les microtubules
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BIOLOGIE CELLULAIRE PARTIE 1: LE CYTOSQUELETTE (R. MARSAULT) ! ➤ INTRODUCTION • Toutes les cellules eucaryotes possèdent dans leur cytosol un réseau de filaments protéiques très organisé et qui remplit de nombreuses fonctions: le cytosquelette. • Il est impliqué aussi bien dans le maintien de la forme des cellules que dans ses modifications, dans le mouvement des organites à l’intérieur du cytoplasme, dans les déplacements des cellules dans un milieu ou sur un support et dans leur division. • Le cytosquelette se compose: - des microtubules, d’un diamètre de 24 nm - des filaments d’actine, d’un diamètre de 7 à 9 nm - des filaments intermédiaires, d’un diamètre intermédiaire aux précédents (≃ 10 nm). ! CHAPITRE 1: LES MICROTUBULES 1 sur 41 I - STRUCTURE ET RÉGULATION A) Rappels sur la structure • Dès les années 60 on a mis en évidence ces structures en forme de petits tubes de 24 nm de diamètre. • L’unité de ces microtubules est un hétérodimère de tubuline α et de tubuline β. • La tubuline est une protéine d'à peu près 55 kDa. • On peut observer une extrémité C-terminal qui fait saillie en dehors de l'hétérodimère et donc en dehors du microtubule. Les interactions du microtubule avec des protéines partenaires se font pour la plupart sur l’extrémité C-terminal. • Ces sous-unités ont une activité de liaison du GTP : - Au niveau de la sous-unité α, on trouve le site N pour non-échangeable ou non-hydrolysable. - Au niveau de la sous-unité β, on trouve le site E pour échangeable ou hydrolysable. ! • La structure de ces tubulines ainsi que la séquence de leurs gènes est extrêmement conservée. Cependant, il existe une certaine variabilité: - Existence d'isotypes (≠ isoformes: les isotypes sont des protéines de la même famille de gène, les isoformes sont plusieurs formes d’une même protéine): ‣ Il existe plusieurs tubulines β (6 chez les mammifères) et plusieurs tubulines α, codées par des gènes différents. Cela induit des différences surtout au niveau des extrémités C-terminal donc des différences dans l’interaction avec un certain nombre de protéines partenaires. ‣ Ces isotypes sont spécifiques à certains tissus (exemple: β3 est spécifique des neurones). - Modifications post-traductionnelles extrêmement nombreuses: ‣ Elles peuvent avoir lieu soit sur l'hétérodimère alpha α-β directement, soit sur le microtubule polymérisé. 2 sur 41 ‣ Un grand nombre de modifications post-traductionnelles touchent l'extrémité Cterminale (Note: cette diapo est non-exhaustive). ‣ Elles impliquent des enzymes. Exemple: La détyronisation se fait par la carboxy‣ ‣ ! peptidase (cette détyronisation est très importante dans la régulation de l'interaction avec la kinésine). Très souvent, ces modifications sont associées à la stabilisation du microtubule. Exemple: L’acétylation permet une plus grande stabilité des cils ou flagelles. Note: Les extrémités C-terminal sont riches en glutamate donc chargées négativement, et les charges négatives sont impliquées dans les interactions avec les protéines partenaires. • Il existe aussi des isoformes de la tubuline, dont les fonctions sont encore soumises à discussion: - La tubuline γ est impliquée dans la biogenèse des microtubules - La tubuline δ joue un rôle dans les corps basaux (corps à la base des flagelles et cils) et les centrioles - La tubuline η aurait une importance dans la duplication des corps basaux - La tubuline ε a des fonctions qu’on ne connaît pas encore. ! B) Polymérisation des microtubules ➤ Polarité structurale • Dans les bonnes conditions, les hétérodimères α-β s'empilent toujours avec la même orientation pour former une structure appelée protofilament. Cela signifie qu'on aura une polarité structurale: si à une extrémité on a une unité α, de l'autre côté on trouvera une sous-unité β. • Au niveau du site E, des acides aminés catalysent l’hydrolyse du GTP en GDP. On a donc: - au niveau de la sous-unité α du GTP - au niveau de la sous-unité β du GDP généralement. ! 3 sur 41 ➤ Le microtubule • De manière générale, un microtubule est constitué de 13 protofilaments. • Les interactions permettant l’association de ces protofilaments sont essentiellement latérales, entre sous-unités de même isoforme. • Ces interactions donnent lieu à une structure très contrainte, avec un décalage par rapport à l’axe. ! ➤ Polarité fonctionnelle • À la polarité structurale s’ajoute une polarité fonctionnelle. • Expérience: - À partir d’un fragment préconstitué (fragment de flagelle ou de cil), les auteurs ont fait varier les concentrations de tubuline et ont défini une concentration critique: ‣ Au-dessus de la concentration critique on observe une polymérisation. ‣ En-dessous de la concentration critique on observe une dépolymérisation. - Les auteurs ont observé une instabilité dynamique plus forte d'un côté que de l’autre: 4 sur 41 ‣ Si on se place au-dessus de la concentration critique, l’incorporation des tubulines se fait de chaque côté mais un côté est plus instable (il y a constamment dépolymérisation et polymérisation). ‣ Si on se place en-dessous de concentration critique, il y a dépolymérisation des deux côtés mais un côté est plus instable. • Cette expérience montre que les 2 extrémités des microtubules ne sont pas équivalentes au niveau fonctionnel: - L’extrémité plus est celle où on observe le plus d’instabilité dynamique. - L’extrémité moins est celle où on observe le moins d’instabilité dynamique. ! C) Centrosome • Expérience: - In vivo, on utilise des molécules fluorescentes pour mettre en évidence la dynamique de la biogenèse des microtubules. Ici, du FITC est utilisé. Aujourd'hui, on utilise plutôt des protéines fluorescentes du type gfp. Les chimistes ont ici greffé un groupement fluorescent sur de la tubuline qui a été injecté par des moyens physiques (pas au moyen d’un plasmide). - Après 20 minutes seulement, on observe le réseau interphasique typique des microtubules. - Cette expérience montre la capacité d'incorporer de la tubuline marquée même en période interphasique en très peu de temps, c’est donc très dynamique. - La colchicine est un agent dépolymérisant du cytosquelette de microtubules, dont l'action est réversible. En lavant les cellules pour éliminer la colchicine et en incorporant à nouveau de la Tubuline-FITC, on observe le centre organisateur des microtubules (COMT) ou centrosome chez les mammifères. ! 5 sur 41 • Dans une cellule standard, les microtubules s’organisent autour du noyau. Ils prennent naissance autour d'un centre organisateur des microtubules (COMT) qui est le plus souvent en position périnucléaire. • Des expériences de microscopie électronique révèlent deux structures perpendiculaires l'une par rapport à l’autre et légèrement décalées, ce sont les centrioles. • Les centrioles sont constitués de 9 triplets périphériques de microtubules. Ils permettent de structurer le centre organisateur. • Autour, un matériel plus ou moins riches en électrons qu'on appelle le matériel péricentriolaire est constitué de protéines. • Dans la cellule, les microtubules sont tous orientés de la même manière: - Les extrémités moins sont ancrées dans le centre organisateur des microtubules. Ces extrémités sont donc maintenues assez stable. - Les extrémités plus à la périphérie sont soumis à une grande instabilité dynamique. 6 sur 41 D) Nucléation des microtubules: fonction du γ-TuRC • Une isoforme de tubuline fondamentale pour la nucléation des microtubules est la tubuline γ. On peut le prouver en utilisant des anticorps dirigés contre la tubuline γ, ce qui a pour effet de bloquer la nucléation. • La tubuline γ se présente sous forme d'un anneau, qui est en interaction avec de très nombreuses protéines (dont la caractérisation n'est pas encore tout à fait déterminée). • Ce complexe s'appelle le γ-TuRC pour γ Tubulin Ring Complex. • Rôle: C’est en quelque sorte un gabarit car de même diamètre que le microtubule. L'ensemble des protofilaments monte et est échafaudé à partir de cette structure. • On trouve ces γ-TuRC au niveau des centrosomes mais également massivement dans le cytoplasme. C’est un résultat qui a paru assez contradictoire. En fait, ils sont présents dans le cytoplasme sous une conformation différente, et c’est grâce au matériel péricentriolaire que les γ-TuRC prennent leur structure de gabarit pour la polymérisation des microtubules. ! E) Comportement dynamique des microtubules dans la cellule interphasique 7 sur 41 • Expérience: - Un lot de cellule dont la totalité de la tubuline est marquée par fluorescence rouge est injecté avec de la tubuline à fluorescence verte. Ce double marquage permet de distinguer la tubuline incorporée du reste de la tubuline. Les cellules sont fixées avec du formaldéhyde. - À t = 60 secondes, on observe que les extrémités des microtubules doublement marquées sont celles qui sont vers le cytoplasme. - Au bout de 3 minutes, le double marquage est toujours aux extrémités de manière un peu plus importante et également au niveau des centrosomes. - À 20 minutes, tout le réseau est doublement marqué. • Le dynamisme est tel qu'au bout de 20 minutes tout le réseau est doublement marqué. ! ➤ Instabilité dynamique des microtubules • Ici, on a modélisé la longueur moyenne des microtubules en fonction du temps. On peut différencier 3 phases: - A: phase de croissance - B: catastrophe, phase de décroissance qui se caractérise par une pente plus brutale que la phase de croissance. C’est une phase de dépolymérisation brutale, d’effondrement du microtubule sur lui même. Cette phase peut être soit complète (effondrement du microtubule jusqu’au centre organisateur) soit suivie d'un sauvetage. - C: phase de sauvetage. Le microtubule ne s’effondre pas jusqu'au centre organisateur et repolymérise. ! ➤ Mécanisme de l'instabilité dynamique des microtubules ! ! ! • Cette image de microscopie montre un microtubule en train de dépolymériser. Le microtubule s'écroule sur lui-même et s’effiloche. ! ! 8 sur 41 • Le point clé est le statut du nucléotide phosphate sous la sous-unité β (la sous-unité ɑ est toujours munie de GTP): - Lorsque la sous-unité β est sous forme GTP, le microtubule croît. - Lorsque la sous-unité β est sous forme GDP, le microtubule s’écroule. • Les biophysiciens ont montré que ce statut de GDP modifie la conformation et induit une courbure des protofilaments. ! ➤ Notion de coiffe GTP • On croyait auparavant qu’il suffisait d'avoir une à deux couches de sous-unités β sous forme GTP pour qu'il y ait polymérisation mais l’épaisseur requise est en fait beaucoup plus importante. Ces sous-unités forment une coiffe GTP. • L’épaisseur de la coiffe a été démontrée par l’utilisation d’anticorps spécifiquement dirigés contre le GTP ou le GDP. L’utilisation de ces anticorps a permis également de démontrer des clusters de GTP, des patch dans le corps du microtubules qui sont probablement très importants pour le sauvetage. ! F) Régulation du comportement dynamique des microtubules • Dans une cellule, les microtubules sont entourés de tout un contexte avec des protéines partenaires, parmi lesquelles on différencie 2 catégories: - Les MAP pour Microtubule Associated Proteins stabilisent les microtubules. - D’autres protéines partenaires sont des promoteurs de catastrophes. ! 1. Protéines de stabilisation: les MAP structurales • Les MAPs ont pour fonction: - L’espacement entre les microtubules 9 sur 41 - L’augmentation du taux de polymérisation - La diminution ou la suppression des catastrophes. • Les MAPs sont contrôlées par phosphorylation. • Il existe des MAPs de type I et de type II. ! a/ MAPs de type I • Les MAPs de type I sont surtout présents dans les neurones. On trouve la MAP1A dans les neurones adultes et la MAP1B intervient dans la neurogenèse. Ce sont de grosses protéines (300, 255 kDa). • Les MAPs de type I sont des protéines qui font de l'espacement entre les microtubules. Dans l'axone d’un neurone adulte, les MAP1A sont responsables de l’espacement très régulier des microtubules. • Les MAPs de type I favorisent la polymérisation en s’opposant aux catastrophes. • Les protéines sont représentées ici sous leur forme de précurseur: - Le précurseur subit un clivage en tant que modification post-traductionnelle (ciseau). - Cette maturation protéolytique génère une chaîne lourde (HC pour Heavy Chain) et une chaîne légère (LC pour Light Chain). - La chaîne légère possède un site de liaison à l’actine. • Très souvent, les MAPs sont intimement associés aux microtubules mais présentent aussi des sites d'interactions à l'actine. Ce sont donc des protéines capables d'interagir avec plusieurs éléments du cytosquelette. ! ! b/ MAPs de type II 10 sur 41 • Les MAPs de type II possèdent des domaines de liaison aux microtubules très bien caractérisés qu’on a identifié par mapping ou cartographie. • Expérience: Pour démontrer que le domaine Ct est le domaine de liaison aux microtubules, on fabrique une protéine chimérique dépourvue de ce domaine Ct et on vérifie que la capacité d’interaction avec les microtubules est perdue. • Parmi les MAPs de type II: - On trouve les MAP2a, MAP2b et MAP2c dans les dendrites. - MAP4 est ubiquiste, on la trouve dans la plupart des types cellulaires. - La protéine Tau est extrêmement étudiée, car très souvent impliquée dans des maladies de neurodégénerescence. • Comme les MAPs de type I, elles agissent en faisant un « pontage » qui permet un espacement très régulier. Elles favorisent la polymérisation car ce sont des protéines de stabilisation qui s'opposent aux catastrophes. ! 11 sur 41 ➤ Protéine Tau • Note: En réalisant une culture primaire de neurones de cortex, on perd la différenciation entre axone et dendrite. • La protéine Tau augmente la croissance des microtubules. Elle réduit les catastrophes. • La protéine Tau s’oppose à l’action de promoteurs de catastrophes (XKCM1) ou de protéines de fragmentation. • La protéine Tau est contrôlée par phosphorylation (cette régulation par phosphorylation est valable pour l'ensemble des MAPs). - La phosphorylation entraîne le détachement de la protéine Tau du microtubule. La stabilité du microtubule diminue. - Cette phosphorylation fait appel à des kinases (énormément de MAPs kinases ont été identifiées). • Dans les maladies de neurodégénérescence, on observe une hyperphosphorylation des protéines qui provoque la formation de plaques fibrilles. ! c/ MAP6 ou STOP protein • La famille MAP6 ou STOP protein (Stable Tubule Only Polypeptide) confère une très grande stabilité aux microtubules au niveau du système nerveux. ! → À retenir sur les MAPs: - Les MAPs sont étroitement associés aux microtubules. - Les MAPs contrôlent la stabilité des microtubules. - Les MAPs sont contrôlés par phosphorylation (MAP kinase, cdc2 kinase, MARKs…). La phosphorylation induit le détachement des microtubules. 12 sur 41 ! 2. Famille des +TIPs • Les +TIPs sont des protéines capables de cibler les extrémités plus des microtubules. • La famille des +TIPs regroupe des dizaines de protéines, parmi lesquelles: - XMAP215 (X car elle a été identifiée chez le Xenop et 215 car c’est une protéine de 215 kDa) favorise la polymérisation. - Les CLASPs (Cytoplasmic Linker ASsociated Proteins) et les CLIPs (Cytoplasmic LInker Proteins) favorisent les sauvetages. - Les protéines EB3 (End Binding) inhibent les catastrophes, favorisent la polymérisation. • Les protéines de la famille des +TIPs semblent être souvent en interaction. • Les mécanismes des +TIPs sont souvent contestés. Les résultats dépendent du modèle étudié (souris, nématode), de l'environnement in vitro et de l'approche expérimentale qui a été réalisée. • Quand on fournit de la tubuline α sous forme recombinante, tout le réseau de microtubules est marqué. • On observe la protéine EB3 aux extrémités des microtubules. • Les chercheurs se servent aussi de ces outils pour mesurer la fréquence des catastrophes. ! 13 sur 41 • Ces TIPs appartiennent à différentes familles de protéines. • L’action des TIPs dans la cellule n'est pas limitée à la régulation de la dynamique des microtubules. • Par exemple, EB1 sert à lier microtubules avec réticulum endoplasmique, ce qui fait d’EB1 une protéine extrêmement importante pour les microtubules mais aussi pour la vie de la cellule. • Ces TIPs font partie des éléments qui connectent les microtubules aux filaments d’actine. ! ➤ Microtubule Minus End Binding Proteins • Il existe également des protéines de l’extrémité -, nommées Microtubule Minus End Binding Proteins. Parmi celles-ci: - La tubuline γ, impliquée dans la nucléation des microtubules - Les CAMSAPs pour Calmodulin-Regulated Spectrin Associated Proteins, impliquées notamment dans la stabilisation des extrémités moins sans centrosomes (prolongements neuronaux, certaines cellules polarisées). Une protéine notable faisant partie de la famille des CAMSAPs est la protéine Nezha. ! 3. Protéines de déstabilisation ou promoteurs de catastrophes 14 sur 41 • Les promoteurs de catastrophes permettent de générer cette dépolymérisation brutale portant le nom de catastrophe. ! a/ Kinésines (MAPs motrices) • Les kinésines sont des moteurs moléculaires, capables de se déplacer principalement au niveau des microtubules en utilisant de l’ATP. • La grande majorité des familles de kinésines ne sont pas des promoteurs de catastrophes. • La kinésine-13 cependant est un promoteur de catastrophe. Cette protéine porte des noms très différents, par exemple Kif2C/MCAK (Mitotic Centromere-Associated Kinesin) chez les mammifères. • 2 mécanismes ont été identifiés pour la kinésine-13: - la séquestration de la tubuline, qui a pour effet d’abaisser la concentration de tubuline libre pour la polymérisation au voisinage de l'extrémité plus - La déstabilisation de l’extrémité plus en perturbant les interactions à cette extrémité. 15 sur 41 • Le domaine moteur de la MCAK humaine est un peu particulier car en position centrale. Ce domaine moteur est capable de lier et d'hydrolyser de l'ATP, ce qui est lié à un travail, par exemple le déplacement d'une vésicule. • Cette protéine est très régulée par phosphorylation. • Quand elle interagit avec la protéine EB, la MCAK permet d’entraîner une dépolymérisation par la protéine EB. ! b/ Stathmines (Oncoprotéines 18 ou Op18) • Les stathmines sont de petites protéines qui ont été et sont encore très étudiées. • L'activité de la stathmine sur les microtubules est indirecte: la stathmine piège 2 molécules d’α,β-tubuline dimérique pour former un complexe T2S. Ces dimères ne sont plus disponibles pour faire de la polymérisation. La stathmine a donc une activité de déstabilisation indirecte. • Ces protéines sont aussi contrôlées (inhibées) par phosphorylation. • Les stathmines ont un profil complexe de phosphorylation: en mitose, c'est une phosphorylation séquentielle qui désactive petit à petit la stathmine. • Intérêt de l’inactivation progressive: par exemple, pour accrocher les kinétochores, il faut augmenter l'instabilité des microtubules. L’inactivation progressive lors de la mitose permet aux stathmines d’être toujours actives en prométaphase pour jouer leur rôle de déstabilisation. ! 4. Protéines à activité « découpante » ou severing proteins 16 sur 41 • Il faut bien différencier l’activité « découpante » d’une protéolyse: les severing proteins déstabilisent pour fragmenter. • Les severing proteins sont des protéines de la superfamille des AAA (ATPases Associées à des Activités cellulaires). Elles ont besoin d'une activité ATPasique pour fonctionner. ! ! ! • Une protéine à activité « découpante » à retenir est la katanine. ! • On peut observer l’activité de fragmentation très rapide de la katanine en étalant des microtubules au temps 0 et en fournissant à la cellule des protéines recombinantes. ! ! ! ! ! ! ! ➤ Katanine • La katanine se présente sous la forme d’un oligomère, constitué: - d’une sous-unité p60 pourvue de l’activité ATPasique nécessaire pour « fragmenter » les microtubules - d’une sous-unité p80 permettant l’adressage (au centrosome, au centromère) • On ne connaît pas le mécanisme d’action des katanines. On sait qu'elles interagissent avec certains isotypes de tubulines et certaines tubulines post-traductionnellement modifiées. ! ! • ! 17 sur 41 • Quelques exemples de fonctions: - La katanine peut être dirigée vers le centrosome ou bien au niveau du kinétochore au moment de la division cellulaire. Lors du passage de l'interphase à la mitose, les microtubules doivent être rapidement démontés, d’où l’utilité de cette activité de fragmentation. - Pendant l'anaphase A, les chromosomes montent vers les pôles. Ce phénomène fait intervenir la kinésine-13 pour la déstabilisation mais aussi la katanine pour la fragmentation. ! G) Composés affectant les microtubules • Beaucoup des composés affectant les microtubules sont extraits du monde végétal: - La colchicine, issue de la colchique, se lie à la tubuline et inhibe la polymérisation. - La vinblastine se lie à la tubuline et inhibe la polymérisation. 18 sur 41 • Le nocodazol (nom à retenir) est un composé de synthèse se liant à la tubuline et inhibant la polymérisation. • Le Taxol (nom commercial) est très utilise comme anti-mitotique pour les cancers. Contrairement aux autres composés, il stabilise les microtubules. ! ! II - QUELQUES GRANDES FONCTIONS DES MICROTUBULES • Les microtubules jouent un rôle dans: - le battement ciliaire et flagellaire - les transports intracellulaires et le maintien de la compartimentation intracellulaire - la division cellulaire: mise en place du fuseau mitotique, séparation des chromosomes, … • Ces fonctions nécessitent les moteurs moléculaires associés aux microtubules ou MAPs motrices. ! A) Le battement ciliaire et flagellaire 19 sur 41 • Les battements ciliaires et flagellaires sont essentiels à la survie de l’espèce humaine. En effet, sans battement ciliaire, il n’y aurait pas de mouvement dans l'oviducte et sans flagelle pas de mouvement du spermatozoïde. • L’épithélium respiratoire est muni de cils. Des mutations au niveau des microtubules impliqués dans le battement de ces cils mènent à des pathologies respiratoires. • Dans l’épithélium respiratoire, les cils sont implantés individuellement. Dans la branchie, les cils forment un tapis ondulant en vagues. Les cils paraissent ici en relation les uns avec les autres par leurs structures d’ancrage cytoplasmique. ! ! ! ! • Mouvement de cils et flagelles: - Les cils engendrent un mouvement de liquide parallèle à leur surface d’implantation. - Les flagelles provoquent un mouvement perpendiculaire à celle-ci, induisant le déplacement de la cellule. ! ! ! • On parlera indifféremment de battement ciliaire et flagellaire, bien qu’il y ait quelques différences dans le type d'onde, la puissance, la fréquence par exemple. ! ! ! ! ! ! 20 sur 41 • Un cil de paramécie a été coupé transversalement à différents niveaux. On peut distinguer de la base vers l'extrémité plus un système assez complexe d’organisation des microtubules: - Le corpuscule basal ressemble beaucoup au centriole: ‣ On observe une structure tubulaire avec 9 triplets périphériques reliés à une gaine centrale. Cette structure est assez solide car tous les éléments sont reliés. ‣ Ce sont des édifices protéiques impliquant plusieurs centaines de protéines différentes. ‣ Il existe des exemples de conversion entre corpuscule basal et le centriole (flagelle du spermatozoïde). - Plus haut se trouve une zone de transition: ‣ Cette zone est dépourvue de gaine centrale. ‣ C’est une zone un peu plus fragile qui est utilisée par les chercheurs pour casser le cil. - Plus haut encore, on trouve l’axonème: ‣ L’axonème est véritablement la partie motrice du cil. ‣ C’est une structure assez complexe où on retrouve les doublets périphérique et structure centrale. ! • L’étude du battement ciliaire et flagellaire se base sur 2 modèles: le flagelle du spermatozoïde et Chlamydomonas reinhardtii, algue unicellulaire. 21 sur 41 1. Structure et organisation de l'axonème • L’axonème est la partie motrice dans la partie terminale du cil ou du flagelle. • L’axonème a une structure qu’on nomme 9 + 2. C’est la structure universelle qu'on retrouve du Protozoaire à l’Homme. Cette structure est composée: - de 9 doublets périphériques de microtubules un peu particuliers: ‣ Le microtubule A est un microtubule complet à 13 protofilaments. ‣ Le microtubule B est un microtubule dit incomplet à 10 ou 11 protofilaments, partiellement fusionné au microtubule A. - d’un doublet central composé des microtubules C1 et C2 parfaitement individualisés. C1 et C2 sont liés entre eux par des ponts protéiques. La structure en gris clair autour correspond à des structures protéiques qui se projettent hors du doublet central (on a identifié à ces projections un rôle très important dans le battement chez Chlamydomonas). • L’axonème est une structure assez complexe avec bien entendu les microtubules mais aussi tout un ensemble de protéines: - Les 9 doublets périphériques sont rendus solidaires entre eux par des ponts protéiques de nexine qui jouent un rôle très important dans le battement. - Des bras rayonnants partent des microtubules A pour rejoindre le doublet central. 22 sur 41 - Au niveau du microtubule A, des bras de dynéine (dynéine axonémale = dynéine ! ciliaire) font saillie soit vers l’extérieur soit vers l’intérieur de l’axonème: ‣ Le bras externe est tourné vers la membrane plasmique. ‣ Le bras interne est tourné vers le centre de l’axonème. La dynéine est le moteur moléculaire permet le battement ciliaire. ➤ La dynéine axonémale - bras externe • Le bras externe est lié au microtubule A et est en interaction (modulée par l’ATP) avec le microtubule B du doublet adjacent. • Les bras externes sont de très grosses structures polypeptidiques de plus de 2000 kDa constituées: - de 3 chaînes lourdes α, β et γ, chacune de plus de 500 kDa (tubuline: 55 kDa) formant un complexe de plus de 1500 kDa portant la partie motrice, c'est à dire le site de liaison au microtubule et le site de liaison et d’hydrolyse de l’ATP dans la partie C-terminale. Les parties N-terminales des 3 chaînes lourdes sont en interaction les unes avec les autres mais aussi avec les autres chaînes. - de chaînes légères (LC) servant à la régulation. Par exemple, la liaison du calcium à LC4 modifie la relation entre LC4 et la chaîne lourde. - de chaînes intermédiaires (IC78 et IC69) permettant d'ancrer l’ensemble au microtubule A. - Les chaînes intermédiaires fonctionnent avec le docking complex (DC1, DC2 et DC3), c'est à dire le domaine d'ancrage. Le docking complex ne fait pas partie de la dynéine mais n’en est pas moins essentiel. • C’est l'extrémité C-terminale de la chaîne lourde qui porte le domaine moteur: - On peut mettre en évidence la présence de 6 domaines de 220 acides aminés, appelés AAA (ATPase Associée à une Activité cellulaire), domaines impliqués dans l'hydrolyse de l’ATP. Ces domaines forment un anneau (head). 23 sur 41 - Les sites de liaison au microtubule sont individualisés au bout de tiges (stalk) formées par l’enroulement d’hélices α séparées de 130 acides aminés. • La partie motrice forme une sorte de roue composée des 6 domaines AAA. • Entre les régions AAA4 et AAA5 (stalk), des hélices alpha se surenroulent et individualisent le site d’interaction (MTBD). • La région du cou (neck) est une région souple qui permet le bon fonctionnement de la dynéine. • La partie N-terminale de la protéine (tail) est en interaction avec les chaînes intermédiaires, les chaînes légères etc. ! ➤ La dynéine axonémale - bras interne • La caractérisation des bras internes est moins avancée. 24 sur 41 • Tout le long des microtubules on observe une organisation répétitive. Les dynéines ne sont pas distribuées au hasard: le complexe se répète tous les 96 nm. Une unité de 96 nm comporte: - 4 bras externes (ODA pour Outer Dynein Arm) - 8 structures peptidiques formant les bras internes: ‣ 1 complexe à 2 chaînes lourdes (fα et fβ) sous forme de dimère, en interaction avec de nombreuses chaînes intermédiaires et légères. ‣ 6 chaînes lourdes. - 3 bras rayonnants (RS pour Radial Spoke): 2 bras sont complets (RS1 et RS2) et un bras est avorté chez Chlamydomonas (RS3) - N-DRC (Nexin - Dynein Regulatory Complex): la nexine permet de former un pont protéique entre les 9 doublets périphériques - complexe de régulation de la dynéine. • La tomographie permet d'avoir une reconstruction tridimensionnelle de l’organisation de l’axonème. • Beaucoup plus récemment, on a mis en évidence des MIP (Microtubule Inner Proteins). La plus étudiée est MIP3 qui se trouve au niveau du microtubule B qui est probablement impliquée dans la jonction au microtubule A. 25 sur 41 2. Mécanisme du battement ➤ Expériences de Gibbons et al, 1965 • Chez la Paramécie, on peut facilement couper un cil dans sa zone de transition avec un laser. Des expériences sur des cils de Paramécie ont permis de comprendre certains aspects du mécanisme du battement ciliaire: - En traitant un cil avec du détergent, il n'y a pas de battement, mais si on rajoute de l’ATP en présence de magnésium on retrouve le battement: ‣ Le détergent fait des trous dans les membranes et dissipe ainsi les ions dont le magnésium et les gradients nécessaires pour produire l’ATP. ‣ Le battement implique donc une ATPase à magnésium. - En traitant un cil avec du détergent et de la trypsine, il n’y a pas de battement. En ajoutant de l’ATP et du magnésium, on ne récupère pas le battement mais on observe un glissement des doublets les uns sur les autres. ‣ La trypsine a une action protéolytique ménagée, c’est à dire qu’elle détruit certaines protéines mais la dynéine reste intacte. ‣ L’absence de battement est normale parce que le traitement a dissipé le gradient nécessaire pour la production d’ATP. ‣ L’ajout d’ATP permet de faire fonctionner les ATPases. Mais l'action de la trypsine est de grignoter les ponts de nexine qui solidarisent les doublets. ! ➤ Théorie du glissement des doublets périphériques 26 sur 41 • Une protéolyse douce par la trypsine rompt les ponts de nexine. L’ajout d’ATP résulte en un glissement des doublets périphériques, car il n'y a plus ces ponts pour empêcher le glissement. • Il est important de montrer la direction du moteur: les dynéines se déplacent vers l’extrémité moins, c’est à dire vers le corpuscule basal. • La dynéine est fixée sur le microtubule A et interagit avec le microtubule B du doublet adjacent. Elle se déplace vers corpuscule basal et entraîne une courbure. Si les ponts de nexine sont présents, on ne peut pas avoir de glissement, il y a une courbure. ! ➤ Mécanisme du déplacement de la dynéine 27 sur 41 • Par analogie avec le système actine-myosine, le mécanisme est entièrement basé sur la liaison et l'hydrolyse de l’ATP, qui génèrent des modifications de conformation de la dynéine ainsi que des modifications dans l’affinité de la dynéine pour le microtubule: - La dynéine dépourvue d'ATP est fixée au microtubule. - La liaison d'ATP provoque une modification conformationnelle, la dynéine se détache du microtubule. - L’hydrolyse de l’ATP provoque la formation d’une nouvelle liaison à une distance de 8 nm vers l’extrémité moins du point de liaison précédent. - Powerstroke: L’énergie provenant de l’hydrolyse de l’ATP permet le retour à la conformation initiale. La dynéine étant fixe, c’est le microtubule qui bouge. ! ➤ Comment expliquer le mouvement de battement? • Glissement des microtubules + éléments de résistance mécanique (ponts de nexine) = courbure. Comment passe-t-on à un battement ? • Hypothèse: Les différentes dynéines le long du flagelle ne s’activent pas en même temps, ce qui génère un battement. ! • Expérience: Des spermatozoïdes sont congelés dans différentes phases de leur mouvement. On observe en faisant des coupes dans l’axonème que toutes les dynéines ne sont pas activées en même temps. Lorsqu’il y a courbure d'un côté, il y a relaxation de l’autre. • Des courbures activées en séquence dans le temps et dans l'espace génèrent un battement. 28 sur 41 ! • Question: Quels sont les mécanismes de cette activation séquentielle et leurs régulations? • Le mécanisme de l’activation séquentielle fait sûrement intervenir l’axe entre le doublet central, les bras rayonnants et les DRC (Dynein Regulatory Complex). • Régulation calcique: Le calcium joue un rôle très important dans la régulation du battement ciliaire. Parmi les protéines sensibles au calcium: - La calmoduline (20 kDa) possède 4 sites de liaison pour le calcium. Quand elle est chargée, elle reconnaît une séquence sur une autre protéine. En se fixant, elle change la conformation de la protéine et régule sa fonction. Elle est en position clé car elle se trouve en interaction avec les bras rayonnants, dont on pense qu’elle permet la rigidité. - la centrine - la LC4 de la dynéine (en interaction avec la chaîne lourde γ du bras externe) - … • Régulation par phosphorylation: - Elle fait intervenir des kinases (la kinase clé est une kinase AMPc dépendante) et des phosphatases. - Parmi les cibles de ces kinases et phosphatases: IC138 du bras interne, chaîne lourde α du bras externe, … • Un résultat est valable avec un modèle et est propre à ce modèle. Ainsi, la rotation du doublet central serait extrêmement importante pour Chlamydomonas pour le battement ciliaire, mais cette hypothèse ne peut être valable pour les organismes dépourvus de doublet central (structure 9+0). ! ! 29 sur 41 • Il existe également des cils 9+0 capables de battement. 3. Les pathologies liées aux cils/flagelles = ciliopathies • Certaines dyskinésies primaires sont liées aux cils (et flagelles) motiles. 29 gènes incriminés (décembre 2014, notamment dans le bras externe de la dynéine). • Quelques exemples: - Infections voies aériennes (épithéliums repiratoires) - Infertilité (flagelle du spermatozoïde, trompe de Fallope) - Hydrocéphalie (cellules épendymaires) - Établissement de l’asymétrie gauche-droite (cellules nodales embryonnaires). ! B) Transports intracellulaires et maintien de la compartimentation intracellulaire ➤ Recherche des moteurs impliqués dans le transport axonal • Jusqu’aux années 80, la dynéine était le seul moteur moléculaire connu associé aux microtubules. ! 30 sur 41 • Le microtubule est un bon exemple d'étude de transport car il existe des prolongements axonaux très longs mais la synthèse de molécules se fait uniquement dans le corps cellulaire. Les molécules sont acheminées par des vésicules. • On s’est aperçu qu’il était possible de bloquer ce transport par des analogues non hydrolysables de l’ATP, donc une activité ATPasique et donc un moteur moléculaire sont nécessaires à ce transport. • On différencie 2 sens de circulation: - Le transport antérograde se fait du corps cellulaire vers l’extrémité de l’axone (= cône de croissance). - Le transport rétrograde se fait du cône de croissance vers le corps cellulaire. • L’axone comporte une population gigantesque de microtubules tous orientés de la même façon: l’extrémité plus est vers le cône de croissance, l’extrémité moins vers le corps cellulaire. • Ces observations laissaient penser qu’il existait un autre moteur moléculaire que la dynéine, qui se déplace uniquement vers l’extrémité moins. ! 1. Dynéine cytoplasmique ➤ Mise en évidence de la dynéine cytoplasmique 31 sur 41 • À partir d’extraits nerveux, l'axoplasme a été purifié dans le but d’obtenir une zone très riche en microtubule. • Une température de 4°C induit la dépolymérisation des microtubules. • Une centrifugation à froid permet de séparer 2 fractions: - le culot (C1), contenant tout un ensemble de vésicules synaptiques avec un ensemble de protéines associées. - le surnageant (S1), dans lequel il y a essentiellement de la tubuline, mais aussi les MAPs qui sont intimement liées de façon à ce qu'elles vont copurifier avec la tubuline. • Le traitement de la fraction avec de l’ATP provoque la libération du moteur moléculaire (déplacement sur un monomère au lieu d’un polymère). On a observé la libération d'une MAP qu'on a appelé MAP1C. ! ➤ Caractérisation de la dynéine cytoplasmique • Les auteurs ont séquencé cette protéine MAP1C: - MAP1C est une protéine de la famille des dynéines, appelée dynéine cytoplasmique. - Sa structure et son fonctionnement sont très conservés. - Elle possède des chaînes lourdes avec les mêmes modules (head, stalk, tail) et est en interaction du côté N-terminale avec des chaînes intermédiaires et légères. • On a mimé ce qui se passe au niveau d'un axone: la dynéine a été fixée sur un support et un microtubule a été ajouté: on a observé le déplacement du microtubule avec l'extrémité plus vers l’avant, ce qui prouve que cette dynéine se déplace vers l’extrémité moins. 32 sur 41 • Il y a une différence fondamentale avec la dynéine axonémale: la dynéine cytoplasmique n'est pas fixée au microtubule, donc si on fait agir la dynéine sur une vésicule (qu’on appelle cargo), celle-ci se déplace vers l'extrémité moins. La dynéine cytoplasmique est donc le moteur moléculaire du transport rétrograde. • La protéine MAP1C fonctionne avec l'équivalent d'un cofacteur, le complexe dynactine. ! ➤ Complexe dynactine • Le complexe dynactine est composé de différentes protéines, dont les plus remarquables sont: - le filament Arp1 pour Actin Related Protein car c’est une protéine très relatée à l’actine - p150 qui possède des sites de liaison au microtubule et est en interaction avec d'autres protéines, notamment la dynamitine (p50). ! → À retenir sur la dynéine cytoplasmique (MAP1C): - La dynéine cytoplasmique a une structure très conservée par rapport à la dynéine axonémale (= dynéine ciliaire). - La dynéine cytoplasmique fonctionne avec l'aide d'un complexe dynactine formé d’un très grand nombre de protéines - La dynéine cytoplasmique est capable de déplacer des cargos vers l'extrémité moins des microtubules. ! ! ! ! ! ! ! ! 33 sur 41 2. Kinésines ➤ Mise en évidence des kinésines • Dans les années 80, d'autres chercheurs ont repris la même expérience mais se sont intéressés au culot, en cherchant d’éventuels moteurs moléculaires restés côté cargo. Après homogénéisation et centrifugation à très grande vitesse (ultracentrifugation), 2 fraction ont été individualisées: - le culot (C2) contenant les membranes des vésicules synaptiques - le surnageant (S2), qu’on teste pour une activité motrice. • Test de la fraction S2: Des microtubules sont stabilisés par du taxol. On utilise des billes de taille connues qui miment des vésicules synaptiques: - Témoin négatif: En ajoutant uniquement de l’ATP, il ne se passe rien. - En présence de la fraction S2 et d’ATP, les chercheurs ont observé un mouvement. - En utilisant un microtubule dont la polarité a été repérée, les chercheurs ont observé que le mouvement se faisait vers l’extrémité plus. Or des moteurs moléculaires se déplçant vers l’extrémité plus n’avaient jamais été mis en évidence auparavant. Les chercheurs ont pu démontrer qu’il s’agissait bien d’une protéine par une expérience de dénaturation à la chaleur ou de dégradation par une protéase. 34 sur 41 - La substitution de l’ATP par un analogue non hydrolysable a pour effet de figer l'activité des billes. • On peut conclure de cette expérience qu’il existe dans la fraction S2 une molécule dénaturable par la chaleur qui utilise de l’ATP en l’hydrolysant et se déplace vers l’extrémité (+) du microtubule. Il faut maintenant la purifier: - En ajoutant à la fraction S2 des microtubules et un analogue non hydrolysable de l’ATP, le moteur moléculaire est piégé sur le microtubule. - Une centrifugation permet d’isoler le microtubule et le moteur moléculaire des autres molécules. - La libération du moteur moléculaire se fait par l’ajout d’ATP. • Ce moteur moléculaire se dirigeant vers l’extrémité plus est baptisé kinésine. ! ➤ Kinésine conventionnelle (kinésine I) • Structure de la kinésine conventionnelle: - La kinésine conventionnelle est constituée de 2 chaînes lourdes et 2 chaînes légères. - La partie violette à gauche correspond à la partie motrice (tête). Elle lie l'ATP et est en interaction avec le microtubule; - La queue est formée par le surenroulement des chaînes lourdes dans la partie Cterminale. - Entre la tête et la queue se trouve le cou. - Les chaînes légères ont une fonction de régulation. • Un double marquage des microtubules et de la kinésine conventionnelle permet de mettre en évidence que cette kinésine est extrêmement exprimée sur les microtubules. 35 sur 41 ➤ La « marche » de la kinésine (version simplifiée!) • La kinésine se déplace en « marchant ». • Notion de « processivité »: La kinésine peut parcourir des distances très longues (800 nm en moyenne) sans se détacher du microtubule. La « processivité » s’explique car la kinésine possède 2 têtes et l'une de ces têtes est toujours attachée au microtubule. ! ➤ Famille des kinésines • On a ensuite purifié de très nombreuses kinésines. • Beaucoup de kinésines se présentent comme des dimères. • Toutes ces kinésines, pour appartenir à la superfamille des kinésines, possèdent un domaine moteur de 350 acides aminés. Ce domaine moteur peut se trouver en fonction des kinésines dans la partie C-terminale ou dans le centre de la molécule. 36 sur 41 • Les kinésines interviennent dans deux grands domaines: - le transport - le cycle cellulaire. • Quelques kinésines remarquables: - La kinésine 2 est une kinésine axonémale. - La kinésine 13 est un promoteur de catastrophe. - La kinésine 14 possède un domaine moteur en C-terminal. C’est la seule famille de kinésines qui se déplace vers l’extrémité (-). Une mutation dans le domaine du cou modifie le sens de déplacement des kinésines. ! - La kinésine 4 ou chromokinésine est capable de se lier aux chromosomes. 37 sur 41 3. L’implication des microtubules et des moteurs moléculaires dasn le positionnement des organelles. Exemple du Golgi • Dans une cellule, le positionnement des organelles fait intervenir les microtubules et leurs moteurs moléculaires: - L’appareil de Golgi est en position périnucléaire dans une cellule classique (ex: fibroblaste), donc vers les extrémités (-) des microtubules. Cela mène à penser que les dynéines sont responsables du positionnement de l’appareil de Golgi en position périnucléaire. - Le réticulum endoplasmique est situé plus vers la périphérie de la cellule, donc vers l’extrémité (+) des microtubules grâce aux kinésines. ! ➤ Mise en évidence de l’implication des microtubules dans le positionnement de l’appareil de Golgi • On ajoute du nocodazole et on regarde ce qui se passe dans le temps. Le nocodazole dépolymérise les microtubules. • On observe la dispersion de l'appareil de Golgi. 38 sur 41 • Les microtubules sont donc impliqués dans le maintien de l’appareil de Golgi en position périnucléaire. ! ➤ Moteurs moléculaires impliqués • En réalisant un marquage d’une chaîne légère de dynéine et un marquage de type golgien, on peut vérifier que les résultats se superposent. • En surexprimant la dynamitine, on observe une dispersion de l’appareil de Golgi. En effet, la dynamitine est inclue dans le complexe dynactine, sans lequel la dynéine ne fonctionne pas. Si on surexprime la dynamitine, on induit une perturbation du fonctionnement de la dynéine. • Donc le complexe dynéine/dynactine est actif pour maintenir l’appareil de Golgi en position périnucléaire. ! 39 sur 41 • En utilisant un anticorps anti-kinésine, on observe un effondrement de l’appareil de Golgi en position périnucléaire. Les kinésines sont donc elles aussi impliquées dans le maintien de la position de l’appareil de Golgi. ! ➤ Transport RE vers Golgi • Le transport du réticulum endoplasmique vers l’appareil de Golgi implique la dynéine cytoplasmique: - On marque par fluorescence une protéine devant être transportée du réticulum endoplasmique à l’appareil de Golgi. En faisant varier la température, on s’aperçoit que: ‣ À 40°C (température non permissive), la protéine est bloquée dans le réticulum endoplasmique ‣ À 32°C (température permissive), la protéine migre vers le Golgi. - La sur-expression de la dynamitine perturbe ce transport. La dynéine cytoplasmique ! est donc impliquée. ➤ Fonction des moteurs au niveau du Golgi • Complexe dynéine/dynactine: - Transport des vésicules du réticulum endoplasmique vers l’appareil de Golgi - Maintenance de l’appareil de Golgi à côté du centrosome • Kinésine conventionnelle: - Influence l’architecture et l’organisation du Golgi - Transport de vésicules du TGN à la membrane plasmique ! ➤ Un exemple de transport intracellulaire: le transport des mélanosomes dans les mélanophores 40 sur 41 • Les mélanophores sont des cellules particulières qu’on retrouve chez les poissons et les batraciens. • Il a été montré que l’agrégation et la dispersion des mélanosomes sont sous contrôle hormonal: - L’augmentation du taux d’AMPc provoque la dispersion des mélanosomes. C’est un mouvement vers l’extérieur, ce qui laisse penser que le moteur moléculaire impliqué est une kinésine. - La diminution du taux d’AMPc provoque l’agrégation des mélanosomes. C’st un mouvement vers le noyau, ce qui laisse penser que le moteur moléculaire impliqué est une dynéine. • Les auteurs ont également démontré le rôle de l’actine dans le transport, qu’on peut comparer à une départementale face aux microtubules qui servent plutôt d’autoroute. • Les moteurs moléculaires impliqués sont la dynéine cytoplasmique et la kinésine-2. • Le mécanisme de régulation de l’activité de la kinésine et de la dynéine implique une protéine kinase associée à l’AMPc (pKA) et liée à la protéine XMAP4 41 sur 41
