Remodelage développemental des synapses
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Dany Arsenault Remodelage développemental des synapses lemniscales dans le noyau ventral postérieur du thalamus Mémoire présenté à la faculté des études supérieures de l'Université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en neurobiologie pour l'obtention du grade de maître es sciences (M.Sc.) Département de psychiatrie Faculté de médecine Université Laval Québec 2007 Dany Arsenault, 2007 Résumé Le développement du système nerveux comprend plusieurs phases : neurogénèse, migration cellulaire, croissance des neurites, synaptogénèse et raffinement synaptique. Cette dernière étape de remodelage est cependant mal connue au niveau des mécanismes cellulaires et synaptiques. Par des enregistrements cellulaires en configuration cellule entière voltage imposé, nous avons caractérisé la maturation synaptique de la fibre lemniscale du système somato-sensoriel des vibrisses chez la souris. Nous avons démontré que les neurones du noyau ventral-postérieurmédian (VPM) du thalamus chez une souris âgée de 7 à 9 jours post-natals (JPN) sont innervés par environ 8 fibres et que ce nombre diminue entre 1 et 3 (moyenne de 1.4) après la troisième semaine post-natale (PN). Cette diminution d'innervation sensorielle démontre que la maturation des fibres lemniscales comprend une élimination de synapses. De plus, cette période d'élimination s'accompagne de plusieurs changements synaptiques tels une augmentation du ratio des réponses AMPA/NMDA (Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-ioxyzole-4-propionic acid (AMPA); N-methyl-D-asparate (NMDA)), une diminution du temps de descente et de la sensibilité à l'ifenprodil (antagoniste des sous-unité NR2B) des réponses NMDA, une augmentation dans la force des premières réponses AMPA et une augmentation du maximum des réponses AMPA et NMDA. La rectification des courants AMPA entrants et la plasticité synaptique à court terme (indice de probabilité de relâchement) ne changent pas au cours de cette période. De manière surprenante, la privation d'expérience sensorielle n'affecte pas l'élimination des synapses ainsi que les changements synaptiques de cette période développementale. Avant-propos Je tiens, dans un premier temps, à remercier mon directeur de recherche, le Dr ZhongWei Zhang, pour m'avoir donné l'opportunité, il y a deux ans, de travailler dans son laboratoire lors d'un stage et, par la suite, de compléter une maîtrise. Sa grande disponibilité durant ces deux années a été grandement appréciée. Je tiens également à remercier le Dr Martin Deschênes pour son aide professionnelle et le temps qu'il a su me consacrer. Je remercie Cyril Bories pour son aide et ses conseils dans la réalisation de certains travaux. Finalement, je remercie tout le personnel du centre de recherche Robert-Giffard. Par leur soutien et leurs conseils, ces personnes, d'une manière ou l'autre, m'ont aidé dans mon apprentissage. Table des matières Page titre Résumé Avant-propos Table des matières Liste des figures Liste des abréviations Chapitre 1 : Rappel du système des vibrisses 1.1 Définition du terme des vibrisses 1.2 Les fonctions des vibrisses 1.3 Structure et arrangement de la vibrisse 1.3.1 Arrangement spatio-corporel des vibrisses 1.3.2 La structure des vibrisses 1.3.3 Récepteurs vibrissaux 1.3.4 Innervations sensorielles de la base épithéliale de la vibrisse 1.3.5 Innervations motrices de la base épithéliales de la vibrisse 1.3.6 Les ganglions sensoriels des vibrisses 1.4 Notion de champs récepteurs 1.5 Organisation du système nerveux des vibrisses 1.5.1 Les relais et les voies ascendantes du système des vibrisses 1.5.2 Le complexe nucléaire trigéminal du tronc cérébral 1.5.3 Le thalamus 1.5.4 Le cortex somato-sensoriel Chapitre 2 : Rappel de la maturation des connexions au cours du développement du système nerveux 2.1 Les deux phases développementales de la maturation synaptique des systèmes somato-sensorielles 2.2 Présence développementale de fibres glutamatergiques silencieuses 2.3 Changements dans les propriétés synaptiques au cours de la maturation 2.4 Rôle de l'expérience sensorielle et de l'activité spontanée dans la maturation des réseaux neuronaux Chapitre 3: Problématique et hypothèse de recherche Chapitre 4 : Matériels et méthodes 4.1 Préparation des tranches de cerveau de souris 4.2 Enregistrement cellulaire de type « patch-clamp » en configuration cellule entière et en voltage imposé 4.3 Voltage membranaire enregistré 4.4 Pharmacologie des réponses lemniscales 4.5 Révélation à labiocytine 4.6 Fixation des tranches à partir d'une solution de « permount » 4.7 Visualisation des neurones marqués à la biocytine Page I II III IV VI VII 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 6 11 11 13 13 15 22 23 23 25 25 26 28 28 4.8 Drogues et applications des drogues 4.9 Privation sensorielle 4.10 Analyse des données 4.11 Recrutement quantitatif des fibres glutamatergiques par un protocole de stimulation progressive 4.12 Estimation du nombre de fibres 4.13 Identification des synapses glutamatergiques silencieuses 4.14 Évaluation de la rectification des réponses médiées par les composantes AMPA 28 29 29 29 30 31 31 Chapitre 5 : Résultats 5.1 Élimination d'entrées synaptiques fonctionnelles durant le développement.... 37 5.2 Présence développementale de fibres glutamatergiques silencieuses 39 5.3 Changements développementaux dans le ratio AMPA/NMDA 40 5.4 Changements développementaux dans les propriétés des composantes NMDA 41 5.5 Changement développemental dans la relation « CPSE- voltage membranaire » des composantes AMPA 42 5.6 Changements développementaux dans la plasticité à court terme 43 5.7 L'effet d'une privation d'expériences sensorielles 43 Chapitre 6 : Discussion et conclusion 6.1 Élimination des synapses dans le VPM au cours du développement 6.2 Élimination des synapses lemniscales silencieuses lors de la maturation 6.3 Changements développementaux dans les propriétés synaptiques des connexions au VPM 6.4 Rôle de l'expérience sensorielle dans le raffinement des connexions lemniscales aux VPM Références 53 54 55 56 58 Liste des figures Page Figure 1.1 Représentation schématique des projections nerveuses des vibrisses mystaciales 9 Figure 1.2 Schéma de la coupe longitudinale d'une vibrisse mystacilale 10 Figure 2.1 Schématisation du rôle de l'expérience visuelle dans la maturation topographique 19 Figure 2.2 Représentation de la maturation visuelle normale chez le chaton 20 Figure 2.3 Représentation de la maturation visuelle lors d'une privation monoculaire chez le chaton 21 Figure 4.1 : Préparation des tranches du thalamus ventral/basai chez la souris et pharmacologie de la réponse lemniscale 33 Figure 4.2 : Quantification des entrées synaptiques par un protocole de stimulation progressive 34 Figure 4.3 : Identification de fibres silencieuses lors d'une quantification électrophysiologique du nombre d'entrée synaptique 35 Figure 4.4 : Rectification des courants AMPA entrants pour une même entrée synaptique 36 Figure 5.1 : Élimination de synapses fonctionnelles au cours du développement post-natal 45 Figure 5.2 Développement du ratio AMPA/NMDA 46 Figure 5.3 Changements dans l'amplitude des réponses AMPA et NMD A 47 Figure 5.4 Diminution développementale dans le temps de descente des réponses NMDA 48 Figure 5.5 Diminution développementale de la sensibilité à l'ifenprodil 49 Figure 5.6 Rectification des courants AMPA durant le développement 50 Figure 5.7 La plasticité à court terme des CPSE est stable entre 7 et 24 JPN 51 Figure 5.8 Une privation d'expérience sensorielle n'a pas d'effet sur le remodelage synaptique 52 Liste des abréviations AFCS - Solution artificielle de fluide cérébral et spinal AMPA - Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-ioxyzole-4-propionic acid AMPAR - Récepteur AMPA APV - D-(-)amino-5-phosphonopentanoic acid CAMKII - protéine kinase II dépendante du Calcium et de la calmoduline CFS - complexe folliculaire-sinus CPSE - Courant post-synaptique excitateur CT - Cortico-thalamique GABA - Acide gamma-aminobutyrique le - Capsule interne JPN - Jour post-natal LV - Ventricule latéral ML - Partie médial de la fibre lemniscale NBQX - 2,3-dioxo-6-nitro-l,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]quinoxaline-7-sulfonamide NMDA - N-methyl-D-asparate NMDAR - Récepteur NMDA PARA - paraformaldhéhyde PB - Solution de tampon phosphate (phosphate buffer) PN - Post-natal PO - Groupe postérieur ou complexe nucléaire du thalamus PRV - Noyau principal du complexe nucléaire trigéminal REC - Électrode d'enregistrement (record électrode) RPSE - Réponse post-synaptique excitateur RT - Noyau réticulaire thalamique SDH - Acide succinique déshydrogénase SMI - Cortex somato-sensoriel primaire SMII - Cortex somato-sensoriel secondaire SPN - Semaine post-natale SPV - Noyau spinal du complexe nucléaire trigéminal SPVi - Sous-noyau interpolaire du noyau spinal du complexe nucléaire trigéminal SPVo - Sous-noyau oral du noyau spinal du complexe nucléaire trigéminal SPVc - Sous-noyau caudal du noyau spinal du complexe nucléaire trigéminal STIM - Électrode de stimulation VL - Noyau ventro-latéral du thalamus VPL - Noyau ventral-latéral du thalamus VPM - Noyau ventral-postérieur-médian du thalamus ZI - Zone incertaine Chapitre 1 Rappel du système des vibrisses Puisque la présente étude porte sur le système des vibrisses, cette première section d'introduction présente l'organisation anatomique et fonctionnelle de ce système chez les rongeurs, plus particulièrement chez la souris. Les fonctions, l'organisation structurale, les afférences et les efférences des différents relais de ce système y sont décrites. 1.1 Définition du terme des vibrisses Le terme de vibrisse fait référence aux longs poils tactiles fortement innervés présents sur le museau de certains mammifères, comme la souris, le rat ou le singe '' 2 . 1.2 Les fonctions des vibrisses Les vibrisses ont comme principale fonction l'intégration d'informations spatiales et temporelles 3' 4. Par des mouvements de faibles amplitudes (whisking) faites par les vibrisses, le rongeur peut explorer ou discriminer les éléments de son environnement, comme la texture et la forme des objets 5' 6. La discrimination tactile chez les rongeurs permet de distinguer entre les surfaces lisses et rugueuses comportant des sillons d'environ 30 microns de profondeur et disposé à des intervalles de 90 microns . Elles semblent également jouer un rôle sur la locomotion, l'orientation et l'équilibre de l'animal puisqu'un déficit dans ces fonctions est observable suite à l'ablation de l'ensemble des vibrisses 6. 1.3 Structure et arrangement de la vibrisse 1.3.1 La structure des vibrisses La base dermique de la vibrisse s'identifie présentement par « complexe folliculaire-sinus » (CFS) et elle est distinguée des autres composantes vasculaires du derme 7' 8. Dans le CFS, le poil vibrissal est recouvert de deux enveloppes épithéliales (interne et externe) et se termine au niveau du bulbe folliculaire. Le « rete ridge collar » enroule les enveloppes du poil de sa sortiedu bulbe folliculaire jusqu'à sa sortiedu derme. Le follicule est enveloppé d'une capsule formée par un sinus vasculaire '• 2- 8. Le sinus vasculaire est délimité par un feuillet mésenchymateux qui se superpose à sa sortie du follicule et par une épaisse capsule collagénique qui le sépare du tissu conjonctif lâche environnant. La capsule et le feuillet se fusionnent à la partie supérieure du follicule pour isoler le sinus et ainsi former le corps conique. L'ensemble capsulaire est innervé à différentes hauteurs (nerfs superficiels et profonds) et sa vascularisation se fait via une arteriole qui pénètre la capsule de collagene et le sang est drainé par un plexus de veinules près du corps conique, (figure 1.2) 1.3.2 Arrangement spatio-corporel des vibrisses Les vibrisses sont disposées de manières ordonnées et stéréotypées sur le tégument facial selon leur orientation et leur longueur. On cartographie généralement les vibrisses par rangée (A,B,C,D,E) de dorsale à ventrale et par arcs (1,2,3,4,5,6,7) de caudal à rostral (figure 1.1). Chez les rongeurs, il y a 4 vibrisses caudales supplémentaires qui sont placées latéralement par rapport aux rangées et qui forment un arc vertical postérieur. La souris possède environ 35 longues vibrisses de chaque côté du museau et la disposition de chacune de celle-ci est déterminé génétiquement9. 1.3.3 Récepteurs vibrissaux Trois différents récepteurs sensoriels sont présents au niveau de la vibrisse. Us permettent la détection de plusieurs types d'information nécessaire aux fonctions d'exploration ou de discrimination. Parmi ceux-ci, on note les récepteurs de Merkel, qui répondent à la compression et qui s'adaptent lentement au stimulus, et les récepteurs lanciformes et réticulés, qui répondent à l'étirement et qui s'adaptent rapidement aux stimulus l0. 1.3.4 Innervations sensorielles de la base épithéliale de la vibrisse Le CFS reçoit une innervation sensorielle dense qui provient de la branche infraorbitale de la division maxillaire du nerf trigéminal 8l "' 12 . Chaque axone sensoriel 13 14 périphérique innerve qu'une seule vibrisse ' et chaque fibre n'innerve qu'un seul type de récepteur sensoriel I4 . Chaque follicule reçoit entre 70 à 170 axones myélinisés 9> 15 . L'ensemble capsulaire reçoit une triple innervation via un nerf vibrissal profond et plusieurs nerfs vibrissaux superficiels. Les terminaisons lanciformes et réticulées sont localisées au niveau du feuillet mésenchymateux. Elles sont parallèles au poil et forment une palissade autour du follicule. En ce qui concerne les terminaisons de Merkel, elles se localisent au niveau du « reteridge collar » et de l'enveloppe épithéliale externe. Leurs axones forment des branches en « T » qui s'orientent perpendiculairement aux terminaisons lanciformes autour du follicule 7 ' 8 . (Figure 1.2) 1.3.5 Innervations motrices de la base épithéliale de la vibrisse Un muscle papillaire vient s'insérer à la base de chaque CFS. Ces muscles sont innervés par les branches du nerf facial et leurs contractions provoquent des mouvements rythmiques de protraction et de rétraction des vibrisses I6. Ces cycles portent le nom de « whisking » et ont une fréquence constante d'environ 8 Hz lors du comportement d'exploration 5 ' 17 . 1.3.6 Les ganglions sensoriels des vibrisses Les corps cellulaires des afférences sensorielles primaires sont contenus dans le ganglion du nerf trijumeau (ganglion de Gasser ou semi-lunaire) situé à la base du crâne. Ces cellules possèdent un champ récepteur correspondant à une vibrisse unique et montrent une sensibilité à la direction de la déflexion. Elles peuvent s'adapter lentement ou rapidement à la stimulation 14' 18' 19. Les fibres qui s'adaptent rapidement répondent à une grande variété de vitesses de déflexion tandis que celles qui s'adaptent plus lentement répondent à la vitesse de la déflexion ainsi qu'à son amplitude. 1.4 Notion de champs récepteurs Le champ récepteur correspond à la zone sensorielle qui modifie l'activité (excitation ou inhibition) d'un neurone lorsque cette dernière est stimulée. Dans le système des vibrisses, le champ de réception du premier neurone sensoriel (ganglion trigéminal) est exclusivement excitateur et est dominé par une vibrisse principale 20 . À des relais supérieurs (thalamus et cortex), les champs récepteurs deviennent plus complexes (inhibiteur ou excitateur, monovibrissal ou polyvibrissal). Parmi les facteurs pouvant moduler le champ récepteur, on note l'état de l'animal (sommeil ou éveillé) et le degré , 21 22 d anesthesie ' . 1.5 Organisation du système nerveux des vibrisses 1.5.1 Les relais et les voies ascendantes du système des vibrisses Le système nerveux des vibrisses se compose de trois relais, soit le complexe nucléaire trigéminal du tronc cérébral, le thalamus et le cortex. Chacun de ces relais fait intervenir plusieurs sous-noyaux : ceux jouant un rôle au niveau du complexe trigéminal sont le noyau principal (PRV) et le noyau spinal (SPV), le VPM et le groupe postérieur (PO) pour le thalamus et les zones somato-sensorielles primaire (SMI) et secondaire (SMII) du cortex. L'information sensorielle des vibrisses est acheminée de la périphérie au cortex via deux voies ascendantes, soit la voie lemniscale et la voie paralemniscale 23 (voir figure 1.1). La voie lemniscale achemine l'information via les noyaux PRV (trigéminal), le VPM (thalamique) et SMI (cortex) alors que la voie paralemniscale passe par les noyaux SPV (trigéminal), PO (thalamique) et SMI/SMII (cortex). Ces deux voies ne sont pas complètement isolées l'une de l'autre car, au niveau du tronc cérébral, le noyau PRV reçoit des innervations du SPV 24 . Ces projections, que l'on nomme internucléaires, semblent responsables de la sensibilité des neurones du PRV aux vibrisses adjacentes à la vibrisse principale. Une lésion de ces connections internucléaires inhibe la sensibilité multiples des neurones du PRV 2 trois relais. 26 . Le reste de cette section décrit plus spécifiquement chacun de ces 1.5.2 Le complexe nucléaire trigéminal du tronc cérébral Le premier relais de ce système est le complexe trigéminal, localisé au niveau du tronc cérébral. Selon la cytoarchitecture et le patron d'activité de l'acide succinique déshydrogénase (SDH) des neurones qui le composent, on peut différencier deux groupes cellulaires, soit le PRV et le SPV. Le SPV peut se subdiviser de nouveau en trois sousnoyaux : l'oral (SPVo), l'interpolaire (SPVi) et le caudal (SPVc) 27. Chacun de ces noyaux possèdent une topographie de l'arrangement périphérique des vibrisses : ils sont composés de plusieurs colonnes neuronales nommées barelettes et chacune de celles-ci répond préférentiellement à une vibrisse 28 29 ' . Les neurones du PRV ont une arborescence dendritique confinée à une seule barelette et ils ont un champ récepteur dominé par une vibrisse 20' 29. Ils projettent principalement au noyau VPM du thalamus et reçoivent des afférences du noyau spinal trigéminal 23 . Pour leur part, les neurones du SPV ont une arborescence qui s'étend à plus d'une barelette et ils répondent à la déflexion de plusieurs vibrisses 30 31 ' . Ces neurones innervent plusieurs autres groupes cellulaires tels le PRV du complexe trigéminal, le PO du thalamus, la zone incertaine, les noyaux pontins, le collicule supérieur, le noyau prétectal antérieur et l'aire périrubrale 31> 32. 1.5.3 Le thalamus D'un point vu général, on considère le thalamus comme la structure qui distribue l'information somato-sensorielle ascendante au cortex. Les différents noyaux qui composent cette structure occupent trois différentes fonctions : les noyaux spécifiques relaient les informations somato-sensorielles des zones corporelles précises vers les aires sensorielles et motrices primaires, les noyaux associatifs transmettent des informations sensorielles diffuses vers plusieurs aires corticales, et il y a les noyaux qui ne possèdent pas de composante sensorielle. Parmi ces noyaux thalamiques, ceux impliqués dans le système des vibrisses sont le noyau VPM et le complexe nucléaire postérieur (Po). Le VPM se compose de neurone de relais ayant des dendrites radiales épaisses et regroupées. Ces regroupements formes, tout comme dans le complexe trigéminal, des unités somatotopiques 3 34 représentant chacune des vibrisses, les barillets thalamiques au noyau réticulaire et aux barils corticaux du SMI ' . Ces neurones projettent 35> 36 . Le VPM reçoit trois types d'afférences : des afférences excitatrices proximales en provenance du PRV et dont les axones voyagent à travers la section médiale de la voie lemniscale excitatrices distales cortico-thalamiques (CT) 39 40 ' 32 37 38 ' ' , des afférences et des afférences inhibitrices en provenance du noyau reticulaire thalamique (RT) et qui se distribuent sur l'arborescence dendritique des neurones du VPM 34 ' 4I . Les axones qui innervent ce noyau sont restreints à un barillet thalamique et correspondent au champ récepteur de la vibrisse principale 20 ' 42 ' 43 . En ce qui concerne le complexe nucléaire postérieur, ce noyau fait partie de la seconde catégorie des neurones thalamiques, dits associatifs. Ils font des connections réciproques et excitatrices avec plusieurs aires corticales comme le SMI, le SMII, le cortex moteur, l'aire insulaire et le cortex périrhinal 35. Le PO reçoit deux types d'entrées cortico-thalamiques, l'une en provenance de la couche six et l'autre provient de la couche cinq et elle est exclusive à la zone granulaire et disgranulaire des barils corticaux . Les autres innervations du PO consistent en des axones collatéraux qui projettent également à la zone incertaine, certains noyaux du tronc cérébral et au « tectum ». Ces collatérales ne font pas de contact avec le noyau reticulaire ou le VPM et leurs synapses avec le groupe postérieur sont proximales et larges 39. Ce noyau reçoit deux types d'afférences inhibitrices : l'une en provenance du noyau reticulaire et l'autre, de la division ventrale de la zone incertaine. Ces synapses font contact avec les dendrites proximales ou directement sur le corps cellulaire 4 . Le PO n'a pas une organisation somatotopique des vibrisses comme le VPM. On retrouve un arrangement spatial analogue à la disposition des vibrisses sur le tégument seulement dans la portion latérale/médiane du Po 45. 1.5.4 Le cortex somato-sensoriel Sur un plan histologique, le cortex se divise en six couches laminaires, parallèles à la surface piale. La différenciation se base sur les variations de la dimension, de la densité et de la morphologie des corps cellulaires. Les SMI et SMII du cortex sont ainsi organisés (six couches laminaires) et ils sont situés dans la région pariétale. Ils contiennent une représentation topographique complète du corps où la représentation des surfaces corporelles du SMII est l'image de celle retrouvée en SMI 46. Les régions représentant les vibrisses mystaciales possèdent une organisation fonctionnelle sous forme de « barils » dans la couche IV 47' 48. En se basant sur des critères morphologiques, biochimiques et physiologiques chez le rat, chacun des barils serait la représentation corticale d'une vibrisse controlatérale 4 49 5 ' . Chez la souris, ces barils corticaux se composent d'un anneau de haute densité cellulaire qui encercle une région de plus faible densité 51. Il a été démontré par des enregistrements électrophysiologiques que les neurones d'un baril cortical répondent à plusieurs vibrisses, mais que même à ce niveau, la prédominance d'une vibrisse demeure 52. D'autres données électrophysiologiques suggèrent que le SMII pourrait compléter les fonctions du SMI en l'aidant à établir le contexte sensoriel global à travers lequel les discriminations tactiles spécifiques sont réalisées 53. Le SMI est innervé dans la plupart des espèces par trois territoires thalamiques : VPM, PO et les noyaux intralaminaires. Les terminaisons thalamo-corticales projettent dans les couches IV et VI ainsi que dans les couches I et Va pour le SMI. Par des études de marquage antérograde, on a pu déterminer que les cellules des barillets du VPM donnent naissance à trois types de fibres : le type I projette dans la colonne corticale correspondant à un seul baril, le type II projette dans un baril et à travers la couche VI de quelques colonnes verticales et le type III innerve le SMII et la zone disgranulaire du SMI. Les types I et II proviennent du corps des barillets du VPM alors que le type III provient de la queue des barillets 49 ' 54 ' 56 . En ce qui concerne les projections du PO, elles évitent la couche IV et forment un champ terminal complémentaire à celui des afférences du VPM 55 ' 57 . Des injections massives d'un traceur antérograde ont démontré que leurs terminaisons se situent dans les couches I et Va 56. La reconstruction unitaire de quelques axones a révélé deux types de fibres projetant au SMI : la première se termine dans la couche Vb à travers toute la région granulaire et dans la couche IV entre les barils, le second type se distribue principalement dans les couches Va et I 35. Quelques études ont aussi suggéré que certains neurones du PO projettent à la fois au SMI et au SMII 53 ' 58 . Le PO traitant les aspects plus généraux de la stimulation vibrissale, ses afférences contribueraient au rôle contextuel du SMII dans le traitement des informations tactiles 53. Finalement, le cortex renvoie certaines informations au thalamus. Ces projections CT sont considérées comme des voies de « feedback » qui modulent les réponses des cellules de relais thalamiques aux stimuli périphériques. Ces projections proviennent des couches V et VI. Plus spécifiquement, la majorité des axones de la couche V qui innervent le thalamus sont des collatérales de fibres cortico-fugales qui projettent au tronc cérébral 59 . Dans le thalamus, ces axones se terminent exclusivement dans le PO dorsal. Ils ne donnent pas de collatérale dans le VPM ou dans le RT 60. Le noyau prétectal antérieur, les collicules supérieurs et les noyaux pontins sont les structures les plus souvent co-innervées. La co-innervation des noyaux du tronc cérébral par les axones de la couche V suggère que cette voie envoie une copie au thalamus des informations corticales destinées aux structures du tronc. En ce qui concerne les projections CT de la couche VI, elles sont de deux types. Le premier type provient de la zone disgranulaire (Via), projette exclusivement au VPM et forme des arborisations terminales correspondant au barillet homotopique de leur colonne corticale d'appartenance. Le second type de fibre provient de la zone disgranulaire du bas de la couche VI, et elle se termine dans le PO et le VPM. Son arborisation axonale dans le VPM traverse une série de barillets adjacents. Tous les neurones CT envoient des collatérales au RT. trigeminal ganglion Infraorbttai I SpV(l) midllne Figure 1.1 Représentation schématique des afferences sensorielles vibrissales aux noyaux trigéminaux du tronc cérébral, aux noyaux VPM et PO du thalamus, et du SMI du cortex. Figure empruntée au Dr Martin Deschênes et qui a été modifiée à partir de Durham et Woolsey(1984) 61 . — Vibrisse Rete ridge collar Terminaisons de Merkel Nerf vibrissal superficiel Glande sébacée Corps conique Terminaisons de Merkel Sinus vasculaires Terminaisons lanciformes Capsule Terminaisons réticulées Membrane basale Feuillet mésenchimateux Nerf vibrissal profond Membrane épithéliale externe Membrane épithéliale externe Bulbe folliculaire Figure 1.2 Schéma de la coupe longitudinale d'une vibrisse mystaciale. Schéma illustrant l'organisation morphologique et la relation avec l'innervation des divers éléments structuraux du complexe follicule-sinus vasculaire d'une vibrisse faciale. Figure modifiée de Ebara 2002 7. 10 Chapitre 2 Rappel sur la maturation des connexions au cours du développement du système nerveux Cette section fait un rappel sur la maturation des connexions au cours du développement. Elle se divise en quatre parties, soit (1) les deux phases de la maturation développementale (ségrégative et post-ségrégative) des systèmes somato-sensoriels nécessaires à l'obtention d'un réseau adulte, (2) la présence de fibres glutamatergiques silencieuses au cours de ces deux phases, (3) les changements synaptiques observés au cours de la maturation et, (4) le rôle de l'expérience et de l'activité spontanée dans chacune des phases. 2.1 Les deux phases développementales de la maturation synaptique des systèmes somatosensoriels Selon le concept actuel, la maturation complète des circuits somato-sensoriels implique deux périodes développementales distinctes. La première consiste en un remodelage principalement anatomique qui conduit à la formation topographique des unités sensorielles (une vibrisse, un œil). La seconde, qui est légèrement plus tardive, semble raffiner les connexions de chacune des unités, permettant d'obtenir une plus grande précision de l'acheminement de l'information et de réduire la capacité synaptique (nombre d'entrées synaptiques) de chacun des neurones. La maturation ségrégative des vibrisses se réalise très tôt chez les rongeurs. Une topographie est observable à la naissance dans le noyau trigéminal27'62'63, à 2-3 JPN dans le thalamus27'64> 65 et entre 2 et 5 JPN dans le cortex66"72. Comme ces données le suggèrent, il semble que les unités somatotopiques se forment chronologiquement de la périphérie jusqu'au cortex sensoriel. La seconde maturation (post-ségrégative) consiste à raffiner (élimination et consolidation) les connexions pour obtenir la précision observée chez l'adulte. Par exemple, il a été démontré que les neurones du thalamus dans le système visuel chez la souris reçoivent plusieurs entrées synaptiques après la période ségrégative, qui débute vers le 3 eme JPN 73, et que ce nombre diminue entre 1 et 3 entrées synaptiques au cours des quatre premières semaines post-natales (SPN) 74 . Ce raffinement des connexions permet de réajuster la capacité synaptique pour chaque neurone, et ainsi obtenir un réseau mature de grande précision. Ce raffinement développemental, qui réajuste la capacité synaptique des neurones et qui permet l'obtention d'une grande précision, est également observé dans d'autres circuits du système nerveux. L'élimination de synapses fonctionnelles a été observée au niveau des fibres grimpantes dans le cervelet chez la souris et sa prévention, par des antagonistes NMDA, entraîne des dysfonctionnements de coordination 75. Il a été démontré au niveau du cortex que la densité synaptique diminue au cours du développement, suggérant une diminution du nombre de synapse 76~78. À la jonction neuromusculaire, il y a une forte élimination de synapses au cours des 2 premières SPN et celle-ci est dépendante de l'activité musculaire chez le rat 79> 80 . Finalement, les connexions synaptiques des fibres cochleaires au noyau magnocellulaire du système auditif du poulet diminue de 4 à 2 entrées synaptiques entre le ]3 ème et le 18ème jour embryonique 81. Ces observations nous suggèrent que le raffinement synaptique est un phénomène assez général. Plusieurs facteurs pouvant intervenir dans la maturation des connexions ont été identifiés. Parmi ceux-ci, il y a la présence de calcium extracellulaire et de protéases dépendantes du calcium. Nous savons que la vitesse d'élimination des entrées synaptiques à la jonction neuro-musculaire (JNM) chez le rat est moindre si la concentration de calcium extracellulaire est diminuée ou s'il y a présence d'inhibiteurs de protéases dépendantes du calcium 82. De même, le blocage des récepteurs NMDA prévient l'élimination des fibres grimpantes du cervelet chez la souris 75 . La synchronisation de l'activité pré- et post- synaptiques pourrait également intervenir dans la maturation post-ségrégative. L'équipe du Dr Feldman a démontré que la synchronisation des activités pré- et post-synaptiques des 12 neurones de la couche II/III du cortex sensoriel primaire dans le système des vibrisses chez la souris pouvaient conduire à l'induction de potentialisation à long terme (PA présynaptique 10 à 20 ms avant celui post-synaptique) ou de dépression à long terme (PA présynaptique 1 à 100 ms après celui post-synaptique), réduisant ainsi la force synaptique des connexions à éliminer et renforçant la force (ou la connexion) de celles à consolider 83 . Finalement, la CAMKII (protéine kinase II dépendante du Calcium et de la calmoduline) semble nécessaire pour l'induction dans les barils corticaux chez la souris de potentialisation à long terme 84 et de plasticité dépendante de l'expérience sensorielle 85. 2.2 Présence de fibres glutamatergiques silencieuses au cours du développement Les fibres glutamatergiques silencieuses sont des synapses qui ne possèdent que des NMDAR (récepteur NMDA) post-synaptiques, donc elles ne sont pas fonctionnelles au voltage membranaire de repos. Dans plusieurs systèmes, comme celui des fibres rétinogéniculées chez la souris, elles sont présentes seulement dans le système immature 74 . Cependant, leur rôle dans la ségrégation et/ou la maturation post-ségrégative est encore mal connu. On sait cependant que certaines de ces fibres, dans l'hippocampe du rat par exemple, ont la capacité de s'activer rapidement quand le neurone post-synaptique est dépolarisé et la fibre pré-synaptique stimulée. Le courant ainsi généré est médié par les récepteurs AMPA puisqu'il est bloqué par tetrahydrobenzo[f]quinoxaline-7-sulfonamide (NBQX) du 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4- 86 87 ' . De plus, la CAMKII semble jouer un rôle important dans l'activation de ces fibres silencieuses. L'expression constitutive de cette protéine accélère le recrutement des récepteurs AMPA au niveau de la fente synaptique chez le têtard 88 . Cette protéine est également impliquée dans le recrutement de récepteur AMPA dépendant de l'activité dans les neurones du CA1 de l'hippocampe chez le rat 86 ' 87 . 2.3 Changements dans les propriétés synaptiques au cours de la maturation Au cours du développement des réseaux neuronaux, plusieurs propriétés synaptiques peuvent changer. L'une de ces propriétés est la plasticité (à court et à long terme). Chez le rat, une double stimulation à 50ms d'intervalle au niveau des couches II/III du cortex préfrontal génère une dépression synaptique (diminution de la 2eme réponse post-synaptique 13 excitatrice (RPSE) chez le jeune alors que son effet produit une facilitation (augmentation de la 2eme RPSE) chez l'adulte 89. Ces résultats suggèrent un changement dans la probabilité de libération de glutamate (plasticité à court terme) à ces synapses au cours de leurs développements. De plus, plusieurs systèmes présentent un contrôle du gain développemental. Comme exemple, nous pouvons citer les neurones de la couche IV du cortex visuel, qui sont capables de dépression à long terme suite à des stimulations de basse fréquence des fibres thalamo-corticales chez le jeune chat ou cochon, mais pas chez l'adulte 90 . De plus, il a été démontré que les neurones des barils corticaux chez le rat sont capables de potentialisation à long terme uniquement avant 7 JPN 91 . Il y a également plusieurs changements dans les courants synaptiques lors du remodelage des connexions de plusieurs réseaux. Par exemple, les fibres rétino-thalamiques (glutamatergiques) du système visuel chez la souris présentent une augmentation significative du ratio des courants AMPA/NMDA au cours du développement, en plus d'une augmentation individuelle des réponses AMPA et NMDA, suggérant un changement dans la composition ou un recrutement de récepteurs aux synapses 74. De plus, la cinétique des courants générés par certains récepteurs peut changer. On a observé une augmentation développementale de la vitesse de retour de courants NMDA au niveau des fibres rétinothalamiques du système visuel chez la souris 74 et des connexions corticales du système visuel chez le furet 92. Il a également été démontré chez le rat que les projections au niveau du gyrus dentelé vers les cellules granulaires de l'hippocampe présentent une diminution développementale du temps de montée des réponses NMDA, mais aucun changement n'est observé dans le temps de descente de ces réponses ~. Ces changements développementaux suggèrent un changement du contenu des récepteurs NMDA. En ce qui concerne les récepteurs AMPA, il a été démontré que les neurones pyramidaux du néocortex chez le rat présentent une rectification des courants AMPA seulement avant 16 JPN et que la linéarisation de la réponse est associée à l'expression de la sous-unité GluR2 94. 14 2.4 Rôle de l'expérience sensorielle et de l'activité spontanée dans la maturation des réseaux neuronaux En ce qui concerne la maturation topographique des systèmes sensoriels, il existe deux modèles, soit un modèle instructif et l'autre permissif (figure 2.1). Ces deux modèles diffèrent par le rôle chronologique de chacun des éléments 9"\ Pour un modèle instructif, la topographie apparaît en second, suggérant que le facteur considéré (expérience sensorielle, activité spontanée) joue un rôle dans la ségrégation des axones. Dans le modèle permissif, la topographie des systèmes sensoriels s'accomplit en premier, suggérant plutôt un rôle dans le remodelage des connexions lors des périodes post-ségrégatives de grande plasticité de l'élément considéré (expérience sensorielle, activité spontanée). Les récentes études suggèrent un rôle permissif de l'expérience sensorielle dans le développement topographique des systèmes sensoriels. Par exemple, nous savons que la ségrégation des colonnes corticales du système visuel se fait peu après l'arrivée des axones et avant l'acquisition d'expériences sensorielles chez le furet % , le chat 97' 98 et le singe " ' l0 °. De plus, les fonctions physiologiques et anatomiques des colonnes de dominances oculaires sont établies avant la naissance et avant la période post-ségrégative critique chez le singe 101 . Par contre, l'activité spontanée pourrait jouer un rôle instructif important dans l'organisation topographique de ces systèmes. Dans le système visuel, quatre points supportent l'idée du rôle instructif de l'activité spontanée dans la ségrégation des axones rétino-géniculés : (1) les vagues d'activité spontanée coïncident avec la ségrégation des axones chez le furet 102 , (2) le blocage des vagues d'activité spontanée par des antagonistes des récepteurs nicotiniques et des récepteurs à l'acétylcholine prévient la ségrégation des axones chez le furet103, (3) les souris déficientes en récepteurs nicotiniques et en récepteurs à l'acétylcholine fonctionnels ne démontrent qu'une faible ségrégation rétinogéniculée 104 et (4) l'induction d'un débalancement dans l'activité spontanée chez le furet diminue le champ terminal des axones à activité réduite 105 . Cependant, la désynchronisation de l'AS via une immunotoxine agissante sur les cellules amacrines cholinergiques n'affecte pas la ségrégation des axones chez le furet 106 ., suggérant que le phénomène est indépendant de la synchronisation de l'activité spontanée. 15 La maturation post-ségrégative est légèrement plus tardive, soit après l'organisation topographique des unités sensorielles et après le début de l'expérience sensorielle. Elle consiste en une période de raffinement synaptique (grande plasticité) où chaque neurone atteint sa capacité synaptique (nombre d'entrées) adulte. Les erreurs synaptiques sont éliminées et les synapses correctement connectées sont consolidées. L'expérience sensorielle semble jouer un rôle important au cours de cette période. Comme exemple, nous pouvons citer l'importance de l'expérience sensorielle dans la maturation des circuits corticaux locaux du système visuel. L'enregistrement des neurones des couches supérieures du cortex visuel chez le chaton démontre une réponse binoculaire dans une situation de non privation (figure 2.2) 107 et une réponse majoritairement monoculaire lorsque la vision d'un œil est empêchée durant la période critique (figure 2.3) . De plus, la privation monoculaire réduit la proportion des colonnes sans activité sensorielle (environ 150-200 fim), comparativement à celles non privées (300-500 \im) chez le macaque 109in . Ceci suggère qu'une modification de l'expérience visuelle normale (privation monoculaire) conduit à une maturation inadéquate et à une intégration anormale de l'information visuelle. On ne sait malheureusement pas si de telles modifications s'observent dans les noyaux sous-corticaux. Ces deux phases de maturation se réalisent dans une période développementale précise, nommée période critique. Dans le système des vibrisses chez les rongeurs, des lésions par électrocautérisation ou par coupure du nerf infraorbital (blocage ou diminution de l'expérience sensorielle et de l'activité spontanée) affectent les formations topographiques seulement avant P5 48' 61' 65' 112~114. De plus, une privation durant la période ségrégative conduit à une désorganisation des unités corticales sensorielles au niveau du système vibrissal chez le rongeur 71> 113'115, et le même phénomène cortical est observable dans le système visuel lors de la privation binoculaire chez le chaton 116. La période critique post-ségrégative est plus tardive à la maturation somatotopique. Par exemple, dans le système visuel chez la souris, il y a élimination des entrées synaptiques au thalamus jusqu'à 28 JPN 74, suggérant que la maturation de ce relais se réalise avant la 5eme semaine. De plus, la privation monoculaire semble avoir un effet maximal à P26 " 7 , et elle n'a plus d'effet 16 après 40 JPN " 8 . Ces résultats suggèrent que la période de forte plasticité développementale se réalise avant 40 JPN et juste après la maturation thalamique. En somme, il semble que l'expérience sensorielle joue un rôle limité dans la ségrégation topographique précoce des systèmes sensoriels, mais qu'elle joue un rôle important dans la maturation post-ségrégative des circuits corticaux locaux et ainsi, dans l'intégration de l'information sensorielle. On connaît peu de choses sur son implication dans la maturation post-ségrégative des différentes couches corticales. En ce qui concerne l'activité spontanée, elle semble jouer un rôle important dans la ségrégation topographique, mais on connaît très peu de son rôle dans la maturation post-ségrégative. 17 Neonatal Young Adult Normal Visual expérience Left B Right Left Right Left Neonatal Right Left Right Young Adult vvvv Normal Visual expérience Left Right Left Right Left Right Left Right Figure 2.1 : Schématisation du rôle de l'expérience visuelle dans la maturation topographique. (A) Dans le modèle instructif, la formation topographique survient après l'expérience visuelle, suggérant qu'elle est nécessaire pour la ségrégation des axones. (B) Le modèle permissif propose une formation topographique avant l'activité sensorielle. Dans ce dernier, l'expérience visuelle jouerait un rôle dans la forte plasticité postségrégative. Figure empruntée à Zhang 95 18 Control Ocular Dominance Histograms LGN Eyes 1 2 Monocular 3 4 5 Blnocular 6 7 Monocular Ocular Dominance Figure 2.2 : Représentation de la maturation visuelle normale chez la chaton. (A) À l'état immature, il n'y a pas de ségrégation des colonnes. (B) Lors d'une expérience visuelle normale, les neurones des couches corticales supérieures sont en connexion avec les colonnes de dominance oculaire des deux yeux. (C) Ces neurones démontrent une réponse majoritairement binoculaire. Figure empruntée à Wiesel et Hubel 107 19 Monocular Deprlvation Ocular Dominance Histograms Rearing B Test LQN Eyes Monocular Blnocular Monocular Ocular Dominance Figure 2.3 : Représentation de la maturation visuelle lors d'une privation monoculaire chez le chaton. (A) L'expérience visuelle de l'oeil droit est bloquée durant la période de maturation. (B) Les neurones corticaux des couches supérieures se connectent majoritairement avec les colonnes de dominance de l'œil non privé. (C) Les cellules répondent majoritairement à l'oeil stimulé (monoculaire). Figure empruntée à Wiesel et Hubel 108 20 Chapitre 3 Problématique et hypothèses de recherche Le développement d'un circuit nerveux comprend plusieurs phases. Il y a tout d'abord la poussée et la croissance des axones, la phase de synaptogenèse et finalement, une période de maturation synaptique. Cette dernière étape permet l'obtention d'un circuit neuronal précis et mature. Deux phases caractérisent cette période développementale dans les systèmes somato-sensoriels, soit une période ségrégative qui conduit à la formation topographique des unités sensorielles dans les différents relais qui acheminent l'information jusqu'aux couches corticales supérieures, et la maturation post-ségrégative qui permet le raffinement des connexions et qui réajuste la capacité synaptique (nombre d'entrées) de chaque neurone. En ce qui concerne la maturation post-ségrégative des noyaux sous-corticaux, nous savons qu'il y a élimination d'entrées synaptiques rétino-géniculées dans le thalamus chez la souris au cours des quatre premières semaines post-natales (SPN) 74. Cependant, nous ne savons pas si ce phénomène est spécifique à cette région thalamique, ou s'il est général. Notre hypothèse de recherche est qu'il y a élimination d'entrées synaptiques au cours de la maturation post-ségrégative (semblable à celle observée dans le système visuel) dans le noyau VPM du thalamus, une structure impliquée dans le relais de l'information des vibrisses. Les résultats de notre recherche vont permettre de vérifier si l'élimination de synapses sensorielles dans le thalamus au cours du développement est un phénomène général. De plus, nous pourrons vérifier l'impact d'une privation d'expérience sensorielle sur la maturation post-ségrégative de ce noyau. Nous avons sélectionné ce système parce qu'il possède une organisation topographique l19 et qu'il est facile de manipulation sensorielle (privation d'expériences sensorielles par simple retrait des vibrisses). Ce système est également l'un des ceux qui sont le mieux connus au point de vue anatomique et physiologique. Finalement, chaque neurone adulte reçoit entre 1 et 3 innervations trigéminales (facilement quantifiable)37. Chapitre 4 Matériels et méthodes 4.1 Préparation des tranches de cerveau de souris Les tranches de cerveau sont préparées à partir de souris de souche C57BL/6 des deux sexes âgées de 7 à 24 JPN. L'animal est d'abord anesthésié avec une injection dans le péritoine de kétamine/xylazine, et ensuite décapité à l'aide d'une guillotine. Pour pouvoir extraire le cerveau de l'animal, la boite crânienne est d'abord coupée sagittalement en suivant la scissure interhémisphère pour être ensuite retirée avec une pince chirurgicale (<60 secondes). Immédiatement après son extraction, le cerveau est placé dans une solution froide (~0 degré Celsius) contenant (en mM) : 210 sucrose, 3 KC1, 1 CaCl2, 3 MgSO4, 1 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 glucose, saturée avec 95% O2 et 5% CO2 au moins 15 minutes avant la décapitation. Les deux hémisphères sont séparés par une coupure franche faite au niveau de la scissure interhémisphère avec une lame chirurgicale. Les régions préfrontales et supérieures du cerveau sont également enlevées par une coupure franche afin d'éliminer les régions corticales qui pourraient causer des interférences via les fibres CT. Ensuite, les deux hémisphères sont fixés sur un plateau et coupés en tranche sagittale de 300 (xm avec un vibratôme (VT 1000s, Leica, Germany). Dès leur coupe, les tranches sont transférées dans une chambre de conservation contenant une solution artificielle de fluide cérébral et spinal (AFCS) à température pièce (21 à 23 degré Celsius) contenant (en mM) : 124 NaCl, 3.0 KC1, 1.5 CaCl2, 1.3 MgCl2, 1.0 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 20 glucose, saturée avec 95% O2 et 5% CO2 au moins 15 minutes avant la décapitation. On laisse récupérer les tranches durant une heure avant le début des enregistrements. 4.2 Enregistrement cellulaire de type « patch-clamp » en configuration cellule entière et en voltage imposé Lors de l'enregistrement, la tranche est transférée dans une chambre de submersion où elle est immergée continuellement (débit d'écoulement de 2.0 ± 0.2 ml/minute) avec une solution de AFCS préchauffée à 30-32 ° Celsius et saturée avec 95% O2 et 5% CO2. La tranche est initialement observée à l'aide de l'objectif 4X afin de repérer la voie lemniscale et le noyau ventral basai du thalamus (figure 4.1 A). Seulement les tranches présentant un contact entre les fibres lemniscales et la partie ventrale-basale du thalamus ont été enregistrées (voir figure 4.1 A), puisque les synapses lemniscales sont contenues dans ces tranches (environ 2 tranches par hémisphère cérébral). La tranche sélectionnée est ensuite fixée au fond de la chambre à l'aide d'un support de platine en forme de « U ». La stimulation des fibres s'effectue par une électrode bipolaire concentrique (pointe de 25 ou 50 [xm de diamètre, FHC, Bowdoinham, ME) placée au niveau des fibres lemniscales. Les neurones du VPM sont observés en illumination infrarouge avec un objectif de 40X immergé dans l'eau (Fluor, 40x/0.80W, Nikon, Mississauga, ON) et une caméra CCD (IR1000, MTI, Michigan City, IN). Les neurones enregistrés sont ceux avec les plus gros corps cellulaires, soit entre 10 et 20 [im (figure 4.1B). Les enregistrements sont réalisés à 30-32 ° Celsius. Les pipettes d'enregistrements sont préparées à partir de capillaire de verre de borosilicate (1.5/0.84 mm, WPI, Sarasota, FL) tirées à partir d'un tireur horizontal (P-97, Sutter Instruments, Novato, CA). La solution intracellulaire contient (en mM) : 100 CsCH3SO3, 10 CsCl, 4 ATP-Mg, 0.5 EGTA, 20 HEPES (pH 7.4 avec CsOH, 270 mOsm). La résistance d'électrode dans le bain est comprise entre 2 et 4 MQ. Le potentiel de jonction est estimé à +5mV avec le logiciel pCLAMP (Axon Instruments, Union City, CA) et, à l'exception des expériences concernant la relation « courant post-synaptique excitateur (CPSE) - voltage membranaire », il n'a pas été corrigé. La résistance de sceau (seal résistance) est habituellement plus grande que 5 GQ. L'enregistrement cellulaire se réalise au niveau du soma avec un amplificateur de type « Multiclamp 700A amplifier » (Axon Instruments, Union City, CA). La résistance de série (Rs) est généralement comprise entre 7 et 15 MQ et n'est pas compensée. La stimulation est d'une durée de 100|is, d'une intensité variant entre 1 et 400 uA et générée par une unité de stimulation (PG4000A et SIU90, Cygnus Technology, Delaware Water Gap, PA). Les expériences sont avec par le logiciel Axograph 4.9 (Axon Instruments, Union City, CA ) qui fonctionne sur un système d'exploitation Macintosh. Les stimulations sont appliquées à une fréquence de 0.1 Hz, soit une stimulation par 10 secondes. Les données sont digitalisées à 8 ou 16 KHz et filtrées (2 ou 4 KHz). Dans plusieurs expériences, les neurones sont marqués à la biocytine (0.25% ou 2.5 mg/ml dans la solution contenue dans 23 la pipette d'enregistrement) et, après l'enregistrement cellulaire, la tranche est fixée dans une solution contenant 4% de paraformaldhéhyde (PARA; masse/volume, soit 40 g de PARA par litre) et 0.1M de tampon phosphate (PB; phospate buffer; 1.9g de NaH2PO4 et 9.45g Na2HPÛ4 par litre) en attendant d'être révélée. 4.3 Voltage membranaire enregistré Les enregistrements intracellulaires sont effectués à deux voltages membranaires imposés, soit -70mV et +40mV. Le premier (-70mV) correspond au voltage membranaire de repos et reflète la réponse synaptique normalement perçue par le neurone, alors que le second voltage (+40mV) permet de démasquer la réponse des NMDAR 120 . Ces récepteurs sont, au voltage membranaire de repos, bloqués par les ions magnésium. Afin de pouvoir dépolariser la cellule et enregistrer les courants entrants des NMDAR (voltage membranaire supérieur au potentiel d'inversion du récepteur, soit OmV), des ions de césium sont rajoutés à la solution intracellulaire. Ces ions bloquent les canaux potassiques responsable de l'hyperpolarisation de la cellule, ce qui permet d'enregistrer à des potentiel membranaires positifs 121 l22 ' . 4.4 Pharmacologie des réponses lemniscales Tel que présenté à la figure 4.1C, nous avons caractérisé par pharmacologie la réponse lemniscale pour les deux voltages membranaires imposés. Dans la situation contrôle, on peut observer une forte différence cinétique entre les réponses enregistrées, suggérant ainsi l'activation de récepteurs distincts. La réponse post-synaptique à +40mV est de cinétique plus lente alors que celle à -70mV est beaucoup plus rapide, tant au niveau du temps de montée que du retour de la réponse. À -70mV, l'ajout de D-(-)amino-5-phosphonopentanoic acid (APV; 50 à 100 \iM) n'affecte pas le pic de la réponse synaptique et la montée de la réponse, mais le retour de la réponse est plus rapide. En présence de NBQX (10 \iM), la réponse synaptique est complètement bloquée, démontrant qu'à -70mV, la réponse est très majoritairement AMPA. La mesure du pic de l'amplitude à ce voltage membranaire est donc une évaluation acceptable de la réponse des composantes AMPA. 24 Lorsque le voltage membranaire est à +40mV, l'addition d'APV (50 à ÎOO^M) bloque la composante lente de la réponse. Le petit courant restant est de cinétique semblable à celui enregistré à -70mv et il est bloqué par l'ajout de NBQX (10 |j,M). Ceci démontre que la composante lente de cette réponse est médiée par les composantes NMDA alors que la réponse rapide provient des récepteurs AMPA (AMPAR). La réponse NMDA peut être isolée de celle AMPA sur une base de cinétique. Puisque la réponse AMPA est presque terminée après 2.5 ms alors que le pic de la réponse NMDA se situe au environ de 5mS, la mesure du pic de la réponse après 2.5ms est une estimation convenable de la réponse NMDA. Finalement, nous savons que la réponse post-synaptique des connexions lemniscales se compose uniquement de récepteurs AMPAR et NMDA puisqu'elle est complètement bloquée à +40mV et -70mV en présence d'APV et de NBQX. 4.5 Révélation à la biocytine Après avoir fixé les tranches de cerveau dans une solution contenant 4% de PARA (masse/volume, soit 40 g de PARA par litre) et 0.1 M de PB (1.9g de NaH2PO4 et 9.45g Na2HPÛ4 par litre) pour une période de 24 à 62 heures, les tranches sont révélées. Le protocole pour révéler la biocytine consiste à incuber les tranches durant un temps prédéterminé dans différentes solutions suivant la chronologie suivante : 1) Deux lavages de 10 minutes dans une solution de tampon phosphate (PB; 0.1 M) afin d'éliminer la PARA des puits d'incubation. 2) Incubation pendant 30 minutes dans une solution de 0.3% de peroxyde, 10% de MeOH et 0.1 M de PB pour éliminer les peroxydases intracellulaires. Cette étape ne requiert aucune agitation. 3) Cinq lavages de 10 minutes dans une solution semblable à celle décrite en 1) afin d'enlever le peroxyde des puits. 4) Une incubation d'une heure dans une solution de 2% de Triton X-100 (détergeant), 1% de NRS (Normal Rabbit Sérum; bloque les sites non spécifiques et diminue ainsi le bruit de fond) et 0.1 M de PB pour perméabiliser la membrane des neurones. 25 5) Incuber de 3 à 4 heures dans une solution contenant 0.25% de Triton X-100, 1 % de NRS, PB 0.1 M et 1 goutte de chacune des solutions du kit « ABC Elite » (Vector Laboratories, Burlingame) par 3ml de solution préparée. Ce kit contient des solutions d'avidine-peroxydase (complexe formé chimiquement) et de biotine. Le dosage est pré-établi par le manufacturier. On doit préparer la solution 30 minutes avant l'incubation pour permettre l'association du complexe avidine-peroxydase biotine. Ce complexe comprend la liaison d'une molécule d'avidine-peroxydase à 4 molécules de biotine. Lors de la fixation du complexe, une biotine cède sa liaison à la molécule de biocytine (sa force de liaison pour l'avidine est plus grande). Ainsi, le complexe se retrouve ainsi piégé avec la biocytine intracellulaire. 6) Deux lavages de 10 minutes dans une solution de TBS (0.05 M; Tris buffer solution) pour enlever l'excédant de complexe qui n'a pas réagi avec une molécule de biocytine. 7) Incuber dans une solution de 0.25 mg/ml de « DAB » (3,3-Diaminobenzidine; 3C6H3(NH2)2 ), de 0.5 mg/ml de « Nickel Ammonium sulfate » ; catalyseur pour la réaction de la peroxydase liée à l'avidine) et de 0.05 M de TBS. DAB est un substrat pour les peroxydases et son produit est de couleur noire et insoluble (l'empêchant de diffuser dans la solution aqueuse). Cette étape sert uniquement à la pénétration du substrat et de son catalyseur dans la tranche (la peroxydase n'est pas encore activée). 8) Incubation dans une solution semblable à celle décrite à l'étape 7) à laquelle on a rajouté .003% de peroxyde. Le peroxyde active la peroxydase liée à l'avidine et permet de métaboliser DAB. À cette étape, il est important de suivre la réaction et de l'arrêter au moment désiré en procédant à l'étape suivante. 9) Deux lavages avec TBS (0.05 M) pour éliminer l'excédant de substrat et ainsi arrêter la réaction. 10) Ensuite, monter les tranches sur des lames de microscope, sécher quelques jours et fixer avec une solution de «permount» (Fisher Scientific; agent d'adhésion permanent pour les tissus). 26 4.6 Fixation des tranches à partir d'une solution de « permount » Déshydrater complètement les tranches de cerveau par des incubations d'une minute dans des bassins d'éthanol de plus en plus concentrés (60% à 100%). Ensuite, immerger les lames dans une solution de toluène (environ 1 minute) pour éliminer l'alcool. En retirant la lame du toluène, étendre une couche de « Permount » (Fisher Scientific; agent d'adhésion permanent pour les tissus) sur les tranches de cerveau et y déposer une lamelle. Si des résidus de « permount » demeurent sous ou sur la lame, les nettoyer avec un papier absorbant préalablement trempé dans le toluène. Ce dernier dissout la solution de « permount ». Les tranches peuvent être ainsi conservé pour de très longues périodes. 4.7 Visualisation des neurones marqués à la biocytine Les neurones marqués à la biocytine sont observés à l'aide d'un microscope optique (Leitz, DMRB), d'une caméra de type Leica DC300 (Leica, Germany), d'un objectif à immersion dans l'huile de 100X (Leica, Germany) et du logiciel IM50 (Product Leica IM50, version 1.20 releade 19, Leica microsystems AG, Switzerland). 4.8 Drogues et applications des drogues Tous les agents pharmacologiques sont appliqués en changeant la solution d'AFCS qui perfuse la chambre à immersion par une solution de composition semblable, à laquelle nous ajoutons les agents pharmacologiques désirés. Toutes les solutions sont continuellement saturées par 95% O2 et 5% de CO2 et ont une température de 31-33 °C lors de leur application. APV, NBQX, l'ifenprodil, et la picrotoxine sont achetés chez Tocris (Ellisville, MO, USA). Tous les autres produits chimiques proviennent de chez SigmaAldrich Canada (Oakville, ON, Canada). 4.9 Privation sensorielle Les souris âgées de 5 JPN sont anesthésiées par l'isofiuorane dans une chambre scellée. Après que l'animal soit profondément endormi (2 à 3 minutes), il est placé sous un microscope de type « plein champ » et les vibrisses de chaque côté du museau sont retirées à l'aide de forceps. Cette procédure est répétée quotidiennement jusqu'à 19 JPN. 27 4.10 Analyse des données Nous avons utilisé « Axograph 4.9 » (Axon Instruments) et « Origin 7 » (OriginLab, Nothampton, MA) pour analyser les résultats et faire les statistiques. L'estimation des constantes de temps et la détection des pics d'amplitude ont été effectuées avec « Axograph 4.9 », alors que les analyses graphiques (dénombrement du nombre de saut, estimation des courbes « CPSE - Voltage membranaire ») et les statistiques (calcul de moyenne, l'écart-type, coefficient de variation, comparaison de moyenne ou de distribution) ont été réalisées à partir de « Origin 7 ». Les moyennes ont été comparées par des « Student's t-test » à deux échantillons ou par des « one-way ANOVA test», alors que les distributions ont été comparées par des « K-S test » (Kolmogorov-Smirnov). 4.11 Recrutement quantitatif des fibres glutamatergiques par un protocole de stimulation progressive La quantification des fibres s'obtient en comptant le nombre de paliers sur un graphique de la réponse synaptique en fonction de l'intensité de stimulation (figure 4.2). Pour ce genre d'expérience, il est nécessaire que la stimulation électrique soit faite avec une électrode bipolaire concentrique (l'injection et le retour du courant se fait sur un même axe) afin d'obtenir une zone de stimulation sphérique et localisée à la pointe de l'électrode. Il est ainsi possible d'associer l'intensité de stimulation avec la zone stimulée. En augmentant progressivement la stimulation, on augmente ainsi la zone stimulée et à chaque nouvelle fibre glutamatergique recrutée, la réponse post-synaptique enregistrée augmente. Sur un graphique de la réponse post-synaptique en fonction de l'intensité de stimulation, le recrutement d'une nouvelle fibre se réalise sur une très petite variation de stimulation et correspond à un saut graphique. Les paliers du graphique correspondent pour leurs parts aux intervalles d'intensité de stimulation (zone stimulée) pour lesquelles aucune nouvelle fibre innervant le neurone enregistré n'est recrutée. Ainsi, on peut dénombrer le nombre d'entrées synaptiques innervant le neurone enregistré en comptant le nombre de sauts ou le nombre de palliers. Le comptage des sauts se fait généralement pour le voltage 28 membranaire +40mV car ce potentiel permet également le dénombrement des fibres silencieuses (voir la section suivante). Pour réaliser ce genre d'expérience, il est également important d'isoler tant que possible les connexions à l'étude. Afin de diminuer toute contamination d'enregistrement par les fibres CT, nous retirons les régions corticales lors de la préparation de nos tranches. Les régions corticales frontale et supérieure du cerveau sont enlevées avant la fixation du cerveau sur le plateau de coupe, alors que la région corticale temporale est séparée lors de la coupe sagittale faite par le vibratome. De plus, le système gabaergique (GABA; Acide gammaaminobutyrique), également présent dans le thalamus et pouvant moduler les réponses, est bloqué par l'ajout systématique de la picrotoxine (lOOuM). 4.12 Estimation du nombre de fibres Dans le cas où le nombre de fibres est très grand, rendant le dénombrement des sauts ou des paliers très difficile, une estimation du nombre de fibres est faite. Deux méthodes acceptables peuvent être employées dans cette situation, mais malheureusement, chacune d'elles présentent des avantages et des inconvénients. La première méthode consiste à diviser le pic de la réponse synaptique maximale par le pic de la première réponse enregistrée. Le problème avec cette méthode est que la grande variabilité de l'intensité de chacune des réponses peut fortement biaiser l'estimation qui est faite. La seconde méthode tend à corriger cette grande variabilité de l'amplitude des réponses unitaires en divisant la réponse maximale par l'amplitude moyenne des trois premières réponses. Cette méthode peut corriger d'une certaine manière les erreurs qui pourraient être engendrées par une très petite ou très grande première réponse. Cependant, cette estimation peut être biaisée par un nouveau facteur : la réponse induite par un ensemble de fibres ne correspond pas nécessairement à la sommation des réponses individuellement induites par ces fibres. Ainsi, cette méthode ne tient pas compte de l'ensemble des interactions synaptiques possibles lors de la stimulation d'un ensemble de fibres. 29 4.13 Identification des synapses glutamatergiques silencieuses Les synapses silencieuses sont des synapses non fonctionnelles. Elles ne génèrent aucune réponse post-synaptique dans des conditions physiologiques normales. En ce qui concerne les connexions glutamatergiques, elles correspondent à une synapse n'ayant que des récepteurs post-synaptiques NMDA. Elles ne génèrent aucune réponse synaptique aux conditions membranaires physiologiques, car l'ion de magnésium bloque les canaux au voltage membranaire de repos 120. Cependant, une dépolarisation du potentiel membranaire (> OmV) permet d'enregistrer une réponse dans le neurone post-synaptique. Ainsi, sur un graphique du pic de la réponse post-synaptique en fonction de l'intensité de stimulation pour des voltages membranaires de -70mV et 40mV, on peut identifier les synapses silencieuse par la présence d'un saut à +40mV uniquement, (figure 4.3) 4.14 Évaluation de la rectification des réponses médiées par les composantes AMPA De précédentes études ont démontré que la sous-untié GluR2 des AMPAR jouait un rôle majeur dans la perméabilité du récepteur au calcium et dans la rectification des courants entrants (courants générés lorsque le voltage membranaire du neurone postsynaptique est supérieur au potentiel d'inversion dans les conditions physiologiques) 94 . Ainsi, on peut estimer la proportion de GluR2 au cours du développement en quantifiant le niveau de rectification des courants AMPA entrants : une plus grande rectification suggère une moins grande proportion de GluR2 et vice-versa (fig. 4.4). Le seul inconvénient de cette estimation est qu'elle ne tient pas compte de la modulation possible des polyamines intracellulaires 12313 °. Ces derniers peuvent changer l'activité de la sous-unité de manière dépendante du voltage et ainsi changer ses propriétés fonctionnelles au cours de l'enregistrement. L'évaluation du niveau de rectification se fait par un graphique de la réponse postsynaptique des AMPAR pures en fonction du voltage membranaire. Pour ce faire, on doit toujours recruter les mêmes fibres (stimulation constante) et isoler la réponse AMPA. Pour obtenir des réponses AMPA pures au niveau de la fibre lemniscale, nous ajoutons systématiquement de la picrotoxine (lOOuM; antagoniste des récepteurs ionotropiques GABAA) et de l'APV (50 à 100 |iM; antagoniste de NR2B des NMDAR). Les voltages 30 membranaires enregistrés sont de -70mV à +50mV avec des sauts de lOmV. Puisque le potentiel de jonction risque de déplacer la trace obtenue, il est estimé (+5mv avec le logiciel pClamp; Axon Instruments Inc.) et corrigé. Pour éviter les changements de l'activité régulatrice dépendante du voltage des polyamines intracellulaires, les enregistrements sont réalisés de la même manière, soit en enregistrant les réponses synaptiques de -70mV à +40mV et en accordant, avant l'enregistrement d'une nouvelle réponse, une période de repos de 30 à 40 secondes après un changement de voltage membranaire. Les droites de part et d'autre du potentiel d'inversion des courants AMPA sont estimées par la fonction « linear fit » d'Origin 7. Un indice de rectification est également calculé; il correspond au ratio de la réponse synaptique à +35mV sur celle à -35mV (1 signifiant aucune rectification et 0, une rectification complète des courants entrants). 31 0.5 mm Control d-APV d-APV + NBQX +40 mV B -70 mV Figure 4.1: Méthodologie et pharmacologie des enregistrements des neurones du thalamus ventrale/basale chez la souris. A : Une tranche sagittale de cerveau de souris de 24 JPN marquée d'une coloration nucléaire avec l'hematoxyline. L'enregistrement cellulaire (REC) s'effectue au niveau du noyau VPM, et la stimulation (Stim) se fait au niveau de la fibre lemniscale médiale (ML) avec une électrode bipolaire concentrique. Abréviations (selon les noms anglais) : ic, internai capsule; LV, latéral ventricle; Po, posterior thalamic nucleus; Rt, reticular thalamic nucleus; VL, ventrolateral thalamic nucleus; VPL, ventral posterolateral thalamic nucleus; ZI, zone incerta. B : Un neurone du VPM de 14 JPN marqué à la biocytine. C : Pharmacologie d'un RPSE provenant d'un neurone de 17 JPN. D-APV (lOOuM, trace en rouge) a peu d'effet sur le pic de l'amplitude à -70mV, mais bloque la composante lente de la réponse à +40mV. La composante rapide est bloquée à70mV et +40 mV par NBQX (10uM). L'intensité de stimulation est de lOOuA. Chaque trace correspond à la moyenne de 4 ou 5 réponses. L'artefact de stimulation est réduit par la soustraction d'une réponse sous le seuil de stimuli et, le reste du pic de l'artefact est enlevé digitalement. Amplitude Maximum CPSE Vm positif OpA Vm négatif- I I Intensité de la stimulation Figure 4.2 : Quantification des entrées synaptiques par un protocole de stimulation progressive. A : Un enregistrement intracellulaire de type en « patch-clamp » configuration cellule entière (ENR) sur un neurone (cercle noir) innervé par trois fibres (FI, F2, F3). La stimulation (FJ) s'effectue au niveau des fibres par une électrode bipolaire concentrique (pour une relation sphérique entre la zone stimulée et l'intensité de stimulation). Les zones limites de recrutement d'une nouvelle fibre sont représentées par les cercles de couleurs (jaune pour le recrutement de la FI, orange pour la F2 et le rouge pour la F3). B : Représentation graphique de l'amplitude maximum du CPSE en fonction de l'intensité de stimulation (zone sphérique recrutée) pour un voltage membranaire (Vm) positif (ligne pleine) et négatif (ligne pointillée). Les sauts (limites des zones de stimulation pour le recrutement d'une nouvelle fibre) sont représentés par les mêmes traits de couleur qu'en (A). C : Représentation des différentes réponses post-synaptiques enregistrées. Les 33 courants enregistrés sont entrants pour un Vm positif et sortants pour un Vm négatif (de part et d'autre du potentiel d'inversion de OmV des canaux glutamatergiques. L'activation des NMDA à un Vm positif génère un CPSE de cinétique beaucoup plus lente. Le recrutement d'une nouvelle fibre augmente le CPSE enregistré, générant ainsi trois niveaux de réponse (correspondent aux paliers du graphique en B). La plus petite réponse enregistrée représente l'activation de FI, la réponse intermédiaire correspond au recrutement de FI et F2, et la plus grande réponse représente le recrutement des trois fibres. 34 ENR B Amplitude Maximum CPSE Vm positif Vm positif O pA. - Vm négatif Vm négatif" I Intensité de la stimulation Figure 4.3 : Identification électrophysiologique du des nombre fibres d'entrée silencieuses synaptique. lors d'une quantification A : Représentation d'une quantification d'entrées synaptiques (comme en 4.2A). La fibre 2 est silencieuse et ne contient que des récepteurs post-synaptiques NMDA. B : Sur un graphique de l'amplitude maximum des CPSE en fonction de l'intensité de stimulation, la stimulation de la fibre silencieuse (F2) ne génère pas de saut quand le Vm est négatif (inférieur au potentiel d'inversion). Les fibres silencieuses sont donc dénombrées en comptant le nombre de sauts uniquement présent pour les voltages positifs. C : Représentation des différents CPSE enregistrés. Au voltage négatif, la réponse synaptique ne change pas lors de la stimulation de F2, générant ainsi un niveau d'enregistrement de moins pour ce potentiel membranaire (2 niveaux au Vm négatif contre 3 pour un Vm positif). 35 CPSE maximum +35 mV. Vm -35 mV ' B CPSE maximum +35 mV. -35 mV " Vm Figure 4.4 : Rectification des courants AMPA entrants pour une même entrée synaptique. A : Représentation d'une réponse AMPA non rectifiée. (Gauche) Les CPSE sont équivalents mais de sens opposés pour deux voltages membranaires de différence équivalente du potentiel d'inversion (OmV). (Droite) Sur un graphique du maximum des CPSE en fonction Vm, une réponse non rectifiée génère une fonction linéaire pour les courants entrants (>0 mV) et sortants (<0 mV). B : Représentation des CPSE pour une réponse synaptique AMPA rectifiée. (Gauche) Les courants sortants (Vm< 0 mV) sont présents, mais ceux sortants sont bloqués ou fortement diminués. (Droite) Sur un graphique du maximum des CPSE en fonction Vm pour une réponse rectifiée, la linéarité s'observe seulement pour les courant sortants (Vm < OmV), alors que les courants entrants sont bloqués (ils tendent vers 0 pA). 36 Chapitre 5 Résultats Les axones myélines des neurones du PRV voyagent dans la partie médiale de la voie lemniscale avant de faire connexion avec les neurones du VPM. Ces connexions, appelées synapses lemniscales, sont préservées dans une coupe sagittale de 300 microns et il est facile de repérer le faisceau de fibres avec un objectif 4X (figure 4.1 A). Nous avons fait l'enregistrement des neurones (« patch-clamp » en configuration cellule entière) du VPM ayant un soma de grande taille ( 1 0 - 2 0 microns; figure 4.1B) dans le VPM et une électrode bipolaire concentrique a été placée dans la voie lemniscale pour stimuler les fibres (100 u.s de stimulation, intensité variable). La picrotoxine (100 fxM; un antagoniste GABAA) est ajoutée systématiquement à la solution extracellulaire pour bloquer les transmissions GABAA inhibitrices et ainsi éviter toute contamination d'enregistrement par celles-ci. Tel qu'illustré à la figure 4.1C, les stimulations supérieures au seuil d'activation des fibres lemniscales produisent dans le neurone du VPM un courant monosynaptique glutamatergique (excitateur) et la pharmacologie de cette réponse démontre que ce courant est médié par des AMPAR et NMDAR. À -70mV, le courant synaptique de cinétique rapide est généré majoritairement par les AMPAR puisqu'il est bloqué par NBQX. À +40mV, la grande réponse post-synaptique (de cinétique lente) est majoritairement NMDA et la petite réponse de cinétique rapide observée en présence d'APV correspond à la réponse des AMPAR à ce voltage. Étant donné la différence de cinétique et d'amplitude de ces deux réponses, on considère le pic (après 2.5 mS) comme étant la réponse des NMDAR. 5.1 Élimination d'entrées synaptiques fonctionnelles durant le développement Nous avons examiné la relation entrée/sortie (réponse synaptique en fonction de l'intensité de stimulation) aux synapses lemniscales de 7 JPN à 24 JPN. Les enregistrements sont de type « patch-clamp » en configuration cellule entière avec un voltage imposé. Tout d'abord, un potentiel de -70mV est imposé et les CPSE sont enregistrés à différentes intensités de stimulation. Par la suite, la même procédure est répétée à un voltage membranaire imposé de +40mV afin d'examiner la composante NMDA des CPSE. Un exemple des résultats obtenus est illustré à la figure 2. Chez une souris âgée de 20-24 JPN, la majorité des neurones démontre une réponse tout ou rien aux différentes intensités de stimulation (fig. 5.1D). Ces résultats sont similaires à ceux obtenus dans le VPM de rat adulte 37 , suggérant que chaque neurone mature du VPM reçoit généralement une seule entrée synaptique. Au contraire, les neurones âgés de 7-9 JPN démontrent une RPSE qui augmente de plus en plus lorsqu'on augmente la stimulation (fig. 5.1A). Chez la souris de 11-13 JPN, la stimulation progressive démontre plusieurs plateaux de RPSE, et le nombre de plateaux correspond à un état intermédiaire entre la pente continuelle des RPSE des souris âgées de 7-9 JPN et de la réponse tout ou rien de ceux de 20-24 JPN (fig. 5.1B). À 16-17 JPN, la majorité des neurones enregistrés présentent une réponse tout ou rien, similaire à celle observée chez les souris de 20-24 JPN (fig. 5.1C). Ces résultats suggèrent qu'à une semaine post-natale, chaque neurone du VPM reçoit des entrées synaptiques de plusieurs axones lemniscales et que chacun de ceux-ci contribue à une fraction de la réponse synaptique totale. Le nombre d'entrées synaptiques diminue ensuite rapidement pour atteindre sa maturité vers 16-17 JPN. Le nombre de fibres lemniscales innervant chaque neurone du VPM est déterminé en comptant le nombre de paliers présents sur le graphique du pic de la réponse synaptique en fonction de l'intensité de stimulation. Pour les neurones présentant trop de paliers pour être comptés (10 neurones de 7-9 JPN et 4 de 11-13 JPN), nous avons estimé le nombre de fibres tel qu'expliqué dans la partie « matériel et méthode ». Pour un groupe de 22 échantillons (groupes 7-9 JPN), les deux méthodes d'estimation donnent des résultats très semblables, soit 8.3 ± 1.1 entrées synaptiques pour la méthode de la première réponse et 7.6 ± 0.9 pour la méthode pour la seconde méthode (division par 3 de la troisième réponse synaptique). Puisque les deux méthodes ne sont pas statistiquement différentes (p > 0.5, KS test), seulement les résultats de la première méthode ont été inclus dans les statistiques. Le nombre moyen d'axones innervant chaque neurone du VPM est de 8.3 ± 1.1 à 7-9 JPN (N=22), 4.2 ± 0.8 à 11-13 JPN (N=17), 1.4 ± 0.2 à 16-17 JPN (N=13) et 1.4 ± 0.2 à 20-24 JPN (N=23). La distribution pour le groupe 7-9 JPN est significativement différente des groupes 16-17 JPN et 20-24 JPN (p < 0.001, K-S test). 38 5.2 Présence développementale de fibres glutamatergiques silencieuses De précédentes études suggèrent la présence de synapses silencieuses dans le réseau glutamatergique immature ' ' . Par exemple, il a été démontré que le nombre de synapses silencieuses diminue au niveau des fibres thalamo-corticales du cortex somatosensoriel du rat avec la maturation (50% sont silencieuses à 3-5 JPN contre 10% à 9-10 JPN) l33 . Afin de vérifier si un phénomène semble s'observe au niveau des fibres lemniscales, nous avons estimé le nombre de fibres silencieuses pour chacun des groupes d'âge en comptant le nombre de sauts graphiques présents uniquement à +40mV (et non à 70mV). Des fibres silencieuses ont été dénombrées seulement dans les deux plus jeunes groupes. À 7-9 JPN, neuf cellules avaient un trop grand nombre de fibres pour permettre l'identification de ces sauts graphiques. Parmi les 4 neurones analysables restants, nous avons trouvé des fibres silencieuses dans 2 de ceux-ci. La première cellule comptait trois fibres silencieuses sur un total de cinq fibres alors que la seconde comptait seulement une fibre silencieuse pour un total de 4 fibres. Ainsi, 50% (2 sur 4) des neurones analysables présentaient des fibres silencieuses et, pour ces 4 neurones, 30,8% (4 sur 13 au total) des fibres étaient silencieuses. Les 9 cellules qui présentaient un trop grand nombre d'innervations pour permettre l'identification de celles silencieuses, laissent présumer que les résultats obtenus sont en dessous de la réalité. À 11-13 JPN, 3 neurones présentaient des fibres silencieuses (8 fibres au total) pour un total de 14 cellules analysables. Parmi ces neurones, la première cellule comptait 4 fibres silencieuses, la seconde 3 et une seule pour la dernière. En somme, 21.4% (3 cellules sur 14) des neurones de ce groupe présentent au moins une fibre silencieuse et, en moyenne, 5.1% des fibres analysées sont silencieuses (3/59 fibres ; le nombre de fibres totale est estimé à partir de la moyenne des fibres innervant chaque neurone). 39 Il est à noter que le nombre de cellules analysées pour le comptage des fibres silencieuses est inférieur au nombre total de neurones étudiés pour le comptage des entrées synaptiques. Ceci est dû au fait que l'identification des fibres silencieuses requiert la présence de saut à -70mV et à +40mV alors que le comptage des fibres innervant le neurone enregistré nécessite seulement le saut à +40mV. 5.3 Changements développementaux dans le ratio AMP A/NMD A Nous avons examiné les composantes AMPA et NMDA des courants synaptiques entre 7 et 24 JPN. Comme illustré à la figure 4.1C, le pic du courant enregistré à -70mV peut être entièrement attribué à l'activation des AMPAR. À +40mV, deux composantes sont observées, soit une composante AMPA, et une composante NMDA. La réponse NMDA se distingue de la réponse AMPA principalement par une cinétique beaucoup plus lente (fig. 4.1C). Étant donnée la cinétique rapide des composantes AMPA (<6 ms), la RPSE enregistrée au-delà de 6ms provient très majoritairement des composantes NMDA. En conséquence, nous avons estimé le ratio des réponses des composantes AMPA et NMDA en mesurant, dans un même neurone, l'amplitude maximal du CPSE à -70mV (AMPA) et +40mV (NMDA; après 6ms) pour une même intensité de stimulation (figure 5.2A et 5.2B). Les composantes AMPA sont estimées en mesurant le pic de l'amplitude de la RPSE à -70mV alors que les composantes NMDA sont estimées en mesurant le pic de l'amplitude à +40mV (après 7ms). Le sommaire des résultats est présenté à la figure 5.2C. Le ratio AMPA/NMDA est de 0.79 ± 0.08 à 7-9 JPN (N=22) et augmente ensuite rapidement (quelques jours) à 2.44 ± 0.27 chez les neurones de 16-17 JPN (N=12) pour être relativement stable par la suite. L'augmentation développementale dans le ratio peut-être causée par une augmentation des composantes AMPA ou une diminution des composantes NMDA (ou les deux). Pour investiguer ces possibilités, nous avons examiné séparément les changements dans les composantes AMPA et NMDA. Comme démontré à la figure 5.3, l'amplitude maximale des CPSE à -70mV (AMPA) double entre 7 et 13 JPN et demeure relativement stable après (fig. 5.3A). D'un autre point de vue, le maximum des réponses NMDA 40 (+40mV) diminue de 50% entre 7 et 16 JPN (fig. 5.3B). Ainsi, le changement developpemental du ratio AMPA/NMDA implique une augmentation de la réponse AMPA et une diminution de celle NMDA. Nous avons également examiné le changement developpemental des réponses minimales (première réponse enregistrée) à -70mV (AMPA) et à +40mV (NMDA). Le sommaire des résultats est donné à la figure 5.3C et 5.3D. Le pic de l'amplitude de la première réponse AMPA augmente de trois fois entre 7 et 13 JPN (fig. 5.3C). L'amplitude maximale des réponses NMDA augmente également avec l'âge, mais elle n'est pas significativement différente (fig. 4D). 5.4 Changements développementaux dans les propriétés des composantes NMDA Nous avons examiné la vitesse de descente des courants synaptiques engendrés par les composantes NMDA (+40mV) aux synapses lemniscales. Tel qu'illustré dans la figure 5.4C, la vitesse de descente est significativement plus lente (constante de temps plus grande) chez les jeunes souris (7-9 JPN). La constante de temps est de 99.1 ± 12.6 ms à 7-9 JPN (N=19), de 44.5 ± 3.6 ms à 11-13 JPN (N=16), 36.6 ± 2.4 ms à 16-17 JPN (N=l 1) et de 37.1 ± 1.9 ms à 20-24 JPN (N=23). Ainsi, la grande réduction de la constante de temps survient durant la seconde SPN. La réduction développementale dans la constante de temps des réponses des composantes NMDA a été observée dans plusieurs structures du SNC et, dans plusieurs de ces cas, elle est associée à une diminution de la sous-unité NR2B et à une augmentation de l'incorporation de la sous-unité NR2A dans les récepteurs membranaires NMDA 134 136 ~ . Pour vérifier si la réduction de la constante de temps des réponses lemniscales est également engendrée par une diminution des composantes NR2B, nous avons utilisé un antagoniste qui, selon le dosage, est sélectif aux récepteurs NMDA composés que de sousunité NR2B/NR1. Comme illustré à la figure 5.5, l'ifenprodil (3|iM) réduit significativement le courant synaptique médié par les NMDAR (+40mV) à 7-9 JPN (62.3 ± 6.4 % du contrôle, N=7) alors que son effet est beaucoup moins prononcé chez les neurones plus âgés, soit de 20-24 JPN (87 % ± 3.5 %, N=7; p < 0.01 vs les résultats obtenus à 7-9 41 JPN, t-Test non paire). De plus, l'ifenprodil a réduit significativement la constante de temps de trois des sept neurones enregistrés à 7-9 JPN (52.7% ± 3.6 % du contrôle, N=3), alors que son effet est moindre pour les quatre autres cellules (90.6 ± 4.5 % du contrôle, N=4). Nos résultats suggèrent donc une baisse développementale de la sous-unité NR2B dans la composition des récepteurs NMDA. 5.5 Changement développemental dans la relation CPSE-voltage membranaire (Vm) des composantes AMPA Des études antérieures ont démontré un changement dans la composition des AMPAR au cours du développement. Par exemple, les AMPAR des neurones pyramidaux du cortex n'ont pas de sous-unité GluR2 dans la composition de leurs récepteurs AMPA à la naissance, ce qui résulte en des courants rectifiés (courants entrants bloqués) et à une haute perméabilité au calcium 94. Une augmentation de l'expression et de l'incorporation des sous-unités au cours du développement de ces neurones conduit à une relation graphique linéaire des « CPSE-Vm » et à une faible perméabilité au calcium. Pour examiner si les synapses lemniscales subissent des changements similaires, nous avons étudié la relation « CPSE-voltage membranaire » des composantes AMPA à 11-13 JPN et 20-24 JPN. Le groupe 7-9 JPN n'a pas été enregistré dans cette situation car les courants synaptiques AMPA obtenus à cet âge sont petits et qu'ils risquent d'être faussés par l'artefact de stimulation ou le bruit de fond. Le potentiel de jonction, évalué à +5mV par le logiciel pClamp (Axon Instruments, Union City, CA), a été soustrait pour tous les voltages membranaires enregistrés. Pour éviter toute contamination d'enregistrements par les récepteurs NMDA, nous avons fait un ajout systématique de 50 à 100 JAM d'APV. À 12 JPN, le tracé graphique démontre une forte rectification de la pente des courants entrants (fig. 5.6A), et le même type de rectification est observé chez un neurone de 24 JPN (fig. 5.6B). Nous avons estimé un indice de rectification en calculant le ratio du pic de la réponse à +35 mV sur celui à -35 mV (1 signifiant aucune rectification et 0, une rectification complète des courants entrants). L'indice estimé à 11-13 JPN est de 0.34 ± 0.04 (N=7; fig. 5.6C) et il n'est pas significativement différent de celui estimé à 20-24 JPN (0.36 ± 0.05, N=5; p > 0.5, t-Test non paire). 42 Des études précédentes ont démontré une réduction dans la constante de temps du retour des CPSE des AMPAR 137 138 ' . Nous avons analysé, toujours en présence d'APV, le temps de descente des réponses AMPA à -70mV. Celui-ci est de 2.1 ± 0.2 ms (N=l 1) à 1113 JPN et de 1.8 ± 0.2 ms (N=7) à 20-24 JPN. Ces résultats ne sont pas significativement différents l'un de l'autre (p > 0.3, t-Test non paire). 5.6 Changements développementaux dans la plasticité à court terme Nous avons étudié la plasticité à court terme grâce à un protocole de double stimulation à 50ms d'intervalle à -70 mV et +40 mV chez les souris âgées de 7 à 24 JPN. Comme illustré à la figure 5.7A et 5.7B, la double stimulation cause une dépression de la deuxième réponse synaptique comparativement à la première pour toute la période développementale étudiée. Nous avons estimé le ratio du pic de la deuxième RPSE sur le pic de la première RPSE à +40 mV (composante NMD A) et -70 mV (composante AMPA) et le sommaire est présenté à la figure 5.7C. Le ratio des réponses des composantes NMDA démontre un petit changement développemental durant la période étudiée, mais il n'est pas statistiquement différent. Il est de 0.56 ± 0.04 à 7-9 JPN (N = 14), de 0.60.± 0.02 à 11-13 JPN (N = 13), de 0.67 ± 0.04 à 16-17 JPN (N = 10), et de 0.57 ± 0.03 à 20-24 JPN (N = 12). Le ratio des APMPAR demeure également relativement stable pour cette période développementale, et il est de 0.63 ± 0.02 à 7-9 JPN, 0.58 ± 0.03 à 11-13 JPN, 0.58 ± 0.02 à 16-17 JPN, et de 0.56 ± 0.03 à 20-24 JPN. 5.7 L'effet d'une privation d'expériences sensorielles Le système somato-sensoriel des vibrisses est fonctionnel à la fin de la première semaine post-natale. Le « whisking », une caractéristique clé dans le comportement d'exploration chez la souris, débute généralement vers le 9eme JPN et cette activité d'exploration est impliquée dans la maturation des champs réceptifs du VMP139. Les synapses lemniscales sont hautement actives durant cette période d'exploration. Pour examiner si l'expérience sensorielle joue un rôle dans l'élimination et le raffinement des synapses lemniscales, nous avons privé des souris d'expériences sensorielles entre 5 et 20 JPN en retirant, à l'aide de forceps (pince chirurgicale), toutes les vibrisses de chaque côté 43 du museau. Nous avons débuté le retrait des vibrisses à 5 JPN, soit avant que l'animal ne commence à explorer son environnement et après la ségrégation spécifique des fibres lemniscales dans le VPM 140 . Les réponses synaptiques ont été enregistrées entre 20 et 23 JPN. Nos résultats montrent que la privation sensorielle n'a aucun effet sur l'élimination des synapses : la majorité des neurones du VPM reçoit une entrée synaptique, et la distribution est très similaire à celle observée chez les souris normales du même âge (fig. 5.8A). De plus, les propriétés synaptiques ne diffèrent pas de celles des souris normales. Les propriétés analysées sont la plasticité à court terme (fig. 5.8B), l'amplitude des CPSE (fig. 5.8C), le ratio AMPA/NMDA et le temps de descente des réponses des NMDAR. Le ratio P2/P1 est de 0.65 ± 0.04 (N=16) à -70mV et de 0.63 ± 0.02 à +40mV. Ces rapports ne diffèrent pas de ceux obtenus chez la souris normale (p > 0.01, t-Test non paire). L'amplitude maximale de CPSE est de 891 ± 123 pA (N=16) à -70 mV et de 667 ± 110 pA à +40 mV, et elle n'est également pas différente de celle des souris normales (p > 0.5, tTest non paire). Le ratio AMPA/NMDA est de 2.37 ± 0.24 (N=16) et ne diffère pas des contrôles (2.41 ± 0.31, N=18; p > 0.5, t-Test non paire). Finalement, la constante de temps des RPSE des NMDAR est de 35.6 ± 1.7 ms (N=22), et elle ne diffère pas des souris avec des expériences sensorielles (37.1 ±1.9 ms, n = 23; p > 0.5, t-Test non paire). 44 1500CL 03 1000- 6- ^O^OOQOO < ^ cp 500- —o— +40 mV —A 70 mV Ji Q. P7-9 5- 0) 0 +40 mV bPS < -70 mV E 2- AA •ouu- : -1000- I 0 10 ms , , P12 2 40 80 120 160 200 Stimulus Intensity (LIA) 800-, 4 Q <D P11-13 400O 1 Plltl • 0- •s E -400O -800rt\ n_ -1200- 1- UJ 0 0 2 20 40 60 80 100 120 140 Stimulus Intensity P17 de •g. +40 mV -70 mV 4 6 8 10 12 14 16 Number of Inputs 4 6 8 10 12 14 16 Number of Inputs 10-, 400-I P16-17 = O 0- -400/ 300 pA / o -800- CL LU -1200- 42- 40 80 120 160 0 200 0 Stimulus Intensity H P21 1000500- 16= 14- 2 4 6 8 10 12 14 16 Number of Inputs •: P20-24 8 ^20 10- +40 mV -70 mV 1 1 ^ E -500O -1000- z 8 12 16 20 Stimulus Intensity (\aA) 420 2 4 6 8 10 12 14 16 Number of Inputs Figure 5.1: Élimination de synapses fonctionnelles au cours du développement post-natal. A à D: Représentation des différentes intensités de CPSE enregistrées chez des neurones du VPM âgés de 7, 12, 17 et 21 JPN (gauche). Représentation graphique entre le maximum du CPSE en fonction de l'intensité de stimulation (droite). On peut noter la présence d'un plus grand nombre de sauts à 7 JPN qu'à 12 JPN. À 17 et 21 JPN, les cellules présentent une réponse tout ou rien. E à H : Distribution des neurones en fonction du nombre d'entrées 45 synaptiques enregistrées pour chacun des différents groupes. La distribution du groupe 7-9 JPN est significativement différente des groupes 16-17 JPN et 20-24 JPN (p < 0.001, K-S test), mais elle n'est pas différente du groupe 11-13 JPN (p > 0.03). Les distributions des groupes 16-17 JPN et 20-24 JPN ne sont pas significativement différentes (p > 0.5) 46 P21 3,5 3,0- g3 2,5a: 1 I 2,01,51,00,50,0 p<0.0 5 ~r W m, P7-9 P11-13 P16-17 i P20-24 Figure 5.2 : Développement du ratio AMPA/NMDA. A : CPSE enregistré d'un neurone âgé de 7 JPN à +40 et -70 mV. B : CPSE enregistré à d'un neurone âgé +40 and -70 mV de 21 JPN. C : Histogramme du cumulatif des ratios AMPA/NMDA pour les différents groupes d'âge. Le ratio moyen est de 0.79 ± 0.08 (N = 22) à 7-9 JPN, 1.79 ± 0.09 (N = 18) à 11-13 JPN, 2.44 ± 0.27 (N = 12) à 16-17 JPN, et 2.41 ± 0.31 à 20-24 JPN. Le groupe 7-9 JPN est significativement différent des autres groupes (p < 0.05, one-way ANOVA). 47 Maximal EPSC at -70 mV (AMPA) First EPSC at -70 mV (AMPA) <; 1200Q. qj 10003 800Q. / / / , • • E p < 0.05 * 600- O 400- ai 2ooP7-9 B 1400- P11-13 P16-17 P20-24 I '7-0 Maximal EPSC at +40 mV (NMDA) P11-13 P16-17 P20-24 First EPSC at +40 mV (NMDA) * p<0.05 ^1200^ •= Q. 800- e 600- O T. 1000 400- ûl W 200 P7-9 P11-13 P16-17 P20-24 P7-9 P11-13 P16-17 P20-24 Figure 5.3 : Changements dans l'amplitude des réponses AMPA et NMDA. A : L'histogramme des réponses maximales enregistrées à -70 mV (RPSE AMPA) pour les 4 groupes d'âge. L'amplitude moyenne est de 408 ± 89 pA (N = 19) à 7-9 JPN, 1002 ± 137 pA(N= 16) à 11-13 JPN, 1113 ± 139pA(N= 11) à 16-17 JPN, et 944 ± 105 pA (N = 17) à 20-24 JPN. Le groupe 7-9 JPN est significativement différent des 3 autres (p < 0.05, oneway ANOVA). B: L'histogramme des réponses maximales enregistrées à +40 mV (RPSE NMDA) pour les 4 groupes d'âge. Le groupe 7-9 JPN est significativement différent du groupe 16-17 JPN et 20-24 JPN (p < 0.05, one-way ANOVA). C: L'histogramme des premières RPSE à -70 mV (la réponse minimale AMPA) pour les 4 groupes d'âge. Le groupe 7-9 JPN est significativement différent des autres (p < 0.05, one-way ANOVA). D: L'histogramme des premières RPSE à +40 mV (la réponse minimale NMDA) pour les 4 groupes d'âge. Les 4 groupes ne sont pas significativement différents (p > 0.1, one-way ANOVA). 48 P8 B P8 30 ms 120-, * (p<0.01) .§,100ra 80- ô 6 §• 40û 20- P7-9 P11-13 P16-17 P20-24 Figure 5.4 : Diminution développementale dans le temps de descente des réponses NMDA. A et B: CPSE à +40 mV de neurones âgés de 8 et 20 JPN. C : Normalisation des CPSE présentés en A et B. Le CPSE à 20 JPN est beaucoup plus rapide qu'à 8 JPN. D : L'histogramme de la constante de temps à +40 raV pour les 4 groupes d'âge. Le groupe 7-9 JPN est significativement différent des autres groupes (p < 0.05, one-way ANOVA). 20 ms P20 Control g ! prodil ( 100 pA c bUo 40- * P T «0.01 HP B ilfiP il 200P7-9 P20-23 Figure 5.5: Diminution développementale de la sensibilité à l'ifenprodil. A et B : L'effet de l'ifenprodil (3 uJVI) sur les CPSE à +40 mV dans des neurones de 7 JPN (A) et 20 JPN (B). NBQX (5 |iM) est présent dans tous les enregistrements. C: Histogramme de l'effet de l'ifenprodil pour deux groupes d'âge. L'inhibition par l'ifenprodil est plus grande à 7-9 JPN qu'à 20-23 JPN (p < 0.05, t-Test non paire). P12 I(PA) / / 100- / o ' ' ' J/--100 20 1,0-, O -20 o' -40 80 -60 r |~" "i c 40 -200 / g : -300 - -400 / o,6- ro o •500 B 0,8- 60 V(mV) E 0,4- & 0,2- I(PA) P24 4002 0 r 80 I -60 • I -40 • i 0,0 / P11-13 P20-24 o° ; -20 • i • £0 20 -200 40 60 V(mV) -400 •600 '_ 800 Figure 5.6 : Rectification des courants entrants AMPA durant le développement. A : (Gauche) Enregistrement d'un même CPSE à différents voltages membranaires chez un neurone de 12 JPN. L'ajout continuel de D - APV (50 (xM) bloque les récepteurs NMDA. (Droite) Représentation graphique de la relation "CPSE - Vm" avec traçage linéaire réalisé à partir des Vm de 0 à -70 mV. Les points pour des potentiels membranaires positifs sont sous le traçage linéaire, indiquant une rectification des courants entrants. Le potentiel de jonction (+5 mV) est corrigé. B : Mêmes résultats, mais pour un neurone de 24 JPN. C : Comparaison entre les deux groupes d'âge, soit 11-13 JPN et 20-24 JPN. L'indice de rectification est estimé par le ratio du CPSE à +35 mV sur celui à -35 mV dans la même cellule pour une même stimulation (1 signifie aucune rectification, 0 signifie une rectification complète des courants entrants). Il n'y a pas de différence significative entre les deux groupes (p > 0.5, t-Test non paire). 51 +40 mV -70 mV 20 ms B P21 200 pA P7-9 P11-13 P16-17 P20-24 Figure 5.7 : La plasticité à court terme des CPSE est stable entre 7 et 24 JPN. A et B: Enregistrements des CPSE lors d'un protocole de double stimulation à +40 mV et à -70 mV de neurones âgés de 7 (A) et 21 JPN (B). C: Histogramme du sommaire des ratio du maximum de la 2ème RPSE sur la 1ère RPSE à +40 mV (colonnes grises) et à -70 mV (colonnes rayées) pour les 4 différents groupes d'âge. Les moyennes ne sont pas significativement différentes (p > 0.1, one-way ANOVA). B 1,0-, 18-, 16i2 14 0 12"5 10- I 0,8- i Normal I Deprived ce Normal 1 8- |o,4 H CD l 0,2 A 20 0,0 1 2 3 4 5 -70 mV Number of Inputs 18 1 1200-, 16"53 O +40 mV I 1000- 14- Whisker-deprived ': Normal I Deprived -g 800 A ^3 10- "a. 600O 400-| V) 42 - £j 200- 0 0 1 2 3 4 Number of Inputs 5 -70 mV +40 mV Figure 5.8 : Une privation d'expérience sensorielle n'a pas d'effet sur le remodelage synaptique. La privation d'expérience sensorielle consiste à retirer quotidiennement les vibrisses de chaque côté du museau du rongeur entre 5 et 19 JPN. A : La distribution du nombre d'entrées synaptiques fonctionnelles chez les souris normales et sans expérience sensorielle. Les deux groupes sont examinés entre 20 et 24 JPN. Les résultats correspondant aux souris normales sont les mêmes que ceux présentés à la figure 5.1H. La distribution des deux groupes n'est pas significativement différente (p > 0.5, K-S test). B : L'histogramme de la plasticité à court terme à +40 mV et à -70 mV chez les souris normales (colonnes rayées) et privées (colonnes grises). Les résultats pour les souris privées d'expériences ne diffèrent pas de ceux des souris normales (p > 0.01, t-Test non paire). C : L'histogramme des premiers CPSE à +40 mV et à -70 mV obtenu chez des souris normales (colonnes rayées) et privées d'expériences (colonnes grises). La moyenne des deux groupes n'est pas significativement différente (p > 0.1, t-Test non paire). 53 Chapitre 6 Discussion et conclusion Au cours du développement nerveux, une élimination massive de connexions précède la phase de synaptogénèse, généralement surnuméraire et imprécise. Cette dernière permet de remanier et raffiner les circuits neuronaux nouvellement formés. Ainsi, les synapses plus faibles sont retirées alors que les autres sont consolidées (renforcées). Cependant, les mécanismes fondamentaux de ce phénomène d'élimination sont encore mal connus. Nos résultats ont démontré qu'il y a élimination de synapses au niveau des fibres lemniscales dans le VPM pendant la deuxième semaine post-natale et que l'expérience sensorielle pendant le jeune âge a peu d'effet sur l'élimination des synapses. 6.1 Élimination des synapses dans le VPM au cours du développement L'information tactile des larges vibrisses de chaque côté du museau des rongeurs est relayée au néocortex par deux voies distinctives. La première voie, nommée lemniscale, implique le PRV dans le tronc cérébral et le VPM dans le thalamus 20 ' 32 . La deuxième fait intervenir le SPV et le PO, et elle se nomme paralemniscale 31 . La voie lemniscale est organisée topographiquement 27-62"71' U3 . Le patron spécifique des vibrisses survient tôt durant le développement et la ségrégation dans le VPM est établie vers 4 JPN chez le rat 27 et la souris 140 . Nos résultats démontrent qu'à 7-9 JPN, après la ségrégation des axones, chaque neurone du VPM est innervé en moyenne par 8 fibres lemniscales alors qu'à 16-17 JPN, la majorité des neurones reçoivent 1 ou 2 entrées synaptiques. Ces résultats suggèrent que les connexions initiales du PRV au VPM manquent de précision, sont surnuméraire et, que le haut niveau de spécificité est atteint par une élimination de synapse au cours de la deuxième SPN, impliquant vraisemblablement un remodelage des branches axoniques. Ces changements coïncident avec la formation des complexes glomerulaires synaptiques (matures à 13 JPN) des barillets thalamiques chez la souris 65. Le raffinement développemental des innervations dans le VPM est similaire à celui observé dans le noyau latéral géniculé chez la souris. Avant l'ouverture des yeux (expérience sensorielle), mais après la ségrégation spécifique de chaque œil dans le noyau latéral géniculé, chaque neurone reçoit un grand nombre d'afférence de la rétine et, à l'exception de 1 à 3 fibres, elles seront éliminées au cours des trois semaines suivant l'ouverture des yeux 74. Cependant, la période développementale diffère significativement entre ces deux structures. Dans le VPM, le patron adulte est atteint à 16-17 JPN, alors que dans le noyau latéral géniculé, le remaniement persiste jusqu'à 28 JPN. Ces résultats suggèrent que l'élimination synaptique est un phénomène général au niveau des synapses de relais thalamique, mais que la période du raffinement est spécifique à chaque synapse. 6.2 Élimination des synapses lemniscales silencieuses lors de la maturation Les résultats obtenus démontrent la présence de fibres silencieuses seulement lorsque le réseau est immature. Ces résultats concordent avec les résultats obtenus dans d'autres études ' , suggérant ainsi qu'il s'agit d'un phénomène général. De plus, la distribution développementale de la proportion des fibres lemniscales « silencieuses/ fonctionnelles », qui est de 30.8% à 7-9 JPN, 5.1% à 11-13 JPN, 0% à 16-17 JPN, semble similaire à celle obtenue au niveau des fibres thalamo-corticales des barils chez le rat (50% à 3-5 JPN, 10% à 9-10 JPN) 133 . Cette similarité suggère un mécanisme commun dans l'activation du devenir (élimination et/ou activation) des fibres silencieuses dans ces deux structures. Parmi les mécanismes suspectés, il y a l'activité spontanée, qui est connue pour jouer un rôle dans la ségrégation des axones au thalamus , et l'expérience sensorielle, que l'on suppose très importante au cours de la deuxième semaine PN (lors des premières activités d'exploration par « whisking ») 141. Le rôle physiologique de ces fibres silencieuses est mal connue. Elles pourraient jouer un rôle dans la consolidation et le renforcement synaptique des connexions correctement ciblées au cours du développement. 55 6.3 Changements développementaux dans les propriétés synaptiques des connexions au VPM Finalement, nos résultats démontrent que le remaniement des connexions dans le VPM est associé à un changement dramatique dans les propriétés synaptiques. Certains de ces changements sont similaires à des changements observés dans d'autres synapses glutamatergiques du SNC au cours du développement, alors que d'autres changements diffèrent. L'augmentation développementale des courants AMPA et le ratio des courants AMPA/NMDA à la fibre lemniscale sont similaires aux résultats obtenus aux synapses rétino-géniculées (autre groupe de synapses thalamiques) du furet et de la souris 74> l42, aux synapses thalamo-corticales chez le rat et la souris 91> 98, et aux synapses de relais auditif du tronc cérébral chez le rat et la souris l37 l38 l43 ' ' . Également, la diminution développementale de l'amplitude et de la durée des courants synaptiques NMDA aux synapses de relais au VPM est comparable avec celle observée dans le noyau latéral géniculé noyaux auditifs du tronc cérébral supérieur l37 l38 l43 ' ' 74 142 ' , dans les , dans le tectum optique 88, dans le colliculus 136 , et dans le néocortex 91"134'l44. De plus, la diminution développementale de la sensibilité à l'ifenprodil (3[xM), un antagoniste sélectif des récepteurs NMDA composés de deux dimères NR1/NR2B, a été rapportée aux synapses du noyau latéral géniculé et dans le néocortex 134 145 . Ainsi, la maturation des fibres lemniscales s'accompagne d'une acquisition de récepteurs AMPA et un changement dans la composition des NMDAR. La rectification des courants synaptiques AMPA a été décrite dans les interneurones GABAergiques dans l'ensemble du cerveau et elle est attribuée au blocage des récepteurs AMPA ne possédant pas la sous-unité GluR2 par les polyamines intracellulaires l47 123 124 146 ' ' ' . Dans les neurones pyramidaux du néocortex, la rectification des courants entrants est présente seulement avant 16 JPN, et le changement développemental est associé à l'augmentation d'expression de la sous-unité GluR2 dans ces neurones 94 . Nos résultats démontrent que la rectification des courants entrants AMPA ne change pas entre 11 JPN et 24 JPN. Ces résultats concordent avec les résultats d'autres études qui ont démontré un faible niveau de GluR2 dans le VPM chez le jeune et le rat adulte 40 ' 148 ' 149 . La présence de AMPAR manquant de GluR2 aux synapses lemniscales pourrait avoir une implication dans la transmission de l'information à travers le thalamus. Nos résultats ont démontré une plasticité à court terme dépressive aux synapses lemniscales pour la période de 7 à 24 JPN. Ces résultats sont comparables avec ceux obtenus aux synapses rétino-géniculées chez la souris , mais ils diffèrent des résultats obtenus aux synapses cortico-thalamiques, qui présentent une facilitation à court terme chez le jeune et l'adulte 150 152 ' . Nos résultats sont aussi différents des ceux observés dans le striatum, le cervelet et le néocortex, où un changement de plasticité développemental de dépressif à facilitaire s'observe 89 l53 155 ' * . La stabilité entre 7 et 24 JPN de la plasticité à court terme suggère que la probabilité de relâchement est mature avant P7 à la synapse lemniscale. 6.4 Rôle de l'expérience sensorielle dans le raffinement des connexions lemniscales aux VPM Des études précédentes ont démontré un rôle critique de l'activité dans le raffinement et la maturation des synapses dans plusieurs parties du système nerveux 77 156 ' . Nos résultats démontrent que les synapses lemniscales chez la souris sont fortement remaniées durant la seconde SPN, soit lorsque l'animal commence à explorer son environnement. Il est surprenant d'observer que la privation d'expérience sensorielle n'a qu'un petit effet sur le développement des synapses, le patron d'innervation et les propriétés synaptiques ne changent pas lors du retrait des vibrisses. De récentes études ont démontré que le retrait des vibrisses réduit la vitesse d'élimination d'épines dendritiques dans le cortex somato-sensoriel de jeunes souris l57 . Dans cette situation cependant, la privation sensorielle se réalise entre 4 et 6 SPN, et il n'est pas clair si la privation sensorielle affecte la période d'élimination synaptique dans le néocortex. Nos résultats sont similaires à ceux obtenus au « calyx of Held » chez des souris congénitalement sourdes, où le développement des propriétés synaptiques semble normal en absence d'activité du nerf auditif 143. 57 Nos résultats n'excluent pas la possibilité que l'activité spontanée puisse jouer un rôle important dans le remaniement des connexions lemniscales. Les neurones du ganglion trigéminal ou du PRV pourraient être actifs spontanément chez la jeune souris et induire une activité requise dans la maturation des connexions lemniscales. Similairement, l'activité spontanée dans le néocortex pourrait promouvoir, par les fibres corticothalamiques, le remaniement des synapses lemniscales à travers des mécanismes hétérosynaptiques. Référence 1. 2. 3. i, 4. « 5. 6. i ! 7. [ 8. t 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Andres, K. H. [On the microstructure of receptors on sinus hair]. Z Zellforsch Mikrosk Anat 75, 339-65 (1966). Vincent, S. The tactile hair of the white rat. 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