Annéeuniversitaire2011Ͳ2012 Mercredi14décembre2011 LV303EXAMEN1èresession,2ndepartieͲDUREETOTALE120min–4pages 2PARTIESARENDRESURDESCOPIESSEPAREES VOUSNEDEVEZGARDERAPORTEEDELAMAINQUEPAPIERETSTYLOS. LESDOCUMENTS,CALCULETTES,TELEPHONESETAUTRESSMARTPHONESDOIVENTETRE IMPERATIVEMENTPLACESATERRE. ___________________________________________________________ ENZYMOLOGIE(pages1Ͳ2,25points)ͲCOPIE1 UneenzymeallostériquehomodimériqueEfixeunsubstratSetdeuxeffecteursallostériquesXetY.Chaque sousͲunitédeEpossèdeunsitedefixationpourS,unsitedefixationpourX,etunsitedefixationpourY. EsuitlemodèledelatransitionconcertéedeMonod,WymanetChangeux. SetXsefixentexclusivementsurR,etYsefixeexclusivementsurT. On mesure les vitesses initiales Vi de la réaction en fonction de [S]. On obtient la Figure 1 où les valeursdeVisontexpriméesenµmol.LͲ1.sͲ1,etcellesde[S]enµmol.LͲ1: enabsenced’effecteur(a) enprésencede[X]=100KX(b) enprésencede[Y]=KY(c) KX et KY sont respectivement les constantes d'équilibre de dissociation de XetY.Laconcentrationd'enzymeE0est de1µmol.LͲ1. Q1°.CaractérisezqualitativementleseffetsdeXetYàl’aidedecegraphe.DequelsystèmeKouVs'agitͲ il,etpourquoi? Sigmoïdes tendant vers une hyperbole à saturation en activateur, Km variables, Vmax apparemment identiques(àvérifierplusloin)ÆSystèmeK LacourbebindiquequeXestunactivateurquidéplaceEentièrementverslaformeR,compteͲtenudesa concentrationуsaturante. LacourbecindiquequeYestuninhibiteurquidéplacepartiellementEverslaformeT(ilesticiseulement demiͲsaturantpourT). Page 1 sur 6 Q2°.VersquellevaleurtendKT,laconstantededissociationdeTpourS?mêmequestionpoura=KR/KT? Fixationsexclusives=AffiniténulledeTpourS:KTÆьeta=KR/KTÆ0 Q3°.Sachantqu’enabsencedesubstratsetd’effecteurslaproportiondeformeTest10foissupérieureà celledeR,quelleestlavaleurdeL0? L0=T0/R0=10(ou100pourlesétudiantsquiontmallu) LesdonnéesdelaFigure1sontreprésentéesselonLineweaverͲBurke(Figure2),où1/Viestexprimé Ͳ1 Ͳ1 enPmol .L.s,et1/[S]enPmol .L Q4°. Pourquoi seule la courbe b estͲelle unedroite? Parce qu’à saturation en activateur tout est sousformeR,pasdecoopérativitédefixation deS,alluremichaelienne. Q5°CettereprésentationvouspermetͲelle de confirmer votre réponse à la Q1° (systèmeKouV)etpourquoi? Oui, car les 3 courbes tendent bien vers la mêmeVmaxàsaturationenS. Q6°.QuelleestlavaleurdeVmax(avecses unités) de la réaction catalysée par E ? justifiezvotreréponse Ͳ1 Ͳ1 Ͳ1 1/Vmax=0.1Pmol .L.sÆVmax=10Pmol.L .s Q7°.QuelleestlavaleurduKm(avecsesunités)delaformeR?justifiezvotreréponse Ͳ1 Ͳ1 Lorsque1/Vi=2/Vmax=0,2Æ1/[S]=1/Km=1Pmol .LÆKm=1Pmol.L On incube 100 µg de E en présence de [X]=100 KX. On ajoute à ce mélange une concentration saturante d'un analogue structural de S, de formule RͲCOͲCH2ͲCl, et marqué au carboneͲ14. Cet analogue réagitavecunecystéinedusiteactifselonlaréactionirréversiblesuivante: EͲSH+RͲCOͲCH2ͲClÆEͲSͲCH2ͲCOͲR+HCl 13 Ͳ1 Laradioactivitéspécifiquedel'analogueestde10 cpm.mol .Enfinderéaction,Eesttotalementinactiveet 4 laradioactivitéfixéesurles100µgdeEestde10 cpm.Rappel:l'enzymeestunhomodimère. Page 2 sur 6 Q8°.Queltyped'inhibitionl'analogueRͲCOͲCH2ͲClexerceͲtͲil?QuelleestlamassemolairedeE?justifiez vosréponses. Mêmesic’estunanaloguestructuraldeS,cen’estpasuninhibiteurcompétitif«classique»,puisqu’ilsefixe defaçoncovalentesurE(etl’inhibeirréversiblement).C’estunmarqueurd’affinité. CompteͲtenudelasaturationenX,toutl’enzymeestsousformeR,quipeutfixerSoubienl'analoguedeS. En fin de réaction E est totalement inactive : les cystéines fixant l'analogue sont donc toutes modifiées. E étantdimérique,2cystéinesdoiventêtremodifiéesparmoléculedeE. 4 4 13 Laradioactivitéfixéesurles100µgdeEestde10 cpm,correspondantà10 /10 molesdel'analogue,soit Ͳ9 Ͳ9 10 mole.Conclusion:0,510 molesdeEontétémodifiées,correspondantàlaquantitéutiliséede100µg. Ͳ6 Ͳ9 5 Ͳ1 LamassemolairedeEestdoncde10010 g/0,510 mol=210 gmol ͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲ Page 3 sur 6 METABOLISME(pages3Ͳ4,25points)ͲCOPIE2 Attention:lestroispartiespeuventêtretraitéesdefaçonindépendante Chezlesbactéries,bienquelavoiedelaglycolyseestlapluscommunémentempruntéepourlaconversiondes hexosesenpyruvate,d’autresvoiesmétaboliquespeuventégalementl'êtredefaçonplusoumoinsspécifique selon le genre bactérien considéré. Ces différentes voies vont être étudiées ciͲdessous à l’aide de bactéries mutéesdanslegènegpi,cequiprovoquelasynthèsed'uneglucose6Ͳphosphateisomérasenonfonctionnelle. I.CatabolismeduglucosechezlegenreEnterococcus. Les bactéries mutées sont incubées en anaérobiose ou en aérobiose dans un mileu de culture complet en présence de glucose radioactif marqué au carboneͲ14 en C1. En anaérobiose, ces bactéries produisent du CO2 radioactif et 5 molécules de lactate à partir 3 molécules de glucose marqué, alors qu'en aérobiose,cesmêmesbactériesneproduisentqueduCO2dontseuleunefractionestradioactive. Q1°. En justifiant votre réponse, donnez le nom des voies métaboliques permettant d’expliquer ces observations. 1èrepartiedelaglycolyseimpossible Voie des PP obligatoire, production de CO2 radioactif,convergencevers5GAP Aérobiose:PYRpuisKrebspuisCO2 Anaérobiose:PYRpuisLACT II. Catabolisme du glucose chez le genre Agrobacterium. II.1.Les bactéries mutées sont incubées en anaérobiose dans un milieu identique à celui décrit précédemment. Curieusement, la quantité de CO2 radiomarqué libéré est moindre que celle observée chez Enterococcus en conditions anaérobies. Cette observation a conduit à la mise en évidence d’une voie parallèle à celle décrite ciͲdessus, et qui ne mène pas à la production de CO2. Un intermédiaire radioactif de cette voie parallèle, le 2ͲcétoͲ3Ͳ désoxyͲ6Ͳphosphogluconate (KDPG), radiomarqué en C1, a été caractérisé et est présentéciͲcontre: Æ Page 4 sur 6 Q2°.SachantqueleprécurseurimmédiatduKDPGestunintermédiaired’unedesvoiesdécritesdansla partieI,quelestͲil? Le6ͲPͲgluconate Q3°. Précisez les réactions métaboliques permettant d’expliquerlaformationdeKDPGradiomarquéenC1àpartir duglucose.Lenomdesenzymesouletypedesréactionsenzymatiquesmisesenjeudevraêtreprécisé maislesformulesdéveloppéesnesontpasdemandées. II.2. Le KDPG radiomarqué en C1 conduit à la formation en une seule étape d’une molécule de pyruvateetd’unintermédiairedelaglycolysedénomméX,quiestensuiteluiͲmêmemétaboliséenpyruvate. Q4°.Identifiezl'intermédiaireXetdonnezsaformuledéveloppée.Précisezletypederéactionouletype d’enzymeimpliquédanscettetransformation. Q5°.Enutilisantlesdonnéesquiprécèdent, établissezlesbilanscarboné,énergétiqueetélectroniquedelaconversiond’unemoléculedeglucoseen lactateparcettevoiealternative. + Comparez ces bilans avec ceux de la glycolyse en considérant que les coenzymes NAD /NADH et + NADP /NADPHsontéquivalents. Justifiezrigoureusementvosréponses. Bilanredoxéquilibré,1seulATPproduit,Rdténergétiquemoitiédelaglycolyse Page 5 sur 6 III.ConversiondupyruvateenleucinechezEnterococcusetAgrobacterium. Lors de la conversion du glucose en lactate, l’intermédiaire pyruvate peut également servir de précurseurpourlabiosynthèsedecertainsacidesaminésdontlaleucine.Unelecturedecetteconversionest proposéeciͲdessous: Q6°.Sachantquelesréactions1,2et3sontanaloguesauxtroispremièresréactionsducycledeKrebs, vousdonnerezpourchacunedes4réactionsnumérotéessontypeainsiquelessubstrats,lesproduitset lescoͲenzymessicelas'avèrenécessaire.Deplus,vouspréciserezlaformuledéveloppéede l’ɲͲisopropylmalate. (1) synthèse de squelette carboné ou condensation, analogue de la citrate synthétase (DͲ isopropylmalatesynthétase) (2) DéshydratationͲHydratation/Isomérisation (ou isomérisation), analogue de l'aconitase (DͲisopropylͲ malateisomérase) (3) OxydoͲréductionetdécarboxylation spontanée (oudécarboxylation oxydative),analoguedel'isocitrate déshydrogénase(DͲisopropylmalatedéhydrogénase) Autressubstrats:NAD+;autresproduits:NADH,CO2 (4)transaminase(leucineaminotransférase,PLP). Autressubstrats:aminoacides;autresproduits:DͲcétoacides Autres réponses acceptables : déshydrogénase (type glutamate déshydrogénase): Autres substrats : + + NAD(P)H,NH4 ;autresproduits:NAD(P) ou synthétase (type glutamate synthétase): Autres substrats : NAD(P)H, + Glutamine;autresproduits:NAD(P) ,glutamate. ͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲ Page 6 sur 6