites dans les régions péri-vasculaires chez divers reptiles
(Cooper et al., 1985), suggérant une homologie fonctionnelle potentielle avec les
nœuds lymphatiques des mammifères.
C. Le système immunitaire
Le système immunitaire des vertébrés possède une composante innée et une
composante acquise. L’immunité acquise et une partie de l’immunité innée sont
basées sur la reconnaissance du « non soi ». L’immunité innée entre en action en
premier lieu car elle ne requière aucune activation que celle fournit par l’agent
pathogène lui-même. Cette première ligne de défense est composée de cellules
phagocytaires dont le but va être de détruire et d’éliminer l’envahisseur. Les divers
acteurs du système immunitaire inné reconnaissent des motifs structuraux très
conservés au cours de l’évolution de nombreux pathogènes. Ces motifs « clés »
représentent le signal nécessaire et suffisant à l’activation des effecteurs du système
44
immunitaire inné. Cependant, les agents pathogènes plus virulents vont pouvoir
échapper à ce contrôle. Ainsi entre en jeu le système immunitaire acquis qui va être
activé via une série d’interactions cellulaires complexes afin de déployer les défenses
nécessaires.
Le système immunitaire acquis est lui-même subdivisé en deux réponses
possibles : une réponse cellulaire et une autre humorale. La réponse cellulaire est
principalement basée sur l’activité cytotoxique de deux groupes de cellules
spécialisées que sont les lymphocytes T cytotoxiques (CD8+) et les cellules tueuses
naturelles ou natural killer (NK). Ces cellules effectrices peuvent cibler et détruire les
cellules infectées grâce à des signaux spécifiques que les cellules infectées par un
agent pathogène exposent sur leur membrane. Les cellules T effectrices reconnaissent
la présence du pathogène dans une cellule hôte grâce au récepteur cellulaire T (TCR).
Ces
récepteurs
engagent
également
une
molécule
du
complexe
majeur
d’histocompatibilité ou CMH de classe 1 dans le cas des cellules T CD8+, exprimé
sur la membrane cellulaire de la cellule hôte. Ces antigènes d’histocompatibilité sont
impliqués dans la présentation de petits fragments peptidiques spécifiques du
pathogène aux cellules T.
La fonction la plus importante de la réponse humorale du système immunitaire
est la production d’immunoglobulines qui sont des molécules solubles, synthétisées et
sécrétées par les lymphocytes B et qui font fonction d’anticorps (Ac). Ces Ac se lient
à un antigène spécifique de l’agent pathogène. La stimulation par l’agent pathogène
déclenche la synthèse d’anticorps ainsi que leur libération dans la circulation sanguine
jusqu’à ce qu’ils rencontrent puis se lient à un agent pathogène spécifique.
Ainsi, les réponses cellulaires et humorales s’interpénètrent lors de la réponse
immunitaire. Il en est de même pour la réponse immunitaire innée. Une première
exposition et réponse à un nouveau pathogène, vont induire la formation d’un groupe
spécifique de lymphocytes. Celles-ci constituent les cellules mémoire latentes en
attente d’une ré-exposition ultérieure. Ces cellules patrouillent dans la circulation
sanguine de l’hôte à l’affût du pathogène ayant déjà déclenché une première réponse.
Ce groupe de cellules mémoire va se réactiver chaque fois que le pathogène initial se
représentera.
45
La réponse immune est un processus complexe impliquant de nombreux
acteurs : cellules et molécules effectrices. Il est possible qu’un grand nombre de ces
fonctions effectrices et des interactions décrites chez les mammifères, existent
également chez les reptiles. Toutefois, le système immunitaire des reptiles a été très
peu étudié, principalement entre les années 1970 et 1980 puis tout intérêt dans ce
domaine a disparu. Un fossé énorme en terme de connaissances s’est formé et celles
ci sont désormais limitées et parcellaires. Ce qui est connu va être développé dans les
sections suivantes.
1. Les mécanismes de défense innée
Ces mécanismes peuvent être actifs via des facteurs humoraux et cellulaires
non spécifiques ou passifs tels que jouer un rôle de barrière (revêtements cutanés ou
muqueux).
a. Revêtements cutanés et muqueux
La peau est la première barrière physique du reptile. La couche externe
kératinisée est très spécifique chez le reptile. Elle est très épaisse ce qui offre une
résistance mécanique et biologique importante ainsi que l’exuviation. L’exfoliation de
la région du cou a également été rapportée chez les tortues marines ainsi que la mue
de certaines écailles. La capacité à remplacer la peau de manière régulière est une
stratégie de défense contre les pathogènes cutanés. La muqueuse au contraire est
souvent déficiente en kératine au sein de sa couche externe ce qui tend à rendre ces
structures plus délicates et vulnérables aux sollicitations mécaniques et aux agents
microbiologiques. Une exception est l’œsophage des tortues marines qui est composé
de papilles kératinisées. Il a été montré que les salmonelles ne peuvent envahir et
traverser la muqueuse intestinale des tortues à tempes rouges lorsque celles-ci sont
maintenues à 26°C (Pasmans et al., 2001, 2002). Par contre cela est tout à fait
possible lorsqu’elles sont maintenues à 37°C. Ainsi la température semble être un
facteur important de l’intégrité des muqueuses chez les reptiles.
b. Les facteurs humoraux non spécifiques
Les sécrétions, la surface des muqueuses et autres fluides corporels
contiennent des composés ayant pour rôle la protection de l’organisme et limitant
46
l’invasion par des micro-organismes pathogènes. Ces composés sont les interférons,
les transferrines, le lysosyme ainsi que le complément.
Les interférons font partie de la grande famille des cytokines et sont connus
pour leur activité antivirale. Chez les mammifères, les interférons de type I (alpha et
béta) possèdent une activité antivirale et permettent d’augmenter l’expression du
CMH-1 à la surface des cellules et d’activer les cellules NK. L’augmentation de
l’expression du CMH-1 renforce la réponse cellulaire à l’encontre des virus grâce à
une présentation exacerbée des peptides viraux aux cellules T cytotoxiques. Les
interférons de type II (gamma) sont impliqués dans la réponse immunitaire de lutte
contre les pathogènes intracellulaires et dans l’activation des macrophages ainsi que
dans la maturation des lymphocytes T CD4+. Ce sont des protéines clé de la
modulation des réponses immunitaires innées et acquises lors d’infections et
d’inflammations. L’existence d’un facteur soluble ayant une activité antivirale
similaire à l’interféron (Origgi et al., 2007) a été rapportée dans les reins de tortues
grecques à la suite de diverses infections virales (West Nile, Newcastle, Sendai). Ce
facteur a permis aux cellules de résister à la charge infectieuse. Il a également été
décrit la production d’un facteur similaire par les cellules du tissu cardiaque des
terrapines infectées avec par le virus de l’encéphalite de Saint Louis.
Les transferrines sont présentes dans le plasma de tous les vertébrés, y compris
les reptiles. Ces protéines ont une très forte capacité à fixer le fer. En séquestrant le
fer disponible, les transferrines ont une activité à la fois bactériostatique et fongicide.
Le taux de fer plasmatique diminue chez des lézards préalablement infectés avec des
bactéries. Ainsi, la combinaison de faible taux de fer plasmatique associée à des
températures corporelles élevées possèdent des effets délétères sur la croissance
bactérienne (Origgi et al., 2007).
Le lysozyme est un facteur antimicrobien qui est produit principalement par
les lignées lymphocytaires/macrophagiques. Après inoculation avec Leishmania
agamae, les taux de lysozyme sérique augmentent de deux à cinq fois chez le lézard
vert (Lacerta viridis), et de trois fois chez l’agame (Agama caudospinosum, Origgi et
al., 2007). Chez les tortues caouannes, l’activité du lysozyme a été corrélée
positivement avec les concentrations plasmatiques de brevetoxine, une neurotoxine
produite par un dinoflagellé Karenia brevis (Walsh et al., 2010
47
Le complément est un complexe de 30 facteurs solubles et de molécules qui
faisant partie d’une cascade inflammatoire. Le système du complément des reptiles
comprend de multiple isoformes de la fraction C3. Cela participerait à étendre leur
capacité de reconnaissance immunitaire (Sunyer and Lambris, 1998). Les effets
inhibiteurs du sérum d’alligator (Alligator mississippiensis) contre E. coli et
Naegleria gruberi sont très probablement médiés par le complément (Merchant et al.,
2004). Une activité antivirale du complément a également été évoquée (Merchant et
al., 2005a). Kuo et al., (2000) ont montré comment la voie alterne du complément
était responsable de la destruction des spirochètes (Borrelia burgdorferi) chez le
lézard des palissades (Sceloporus occidentalis) et le lézard alligator (Elgaria
multicarinata). L’identification de la voie alterne de l’activation du complément a
relativement récemment été mise en évidence chez l’alligator (Merchant et al., 2005b).
c. Les facteurs cellulaires non spécifiques
La phagocytose
Il s’agit de la capture et de l’ingestion de particules telles que des bactéries et
des débris cellulaires par des cellules spécialisées. Ces cellules incluent les
macrophages, les hétérophiles et les cellules dendritiques. La membrane cellulaire des
phagocytes englobe les pathogènes afin de former une vésicule de phagocytose qui va
ensuite fusionner avec les lysosomes afin de former un phagolysosome. Le matériel
ingéré est ensuite dégradé par des enzymes ainsi qu'un pH acide. L’activation de la
production de composés toxiques pour le pathogène comme le peroxyde d’hydrogène
et les radicaux libres est appelée explosion respiratoire.
Les monocytes - macrophages
Les leucocytes les plus grands (8 à 25 µm) dans la cirulation sanguine des
reptiles sont les monocytes. Ils sont similaires à ceux des mammifères en fonction et
en morphologie (Sypek and Borysenko, 1988). Ils sont ronds avec un cytoplasme gris,
pâle à modérément basophile (Fig. 12). En fonction de leur stade de réaction, les
monocytes peuvent contenir des vacuoles cytoplasmiques de taille et forme variables
(Fig. 12). En quantité, les monocytes peuvent constituer 10% des leucocytes (Sypek
and Borysenko, 1988). Leur nombre varie peu en fonction des saisons et leur
48
pourcentage reste constant (Duguy et al., 1970). Toutefois, leur nombre augmente lors
de l'hibernation de la tortue du désert et en cas de dystocies chez les caméléons (Stacy
et al., 2011). Leur nombre augmente également lors de stimulation antigénique ce qui
est fortement évocateur d'un processus infectieux chronique. Ils sont présents dans les
granulomes et la formation des cellules géantes en cas d'infection bactériennes ou en
présence d'oeufs de trématodes (Campbell, 1996).
Figure 12. Photomicrographie de monocyte de tortue Gopherus agassizii, normal à gauche et de
monocytes réactifs de tortue Geochelone sulcata. Coloration Wright-Giemsa. D'après Strik et al., 2007
Les macrophages sont des phagocytes spécifiques des organes dérivant des
monocytes circulants. Ils font partie à la fois de l’immunité innée et acquise. Les
macrophages phagocytent activement bactéries, parasites, débris cellulaires et autres
matériaux. Après phagocytose les micro-organismes sont digérés et leurs
déterminants structuraux sont présentés sur le CMH aux cellules T circulantes afin
d’activer la réponse acquise. Chez les reptiles, l’activité phagocytaire des
macrophages a été étudiée par plusieurs auteurs. Roy et Rai (2004) ont montré que de
faibles niveaux de catécholamines pouvaient augmenter l’activité phagocytaire des
macrophages spléniques chez le gecko (Hemidactylus flaviviridis). A forts taux
cependant, les catécholamines agissent comme immunosuppresseurs. Mondal and Rai
(2002), ont montré que le temps d’exposition et la dose de glucocorticoïdes
affectaient l’activité phagocytaire et la libération des nitrites issus des macrophages
spléniques activés par le liposacharide (LPS). Les hormones sexuelles (mâles et
femelles) possèdent également un rôle inhibiteur de l’activité phagocytaire, de la
libération de nitrites avec pour conséquence une perturbation importante de l’activité
cytotoxique des macrophages (Mondal and Rai, 1999). La température est aussi un
facteur affectant la phagocytose des macrophages spléniques du gecko. En effet, la
phagocytose et l’activité cytotoxique des macrophages sont plus importantes à 25°C
49
qu’à de plus hautes ou de plus basses températures (Mondal et Rai, 2001). Une autre
étude réalisée en 2002 (Pasmans et al., 2002) a montré que les macrophages de tortues
à tempes rouges ne phagocytaient aisément Salmonella enterica (ser Muenchen)
qu’entre 30˚C et 37˚C.
Les mélanomacrophages sont des macrophages caractérisés par la présence de
mélanosomes intracellulaires. Une autre étude menée sur les mélanomacrophages a
montré qu’à basses températures les mélanophages des tortues avaient une activité
phagocytaire plus importante vis à vis de E. coli que leur homologue de mammifères
(Stacy et al., 2011).
Les cellules dendritiques
Les cellules dendritiques sont des cellules présentatrices d’antigène (CPA)
spécialisées, capables de présenter via le CMH, les antigènes aux lymphocytes-T.
Contrairement aux cellules dendritiques immatures, les cellules matures perdent toute
activité phagocytaire pour ne conserver que leur rôle de CPA. Chez les reptiles, il
semble que les cellules dendritiques se situent dans la zone marginale de la rate
(Origgi et al., 2007). Chez la tortue caspienne, l’injection de billes de carbone ne
semble pas induire la phagocytose de celles-ci par les cellules dendritiques matures.
Les hétérophiles
Ces cellules sont grandes, rondes, avec un cytoplasme clair qui contient de
nombreux granules cytoplasmiques allongés, pouvant recouvrir le noyau. La forme du
noyau dépend de l'espèce étudiée varie de rond à ovale, est excentré (chez la plupart
des serpents, chéloniens et crocodiliens) ou encore posséde deux ou plusieurs lobes
(lézards). La taille de ces cellules varie de 10 à 23 µm. Les granules cytoplasmiques
des chéloniens et crocodiliens sont éosinophiles et fusiformes (Fig. 13). Une
morphologie anormale peut être observée lors de réponse à un processus
inflammatoire et particulièrement lors de maladies infectieuses. Des hétérophiles dits
"toxiques" se forment dans la moelle osseuse avant leur libération dans le sang
périphérique. Les changements les plus sévères, aussi bien morphologiques que
numériques des hétérophiles, sont provoqués par des toxines bactériennes et sont
souvent témoins d'entérite ou autres infections bactériennes sévères à gram négatif
(Stacy et al., 2011). La toxicité est caractérisée par l'intensification de la basophilie du
50
cytoplasme, la dégranulation, la vacuolisation, une granulation excessive du
cytoplasme et un noyau excessivement lobulé (Fig. 13). Ces changements toxiques
varient en intensité avec la sévérité de la maladie. Une toxicité modérée est associée à
une augmentation de la composante basophile du cytoplasme, avec des granules
hétérophiles normaux en nombre et morphologie. La dégranulation peut résulter d'un
artéfact lors de la préparation du frottis sanguin ou d'une conservation excessive du
sang dans l'anticoagulant. Une modification des granules, qui deviennent violet très
foncé ou moins nombreux et de taille augmentée, accompagne une toxicité sévère.
Une lobation du noyau chez des espèces n'en ayant habituellement pas peut également
témoigner d'une toxicité (Campbell, 1996). Un déplacement vers la gauche est
visualisable par la présence de myélocytes et métamyélocytes. Les hétérophiles
immatures possèdent un noyau plus grand, des granules pléiomorphes, un cytoplasme
plus basophile contenant des granules primaires (Fig. 13). Cela se produit en cas
d'infection très sévère avec une demande de mobilisation accrue. Les bactéries
intracytoplasmiques dans le sang périphérique chez les animaux septicémiques sont
très rarement observées. Leurs fonctions consistent en la phagocytose et l'activité
microbicide lors de maladies inflammatoires (Stacy et al., 2011). Les hétérophiles
représentent entre 30 et 45% des leucocytes lors du comptage cellulaire chez les
reptiles sains (Frye, 1991). Une hétérophilie est décrite lors de réponses
inflammatoires chez les reptiles au cours de infections microbiennes, des maladies
parasitaires, et des processus inflammatoires non spécifiques ou de processus
nécrotiques (Campbell, 1996). La gestation, l'administration de glucocorticoides, le
stress, les processus néoplasiques, les leucémies granulocytiques entrainent également
une hétérophilie (Stacy et al., 2011). L'hétéropénie est décrite en cas d'infection
extrèmement sevère, résultant d'une demande excessive de cellules dans les tissus
atteints. Des anomalies hématologiques telles que les modifications toxiques peuvent
se produire de manière concomittante.
51
Figure 13. Photomicrographie d'hétérophiles. A gauche, il s'agit d'un hétérophile d'alligator, qui est
normal ; on remarque un petit lymphocyte bien différencié (tête de la flèche) et un autre plus grand
(flèche). A droite par contre, il s'agit d'hétérophiles de Physignathus, ceux-ci sont modérément toxiques
avec une dégranulation et un cytoplasme basophile. Coloration Wright-Giemsa. D'après Strik et al.,
2007
Il y a très peu d’informations concernant les mécanismes cellulaires
conduisant à la phagocytose des micro-organismes par les hétérophiles.
Activation de la phagocytose
La phagocytose réalisée par les macrophages et hétérophiles peut également
être influencée par des molécules telles que les opsonines ou interférons gamma.
Pasmans et al., 2001, ont décrit chez la tortue à temps rouge l’osponisation de
Salmonella enterica, entraînant une augmentation de l’explosion respiratoire des
macrophages et ce par comparaison aux bactéries non préalablement opsonisées.
Les cellules tueuses cytotoxiques (NK cells)
Elles forment un sous groupe de lymphocytes et sont caractérisées par leur
capacité innée à détruire les cellules infectées sans avoir été préalablement ni
recrutées ni activées par les cellules présentatrices d’antigènes. Les cellules tueuses
naturelles prennent en charge les cellules infectées via leur récepteur Fc, qui se lie aux
anticorps recouvrant les cellules infectées. Ce processus est nommé cytotoxicité à
médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Les cellules tueuses naturelles
ont été mises en évidence et caractérisées par Sherif and El Ridi (1992) chez les
couleuvres sifflantes des sables (Psammophis sibilans) et par Munoz et al., (2000)
chez la tortue Caspienne. Pour cette espèces, l’activité NK était plus importante en
hiver et été (hiver et printemps pour les cellules thymique des mâles) qu’en automne
et printemps. Une activité plus importante a été détectée chez la couleuvre africaine
52
(Psammophis sibilans) au printemps et en automne (Sherif and El Ridi, 1992). Cela
suggère une variation saisonnière quant au nombre de sous populations ayant une
activité NK chez ces deux espèces avec très probablement une panoplie de cellules
NK différente. Sherif and El Ridi (1992) suggère que l’activité NK chez Psammophis
sibilans est corrélée aux lymphocytes B et T car leur variation saisonnière en nombre
était directement proportionnelle à l’activité NK chez cette espèce. Au contraire,
Munoz et al., (2000) suggèrent que l'augmentation d'activité des cellules NK, qui se
produit au même moment que l’involution des tissus lymphatiques chez la tortue
caspienne, pourrait être une adaptation d'évolution à cette immunosuppression
physiologique saisonnière.
Les éosinophiles
Les éosinophiles sont de grandes cellules (9 à 20 m), rondes, de même taille
que les hétérophiles. Elles possèdent un cytoplasme clair rempli de granules
éosinophiles et sphériques ainsi qu'un noyau bilobé, qui peut être centré ou non (Fig.
14). Chez les tortues vertes, deux types d'éosinophiles ont été décrits (Work et al.,
1998). Une morphologie anormale est extrèmement rare ; les éosinophiles immatures
contiennent des granules intracytoplasmiques pâles, modérément basophiles, ronds ou
allongés (Fig. 14). Chez les reptiles sains, leur nombre varie entre 7 et 20% des
leucocytes (Frye, 1991) avec les valeurs les plus élevées chez les tortues et les valeurs
faibles chez les lézards (Sypek and Borysenko, 1988). Leur nombre varie en fonction
de facteurs saisonniers, avec des valeurs plus faibles rapportées en été et élevées au
cours de l'hibernation (Duguy, 1970). Une éosinophilie peut être associée au
parasitisme ou à une stimulation immunitaire non spécifique. Les éosinophiles
participent à la réponse immunitaire des tortues hargneuses (Chelydra serpentina) en
phagocytant des complexes immuns lors d’infections, ainsi que chez les jeunes
alligators Américains sains dont les cellules sanguines périphériques sont mises en
présence de Staphylococcus aureus (Stacy et al., 2011).
53
Figure 14. Photomicrographie d'éosinophiles. A gauche, il s'agit d'un éosinophile normal (tête de la
flèche) d'alligator ; on remarque un hétérophile toxique (flèche). A droite, il s'agit de 2 éosinophiles de
Cuora galbinifrons, tortue indonésienne très rare. L'un est normal (flèche) et l'autre plus large est
toxique avec des granules basophiles primaires et éosinophiles secondaires (Coloration WrightGiemsa ; D'après Strik et al., 2007). Les cellules dites toxiques subissent un changement
morphologique tel que dans les cas modérés une dégranulation, un cytoplasme basophilique, et dans les
cas sévères, une vacuolisation cytoplasmique et la présence de granules cytoplasmiques
pléiomorphiques. Ces cellules « toxiques » ont été activées et libèrent par phase des médiateurs
inflammatoires et de molécules toxiques.
2. Les mécanismes de défense spécifique
a. Les Lymphocytes : présentation générale (Abbas et al., 2015)
Les lymphocytes sont des cellules intervenant dans l’immunité acquise. Ils
sont traditionnellement divisés en deux groupes, les B pour Bourse de Fabricius (chez
les oiseaux) et Bone marrow (moelle osseuse pour les mammifères) ainsi que les
lymphocytes T (Thymus chez les mammifères). Les deux sous-populations
proviennent de la moelle osseuse ; les lymphocytes migrent progressivement vers leur
organe de différenciation où ils se divisent, puis subissent un processus de maturation
par étapes. Le processus de maturation des lymphocytes B s’effectue dans la moelle
osseuse; le lymphocyte B immature exprimant une IgM complète à sa surface subira
une sélection envers les antigènes du soi. Les cellules B qui survivront à cette
sélection se retrouveront dans les organes lymphoïdes secondaires, où elles
deviendront des lymphocytes B matures, exprimant en plus une IgD à sa surface et
pouvant être activées par des antigènes exogènes.
Le processus de maturation des lymphocytes T permet de conserver une
grande diversité de reconnaissance des antigènes par les récepteurs des lymphocytes T
et des anticorps tout en prévenant d’une action contre les antigènes du soi. Les
54
lymphocytes sélectionnés positivement permettent la défense contre les antigènes
étrangers reconnus dans un contexte CMH, tandis que la sélection négative est
essentielle pour éviter les réactions auto-immunitaires. À leur arrivée dans le cortex
thymique, les progéniteurs lymphoïdes vont interagir avec un réseau de cellules
épithéliales, afin d’acquérir certaines molécules de surface dont le Thy-1. Les cellules
deviennent ainsi thymocytes « doubles négatifs ». Lorsque les thymocytes expriment
les molécules CD44 (molécule d’adhésion) et CD25 (récepteur de l’interleukine 2),
les gènes codant pour la chaîne β du récepteur T se réarrangent pour être exprimée.
Les cellules qui échouent meurent, alors que les cellules qui réussissent et produisent
une chaîne β fonctionnelle, survivent et perdent l’expression de CD25. La chaîne β
s’assemble ensuite avec une chaîne α pour former le pré-récepteur T (pré-RcT),
accompagné du CD3. L’assemblage CD3/pré-RcT engendre une prolifération et
l’expression des molécules CD4 et CD8, appelés thymocytes « doubles positifs ».
Lorsque la prolifération s’arrête, les gènes codant pour la chaîne α se réarrangent.
Lorsque la chaîne α et la chaîne β sont exprimées à la surface cela forme le récepteur
T fonctionnel. Par la suite, les cellules « doubles positives » passent un processus de
sélection positive avant de migrer vers la médulla pour subir une sélection négative.
La sélection positive permet la survie des thymocytes qui possèdent une bonne
affinité avec les CMH de classe I et II exprimés sur les cellules épithéliales du cortex
thymique. Cette sélection est nécessaire pour induire une réponse immunitaire
restreinte spécifique du soi. Les thymocytes « doubles positifs » interagissent avec les
CMH I et II par leur RcT et les molécules CD8 et CD4 respectivement. Les
thymocytes qui ne se lieront pas aux CMH mourront par apoptose. La sélection
négative permet d’éliminer les thymocytes qui réagissent fortement aux interactions
entre le CMH de classe I et II des cellules dendritiques et macrophages, présentant un
peptide du soi. Le but étant de développer une tolérance au soi.
Une fois matures, les lymphocytes B et T, en état de repos, se retrouvent dans
la circulation sanguine afin d’atteindre les organes et tissus lymphoïdes (nœuds
lymphatiques, tissu lymphoïde associée aux intestins et aux bronches, rate, …) où ils
rencontreront des antigènes étrangers. L'activation des lymphocytes T nécessite la
présentation des antigènes étrangers par une cellule présentatrice d’antigène ou CPA
(macrophage, cellule dendritique ou lymphocyte B). Le premier signal d'activation du
lymphocyte T présentant un marqueur de surface CD4+ est constitué par l'engagement
55
d'un récepteur T avec un CMH de classe II, présentant un peptide immunogène sur
une CPA. L’activation complète des lymphocytes nécessite un second signal, appelé
co-stimulation, qui doit être reçu au moment de la reconnaissance de l’antigène par le
RcT. Les lymphocytes activés synthétisent des cytokines et entrent en division
cellulaire. Les lymphocytes CD4+ libèrent l’interleukine 2 (IL-2) et expriment la
chaîne α du récepteur de l’IL-2 (CD25), permettant ainsi à cette cytokine d’agir de
manière autocrine pour activer leur prolifération. Les lymphocytes T CD4+
reconnaissent également les peptides antigéniques exposés en association avec le
CMH de type 1. La libération d'IL-2 par les cellules CD4+ peut aussi activer les
lymphocytes CD8+ reconnaissant un antigène étranger présenté par un CMH de classe
I. Les lymphocytes T CD4+ sont impliqués dans la régulation de la réponse
immunitaire acquise.
La différenciation des lymphocytes T CD4+ naïf peut se produire en deux
directions : lymphocyte T helper TH1 ou TH2. La production de cellules TH1 mène à
une immunité cellulaire, tandis que la production de cellules TH2 mène à une
immunité humorale. La différence entre les cellules TH1 et TH2 réside dans les
patrons de cytokines produites. Les cellules TH1 sécrètent principalement l’intéféron
INF-γ, l’IL-2, les TNF-α et TNF-β, tandis que les cellules TH2 sécrètent
principalement les interleukines IL-4, IL-5, IL-10 et le TGF-β.
La stimulation des lymphocytes T CD8+ ou cellules T cytotoxiques requiert un
signal généré par la liaison du CMH de classe I présentant un peptide étranger, des
signaux de co-stimulation et un signal généré par la liaison de L'IL-2 à son récepteur.
Une cellule dendritique activée, possédant des molécules de co-stimulation, peut
directement activer un lymphocyte T CD8+. La cellule T CD8+ peut alors sécréter
l’IL-2 et induire sa propre activation et différenciation. Les protéines virales produites
par les cellules infectées, sont dégradées par un complexe de protéases catalytiques
appelé le protéasome. Les peptides de l’agent viral qui en résultent sont ensuite
transportés au sein du réticulum endoplasmique où ils sont chargés avec le CMH-1
pour être exprimés à la surface cellulaire. Ces peptides présentés avec le CMH-1 sont
détectés par les récepteurs des lymphocytes T CD8+. Lors de la rencontre entre un
lymphocyte T CD8+ activé et sa cible spécifique, celui-ci s’attache à la cible et sécrète
un grand nombre de facteurs (perforines et granzymes principalement) qui forment
56
ainsi des « trous » dans la membrane cellulaire conduisant à la mort cellulaire. Les
cellules T cytotoxiques sont efficaces pour éliminer les cellules infectées par des virus
ou des parasites, inaccessibles par les anticorps et interviennent dans le rejet de
greffes allogéniques.
Les
lymphocytes
B
forment
une
population
responsable
du
bon
fonctionnement de la réponse immunitaire humorale. Ces cellules peuvent détecter les
antigènes via les immunoglobulines ancrées dans leur membrane. Elles forment le
récepteur des lymphocytes B. Il a été montré qu’elles existent chez les reptiles (Sherif
and El Ridi, 1992). Lorsqu’un lymphocyte B rencontre un antigène donné, il est en
général nécessaire qu’apparaisse un second signal en provenance des lymphocytes Th
CD4+ afin que les lymphocytes B s’activent et soient en mesure de produire des
anticorps. Suite à la captation de protéines solubles par leur récepteur, les
lymphocytes B internalisent ce complexe où l’antigène sera dégradé et présenté par
les CMH de classe II. Les récepteurs des cellules T CD4+ reconnaissent le peptide
étranger présenté par les CMH II sur le lymphocyte B, puis les cellules CD4+
sécrètent les interleukines IL-4 et IL-5, qui sont nécessaires à l'activation complète
des lymphocytes B. Cette activation conduit à une expansion clonale de la cellule B
spécifique de l’antigène donné. Ces cellules B actives et en grand nombre vont
ensuite subir une maturation afin de devenir des plasmocytes capables de produire et
libérer des anticorps dans l’environnement dans lequel se trouve l’antigène. Une fois
l’infection résolue, les cellules B et T activées, spécifiques de l’antigène forment un
pool de cellules mémoires circulantes qui seront réactivées lorsqu’elles rencontreront
le même pathogène.
57
Figure 15. Immunité adaptative. D’après Abbas
et al, 2015.
Figure 16. Réponse immunitaire en réponse à une
infection virale. D’après Lambotin et al., 2010.
Immunité humorale impliquant les lymphocytes
B. Secretion d’anticorps pour éliminer les
microbes extracellulaires. Immunité à médiation
cellulaire. Les lymphocytes Th activent les
macrophages afin qu’ils tuent les microbes
phagocytés. Les lymphocytes Tc éliminent
directement les cellules infectées par des virus.
CPA activées présentant l’antigène aux lymphocytes T
CD4+et CD8+ naïfs qui sont activés via la reconnaissance
du CMH par le TCR. Les CPA produisent aussi des
cytokines: interféron-α (IFNα), interleukine-12 (IL-12) et
IL-15 qui vont influencées la survie et différenciation des
lymphocytes et cellules NK. Les lymphocytes T CD4+
vont se différencier en TH1 ou TH2. L’interféron-γ (IFNγ) sécrété par les TH1 va stimuler l’activation des
lymphocytes cytotoxiques ainsi que la production d’IgG1
par les lymphocytes B tout en inhibant l’activation des
TH1. Les anticorps sont dans ce cas neutralisants. Les
cellules cytotoxiques et les NK sécrètent de l’IFN-γ ou
lyse directement les cellules infectées via la libération de
médiateurs de lyse.
b. Les lymphocytes B et T des reptiles
Les lymphocytes des reptiles ressemblent à ceux des mammifères, variant en
taille avec un diamètre de 5 à 10 m pour les petits et de 15 m pour les grands. La
distinction avec les thrombocytes n'est pas évidente (Fig. 17). Comparé aux
thrombocytes, les lymphocytes sont plus grands et possèdent une bordure plus
distincte. Le noyau du lymphocyte est plus grand, rond ou légèrement oval et
positionné au centre ou légèrement excentré. Les lymphocytes possèdent un rapport
nucléo-cytoplasmique très élevé. Les immatures, présents en faible nombre chez les
animaux sains, sont plus grands, avec un cytoplasme fortement basophile et réduit et
un noyau qui contient de la chromatine très violette et pouvant contenir un nucléole.
58
Figure 17. Photomicrographie de lymphocyte de boa constrictor (tête de flèche) à côté d'un
thrombocyte. Coloration Wright-Giemsa. D'après Strik et al., 2007
Les lymphocytes réactifs sont indicatifs de stimulation antigénique. Ils sont
typiquement plus grands, bien différenciés et possèdent un cytoplasme abondant,
modérément à intensément basophile pouvant contenir de discrètes vacuoles. Certains
lymphocytes réactifs sont plasmacytoïdes en apparence ; ils possèdent un cytoplasme
basophile étendu, avec un noyau excentré ce qui les fait ressembler à des plasmocytes.
Les lymphoblastes, en très faible quantité apparaissent chez des animaux malades
dont le système immunitaire a été très fortement stimulé. Les lymphocytes sont les
leucocytes prédominants du sang périphérique et des tissus hématopoïétiques de la
plupart des reptiles avec un pourcentage pouvant atteindre 80% (Stacy et al., 2011).
Le tableau II illustre les valeurs hématologiques les plus communément obtenues chez
les reptiles. Les valeurs concernant les tortues marines sont décrites dans le chapitre 1
de la partie expérimentale. Leur nombre est influencé par les saisons ainsi que des
facteurs individuels (Stacy et al., 2011). Ils sont en plus faible quantité en hiver ou au
cours des périodes d'hibernation et en quantité élevée l'été ainsi qu'au cours de la mue.
Une lymphocytose est souvent associée à un processus de cicatrisation, une maladie
infectieuse ou inflammatoire, représentant un processus chronique. Les maladies
virales, parasitaires telles que l'anisakiase ou la spirorchidiase ou les maladies dues
aux hématozoaires peuvent induire une lymphocytose (Stacy et al., 2011). Chez les
boidés une lymphocytose peut être provoquée par une leucémie lymphoïde ou la
maladie des corps d'inclusion (Inclusion body disease, IBD) (Stacy et al., 2011). Une
lymphopénie peut également être le témoin de malnutrition ainsi que consécutive à
l'utilisation de corticostéroïdes (Stacy et al., 2011).
59
Tableau II. Valeurs hématologiques publiées chez les reptiles. D’après Campbell.,
2012.
Leucocyt
es
x 1000/µl
Hétérophiles
%
Lymphocytes
%
Monocytes
%
Eosinophiles
%
Basophiles
%
Lézard
3,9-22,4
16 - 58
2 - 40
0-6
0 - 18
4 - 26
Boa
constrict
or
4-10
20 - 65
10 - 60
0-6
0-3
0 - 20
Python
royal
7,9 – 16,4
56 - 67
7 - 121
2 - 22
–
0-2
Tortue
géante
des
Séychell
es
1-8,3
32 - 79
2 - 40
0–8
0–7
Tortue
du désert
6,6 – 8,9
35 – 60
25 - 50
0- 4
0- 4
0- 4
2 - 15
L’existence de diverses populations de lymphocytes a été indirectement
documentée dans plusieurs études mais n’a jamais été mise en évidence directement.
Ces études suggèrent que l’organisation des lymphocytes circulants chez les reptiles
serait similaire à celle des mammifères et des oiseaux. Ceci a été mis en évidence
chez l’alligator Américain grâce à l’utilisation de mitogènes spécifiques des
lymphocytes B et T afin de distinguer fonctionnellement ces deux populations
(Cuchens and Clem, 1979). De plus, des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre
les immunoglobulines d’alligators ont été utilisés afin d’identifier et de distinguer les
lymphocytes B des autres. L’évidence de l’existence des sous-populations de
lymphocytes T chez les reptiles a été rapportée. El Masri et al., 1995, suggère
l’existence de quatre sous-populations de lymphocytes T chez le scinque (Chalcides
ocellatus) qui sont distinctes phénotypiquement soit par la présence ou l’absence de
deux antigènes de surface (antigène thêta) et le récepteur pour l'agglutinine de
cacahuète. D’autres études suggèrent l’existence d’une sous-population de cellules Thelper (Origgi et al., 2007). Chez la couleuvre de Forsskal (Psammophis schokari),
les éléments lymphoïdes de la rate, thymus, et une partie du GALT sont bien
développés en automne et au printemps alors qu’ils en sont dépourvus en été et hiver.
60
La réponse humorale aux divers antigènes tels que les érythrocytes de rat (RRBC), le
sérum d’albumine humaine (HSA), ou de polyvidone (PVP) était forte durant le
printemps et l’automne. Au contraire, cette réponse dirigée contre les RRBC et HSA
était faible en été alors qu'elle demeurait forte vis-à-vis de la PVP, un antigène thymoindépendant chez les mammifères. Ainsi, ces résultats montrent l’existence de
l’activité des lymphocytes T-helper en automne et printemps qui est absente pendant
les autres saisons à cause de la disparition ou réduction des sous-populations de
lymphocytes T. Plus récemment, la prolifération des lymphocytes T a été mise en
évidence chez le sphénodon ponctué (Sphenodon punctatus) (Burnham et al., 2005)
consécutive à une stimulation par des mitogènes spécifiques des lymphocytes T (PHA
et ConA). Les sous-populations de lymphocytes B ont également été explorées
(Munoz et al., 2000). Il a été observé une saisonnalité concernant l’adhérence des
lymphocytes B et la prolifération cellulaire au mitogène constitué par la phytolaque
chez la tortue caspienne, contrairement à l’exposition au lipopolysaccharide où la
prolifération cellulaire a été détectée tout au long de l’année, suggérant une souspopulation différente.
c. Les immunoglobulines
Les immunoglobulines sont des glycoprotéines sécrétées par les lymphocytes
B en réponse à une stimulation antigénique. Elles possèdent une structure conservée
en « Y ». Les immunoglobulines sont en général composées de deux paires de chaînes
légères et lourdes reliées par des forces non covalentes et des ponts di-sulfure. Les
chaînes lourdes et légères sont composées de domaines variables et constants. Les
domaines variables interagissent avec l’antigène alors que les domaines constants sont
structuraux. L’activation des lymphocytes B conduit à leur expansion clonale afin de
créer un groupe de lymphocytes spécifiques de cet antigène. Ces cellules activées
vont subir une maturation afin de devenir des cellules productrices d’anticorps dirigés
contre l’antigène initial qui pourront être libérés dans l’organisme.
Chez les reptiles, les immunoglobulines ont été peu étudiées. La plupart des
informations proviennent d’extrapolations par comparaison aux autres espèces. Il
existerait des différences de maturation des anticorps entre les divers groupes de
reptiles (Origgi et al., 2007) comme les tortues des steppes (Agrionemys horsfieldii)
par comparaison au serpent de verre (Ophisaurus sp.). Il y a peu d’information
61
concernant la structure des immunoglobulines chez les reptiles. L’immunoglobuline
IgY est considérée comme l’homologue des IgG et IgE chez les mammifères.
Contrairement aux IgG des mammifères, les IgY ne possèdent pas de jonction ce qui
confère à la molécule une moindre flexibilité. Considérant l’ensemble des reptiles, au
moins deux isotypes distincts ont été détectés : IgM et IgY (Cooper et al., 1985). Plus
récemment, la cinétique de production des anticorps a été suivie chez la tortue verte
en utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre les fractions 19S, 7S et 5,7S des
immunoglobulines (Herbst and Klein, 1995) de tortue verte. La réponse des IgY (7S)
est précoce, suivie par celle des IgY tronquées (5,7S) pour laquelle 3 mois à plus de 8
mois sont nécessaires pour être détectée. Les cinétiques de production des IgM sont
plus délicates à évaluer (Herbst and Klein, 1995).
L’étude de la réponse immunitaire humorale des reptiles a bénéficié du
développement de tests sérologiques. Des tests ELISA ont été développés afin
d’évaluer la production d’anticorps chez la tortue du désert (Gopherus polyphemus),
l’alligator d’Amérique, le caïman à museau large (Caïman latirostris), le crocodile du
Siam (Crocodylus siamensis) (Origgi et al., 2007), la tortue marine verte (Herbst and
Klein, 1995 ; Work et al., 2000), les tortues grecque et d’Hermann (Origgi et al.,
2001) et le boa constrictor (Boa constrictor) (Origgi et al., 2007). Une séroconversion
vis à vis de l’antigène sélectionné pourrait être détectée dès 4 semaines post-injection
chez la tortue grecque (Origgi et al., 2001), chez la tortue gaufrée du désert et le boa
constrictor (Origgi et al., 2007), et dès 6 semaines chez l’alligator, le caïman, le
crocodile du Siam et la tortue verte (Work et al., 2000).
Les fonctions des Igs comprennent la neutralisation, l’agglutination, la
précipitation et la fixation du complément. Les deux dernières fonctions ne seront pas
développées puisqu’il n’existe pas de travaux probants à ce jour.
La neutralisation est la capacité à bloquer l’interaction entre un virus ou une
toxine avec les récepteurs exposés à la membrane de la cellule cible. La neutralisation
par des anticorps reptiliens est utilisée dans les tests de séroneutralisation afin de
déterminer l’exposition éventuelle des chéloniens aux herpès virus (Origgi et al.,
2001). La neutralisation des anticorps sériques requièrent sept à neuf semaines afin
d’obtenir un seuil de détection suffisant pour déterminer l’exposition aux herpès virus.
Pour détecter les anticorps IgY, deux à cinq semaines supplémentaires sont
62
nécessaires (Origgi et al., 2001). En effet, l’activité neutralisante nécessite une
maturation des anticorps, ce qui requière plusieurs semaines. Le test ELISA détecte la
production de tous les anticorps anti-herpèsvirus, ce qui commence peu après
l’infection tandis que la présence d’anticorps capables de neutraliser le virus demande
plus de temps.
L’agglutination se produit lorsque les anticorps se lient aux antigènes qui se
regroupent et par conséquent ne peuvent plus diffuser dans l’organisme. Cette étape
induit l’activation de la phagocytose. La précipitation se produit lors de la liaison
entre anticorps et antigènes solubles qui précipitent et deviennent ainsi inactifs. Ces
deux mécanismes ont été décrits chez les tortues hargneuses, les tortues grecques et
les tortues d’Hermann et des Steppes (Origgi et al., 2007). L’inhibition de
l’hémagglutination a été utilisée pour évaluer l’exposition des serpents au
paramyxovirus (Jacobson et al., 1981).
d. La réponse immunitaire à médiation cellulaire.
L’évaluation de ce type de réponse immune a été réalisée en grande partie
grâce à des études fonctionnelles. Celles-ci sont en effet basées sur la détection et la
mesure de trois réactions fondées sur la médiation cellulaire : le rejet de greffes, le
rejet du greffon contre l’hôte et la réaction lymphocytaire mixte. Ces trois
composantes ont toutes été observées chez les reptiles, indirectement, suggérant
l’existence de lymphocytes T allo-réactifs et d’homologues reptiliens de déterminants
de base et d’acteurs de la réponse immunitaire cellulaire comme chez les vertébrés
supérieurs (Origgi et al., 2007).
Allogreffes et xénogreffes
Des organes de tortues peintes (Chrysemys picta) transplantés au sein
d’embryons de tortues hargneuses ont été soit acceptés soit rejetés partiellement
tandis que des xénogreffes provenant de tortues à carapace molle de Floride (Apalone
ferox) ont toujours été rejetées. La distance phylogénétique faible existant entre les
deux premières espèces peut expliquer le rejet partiel par comparaison à la distance
phylogénétique plus imporatante existant entre les deux espèces de tortutes suivantes
(Cooper et al., 1985). Les allogreffes ont été rejetées de très nombreuses fois et ce
pour diverses espèces de reptiles.
63
La réaction du greffon contre l’hôte
La réaction du greffon contre l’hôte a été objectivée in vitro en mélangeant des
splénocytes de tortues hargneuses adultes (hôte) avec des fragments de rate de
juvéniles (greffon) afin d’obtenir des splénocytes allogéniques (donneur et receveur
différents). La réaction du greffon contre l’hôte a été observée uniquement lorsque les
individus avaient moins de trois mois.
Réaction lymphocytaire mixte : MLR
Des injections intrapéritonéales de splénocytes administrées à des nouveaux
nés, receveurs allogènes ont induit une splénomégalie, un retard de croissance et
aboutit à la mort. Farag and el Ridi (1985) ont étudié la réaction lymphocytaire mixte
chez la couleuvre africaine (Psammophis sibilans) en utilisant des splénocytes
provenant d’autres races de serpents. La prolifération observée lors des cultures de
réactions lymphocytaires mixtes a mis en évidence la présence de sous-populations
lymphocytaires capables de reconnaître et de répondre aux allo-antigènes. Les
analyses plus poussées de greffes de peau, réaction lymphocytaire mixte et de
lympholyse à médiation cellulaire ont permis de suggérer l’existence d’un CMH chez
les reptiles (Farag and El Ridi, 1990)
64
3. Récapitulatif des tests pouvant être utilisés
Tableau III : Divers tests des fonctions du système immunitaire utilisés chez les
reptiles ainsi que leurs limites. (Adapté d'après Keller et al., 2005b).
Test
Catégorie
Captivité
Euthanasie
Réactif spé
Référence
requise?
requise?a
d'espèce?
Biochimie
Général
Non
Non
Non
Keller et al.,
Numération formule
Général
Non
Non
Non
Bolten et al.,
Histologie
Général
Non
Oui
Non
Leceta et al.,
Activité NK
Inné
Non
Oui/Non
Non
Munoz et al.,
Phagocytose
Inné
Non
Oui/Non
Non
Mondal et al.,
Production nitrate
Inné
Non
Oui/Non
Non
Mondal et al.,
Activité lysozyme
Inné
Non
Non
Non
Walsh et al.,
Explosion
respiratoire
Inné
Non
Oui/Non
Non
Pasmans et al.,
Lymphocyte
Immuno-marquage
IMC
Non
Oui/Non
Oui
El Masri et al.,
Munoz et al.,
Réaction
lymphocytaire mixte
IMC
Non
Oui/Non
Non
Saad and El Ridi
Hypersensibilité
IMC
Oui
Non
Non
Coope et al.,
Rejet d'allogreffe
IMC
Oui
Non
Non
Saad and El Ridi
Activité cytotoxique
IMC
Non
Oui/Non
Non
Farag and El Ridi
Prolifération
lymphocytaire
Lymphocyte T
IMC
Non
Oui/Non
Non
Lymphocyte B
IMH
Non
Oui/Non
Non
Keller et al; Ulsh
et al; Mc Kinney
and Bentley;
Cuchens et al.,
idem
Titrage IgY IgM
IMH
Non
Non
Oui/Nonb
Herbst and Klein
Titrage anticorps
suite à épreuve
IMH
Oui
Non
Oui/Nonb
Herbst and Klein
Lyse formant des
plages
IMH
Oui
Oui
Non
Leceta and Zapata
IMC: immunité à médiation cellulaire
IMH: immunité à médiation humorale
a
Oui/Non : Euthanasie requise pour collecter les lymphocytes de la rate et du thymus ou les
macrophage de la cavité péritonéale.
b
Réactif spécifique d'espèce requis sauf si le test utilisé est l'hémagglutination.
65
4. La mémoire immunitaire chez les reptiles
La caractéristique la plus importante de l’immunité adaptative est
probablement la capacité du système immunitaire de l’hôte à réagir contre un antigène
précédemment rencontré de manière plus rapide, plus forte (titre d’anticorps plus
important) et plus longue qu’au cours de la réponse primitive. La mémoire
immunitaire est permise par l’existence de lymphocytes B et T produits au cours de la
réponse primaire.
L’existence d’une mémoire immunitaire chez les reptiles est encore
controversée. Le stress a un effet immunosuppresseur important pouvant biaiser les
études. La température est également un facteur important : de faibles variations
peuvent conduire à des déductions erronées. L’étude la plus récente de l’existence
d’une mémoire immunitaire humorale chez les reptiles a été apportée par Origgi et al.,
(2004). Lors d’une étude expérimentale de transmission d’herpès virus chez la tortue
grecque, une courte phase de décalage et des titres de neutralisation plus élevés ont
été enregistrés lors d’une seconde exposition à l’antigène. Cependant il était
impossible de détecter une quantité plus importante d’anticorps totaux (non
neutralisants) dirigés contre le virus. La durée du pic de la réponse secondaire n’a pas
pu être déterminée.
5. Facteurs de variation de la réponse immune
De nombreux facteurs peuvent influencer les processus complexes de la
réponse immunitaire tels que l’âge, le statut nutritionnel, la reproduction, la génétique,
les antigènes utilisés, les voies de pénétration des antigènes, la température, la saison,
le stress, et beaucoup d’autres pouvant être regroupés en facteurs intrinsèques (relatif
à l’hôte) et extrinsèques. Les reptiles sont des vertébrés ectothermes donc
particulièrement sensibles aux facteurs extrinsèques. Nous n’aborderons que les deux
principaux que sont la température et la saisonnalité.
a. La température
Le système immunitaire inné et acquis des reptiles est très fortement influencé
par la température (Cooper et al., 1985 ; Origgi et al., 2007). Les tortues d’Hermann
immunisées avec du sérum de porc (NPS) ont montré une production d’anticorps
66
retardée lorsqu’elles étaient maintenues à 20°C comparativement à 28°C. Le système
immunitaire humoral des tortues grecques vis à vis de Brucella abortus était réprimé
lorsque celles-ci étaient maintenues en dessous de 10°C par comparaison à 15 ou
30°C. Chez les iguanes du désert, les températures au delà de 40°C et en deçà de 25°C
étaient associées à une production d’anticorps plus faible contre l’antigène antiSaitohin. Chez Emerias véloce (Eremias velox) et l’iguane de l’île d’Andros aux
Bahamas (Cyclura cychlura), la réponse anticorps contre l’encéphalite à tique n’était
pas détectable lorsque les lézards étaient maintenus à 4°C mais l’était à 37°C. De
manière identique, aucune réponse anticorps n’a été détectée chez le saurien Egernia
cunninghami immunisé avec des SRBC, lorsque les individus sont maintenus à 20°C,
tandis qu’une réponse mesurable était présente à des températures plus élevées avec
une réponse maximale à 30°C. Les allogreffes et xénogreffes sont dépendantes de la
température chez la tortue hargneuse, ainsi que la réaction du greffon contre l’hôte
chez les très jeunes individus de cette même espèce.
b. La saison et les hormones
L’influence des saisons a été décrite très largement chez les reptiles (Origgi et
al., 2007). Chez la tortue de Hermann immunisée à diverses périodes de l’année, la
réponse immunitaire varie grandement. La plus forte réponse immunitaire est obtenue
chez les individus immunisés au printemps (avril), tandis que les animaux immunisés
début octobre réagissaient faiblement. De manière intéressante, les tortues
immunisées tardivement en automne (novembre) possèdent une réponse humorale
légèrement plus faible qu’une immunisation de printemps, mais plus forte qu’en
automne. Leceta and Zapata (1986) ont évalué les réponses anticorps primaires et
secondaires ainsi que les réponses PFC (« hemolysin plaque-forming cell ») chez la
tortue caspienne en été et automne. Les réponses PFC sont obtenues en injectant des
globules rouges de mouton, comme antigènes, aux animaux. Après prélèvement de la
rate, la production d'anticorps anti-globules rouges de mouton est estimée par le
nombre de PFC, c'est-à-dire par le nombre de plages de lyse obtenues. La première
immunisation déclenche la production d’anticorps sensibles au mercaptoéthanol (2ME) ainsi que de réponses PFC en automne, contrairement à l’été. Au cours de la
seconde réponse, des anticorps résistants au 2-ME ont été détectés en automne et en
été, tandis que le nombre de PFC était significativement réduit en été.
67
Concernant la réponse cellulaire, chez la couleuvre des sables africaine, la
réaction lymphocytaire mixte est observable uniquement au printemps et en automne
(Farag and El Ridi, 1985). Chez le scinque ocellé, la réaction lymphocytaire mixte et
le rejet de greffe étaient non fonctionnels en hiver, et plus faibles au printemps qu’en
automne (Saad and El Ridi, 1984). Munoz and De la Fuente (2001) ont étudié les
fonctionnalités (adhérence au substrat, chimiotaxie, réponse de prolifération
lymphocytaire, cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps et cytotoxicité des
cellules tueuses naturelles) des splénocytes chez la tortue caspienne à divers moments
de l’année. En hiver, il a été observé une faible adhérence au substrat, une forte
chimiotaxie et une forte activité cytotoxique, tandis qu’en automne, seule l’adhérence
au substrat était importante. Enfin, au printemps, de fortes activités ont été
enregistrées uniquement pour les réponses lymphocytaires prolifératives. Les mêmes
auteurs ont étudié l’influence des saisons sur les thymocytes de la tortue caspienne
(Munoz and De la Fuente, 2001). De manière générale, les plus faibles réponses
(chimiotaxie, cytotoxicité et prolifération lymphocytaire après exposition aux
mitogènes) étaient observées en automne et ce pour les deux sexes. La prolifération
lymphocytaire était à son maximum au printemps. Chez les femelles, les thymocytes
possèdent la plus forte cytotoxicité et activité chimiotaxique durant l’été. Enfin, les
mêmes tests fonctionnels ont été utilisés pour étudier l’influence de la saison sur les
lymphocytes du sang périphérique. La chimiotaxie, réponse lymphocytaire aux
mitogènes et la cytotoxicité étaient élevées en hiver. La prolifération lymphocytaire
était élevée jusqu’au printemps avant de diminuer en été, alors que l’adhérence, la
chimiotaxie et la cytotoxicté augmentaient en été.
Les saisons influencent également la structure et le remaniement des tissus
lymphoïdes. Chez la tortue caspienne, la rate et le thymus présentent des variations
saisonnières : la corticale et médullaire du thymus ainsi que les manchons
lymphocytaires péri-artériolaires et la pulpe blanche péri-ellipsoïdale sont affectés
différemment (Leceta and Zapata, 1985). L’involution thymique se produit
généralement en été. Au début du printemps la corticale n’est pas bien développée et
ce malgré une augmentation de volume du thymus. Toutefois en fin de printemps, la
corticale et la médullaire sont à nouveau bien développées, dès lors que le thymus
prend un volume plus conséquent. A cette même période, la pulpe blanche de la rate
68
se développe également de manière conséquente avant d’involuer en été. Les
structures non lymphoïdes du thymus, subissent aussi une variation saisonnière.
Les changements saisonniers des fonctions immunitaires des reptiles semblent
être corrélés aux variations hormonales et aux changements structuraux des tissus
lymphoïdes. Chez le scinque ocellé, quatre populations de lymphocytes T
(PNA+Thy1-,
PNA+
Thy1+,
PNA-Thy1-,
PNAThy1+)
étaient
affectées
indépendemment des saisons en présence de niveau de stéroïdes endogènes (El Masri
et al., 1995). Les cellules PNA+ démontrent une capacité à lier une lectine particulière,
la peanut agglutinine (PNA). Chacune des populations lymphocytaires T (moelle
osseuse, rate, thymus et autres populations lymphocytaires) était modulée
différemment par des taux de stéroïdes endogènes. L’étude des effets des variations
saisonnières des corticoïdes endogènes sur les fonctions du système immunitaire du
scinque ocellé ont montré que le développement optimum de la pulpe blanche associé
à une forte réponse immunitaire se produisait du printemps à début d’automne et été
correlé avec un faible niveau de corticoïdes (Origgi et al., 2007). A l’inverse, une
involution marquée des tissus lymphoïdes était observée en automne et hiver et
associée à de forts niveaux de corticoïdes endogènes ou exogènes (acétate
d’hydrocortisone). Un traitement des lézards à l’acétate d’hydrocortisone montraient
une élévation de corticoïdes sanguins forte et durable associée à une involution des
tissus lymphoïdes et un dysfonctionnement de la réactivité immunitaire, mimant ainsi
le statut physiologique de celui-ci d’automne à hiver. De plus, un traitement avec un
antagoniste synthétique du cortisol (metyrapone) en début d’automne interférait avec
l’immunosuppression dépendante des saisons.
La corticostérone est également impliquée dans l’apoptose des thymocytes
comme rapportée chez le gecko d’Inde (Hemidactylus leschenaultii). La
fragmentation de l’ADN induite par la corticostérone semble être dose-dépendante et
requière 48h (Origgi et al., 2007). Le thymus de ce gecko subit de profonds
changements structuraux saisonniers, telle qu'une involution en hiver lorsque les
niveaux d’androgènes sont au maximum. Le thymus se régénère au printemps afin de
devenir pleinement compétent en été, lorsque le niveau de testostérone est à son
minimum. Au cours de ce travail, les auteurs ont pu castrer les animaux et ajouter des
concentrations de testostérone exogène. Il a été décrit ultérieurement un effet
69
inhibiteur direct de la dihydrotestostérone sur la prolifération des thymocytes ainsi
que ses effets indirects sur l’augmentation du processus d’apoptose de thymocytes
dépendant des caspases, le tout médié par les cellules réticulo-épithéliales de la
corticale (Origgi et al., 2007). Chez deux espèces de lézards (Psammodromus algirus
et Acanthodactylus erythrurus), il semble que la stimulation des lymphocytes par la
phytohémagglutinine (PHA) soit fortement diminuée chez les mâles traités à la
testostérone. Une corrélation significativement négative entre la variabilité
individuelle de la réponse médiée par les lymphocytes T et la concentration
plasmatique en testostérone a été observée. Des résultats identiques ont été rapportés
chez le scinque ocellé (Origgi et al., 2007). Cela est à considérer lors d’exposition de
ces reptiles à des polluants organiques mimant les effets des hormones sexuelles
(Bergeron et al., 1994).
IV. Toxicité des polychlorobiphényles chez la tortue marine
Les aspects toxicologiques sont souvent initialement abordés à l’aide de
dosage de la concentration d’un toxique au sein d'un tissu qu’il s’agisse de muscle,
graisse ou divers organes clés entrant dans des processus de détoxification de
l’organisme comme le foie ou les reins. Alors que les tortues marines sont
relativement résistantes aux dommages physiques, tels que les attaques de requins ou
les collisions avec les bateaux, elles sont extrêmement sensibles aux polluants
chimiques (Keller et al., 2005b). Nous nous restreindrons aux polychlorobiphényles
pour ce travail, bien que la même approche pourrait s'appliquer à d'autres composés
chimiques.
A. Les polychlorobiphényles (PCB)
1. Histoire naturelle des polychlorobiphényles
Les polychlorobiphényles (PCB) sont des hydrocarbures halogénés qui
forment un groupe de 209 congénères (Annexe 1) possédant entre 1 et 10 substituts
chlorés sur le cycle biphényle (Fig. 18). Ils possèdent une nomenclature IUPAC
(International Union of Pure and Applied Chemistry). Leur formule empirique est
C12H10-nCln avec n entier nombre d'atomes de chlore.
70
La nomenclature utilisée pour le positionnement des atomes de chlore est la suivante :
- Ortho : substitution au niveau des positions 2, 2’, 6 et 6’
- Meta : substitution au niveau des positions 3, 3’, 5 et 5’
- Para : substitution au niveau des positions 4 et 4’
Figure 18: Structure générale des Polychlorobiphényles
En France, ils ont été synthétisés par l’industrie de 1930 à 1980. Leur
utilisation était
alors extrêmement
variée : isolants électriques dans les
transformateurs et condensateurs de puissance, additifs dans certaines formulations de
pétrole, agents plastifiants dans les peintures, colles, encres, plastiques, huile de coupe
ou encore lubrifiants (Environmental Protection Agency, 2013), etc … Ces composés
sont des ignifugeants, possèdent une grande stabilité chimique et thermique, d’où leur
intérêt pour l’industrie.
Les propriétés physico-chimiques suivantes sont les points clés à retenir:
 Les PCB ont une répartition étendue du fait de leur transport lors du lessivage des
sols ou par le courant, la pluie et le vent (décharges à ciel ouvert) (Safe, 1992).
 Faible solubilité aqueuse, ils s’adsorbent aisément sur le sédiment ou les
particules organiques.
 Faible dégradation dans l'environnement. Fonction du nombre et de la répartition
des atomes de chlore.
 Molécules très stables avec des demi-vies très longues (Safe, 1992).
 Lipophiles: concentrent dans les tissus et organes riches en graisse (Safe, 1992).
 Bioamplifiables le long de la chaîne trophique, surtout dans les écosystèmes
aquatiques car les chaînes trophiques y sont plus longues (Safe, 1992).
 Bioaccumulables.
71
2. Toxicité des PCBs: généralités
En France, leur utilisation a été interdite en 1979 dans quelques produits tels
que les encres, les huiles, les adhésifs ainsi que leur application dans les espaces
ouverts. Puis, en 1987, il a été interdit de vendre ou d’acheter tout matériel contenant
des PCBs. Finalement, en 2003 un plan de décontamination a été mis en place pour
éliminer tout appareil contenant des PCB. Aux Etats Unis, la production de PCBs a
été interdite en 1977. Détectés initialement dans l’environnement en 1966, ces
polluants sont toujours d'actualité malgré les régulations internationales, et se
retouvent dans l’environnement et en particulier dans le milieu aquatique.
Il existe une littérature abondante concernant les PCBs et leurs effets
reprotoxiques, neurotoxiques, immunotoxiques et sur le système endocrinien des
mammifères (Safe, 1994). De nombreuses études ont montré que certains congénères
des PCBs avaient un potentiel cancérigène avéré (US Environmental Protection
Agency et The International Agency for Research on Cancer). La première évaluation
des PCBs en tant que substances cancérigènes effectuée par l’EPA date de 1987. Les
études portaient sur l’Aroclor 1260 uniquement. Ultérieurement, d’autres mélanges
comme l’Aroclor 1016, 1242 et 1254 ont été évalués. Il existe 9 types d'Aroclor (1221,
1232, 1016, 1242, 1248, 1254, 1260, 1262 et 1268), tous commercialisés par
Monsanto Corporation. Les congénères capables d’accumulation dans les poissons et
se liant fortement aux sédiments sont les composées ayant le plus fort potentiel
cancérigène. Des études épidémiologiques rétrospectives effectuées chez des ouvriers
travaillant chez Monsanto exposés aux PCBs en 1936 ont montré que ceux-ci
souffraient plus fréquemment d’acné chlorique ainsi que de cancers hépatiques (EPA,
accessed 2013).
Bien que nous ne rentrerons pas dans les détails, il est important de
comprendre que tous les congénères ne possèdent pas tous la même toxicité. Cela est
dû au nombre d'atomes de chlore ainsi que leur position sur le cycle (Safe, 2001).
Certains congénères dits PCB "dioxin-like", partagent une similarité de structure ainsi
que la coplanarité de la dioxine. Les autres PCB (non "dioxin-like") présentent une
toxicité liée au nombre de substitutions. La 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine
(TCDD) possède une forte affinité pour le récepteur Aryl hydrocarbon (AhR) ainsi
qu'une toxicité élevée. Ainsi un facteur d'équivalence toxique (TEF) a été mis en
place afin d'évaluer la toxicité des PCBs par rapport à celle de la dioxine. Les
72
congénères de PCB sans substitution en position ortho (non-orthosubstitués) ou avec
une substitution en position ortho (mono-orthosubstitués) et ayant des chlores en
position para et au moins deux chlores en position meta sont appelés "dioxin-like"
(PCB-126, voir Annexe 1). Ainsi les congénères "dioxin-like" non-orthosubstitués
(comme les PCB-77, PCB-81, PCB-126 et PCB-169) sont coplanaires et les "dioxinlike" mono-orthosubstitués sont non coplanaires (PCB-105). Chez les vertébrés, les
enzymes de phase 1 des processus de détoxification comme les cytochromes P450isoforme A1 sont induites par les hydrocarbures aromatiques polycycliques via leur
liaison au récépteur AhR (Safe, 2001). Les PCB di-,tri- ou trétra-orthosubstitués sont
plus encombrants ce qui leur confère une toxicité différente de celle des "dioxin-like",
faisant intervenir des mécanismes de toxicité indépendante de l’activation du
récepteur AhR (Safe, 2001).
3. Effets biologiques des PCBs chez les tortues
a. Les voies d'entrée
Dans l’environnement, les PCBs sont toujours sous forme de mélanges
complexes, associés à d’autres contaminants, et il est ainsi souvent impossible
d’assigner un lien de causalité à un composé en particulier. A cause du faible nombre
d’études expérimentales, les voies d’entrées des contaminants et les mécanismes
conduisant à leur toxicité sont relativement peu connus chez les reptiles. Comme tout
vertébré, les voies d’entrées principales sont le derme, les tractus respiratoire et
digestif. L'importance du rôle du derme est souvent sous-estimé. La pérméabilité de la
peau des reptiles varie considérablement d'une espèce à l'autre et ce en fonction de
l'hypoderme et de la kératinisation. Les espèces aquatiques possèdent une peau
relativement perméable afin de faciliter la respiration, ce qui va les rendre plus
susceptibles aux atteintes chimiques. Les études ayant montré la susceptibilité du
derme des tortues marines aux polluants concerne les effets du pétrole (Lutcavage et
al., 1995). Les tortues caouannes ayant une alimentation carnée donc se situant assez
haut dans le réseau trophique encourent un risque accru d’exposition aux polluants
permis par une bioaccumulation importante. Les ingestions accidentelles de déchets,
notamment plastiques concourrent à l'absorption de toxiques (organiques ou
inorganiques). Le comportement de plongée des tortues marines n'est pas dépourvu
73
de risque. En effet, les tortues inspirent un large volume d’air, à l’interface air-eau,
avant de plonger et remontent à la surface. Tous les produits émettant des vapeurs
toxiques à la surface de l’eau, comme par exemple le pétrole, sont dangereux et
arrivent directement aux poumons (Milton and Lutz, 2003). Les nouveaux-nés sont
les plus affectés par cette voie d’entrée car passent plus de temps à la surface que les
juvéniles et adultes. Les voies d'entrées principales de toxiques ainsi que leurs
conséquences majeures chez la tortue marine sont schématisées sur la Fig. 19.
• Carcinogène
• Parasitisme
• Dermatite
Peau
• Capacité aérobie
réduite
Poumon
• Temps de plongée
réduit
Intestin
Organes
des
sens
Oeufs
• Diminution de
l'assimilation
• Effets internes:
hormone et
dysfonction
organique
• Interférence
(glande à sel)
• Développement
anormal
Figure 19. Voies d'entrées et conséquence d'exposition aux toxiques (adapté d'après Lutz, 1990).
b. Excrétion du sel : les glandes à sel
Les reptiles ne peuvent pas concentrer leurs urines qui sont hyperosmotiques
par rapport au sang ; ainsi de nombreuses espèces possèdent des sites extra-rénaux
d’excrétion du sel (sel de l’eau de mer et de l’alimentation) constituant un mécanisme
d’homéostasie. Cela est particulièrement vrai pour les espèces marines, telles que les
tortues marines, les serpents de mer, les crocodiles de mer ainsi que les espèces
désertiques telles que le chuckwalla (Sauromalus spp.) et l’iguane du désert
(Dipsosaurus dorsalis). Chez les tortues marines et les terrapins à dos de diamant
(Malaclemys terrapin), les glandes lacrymales situées dans la partie postérieure de
74
l’orbite ont été modifiées en glandes à sel (Fig. 20). Contrairement aux Malaclemys
où de nombreux canaux drainent la glande et s’ouvrent individuellement le long de la
paupière inférieure, chez la tortue marine, tous les canaux lobulés se rejoignent en un
seul canal.
Figure 20. Glandes à sel de tortue caouanne (Caretta caretta). Elles se situent derrière chaque oeil
(flèches) et latéralement au cerveau (BR) (d'après Jacobson et al., 2007).
Comme tous les vertébrés, les tortues marines ont une concentration en
chlorure de sodium dans leur corps d’environ 1/3 de celle de l’eau salée. Leur
nourriture (crabes, oursins ou autres invertébrés) a la même teneur en chlorure de
sodium que l’eau de mer. L’œsophage des tortues marines est constitué de longues
papilles coniques alignées et réparties de manière très dense qui sont orientées vers
l’estomac. Les contractions de l’œsophage pendant la prise de nourriture
permettraient d’expulser l’eau de mer à travers la bouche ou les naseaux et donc de
limiter la consommation excessive d’eau de mer pendant leur repas. Stimulées par
d’importantes quantités de chlorure de sodium dans le sang, les glandes à sel peuvent
excréter une solution saline deux fois plus concentrée que l’eau de mer.
Récemment, une étude a montré une association négative entre les électrolytes
plasmatiques (sodium et potassium) mesurés chez la tortue caouanne et le
75
dichlorodiphényldichloroéthylène suggérant une altération des reins et ou glandes à
sel, les deux étant sensibles aux polluants organiques (Camacho et al., 2013).
c. Toxicité sur les embryons
Plusieurs études, effectuées sur des résidus d’œufs retrouvés lors de
patrouilles côtières, ont rapporté que les œufs de tortues caouannes contenaient divers
polluants chimiques tels que les PCBs, le chlorane, la dieldrine, les hydrocarbures
polyaromatiques, et les dérivés du naphtalène (Alava et al. 2011). En Malaisie, la
consommation d’œufs représente un problème de santé publique tant les
concentrations en PCBs sont élevées (van de Merwe et al. 2009). La concentration de
PCBs dans les œufs est la plus importante dans la membrane chorio-allantoïdienne
(Cobb and Wood 1997). Bien que la voie d’exposition ne soit pas déterminée avec
exactitude, le transfert maternel est probablement la voie la plus importante. Les
tortues marines sont ovipares et à ce titre, les contaminants lipophiles sont transmis
par la mère lors de la vitellogenèse qui requière la synthèse de lipoprotéines, cruciales
pour fournir des nutriments et des hormones à l’embryon. Ces lipoprotéines sont
également des transporteurs de contaminants environnementaux de la mère vers le
jeune. Tout composé lipophile ou s’associant aux lipoprotéines va pouvoir être
transmis au jeune. Ainsi, ce transfert maternel de composés organiques a été rapporté
chez les tortues marines (Stewart et al., 2011) et est corrélé avec le taux d’éclosion
prématuré et des déformations des nouveau-nés (Bishop et al. 1998). Tous PCBs
(mélange, congénères individuels ou métabolites hydroxylés) ayant une pertinence
environnementale peuvent entraîner une augmentation de la féminisation chez la
tortue à tempe rouge (Trachemys scripta elegans) (Bergeron et al. 1994). Ainsi par
extrapolation, le transfert maternel des PCBs peut éventuellement compromettre le
succès reproducteur des tortues marines.
Beaucoup de reptiles produisent une seule couvée et la concentration de
contaminants est relativement similaire dans tous les œufs de la couvée (Alava et al.,
2011). La structure et le processus de calcification de la coquille varient en fonction
de l’espèce de reptile et ces paramètres ont une importance en terme de transfert
potentiel des contaminants. Les crocodiliens, geckos ainsi que les tortues possèdent
des coquilles dures et relativement imperméables. Ainsi, l’utilisation de l’œuf de
76
reptile comme indicateur biologique de la contamination à un endroit donné est
maintenant très repandue. Cela n’est pas envisageable chez les espèces menacées dont
le prélèvement d’œufs impacterait sur le taux de renouvellement de la génération
suivante et donc réduirait le nombre d’animaux attaignant l’âge adulte. Cependant
devant les anomalies constatées chez ces espèces, quelques prélèvements ponctuels
d’œufs non éclos (après éclosion générale) ont été autorisés (Keller et al., 2013). Dans
le cas d’espèces non menacées, il est possible d’incuber les œufs artificiellement afin
de déterminer le succès d’éclosion et le cas échéant la fréquence des malformations
(Bishop et al., 1998). Les nouveau-nés sont ensuite relâchés dans leur site naturel. Le
dosage concomitant de contaminants chez les adultes doit si possible être réalisé afin
de pouvoir tirer des conclusions quant à la possibilité de transmission verticale (Keller
et al., 2013). Les diverses études ont montré que la distribution des contaminants au
sein des organes chez les reptiles est similaire à celle des autres vertébrés.
d. Contamination et marqueurs d’exposition
La contamination environnementale en PCBs a été démontrée chez de
nombreuses espèces de reptiles incluant les tortues marines (Camacho et al., 2013,
2014; Gardner et al., 2003; Lake et al.1994; Miao et al. 2001; Keller et al. 2004b;
Keller et al. 2004c; Oros et al., 2009; Storelli et al. 2007; Swarthout et al., 2010). Les
marqueurs d'exposition nous renseignent sur la présence de substances exogènes ou
de leurs métabolites ou encore sur les interactions entre la cellule ou molécule cible et
le contaminant. Il n’existe pas de seuil de toxicité des PCBs chez les tortues marines
ou les reptiles plus généralement. Les congénères possédant le plus d'atomes de
chlore 138>153>180, et 118 sont les plus communément retrouvés chez les tortues
caouannes (Camacho et al., 2013, 2014; Keller et al., 2004b; Lazar et al., 2011; Oros
et al;, 2009; Storelli et al. 2007). Ces composés ont le potentiel d’affaiblir le système
immunitaire de ces animaux (Keller et al. 2006) et d’affecter leur régulation
métabolique (Keller et al. 2005b). Une étude récente a mesuré la concentration en
PCBs dans le foie chez trois espèces de tortues marines (tortues vertes, caouannes et
olivâtre). Les PCBs majoritaires étaient les biphényl penta et hexa chlorés (PCB-138
et -153). Plus de 70% des PCBs mesurés étaient constitués de congénères ne
possédant pas de chlore en positon ortho (PCB-77, -126, -169) et constituant la
famille des "dioxine-like". Les enzymes CYP2K1 et CYP3A27 ont été détectées
77
(Western Blot) dans les microsomes hépatiques, au contraire du cytochrome CYP1A.
Le cytochrome P450 2K1 est constitutif chez les poissons et permet la catalyse de
l’hydroxylation des stéroïdes (catalyse l’hydroxylation du 17β-estradiol, de la
testotérone (16β-hydroxylation) et progestérone (16α-hydroxylation)). Il catalyse
également l’oxydation de l’acide laurique. Concernant la transformation des
xénobiotiques, il active l’aflatoxine B1 en sa forme époxyde carcinogène (Uno et al.,
2012). Le CYP3A27 permet la catalyse de l’hydroxylation 6β de la testostérone et
progesterone (Uno et al., 2012). L’enzyme CYP1A contribue chez les mammifères à
la biotransformation des PCBs. En se basant sur les relations structure-activité des
PCBs existant pour les isoenzymes du cytochrome P450, il a été conclu que chez ces
3 espèces de tortues marines existait une activité limitée de l’enzyme CYP1A. Cela
implique une accumulation hépatique possible des PCBs qui sont usuellement
substrats des CYP1A ainsi qu’une capacité de biotransformation qui diffère des
mammifères (Richardson et al., 2009). Une autre étude récente (Oros et al., 2013) a
mis en évidence un cas de panstéatite chez une tortue caouanne adulte échouée qui
contenait des taux très élevés en PCB-138, -153, -180 et -209. Même si une cause
nutritionnelle ne peut pas être écartée, les nombreux dépôts de céroïdes et la réponse
inflammatoire présente dans la cavité coelomique ne peuvent exclure un phénomène
de peroxidation lipidique ayant pour orgine une forte concentration de PCBs
hépatiques.
Une bioaccumulation hépatique a été suggérée mais non corrélée aux PCBs
résiduels chez les tortues vertes, caouannes et de Kemp (Gardner et al. 2003; Milton
and Lutz 2003). Il est important de mentionner que l’ingestion accidentelle de débris
et particulièrement de plastiques à la surface desquels les PCBs sont adsorbés
concourent à une accumulation des PCBs à un niveau d’environ cent fois plus élevé
que l’eau environnante (Mato et al. 2001). Les débris plastifiés sont donc une source
importante de PCBs lors de leur ingestion accidentelle. Cela est particulièrement vrai
pour les juvéniles qui naviguent les océans. Les tissus les plus communément utilisés
pour la détection de PCBs sont le foie et le tissu adipeux où les hexachlorobiphényles
sont majoritaires (Miao et al. 2001). Les quantités de PCBs mesurés chez les tortues
de Kemp sont beaucoup plus importantes que chez les autres espèces (Lake et al.
1994). Puis viennent ensuite la tortue caouanne, la tortue luth et la tortue verte. La
position des espèces au sein du réseau trophique, l’âge et l’habitat semblent être des
78
critères qui contribuent très probablement à la bioaccumulation de plusieurs
organochlorés (Keller et al. 2005b).
4. Effets des PCBs sur le système immunitaire
a. Généralités
De nombreuses études illustrent la capacité des PCBs à moduler le
système immunitaire des mammifères entraînant des effets néfastes. Ils semblent
jouer un rôle dans la susceptibilité accrue vis à vis d’agents pathogènes. Ainsi, chez
les singes Rhésus il a été observé une diminution significative de la taille du thymus
chez les jeunes, une diminution de la capacité de réponse suite à une épreuve aux
globules rouges de mouton (évaluation de la capacité d’une réponse anticorps afin de
développer une immunité protectrice), ainsi qu’une diminution de la résistance au
virus d’Epstein-Barr (Strauss and Heiger-Bernays, 2012). En 1988, plus de 20 000
phoques communs (Phoca vitulina) sont morts en Europe lors de l'épidémie de
maladie de Carré due à un morbillivirus, le « phocid distemper virus-1 » (Aguilar et
al., 1994). Les individus morts avaient des taux de contaminants organochlorés plus
élevés que ceux qui ont survécu. Une étude a ensuite montré que les individus nourris
avec du hareng contenant des PCBs possédaient une activité NK fortement diminuée
(Ross et al. 1996). Le même résultat a été objectivé chez le dauphin bleu blanc
(Stenella coeruleoalba) à la suite d’une épizootie de morbillivirus en mer
Méditerranée (Aguilar et al., 1994).
Les PCBs sont également impliqués comme facteur de risque d’apparition de
lymphomes non Hodgkinien (Strauss and Heiger-Bernays, 2012) ainsi que dans
l’augmentation de la prévalence de néoplasmes chez les bélugas du Saint Laurent
(DeGuise et al., 1995b). Plusieurs études réalisées sur les mammifères marins, ont
montré que 5 µg/ml de chacun des congénères PCB-138, -153, -180 (15 µg/ml total
de PCBs), diminuait la prolifération des splénocytes de béluga (De Guise et al., 1998).
Enfin, une étude récente et intégrée a mis en évidence les effets des PCBs sur la santé
de populations de grands dauphins (Tursiops truncatus) sauvages résidents en
Géorgie (USA). Les concentrations de PCBs étaient associées à une hypothyroidie,
une suppression des fonctions de l'immunité aquise et innée ainsi qu'une anémie
79
sévère (Schwacke et al., 2011).
Ces études, prises dans leur ensemble, suggèrent fortement que l'exposition
aux PCBs, aux concentrations environnementales, peuvent moduler les fonctions du
système immunitaire. Il est plausible que cela conduise à une diminution de la
résistance de l'hôte vis à vis d’agents pathogènes et à l’induction de cancers pouvant
conduire à la mortalité dans des cas extrêmes. Toutefois aucun lien de causalité direct
n’a été mis en évidence.
b. Les tortues marines
Chez les tortues caouannes juvéniles de la côte sud-est des Etats-Unis
les concentrations de PCBs mesurées dans le sang et le tissu adipeux corrélaient
positivement avec le nombre total de leucocytes entraînant une augmentation de ceuxci. Une augmentation du rapport hétérophile/lymphocyte, utilisé comme indicateur de
stress, corrélait positivement avec les concentrations de PCBs "dioxine-like"
mesurées dans la graisse des individus (Keller et al., 2004b). La prolifération
lymphocytaire était augmentée lors d’exposition aux PCBs in vitro et ex vivo (Keller
et al. 2005b; Keller et al. 2006). Ainsi, une corrélation positive significative a été
établie entre la concentration plasmatique de l'Aroclor 1254 (0,1 à 50 ng/g masse
humide) et la prolifération lymphocytaire des lymphocytes B et T (Keller et al., 2006).
La majorité des corrélations mises en évidence pour les concentrations de PCBs
plasmatiques ont également été mises en évidence pour les concentrations mesurées
dans les graisses. Ces résultats concordent avec d'autres publiés chez les oiseaux et
rongeurs (Keller et al., 2005b). En effet, une augmentation de la réponse cutanée au
PHA a été mise en évidence chez les faucons crécerelles d'Amérique adultes (Falco
sparverius) nourris avec un mélange de trois Aroclor (1248, 1254, 1260). Les
goélands argentés juvéniles vivant dans des sites très fortement contaminés des
Grands Lacs d'Amérique, possèdaient une lymphoprolifération plus importante que
les oiseaux des sites de référence. Les souris à pattes blanches (Peromyscus leucopus)
exposées in utero à l'Aroclor 1254, montraient une prolifération accrue des
thymocytes et splénocytes.
80
Au contraire, chez les tortues caouannes juvéniles de Caroline du Nord,
l'activité du lysozyme plasmatique, un indicateur de l'immunité innée, diminuait
significativement avec les concentrations croissantes de PCBs mesurées dans le sang
(Keller et al., 2006). Une diminution de la prolifération lymphocytaire a été mise en
évidence chez les tortues vertes atteintes de fibropapillomes (Cray et al. 2001; Aguirre
and Lutz 2004) et vivant dans des zones très polluées.
Enfin, les leucocytes de 16 tortues caouannes ont été exposées in vitro à
l’Aroclor 1254 (1 ng/ml à 13500 ng/ml) sans qu’aucune différence significative de
prolifération des lymphocytes T n'ait été mesurée, bien qu’une augmentation générale
par comparaison au contrôle ait été rapportée (Keller et al., 2005b). Une courbe doseréponse biphasique a été obtenue pour la prolifération des lymphocytes B. En effet,
une concentration de 5 ng/ml d'Aroclor 1254 augmentait la prolifération tandis que
celle de 498 ng/ml la diminuait. Les concentrations plasmatiques de PCBs mesurées
chez les tortues caouannes variaient de 0,121 ng/g à 23,9 ng/g, ce qui correspond à la
première phase de la courbe (ascendante). Les tendances observées lors d'exposition
in vitro ont également été observées lors d'exposition ex vivo. Les concentrations de
PCBs mesurées chez les tortues marines sont généralement bien inférieures à celles
mesurées chez les phoques ou les sternes (Keller et al., 2004a, 2004b).
Il semblerait que les PCBs aient un effet immunostimulant sur la prolifération
des lymphocytes de tortues aux faibles concentrations (concentrations mesurées dans
l’organisme) tandis qu’ils entraînent une immunodépression aux concentrations plus
fortes. Alors que la diminution des fonctions du système immunitaire est souvent
néfaste, une réaction immunitaire exacerbée n'est pas nécessairement une chose
profitable. En effet, cela s’illustre dans le cas des réponses d'hypersensibilité et
maladies autoimmunes. Certains PCBs mesurés dans divers tissus de tortues marines
possèdent des activités oestrogènes et anti-androgènes chez les reptiles (Bergeron et
al., 1994). Des concentrations légèrement plus élevées que le niveau d'oestrogènes
endogènes peuvent décupler la prolifération lymphocytaire, alors que des taux encore
plus importants inhibent cette fonction (Keller et al., 2005b). Il est ainsi purement
spéculatif mais non impossible de penser que les PCBs ayant un effet activateur de la
prolifération lymphocytaire chez les tortues caouannes implique un mécanisme reliant
81
les perturbations du système endocrine (via des mécanismes dépendant des
oestrogènes) à une immunomodulation.
B. Les outils d'étude
Comme décrit dans le tableau III, les tests principaux permettant l'évaluation des
fonctions du système immunitaire ont été utilisés chez les reptiles.
1. L'hématologie et biochimie
Les paramètres hématologiques tels que la numération formule sangine fournit
des informations importantes quant au stress que subit l'animal. Un rapport
hétérophile/lymphocyte augmenté a été associé à une exposition aux PCBs chez la
tortue caouanne (Keller et al., 2004b). Dans cette même étude, Keller et al., ont
montré qu'il existait une corrélation négative entre la numération de leucocytes
sanguins et la somme des PCB mesurés. Une corrélation négative a été décrite entre la
somme des congénères PCBs-138 et -180, mesurés dans le sang et le taux
d'hématocrites des tortues caouannes adultes. Il a également été montré que pour cette
même population d'individus, le congénère -52 était associé à une diminution des
leucocytes sanguins (Camacho et al., 2013). Le comptage des diverses populations de
lymphocytes T (CD4 et CD8) utilisant des marqueurs de surface pourrait être plus
précis et prédictif quand à la réponse immunitaire enclenchée.
2. L'immunité innée
Les outils à notre disposition sont la mesure de l'activité lysosyme (Walsh et
al., 2010), les propriétées bactéricides du sérum et la production d'ions superoxyde
(Merchant et al., 2009), la phagocytose des macrophages spléniques (Mondal and Rai,
2002) sans que cela ait été mis à profit pour des études de toxicité. L'activité des
cellules tueuses naturelles a été étudiée chez la tortue caspienne ainsi que la
cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) chez la tortue verte afin
d'objectiver les modifications saisonnières (Munoz and De la Fuente., 2001 ;
McKinney and Bentley., 1985).
82
3. L'immunité acquise
Cette immunité comprend les réponses humorale et cellulaire. L'évaluation de
l'immunité cellulaire a été relativement bien étudiée à travers la prolifération
lymphocytaire grâce à l'utilisation d'agents mitogènes. Si les tests de prolifération
lymphocytaire peuvent sembler un peu désuets chez les mammifères, ils n'en
demeurent pas moins très indicatifs chez les reptiles. En effet, chez les tortues marines
échouées et émaciées, la capacité de prolifération lymphocytaire est annhilée pour les
animaux ayant des concentrations significatives de mercure (Day et al., 2007). Les
conditions optimales de fonctionnement des tests requièrent de nombreux
ajustements; en effet, les reptiles sont ectothermes et la température adéquate doit être
déterminée. Les études mesurant les fonctions du système immunitaire ex vivo
montrent que la température optimale varie entre 27°C et 37°C (Cray et al., 2001;
Keller et al., 2005a; McKinney et al., 1985; Munoz and De la Fuente, 2001). Une
étude offre une explication détaillée pour optimiser les méthodes de prolifération
lymphocytaire chez la tortue à tempe rouge (Ulsh et al., 2001) ainsi que la tortue
caouanne (Keller et al., 2005a), l'alligator (Cuchens et al., 1979) et la tortue verte
(McKinney and Bentley, 1985). Comme précédemment décrit, une immunisation a
été réalisée puis les titrages en anticorps ont été mesurés grâce à l'utilisation de
l'hémagglutination qui ne requière pas de réactifs spécifiques d'espèce (Keller et al.,
2005b). Le facteur limitant est la durée nécessaire après l'immunisation avant que la
production d'anticorps soit détectable. Chez les mammifères, la production d’Ac est
relativement rapide avec la détection d'IgM variant entre 4 et 7 jours après
l’immunisation. Chez les reptiles l’apparition est plus lente allant de 4 semaines pour
les alligators à 5 et 9 mois pour les tortues vertes (Herbst et al., 1995). Enfin,
l'immunité humorale a déjà été explorée grâce à l'utilisation du test de cellules
formant des plages de lyse. Ce test prend en compte la réponse humorale dépendante
des lymphocytes T dans son intégralité. En effet, les macrophages sont requis lors de
la présentation des antigènes aux cellules Th, qui permettent aux cellules B d'initier la
production d'anticorps. Ce test a également été utilisé par Munoz and De la Fuente
(2001), nécessite toutefois l'euthanasie de l'animal afin de récolter les splénocytes,
ainsi qu'une immunisation préalable.
83
V. Conclusion partielle
Au terme de cette étude bibliographique, il ressort que les tortues marines,
animaux à la fois terrestres mais surtout marins constituent des espèces sentinelles de
l’environnement aquatique. En effet, elles parcourent les eaux du globe, vivent
longtemps, atteignant une maturité sexuelle tardive, et sont exposées de manière
chronique à de nombreux polluants chimiques. Ces composés constituent les menaces
les moins bien documentées et par lesquelles ces animaux semblent être très affectés.
Parmi tous les composés chimiques, les polychlorobiphényles, composés dont la
fabrication remonte au siècle dernier mais dont l’impact environmental se fait encore
sentir, ont été relativement bien étudiés. Ces polluants organiques s’accumulent et
persistent au sein des tissus biologiques des tortues caouannes. Des études
relativement récentes montrent leurs effets délétères chez ces reptiles en induisant une
prédisposition aux maladies, via un affaiblissement de l’animal. Le système
immunitaire constitue ainsi une interface entre l’état de santé de l’animal et son
environnement. La littérature dans ce domaine est ancienne et plutôt rare chez les
reptiles. Après avoir fait l’état des lieux des connaissances actuelles, nous nous
proposons d’étudier certaines fonctionnalités du système immunitaire inné et acquis,
consécutif à une étude préalable d’investigation des paramètres hématologiques et
biochimiques des individus étudiés ultérieurement. Puis nous montrerons l’effet de
quelques PCBs sur les fonctionnalités du système immunitaire inné.
84
PARTIE 2:
ETUDE EXPERIMENTALE
85
Partie 2: Etude expérimentale
Ce travail propose de déterminer les paramètres hématologiques et biochimiques chez
5 classes d’âge de tortues caouannes juvéniles, puis d’étudier certaines fonctions du
système immunitaire inné et acquis avant de se pencher sur les effets de PCBs
sélectionnés sur les fonctionnalités du système immunitaire inné. Dans cette section,
nous nous attacherons à décrire les conditions de zootechnie, de prélèvement sanguins
ainsi que les méthodes de biologie cellulaire utilisées.
I.
Matériels et méthodes
A.
Sujets d’étude et conditions de captivité
Pour l’étude portant sur les paramètres hématologiques et biochimiques, 85
individus répartis dans 5 groupes d’âge consécutif de 8, 20, 32 44 et 56 mois ont été
étudiés. Chaque groupe comportait respectivement 21, 21, 22, 14 et 7 animaux.
Toutes les tortues ont été collectées après leur éclosion sur les sites de ponte en
Floride entre 2005 et 2009. Cette collecte faisait partie intégrante du programme
d’élevage d’animaux captifs du centre d’étude et réhabilitation des tortues marines de
Galveston (National Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA) Sea Turtle
Facility (Galveston, TX, USA)).
Chaque groupe d’âge consécutif était de 12 mois plus âgé que le précédent.
Toutes les tortues étaient élevées et maintenues au Sea Turtle Facility dans des
conditions d’environnement identiques (Higgins, 2003). Les individus captifs sont
maintenus dans des bassins d’élevage séparés contenant de l’eau de mer provenant
directement du Golf du Mexique. L’eau pompée est filtrée et l’eau du bassin est
renouvelée tous les deux jours. La température de l’eau (27–29 ºC), son acidité
(pH=7.5–7.8) et sa salinité (25–26 ppt) ont très peu varié entre chaque bassin et au
cours de l’étude. La durée de la photopériode est en adéquation avec la durée naturelle
du jour.
86
L’alimentation des tortues caouannes est principalement composée de
croquettes industrielles produites par PMI International Inc. Les individus âgés de 8 et
20 mois recevaient respectivement de l’AquaMax™ 400 et 500, tandis que les
individus de 32, 44 et 56 mois étaient nourris avec un aliment pour crocodile (Small
Mazuri® Crocodilian Diet). Leur ration étaient également complétée avec des calmars
jusqu’à satiété, et ce une fois par semaine, afin d’augmenter le taux d’humidité. Le
calcul de la quantité de nourriture est basé sur le poids vif de l’animal. Une formule a
été développée lors de calculs de rations chez des tortues de Kemp captives âgées de 0
à 18 mois (Fontaine and Shaver, 2005), au cours du projet Kemp's ridley Headstart
(1978–1992). Passé 18 mois, la ration est ajustée afin de permettre une croissance
optimale suivant des critères de recherche. Les individus de 8 à 20 mois sont nourris
le matin et l’après-midi tandis que les individus plus âgés sont nourris le matin
uniquement. Les apports alimentaires quotidiens sont les suivants pour les cinq
groupes d’individus (de 8 à 56 mois): 1% (1g de nourriture pour 100g de poids vif),
0,94% (9,4g de nourriture pour 1 kg de poids vif), 0,36%, 0,24%, et 0,34% du poids
vif (kg) de chacun des animaux respectivement.
Pour l’étude portant sur le système immunitaire de la tortue caouanne, les
échantillons de sang ont été collectés à partir de 65 tortues caouannes immatures
maintenues en captivité au NOAA Fisheries Sea Turtle Facility (Galveston, TX). Les
conditions de prélèvements sont décrites dans les permis 1 . Toutes les recherches
étaient conformes aux recommandations institutionnelles sur le bien-être animal. La
NMFS n’avait pas requis d’approbation d’IACUC mais respectait intégralement les
conditions requises par l’USFWS et par l’état de Floride sur la détention de tortues
marines et leur prise en charge lors d’échouage. Les animaux des deux sexes étaient
inclus dans cette étude. Ils étaient âgés entre 20 et 56 mois avec une longueur de
carapace (SCL moyenne ± SD) de 45,5 cm ± 7,4 et un poids moyen de 12,2 kg ± 5,3.
Tous les animaux inclus ont été préalablement examinés par un vétérinaire et étaient
en bonne santé. De plus, leurs paramètres biochimiques et hématologiques étaient
connus. (Rousselet et al., 2013a).
Les permis ont été délivrés par l’U.S. Fish and Wildlife Service (USFWS) Endangered
Species Act Section 10a(1)a (Scientific Research Permits # TE-676379-4 and TE#676379-5),
ainsi que par le Florida Fish and Wildlife Conservation Commission Marine Turtle (Permit
#MTP-015)
1
87
Pour l'étude portant sur les effets des PCBs sur l'immunité innée, les
échantillons sanguins de 19 tortues caouannes immatures captives ont été utilisés. Les
animaux de cette étude étaient âgés de 32 et 44 mois et possédaient une moyenne
pondérale de 12,6 kg ± 2,3. Tous les animaux de cette étude étaient en bonne santé
(Rousselet et al., 2013a). Pour cette étude un IACUC (Institutional Animal Care and
Use Committee) était requis et a été délivré par l'Université du Connecticut.
B.
Prélèvement de sang chez les tortues marines
Au moment des prises de sang, un examen physique de chaque individu a été
réalisé afin de s’assurer du score corporel de l’animal et de son état de santé. Les
animaux ont ensuite été pesés, et les mesures de carapace en ligne droite (SCL) ont
été effectuées. Les prises de sang ont été effectuées sur animaux vigiles bénéficiant
d’une contention manuelle.
Chez les tortues marines, le sinus cervical dorsal prenant son origine au niveau
du plexus veineux post-occipital est utilisé comme site de prélèvement préférentiel
(Owens and Ruiz, 1980). L'aiguille est insérée perpendiculairement à la face dorsal du
cou, craniale à la carapace et légèrement latérale à une ligne centrale. La tête de
l'animal doit être maintenue plus basse que son corps afin de gorger le sinus (Fig. 21).
A cet endroit une hémodilution par la lymphe peut survenir.
Figure 21. Prise sang réalisée sur un juvénile (Photo de Mr Higgins).
88
C.
Analyse sanguine hématologique et biochimique
Les individus de cette étude ont été mis à jeun 24h avant la prise de sang. Tous
les échantillons ont été prélevés pendant 3 jours consécutifs en mars 2010. La quantité
de sang maximale prélevée est basée sur le poids de l’animal et a variée entre 300 µl
et 12 ml pour cette étude (National Marine Fisheries Service Southeast Fisheries
Science Center, 2008). Une seringue jetable de 1 ml montée d’une aiguille de 25gauge, 5/8 inch a été utilisée pour les animaux pesant moins de 500g. Pour les
individus plus lourds, des seringues de 3, 6 ou 12 ml montées d’une aiguille de 21gauge, 1-inch (unités américaines) ont été utilisées. Pour l’étude fonctionnelle du
système immunitaire, les échantillons sanguins sont obtenus en utilisant un système
de tube hépariné sous vide (Vacutainer, Becton Dickinson). Tous les échantillons de
sang ont été conservés au frais et acheminés pendant la nuit jusqu’au laboratoire afin
d’être analysés en moins de 24h. Concernant l’étude hématologique et biochimique, le
sang a été transféré dans des tubes héparinés (lithium-heparin BD Microtainer®). Les
échantillons de sang contaminés par de la lymphe ont été écartés de l’analyse.
Immédiatement après le transfert du sang dans le tube approprié, ceux-ci ont
été maintenus dans une glacière à une température de 10°C puis les échantillons ont
été traités dans les 4h suivant la prise de sang. Une fraction d’échantillon a été utilisé
afin d’effectuer le comptage manuel des leucocytes. Le reste de l’échantillon a été
centrifugé à 6000g pendant 10 min, et le plasma incolore a immédiatement transféré
dans des cryotubes (cryotubes™ Corning Incorporated). Le plasma ainsi collecté a
ensuite été stocké à -80°C pour un maximum de trois semaines avant d’effectuer les
analyses biochimiques.
Deux frottis sanguins ont été préparés pour chaque échantillon de sang
collecté, séchés à l’air libre, puis colorés avec du Diff-Quik® (Dip Quick Stain Kit,
Jorgensen Laboratories) en suivant les recommandations du fabricant. Les frottis ont
été évalués au niveau des aires représentatives de distribution homogène des
leucocytes sous microscope. Deux cents leucocytes ont été comptés et répartis entre
lymphocytes,
hétérophiles,
monocytes,
éosinophiles,
et
basophiles
comme
précédemment décrit (Campbell, 2006).
La numération formule des reptiles s’effectue manuellement et à l’aide de
deux méthodes qui doivent toujours être confrontées pour permettre l’obtention d’un
résulatat le plus précis possible. Ainsi, deux paramètres sont obtenues : l’estimation
89
des leucocytes ou TWB estimate à partir du comptage des leukocytes au microscope
et la concentration leucocytaire absolue ou TWBC absolute à partir du nombre de
granulocytes. L’estimation des leucocytes a été obtenue en multipliant le nombre
moyen de leucocytes observés dans 10 champs du microscope à l’objectif 40x par
2000 (Campbell, 1995). Le paramètre mesuré est appelé TWBC (Total White blood
cell) estimate dans la suite du manuscrit. Il s’agit en effet d’une estimation à
confronter avec la mesure absolue décrite ultérieurement. Le degré de polychromasie
ainsi que les thrombocytes ont été évalués de manière qualitative (Stacy et al., 2011).
Concernant le nombre absolu de leucocytes, le comptage des éosinophiles et
hétérophiles a été réalisé en utilisant le système Avian Leukopet® system (Vetlab).
La concentration en leucocytes (TWBC/µl) a été obtenue suite à au comptage
différentiel (comptage de chaque type cellulaire pour 200 leucocytes) et au résultat du
Leukopet® en utilisant l’équation suivante (Campbell, 1995):
(Nombre de cellules totales obtenues avec AvianLeukopet® x 1.1 x 16 x100)/(%
Hétérophiles + % Eosinophiles obtenus lors du différentiel).
Deux tubes capillaires ont été remplis puis centrifugés à 12,000g pendant 5
minutes. Le PCV a été évalué comme sur la Fig. 22. Par abus de language nous
appelerons PCV, hématocrite. A noter que le PCV (Packed cell Volume) n'est pas un
paramètre calculé comme l'est l'hématocrite mais bien mesuré (Fig. 22). Les protéines
totales ont été mesurées grâce à l’utilisation du refractomètre (TS : total solid). Les
échantillons plasmatiques précédemment récoltés pour les animaux âgés de 20 à 56
mois ont été analysés par l’analyseur Modular-P Analytics® (Roche Diagnostics) au
Texas Veterinary Medical Diagnostic Laboratory (TVMDL), College Station, Texas,
USA. Le volume des échantillons obtenus pour les tortues de 8 mois était trop faible
pour pouvoir effectuer une analyse biochimique.
Figure 22. Lecture du PCV (packed cell volume) après centrifugation d'un microtube. Sur la figure le
PCV est de 22%. Noter la couleur du plasma.
90
Pour les tortues de 20 à 56 mois, les paramètres biochimiques suivants ont été
analysés : albumine, alanine aminotransférase (ALT), alkaline phosphatase (ALP),
amylase, aspartate aminotransférase (AST), Urée (BUN), calcium (Ca), chlore (Cl),
cholestérol, créatine kinase (CK), créatinine (Crea), gamma glutamyltransférase
(GGT), globuline, glucose (Glu), phosphore (P), potassium (K), sodium (Na),
bilirubine totale, protéine totale (TP) et l’acide urique (UA).
D.
Fonctionnalité du système immunitaire
1.
Isolement des cellules sanguines mononuclées (PBMC)
Les cellules sanguines mononuclées ont été isolées par centrifugation de
gradients de différentes densités. Quatre ml de sang total ont été mélangés à 4 ml de
milieu de culture (RPMI) puis ensuite répartis sur du Ficoll-Paque plus (1.077 g/ml,
Amersham Biosciences). Les échantillons ont été centrifugés pendant 35 min à 600 g.
Le gradient a été collecté et les cellules ont été re-réparties sur du Ficoll-Paque une
seconde fois si de nombreux érythrocytes persistaient. Les cellules mononuclées ont
été re-suspendues dans un milieu complet de RPMI (Mediatech Inc.) supplémenté
avec 2mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium (BioWhittaker), 100 mM
d’aminoacide non essentiel (BioWhittaker), 10 mM d’HEPES, un mélange de
pénicilline (50 U/ml) et streptomycine (50 µg/ml, MP Biomedicals) et 10% de sérum
de fœtus bovin (BioWhittaker). Les cellules ont été rincées deux fois, comptées et leur
viabilité a été évaluée par le test d’exclusion au bleu de trypan.
2.
Prolifération lymphocytaire
La prolifération lymphocytaire induite par les agents mitogènes a été testée in
vitro comme précédemment décrit avec quelques modifications (Levin et al., 2007a).
Les lymphocytes, maintenus en milieu RPMI complet, ont été distribués sur une
plaque de 96 puits à fond plat à raison de 2 x105 cellules/puits (Falcon, Becton
Dickinson) et ce en triplicata avec et sans (cellules non stimulées) ajout de mitogènes.
Les cellules ont été maintenues dans un incubateur à 28°C, en atmosphère humide
enrichie avec 5% CO2 pendant 96 hr. Deux agents mitogènes ciblant les lymphocytes
T ont été testés: la concanavaline A (ConA, C5275, Sigma, St. Louis, MO) et la
91
phytohemagglutinine (PHA-P, L1668, Sigma, St. Louis, MO) aux concentrations
finales de 1, 2, 5, 10 et 20 μg/ml. Le lipopolysaccharide (LPS E. coli 0127:B8, L4516,
Sigma) a été choisi afin de cibler la croissance des lymphocytes B, aux concentrations
finales de 1, 2, 5, 10 et 20 μg/ml. Le raisin d’Amérique ou « pokeweed mitogen »
(PWM ; Phytolacca Americana, L8777, Sigma, St. Louis, MO) a été testé aux mêmes
concentrations que précédemment afin de stimuler à la fois les lymphocytes B et T.
La
prolifération
lymphocytaire
a
été
évaluée
par
l’incorporation de
la
bromodéoxyuridine (5-bromo-2'-deoxyuridine, ou BrdU) dans l'ADN nouvellement
synthétisé des cellules en cours de division. Il s’agit d’un nucléoside synthétique
analogue de la thymidine. La BrdU a été ajouté pendant les 18 dernières heures
d’incubation puis a ensuite été détectée grâce à un anticorps monoclonal et une
réaction enzymatique colorimétrique (Cell Proliferation colorimetric ELISA BrdU,
RocheDiagnostics) en suivant les instructions du fabricant. La mesure de la densité
optique a été réalisée avec un lecteur de plaques ELISA (Multiskan EX v.1.0) à la
longueur d’onde de 450 nm et celle de référence à 690 nm.
3.
Activité NK cellule tueuse naturelle avec et sans PCBs
L’activité des cellules tueuses naturelles (NK) a été testée contre deux lignées
cellulaires, une lignée érythroleucémique humaine (K-562, CCL-243™, ATCC) et
une lignée de lymphome murin (YAC-1, ATCC, TIB-160™) selon le protocole décrit
par DeGuise et al. (1997), avec de légères modifications. Un ml de suspension de la
lignée cellulaire cible (un million de cellules/ml) a été ajoutée à 10 µl d’une solution
lipophile à 3 mM de carbocyanine permettant la coloration des membranes cellulaires
(perchlorate de 3,3’-dioctadécyloxabocyanine (DiO, Molecular Probes) dissous dans
du diméthylsulfoxide (DMSO, Sigma). Les cellules cibles ont ensuite été incubées
pendant 20 min à 37°C et 5% CO2, suivi de deux lavages dans le milieu de RPMI
complet. Les cellules sanguines mononuclées constituant les cellules effectrices ont
été ajustées à une concentration de un million de cellules/ml et ajoutées afin d’obtenir
les rapports cellules effectrices : cellules cibles de 100 :1. 50 :1, 25:1, 12,5 :1 et
6,25 :1. L’activité des cellules tueuses naturelles a été mesurée après deux heures et
demie d’incubation soit à 28°C ou 37°C. Les cellules ont ensuite été colorées à
l’iodure de propidium (PI, Invitrogen) immédiatement avant l’acquisition de la
fluorescence par un cytomètre de flux (FACScan, Becton Dickinson) et analysées par
92
le logiciel CellQuest Pro software (Becton Dickinson, Immunocytometry System)
afin de mesurer la mort des cellules cibles (cytoléthalité). Les résultats ont été
exprimés en pourcentage de cellules cibles mortes2.
L'activité des cellules NK suite à leur exposition aux PCBs a été mesurée en
utilisant la lignée de lymphome murin (YAC-1) comme cellules cibles (Rousselet et
al., 2013b). La concentration des cellules effectrices (PBMC) a été ajustée à 106
cells/mL puis les cellules ont été incubées dans du RPMI avec ou sans PCB à des
concentrations croissantes de 0,5 à 20 ppm pendant 3h. Les cellules cibles ont ensuite
été ajoutées aux PBMC pour un rapport cellules effectrices/ cibles de 50:1. L'activité
des cellules NK a été mesurée après 2.5 hr d'incubation à 28 C. Le reste du protocole
est identique à ce qui a été décrit ci-dessus.
4.
Isolement des sous-populations de cellules leucocytaires
Les monocytes, lymphocytes et granulocytes ont été séparés grâce à
l’utilisation de gradients interrompus de Percoll. Quatre ml de sang total ont été
placés au dessus de 10 ml du gradient de Percoll 3 (Percoll, P4937, Sigma). Ce
gradient de faible osmolarité a été préparé selon les recommandations du fabricant et
était constitué de multiples couches de 2 ml de densité différente (la densité la plus
importante se trouvant sous la précédente). Les densités suivantes ont été utilisées :
1,053 g/ml (40%), 1,059 g/ml (45%), 1,064 g/ml (50%), 1,070 g/ml (55%) and 1,076
g/ml (60%). Le sang placé au dessus des gradients de Percoll a ensuite été centrifugé
à 400g pendant 5 min à 4°C, suivi immédiatement par une centrifugation à 800g
pendant 20 min à 4°C, puis arrêté sans utilisation du frein afin de ne pas perturber les
couches ainsi obtenues. Les diverses couches cellulaires obtenues, situées entre deux
gradients, ont ensuite été récoltées à l’aide d’une pipette puis transférées stérilement,
mises en suspension puis lavées deux fois (400g pendant 5 min à 4°C) dans du milieu
RPMI complet. Le comptage et la viabilité cellulaire ont été déterminés par exclusion
du bleu de Trypan et en utilisant un hémocytomètre.
2
Lors des lésions membranaires des cellules cibles induites par les cellules NK, le PI se lie à l’ADN
des cellules cibles, qui deviennent ainsi doublement positives DiO+, PI+. Au contraire, les cellules
cibles non affectées par les cellules NK, vont exclure le PI et restent ainsi DiO+, PI−.
3
Le Percoll est une solution de particules de silice colloïdale revêtue de polyvinylpyrrolidone.
93
5.
Tri cellulaire et caractérisation morphologique
Le type cellulaire des sous populations de leucocytes déterminées par
cytomètre de flux en se basant sur leur taille (FSC) ainsi que leur granulosité (SSc
pour Side Scatter) relative, a été confirmé grâce au tri cellulaire (FACSAria II) puis à
l’évaluation morphologique des cellules au microscope. Les leucocytes isolés soit par
utilisation de gradient de Ficoll® ou de Percoll® ont été triés grâce au cytomètre de
flux FACSAria II (BD Biosciences) utilisant une douille filtrante de 70 ou 85 µm.
Des lames de cellules en couche mince ont été préparées à l’aide d’une
cytocentrifugeuse (Cytospin, Shandon Inc., Pittsburgh, Pennsylvania, USA) à 450
rpm pendant 10 min. Les lames de cellules en couche mince ont ensuite été colorées
au Diff Quick (Jorgenson Dip Quick Stain set, Loveland, CO).
6.
Phagocytose avec et sans PCBs
La capacité de phagocytose in vitro a été déterminée selon le protocole décrit
par Levin et al. (2005), avec quelques modifications. Brièvement, la concentration des
leucocytes a été ajustée à 2 millions de cellules par ml de HBSS (sans calcium ni
magnésium, BioWhittaker, Walkersville, MD) enrichi avec 1% de sérum de fœtus
bovin (Lonza Bioscience, Rockland, EA). Un million de cellules ont été distribuées
dans des puits à fond arrondi de plaques 96-puits (Falcon, Becton Dickinson, Franklin
Lakes, NJ) puis une suspension de billes de 1 µm en latex fluorescentes (Molecular
Probes, Eµgene, OR) dans du PBS (Mediatech Inc., Manassas, VA) a été ajoutée à la
suspension cellulaire afin d’obtenir un rapport d’environ 100 billes par cellule. Les
cellules ont été incubées pendant 1h à 28°C sous agitation à 300 rpm en utilisant un
Thermomixer R (Eppendorf, Hamburg, Germany). La suspension cellulaire de chaque
puits a été déposée sur du sérum d’albumine bovine à 3% glacial (Sigma, St Louis,
MO) puis le tout a été centrifugé à 150g pendant 8 min à 4°C. Le surnageant
contenant les billes libres a été écarté et les cellules ont été mises en suspension dans
200 µl de PBS contenant 1 % de solution tampon de formol (Decal Corp., Tallman,
NY). La suspension cellulaire ainsi préparée a été stockée à 4°C jusqu’aux analyses
(24h plus tard au maximum). La fluorescence de 10000 évènements environ a été
mesurée à une longueur de 530 mm (FL-1) avec le cytomètre de flux FACScan.
94
L’échelle de lecture est logarithmique et les billes libres servent de référence. Les
diverses populations cellulaires, granulocytes, lymphocytes et monocytes ont été
délimitées électroniquement en fonction de leur taille (FSC) et de leur granulosité
(SCC). Les cellules possèdent ainsi une fluorescence correspondante au nombre de
billes ingérées. La phagocytose a été rapportée comme le pourcentage de cellules
ayant phagocyté une bille ou plus (Burleson et al., 1995; Brousseau et al., 1999, 2000).
Les granulocytes ont été séparés grâce à l'utilisation de gradients discontinus
de Percoll comme décrit précédemment (Rousselet et al., 2013b). Les cellules situées
entre le plasma et 40% de Percoll ainsi que celles situées entre 40-45% de Percoll ont
été combinées. Les granulocytes ont été incubés avec PCBs aux concentrations de 0,5
à 15 ppm, pendant 3 hr à 28 C. Le reste du protocole est identique à ce qui est
mentionné ci-dessus.
7.
Explosion respiratoire
L’explosion respiratoire in vitro a été réalisée selon le protocole de Levin et al.,
2007a. Brièvement, la concentration des leucocytes a été ajustée à 2 millions de
cellules par ml de RPMI complet. Les suspentions cellulaires ont été incubées pendant
30 min à 28°C, en présence de 5 mM de diacétate 2,7-dichlorofluorescine (DCFDA,
Molecular Probes), une sonde fluorescente permettant de détecter la production
d’hydroxyde d’oxygène. La suspension cellulaire a été centrifugée pendant 10 min à
220 g puis mise à nouveau en suspension dans du PBS-glucose (1 g/L; PBS-G). Les
cellules ont été distribuées dans des plaques 96-puits à fond rond, en présence ou non
de 10-9 M de phorbol myristate-2 acétate-3 (PMA, Molecular Probes), un activateur
cellulaire. Les plaques ont ensuite été incubées pendant 1 hr à 28°C. Les cellules ont
ensuite été fixées avec 1 % de solution tampon de formol dans du PBS puis stockée à
4°C jusqu’aux analyses (24h plus tard au maximum). L’explosion respiratoire a été
mesurée à la longueur d’onde de 530 nm (FL-1), et exprimée selon le rapport (ou
indice de stimulation) : fluorescence moyenne émise par les cellules stimulées par le
PMA / fluorescence moyenne émise par des cellules non stimulées.
8.
Préparation des PCBs
Les PCBs utilisés (PCBs -105, 138 et -169) avaient une pureté >98.4% (Ultra
Scientific, North Kingston, RI, USA). Ils ont été mis en suspension dans du DMSO
95
exempt d’endotoxine, puis dans du DMEM utilisé comme diluant afin de préparer les
solutions-mère. La concentration finale en DMSO ne dépassait pas 0,4%.
E.
Analyse statistique
Les analyses statistiques ont été effectuées grâce à l’utilisation de SigmaStat
Windows 1.0 (Jandel Scientific) et du logiciel R; p ≤ 0.05 est considéré comme
statistiquement significatif. La puissance statistique pour chaque expérience était
supérieure à 0,8 qui est considéré comme le euil requis par les logiciels de statistique
afin de s’assurer de la confiance pouvant être accordée à l’interprétation des résultats.
1. Etude des paramètres hématologiques et biochimiques
Le test de normalité de Shapiro-Wilk a été utilisé pour l’analyse de tous les
jeux de données d'analytes hématologiques et biochimiques de chaque groupe d’âge.
La moyenne, déviation standard, et gamme (pour les variables distribuées
normalement) et la médiane, les quartiles à 25-75% et la gamme (pour les variables
non normales) ont été déterminés pour tous les analytes. Trente deux comparaisons
entre les cinq groupes de tortues ont été réalisées en utilisant un test d’analyse des
variances (ANOVA). Le test ANOVA non-paramétrique de Kruskal-Wallis suivi par
le test de Wilcoxon sur données appariées a été utilisé lors de distribution non
normale et le test ANOVA paramétrique de Holm-Sidak suivi par un t-test a été
utilisé dans le cas contraire. Le test de Mann-Whitney a été utilisé pour des
comparaisons deux à deux. Les corrélations de Spearman ont également été réalisées.
2.
Etude du système immunitaire avec ou sans PCBs
Les analyses statistiques One-way repeated-measures analysis of
variance (RM ANOVA) suivi d'un test post hoc de Bonferroni (test paramétrique) ou
Holm-Sidak (test non paramétrique) ont été utilisées. Si les données étaient
distribuées normalement pour une comparaison de deux jeux de données, un t-test a
été utilisé; sinon un test des rangs de Mann-Whitney a été utilisé.
96
II.
Paramètres hématologiques et biochimiques
A. Résultats
1. Morphométrie et Hématologie
L’évolution du poids des tortues et de la longueur de la carapace est montrée
dans la Figure 23.
Figure 23. Evolution du poids (Weight) et de la longueur de carapace (SCL) pour les 5 classes d'âge
(Age) de tortues juvéniles (8, 20, 32,44 et 56 mois). Ces deux paramètres sont étroitement correlés (p=
0,01)
Les résultats complets d’hématologie sont présentés dans le Tableau IV (p 98).
Plusieurs analytes hématologiques varient de manière significative parmi les groupes
d’âge. La moyenne d’hématocrite était significativement plus basse chez les tortues
de 8 mois (moyenne 20,3%, p < 0,001, Fig. 24A) comparativement aux animaux de
20 mois (moyenne 27,5%), 32 mois (moyenne 25,4%), 44 mois (moyenne 25,5%) et
56 mois (moyenne 29,1%). Le degré de polychromasie (Fig.25) était de 6% chez tous
les individus étudiés, cependant sans différence significative parmi les groupes d’âge.
Les stades érythrocytes immatures (par ex les rubricytes) étaient absents des frottis
chez tous les animaux étudiés.
Les animaux de 8 mois avaient une médiane de numération leucocytaire
significativement plus basse (4800 cellules /μl, p < 0,001) comparée aux individus de
20, 32, 44 et 56 mois. Les animaux de 20 mois avaient une médiane de
numération leucocytaire significativement plus haute (13700 cellules/μl, p < 0,001)
que les animaux âgés de 8, 32, 44 et 56 mois.
97
Tableau IV. Paramètres hématologiques et morphométriques [Moyenne (M) ± SD ou Médiane (Med), 25–75% quartiles (q)] chez les tortues
caouannes immatures (8, 20, 32, 44 et 56 mois). L’asterisque (*) indique une difference statistique significative figurant en détail en bas du
tableau par orde alphabétique.
Age
Nombre échantillon
SCL (cm)
M
20 mois
32 mois
44 mois
56 mois
(nés en 2009)
(nés en 2008)
(nés en 2007)
(nés en 2006)
(nés en 2005)
n=21
n=21
n=22
n=14
n=7
9,6
SD (Gamme)
Poids (kg)
M
8 mois
SD (Gamme)
0,4
32,4
0,7
44,9
1,2
51,0
2,1
55,8
1,1
(8,8 –10,2)
(31,4 – 33,6)
(42,9 – 47,4)
(46,0 – 54,5)
(54,4 – 56,5)
0,13
4,25
10,52
15,70
22,11
0,01
0,23
0,67
0,94
1,23
(0,11 – 0,14)
(3,72 – 4,62)
(9,39 – 11,96)
(13,50 – 16,98)
(20,3 – 23,39)
20,3 1,9 (17 – 23) a*
27,5 ± 2,4 (23 – 30)
25,4 2,5 (20 – 30)
25,5 2,1 (22 – 29)
29,1 2,4 (25 – 32)
4,8, 3,9 – 6,5
13,7, 10,8 – 19,4
11,4, 7,7 – 13,7
12,5, 7,6 – 18,0
7,0, 5,1 – 8,2
Hct (%)
M
SD (Gamme)
3
Total WBC (x10 /µl)
Médiane, q
b
(Gamme)
b
(2,1 – 12,3) *
(6,8 – 27,3) *
(2,6 – 21,1)
(5 – 24,6)
(4 – 12,3)
5,4, 3,8 – 6,4
11,4, 9,6 – 14,6
8,8, 7,2 – 10,3
10,0, 7,4 – 11,3
9, 7,8 – 9,6
(3 – 16,8)
(5,2 – 15,4)
(6,4 – 17,4)
3
WBC Estimate (x10 /µl)
Médiane, q
(Gamme)
c
(1,8 – 10,4) *
c
(4,4 – 19,8) *
98
Lymphocytes (%)
82,5, 73,3 – 87,8
Médiane, q
92,0, 88,0 – 95,0
91,0, 88,0 – 95,0
92,0, 88,5 – 95,0
92,0, 88,2 – 93,0
(41 – 96) *
(75 – 99)
(77 – 100)
(74 – 99)
(83 – 95)
3,8, 2,9 – 5,1
12,5, 10,4 – 17
9,8, 6,8 – 12,6
11,1, 6,9 – 16,4
6,5, 4,8 – 7,1
d
(Gamme)
3
Lymphocytes (x10 /µl)
Médiane, q
e
e
(2 – 11, 2) *
(6 – 25,3) *
(2,6 – 19,9)
(4,2 – 22,9)
(3,7 – 11,2)
11,0, 5,3 – 17,0 (0 – 41) f*
4,0, 3 – 8,0 (0 – 19)
6,0, 2,8 – 8,0 (0 – 20)
7,0, 3,0 – 10,0 (1 – 25)
5,5, 4,0 – 7,0 (1 – 10)
Médiane, q
0,46, 0,25 – 1,15
0,7, 0,4 – 1,3
0,6, 0,4 – 1,1
0,7, 0,3 – 1,2
0,3, 0,25 – 0,5
(Gamme)
(0 – 2,4)
(0,1 – 2,2)
(0 – 1,6)
(0,1 – 1,7)
(0,2 – 0,9)
1,5, 1,0 – 3,0 (0 – 9)
1,0, 0 – 2,25 (0 – 10)
2,0, 1,0 – 3,0 (0 – 8)
0,5, 0 – 1,7 (0 – 9) h*
1,0, 1,0 – 4,0 (0 – 7)
0,1, 0,02 – 0,2 (0 – 0,9)
0,15, 0 – 0,4 (0 – 2,1)
0,2, 0,07 – 0,3 (0 – 1,2)i*
0, 0 – 0,1 (0 – 0,9)i*
0,1, 0,05 – 0,3 (0 – 0,5)
3, 1 – 5 (0 – 9) j*
1, 0 – 1 (0 – 6)
1, 0 – 1 (0 – 3)
0, 0 – 1 (0 – 2)
1, 0 – 0,2 (0 – 6)
0,1, 0 – 0,2 (0 – 0,6)k*
0,1, 0 – 0,2 (0 – 0,4)
0,07, 0 – 0,14 (0 – 0,3)
0, 0 – 0,1 (0 – 0,2)
0,05, 0 – 0,1 (0 – 0,6)
1, 0 – 2 (0 – 7) l*
0 (0 – 1)
0 (0 – 1)
0 (0 – 1)
0 (0 – 2)
0,05, 0 -0,08 (0 - 0,9) m*
0 (0 – 0,2)
0 (0 – 0,1)
0 (0 – 0,1)
0 (0 – 0,2)
(Gamme)
Hétérophiles (%)
Médiane, q (Gamme)
3
Hétérophiles (10 /µl)
g*
Monocytes (%)
Médiane, q (Gamme)
Monocytes (x103/µl)
Médiane, q (Gamme)
Eosinophiles (%)
Médiane, q (Gamme)
3
Eosinophiles (10 /µl)
Médiane, q (Gamme)
Basophiles (%)
Médiane, q (Gamme)
3
Basophiles (10 /µl)
Médiane, q (Gamme)
99
Kruskal -Wallis test on Wilcoxon Rank-sum test: 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois, Chi-squared=52,01, significatif avec p < 0,001*,
a
b
One Way ANOVA performed on logarithmic values: 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois et 20 mois vs 8, 32, 44, 56 mois, F=34,6, significatif avec p < 0,001*,
Kruskal -Wallis test on Wilcoxon Rank-sum test: 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois et 20 mois vs 8, 32, 44, 56 mois, Chi-squared =68,2, significatif avec p <
c
0,001*,
Kruskal -Wallis test on Wilcoxon Rank-sum test: 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois, Chi-squared =41,7, significatif avec p < 0,01,
d
e
One Way ANOVA performed on logarithmic values: 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois et 20 mois vs 8, 32, 56 mois, F=43,7, significatif avec p < 0,001*,
Kruskal -Wallis test on Wilcoxon Rank-sum test: 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois, Chi-squared =18,6, significatif avec p < 0,02*,
f
Kruskal -Wallis test on Wilcoxon Rank-sum test: Chi-squared =7,2, p = 0,12: not significant,
g
h
Mann -Whitney Ranks 44 mois vs 8 mois U=726,5, T=716,5, P = 0,019*, 44 mois vs 32 mois U=731, T=686, P = 0,009*, 44 mois vs 56 mois U=101, T=328,
p = 0,036*,
i
Mann -Whitney Ranks 8 mois vs 32 mois U=519,5, T=1580,5, P = 0,027*, 20 mois vs 44 mois U=470,5, T=518,5, p = 0,038*, 32 mois vs 44 mois U=580,5,
T=500,5, P = 0,004*,
j
Kruskal -Wallis test on Wilcoxon Rank-sum test: 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois, H=41,9, significatif avec p < 0,01*,
k
Mann -Whitney Ranks 8 mois vs 32 mois U=1014, T=1086, P = 0,004*, 8 mois vs 44 mois U=737,5, T=504, significatif avec p < 0,001*,
l
Kruskal -Wallis test on Wilcoxon Rank-sum test : 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois, H=54,8, significatif avec p < 0,02*,
m
Mann -Whitney Ranks 8 mois vs 20 mois U=950, T=848, p < 0,001*, 8 mois vs 32 mois U=1161,5, T=938, p < 0,001*, 8 mois vs 44 mois U=760,5, T=481,
P < 0,001*, 8 mois vs 56 mois U=322,5, T=152,5, significatif avec p = 0,007*,
100
Ces résultats ont également été rapportés en ce qui concerne les numérations
leucocytaires estimées. La numération leucocytaire obtenue par estimation corrélait
avec le comptage absolu (Coefficient corrélation Spearman 0,6, p < 0,0001). Cela
nous permet de renforcer la confiance vis à vis des résultats obtenus. Les animaux
âgés de 8 mois avaient un pourcentage (82,5%, p < 0,01) ainsi que des valeurs
absolues (3800 lymphocytes/µl, p < 0,001) du nombre de lymphocytes (Fig.25)
significativement plus bas ainsi qu’un pourcentage d’hétérophiles (11%, p < 0,02),
d’éosinophiles (3%, p < 0,01) et de basophiles (1%, p < 0,02) et des valeurs absolues
(50 basophiles/µl, p < 0,007) significativement plus élevées que chez les tortues plus
âgées.
Figure 24. Boxplot faisant figurer la médiane, les percentiles 25 et 75 (limites basses et hautes de la
boite) et les percentiles 5 et 95 (moustaches du diagramme) pour le paramètre choisi. Chaque classe
d'âge (en mois) des tortues caouannes juvéniles est représentée en abscisse. Les astérisques (*)
indiquent les différences significatives. A : Packed cell volume (PCV) ; B : Comptages leucocytaires
réalisées par estimation (WBC estimates) par microlitre.
Les tortues de 8 mois avaient également un nombre d’éosinophiles (Fig.25)
significativement plus élevé (100 éosinophiles/µl, p < 0,004) comparé aux animaux
âgés de 32 et 44 mois. Les animaux de 20 mois avaient un nombre significativement
plus élevé de lymphocytes (12500 lymphocytes/µl, p < 0,001) que les autres groupes.
Les pourcentages de monocytes (Fig.25) obtenus pour les animaux de 44 mois étaient
significativement plus bas que chez les animaux de 8, 32 et 56 mois (p < 0,036),
tandis que le nombre de monocytes était significativement plus bas chez les animaux
de 44 mois que chez les animaux de 20 et 32 mois (p < 0,038). De plus, les animaux
de 32 mois avaient un nombre de monocytes significativement plus élevé (200
monocytes/µl, p < 0,027) que les animaux de 8 mois.
101
Il n’y avait aucune différence morphologique des leucocytes en fonction de
l’âge. Les thrombocytes semblaient normaux en nombre et morphologie chez tous les
animaux (Fig.25).
A
B
C
D
Figure 25. Photomicrographies de cellules sanguines de tortue caouanne juvénile. Crédit. Estelle
Rousselet. A. >lymphocyte, *thrombocyte. B. >éosinophile. C. > hétérophile, ** polychromatophile ou
érythrocyte immature. D. monocytes. Bar :5µm.
2.
Biochimie plasmatique
Les résultats des paramètres plasmatiques et les comparaisons statistiques entre
les groupes d’âge sont présentés dans le Tableau V (p105). Les animaux de 8 mois
avaient des valeurs plasmatiques de protéine totale déterminée par réfractométrie (TS)
significativement plus basses (médiane 1,1 g/dl, p < 0,001) comparées aux animaux
plus âgés. Les valeurs de solide plasmatique corrélaient avec le poids et la longueur
de la carapace des individus (Corrélation de Spearman, r=0,50 et 0,56 respectivement,
p = 2x10–8 et 1,2x10–6, n=85, tous groupes d’âge). Les taux de protéines plasmatiques
totales étaient significativement plus bas chez les animaux de 20 mois (médiane 2,0
g/dl, p < 0,017) comparés aux animaux de 32, 44 et 56 mois (Fig. 24C). Les taux de
protéines plasmatiques corrélaient faiblement au poids ou longueur de carapace
(Corrélation de Spearman, r=0,32 et 0,34 resp., p = 0,01 et 0,006 resp., n=64, pour les
animaux de 20 à 56 mois). Une corrélation significative a été montrée entre les taux
102
plasmatiques de protéines totales mesurées par réfractométrie et analyseur
(Corrélation de Spearman, r=0,63, p = 2x10–8; de 20 à 56 mois). Il n’y avait pas de
différence significative concernant l’albumine ainsi que le rapport albumine/globuline
pour les individus âgés de 20 à 56 mois. Les animaux de 20 mois avaient des
concentrations de globuline significativement plus basses (médiane 1,1 g/dl, p <
0,006) que les tortues plus âgées. Les concentrations de glucose (moyenne 153,5
mg/dl ± 21,7 SD, p < 0,001; Fig. 24D), et les activités AST (moyenne 157,7 U/l ± 51
SD, p < 0,001) et ALP (moyenne 73 U/l ± 24,2 SD, p < 0,001) étaient
significativement plus élevées chez les animaux de 20 mois que chez les animaux plus
âgés alors que les concentrations de cholestérol (moyenne 60 mg/dl ± 14,2 SD, p <
0,001, Fig. 24E) étaient significativement plus basses. Pour les tortues de 32 mois, les
activités CK avaient la variabilité la plus importante, allant de 288 à 2829 U/l, et
étaient significativement plus élevées (moyenne 991,5 U/l ± 536,1 SD, p < 0,01) que
pour les tortues de 44 mois. Les animaux de 32 mois avaient des activités amylase
significativement plus basses (médiane 562 U/l, p < 0,001) que pour les tortues de 20
et 44 mois. Les valeurs d’acide urique étaient significativement plus basses pour les
tortues de 32 mois (moyenne 0,5 mg/dl ± 0,14 SD, p < 0,01) que pour celles de 20
mois. Les tortues de 56 mois avaient des concentrations d’urée significativement plus
élevées (moyenne 43,3 mg/dl ± 6,6 SD, p < 0,016) que pour tous les autres groupes
(Fig. 24F). Chez ces mêmes individus, la créatinine était significativement plus élevée
(médiane 0,07 mg/dl, p < 0,04) que pour les animaux de 20 et 32 mois. Les
concentrations de bilirubine totale étaient en dessous de 0,1 mg/dl, les activités
alanine aminotransférase étaient inférieures à 4 U/l et celles des gammaglutamyltransférases étaient inférieures à 3 U/l pour tous les groupes d’âge. Il n’y
avait aucune différence significative entre les classes d’âge concernant les
concentrations plasmatiques de calcium, phosphore, rapport phospho-calcique,
sodium, chlore et potassium.
103
Figure 24. Boxplots faisant figurer la médiane, les percentiles 25 et 75 (limites basses et hautes de la
boite) et les percentiles 5 et 95 (moustaches du diagramme) pour chaque paramètre hématologique et
biochimique d'intérêt. Les classes d'âge (mois) des tortues caouannes immatures sont en abscisse. Les
cercles à l'extérieur des moustaches représentent les valeurs extrèmes. Les astérisques (*) indiquent les
différences significatives. C. Protéines totales ; D. Glucose ; E. Cholestérol ; F. Urée (BUN).
104
Tableau V. Analytes biochimiques [Moyenne (M) ± SD ou Médiane (Med), 25–75% quartiles (q)] chez les tortues caouannes immatures (8, 20,
32, 44 et 56 mois). L’asterisque (*) indique une difference statistique significative figurant en détail en bas du tableau par orde alphabétique.
Age
8 mois
20 mois
32 mois
44 mois
56 mois
(2009 hatchlings)
(2008 hatchlings)
(2007 hatchlings)
(2006 hatchlings)
(2005 hatchlings)
n=21
n=21
n=22
n=14
n=7
1,1, 1 – 1,2 a*
1,6, 1,4 – 1,7
1,6, 1,53 – 1,80
1,55, 1,4 – 1,8
1,8, 1,7 – 1,9
0,9 - 1,8
1,0 - 2,0
1,2 - 2,0
1,2 - 2,0
1,5 - 2
Médiane, q
2,0, 2 – 2,2 b*
2,2, 2,1 – 2,4
2,25, 2,1 – 2,37
2,3, 2,15 – 2,35
Gamme, g/dl
1,3 - 2,3
1,7 - 2,6
1,3 - 2,7
1,9 - 2,5
Médiane, q
0,9, 0,9 – 1,10
1, 1,0 – 1,10
0,9, 0,9 – 1,1
1,0, 0,95 – 1,1
Gamme, g/dl
0,5 - 1,1
0,8 - 1,2
0,6 - 1,1
0,8 - 1,1
Médiane, q
1,1, 1,1 – 1,2 d*
1,2, 1,1 – 1,3
1,25, 1,2 – 1,3
1,3, 1,15 – 1,3
Gamme, g/dl
0,7 - 1,3
0,9 - 1,4
0,7 - 1,6
1,1 - 1,4
0,8
0,9
0,8
0,8
Taille échantillon
Protéine Totale (réfractométrie) g/dl
M
SD or Med, q
Gamme, g/dl
Protéine Totale (analyseur) g/dl
Albumine c g/dl
Globuline g/dl
Albumine: Globuline Ratio
Mean
SD
0,1
105
0,1
0,1
0,1
Créatinine, µmol/l (mg/dl)
Médiane, q
Gamme, µmol/l (mg/dl)
2,64, 2,64 – 3,52
3,52, 2,64 – 3,52
3,98, 3,52 – 5,08
6,19, 3,98 – 6,19 e*
(0,03, 0,03 – 0,04)
(0,04, 0,03 – 0,04)
(0,045, 0,04 – 0,058)
(0,07, 0,045 – 0,07)
0,88 - 5,30
2,65 - 6,19
2,65 - 9,72
3,54 - 6,19
(0,01 - 0,06)
(0,03 - 0,07)
(0,03 - 0,11)
(0,04 - 0,07)
41,6, 35,7 – 47,6
29,7, 23,8 – 35,7 f*
35,7, 29,7 – 35,7
35,7, 35,7- 41,6
(0,70, 0,60 – 0,80)
(0,50, 0,40 – 0,60)
(0,60, 0,50 – 0,60)
(0,60, 0,60 – 0,70)
17,6 - 65,4
17,8 - 47,6
23,8 - 41,6
35,7 - 41,6
(0,30 - 1,10)
(0,30 - 0,80)
(0,40 - 0,70)
(0,60 - 0,70)
11,3, 10,1 – 11,6
11,0, 9,9 – 12,6
10,6, 9,3 – 11,5
16,4, 13,7 – 16,9 g*
(31,7, 28,2 – 32,5)
(30,7, 27,63 – 35,25)
(29,6, 26,05 – 32,2)
(46,0, 38,3 – 47,4)
5,9 - 12,7
7,8 - 17,1
6,96 - 13,7
12,2 - 18,3
(16,6 - 35,6)
(21,9 - 47,9)
(19,5 - 38,5)
(34,1 - 51,3)
Acide urique, µmol/l (mg/dl)
Médiane, q
Gamme, µmol/l (mg/dl)
Urée, mmol/l (mg/dl)
Médiane, q
Gamme, mmol/l (mg/dl)
Glucose, mmol/l (mg/dl)
8,5
Moyenne
1,2 h*
5,2
0,7
5,0
0,9
5,2
0,5
16,1)
(93,9 9,5)
SD
(153,5
Gamme, mmol/l (mg/dl)
21,7)
(92,8
11,9)
(91,0
6,6 - 10,5
4,1 - 6,4
3,6 - 6,9
4,6 - 6,0
(119,0 - 189,0)
(74,0 - 115,0)
(65,0 - 124,0)
(83,0 - 108,0)
<0,1
Bilirubine totale (mg/dl)
106
Cholestérol, mmol/l (mg/dl)
Moyenne
1,55
0,37i*
2,30
0,53
2,33
0,53
2,64
(60,0
14,2)
(89,5
20,4)
(90,1
20,6)
(102,2
0,69
SD
Gamme, mmol/l (mg/dl)
26,6)
0,76 - 2,05
1,36 - 3,30
1,18 - 3,17
2,02 - 3,93
(29,2 - 79,1)
(52,8 - 127,8)
(45,6 - 122,4)
(78,1 - 152,1)
Médiane, q
78,0, 66,0 – 82,0 j*
28,5, 25,0 – 35,5
30,0, 25,5 – 34,0
31,0, 27,0 – 40,0
Gamme
22,0 - 118,0
22,0 - 67,0
18,0 - 43,0
25,0 - 50,0
ALP, U/l
CK, U/l
Moyenne
SD
Gamme
699,8
344,9
991,5
201,0 - 1464,0
536,1 k*
288,0- 2829,0
582,4
397,4
83,0 - 1381,0
507,7
243,1
269,0 - 944,0
AST, U/l
Moyenne
SD
157,7
51,0 l*
Gamme
75,0 - 298,0
ALT, U/l
<4
GGT, U/l
<3
101,8
17,5
97,1
19,9
89,0
11,5
57,0 - 128,0
56,0 - 147,0
75,0 - 104,0
Amylase, U/l
Médiane, q
835,0, 694,0 – 1090,0
562,0, 506,0 – 618,75 m*
951,5, 871,0 – 1025,0
790,0, 620,0 – 1136,0
Gamme
582,0 - 1276,0
414,0 - 1003,0
664,0 - 1179,0
439,0 - 1249,0
107
P, n mmol/l (mg/dl)
Médiane, q
Gamme, mmol/l (mg/dl)
2,48, 2,27 – 2,66
2,29, 2,22 – 2,48
2,09, 2,02 – 2,32
2,05, 2,02 – 2,22
(7,68, 7,04 – 8,25)
(7,10, 6,87 – 7,68)
(6,48, 6,25 – 7,19)
(6,36, 6,25 –6,89)
1,66 - 2,86
1,75 - 2,69
1,51 - 2,84
1,88 - 2,45
(5,14 - 8,85)
(5,41 - 8,33)
(4,69 - 8,8)
(5,82 - 7,59)
1,7, 1,48 – 1,75
1,61, 1,53 – 1,65
1,66, 1,54 – 1,72
1,67, 1,51 – 1,8
(6,80, 5,90 – 7,0)
(6,45, 6,13 – 6,60)
(6,65, 6,18 – 6,90)
(6,7, 6,05 – 7,2)
1,17 - 1,85
1,25 - 1,77
1,25 - 1,825
1,40 - 1,85
(4,70 - 7,40)
(5,00 - 7,10)
(5,00 - 7,30)
(5,60 - 7,40)
0,89
0,89
0,99
1,01
Ca, o mmol/l (mg/dl)
Médiane, q
Gamme, mmol/l (mg/dl)
Ca:P
Moyenne
SD
Gamme
0,08
0,07
0,10
0,11
0,77 - 1,02
0,74 - 1,04
0,77 - 1,17
0,85 - 1,16
Médiane, q
150,0, 128,0 – 153,0
149, 145,25 – 151
149,5, 146,3 – 150
140, 132 – 148
Gamme, mmol/l
84,0 - 155,0
115,0 - 154,0
102,0 - 154,0
128,0 – 151,0
p
Na, mmol/l = meq/L
q
K, mmol/l= meq/L
Moyenne
SD
Gamme, mmol/l
3,8
0,7
3,9
0,4
3,8
0,4
3,5
0,2
2,1 - 4,7
3,1 - 4,7
2,8 - 4,5
3,3 - 3,7
Médiane, q
119, 100 – 120
115,5, 114 – 119
117, 115 – 119,25
112, 103,5 – 117,5
Gamme, mmol/l
63,0 - 122,0
90,0 - 122,0
79,0 - 212,0
100,0 -120,0
r
Cl, mmol/l= meq/L
108
Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: 8 vs 20, 32, 44, 56 mois, H=36,855, significatif avec p < 0,001*,
Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: 20 vs 32, 44, 56 mois, H=10,176, significatif avec p = 0,017*;
Mann-Whitney 20 mois vs 32 mois (p = 0,007), 44 mois (p = 0,021), 56 mois (p = 0,031),
c
Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: H=6,389, p = 0,09,
d
Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: H=12,5, significatif avec p = 0,006*; Mann-Whitney 20 mois vs 32
mois (p = 0,043), 44 mois (p = 0,002), 56 mois (p = 0,01),
e
Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: H=15,24, significatif avec p = 0,002*; Wilcoxon rank sum test: 56
mois vs 32 mois (p = 0,04), 20 mois (p = 0,01),
f
Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: H=13,78, significatif avec p = 0,003*; Wilcoxon rank sum test: 20
mois vs 32 mois (p = 0,01),
g
Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: H=14,49, significatif avec p = 0,002*; Wilcoxon rank sum test: 56
mois vs 44 mois (p = 0,009), 32 mois (p = 0,016), 20 mois (p = 0,002),
h
One Way Test with non equal variance (Welsh) and normal distribution, significatif avec p < 0,001*; Pairwise comparisons using
t tests: 20 mois vs 32, 44, 56 mois (p < 0,001),
i
One Way ANOVA with equal variances and normal distributions, significatif avec p < 0,001*; Pairwise comparisons using t tests
20 mois vs 32, 44, 56 mois,
j
Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: H=30,2, significatif avec p < 0,001*; Wilcoxon rank sum test: 20 mois vs
32 mois (p < 0,001), 44 mois (p < 0,001), 56 mois (p = 0,009),
k
One Way ANOVA with equal variances and normal distributions after log transformation p = 0,005; Pairwise comparisons using t tests:
32 mois vs 44 mois (significatif avec p < 0,01*),
l
One Way Test with non equal variance (Welsh) and normal distribution significatif avec p < 0,001*; Pairwise comparisons using t tests:
20 mois vs 32, 44, 56 mois (p < 0,001),
m
Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: H=23,45, significatif avec p < 0,001*; Wilcoxon rank sum test: 32 mois
vs 20, 44 mois (p < 0,001),
n, o, p, q
Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method, resp. H=8,59, p = 0,035; H=3,22, p = 0,359; H=2,006, p = 0,571; H=6,71, p = 0,082.
a
b
r
Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method, H=1,89, P = 0,60,
109
110
B.
Discussion
Les tableaux VI et VII présentent une synthèse respectivement des analytes
hématologiques et des paramètres biochimiques référencés dans la littérature pour les
tortues caouannes et vertes. Dans cette étude, nous avons pris pour références ces
données bibliographiques, en rappelant que ces valeurs varient en fonction de la taille
de l’échantillonnage et de la méthodologie utilisée pour obtenir ces résultats, à
l’origine de variations inter-laboratoires.
1.
Hématologie
Le volume de sang total d'un reptile varie en fonction des espèces mais de
manière générale est d'environ 5 à 8% du poids total (Strik et al., 2007). Donc le
volume de sang d'un serpent de 100g est de 5-8 mL. Les reptiles sains peuvent
aisément perdre 10% de leur volume de sang total sans conséquences délétères; ainsi
0,7 mL de sang peut être prélevé sans problème chez un animal de 100g.
Pour les animaux de 8 mois, les valeurs d’hématocrite de notre étude sont
incluses dans les gammes précédemment publiées (Bradley et al., 1998; Kakizoe et al.,
2007). Les tortues de 20 à 56 mois ont des valeurs d’hématocrite similaires à celles
rapportées pour des tortues caouannes immatures, captives d’élevage présentes au
Japon ainsi que pour des immatures sauvages de taille/âge similaires (Casal and Oros,
2007; Kakizoe et al., 2007; Keller et al., 2004b; Morpurgo and Gelman, 1991). Dans
notre étude, le taux d’hématocrite varie en fonction de l’âge des individus ce qui
corroborent les corrélations (en fonction de l’âge et de la longueur de la carapace)
précédemment décrites chez diverses espèces de tortues marines (Frair and Shah,
1982; Kakizoe et al., 2007; Wood and Ebanks, 1984). Bien que des reptiles sains
puissent avoir un faible degré de polychromasie (<5%), les jeunes peuvent avoir un
degré plus élevé que les adultes (Duguy, 1970). Les petites inclusions basophiles
ponctiformes observées fréquemment au sein des érythrocytes chez tous les groupes
d’âge sont morphologiquement évocateurs d’organelles dégénérées (Alleman et al.,
1992; Casal and Oros, 2007).
Le nombre de leucocytes totaux de notre étude entre dans la gamme de valeurs
rapportées précédemment chez des tortues caouannes immatures sauvages (Casal et
111
al., 2009; Flint et al., 2010a; Keller et al., 2004b; Stamper et al., 2005) ainsi que chez
les tortues vertes (Flint et al., 2010b; Work et al., 1998). Les variations de
pourcentage de leucocytes observées en fonction des diverses classes d’âge sont en
adéquation avec la relation positive existant entre l’âge et le pourcentage de
lymphocytes ainsi que la relation négative qui existe entre l’âge et le pourcentage
d’hétérophiles ayant été décrite par Kakizoe et al. Dans notre étude, le nombre absolu
total de lymphocytes est similaire aux valeurs précédemment rapportées chez des
tortues caouannes immatures, maintenues en captivité ou sauvages (Keller et al.,
2004b; Stamper et al., 2005). Le type cellulaire le plus fréquent de notre étude chez
toutes les tranches d’âge est le petit lymphocyte bien différencié. Très peu de
lymphocytes larges ou intermédiaires étaient présents sur les frottis de certains
individus. Ils peuvent toutefois être observés en faible nombre dans la circulation
périphérique des reptiles sains (Stacy et al., 2011). En seconde position viennent
ensuite les hétérophiles, ce qui concorde avec les tortues caouannes immatures de
Caroline du Nord (USA, Keller et al., 2004b) et les tortues vertes de Hawaii (Work et
al., 1998). Par contre deux études, l’une réalisée sur des tortues caouannes captives
âgées d’un an en Caroline du Sud (Bradley et al., 1998) et l’autre réalisée sur des
immatures aux Canaries (Casal and Oros., 2007; Casal et al., 2009) ont montré que les
hétérophiles constituaient la population leucocytaire dominante. Les valeurs du
nombre d’hétérophiles rapportées dans notre étude sont inférieures à celles
précédemment rapportées chez des individus captifs immatures (Bradley et al., 1998;
Kakizoe et al., 2007). La population de monocytes représente généralement un faible
pourcentage des leucocytes présents dans le sang périphérique des reptiles sains
(Bradley et al., 1998; Casal and Oros, 2007; Deem et al., 2009; Flint et al., 2010a).
Les pourcentages d’éosinophiles obtenus étaient dans la gamme des valeurs
précédemment publiées chez les tortues caouannes (Bradley et al., 1998; Stamper et
al., 2005; Keller et al., 2004b) ; cependant aucune valeur, qui aurait pu servir de
comparaison, n’est disponible dans l’étude réalisée par Kakizoe et al. (2007). Les
basophiles étaient présents mais en très faible nombre, ce qui a également été
mentionné dans des études ultérieures chez les tortues vertes et caouannes (Work et
al., 1998; Casal and Oros, 2007).
112
Tableau VI. Synthèse des paramètres morphométriques et hématologiques rapportés dans la litérature pour C. caretta et C. mydas
C. mydasa
C. mydasb
C. mydasc
C. mydasd
C. carettae
C. carettaf
C. carettag
38,9 – 107,2
38,9 – 107,2
16,5 – 49,3
45,7 – 77,3
64,55
Longueur SCL (cm)
41 – 59
Poids (kg)
>10
0,8 – 26,4
5,5 – 149
5,5 – 149
1,4 – 26
14,4 – 56,6
41
HCT (%)
17 – 35
18 – 56
13,4 – 53,2
13,4 – 53,2
17 – 45
23 – 38
32
Total WBC (103/µl)
5,9 – 23,6
20 – 60
0,8 – 30,1
2,6 – 29,2
2 – 18,9
5,8 – 20,7
15,8
Lymphocytes (%)
72,5
24 – 86
Lymphocytes (x103/µl)
3,6 – 18,6
Hétérophiles (%)
10,1
Hétérophiles (x103/µl)
0,3 – 3,2
Monocytes/Azurophils (%)
5,8
Monocytes/Azurophils (x103/µl)
0,1 – 1,9
Eosinophiles (%)
12,3
Eosinophiles (x103/µl)
0,7 – 3,2
Basophiles (%)
0
Basophiles (x103/µl)
0–1
65
0,6 – 22,3
0,6 – 22,3
0,1 – 1,8
4,6 – 15
0 –17
9,92
27
0,04 – 6,8
0,4 – 8,3
1,8 – 7,3
1,3 – 8,2
0
3,48
3
0,07 – 3,4
0,07 – 3,4
0 – 0,3
0,17 – 1,5
8 – 37
0,75
6
0,01 – 1,7
0,01 – 2,9
0 – 1,2
0,14 – 2,7
2 – 45
0,88
0
0
0
113
0 – 10-6
0 – 0,38
0
Tableau V. suite,
C. carettah
C. carettai
C. carettaj
C. carettak
C. carettal
C. carettam
Longueur SCL (cm)
59,45
4,5 – 58,2
8,46 – 20,6
67,5 – 95,5
67,5 – 95,5
8,8 – 56,5
Poids (kg)
31,8
0,02 – 26,7
0,11 – 14,4
49 – 90
49 – 90
0,11 – 23,4
HCT (%)
28
16 – 26,2
16,4 – 20,3
Total WBC (103/µl)
14,3
4,7 – 10,2
0,38 – 6,19
Lymphocytes (%)
36
24,6 – 58,6
8,6 – 32,8
Lymphocytes (103/µl)
4,29
1,3 – 5,2
Hétérophiles (%)
60
35,8 –73,3
Hétérophiles (x103/µl)
6,33
2,5 – 5,1
Monocytes/Azurophils (%)
4
0 – 2,2
Monocytes/Azurophils (x103/µl)
1,52
Eosinophiles (%)
2
Eosinophiles (x103/µl)
0,23
Basophiles (%)
0
Basophiles (x103/µl)
0
13,9 – 47,3
2,63 – 31,3
3,67 – 50,9
2,1 – 27,3
41 – 100
0,55 – 15,5
0,64 – 33,9
55,4 – 85,9
2 – 25,3
0 – 41
0,97 – 8,20
0,18– 48,95
2,3 – 4
0 – 2,4
0 – 10
0,05 – 3,22
0,05 – 3,22
1,9 –7
0 – 2,1
0–9
0,09 – 3,45
0,17 – 0,8
17 – 32
0,09 – 3,45
0 – 0,6
0–7
0 – 0,9
114
a
D’après Work et al, 1998 (Unopette method, n=26, immatures sauvages, gamme),
b
D’après Wood and Ebanks, 1984 (n=20-102, animaux en captivité 6 -18 -30 et 45 mois, gamme),
c
D’après Flint et al, 2010 (WBC estimate, n=34-141, mâles immatures sauvages, Intervalle de Reference),
d
D’après Flint et al, 2010 (n = 72 -141, femelles immatures sauvages, Intervalle de Reference),
e
D’après Casal et al, 2009 (Méthode Natt and Herrick, n=69, juvéniles sauvage suite rehabilitation, gamme),
f
Keller et al, 2004b (Natt and Herrick method, n=13, juveniles sauvages, gamme),
g
Stamper et al, 2005 (Natt and Herrick method, n=15, juveniles résidents, médiane),
h
Stamper et al, 2005 (Natt and Herrick method, n=42, juveniles en migration, médiane),
i
D’après Kakizoe et al, 2007 (Méthode Unopette, n=5, animaux captifs 1-36 months of age, gamme de moyennes),
j
D’après Bradley et al, 1998 (Méthode Unopette, n=10, animaux captifs 2-12 months of age, gamme de moyennes),
k
D’après Flint et al, 2010 (WBC estimate, n=34-55, mâles immatures sauvages de grande taille, Intervalle de Reference),
l
D’après Flint et al, 2010 (WBC estimate, n=23-55, femelles immatures sauvages de grande taille, Intervalle de Reference),
m
Notre étude (Méthode Unopette, n=85, animaux captifs 8-56 mois, gamme),
115
116
2. Biochimie plasmatique
Notre étude des paramètres biochimiques plasmatiques a permis de mettre en
évidence plusieurs différences significatives ainsi que les sens de variations telles que
rapportées dans le tableau VI. Les variations des valeurs biochimiques en fonction des
différences d’âge, de poids et de taille des tortues caouannes ont été rapportées dans
plusieurs études antérieures (Bradley et al., 1998; Casal et al., 2009; Deem et al.,
2009; Delgado et al., 2011; Flint et al., 2010a; Gelli et al., 2009; Keller et al., 2004b;
Osborne et al., 2010; Stamper et al., 2005). Les concentrations significativement plus
faibles de protéines totales, mesurées à la fois par réfractométrie et analyseur, chez les
tortues de 8 et 20 mois respectivement sont concordantes avec des études antérieures
qui mentionnent une augmentation relative des protéines totales avec le poids et l’âge
des tortues (Casal et al., 2009; Frair and Shah, 1982; Kakizoe et al., 2007). Une étude
mentionne que la longueur de la carapace (SCL
81 cm) et le poids des tortues
caouannes immatures corrèlent avec les concentrations en protéines totales (Osborne
et al., 2010). Cela n’a pas été objectivé dans notre étude. Les concentrations en
globulines augmentent avec l’âge. Les augmentations relatives à l’âge en
concentration de protéines totales, albumine et globuline chez les animaux captifs
comparées aux individus sauvages peuvent
être associées aux disparités
nutritionnelles, à une stimulation du système immunitaire et/ou un stade reproductif
différent.
Kakizoe et al. (2007) ont décrit une glycémie décroissante avec l’âge chez les
tortues caouannes, ce qui correspond à nos observations (Kakizoe et al., 2007). De
manière tout à fait similaire aux observations effectuées sur des crocodiles du Nil, les
concentrations en cholestérol des tortues de notre étude augmentent avec l’âge
(Morpurgo and Gelman, 1991).
Les activités tissulaires des enzymes ALP, AST et CK ne sont pas spécifiques
d’un tissu donné chez les tortues marines et reptiles terrestres mais sont plutôt
présentes dans divers organes (Wagner and Wetzel, 1999). Ainsi, une augmentation
significative de l’activité d’une des enzymes précédemment citées n’est pas spécifique
d’une lésion d’un tissu donné chez les reptiles mais plutôt indicateur, chez les
individus captifs immatures, d’une phase de croissance tissulaire et/ou d’effets
imputés à la captivité tels que la manipulation et les possibles agressions entre
117
congénères (Innis et al., 2009). Le lien avec une croissance tissulaire a été confirmé
dans notre étude grâce à une prise de poids concomitante et non négligeable.
Les concentrations plasmatiques en créatinine et urée de nos individus
augmentaient graduellement avec l’âge, ce qui correspond aux résultats de Kakizoe et
al. (2007). Ce résultat peut être très probablement associé aux différences de nutrition,
et aux rations chez les animaux de 32 mois versus ceux de 56 mois et peut être ainsi
attribué à l’utilisation de deux aliments commerciaux différents chez les animaux de
32 et 56 mois. Les concentrations en bilirubine étaient en dessous du seuil de
détection de l’analyseur (< 0,1mg/dl) dans tous les groupes d’âge et également par
comparaison avec les autres tortues caouannes juvéniles (Keller et al., 2004b). Cet
analyte est rarement rapporté chez les tortues marines et les autres espèces de reptiles
puisque la biliverdine est le principal pigment biliaire chez ces espèces (Campbell,
2006). L’importance clinique de la bilirubine périphérique chez les reptiles n’est pas
encore éclaircie.
Aucune différence significative n’a été décelée pour le calcium, phosphore,
sodium, chlore et potassium entre les différentes classes d’âge. La moyenne de
calcémie et phosphatémie correspondait aux valeurs rapportées pour des tortues
caouannes juvéniles d’Espagne (Casal et al., 2009), de Caroline du Nord (Keller et al.,
2004b) et pour des individus immatures d’Australie (Flint et al., 2010a). La moyenne
des natrémies était légèrement plus basse que celle précédemment décrite chez des
caouannes immatures (Keller et al., 2004b). La moyenne des kaliémies et chlorémies
se situait dans les gammes de valeurs physiologiques connues pour les tortues marines
(Campbell, 2006).
Ainsi notre étude avait pour but de rapporter des gammes de valeurs
hématologiques et biochimiques pour des tortues caouannes immatures, captives et
saines appartenant à diverses catégories d’âge. La prise de sang constitue un outil
diagnostique indispensable pour le vétérinaire, ainsi ce travail a pour but de fournir un
outil supplémentaire d’intérêt médical dans le soin et les traitements mis en place chez
cette espèce.
118
Tableau VII. Synthèse des analytes biochimiques rapportés dans la litérature pour C. caretta et C. mydas et sens de variation des paramètres de
notre étude.
C. mydasa
C. mydasb
C. mydasc
C. carettad
C. carettae
6,2
Protéine Totale, g/dL
3–5
2,08–6,2
1,5– 3,3 *
2,9– 4,1
2,07
Albumine, g/dL
1 – 2,9
0,69 – 1,75
1,0 – 2,5
C. carettag
4,6– 6,1
d
2,6–5,5
C. carettaf
1,6– 5,6f*
2,9–7,2
1,4–1,9
d
0,56 – 1,37 *
0,7– 3,1
0,8–1,6g*
0,75 – 1,6
2,7– 5,1
1,54 – 4,66
Globuline, g/dL
1,0– 4,0f*
1,6 – 3,3
Créatinine,
0,28 – 0,54
0,1 – 0,2
d
0,44 – 1,13 *
0,10 – 0,5f*
0,46
0,2 – 0,90
Acide urique,
mg/dL
0,7 – 1,4
0,37 – 2,21
0,81 – 2,10
0,14 – 0,96d*
Urée,
mg/dL
0,6 – 1,4
4 –35
0 – 77,03
54,06 – 143,98
41,45– 142,3d*
28 – 74
66,7 – 178,4
97,3 – 185,6
122,0 – 165,0d*
119
0,29 – 2,64
1,0 – 107,0f*
60,8 – 135,6
73,9 – 113,5
110,45
72 –128
0,20 –1,20f*
0,16 – 0,47
5,0 – 13,0
83,98
Glucose,
mg/dL
0,10 – 0,60
0,81
mg/dL
2,12– 5,9
73 – 111
70,3– 136,9f*
77,48 – 160,4
Cholestérol,
189,2 –339,8
409,3
mg/dL
92 – 207
ALP, U/L
7–107
92,7 – 312,7
8,3–37,9
103,5 – 193d*
31–63
53 – 228
7–22
544,7
CK, U/L
181–3145
326–2728,5
145–1802
AST, U/L
99–343
74,1–244,6
396–3175
Amylase, U/L
45,2 – 200f*
400–2,810,6d*
163–1470
221,7 –1016d*
10,5–132,9
81–1,627
319–1742
3–1,899f*
157–2,211
149–318
2 – 255f*
78,7–247,6
2–417f*
P, mg/dL
6,1–10,5
4,95 –11,1
6,19 – 13,3
6,1 – 16,8d*
6,0–9,5
4,1 – 7,9f*
4,9 – 9,9
Ca, mg/dL
5,3–11,3
0,8 – 8,8
5,6 – 8,0
5,96 – 8,5d*
4,3–7,7
5,6 – 8,3f*
4,8 – 8,0
Na, mmol/L
147–174
139,2–157,8
148–162
143,2–154,4d*
150–168
135–175f*
K, mmol/L
4,0–5,1
3,0–7,1
3,5–6,7
3,2–4,48d*
3,5–7,9
3,3–13,9f*
Cl, mmol/L
94–119
100,7–121,1
116–131
103,0–120,6d*
103–128
107–158f*
120
3,2–5,7
Tableau VI, suite,
C. carettah
C. carettai
C. carettaj
C. carettak
C. carettal
2,6– 6
Protéine Totale, g/dL
2,4– 5,9
2– 11i*
2,1– 4
2,9–4,60
1,3 - 2,7
Comparaison et sens de variation
 tortues caouannes immatures sauvages
d, f, h, i, j
a, b, c
ou réhabilitées
et tortues vertes
 tortues caouannes adultes sauvages ou en
d, e, f, g, h, i
réhabilitation
1,1–2,6
1,0–1,4i*
d, e, f, g, h, i, k
Albumine, g/dL
<1,0 – 1,5
0,1 – 0,2
1,0 – 1,6
0,5 –1,2
Globuline, g/dL
1,5– 4,5
0– 2,6i*
1,7– 3,8
0,7 – 1,6
Créatinine, mg/dL
0,1 – 0,2
0,3 – 0,8
0,3 – 0,5
Acide urique, mg/dL
0,3– 3,4
<0,84 – 1,68i*
1– 2,4
0,17 – 1,0
0,30 – 1,10
Urée, mg/dL
25 – 197
5,0 – 188,5i*
62 – 344,5
42,0 – 93,6
16,6 – 51,3
1,5– 3,6
0,01 – 0,11
 tortues caouannes
a, b, c
tortues vertes immatures
c
 tortues de Kemp immatures
 tortues marines sauvages immatures ou
b, c, i, g, k
adultes
 (Gelli et al., 2009),
 caouannes sauvages et immatures de
d, g, h, i, j, k
diverses tailles
e, h, i, j
 tortues caouannes immatures
b
 tortues vertes sauvages + tortues de
c
Kemp convalescents
 tortues vertes immatures en centre de
c
a
réhabilitation + tortues vertes de Floride
d, h, i
 caouannes juvéniles
g
 caouannes adultes immatures
f,
 tortues caouannes immatures sauvages
g, h, i
a, b
Glucose, mg/dL
Cholestérol
76–143
19,8 – 291,9i*
71 – 197
212,3 – 351,3
60 – 200
54,8 – 104,3
65 – 189,0
tortues vertes et Kemp immatures
(Alleman et al., 1992)
 tortues femelles adultes en phase de
f, i
jeûne pendant la saison de reproduction
29,2 – 152,1
 tortues caouannes de taille et poids
121
d, f, i
50,2 – 397,7i*
mg/dL
ALP, U/L
9–74
CK, U/L
281–5,667
AST, U/L
128–355
51–562i*
analogues
a, c
 tortues vertes et de Kemp
51–120
6,4–17,6
83,0 – 2,829,0
<10–844i*
414 – 1,276,0
5,2–9,1
g, h
 tortues caouannes
57,0 – 298,0
13–238
Amylase, U/L
P, mg/dL
18,0 –118,0
3,3–13,4
4,9 – 7,6
4,7–8,85
3,1–7,1
5,4 – 8,2
4,70–7,40
(Casal et Oros, 2007)
8,4 – 17,2
2,8 – 12,4 i*
Ca, mg/dL
5,5–11,4
Na, mmol/L
154–164
135,9–166,2
148,0–156,2
84,0–155,0
K, mmol/L
3,1–5,6
3,7–7,3
2,84–3,92
2,1–4,7
Cl, mmol/L
110–125
100,0–136,0
105,4–118,0
63,0–212,0
D’après Jacobson et al., 2007 (33,5 cm <SCL< 47,3cm, juvéniles, range),
D’après Flint et al., 2010 (n>190, immature de grande taille, Intervalle de Référence),
c
D’après Anderson et al., 2011 (29,4cm<SCL< 47,1cm, gamme),
d
D’après Kakizoe et al., 2007 (n=61, femelles adultes, moyenne n=5, juvéniles *, 1-36 mois, gamme des moyennes),
e
D’après Jacobson et al., 2007 (SCL>60 cm, gamme),25
f
D’après Deem et al., 2009 (femelles en ponte, juvéniles*, gamme),
g
D’après Flint et al., 2010 (n=63, adultes et juvéniles de grande taille, Intervalle de Référence) ,
h
D’après Keller et al., 2004b (n=40, juvéniles sauvages, gamme),
i
D’après Casal et al., 2009 (n=34, femelles adultes sauvages, n=69, juvéniles réhabilités*, gamme),
j
D’après Delgado et al., 2011 (n=21, 19,7 cm, SCL<51,9 cm, juvéniles sauvages, sérum),
k
D’après Stamper et al., 2005 (en migration, 10th et 90th percentiles),
l
Notre étude (n=85, 8-56 mois, gamme)
Valeurs de notre étude dans la gamme, Valeurs de notre étude inférieures vs autres études,Valeurs de notre étude dans la limite inférieure
a
b
122
III. Evaluation des fonctions immunitaires de la tortue caouanne
immature et captive (Caretta caretta).
A. Résultats
1. Profils cellulaires obtenus en cytomètre de flux et caractérisation
morphologique des leucocytes du sang périphérique.
La figure 26 représente un nuage de points (Figure 26A) des cellules
collectées sur Ficoll (Fig. 26B). Les cellules ont été circonscrites électroniquement
(Figure 26A) en se basant sur leur taille relative (FSC) et leur granulosité (SCC) puis
triées par cytomètre de flux afin d’être examinées histologiquement (Fig. 26C et D).
La population lymphocytaire constituait 79,5% ±7 (n=20) du gradient de Ficoll (Fig.
26B), le reste étant des débris cellulaires et membranaires. Les lymphocytes sont des
cellules rondes et mononuclées, possédant peu de cytoplasme bleu-violet. Ce
cytoplasme ne contient pas de granules (Campbell, 2006).
Figure 26. A. Profils obtenus par cytomètre de flux et B. Examen cytologique des cellules sanguines de
tortues caouannes (objectif 40x) collectées sur Ficoll. Noter la complexité (SSC) et taille relative (FSC),
qui sont caractéristiques des lymphocytes de Caretta caretta. (C) Lymphocytes. (D) Débris et
membranes cellulaires.
123
Les sous-populations cellulaires obtenues entre chaque gradient de Percoll
(Fig. 27) ont été triées et isolées par cytométrie de flux. La première couche (L1) se
situait entre le plasma et le gradient à 40% de Percoll, la seconde couche (L2) entre
les gradients à 40 et 45% de Percoll et enfin la troisième couche (L3) été située entre
les gradients à 50 et 55% de Percoll.
La figure 28 montre les nuages de points obtenus par cytométrie de flux
représentatifs des cellules présentes dans les premières et secondes couches (Fig. 28A
et B respectivement), ainsi que les morphologies cellulaires des sous-populations
obtenues par cytologie lors de leur séparation par gradient discontinu de Percoll. Les
divers types cellulaires collectés dans chacun des gradients de Percoll ont été triés par
cytométrie de flux afin de pouvoir examiner leur morphologie cellulaire (Fig. 28C, D
et E). Pour chaque couche de Percoll, vingt mille événements totaux ont été
enregistrés par cytométrie de flux. Le nombre de cellules (moyenne, % du nombre
d’évènements totaux) appartenant à un type cellulaire donné pour chaque couche de
Percoll a été mesuré. Quatre populations ayant une morphologie distincte ont été
définies sur la base de la taille et de la granulosité. Les lymphocytes (Fig. 28E) sont
de petites cellules, les moins granuleuses, tout comme les thrombocytes, alors que les
monocytes (Fig. 28D) sont plus des cellules plus grandes et légèrement plus
granuleuses. Les monocytes sont les plus grandes cellules circulant dans le sang
périphérique des reptiles. Ces cellules sont rondes, possèdent un seul noyau ainsi
qu’un cytoplasme bleu-gris abondant (Campbell, 2006). Les éosinophiles sont les
cellules les plus granuleuses (Fig. 28C). Ce sont de grandes cellules rondes, possédant
des granules cytoplasmiques rose vif et sphériques ainsi qu’un noyau basophile et
périphérique. Leur cytoplasme est bleu pâle (Campbell, 2006).
Les éosinophiles constituaient 11,2% des cellules détéctées par cytométrie de
flux (n=20 animaux) se situant entre le plasma et le Percoll à 40%. Les thrombocytes
constituaient 34,5% des cellules détéctées (n=20) de cette même première couche. Les
monocytes constituaient 12% (n=20) des cellules détectées dans les couches formées
des gradients plasma 40 % de Percoll (première couche) et 40-45% de Percoll
(seconde couche). Finalement, les lymphocytes formaient 65% des cellules (n=27) de
la seconde couche ainsi que 87% (n=11) des cellules de la troisième couche (gradients
50-55% de Percoll) dans laquelle ils étaient majoritaires.
124
Figure 27. Gradients de Percoll discontinus obtenus après centrifugation. Le sang total de tortue
caouanne a été déposé au dessus de plusieurs couches de Percoll de différentes densités allant de 1,053
(40%) à 1,076 g/ml (60% solution stock) afin de former un gradient discontinu.
Figure 28. A. Profils obtenus par cytomètrie de flux des leucocytes sanguins de tortues caouannes
isolés entre les gradients de plasma et 40% de Percoll ainsi que 40-45% de Percoll. Les différentes
populations cellulaires ont été distinguées sur la base de leur taille (FSC) et granulosité (SSC). B.
Examination cytologique d’étalement sur lame des cellules sanguines de tortues caouannes
(microscopie avec objectif 40x) préalablement triées par cytométrie de flux. C. Les éosinophiles sont
granuleux avec un cytoplasme abondant ainsi qu’un grand noyau excentré. D. Les monocytes sont de
grandes cellules, peu granuleuses, tandis que les lymphocytes (E) sont de petites cellules peu
granuleuses.
125
2. Le système immunitaire inné des tortues caouannes
Les données d’au moins quatre expériences indépendantes portant sur la
phagocytose (trois individus par expérience), et portant sur l’explosion respiratoire
(de deux à six individus par expérience) ont été regroupés. Pour les tests portant sur la
fonctionnalité des cellules tueuses, une à deux expériences indépendantes (quatre
individus pour chaque expérience) pour chaque température, milieu de culture et
temps d’incubation testés ont été regroupés.
a. La Phagocytose
La Fig. 29A montre les capacités de phagocytose des sous-populations
leucocytaires. Les monocytes ont été principalement isolés à partir des couches 1 et 2
(Fig. 29A and B). Il n’y avait pas de différences significatives de l’activité
phagocytaire des monocytes (Fig. 29B) entre les couches 1 et 2 pour: l’ingestion
d’une bille ou plus (1+ beads, moyenne= 28,8% et 27,8%, respectivement, p=0,445),
l’ingestion de deux billes ou plus (2+ beads, moyenne=12,7% et 11,4%,
respectivement, p=0,250) et l’ingestion de trois billes ou plus (3+ beads,
moyenne=6,7% et 5,6%, respectivement, p>0,05). La phagocytose (1+ et 2+) était
significativement plus importante pour les monocytes que pour les autres types
cellulaires (Fig. 29B) au sein des couches 1 et 2 (p<0,001). Cependant, il n’y avait pas
de différences significatives de phagocytose entre les monocytes et les éosinophiles
lorsque trois billes ou plus étaient phagocytées (Fig. 29B, p>0,05). Il n’y avait pas de
différences significatives de phagocytose entre les thrombocytes, éosinophiles et
lymphocytes lorsque une bille ou plus était impliquée (p>0,05). La phagocytose des
éosinophiles était légèrement plus importante (p<0,025) que celles des thrombocytes
et lymphocytes (isolées dans la troisième couche) pour deux billes ou plus (6,9% vs
5,7% et 1,3% respectivement) et trois billes ou plus (4,8% vs 2,45% et 0,1%
respectivement).
126
Figure 29. A. Profils obtenus par cytomètre de flux des cellules collectées entre le plasma et 40% de
Percoll et les histogrammes d’activité phagocytaire des éosinophiles et monocytes correspondants. B.
Pourcentage de cellules (éosinophiles, monocytes et lymphocytes) phagocytant une bille ou plus
(1+beads), deux billes ou plus (+ beads) ou trois billes ou plus (3+beads). N=22 pour les cellules
(éosinophiles, thrombocytes, monocytes) isolées entre le plasma et 40% Percoll (L1); N=34 pour les
cellules (lymphocytes et monocytes) isolées entre les gradients 40 et 45% de Percoll (L2) et N=22 pour
les lymphocytes isolés entre les gradients 50 et 55% de Percoll (L3). * Différences significatives pour
tous les types cellulaires sauf les monocytes. ** Différences significatives des éosinophiles.
b. L’explosion respiratoire
Les lymphocytes isolés dans les couches 2 ou 3 ont généré une faible
explosion respiratoire (Fig. 30, moyenne du rapport des cellules stimulées par le PMA
/ cellules non stimulées =1,37 dans la couche 2 et 1,09 pour la couche 3). Les
monocytes isolés dans la couche 2 (Percoll 40-45%) ont montré une explosion
respiratoire statistiquement plus importante (rapport = 2,34) que les lymphocytes
isolés dans les couches 2 and 3 (Fig. 27, p<0,001).
127
Figure 30. Explosion respiratoire in vitro (moyenne ± SD) chez les tortues caouannes juvéniles,
exprimée par le rapport cellules stimulées par le PMA/ cellules non stimulées. n = nombre d’individus.
* Différences significatives (p < 0,001, α=0,99). Les monocytes isolés entre les gradients 40 et 45% de
Percoll (L2) figurent en noir. Les lymphocytes isolés entre les gradients 40 et 45% de Percoll (L2) sont
en gris et les lymphocytes isolés entre les gradients 50 et 55% de Percoll (L3) sont en blanc.
c. L’activité des cellules tueuses naturelles (cellules NK)
La figure 31 montre l’activité des cellules tueuses naturelles en utilisant deux
lignées cellulaires cibles avec des conditions d’incubation différentes et des rapports
cellules effectrices/cellules cibles différents. L’activité des cellules tueuses naturelles
était significativement plus importante vis à vis des cellules cibles YAC-1 que des
cellules cibles K-562 (p≤0,02) pour des rapports E:T (Effector =cellules NK:
Target=cellules cibles) de 100:1 à 25:1. Pour les ratios E:T de 100:1 et 50:1, il n’y
avait pas de différences d’activité des cellules NK entre celles incubées dans le
DMEM ou RPMI (p=0,057). Toutefois pour les dilutions supérieures (25:1 à 6:1), le
milieu de culture avait une influence puisque l’activité des cellules NK était
significativement plus importante pour le RPMI que pour le DMEM (p<0,001). Il n’y
avait pas de différence significative concernant l’activité des cellules NK vis à vis des
cellules cibles YAC-1 lorsque le RPMI était utilisé comme milieu de culture, à 28°C
que l’incubation était de 2,5 h ou 3 h et ce pour des rapports E:T de 100:1 à 6:1
(p=0,163). Une activité tueuse plus importante pour des rapports E:T allant de 100:1 à
6:1 a été obtenue à 28°C comparé à 37°C (p<0,04) et ce pour une incubation de 2, 5 h
ou 3 h.
128
Figure 31. Activité des cellules NK in vitro (moyenne ± SD) mesurée en fonction des cellules cibles
tuées (lignée cellulaire sensible au cellules NK) par les cellules NK (cellules effectrices). Divers
paramètres ont été testés (milieu de culture, température, cellules cibles et durée d’incubation)
n=nombre d’individus. *Différences significatives entre les cellules cibles YAC-1 et K562 dans le
DMEM, **Différences significatives entre 28 et 37˚C soit après 2h30 ou 3h d’incubation dans le RPMI.
***Différences significatives entre les DMEM et le RPMI à 28˚C après 2h30 d’incubation. T-tests (p <
0,05, α=0,8).
3. Réponse des lymphocytes de tortue caouanne à une stimulation
Les données de neuf expériences indépendantes portant sur la prolifération
lymphocytaire (trois individus par expérience) ont été regroupés. La figure 32 montre
les résultats des tests de prolifération lymphocytaire obtenus lors de la stimulation par
des agents mitogènes. La phytohémagglutinine PHA-P et la concanavaline A ConA
induisaient une augmentation statistiquement significative de la prolifération des
lymphocytes, comparée aux cellules non stimulées et ce pour des concentrations de 1,
2, 5 et 10 µg/ml (resp. p<0,001 et p<0,02). Toutefois à 20 µg/ml aucune prolifération
significative n’avait été rapportée, pour aucun des deux mitogènes testés stimulant la
prolifération des lymphocytes T. PHA-P a induit un changement plus important de
l’indice de prolifération que ConA. Les concentrations optimales pour le PHA étaient
1 et 2 µg/ml, tandis qu’elles étaient de 5 et 10 g/ml pour ConA.
Les cellules stimulées avec le « pokweed mitogen » (PWM ; Phytolacca
americana) à une concentration de 1, 2, 5, 10 et 20 µg/ml avaient un indice de
129
prolifération significativement plus important que pour les cellules non stimulées
(p<0,01), et l’amplitude de changement était comparable à ce qui a été obtenu lors
d’une stimulation avec ConA pour des concentrations similaires. Enfin, une
concentration de 1 µg/ml de LPS induisait une augmentation modeste mais
significative de la prolifération cellulaire par comparaison aux cellules non stimulées
(p=0,002).
Figure 32. Prolifération lymphocytaire in vitro après stimulation par les agents mitogènes. Moyenne ±
SD de 9 expériences réalisées en triplicat. Différences statistiquement plus élevées que les controles
*p<0,05,**p<0,01, ***p<0,001.
B. Discussion
Notre étude portait sur l’optimisation, la validation et la mesure de fonctions
du système immunitaire inné et acquis chez les tortues caouannes juvéniles. Dans
notre étude, les monocytes possédaient une activité phagocytaire et une explosion
respiratoire plus importantes que les autres leucocytes. Les éosinophiles ont montré
une capacité à phagocyter. Ce travail décrit pour la première fois l’activité des
cellules tueuses (NK) chez les tortues marines. La lignée cellulaire YAC-1 semble
être la cible la plus adéquate. Enfin, nous avons également confirmé que les
leucocytes du sang périphérique des tortues marines pouvaient produire une réponse
130
lympho- proliférative à une diversité d’agents mitogènes, comme cela a été largement
décrit chez les mammifères.
Afin de s’affranchir de l’absence de réactifs disponibles nécessaires à
l’identification des sous-populations de cellules immunitaires chez les reptiles, les
cellules immunitaires circulant dans le sang périphérique ont été identifiées grâce à
l’utilisation conjointe du cytomètre de flux et la caractérisation morphologique. Leurs
fonctions ont ensuite été explorées. Contrairement aux érythrocytes des mammifères
qui peuvent être lysés par choc osmotique avec du chlorure d’ammonium, les
érythrocytes des tortues caouannes sont nucléés et donc osmotiquement plus résistants
(Aldrich et al., 2006). Les sous-populations de leucocytes sanguins ont été isolées,
grâce à l’utilisation d’une superposition de gradients de Percoll discontinus, triées et
analysées. Comme précédemment décrit, la population de granulocytes de faible
densité migrant entre le plasma et 40% de Percoll a été identifiée (Harms et al., 2000).
Les éosinophiles étaient la principale sous-population de granulocytes isolée. Les
monocytes migraient aussi bien entre le plasma et 40% de Percoll qu’entre 40 et 45%
de Percoll, tandis que les lymphocytes ont été retrouvés principalement entre les
gradients de 50-55% de Percoll comme précédemment décrit (Harms et al., 2000).
Les érythrocytes étaient présents au fond du gradient. Chaque population de cellules
identifiée par cytométrie de flux (basé sur la taille et la granulosité) a également été
étudiée par cytologie afin d’identifier le type cellulaire.
1.
Fonctions du système immunitaire inné chez les tortues
caouannes
Les mesures de phagocytose de différentes sous-populations de leucocytes ont
été déterminées de façon simultanée grâce au cytomètre de flux. Les monocytes
possédaient l’activité phagocytaire combinée à une explosion respiratoire la plus
importante. Chez les reptiles, les monocytes constituent généralement la première
ligne de défense dans la réponse immune. Tandis que les monocytes ont été rapportés
comme participant aux interactions entre antigènes spécifiques et immunoglobulines,
impliquant particulièrement les IgM et IgY (Campbell, 2006), la phagocytose dans ce
cas s’est avérée être indépendante des immunoglobulines puisque les billes en latex
ne sont pas opsonisées. En effet, les monocytes peuvent phagocyter des particules non
préalablement opsonisées et ce via un processus direct non spécifique, ce qui diffère
131
de la phagocytose médiée par les récepteurs de la fraction Fc des immunoglobulines
(Liao et al., 1994). Bien que les granulocytes les plus nombreux chez les tortues
caouannes soient les hétérophiles (Bradley et al., 1998; Kakizoe et al., 2007;
Rousselet et al., 2013a), nous n’avons pu les isoler correctement malgré l’utilisation
de protocoles spécifiques des hétérophiles aviaires (Andreasen et al., 1989; Latimer et
al., 1989). Il existe plusieurs descriptions montrant que les hétérophiles adhèrent au
verre, nécessitant des traitements préalables (Andreasen et al., 1990, Brooks et al.,
1996) que nous avons effectué sans succès.
Les éosinophiles ont montré une activité phagocytaire plus faible que les
monocytes. L’étude réalisée a montré que les éosinophiles sont capables de
phagocyter les billes de latex, ce qui corrobore avec leur capacité de phagocytose de
complexes immuns (Campbell, 2006). Bien que les éosinophiles des mammifères sont
connus pour jouer un rôle dans les infections parasitaires en produisant des radicaux
peroxyde et superoxyde (Coico et al., 2009), la capacité des éosinophiles des tortues
marines à générer une explosion respiratoire en plus de la phagocytose requière des
études supplémentaires. Chez les tortues caouannes juvéniles en bonne santé, les
éosinophiles constituent la population de granulocytes minoritaires (Rousselet et al.,
2013a), ce qui rend leur évaluation fonctionnelle difficile car un grand nombre
d’éosinophiles est nécessaire pour réaliser le test d’explosion respiratoire.
Dans notre étude, la phagocytose a été mise en évidence à la fois pour les
lymphocytes et les thrombocytes. Les thrombocytes des reptiles possèdent les mêmes
capacités d’hémostase et de cicatrisation que les plaquettes des mammifères (Sypek
and Borysenko, 1988). Ils sont en plus capables de phagocyter les bactéries chez les
oiseaux (Bertram et al., 1998; Wigley et al., 1999) et d’autres espèces de reptiles
(Frye, 1991). Tandis que les lymphocytes sont habituellement impliqués dans le
système immunitaire acquis, une étude a mis en évidence les capacités phagocytaires
des lymphocytes T
humains (Wu et al., 2009) de la même manière que les
lymphocytes B chez les téléostéens et Xenopus (Li et al., 2006). Cependant, notre
étude n’exclut pas la possibilité que les billes aient pu s’attacher à la membrane
cellulaire externe, plutôt que d’avoir été internalisées.
L’activité des cellules tueuses constitue un autre mécanisme de défense non
spécifique. Les cellules NK forment une population hétérogène CD3 négative, sans
récepteur T, constitués de grands lymphocytes qui expriment couramment des
132
marqueurs de surface tels CD16 et CD56 chez l’homme (O’Shea and Ortaldo, 1992).
Ces cellules se définissent par leur fonction, i.e. la lyse de cellules infectées par un
virus ou de cellules tumorales. L’activité des cellules NK n’est pas restreinte par le
complexe majeur d’histocompatibilité et ne requière pas une sensibilisation préalable.
Les cellules NK partagent des mécanismes tueurs avec les lymphocytes T CD8+
cytotoxiques et produisent des cytokines de manière similaire aux lymphocytes T
CD4+ helper (Boysen and Storset, 2009). Les interleukines IL-2, IL-15, IL-21 et
l’interféron de type I (IFN- / ) augmentent l’activité cytotoxique des cellules NK
(Boysen and Storset, 2009). Une augmentation de l’activité des cellules NK en
réponse à l’interleukine IL-2 a été mise en évidence chez diverses espèces (Henney et
al., 1981) incluant les belugas et les phoques communs (Ross et al., 1996; De Guise et
al., 1997). L’activité des cellules NK est fortement conservée parmi les vertébrés.
Cette activité a précédemment été détectée chez les tortues d’eau douce (Munoz et al.
2000) contrairement aux tortues vertes (McKinney and Bentley, 1985). Dans notre
étude, la lignée cellulaire YAC-1 de lymphomes T murins constitue la meilleure cible
comparée à la lignée érythroleucémique humaine K-562. L’activité cytotoxique la
plus importante a été obtenue dans le milieu de culture RPMI à 28˚C, paramètres
identiques pour l’évaluation de la prolifération lymphocytaire. Le temps d’incubation
optimal de mise en présence des cellules NK avec leur cible était de deux heures et
demi ou 3 h. Ce laps de temps est similaire à celui des amphibiens anuriens, tilapias,
poissons chat, pour lesquels l’activité cytotoxique NK/ non spécifique a été rapportée
avec les cellules YAC-1 comme cellules cibles (Evans and Cooper, 1990).
2.
La prolifération lymphocytaire
La prolifération lymphocytaire mesure seulement une étape unique et précoce
au sein de la réponse immunitaire. La prolifération lymphocytaire (LP) est fortement
diminuée chez les tortues vertes malades (Work et al., 2001) et a été montré comme
étant corrélée positivement aux contaminants organo-chlorés ainsi que les dérivés du
mercure (Day et al., 2007; Keller et al., 2004b). La prolifération lymphocytaire sous
stimulation aux mitogènes a précédemment été étudiée chez les reptiles terrestres et
aquatiques (Farag and El Ridi, 1986; Burnham et al., 2005 ; Munoz et al., 2003) ainsi
que chez les tortues marines (Work et al., 2000; Cray et al., 2001; Keller et al., 2005a,
133
2006). Dans notre étude, les PBMC ont été exposées à quatre mitogènes pour des
concentrations de 1 à 20 µg/ml pendant 96h, ce qui avait déjà été rapporté comme
pouvant induire une mitogènèse chez les lymphocytes de tortues (Ulsh et al., 2001,
Munoz et al., 2003, Keller et al., 2005a). Les indices de stimulation sont plus élevés
pour le PHA que pour la ConA, avec cependant des variations entre animaux
importantes. Le LPS utilisé dans notre étude est celui produit par le sérotype 0127:B8
de E coli. Etant donné que ce sérotype a été le seul testé, les auteurs ne savent pas s'il
était le plus approprié pour induire la prolifération des lymphocytes B. L’utilisation
d’un test ELISA colorimétrique BrdU au lieu des tests impliquant la thymidine tritiée,
rend la comparaison directe avec les résultats précédemment obtenus dans la
littérature très difficile (Keller et al., 2005a). Les études des paramètres
hématologiques effectuées sur ces individus (Rousselet et al., 2013a) ainsi que
d’autres tortues caouannes juvéniles (Bradley et al., 1998; Kakizoe et al., 2007)
démontrent des variations du nombre de leucocytes ainsi que des hématocrites en
fonction de l’âge des individus, ce qui peut avoir comme conséquence la modulation
des fonctions du système immunitaire des ces animaux comparativement à des
animaux plus âgés. Notre étude rapporte une prolifération des lymphocytes B et T
chez les tortues caouannes ce qui concorde avec des études précentes chez la même
espèce (Keller et al., 2005a) ainsi que chez les tortues vertes (Herbst and Klein, 1985;
McKinney et al., 1985; Munoz et al., 2009; Work et al., 2000). Le PHA-P était le
mitogène induisant la prolifération la plus importante tandis que LPS induisait la
réponse la plus faible avec la ConA et le PWM intermédiaires. La réponse
proliférative mesurée successivement à une stimulation par des mitogènes, fournit une
preuve indirecte de l’existence des populations de lymphocytes B et T chez les
reptiles.
C. Conclusion
Le système immunitaire constitue un réseau complexe d’interaction entre
types cellulaires identiques ou différents et de messages faisant intervenir entre autres
les cytokines. Dans cette étude, un nombre de tests précédemment utilisés chez les
mammifères marins (DeGuise et al. 1995a, 1996, 1997) ont été optimisés afin
d’évaluer le type puis la fonction des divers leucocytes chez la tortue caouanne.
Considéré dans sa globalité, une batterie de tests représentatifs de divers aspects du
134
système immunitaire constitue un outil de qualité, permettant d’aider à identifier
l’intégrité des mécanismes de défense dont dispose l’individu. Des études ultérieures
peuvent inclure le développement d’anticorps monoclonaux spécifiques d’un type
cellulaire chez la tortue caouanne ainsi que l’évaluation de niveau d’expression des
cytokines, notamment suite à l’activation des lymphocytes. Ces deux axes permettront
de mieux caractériser les mécanismes sous-jacents des fonctionnalités du système
immunitaire chez les chéloniens.
L’utilisation des outils optimisés dans notre étude donnera de nouvelles pistes
sur les interactions entre le système immunitaire et la susceptibilité aux pathogènes,
comme le fibropapillomavirus (Work et al., 2001). Cela s’applique également aux
individus en centre de réhabilitation, débilités et/ou souffrant d’anémie non
régénérative consécutive à une infection systémique et/ou inflammation sèvere. Cette
thématique a donné lieu à une étude préliminaire, présentée sous forme de poster,
ayant fait l’objet d’un financement de la bourse aux idées Mérial ainsi que de la
Morris Animal Foundation (Annexe 5). Ainsi, l’utilisation de ces tests combinés à
l’hématologie pourrait nous renseigner sur l’état d’évolution du patient en cours de
traitement, et ce à travers la réponse du système immunitaire face au traitement
médical et ainsi potentiellement permettre un ajustement de la prise en charge
médicale chez les individus malades. Enfin, ce travail est un outil à l’investigation des
actions immunotoxiques de certains polluants émergents, décrits comme affectant les
tortues marines (Keller et al., 2004b). Cela va être développé au cours de la partie
suivante.
135
IV. Modulation du système immunitaire inné par les PCBs
A. Résultats
Dans notre étude, nous avons évalué les effets de trois PCBs (PCB-105, -138
et -169), sur la phagocytose et l'activité des cellules tueuses naturelles à partir de
leucocytes de tortues caouannes juvéniles. Les tests utilisés ont été préalablement
validés dans cette espèce (Rousselet et al., 2013b).
Le pourcentage de PBMC viables après exposition à chacun des PCB-105, 138 et -169, pendant 96 heures a été déterminé par cytométrie de flux. Il n'y avait
aucune différence significative concernant la viabilité des cellules exposées par
comparaison aux cellules non exposées. La viabilité était supérieure à 90%.
1.
Effets des PCBs-105 et 138 sur la phagocytose
Les résultats d'au moins trois expériences de phagocytose indépendantes ont
été réunis (trois individus par expérience). Le PCB-105 considéré "dioxine-like",
induisait une augmentation de la phagocytose (1+ beads, 2+ beads et 3+ beads) pour
les éosinophiles (Fig 33) de tortues caouannes consécutivement à leur exposition in
vitro pendant 3 hr et cela contrairement au PCB-138 (Fig. 34). Cette augmentation
était dose-dépendante. Une corrélation positive entre l'activité phagocytaire et la
concentration en PCB-105 a été déterminée pour 1+ beads (Corrélation de Pearson, r
= 0,66, p = 5,2x10-6), 2+ beads (r = 0,59, p = 4,2x10-5) et 3+ beads (r = 0,56, p =
1,4x10-4). Le PCB-105 induisait une augmentation significative aux concentrations de
10 et 15 ppm (p<0,002) tandis que pour le PCB-138 la phagocytose augmentait
significativement pour 15 ppm uniquement (p<0,04).
136
Figure 33. A. Profils obtenus par cytométrie de flux des cellules isolées par gradient de Percoll. B.
Histogramme d’activité phagocytaire des granulocytes correspondants (entourés sur le diagramme de
gauche). C. Une corrélation positive entre l'activité phagocytaire et la concentration en PCB-105 a été
déterminée pour 1+ beads (M1, Corrélation de Pearson, r = 0,66, p = 5,2x10-6), 2+ beads (M2, r = 0,59,
p = 4,2x10-5) et 3+ beads (M3, r = 0,56, p = 1,4x10-4). * Augmentation significative aux concentrations
de 10 et 15 ppm (p<0,002).
Figure 34. Activité phagocytaire en fonction de la concentration en PCB-138. Le PCB-138 induisait
une augmentation significative aux concentrations de 15 ppm (p<0,04)
137
2.
Effets des PCBs 105, 138 et 169 sur l’activité NK
Les résultats de l'activité NK étudiée chez quatre individus pour chaque PCB
ont été combinés. Les cellules YAC-1 ont précédemment été définies comme les
cibles des PBMC de tortue caouanne les plus adéquates. Les PBMC ont été exposées
in vitro à chacun des trois PCBs puis la capacité des cellules tueuses naturelles à lyser
les cellules YAC-1 a été déterminée. Les cellules NK montraient une capacité de lyse
statistiquement plus faible (Fig. 35) après exposition aux PCB-105 et 138 et ce aux
concentrations de 15 et 20 ppm (p<0,01) pour un rapport de 50:1 (NK: cellules cibles).
L’exposition aux PCBs n'affectait pas la viabilité des cellules NK. L'activité NK
n'était pas modulée par le PCB-169. Une corrélation négative entre l'activité NK et la
concentration croissante du PCB-105 (Corrélation de Pearson, r = -0,585, p = 0,0027)
ainsi que du PCB-138 (r = -0,557, p = 0,0087) a été déterminée.
Figure 35. Activité cytotoxique des cellules NK avec les cellules YAC-1 comme cellules cibles et ce
pour un rapport de 50 :1. Activité NK statistiquement plus faible après exposition aux PCB-105 et 138
à 15 et 20 ppm (p<0,01). Corrélation négative entre activité NK et concentration croissante des PCB105 (Corrélation de Pearson, r = -0,585, p = 0,0027) et PCB-138 (r = -0,557, p = 0,0087).
138
B. Discussion
Il s'agit de la première étude portant sur la modulation de deux fonctions
majeures du système immunitaire inné (phagocytose et activité NK) par les PCBs
chez la tortue caouanne. Les effets biologiques des polluants sur les tortues marines
constituent une préoccupation actuelle critique, listés parmi les 20 priorités de
conservation de ces espèces devant être adressées (Hamann et al., 2010).
Les premières mesures de concentrations de PCBs chez les tortues marines
datent des années 90. Une littérature croissante, témoignant d’une préoccupation
environnementale accrue chez ces espèces nous permet désormais d’avoir plus de
recul sur le sujet. Les concentrations en PCBs ont été mesurées dans de nombreux
organes et pour chacune des 7 espèces de tortues marines. Le tissu adipeux, le foie et
maintenant les œufs (van de Merwe et al., 2009; Alava et al., 2011 et Keller et al.,
2013) sont les tissus biologiques les plus étudiés pour la mesure de ces composés.
Trois auteurs rapportent à ce jour les concentrations de PCB mesurées à partir du
plasma des tortues caouannes (Camacho et al., 2013, 2014; Keller et al., 2004a, 2006,
Ragland et al., 2011). L’utilisation de ce fluide biologique comme matrice de mesure
des PCBs est intéressante car les prises de sang constituent un acte non léthal. Il a été
montré que les PCBs se répartissaient très majoritairement dans le plasma et non dans
les érythrocytes de tortues marines (Keller et al. 2004a).
Le PCB-138, composé hexachloré non coplanaire et marqueur de la
contamination environmentale s’avère être le congénère le plus abondant chez les
tortues caouannes (Camacho et al., 2014; Gardner et al., 2003; Keller et al., 2004b,
2006; Lazar et al., 2011; Oros et al., 2009, 2013; Storelli et al., 2007). D’autres PCBs
coplanaires, tels que les PCB-105 (mono-ortho) et PCB 169 (non-ortho) ont
également été mesurés chez la tortue caouanne (Alava et al., 2011; Camacho et al.,
2013; Storelli et al., 2007; Richardson et al., 2009). Leur détection est importante car
ils sont considérés comme stéréoisomères de la dioxine, possédant des mécanismes
d'actions identiques chez les mammifères, et ce par liaison au récepteur AhR.
Comparativement à d’autres espèces marines cotières (mammifères marins,
elasmobanches, alligators et oiseaux), les concentrations de PCBs sont souvent d’un à
plusieurs ordres de grandeur de différence pour les tortues marines (Keller et al.,
2014). En effet, les concentrations sont beaucoup plus faibles (Camacho et al., 2013;
139
Keller et al., 2004b) ce qui peut s’expliquer grâce à à leur position dans le réseau
trophique et type d’alimentation. Chez les tortues marines, les tortues de Kemp se
situent en haut de ce réseau avec une alimentation carnée, suivi des tortues caouannes
qui sont omnivores et avec un habitus opportuniste. Cela tendrait à favoriser la
bioaccumulation des contaminants (Bjorndal, 1997). Enfin viennent les tortues luth et
vertes se situant au bas de ce réseau. L'ingestion de débris notamment plastifiés
contribue à la variabilité de teneur en PCBs chez ces animaux (Bjorndal, 1997). Les
concentrations peuvent être un million de fois plus élevée que celles de la mer
environnante (Mato et al., 2001).
Bien que pour notre étude, le nombre de congénères testés soit réduit, elle
constitue néanmoins une première approche. Les concentrations en PCBs utilisées
s’échelonnaient de 0,5 à 20 ppm. Les concentrations de dix et 15 ppm de PCB-105
induisaient une augmentation significative de la phagocytose des éosinophiles. Cette
augmentation était dose-dépendante et une corrélation positive a été déterminée. Le
PCB-138 induisait une augmentation significative de la phagocytose pour 15 ppm
uniquement et ce sans relation dose-dépendante. L’exposition aux PCB-105 et 138 a
entraîné une diminution significative de l’activité lytique des cellules NK et ce aux
concentrations de 15 et 20 ppm. Une corrélation négative entre l'activité NK et la
concentration croissante des PCB-105 et PCB-138 a été objectivée. Contrairement
aux deux PCBs précédents, les PCB-169 n’a pas modulé l'activité NK.
Les concentrations de PCBs utilisées dans notre étude sont identiques à celles
précédemment utilisées pour étudier et comparer les effets immunotoxiques des
composés organochlorés chez diverses espèces de mammifères marins (Levin et al.,
2007a). Toutefois, la concentration plasmatique de la somme des PCBs chez les
tortues caouannes se situe en deça. En effet, la gamme de valeur s’étale de 27 ± 42
ng/ml soit 0,027 ± 0,04 ppm (Camacho et al., 2014), à 5560 pg/g soit 5,56 ppm (sang
total, moyenne, Keller et al., 2004a) et 7267 pg/g soit 7,3 ppm (plasma, médiane,
Ragland et al., 2011). Au moment de notre étude (2009), seule le travail de Keller et
al., portant sur le sang total était accessible. Nous nous sommes basés sur les travaux
réalisés chez les mammifères marins, en y incluant la valeur de 5ppm (Keller et al.,
2004a) dans notre gamme de concentration. Chez les mammifères, l’exposition in
vitro aux PCBs entraînent généralement une immunosuppression pour des
140
concentrations correspondant à celles de fin de gamme pour notre étude (13.5
μg/ml=13.5 ppm). Chez de nombreux vertébrés, les PCBs peuvent déclencher une
augmentation de certaines fonctions pour de faibles concentrations alors que ces
même composés vont induire une diminution pour des concentrations plus fortes
(Keller et al., 2005b). Une augmentation de certaines fonctions du sytème
immunitaire a été observée chez le rat pour des concentrations faibles (0,005 μg/ml)
engendrant une augmentation de la prolifération lymphocytaire chez la tortue
caouanne (Keller et al., 2005b). Toutefois, dans notre étude les concentrations
induisant des changements significatifs des fonctions du système immunitaire inné
étaient bien plus élevées que les concentrations mesurées actuellement dans le sang de
ces animaux.
La signification biologique exacte des changements rapportés dans notre étude
portant sur une exposition in vitro des cellules isolées à partir de sang total est
difficile à évaluer. En effet, les animaux « sauvages » sont exposés à une variété de
polluants et contraintes environmentales (température, ressources alimentaires,
interactions négatives, maladies) qui sont autant de facteurs difficiles à transposer
chez des animaux maintenus captifs. Ainsi, dans le but de s’approcher d’une réalité
biologique, il serait nécessaire de pouvoir réaliser cette même étude (utilisation de
sang) sur des animaux sauvages, capturés puis relachés afin de mesurer les fonctions
innées du système immunitaire simultanément aux mesures de PCBs et autres
polluants organiques.
Enfin les animaux utilisés dans notre étude étaient jeunes, en bonne santé et
maintenus captifs. L'eau de mer des bassins individuels dans lesquels ils sont
maintenus est issue de la filtration de l'eau de mer du Golf du Mexique (Galveston,
TX, USA). Bien qu'au moment de l’étude celle-ci n'était pas encore affectée par la
marée noire du Deepwater Horizon (BP), aucune mesure de PCBs potentiellement
présents dans le plasma des animaux n'a été réalisée. Ces limitations sont directement
liées à plusieurs paramètres que sont 1/ le financement nécessaire à la poursuite de ce
projet, 2/ le temps et 3/ la mobilisation de personnel. En effet, concernant le facteur
temporel, deux études publiées ont été réalisées en une année scolaire ainsi que cette
étude préliminaire. Les délais d'obtention des permis fédéraux et IACUC sont longs,
se comptant en mois.
141
142
Conclusion
Les tortues caouannes (Caretta caretta) sont menacées et figurent sur la
liste rouge de l’IUCN des espèces en danger d’extinction. Leurs caractéristiques
biologiques ainsi que les risques auxquels ces animaux sont exposés, notamment
la pollution chimique, en font des animaux sentinelles de l’environnement marin.
Parmi les nombreux polluants organiques, les concentrations de
polychlorobiphényles (PCBs) dans divers organes et fluides sont élevées et sont
associées à des dysfonctionnements de nombreuses fonctions organiques et
hormonales, et du système immunitaire en particulier. Face à l’importance
croissante de la conservation des espèces menacées, associée à l’implication des
vétérinaires travaillant dans des centres de réhabilitation, la recherche
concernant la pathologie variée des tortues marines est devenue nécessaire.
Les paramètres hématologiques et biochimiques constituent des
indicateurs pronostiques de premier choix afin d’évaluer l’état de santé global de
animaux, y compris lors d’exposition à des polluants environnementaux.
Cependant ils ne permettent pas d’évaluer l’aspect fonctionnel du système
immunitaire qui constitue une interface entre l’animal et son environnement.
Nous avons donc déterminé 33 paramètres chez cinq classes d’âge
successives de tortues caouannes juvéniles et captives afin d’estimer la
variabilité inter-classes pour certains de ces paramètres. Ce travail visant à
déterminer les valeurs de référence pour ces 33 paramètres a constitué un outil
fondamental pour objectiver les dysfonctionnements et suivre les soins et
traitements mis en place chez les tortues échouées. Les mêmes animaux pour
lesquels les analyses hématologiques et biochimiques ont été réalisées, ont été
utilisés pour l’évaluation du système immunitaire. Le second objectif de ce
travail était de développer et d’optimiser des tests permettant l’exploration
fonctionnelle du système immunitaire inné et acquis. En cytométrie de flux, nous
avons isolé, à l’exception des hétérophiles, chacune des populations cellulaires
sanguines, à savoir les lymphocytes, les monocytes et les éosinophiles et
confirmé leur identité par étalement sur lame. Cette technique nous a permis de
nous affranchir de l’absence de marqueurs membranaires disponibles chez les
chéloniens. Parmi les lymphocytes, nous avons pu confirmer l’existence de deux
populations de lymphocytes, B et T chez la tortue caouanne, grâce à l’utilisation
de mitogènes spécifiques. Concernant la composante innée, nous avons mis en
évidence pour la première fois dans cette espèce, une activité « natural killer »
(NK), confirmé l’importance de la phagocytose portée par diverses populations
cellulaires et montré l’influence de paramètres extrinsèques sur ces deux
activités.
Une fois ces tests validés, nous les avons utilisés pour évaluer les effets de
trois PCBs (PCB-105, -138 et -169) sur le système immunitaire inné des tortues
caouannes. Nous avons mis en évidence une modulation de la phagocytose et de
l’activité des cellules tueuses naturelles. Cette étude pionnière, constituant une
première approche des effets des PCBs sur le système immunitaire des tortues
caouannes, devra être confirmée par des études ultérieures. Les concentrations
de PCBs devront être mesurées directement à partir du plasma des animaux
sauvages, puis des tests fonctionnels du système immunitaire pourront être
143
réalisés ex vivo. Pour des animaux captifs, les résidus de PCBs sanguins seront
mesurés puis les tests fonctionnels précédemment cités seront utilisés après
exposition in vitro.
Ces tests pourront servir dans un but de suivi sanitaire des animaux en
centre de réhabilitation, afin de savoir si l’individu répond correctement au
traitement et permettre ainsi l’amélioration de la prise en charge chez ces
individus afin d’aboutir à leur ré-introduction dans le milieu naturel.
Thèse de Mme Estelle ROUSSELET-RUSSO
144
BIBLIOGRAPHIE
Aguilar, A., and Borrell, A. 1994. Abnormally high polychlorinated biphenyl levels in
striped dolphins (Stenella coeruleoalba) affected by the 1990–1992
Mediterranean epizootic. Science of the Total Environment, 154(2), 237-247.
Aguirre, A.A., Balazs, G.H., Zimmerman, B., Galey, F.D., 1994. Organic
contaminants and trace metals in the tissues of green turtles (Chelonia mydas)
afflicted with fibropapillomas in the Hawaiian islands. Marine Pollution
Bulletin 28, 109-114.
Aguirre, A.A., Lutz, P.L., 2004. Marine Turtles as Sentinels of Ecosystem Health:
Is Fibropapillomatosis an Indicator? EcoHealth 1, 275-283.
Aguirre, A.A., Gardner, S., Marsh, J., Delgado, S., Limpus, C., Nichols, W., 2006.
Hazards Associated with the Consumption of Sea Turtle Meat and Eggs: A
Review for Health Care Workers and the General Public. EcoHealth 3, 141153.
Alava, J.J., Keller, J.M., Wyneken, J., Crowder, L., Scott, G., Kucklick, J.R., 2011.
Geographical variation of persistent organic pollutants in eggs of threatened
loggerhead sea turtles (Caretta caretta) from southeastern United States.
Environ Toxicol Chem 30, 1677-1688.
Aldrich, K., Saunders, D.K., Sievert, L., Sievert, G., 2006. Comparison of erythrocyte
osmotic fragility among amphibians, reptiles, birds and mammals.
Transactions of the Kansas academy of science 109, 149-158.
Alleman, A. R., E. R. Jacobson, and R. E. Raskin. 1992. Morphologic and
cytochemical characteristics of blood cells from the desert tortoise (Gopherus
agassizii). Am. J. Vet. Res. 53: 1645-1651.
Andreasen, C.B., Latimer, K.S., 1989. Separation of avian heterophils from blood
using Ficoll-Hypaque discontinuous gradients. Avian Dis. 33, 163-167.
Andreasen, C.B., Latimer, K.S., Steffens, W.L., 1990. Evaluation of chicken
heterophil adherence. Avian Dis. 34, 639-642.
Anderson, E. T., L. J. Minter, E. O. Clarke 3rd, R. M. Mroch 3rd, J. F. Beasley, and C.
A. Harms. 2011. The Effects of Feeding on Hematological and Plasma
Biochemical Profiles in Green (Chelonia mydas) and Kemp's Ridley
(Lepidochelys kempii) Sea Turtles. Vet. Med. Int. 890-829.
145
Arthur, K., Shaw, G., Limpus, C., and Udy, J. A review of the potential role of
tumour-promoting compounds produced by Lyngbya majuscula in marine
turtle fibropapillomatosis. African Journal of Marine Science 28(2): 441-446,
2006.
Baker, J.D., C.L. Littnan, and D.W. Johnston. 2006. Potential effects of sea level rise
on the terrestrial habitats of endangered and endemic megafauna in the
Northwestern Hawaiian Islands. Endangered Species Research 2:21-30.
Bergeron, J.M., Crews, D., McLachlan, J.A., 1994. PCBs as environmental estrogens:
turtle sex determination as a biomarker of environmental contamination.
Environ Health Perspect 102, 780-781.
Bertram, E.M., Jilbert, A.R., Kotlarski, I., 1998. Characterisation of duck
thrombocytes. Res Vet Sci. 64(3):267-70.
Bishop, C.A., Ng, P., Pettit, K.E., Kennedy, S.W., Stegeman, J.J., Norstrom, R.J.,
Brooks, R.J., 1998. Environmental contamination and developmental
abnormalities in eggs and hatchlings of the common snapping turtle (Chelydra
serpentina serpentina) from the Great Lakes-St Lawrence River basin (19891991). Environ Pollut 101, 143-156.
Bjorndal, K.A. 1997. Foraging ecology and nutrition of sea turtles. In: The Biology of
Sea Turtles Lutz, P.L. and J.A. Musick (editors). CRC Press.
Boca
Raton, Florida. Pages 199-231
Bjorndal, K.A., A.B. Bolten, T. Dellinger, C. Delgado, and H.R. Martins. 2003.
Compensatory growth in oceanic loggerhead sea turtles: response to a
stochastic environment. Ecology 84(5):1237–1249.
Bradley, T.A., Norton, T.M., Latimer, K.S., 1998. Hemogram values, morphological
characteristics of blood cells and morphometric study of loggerhead sea
turtles, Caretta caretta, in the first year of life. Bulletin of the association of
reptilian and amphibian veterinarians. 8, 8-16.
Brooks, R.L., Bounous, D.I., Andreasen, C.B., 1996. Functional comparison of avian
heterophils with human and canine neutrophils Comp. Haematol. Int. 6, 153159.
Brousseau, P., Payette, Y., Tryphonas, H., Blakley, B., Boermans, H., Flipo, D.,
Fournier, M., 1999. Manual of Immunological Methods. Boca Raton: CRC
Press.
Brousseau, P., Pellerin, J., Morin, Y., Cyr, D., Blakley, B., Boermans, H., Fournier,
M., 2000. Flow cytometry as a tool to monitor the disturbance of phagocytosis
146
in the clam Mya arenaria hemocytes following in vitro exposure to heavy
metals. Toxicology 142(2), 145-156.
Bolten, A.B. 2003. Active swimmers - passive drifters: the oceanic juvenile stage of
loggerheads in the Atlantic system. Pages 63–78 In: Bolten, A.B. and B.E.
Witherington (editors). Loggerhead Sea Turtles. Smithsonian Books,
Washington D.C.
Boysen, P., Storset, A.K., 2009. Bovine natural killer cells. Vet. Immunol.
Immunopathol. 130, 163-177.
Burleson, G.R., Dean, J.H., Munson, A.E., (Eds). 1995.
Immunotoxicoogy. Vol. 2. Wiley-Liss, Inc.: New York.
Methods
in
Burnham, D.K., Keall, S.N., Nelson, N.J., Daugherty, C.H., 2005. T cell function in
tuatara (Sphenodon punctatus). Comp. Immunol. Microb. 28, 213-222.
Camacho, M., Luzardo, O.P., Boada, L.D., Lopez Jurado, L.F., Medina, M., Zumbado,
M., Oros, J., 2013. Potential adverse health effects of persistent organic
pollutants on sea turtles: evidences from a cross-sectional study on Cape
Verde loggerhead sea turtles. Sci Total Environ 458-460, 283-289.
Camacho, M., Oros, J., Henriquez-Hernandez, L.A., Valeron, P.F., Boada, L.D.,
Zaccaroni, A., Zumbado, M., Luzardo, O.P., 2014. Influence of the
rehabilitation of injured loggerhead turtles (Caretta caretta) on their blood
levels of environmental organic pollutants and elements. Sci Total Environ
487, 436-442.
Campbell, T. W. 1995. Avian Hematology. In: Campbell, T. W. (2nd ed.). Avian
Hematology and Cytology. Iowa State University Press, Ames, Iowa. Pp. 7-11.
Campbell, T.W., 1996. Clinical Pathology, In: Reptile Medicine and Surgery, Mader
DR (Ed.), Saunders, Philadelphia, pp. 248-257
Campbell, T.W., 2006. Clinical Pathology of Reptiles, In: Mader (Ed.) Reptile
Medicine and Surgery. Sauners, St Louis, pp. 453-465.
Campbell, T.W., 2012. Chap 20. Hematology of reptile. p277, In: Thrall, Weiser,
Allison and Campbell (Eds). Veterinary Hematology and Clinical Chemistry,
2nd Edition, Wiley-Blackwell.
Casal, A. B., M. Camacho, L. F. Lopez-Jurado, C. Juste, and J. Oros. 2009.
Comparative study of hematologic and plasma biochemical variables in
Eastern Atlantic juvenile and adult nesting loggerhead sea turtles (Caretta
147
caretta). Vet Clin Pathol 38: 213-218.
Casal, A. B., and J. Oros. 2007. Morphologic and cytochemical characteristics of
blood cells of juvenile loggerhead sea turtles (Caretta caretta). Res. Vet. Sci.
82: 158-165.
Casale, P., P. P. Astore and R. Argano. 2009. Age at size and growth rates of early
juvenile loggerhead sea turtles (Caretta caretta) in the Mediterranean based
on length frequency analysis. Herpetol. J. 19: 29-33.
Chan, S.K., I.-J. Cheng, T. Zhou, H.-J. Wang, H.-X. Gu, and X.-J. Song. 2007. A
comprehensive overview of the population and conservation status of sea
turtles in China. Chelonian Conservation and Biology 6(2):185–198.
Chong, Y.C., Duffus, W.P., Hannant, D., 1992. Natural killer cells in normal horses
and specific-pathogen-free foals infected with equine herpesvirus. Vet.
Immunol. Immunopathol. 33, 103-113.
Cobb, G.P., Wood, P.D., 1997. PCB concentrations of eggs and chorioallantoic
membranes of loggerhead sea turtles (Caretta caretta) from the Cape Romain
National Wildlife Refuge. Chemosphere 34, 539-549.
Coico, R., Sunshine, G., and Benjamini, E., 2009. Immunology, A Short Course.
Hoboken, N.J: Wiley and Sons Sunshine 6th ed.
Conant, T.A., P.H. Dutton, T. Eguchi, S.P. Epperly, C.C. Fahy, M.H. Godfrey, S.L.
MacPherson, E.E. Possardt, B.A. Schroeder, J.A. Seminoff, M.L. Snover,
C.M. Upite, and B.E. Witherington. 2009. Loggerhead sea turtle (Caretta
caretta) 2009 status review under the U.S. Endangered Species Act. Report of
the Loggerhead Biological Review Team to the National Marine Fisheries
Service, August 2009. 222 pp.
Connelley, T., Storset, A.K., Pemberton, A., Machµgh, N., Brown, J., Lund, H.,
Morrison, I.W., 2011. NKp46 defines ovine cells that have characteristics
corresponding to NK cells. Vet. Res. 42, 37.
Cook, C.G., Splitter, G.A., 1989. Characterization of bovine mononuclear cell
populations with natural cytolytic activity against bovine herpesvirus 1infected cells. Cell Immunol 120, 240-249.
Cooper, E.L., Klumpau, A.E, and Zapata A.G. 1985. Chap 8. Reptilian immunity, In:
Biology of the Reptilia, Vol 14, Morphology, Gans c (Ed.) Academic press,
New York, 599-678.
148
Cray, C., Varella, R., Bossart, G.D., Lutz, P., 2001. Altered in vitro immune
responses in green turtles (Chelonia mydas) with fibropapillomatosis. J. Zoo.
Wildl. Med. 32, 436-440.
Cuchens, M.A., Clem, L.W., 1979. Phylogeny of lymphocyte heterogeneity. III.
Mitogenic responses of reptilian lymphocytes. Dev. Comp. Immunol. 3, 287297.
Day, R.D., A.L. Segars, M.D. Arendt, A.M. Lee, and M.M. Peden-Adams. 2007.
Relationship of blood mercury levels to health parameters in the loggerhead
sea turtle (Caretta caretta). Environ Health Perspect 115: 1421-1428.
Deem, S. L., T. M. Norton, M. Mitchell, A. Segars, A. R. Alleman, C. Cray, R. H.
Poppenga, M. Dodd, and W. B. Karesh. 2009. Comparison of blood values in
foraging, nesting, and stranded loggerhead turtles (Caretta caretta) along the
coast of Georgia, USA. J. Wildl. Dis. 45: 41-56.
DeGuise, S., Flipo, D., Boehm, J.R., Martineau, D., Beland, P., Fournier, M., 1995a.
Immune functions in beluga whales (Delphinapterus leucas): evaluation of
phagocytosis and respiratory burst with peripheral blood leukocytes using
flow cytometry. Vet. Immunol. Immunopathol. 47, 351-362.
De Guise, S., Martineau, D., Béland, P., Fournier, M. 1995b. Possible mechanisms of
action of environmental contaminants on St. Lawrence beluga whales
(Delphinapterus leucas). Environmental Health Perspectives, 103(Suppl 4),
73.
DeGuise, S., Bernier, J., Dufresne, M.M., Martineau, D., Beland, P., Fournier, M.,
1996. Immune functions in beluga whales (Delphinapterus leucas): evaluation
of mitogen-induced blastic transformation of lymphocytes from peripheral
blood, spleen and thymus. Vet. Immunol. Immunopathol. 50, 117-126.
DeGuise, S., Ross, P.S., Osterhaus, A.D., Martineau, D., Beland, P., Fournier, M.,
1997. Immune functions in beluga whales (Delphinapterus leucas): evaluation
of natural killer cell activity. Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 345-354.
De Guise, S., Martineau, D., Beland, P., Fournier, M., 1998. Effects of in vitro
exposure of beluga whale leukocytes to selected organochlorines. J Toxicol
Environ Health A 55, 479-493.
Delgado, C., A. Valente, I. Quaresma, M. Costa, and T. Dellinger. 2011. Blood
biochemistry reference values for wild juvenile loggerhead sea turtles (Caretta
caretta) from Madeira archipelago. J. Wildl. Dis. 47: 523-529.
149
Dodd, C.K., Jr. 1988. Synopsis of the biological data on the loggerhead sea turtle
Caretta caretta (Linnaeus 1758). U.S. Fish and Wildlife Service, Biological
Report 88(14). 110pages.
Duguy, R. 1970. Numbers of blood cells and their variations. In: Biology of the
Reptilia, C. Gans, and T. C. Parsons, (eds.). Academic Press, New York. Pp.
93-109.
El Masri, M., Saad, A.H., Mansour, M.H., Badir, N., 1995. Seasonal distribution and
hormonal modulation of reptilian T cells from Immunobiology. 193, 15- 41
Environmental Protection Agency (EPA).
http://www.epa.gov/epawaste/hazard/tsd/pcbs/pubs/about.htm accessed 2013
Evans, D.L., Cooper, E.L., 1990. Natural Killer Cells in Ectothermic Vertebrates.
BioScience 40, 745-749.
Farag, M.A., el Ridi, R., 1985. Mixed leucocyte reaction (MLR) in the snake
Psammophis sibilans. Immunology 55: 153-181.
Farag, M.A., el Ridi, R., 1986. Proliferative responses of snake lymphocytes to
concanavalin A. Dev. Comp. Immunol. 10, 561-569.
Farag, M.A., el Ridi, R., 1990. Functional markers of the major histocompatibility
gene complex of snakes. Eur J Immunol 20:2029-2033.
Flint, M., J. M. Morton, C. J. Limpus, J. C. Patterson-Kane, and P. C. Mills. 2010.
Reference intervals for plasma biochemical and hematologic measures in
loggerhead sea turtles (Caretta caretta) from Moreton Bay, Australia. J.
Wildl. Dis. 46: 731-741.
Flint, M., J. M. Morton, C. J. Limpus, J. C. Patterson-Kane, P. J. Murray, and P. C.
Mills. 2010. Development and application of biochemical and haematological
reference intervals to identify unhealthy green sea turtles (Chelonia mydas).
Vet. J. 185: 299-304.
Fontaine, C., and D. Shaver. 2005. Head-starting the Kemp’s ridley sea turtle,
Lepidochelys kempii, at the NMFS Galveston Laboratory, 1978–1992: a
review. Chelonian Conserv Biol. 4: 838–845.
Frair, W., and B. K. Shah. 1982. Sea turtle serum blood protein concentrations
correlated with carapace lengths. Comp. Bichem. Physiol., A. 73: 337-339.20.
Frye, F.L., Hematology as applied to clinical reptile medicine. In: Biomedical and
150
surgical aspects of captive reptile husbandry, Frye, F.L. (Ed). Vol. 1. 2nd
edition. Melbourne (FL). p. 209–77.
Gardner, S.C., Pier, M.D., Wesselman, R., Juarez, J.A., 2003. Organochlorine
contaminants in sea turtles from the Eastern Pacific. Mar Pollut Bull 46, 10821089.
Gelli, D., V. Ferrari, A. Zanella, P. Arena, L. Pozzi, S. Nannarelli, C. Vaccaro, D.
Bernardini, and S. Romagnoli. 2009. Establishing physiological blood
parameters in the loggerhead sea turtle (Caretta caretta). Eur. J. Wildl. Res.
55: 59-63.
Greenlee, A.R., Brown, R.A., Ristow, S.S., 1991. Nonspecific cytotoxic cells of
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) kill YAC-1 targets by both necrotic and
apoptic mechanisms. Dev. Comp. Immunol. 15, 153-164.
Hamann, M., M. H. Godfrey, J. A. Seminoff, K. Arthur, P. C. R. Barata, K. A.
Bjorndal, A. B. Bolten, A. C. Broderick, L. M. Campbell, C. Carreras, P.
Casale, M. Chaloupka, S. K. F. Chan, M. S. Coyne, L. B. Crowder, C. E. Diez,
P. H. Dutton, S. P. Epperly, N. N. FitzSimmons, A. Formia, M. Girondot, G.
C. Hays, I. J. Cheng, Y. Kaska, R. Lewison, J. A. Mortimer, W. J. Nichols, R.
D. Reina, K. Shanker, J. R. Spotila, J. Tomás, B. P. Wallace, T. M. Work, J.
Zbinden and B. J. Godley. 2010. Global research priorities for sea turtles:
informing management and conservation in the 21st century. Endang. Species
Res. 11: 245-269.
Harms, C.A., Keller, J.M., Kennedy-Stoskopf, S., 2000. Use of a two-step Percoll
gradient for separation of loggerhead sea turtle peripheral blood mononuclear
cells. J. Wildlife Dis. 36, 535-540.
Herbst, L.H., Klein, P.A., 1995. Monoclonal antibodies for the measurement of classspecific antibody responses in the green turtle, Chelonia mydas. Vet.
Immunol. Immunopathol. 46, 317-335.
Herbst, L.H., Jacobson, E.R., Klein, P.A., Balazs, G.H., Moretti, R., Brown, T.,
Sundberg, J.P., 1999. Comparative pathology and pathogenesis of spontaneous
and experimentally induced fibropapillomas of green turtles (Chelonia mydas).
Vet Pathol 36, 551-564.
Higgins, B. 2003. Sea Turtle Husbandry. In: The Biology of Sea Turtles, P. L. L. A. J.
A. Musick, (ed.). CRC Press, Boca Raton, FL. pp. 411-439.
Henney, C.S., Kuribayashi, K., Kern, D.E., Gillis, S., 1981. Interleukin-2 augments
natural killer cell activity. Nature. 291(5813), 335-8
151
Hopkins-Murphy, S.R., D.W. Owens, and T.M. Murphy. 2003. Ecology of immature
loggerheads on foraging grounds and adults in internesting habitat in the
Eastern United States. Pages 79–92 in Bolten, A.B. and B.E. Witherington
(editors). Loggerhead Sea Turtles. Smithsonian Books, Washington D.C.
Hawkes et al., 2009
Innis, C. J., J. B. Ravich, M. F. Tlusty, M. S. Hoge, D. S. Wunn, L. B. BoernerNeville, C. Merigo, and E. S. Weber III. 2009. Hematologic and plasma
biochemical findings in cold-stunned Kemp’s ridley sea turtles: 176 case
(2001-2005). J. Am. Vet. Med. Assoc. 235: 426 – 432.
IUCN.
2012. IUCN Red List of Threatened Species.
<www.iucnredlist.org>. Accessed 18 April 2013.
Version
2012.2.
Jacobson, E., Gaskin, J. M., Page, D., Iverson, W. O., and Johnson, J. W. 1981.
Illness associated with paramyxo-like virus infection in a zoologic collection
of snakes. Journal of the American Veterinary Medical Association, 179(11),
1227-1230.
Jacobson, E., K. Bjorndal, A. Bolten, R. Herren, G. Harman, and L. Wood. 2007.
Establishing plasma biochemical and hematocrit reference intervals for sea
turtles in Florida.
http://accstr.ufl.edu/CC_summary.htm. Accessed 08
January 2012.
Kakizoe, Y., Sakaoka, K., Kakizoe, F., Yoshii, M., Nakamura, H., Kanou, Y., Uchida,
I., 2007. Successive changes of hematologic characteristics and plasma
chemistry values of juvenile loggerhead turtles (Caretta caretta). J. Zoo.
Wildl. Med. 38, 77-84.
Keller, J.M., Kucklick, J.R., Harms, C.A., McClellan-Green, P.D., 2004a.
Organochlorine contaminants in sea turtles: correlations between whole blood
and fat. Environ Toxicol Chem 23, 726-738.
Keller, J.M., Kucklick, J.R., Stamper, M.A., Harms, C.A., McClellan-Green, P.D.,
2004b. Associations between organochlorine contaminant concentrations and
clinical health parameters in loggerhead sea turtles from North Carolina, USA.
Environ. Health Persp. 112, 1074-1079.
Keller, J.M., McClellan-Green, P.D., Lee, A.M., Arendt, M.D., Maier, P.P., Segars,
A.L., Whitaker, J.D., Keil, D.E., Peden-Adams, M.M., 2005a. Mitogeninduced lymphocyte proliferation in loggerhead sea turtles: comparison of
methods and effects of gender, plasma testosterone concentration, and body
condition on immunity. Vet. Immunol. Immunopathol. 103, 269-281.
152
Keller, J.M., Peden-Adams, M.M., Aguirre, A.A., 2005b. Immunotoxicology and
implications for reptilian health. In: Toxicology of Reptiles. Oberdorster, E.,
and Gardner, S. (Eds). CRC Imprint, Taylor and Francis Group, Boca Raton,
FL.
Keller, J.M., McClellan-Green, P.D., Kucklick, J.R., Keil, D.E., Peden-Adams, M.M.,
2006. Effects of organochlorine contaminants on loggerhead sea turtle
immunity: comparison of a correlative field study and in vitro exposure
experiments. Environ. Health. Persp. 114, 70-76.
Keller, J.M., 2013. Forty-seven days of decay does not change persistent organic
pollutant levels in loggerhead sea turtle eggs. Environmental Toxicology and
Chemistry 32, 747-756.
Keller, J.M. 2014. Chapter 11. Exposure to and Effects of Persistent Organic
Pollutants. In : The Biology of Sea Turtles, Volume III. Jeanette Wyneken,
Kenneth J. Lohmann, and John A. Musick CRC Press. pp 285–328
Knapp, D.W., Leibnitz, R.R., DeNicola, D.B., Turek, J.J., Teclaw, R., Shaffer, L.,
Chan, T.C., 1993. Measurement of NK activity in effector cells purified from
canine peripheral lymphocytes. Vet. Immunol. Immunopathol. 35, 239-251
Kuby, J. 2006. Immunology, 6th ed. New York: W. H. Freeman.
Kuo, M.M., Lane, R.S., Giclas, P.C., 2000. A comparative study of mammalian and
reptilian alternative pathway of complement-mediated killing of the Lyme
disease spirochete (Borrelia burgdorferi) from J Parasitol. 86, 1223-1228
Lambotin, M.l., Raghuraman, S., Stoll-Keller, F.o., Baumert, T.F., Barth, H., A look
behind closed doors: interaction of persistent viruses with dendritic cells. Nat
Rev Micro 8, 350-360.
Lake, J.L., Haebler, R., McKinney, R., Lake, C.A., Sadove, S.S., 1994. PCBs and
chlorinated organic contaminants in tissues of Juvenile Kemp's Ridley Turtles
(Lepidochelys kempi). Marine Environmental Research 38, 313-327.
Latimer, K.S., Kircher, I.M., Andreasen, C.B., 1989. Separation of turkey heterophils
from blood using two-step Ficoll-Hypaque discontinuous gradients. Avian
Dis. 33, 571-573.
Lazar, B., Maslov, L., Romanic, S.H., Graçan, R., Krauthacker, B., Holcer, D.,
Tvrtkovic, N., 2011. Accumulation of organochlorine contaminants in
153
loggerhead sea turtles, Caretta caretta, from the eastern Adriatic Sea.
Chemosphere 82, 121-129.
Leceta, J., Zapata, A., 1985. Seasonal changes in the thymus and the spleen of the
turtle Mauremys caspica. A morphometrical, light microscopic study. Dev
comp imunol 9 :653-668.
Leceta, J., Zapata, A., 1986. Seasonal variations in the immune response of the
tortoise Mauremys caspica. Immunology 57 :483-487.
Levin, M., De Guise, S., Ross, P.S., 2005. Association between lymphocyte
proliferation and polychlorinated biphenyls in free-ranging harbor seal (Phoca
vitulina) pups from British Columbia, Canada. Environ. Toxicol. Chem. 24,
1247-1252.
Levin, M., Leibrecht, H., Mori, C., Jessup, D., De Guise, S., 2007a.
Immunomodulatory effects of organochlorine mixtures upon in vitro exposure
of peripheral blood leukocytes differ between free-ranging and captive
southern sea otters (Enhydra lutris). Vet. Immunol. Immunopathol. 119, 269277.
Levin, M., Morsey, B., De Guise, S., 2007b. Modulation of the respiratory burst by
organochlorine mixtures in marine mammals, humans, and mice. J Toxicol
Environ Health A 70, 73-83.
Lewison, R.L., S.A. Freeman, and L.B. Crowder. 2004. Quantifying the effects of
fisheries on threatened species: the impact of pelagic longlines on loggerhead
and leatherback sea turtles. Ecology Letters 7:221-231.
Li, J., Barreda, D.R., Zhang, Y.A., Boshra, H., Gelman, A.E., Lapatra, S., Tort, L.,
Sunyer, J.O., 2006. B lymphocytes from early vertebrates have potent
phagocytic and microbicidal abilities. Nat Immunol. 7(10): 1116-24.
Liao, G., Simone, J., Simon, S.R., 1994. Paracrine downregulation of Fc gamma RIII
in human monocyte-derived macrophages induced by phagocytosis of
nonopsonized particles. Blood. 83 (8): 2294-2304.
Lutcavage, M.E., P.L. Lutz, G.D. Bossart, and D.M. Hudson. 1995. Physiologic and
clinicopathologic effects of crude oil on loggerhead sea turtles. Archives of
Environmental Contamination and Toxicology 28:417-422.
Lutcavage, M.E., P. Plotkin, B. Witherington, and P.L. Lutz. 1997. Human impacts
on sea turtle survival. Pages 387-409 in: Lutz, P.L. and J.A. Musick (editors).
The Biology of Sea Turtles. CRC Press. Boca Raton, Florida.
154
Lutz, P.L., Cray, C., Sposato, P.L., 2001. Studies of the association between
immunosuppression and fibropapillomatosis within three habitats of Chelonia
mydas, NOAA Southwest Fisheries Science Center Admin Report H-01-01C.
Mato Y., Isobe T.,Takada H., Kanehiro H., Ohtake C. and Kaminuma T. 2001. Plastic
resin pellets as a transport medium for toxic chemicals in the marine
environment. Environmental Science and Technology 35 (2): 318-324.
McKinney, E.C., Bentley, T.B., 1985. Cell-mediated immune response of Chelonia
mydas. Dev. Comp. Immunol. 9, 445-452.
Merchant, M.E., Roche, C., Elsey, R.M., Prudhomme, J., 2003. Antibacterial
properties of serum from the American alligator (Alligator mississippiensis)
from Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 136, 505-513
Merchant, M.E., Thibodeaux, D., Loubser, K., Elsey, R.M., 2004. Amoebacidal
effects of serum from the American alligator (Alligator mississippiensis) from
J Parasitol. 90, 1480-1483
Merchant, M.E., Pallansh, M., Paulman, R.L., Wells, J.B., Nalca, A., Ptak, R., 2005a.
Antiviral activity of serum from the American alligator (Alligator
mississippiensis) from Antiviral Res. 66, 35-38
Merchant, M.E., Roche, C.M., Thibodeaux, D., Elsey, R.M., 2005b. Identification of
alternative pathway serum complement activity in the blood of the American
alligator (Alligator mississippiensis) from Comp Biochem Physiol B Biochem
Mol Biol. 141, 281-288
Merchant, M., Williams, S., Hardy, R., 2009. Production of superoxide ions by
leukocytes of the American alligator (Alligator mississippiensis). Comp
Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 152, 67-71.
Miao, X.S., Balazs, G.H., Murakawa, S.K.K., Li, Q.X., 2001. Congener-specific
profile and toxicity assessment of PCBs in green turtles (Chelonia mydas)
from the Hawaiian Islands. Science of The Total Environment 281, 247-253.
Miller, J.D. 1997. Reproduction in sea turtles. Pages 51–81 in Lutz, P.L. and J.A.
Musick (editors). The Biology of Sea Turtles. CRC Press. Boca Raton, Florida.
Miller, J.D., C.J. Limpus, and M.H. Godfrey. 2003. Nest site selection, oviposition,
eggs, development, hatching, and emergence of loggerhead turtles. Pages 125–
143 in Bolten, A.B. and B.E. Witherington (editors). Loggerhead Sea Turtles.
Smithsonian Books, Washington D.C.
155
Milton, S.L. and P.L. Lutz. 2003. Physiological and genetic responses to
environmental stress. Pages 163–197 in Lutz, P.L., J.A. Musick, and J.
Wyneken (editors). The Biology of Sea Turtles, Volume II. CRC Press. Boca
Raton, Florida.
Mondal, S., Rai, U., 1999. Sexual dimorphism in phagocytic activity of wall lizard's
splenic macrophages and its control by sex steroids from Gen Comp
Endocrinol. 116, 291-298
Mondal, S., Rai, U., 2001. In vitro effect of temperature of phagocytic and cytotoxic
activities of splenic phagocytes of the wall lizard, Hemidactylus flaviviridis
from Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129, 391-398
Mondal, S., Rai, U., 2002b. Dose and time related in vitro effects of glucocorticoid on
phagocytosis and nitrite release by splenic macrophages of the wall lizard,
Hemidactylus flaviviridis from Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol.
132, 461-470
Munoz, F.J., Galvan, A., Lerma, M., De la Fuente, M., 2000. Seasonal changes in
peripheral blood leukocyte functions of the turtle Mauremys caspica and their
relationship with corticosterone, 17-beta-estradiol and testosterone serum
levels. Vet. Immunol. Immunopathol. 77, 27-42.
Morpurgo, B., and A. Gelman. 1991. The effect of age, sex and diet on the plasma
cholesterol levels of the Nile crocodile, Crocodylus niloticus. Comp. Biochem.
Physiol., A. 99: 687-689.
Munoz, F.J., Galvan, A., Lerma, M., De la Fuente, M., 2000. Seasonal changes in
peripheral blood leukocyte functions of the turtle Mauremys caspica and their
relationship with corticosterone, 17-beta-estradiol and testosterone serum
levels. Veterinary immunology and immunopathology 77, 27-42.
Munoz, F.J., De la Fuente, M., 2001. The effect of the seasonal cycle on the splenic
leukocyte functions in the turtle Mauremys caspica. Physiol Biochem Zool 74,
660-667.
Munoz, F.J., De la Fuente, M., 2003. In vitro proliferation of blood, spleen and
thymus leukocytes from the turtle Mauremys caspica. Comp Biochem Physiol
C Toxicol Pharmacol 134, 303-309.
Munoz, F.A., Estrada-Parra, S., Romero-Rojas, A., Work, T.M., GonzalezBallesteros, E., Estrada-Garcia, I., 2009, Identification of CD3+ T
156
lymphocytes in the green turtle
Immunopathol. 131, 211-217.
Chelonia
mydas.
Vet.
Immunol.
NMFS and USFWS 2007. Loggerhead sea turtle (Caretta caretta) 5-year review:
summary and evaluation. National Marine Fisheries Service and U.S. Fish and
Wildlife Service, Washington, D.C., USA.
National Marine Fisheries Service Southeast Fisheries Science Center. 2008. Sea
Turtle Research Techniques Manual. NOAA Technical Memorandum. NMFSSEFSC-579, 92p.
Origgi, F. C., Klein, P. A., Mathes, K., Blahak, S., Marschang, R. E., Tucker, S. J., &
Jacobson, E. R. 2001. Enzyme-linked immunosorbent assay for detecting
herpesvirus exposure in Mediterranean tortoises (spur-thighed tortoise Testudo
graeca and Hermann's tortoise Testudo hermanni). Journal of clinical
microbiology, 39 (9), 3156-3163.
Origgi, F. C., Romero, C. H., Bloom, D. C., Klein, P. A., Gaskin, J. M., Tucker, S. J.,
and Jacobson, E. R. 2004. Experimental transmission of a herpesvirus in
Greek tortoises (Testudo graeca). Veterinary Pathology Online, 41 (1), 50-61.
Origgi F. C. 2007. Reptile immunology. In: E.R. Jacobson. Infectious diseases and
Pathology of Reptiles: A color Atlas and Text. Boca Raton, FL: CRC/Taylor &
Francis. 440p
Oros, J., Gonzalez-Diaz, O.M., Monagas, P., 2009. High levels of polychlorinated
biphenyls in tissues of Atlantic turtles stranded in the Canary Islands, Spain.
Chemosphere 74, 473-478.
Oros, J., Monagas, P., Calabuig, P., Luzardo, O.P., Camacho, M., 2013. Pansteatitis
associated with high levels of polychlorinated biphenyls in a wild loggerhead
sea turtle Caretta caretta. Dis Aquat Organ 102, 237-242.
Osborne, A. G., E. R. Jacobson, M. J. Bresette, D. A. Singewald, R. A. Scarpino, and
A. B. Bolten. 2010. Reference intervals and relationships between health
status, carapace length, body mass, and water temperature and concentrations
of plasma total protein and protein electrophoretogram fractions in Atlantic
loggerhead sea turtles and green turtles. J. Am. Vet. Med. Assoc. 237: 561567.
O’Shea, J., Ortaldo, J.R., 1992. The biology of natural killer cells: insights into the
molecular basis of function. In: Lewis, C.E. D McGee, J.O., (Eds.), The
natural immune system: the natural killer cell, Oxford Univ. Press, New York.
pp. 2-40.
157
Owens, D.W., Ruiz, G.J., 1980. New methods of obtaining blood and cerebrospinal
fluid from marine turtles. Herpetologica 36, 17-20.
Pasmans, F., Herdt, P.D., Nerom, A.V., Haesebrouck, F., 2001. Induction of the
respiratory burst in turtle peritoneal macrophages by Salmonella muenchen
from Dev Comp Immunol. 225, 159-168
Pasmans, F., Herdt, P.D., Haesebrouck, F., 2002. Interactions of Salmonella enterica
serovar Muenchen with macrophages of the turtle Trachemys scripta scripta
from Dev Comp Immunol. 26, 295-304
Peckham, S.H., D.M. Diaz, A. Walli, G. Ruiz, L.B. Crowder, and W.J. Nichols. 2007.
Smallscale fisheries bycatch jeopardizes endangered Pacific loggerhead
turtles. PLoS ONE 2(10):e1041.
Polovina, J., I. Uchida, G. Balazs, E.A. Howell, D. Parker, and P. Dutton. 2006. The
Kuroshio Extension Bifurcation Region: a pelagic hotspot for juvenile
loggerhead sea turtles. Deep- Sea Research II 53:326-339
Ragland, J.M., Arendt, M.D., Kucklick, J.R., Keller, J.M., 2011. Persistent organic
pollutants in blood plasma of satellite-tracked adult male loggerhead sea
turtles (Caretta caretta). Environ Toxicol Chem 30, 1549-1556.
Richardson, K.L., Lopez Castro, M., Gardner, S.C., Schlenk, D., 2009.
Polychlorinated Biphenyls and Biotransformation Enzymes in Three Species
of Sea Turtles from the Baja California Peninsula of Mexico. Arch Environ
Contam Toxicol.
Ross, P.S., De Swart, R.L., Timmerman, H.H., Reijnders, P.J.H., Vos, J.G., Van
Loveren, H., Osterhaus, A.D.M.E., 1996. Suppression of natural killer cell
activity in harbour seals (Phoca vitulina) fed Baltic Sea herring. Aquat.
Toxicol. 34, 71- 84.
Rousselet, E., Stacy, N.I., LaVictoire, K., Higgins, B.M., Tocidlowski, M.E.,
Flanagan, J.P., Godard-Codding, C.A.J. 2013a Hematology and plasma
biochemistry in five age classes of immature captive-reared loggerhead sea
turtles (Caretta caretta). J. Zoo. Wildl. Med. 44 (4)859-874.
Rousselet, E., Levin, M., Gebhard, E., Higgins, B.M., DeGuise, S., Godard-Codding,
C.A.J. 2013b. Evaluation of immune functions in captive immature
loggerhead sea turtles (Caretta caretta). Vet immunol. Immunopath. 156(12):43-53.
158
Roy, B., Rai, U., 2004. Dual mode of catecholamine action on splenic macrophage
phagocytosis in wall lizard, Hemidactylus flaviviridis from Gen Comp
Endocrimol. 136, 180-191
Saad, A. H., and El Ridi, R. 1984. Mixed leukocyte reaction, graft-versus-host
reaction, and skin allograft rejection in the lizard, Chalcides ocellatus.
Immunobiology, 166(4), 484-493.
Safe, S. 1992. Toxicology, structure-function relationship, and human and
environmental health impacts of polychlorinated biphenyls: progress and
problems. Environ Health Perspect 100:259-268.
Safe, S. 1994. Polychlorinated biphenyls (PCBs): environmental impact, biochemical
and toxic responses, and implications for risk assessment. Crit Rev Toxicol
24:87–149.
Safe, S. 2001. PCBs as Aryl Hydrocarbon Receptor Agonists-Implications for Risk
Assessment. In: PCBs Recent Advances in the Environmental Toxicology and
Health Effects. Edited by Larry W. Robertson and Larry G. Hansen. The
University Press of Kentucky.
Salmon, H., Charley, B., Labonnardiere, C., Olivier, M., Kelley, K., Paraf, A., 1989.
Natural killer (NK) activity and interferon (IFN) production by a fraction of
spleen and blood lymphocytes in swine. Vet. Immunol. Immunopathol. 23,
113-128.
Schwacke, L.H., Zolman, E.S., Balmer, B.C., De Guise, S., George, R.C., Hoguet, J.,
Hohn, A.A., Kucklick, J.R., Lamb, S., Levin, M., Litz, J.A., McFee, W.E.,
Place, N.J., Townsend, F.I., Wells, R.S., Rowles, T.K., 2011. Anaemia,
hypothyroidism and immune suppression associated with polychlorinated
biphenyl exposure in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Proc Biol Sci
279, 48-57.
Sherif, M., El Ridi, R., 1992. Natural Cytotoxic cell activity in the snake Psamophis
sibilans from Immunobiol. 184, 348-358
Stacy, N.I., Alleman, A.R., Sayler, K.A., 2011. Diagnostic hematology of reptiles.
Clin. Lab. Med. 31, 87-108.
Stamper, M. A., C. Harms, S. P. Epperly, J. Braun-Mcneill, and M. K. Stoskopf.
2005. Relationship between barnacle epibiotic load and hematologic
parameters in loggerhead sea turtles (Caretta caretta), a comparison between
migratory and residential animals in Pamlico Sound, North Carolina. J. Zoo
Wildl. Med. 36: 635-641.
159
Stewart, K. R., Keller, J. M., Templeton, R., Kucklick, J. R., and Johnson, C. 2011.
Monitoring persistent organic pollutants in leatherback turtles (Dermochelys
coriacea) confirms maternal transfer. Marine pollution bulletin, 62 (7), 13961409.
Storelli, M.M., Barone, G., Marcotrigiano, G.O., 2007. Polychlorinated biphenyls and
other chlorinated organic contaminants in the tissues of Mediterranean
loggerhead turtle Caretta caretta. Sci Total Environ 373, 456-463.
Strauss, H. S., and Heiger-Bernays, W. 2012. Methodological Limitations May
Prevent the Observation of Non-Hodgkin’s Lymphoma in Bioassays of
Polychlorinated Biphenyls. Toxicologic pathology, 40 (7), 995-1003.
Strik, N.I., Alleman, A.R., Harr, K.E., 2007. Circulating inflammatory cells. Chap 3.
p167-186. In: E.R. Jacobson. Infectious diseases and Pathology of Reptiles: A
color Atlas and Text. Boca Raton, FL: CRC/Taylor & Francis. 440p.
Sunyer, J.O., Lambris, J.D., 1998. Evolution and diversity of the complement system
of poikilothermic vertebrates from Immunol. Rev. 166, 39-57
Swarthout, R.F., Keller, J.M., Peden-Adams, M., Landry, A.M., Fair, P.A., Kucklick,
J.R., 2010. Organohalogen contaminants in blood of Kemp's ridley
(Lepidochelys kempii) and green sea turtles (Chelonia mydas) from the Gulf of
Mexico. Chemosphere 78, 731-741.
Sypek, J., Borysenko, M., 1988. Reptiles, p. 211-248. In: A.F. Rowley and
N.A. Ratcliffe (Eds). Vertebrate blood cells. Cambridge, University Press,
456p.
TEWG (Turtle Expert Working Group), 2009. An assessment of the loggerhead turtle
population in the western North Atlantic Ocean, NOAA Technical Memo,
NMFS-SEFSC-575.
Tompkins, M.B., Ogilvie, G.K., Franklin, R.A., Kelley, K.W., Tompkins, W.A.,
1987. Induction of IL-2 and lymphokine activated killer cells in the cat. Vet.
Immunol. Immunopathol. 16, 1-10.
Ulsh, B.A., Congdon, J.D., Hinton, T.G., Whicker, F.W., Bedford, J.S., 2001. Culture
methods for turtle lymphocytes. Methods Cell. Sci. 22, 285-297.
Uno, T., Ishizuka, M., Itakura, T. 2012. Cytochrome P450 (CYP) in fish.
Environmental toxicology and pharmacology 34.1: 1-13.
160
U.S. Fish and Wildlife Service, (accessed 10.07.12), Recovery Plan for the Northwest
Atlantic Population of the Loggerhead Sea Turtle 2 nd revision in 2009,
http://www.nmfs.noaa.gov/pr/pdfs/recovery/turtle_loggerhead_atlantic.pdf
van de Merwe, J.P., Hodge, M., Olszowy, H.A., Whittier, J.M., Ibrahim, K., Lee, S.Y.,
2009. Chemical contamination of green turtle (Chelonia mydas) eggs in
peninsular Malaysia: implications for conservation and public health. Environ
Health Perspect 117, 1397-1401.
van de Merwe, J.P., Hodge, M., Olszowy, H.A., Whittier, J.M., Lee, S.Y., 2010.
Using blood samples to estimate persistent organic pollutants and metals in
green sea turtles (Chelonia mydas). Mar Pollut Bull 60, 579-588.
van Oss, C.J., 1986. Phagocytosis: an overview. Methods Enzymol 132, 3-15.
Wagner, R. A., and R. Wetzel. 1999. Tissue and plasma enzyme activities in juvenile
green iguanas. Am. J. Vet. Res. 60:201–203.
Walsh, C.J., Leggett, S.R., Carter, B.J., Colle, C., 2010. Effects of brevetoxin
exposure on the immune system of loggerhead sea turtles. Aquat Toxicol 97,
293-303.
Welsh, R.M., Brubaker, J.O., Vargas-Cortes, M., O'Donnell, C.L., 1991. Natural
killer (NK) cell response to virus infections in mice with severe combined
immunodeficiency. The stimulation of NK cells and the NK cell-dependent
control of virus infections occur independently of T and B cell function. J Exp
Med 173, 1053-1063.
Wibbels, T. 2003. Critical approaches to sex determination in sea turtles. Pages 103134 in: Lutz, P.L., J.A. Musick, and J. Wyneken (editors). Biology of Sea
Turtles, Volume II. CRC Press, Boca Raton, Florida
Wigley, P., Hulme, S.D., Barrow, P.A., 1999. Phagocytic and oxidative burst activity
of chicken thrombocytes to Salmonella, Escherichia coli and other bacteria.
Avian Pathology. 28:6, 567-572
Witherington, B.E. 1986. Human and natural causes of marine turtle clutch and
hatchling mortality and their relationship to hatchling production on an
important Florida nesting beach. Unpublished Master of Science thesis.
University of Central Florida, Orlando, Florida. 141 pages.
Witherington, B.E. 1997. The problem of photopollution for sea turtles and other
nocturnal animals. Pages 303-328 in Clemmons, J.R. and R. Buchholz
161
(editors). Behavioral Approaches to Conservation in the Wild. Cambridge
University Press, Cambridge, United Kingdom.
Witherington, B.E. 2002. Ecology of neonate loggerhead turtles inhabiting lines of
downwelling near a Gulf Stream front. Marine Biology 140:843–853.
Witherington, B., Kubilis, P., Brost, B., Meylan., A., 2009. Decreasing annual nest
counts in a globally important loggerhead sea turtle population. Ecol Appl.
(1):30-54.
Wood, F. E., and G. K. Ebanks. 1984. Blood cytology and hematology of the green
sea turtle, Chelonia mydas. Herpetologica. 40: 331-336.
Work, T. M., R. E. Raskin, G. H. Balazs, and S. D. Whittaker. 1998. Morphologic and
cytochemical characteristics of blood cells from Hawaiian green turtles. Am.
J. Vet. Res. 59: 1252-1257.
Work, T.M., Balazs, G.H., Rameyer, R.A., Chang, S.P., Berestecky, J., 2000.
Assessing humoral and cell-mediated immune response in Hawaiian green
turtles, Chelonia mydas. Vet. Immunol. Immunopathol. 74, 179-194.
Work, T.M., Rameyer, R.A., Balazs, G.H., Cray, C., Chang, S.P., 2001. Immune
status of free-ranging green turtles with fibropapillomatosis from Hawaii. J
Wildlife Dis. 37, 574-581.
Wu, Y., Wu, W., Wong, W. M., Ward, E., Thrasher, A. J., Goldblatt, D., Osman, M.,
Digard, P., Canaday, D.H., Gustafsson, K., 2009. Human γδ T Cells: A
Lymphoid Lineage Cell Capable of Professional Phagocytosis. J Immunol,
183, 5622-5629.
Zapata, A., Garrido, E., Leceta, J., Gomariz, R.P., 1983. Relationships between
neuroendocrine and immune systems in amphibians and reptiles Dev. Comp.
Immunol. 7, 771-774.
162
Annexes
Annexe 1: Nomenclature IUPAC des PCBs
163
Article 1: J Zoo Wildl Med. 2013 Dec;44(4):859-74. (Annexe 2)
Hematology and plasma biochemistry analytes in five age groups of immature,
captive-reared loggerhead sea turtles (Caretta caretta). Estelle Rousselet, Nicole I.
Stacy, Kara LaVictoire, Benjamin M. Higgins, Maryanne E. Tocidlowski, Joseph P.
Flanagan and Céline A.J. Godard-Codding.
ABSTRACT
Blood samples of 85 immature, apparently healthy, captive-reared loggerhead
sea turtles (Caretta caretta) were analyzed for 13 hematologic variables and total
solids of 5 age groups (8-, 20-, 32-, 44- and 56-month old) and for 20 plasma
biochemical analytes of 4 age groups (20- to 56-month old). Each individual turtle
was sampled under similar conditions during a blood collection period of 3 days.
Hematologic analytes included packed cell volume, white blood cell counts, white
blood cell estimates, and leukocyte differentials. Biochemical analysis included
albumin, alanine aminotransferase, alkaline phosphatase, amylase, aspartate
aminotransferase, blood urea nitrogen, calcium, chloride, cholesterol, creatine kinase,
creatinine, gamma glutamyltransferase, globulins, glucose, phosphorous, potassium,
sodium, total bilirubin, total protein, total solids and uric acid. In due consideration of
small sample size in all 5 age groups, the results of hematologic and biochemical
analysis were used to determine ranges for these analytes and to compare values
among consecutive age groups. Several significant differences in some hematologic
and biochemical variables were identified and need to be considered in the
interpretation of blood work of immature, growing sea turtles in human care.
Word count: 181
Key words: Caretta caretta, loggerhead sea turtle, immature, captivity, hematology,
plasma biochemistry.
164
Article 2: Vet Immunol Immunopathol. 2013 Nov 15;156(1-2):43-53. (Annexe 3)
Evaluation of immune functions in captive immature loggerhead sea turtles (Caretta
caretta). Estelle Rousselet, Milton Levin, Erika Gebhard, Benjamin M. Higgins,
Sylvain DeGuise and Céline A.J. Godard-Codding.
ABSTRACT
Sea turtles face numerous environmental challenges, such as exposure to chemical
pollution and biotoxins, which may contribute to immune system impairment,
resulting in increased disease susceptibility. Therefore, a more thorough assessment
of the host’s immune response and its susceptibility is needed for these threatened and
endangered animals. In this study, the innate and acquired immune functions of sixtyfive clinically healthy, immature, captive loggerhead sea turtles (Caretta caretta)
were assayed using non-lethal blood sample collection. Functional immune assays
were developed and/or optimized for this species, including mitogen-induced
lymphocyte proliferation, natural killer (NK) cell activity, phagocytosis, and
respiratory burst. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and phagocytes were
isolated by density gradient centrifugation on Ficoll Paque and discontinuous Percoll
gradients, respectively. The T lymphocyte mitogens ConA significantly induced
lymphocyte proliferation at one and two µg/ml while PHA significantly induced
lymphocyte proliferation at 5 and 10 µg/ml. The B lymphocyte mitogen LPS
significantly induced proliferation at one µg/ml.
Monocytes demonstrated higher
phagocytic activity than eosinophils. In addition, monocytes exhibited respiratory
burst. NK cell activity was higher against YAC-1 than K-562 target cells. These
optimized assays may help to evaluate the integrity of loggerhead sea turtle’s immune
system upon exposure to environmental contaminants, as well as part of a
comprehensive health assessment and monitoring program.
Keywords: Caretta caretta; Lymphocyte proliferation; Mitogen; Natural killer;
Phagocytosis; Respiratory burst; Sea turtle
165
Article 3: Short communication non publiée (Annexe 4)
Communication orale à l’ISTS : International Sea Turtle Society Conference
(Baltimore, 2012)
Modulation of the innate immune system by selected polychlorinated biphenyls upon
in vitro exposure of leukocytes in juvenile loggerhead sea turtles (Caretta caretta).
Estelle Rousselet1, 2, 5, Milton Levin3, Erika Gebhard3, Benjamin M. Higgins4, Sylvain
DeGuise3 and Céline A.J. Godard-Codding1
1
Department of Environmental Toxicology, The Institute of Environmental and
Human Health, Texas Tech University, 1207 Gilbert Drive, Lubbock, Texas, 79416,
United States 2 Present address: VetAgroSup-Campus Vétérinaire de Lyon, 1 avenue
Bourgelat, 69280 Marcy l’Etoile, France3 Department of Pathobiology and Veterinary
Science, University of Connecticut, 61 North Eagleville Road, U-89 Storrs, CT 06269,
United States4 National Oceanic and Atmospheric Administration, National Marine
Fisheries Service, Southeast Fisheries Science Center, 4700 Avenue U, Galveston,
Texas, 77551, United States 5Corresponding author (email: [email protected])
ABSTRACT
Endangered loggerhead sea turtles (Caretta caretta) face numerous environmental
challenges including exposure to polychlorinated biphenyls (PCBs). Although banned
in the 1970 in the United States, they still persist in the environment and are
documented to exert immunotoxicity in a wide range of species. This is of particular
concern as modulation of the immune system may lead to an increase of disease’s
susceptibility. In vitro immune assays were used to quantify the direct effects of PCB
105, 138 and 169 on innate immunity at increasing concentrations (0.5, 1, 2.5, 5, 10,
15 and 20 ppm). Peripheral blood mononuclear cell viability was > 90% after 96h of
exposure with both coplanar non-coplanar PCBs. PCB 105 and 138 significantly
increased phagocytosis at 10 and 15 ppm (p<0.002, n=4, PCB 105) and 15 ppm
(p<0.04, n=4, PCB 138) compared to unexposed eosinophils. PCB 169 did not
modulate NK cell activity, while PCBs 138 and 105 significantly decreased NK cell
activity at 15 ppm (p=0.007, n=3) and 20 ppm (p=0.008, n=3) respectively, compared
to unexposed control. This research will help to establish relationships between
chemicals measured in loggerhead sea turtles and the integrity of innate defense
mechanisms as indicators of disease susceptibility to pathogens.
166
Widespread coastal oceanic pollution is a result of both direct pollutant
discharges and diffuse sources such as land runoff and atmospheric emissions. Ocean
pollution is leading to a growing concern for the health of threatened marine species.
The loggerhead sea turtle, Caretta caretta, is protected as a threatened species under
the U.S. Endangered Species Act (TEWG, 2009) and is considered an endangered
species under the International Union for Conservation and Nature (IUCN, 2012). Our
understanding of the impact of pollution on marine turtle survival and health is very
limited, in large part due to insufficient knowledge of basic sea turtle toxicology
(Aguirre et al. 1994; Keller et al. 2004b; Lutcavage et al. 1995). Sea turtles are
particularly at risk as they are long-lived, air-breathing marine vertebrates that are
exposed to pollutants through food, seawater and air. Their long life implies longterm exposure to marine pollutants, which can make them particularly susceptible to
chemical bioaccumulation (Aguirre et al. 2006; Camacho et al. 2013; Hamann et al.,
2010; Keller et al. 2006; Oros et al. 2013). Moreover, sea turtles appear to be very
sensitive to chemical insults (Lutcavage et al. 1997) and various deleterious effects
have been reported in these species such as chronic stress, tissue necrosis and other
physiological disturbances (Camacho et al, 2013; Milton and Lutz, 2003; Oros et al.
2009, 2013). Environmental organochlorine contaminants, including polychlorinated
biphenyls (PCBs) are ubiquitous persistent chemicals widely used until banned in the
late 70s. Due to their bioaccumulative nature, PCBs are still detected in liver, muscle
and fat of Caretta caretta (Camacho et al., 2013; Keller et al., 2004b; Lazar et al.,
2011; Oros et al., 2009, 2013) all around the globe, Chelonia mydas from Pacific
Ocean (Gardner et al. 2003; Miao et al., 2001; van de Merwe et al. 2010) and
Lepidochelys kempi from the Atlantic Ocean (Keller et al., 2004a; Lake et al. 1994;
Swarthout et al. 2010). Only five studies have reported PCBs in the blood of live
loggerheads (Keller et al. 2004a, 2006; Ragland et al. 2011; Camacho et al., 2013;
2014).
Both experimental and epidemiological studies have demonstrated that PCBs
exert negative effects on the immune system of marine mammals (De Guise et al.,
1995 and 1998, 2003; Levin et al., 2005, 2007a, 2007b; Schwacke et al., 2011) and
sea turtles (Keller et al. 2004a, 2006). Impaired immune system may lead to increased
vulnerability to disease (Camacho et al., 2014; Cray et al., 2001; Work et al., 2001;
Keller et al., 2004b; Oros et al., 2013), which could severely affect the recovery of
endangered sea turtles. PCBs have been found positively correlated with WBC and
heterophil counts as well as lymphocyte proliferation (Keller et al. 2004b and 2006).
On the contrary, lysozyme activity decreased with increasing concentration of PCBs
(Keller et al. 2006) and higher concentrations of PCBs were reported in debilitated
animals when compared to healthier one (Keller et al. 2006; Camacho et al., 2014).
In our study, we propose to address for the first time the immunomodulatory
effects of PCB 105, 138 and 169 on phagocytosis and NK activity upon in vitro
exposure of leukocytes of juvenile loggerhead sea turtles. These tests of the innate
immune functions have been previously validated in the loggerhead sea turtles
167
(Rousselet et al., 2013b).
Blood samples were colletected in 2010, from 19 immature captive loggerhead
sea turtles at the NOAA Fisheries Sea Turtle Facility in Galveston, (TX, USA)
(Higgins, 2003) were collected. Animals were 32 and 44 month old with an average
weight of 12.6 kg ± 2.3. All animals in this study were clinically healthy based on a
veterinary examination as well as complete blood count and plasma chemistry panel
values (Rousselet et al., 2013a). All research complied with all institutional animal
care guidelines of the University of Connecticut and conditions described in U.S. Fish
and Wildlife Service Endangered Species Act Section 10a(1)a Scientific Research
Permits# TE-676379-4 and TE#676379-5, and Florida Fish and Wildlife
Conservation Commission Marine Turtle Permit #MTP-015. Eight mL of blood were
collected into lithium heparin tubes kept cool until processed within 24 h. PCBs
(purity >98.4%) were re-suspended in endotoxin free dimethyl sulfoxide and then
added to Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) to prepare working solutions.
The final DMSO concentration did not exceed 0.4%. Peripheral blood mononuclear
cells (PBMC) were isolated by density gradient centrifugation using Ficoll-Paque plus
(1.077 g/mL) as previously described (Rousselet et al., 2013b). Viability of PBMC
after 96 hours of PCBs’ exposure was evaluated by flow cytometry using propidium
iodide (PI) (100 µg/mL) as described by Brousseau et al. (1999). Samples were
analyzed with a FACScan flow cytometer (Becton Dickinson, Rutherford, NJ) and the
fluorescence of 10000 events was read. Data are expressed as a percent of viable cells.
Natural Killer (NK) cell activity after exposure to PCBs was measured using the
murine lymphoma cell line (YAC-1) as previously described (Rousselet et al., 2013b).
PBMCs (effector cells) were adjusted to 106 cells/mL and were incubated in RPMI
with or without one congener of PCB at increasing concentration ranging from 0.5 to
20 ppm for 3h. Then, target cells were added to PBMCs at an effector:target (E:T)
ratio 50:1. NK cell activity was measured after 2.5 hr incubation at 28 C.
Granulocytes were separated using discontinuous Percoll-gradients as previously
described (Rousselet et al., 2013b). Cells obtained at the interface between plasma
and 40% and 40-45% of percoll were pooled and used for phagocytosis. 2x105
leukocytes were plated in each well of round bottom 96-well plates and incubated
with or without one PCB congener at concentration ranging from 0.5 to 15 ppm, for 3
hr at 28 C. The method was then previously described (Rousselet et al., 2013b). Data
from at least three independent phagocytosis experiments (three individuals per
experiment) were pooled. Data from four individuals per NK experiment were used.
One-way repeated-measures analysis of variance (RM ANOVA) followed by
Bonferroni’s or Holm-Sidak’s post-hoc testing were used to compare the different
experimental groups. If only two experimental groups were compared and the data
were normally distributed, t-test was used; otherwise Mann-Whitney Rank Sum test
was used instead. RM ANOVA was evaluated using the SigmaStat Windows 1.0
(Jandel Scientific, San Rafael, CA) software, using p<0.05 for statistical significance.
Statistical power for each experiment was greater than 0.8, the threshold required by
the statistical software to assure confidence in the interpretation of the statistical
168
results.
The percentage of viable cells was > 90% as determined by flow cytometry after in
vitro exposure to PCB-105 138 and 169 for 96 hr. There were no statistically
significant treatment-related effects on the viability of immune cells (data not shown).
The PCB-105 induced a concentration-dependent increase of phagocytosis in
loggerheads’ eosinophils (Fig. 1) for 1+, 2+ and 3+ beads contrary to PCB-138 (Fig.
2). PCB-105 significantly increased phagocytosis at 10 and 15 ppm (p<0.002) while
PCB-138 significantly increased phagocytosis at 15 ppm (p<0.04). The positive
correlation between phagocytic activity and PCB-105 concentrations was found for
1+ beads (Pearson correlation, r = 0.66, p = 5.2.10-6), 2+ beads (r = 0.59, p = 4.2.10-5)
and 3+ beads (r = 0.56, p = 1.4.10-4). The ability of NK cells to lyse YAC-1 cells after
exposure to PCB-105 and -138 showed a significant decrease (Fig. 3) with 15 and 20
ppm (p<0.01) for the 50:1 ratio (NK:target), whereas PCB-169 did not modulate NK
activity. A negative correlation between NK activity and PCB-105 (Pearson
correlation, r = -0.585, p = 0.0027) as well as PCB-138 (r = -0.557, p = 0.0087) was
found.
This is the first report on the modulation of two major functions of the innate
immune system (phagocytosis and NK cell activity) by PCBs in loggerhead sea turtles.
The effect of pollutants is currently of critical concern as it is listed among top 20
research questions for sea turtle conservation on the global level (Hamann et al.,
2010). Although the number of congeners tested is reduced, we tested three of them.
Further studies have to be performed to test additional congeners or mixtures. Noncoplanar hexachlorinated PCB-138 was tested as it was among the most abundant
congener in loggerhead sea turtles (Camacho et al., 2014; Keller et al., 2004b, 2006;
Lazar et al., 2011; Oros et al., 2009; Storelli et al., 2007). The coplanar mono-ortho
PCB 105 and non-ortho PCB 169 were chosen because they are stereoisomers of the
highly toxic TCDD and have been shown to act through the same mechanism of
action through binding to the AhR. These congeners were reported in the liver of
loggerhead sea turtles (Alava et al., 2011; Camacho et al., 2013; Storelli et al., 2007;
Richardson et al., 2009).
Compared to aquatic mammalians, PCB concentrations are about one order of
magnitude lower in sea turtles (Camacho et al., 2013; Keller et al., 2004). However,
loggerhead sea turtles have omnivorous feeding habits, which make them more likely
to bioaccumulate contaminants than some other sea turtle species, such as leatherback
and green sea turtles (Bjorndal, 1997). Additionally, ingestion of debris might add
variability to the concentrations of PCBs in the sea turtles. Incidental ingestion of
marine debris, particularly plastics that has been found in many sea turtles (Bjorndal,
1997), increase adsorption of PCBs up to 106 higher than surrounding seawater (Mato
et al., 2001).
Only three authors reported measured PCBs in loggerhead sea turtles’ blood
(Camacho et al., 2013; Keller et al., 2004a, 2006, Ragland et al., 2011). In these
studies blood concentration of sum PCBs ranged from 5,560 pg/g (5.56 ppm) wet
mass whole blood (mean, Keller et al., 2004a) to 7,267 pg/g (7.3 ppm) wet mass
plasma (median for transient animals, Ragland et al., 2001). Blood sampling may act
169
as a representative, non-lethal sampling mechanism to test for organochlorine
concentrations (Keller et al. 2004a). The concentrations of tested PCBs ranged from
0.5 to 20 ppm as it represented concentrations previously used to investigate and
compare the immunotoxic effects of OCs upon in vitro exposures in several marine
mammal species (Levin et al., 2007a). The mammalian studies that demonstrated
immunosuppression by PCBs used concentrations near the high end of the range used
in the loggerhead turtle study (13.5 μg/ml=13.5 ppm). Enhancement, of lymphocyte
proliferation was observed in the rat study at a similar concentration that enhanced
loggerhead lymphocyte proliferation (0.005 μg/ml) (Keller et al., 2005). In many
vertebrate species, PCBs have been shown to trigger immunoenhancement at lower
concentrations and immunosuppression at higher concentrations (Keller et al., 2005).
The differences in immunotoxic effects observed between different vertebrate species
may also be explained simply by species differences in immune responses or the use
of different immune function tests.
Finally, the exact in vivo significance of the changes reported in the present in
vitro exposure study is hard to assess. Further studies to be done would measure PCBs
levels in blood of the animals during health assessment campains and use the same
sample to assay the innate immune functions. PCBs concentration was not determined
in the blood of captive animals from our study.
170
Annexe 5 : Poster Morris Animal Foundation Veterinary Student Scholar program:
Combined hematology and immunology : a breakthrough to understand immune
functions of stranded sea turtles
171
172
NOM PRENOM : ROUSSELET ESTELLE
TITRE : Etude du système immunitaire de la tortue caouanne (Caretta
caretta) : Utilisation comme outil diagnostique et indicateur de
toxicité des polychlorobiphényles (PCBs)
Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, (28 Novembre 2014)
RESUME
La recherche concernant les pathologies affectant les tortues caouannes (Caretta
caretta) et les polluants auxquels elles sont exposées, est incontournable au vu de l’importance
croissante de la conservation des espèces menacées d’extinction (IUCN) ainsi que l’implication
des vétérinaires en centres de réhabilitation. Les valeurs de référence de 33 paramètres
hématologiques et biochimiques ont été déterminées chez cinq classes d’âge successives
d’animaux juvéniles et captifs. Des tests permettant l’exploration fonctionnelle du système
immunitaire inné et acquis ont été développés et d’optimisés. Lymphocytes, monocytes et
éosinophiles ont été isolés par cytométrie de flux puis identifiés. La prolifération des
lymphocytes B et T l’activité « natural killer », la phagocytose et l’activité d’explosion
respiratoire portée par diverses populations cellulaires ont été étudiées. Une modulation de la
phagocytose et de l’activité NK ont été mises en évidence suite à l’exposition des cellules aux
PCB-105, -138 et -169. Cette étude constitue une première approche des effets des PCBs sur le
système immunitaire et devra être confirmée par des mesures directes de polluants à partir du
plasma des animaux sauvages ainsi que de tests fonctionnels du système immunitaire ex vivo.
MOTS CLES :
- Biphényles polychlorés
- Caretta
- Système immunitaire
JURY :
Président :
Monsieur le Professeur Frédéric BERARD
1er Assesseur :
2ème Assesseur :
Monsieur le Professeur Michel PEPIN
Monsieur le Professeur Philippe BERNY
DATE DE SOUTENANCE : Vendredi 28 Novembre 2014
ADRESSE DE L’AUTEUR :
4 rue des Nouvelles maisons
69009 Lyon