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DAVID POISSON PARÉ
EXPRESSION DE LA SULFATASE DES STÉROÏDES ET DE
LA SULFOTRANSFÉRASE DE L'ESTRONE DANS LE
CANCER DU SEIN.
et
EXPRESSION DU RÉCEPTEUR DES ANDROGÈNES DANS
LA GLANDE MAMMAIRE DE sO,u rus SAUVAGES OU
«KNOCK-OUT» POUR LES RÉCEPTEURS DES
ESTROGÈNES.
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures de l' Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Physiologie - Endocrinologie
pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M. Sc.)
FAÇULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2009
© David Poisson Paré, 2009
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-
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11
Résumé
Le cancer du sein est la maladie maligne la plus diagnostiquée chez la femme et 95 % des
cas sont initialement estrogène-dépendants. La sulfatase des stéroïdes et la sulfotransférase
de l' estrone, deux enzymes régulant l'équilibre entre les estrogènes actifs et inactifs, sont
communément exprimées dans les carcinomes. En étudiant des échantillons humains, nous
avons remarqué que la sulfatase et la sulfotransférase sont surexprimées dans les cancers du
sein par rapport aux tissus adjacents. De plus, dans les tumeurs, la sulfotransférase s' est
avérée positivement corrélée avec certains récepteurs (ER-P et PR-B) déjà associés à un
meilleur pronostic.
Dans une étude complémentaire avec des souris sauvages et des souris knock-out pour le
récepteur des estrogènes alpha ou bêta, nous avons remarqué que l' expression du récepteur
des estrogènes bêta est nécessaire pour maintenir des niveaux normaux de récepteurs des
androgènes dans la glande mammaire. L'administration
l'expression du récepteur. des androgènes.
d ~ androgènes
augmente également
111
Abstract
Increased exposure to estradiol is an important risk factor for the development of breast
cancer. Steroid sulfatase (enzyme that inactivates estrogens) and estrone sulfotransferase
(enzyme that reactivates estrogens) are commonly expressed in breast carcinomas. By
studying the expression of these enzymes in breast cancer and normal adjacent tissue, we
have observed that sulfatase and sulfotransferase expression was higher in carcinomas than
in adjacent normal tissues. Estrone sulfotransferase was positively correlated with ER-p
and PR-B, two receptors already associated with improved breast cancer ·prognosis.
In a complementary study, we examined the expression of androgen receptor in wild type,
estrogen receptor alpha knock-out and receptor alpha knock-out ovariectomized mice. We
determined that dihydrotestosterone increases the expression of its own receptor in mouse
mqmmary gland while estradiol has only a minor effect. The p!esence of the estrogen
receptor beta appears necessary to maintain normal androgen receptor levels in the mouse
mammary gland.
IV
Avant Propos
Le présent mémoire constitue un récapitulatif du travail que j ' ai effectué lors de mes deux a~ées de
maîtrise. Mon principal projet de maîtrise a été l'analyse de l' expression des enzymes « sulfatase
des stéroïdes» et « sulfotransférase de l' estrone lEI» dans le cancer du sein et dans des tissus non
cancéreux adjacents aux carcinomes. J' ai également eu la responsabilité d' un deuxième projet
portant sur l' expression du récepteur des androgènes (AR) chez des souris de type sauvage, knockout pour ER-alpha ou knock-out pour ER-beta suite à différents traitements hormonaux
(ovariectomie, admi'nistration d' androgènes ou administration d' estradiol).
Ce mémoire est divisé en trois chapitres. Le premier chapitre, l' introduction générale, détaille
succinctement la morphologie et la physiologie de la glande mammaire, le développement du
cancer du sein, les preuves de l'implication des estrogènes dans le processus de cancérisation ainsi
que les voies de synthèse des estrogènes. Les différents sujets abordés sont essentiels pour saisir la
démarche scientifique qui a menée à la réalisation des études présentées dans les deux chapitres
subséquents. Ils permettent également de faciliter la compréhension et la signification des résultats
obtenus.
Le deuxième chapitre présente un article scientifique portant sur l'expression de la sulfatase des
stéroïdes» et de la « sulfotransférase de l' estrone » dans le cancer du sein (article accepté pour
publication par la revue scientifique « Breast Cancer: Basic and Clinical Research »). Ce chapitre
présente les hypothèses de recherche, la méthodologie employée, les principaux résultats
expérimentaux obtenus ainsi qu'une discussion suggérant de nouvelles possibilités de recherche en
regard aux résultats.
Finalement, le troisième chapitre traite de l'expression de AR chez des souris sauvages, knock-out
pour ER-alpha ou knock-out pour ER-beta suite à différents traitements hormonaux. Ce chapitre
débute avec une brève introduction détaillant l'action connue des androgènes sur le développement
de la glande mammaire ainsi que de la production de souris knock-out. S'ensuit ensuite l' insertion
d ' un deuxième article scientifique présentant les hypothèses de recherche et les principaux résultats
obtenus (article accepté sous conditions de quelques modifications par la revue «Journal of
Molecular Histology »).
v
Remerciements
Je tiens à remercier mon directeur de maîtrise, Dr Georges Pelletier, pour m' avoir accueilli au sein
de son laboratoire. Il a su me faire bénéficier de sa passion et de sa grande expérience dans le
domaine de l' endocrinologie, m' apportant ainsi des connaissances et des compétences qui me
seront extrêmement avantageuses tout au long de ma future carrière. Marcher dans ses pas sera un
énorme défi que je compte bien entreprendre! Je tiens également à remercier mon co-directeur de
maîtrise, Dr Fernand Labrie, qui, malgré son horaire chargé, a toujours trouvé le temps de répondre
à mes questions et de me faire part de commentaires constructifs. Merci Drs Pelletier et Labrie!
Je veux remercier tout spécialement Johanne Ouellet, qui, en plus de me partager ses connaissances
sur les techniques de laboratoire, m' a surtout partagé une amitié solide. Comme plusieurs autres
étudiants qui ont évolué dans le laboratoire de Dr Pelletier, je lui dois une grande part de ma
réussite. Si elle n' avait pas été là pour répondre à ma multitude de questions et pour résoudre avec
douceur tous les problèmes qui me semblaient insurmontables, je ne serais pas sur le point de
conclure ce mémoire. Merci Johanne!
Je tiens à remercier mes amies chinoises, Fei et Zhuo, sans qui mon anglais serait encore aussi
mauvais qu ' il y a deux ans ... Les filles, je vous dois un regard nouveau et une ouverture sur le
monde que je n' avais pas auparavant. Vous m'avez partagé avec gentillesse votre culture qui est si
différente de la mienne. J'espère que j ' aurai la chance d' accepter votre invitation et d' aller vous
visiter chez vous, de l'autre côté du globe! Merci!
Je souhaite remercier Émilie, la dame de mon coeur. Celle qui était ma copine au début de ma
maîtrise et qui est maintenant ma femme! Les deux dernières années ont été riches en émotions de
toutes sortes. Grands moments de stress, voire de panique... Grands moments de bonheur et de
complicité. Tu m' as
appuy~
tout au long de ma maîtrise, dans toutes les sphères de ma vie. J' espère
que tu seras toujours à mes côtés. Je t'aime.
Un merci spécial à ma famille, àma belle-famille, mes amis et tous ceux qui m' ont supporté durant
cette étape importante de ma vie. MERCI!
Finalement, merci à Endorecherche, à Génome Québec et à Génome Canada pour leur appui
financier tout au long de ma maîtrise.
VI
Table des matières
Résumé ................................................................................................................................... ii
Abstract ................................................................................................................................. iii
Avant Propos .......................................................................................................... ·................ iv
Remerciements ......................................................................................................................... V
Table des matières ................................................................................................................. vi
Liste des figures ... :.............................................................................................................. viii
Liste des tableaux ................................................................................................................... ix
Liste des abréviations .............................................................................................................. x
Chapitre l - Introduction ......................................................................................................... 1
1. La glande mammaire .......................................................................................................... 2
1.1. Description physiologique ........................................................................................... 2
1.2. Son développement ...................................................................................................... 4
2. Le cancer du sein ................................................................................................................ 6
2.1. Le cancer - définition générale .................................................................................... 6
2.2. L'incidence du cancer du sein ..................................................................................... 7
3. Les estrogènes ..................................................................................................................... 9
3.1. La signalisation hormonale .......................................................................................... 9
3.2. Les hormones stéroïdiennes .......................................................
11
3.3. L'implication des estrogènes dans le cancer du sein ................................................. 13
3.3.1. Les SERM dans le traitement du cancer ............................................................. 13
3.3.2. Les facteurs de risque reliés aux estrogènes ....................................................... 14
3.4. Les mécanismes d'induction du cancer par les estrogènes ........................................ 17
3.4.1. La carcinogenèse lors de la prolifération cellulaire ............................................ 18
3.4.2. La génotoxicité des métabolites des estrogènes ................................................. 20
4. La biosynthèse classique des estrogènes .......................................................................... 21
4.1. Les enzymes P450 à fonction mono-oxygénase ........................................................ 21
4.2. La synthèse ovarienne des estrogènes ....................................................................... 24
4.2.1. Réactions ayant lieu dans les cellules de la thèque .............................................. 24
4.2.2. Réactions ayant lieu dans les cellules de la granulosa ........................................ 25
4.3. La synthèse surrénalienne de précurseurs des estrogènes .......................................... 27
5. La synthèse intracrine des estrogènes ............................................................................... 29
5.1. La voie de l'aromatase ............................................................................................... 30
5.2. La voie de la sulfatase des stéroïdes .......................................................................... 31
5.2.1. Information générale ........................................................................................... 31
5.2.2. Inhibiteurs de la STS ........................................................................................... 32
6. Les sulfotransférases ......................................................................................................... 34
Chapitre II - Étude sur la STS et l'EST1E1 .......................................................................... 36
1.. Avant Propos ....................................................................................................................... 37
2. Article - Title and Authors ................................................................................................ 38
3. Résumé .............................................................................................................................. 39
4. Abstract .............................................................................................................................. 40
5. Background ....................................................................................................................... 41
6. Material and Methods ....................................................................................................... 44
6.1 Patients ........................................................................................................................ 44
&0 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
Vll
6.2 Immunohistochemistry ............................................................................................... 45
6.3 Scoring of immunoreactivity ...................................................................................... 47
6.4 Statistical analyses ...................................................................................................... 47
7. Results ............................................................................................................................... 48
7.1. Expression of STS and EST1E1 ................................................................................. 48
7.2. Expression of steroid receptors and CDC47 .............................................................. 50
7.3. Correlations between STS, ESTIE1 , and the other parameters evaluated ................ 51
8. Discussion ......................................................................................................................... 54
8.1. STS ............................................................................................................................. 54
8.2. ESTIE1 ...................................................................................................................... 55
9. Conclusions ....................................................................................................................... 58
10. Acknowledgements ......................................................................................................... 58
Chapitre III -Androgène, DHEA et développement mammaire .................................... ·...... 59
1. Avant Propos ..................................................................................................................... 60
2. Les androgènes ................................................................................................................. 61
2.1. Information générale ....................................................................................... ~ .......... 61
2.2. La dualité de l'effet des androgènes sur la glande mammaire ................................... 62
3. Les souris knock-out ......................................................................................................... 65
4. Article - Title and Authors ............................................................................................... 68
5. Résumé .............................................................................................................................. 69
6. Abstract ............................................ :................................................................................ 70
7. Introduction ....................................................................................................................... 71
8. Methods ............................................................................................................................ 73
8.1. Animal treatments ...................................................................................................... 73
8.2. Immunohistochemistry ............... ................................................................................ 74
8.3. Scoring ofimmunoreactivity ..................................................................................... 75
9. Results ............................................................................................................................... 76
10. Discussion ....................................................................................................................... 78
Il. Conclusion ...................................................................................................................... 80
12 ..Acknowledgement .......................................................................................................... 81
Conclusion ............................................................................................................................ 82
Bibliographie ........................................................................................................................ 84
VIl!
Liste des figures
Figure 1 : Coupe sagittale d'un sein ....................................................................................... 3
Figure 2 : Histologie de la glande mammaire ......................................................................... 3
Figure 3 : Stades du développement de la glande mammaire ............................. ..................... 5
Figure 4 : Les quatre voies de sécrétion hormonale ............................................................. 10
Figure 5 : Structures des trois principaux estrogènes naturels .............................................. Il
Figure 6 : Structures du cholestérol et du cyclo-pentano-phénanthrène ............................... 12
Figure 7 : Effet prolifératif des estrogènes sur les lactocytes ............................................... 18
Figure 8 : Initiation de la prolifération cellulaire par les estrogènes .................................... 20
Figure 9 : Mécanismes de réduction de l'hème .................................................................... 22
Figure 10 : Schéma de la stéroïdogénèse. Le précurseur général est le cholestérol. ............ 23
Figure Il : Théorie des deux cellules ................................................................................... 24
Figure 12 : Biosynthèse des stéroïdes dans le cortex de la glande surrénale ........................ 28
Figure 13 : Production intracrine d'E2 dans une cellule mammaire cancéreuse .................. 30
Figure 14 : Réaction catalysée par l'aromatase .................................................................... 30
Figure 15 : Progestatifs inhibiteurs de la STS ...................................................................... 33
Figure. 16 ': Activité anti-tumorale du (p-O-sulfamoyl)-N-tetradecanoyl tyramine ........ ~ ..... 33
Figure 17 : Réaction catalysée par la EST1E1 ..................................................................... 35
Figure 18: Validation of the STS antibody specificity by Western blot. .............................. 46
Figure 19: Immunoabsorption study to validate the STS specificity .................................... 46
Figure 20: Localization of STS in carcinoma (A) and in adjacent breast tissue (B) ............ 49
Figure 21: Localization ofEST1E1 in carcinoma (A) and in adjacent breast tissue (B) ..... 49
Figure 22: STS (A) and EST1E1 (B) expression between cancer and adjacent tissue ......... 50
Figure 23 : Production des androgènes bioactifs .................................................................. 62
Figure 24 : Vecteur pouvant être utilisé pour invalider un gène .......................................... 65
Figure 25 : Création de cellules possédant un allèle knock-out. .......................................... 66
Figure 26 : Production de souris knock-out à partir de souris mosaïques ............................ 67
Figure 27: Effect of hormonal treatments on AR expression ............................................... 77
Figure 28: Comparison of the AR expression between WT and ERf3KO mice ................... 78
IX
Liste des tableaux
Tableau
Table 2:
Table 3:
Table 4:
Table 5:
Table 6:
Table 7:
1: Études ayant associé les HRT aux risques de développer le cancer du sein ...... 16
Patient characteristics ............................................................................................. 44
List ofprirnary antibodies ....................................................................................... 45
ERs, PRs and CDC47 expression between cancer and adjacent tissues ................ 51
Correlation between STS irnrnunoreactivity and clinical pararneters .................... 52
Correlation between EST1E1 irnrnunoreactivity and clinical pararneters .............. 53
Mice distribution following the randornization ...................................................... 74
x
Liste des abréviations
3p-HSD
dés.hydrogénase des 3p -hydroxystéroïdes / isomérase ~5-~4
3/l-hydroxysteroid dehydrogenase / L15-L14-isomerase
5aRed
réductase des androgènes 5a
5 a-reductase
17p-HSD
déshydrogénase des 17p -hydroxystéroïdes
17p -hydroxysteroid dehydrogenase
AAALAC
Association pour l'évaluation et l'accréditation du traitement des
animaux de laboratoire
Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal
Care
ADN
acide désoxyribonucléique
deoxyribonucleic acid
AdRed
réductase de l' adrénodoxine
adrenodoxin reductase
Adx
adrénodoxine
adrenodoxin
AR
récepteur des androgènes
androgen receptor
CAH
hyperplasie surrénale congénitale
congenital adrenal hyperplasia
cAMP
adénosine monophosphate cyclique
cyclic adenosine monophosphate
CCPA
CCAC
Conseil canadien de protection des animaux
Canadian Council on Animal Care
CCRT
thérapie de remplacements hormonaux combinés continues
continuous combined replacement therapy
CDC47
protéine de contrôle de la division cellulaire 47
ceU division control prote in 47
CHRT
thérapie de remplacements hormonaux combinés
combinedhormone replacement therapy
DHEA
déhydroépiandrostérone
dehydroepiandrosterone
DHEA-S
sulfate de déhydroépiandrostérone
dehydroepiandrosterone-sulfate
DHT
dihydrotestostérone
dihydrotestosterone
Xl
~4-dione
androstènedione
androstenedione
El
estrone
estrone
EI-S
sulfate d' estrone
estrone-sulfate
E2
estradiol
estradiol
E2-S
sulfate d' estradiol
estradiol-sulfate
E-2,3-Q
estrogène-2,3-quinone
estrogen-2, 3 -quinone
E3
estriol
estriol
E-3 ,4-Q
estrogène-3 ,4-quinone
estrogen-3,4-quinone
ER
récepteur des estrogènes
estrogen receptor
ER-a
récepteur des estro gènes a
estrogen receptor a
ERaKO
souris ayant le gène ER-a invalidé
estrogen receptor a knock-out
ER-~
récepteur des estro gènes ~
estrogen receptor f3
E~KO
souris ayant le gène ER-p invalidé
estrogen receptor f3 knock-out
ERE
élément de réponse aux estrogènes
estrogen response element
ERT
thérapie de remplacement par les estrogènes
estrogen replacement therapy
ESTIEI
sulfotransférase des estro gènes 1E 1
estrogen sulfotransferase 1El
FDA
Agence états-unienne des denrées alimentaires et des médicaments
Food and Drug Administration
FSH
hormone folliculo-stimulante
follicle stimulating hormone
HRT
thérapie de remplacement hormonal
hormone replacement therapy
XlI
HSP
protéine de choc thermique
heat shock prote in
LH
hormone leutéinisante
leuteinizing hormone
NAD+/NADH
nicotinamide adénine dinucléotide (oxydé / réduit)
nicotinamide adenine dinucleotide (oxydized / reducéd)
NADP+/NADPH
nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (oxydé / réduit)
nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (oxydized / reduced)
NeI
Institue nationale du cancer (des États-unis d 'Amérique)
National Cancer Institute (of United-States)
NO
oxyde nitrique
nitrogen monoxide
NR
récepteur nucléaire
nuclear receptor
OMS
WHO
Organisation mondiale de la santé
World Health Organisation
OR
rapport de chances
odds ratio
OVX
ayant subi l'ovariectomie
ovariectomized
P450scc
Enzyme à cytochrome P450 catalysant le clivage de la chaîne latérale
'cytochrome P450 side-chain-cleavage
P450c17
Enzyme à cytochrome P450 - hydroxylase des 17a-stéroïdes / lyase
17-20
17a-steroid hydoxylase / 17-20-lyase
PAPS
3'-phosphoadénosine-5' -pho spho sulfate
3 '-phosphoadenosine.;.5 '-phosphosulfate
PBS
tampon phosphate
phosphate-buffered saline
PR-A
récepteur de la progestérone A
progesterone receptor A
PR-B
récepteur de la progestérone B
progesterone receptor B
RE
réticulum endoplasmique
endoplasmic reticulum
RR
risque relatif
relative risk
SEPRT
thérapie de remplacements hormonaux combinés séquentiels
sequential estrogen plus progestin replacement therapy
Xlll
SERM
modulateur sélectif des récepteurs des estrogènes
selective estrogen receptor modulator
SHAM-OVX
ayant subi un semblant d' ovariectomie
sham-ovariectomized
SHBG
globuline se liant aux hormones sexuelles
sex hormone-binding globulin
StAR
protéine régulatrice de la stéroïdogenèse
steroidogenic acute regulatory protein
STS
sulfatase des stéroïdes
steroid sulfatase
T I /2
demi-vie
half-Life
1
Chapitre 1- Introduction
2
1. La glande. mammaire 1
1. 1. Description .physiologique
Le sein ou la poitrine dans son ensemble est un organe sexuel secondaire retrouvé sur la
région ventrale supérieure des mammifères. Chez l ' humain, les seins sont plus
particulièrement localisés sur la face antérieure du thorax. Structurellement identiques chez
l' homme et la femme, ils sont plus développés chez cette dernière puisque l' environnement
hormonal féminin est propice à leur croissance et à leur maturation.
Le sein est formé d' un ensemble de 15 à 20 lobes disposés en rayons autour de l' aréole
(cercle pigmenté qui entoure le mamelon du sein). Chaque lobe constitue une glande
indépendante. L' ensemble des lobes est supporté par du tissu conjonctif riche en collagène
tandis que le tissu adipeux comble l'espace interlobulaire. Les lobes sont associés à des
canaux galactophores de 2 à 4 'mm de diamètre débouchant sur un petit orifice (0,4 à 0,7
mm de diamètre) à l' extrémité du mamelon. D ' abord évalué à 15 à 20 (un canal pour
chaque lobe), ie nombre de canaux galactophores déterminé lors de récentes études
morphologiques s'est avéré beaucoup plus restreint [(Ramsay, Kent et al. 2005), 9 canaux
en moyenne (4-18); (Love and Barsky 2004),5 canaux en moyenne (1-17)]. Un peu avant
l'ouverture terminale, les canaux galactophores se dilatent pour former les sinus
galactophores, des ampoules pouvant contenir quelques millilitres de sécrétion (colostrum
ou lait). Il est cependant à noter que le rôle - voire l'existence - de tels sinus est remis en
question dans une récente étude d'imagerie par ultrasons (Ramsay, Kent et al. 2005).
1
L'information générale sur la glande mammaire est tirée de :
•
Leeson, T. S. and C. R. Leeson (1971). Appareil génital femelle. Paris.
•
Krontiras, H. and K. 1. Bland (2006). Anatomy of the breast. axilla, and thoracic wall. Hamilton.
3
Sein
cl vi ul
mus<te .....-----..,.,.....,/
tinu conjonctii .....----~"'\IIU
tissu adi~U)c ..
- ---~~
côtes
Figure 1 : Coupe sagittale d'un sein. (Société canadienne du cancer s.d.)
Chaque lobe est subdivisé en 20 à 40 lobules par du tissu conjonctif adipeux, dense et
fibreux (figure 2A). Les lobules représentent un ensemble bien défini de 10 à 100 alvéoles
nommées « acini ». Lès acini sont des structures sécrétrices arrondies constituées d' une
lumière centrale bordée par une ou plusieurs couches de lactocytes (cellules épithéliales
produisant le lait dans la glande mammaire), eux-mêmes entourés d'une couche de cellules
myoépithéliales responsables de la contraction nécessaire à l'évacuation des sécrétions
(figure 2B). Les acini sont séparés les uns des autres par du tissu conjonctif lâche et
hautement vascularisé. Dans la glande mammaire, chaque acinus est disposé de façon à
pouvoir éjecter le lait sécrété dans un petit canal terminal. Le lait s'écoule ensuite dans des
canaux collecteurs interlobulaires,
qui
sont eux-mêmes drainés par les canaux
galactophores. Comme pour les acini, ces différents canaux sont constitués d'une couche
interne de cellules épithéliales et d'une couche externe de cellules myoépithéliales
contractiles.
Cellule
myoépithéliale
Tissus
Connectif--l~"ffj
(Stroma)
~.........~-
Lumière
Lobule
Cellule
épithéliale
Figure 2: Histologie de la glande mammaire. A) Microphotographie de quelques lobules (25X).
B) Microphotographie d'une coupe transversale d' un acinus (250X). (Jensen 1999)
4
1.2. Son développement
De l' âge embryonnaire à la puberté, les canaux galactophores atrophiés sont les principales
structures du sein observables chez la femme comme chez l' homme. À ce stade, les lobes
ne sont que de petits bourgeons (figure 3A). Au moment de la puberté, il y a apparition
d'un dimorphisme entre les hommes et les femmes dû à une production d' hormones
stéroïdiennes différente entre les testicules et les ovaires. Les estrogènes et la progestérone
retrouvés de façon p!édominante chez la femme sont essentiels au développement de la
glande mammaire. Ils agissent en effet comme stimulateur de croissance des cellules
épithéliales, menant à l' élongation et à l' élargissement des canaux. Ils causent également
une multiplication de la quantité de cellules adipeuses qui en viennent à composer plus de
80 % du stroma. Les acini, s' il en existe, sont très peu développés (figure 3B-3C).
Lors de la grossesse, des modifications importantes de la glande mammaire se produisent
afin de préparer la lactation. La progestérone, la prolactine et plusieurs autres facteurs de
croissances causent une élongation des canaux interlobulaires ainsi que le développement
des acini. Les tissus adipeux s' écartent pour laisser place aux glandes; le ratio tissu
glandulaire/tissu adipeux passe de 1: 1 à 2: 1 (Ramsay, Kent et al. 2005). Cette croissance
glandulaire conduit la glande mammaire à son stade de développement maximal (figure
3D-3E). Le poids de chaque sein à la fin d' une grossesse peut atteindre plus de 500 g alors
qu' un sein au repos pèse généralement entre 150 et 225 g. Lorsque la lactation prend fin, la
glande subit une régression et retourne au stade de repos. La glande ne revient cependant
pas totalement à l' état nullipare car de nombreux acini demeurent reconnaissables. Après la
ménopause, les seins s'atrophient progressivement en l'absence de stimulation ovarienne.
Le tissu conjonctif les supportant devient plus homogène. Les seins perdent du volume et
deviennent moins fermes et plus tombants (figure 3F).
5
Figure 3 : Stades du développement de la glande mammaire. Colonnes : 1, vue antérieure du sein; 2, vue
latérale du sein; 3, apparence des canaux; 4, apparence des lobules. Rangées: A, pré-puberté; B, puberté; C,
maturité; D, grossesse; E, lactation; F, ménopause. (Krontiras and Bland 2006)
6
2. Le cancer du sein '
2. 1. Le cancer - définition générale
Comme la plupart des organes du corps humain, la glande mammaire est susceptible d'être
affectée par le cancer. L'Organisation mondiale de la santé (OMS), définie le cancer
comme suit:
Le cancer est un terme général appliqué à un grand groupe de maladies qui
peuvent toucher n'importe quelle partie de l'organisme. L ' un des traits
caractéristiques du cancer est la prolifération rapide de cellules anormales qui,
au-delà de leur délimitation normale, peuvent envahir des parties du corps
adjacentes et essaimer dans d'autres organes - formant ce qu'on appelle des
métastases. (Organisation mondiale de la santé 2008)
Les cellules cancéreuses sont des cellules qui ont perdu leurs fonctions normales et se
multiplient de façon incontrôlée en esquivant tous les processus de régulation de la division
cellulaire. Puisque les cellules cancéreuses n'ont plus l'équilibre entre les processus de
prolifération cellulaire et les processus d'apoptose, elles deviennent vite envahissantes et
perturbent le fonctionnement normal des organes du corps. Ces cellules peuvent présenter
des morphologies, des génotypes et des phénotypes variables et elles peuvent se modifier
tout au long de l'évolution de la maladie. Il fut déterminé que l'apparition d'un phénotype
malin est toujours la résultante de six altérations de la physiologie c'ellulaire (Hanahan and
Weinberg 2000) :
a) Autosuffisance en facteurs de croissance
b)
I~ibition
de l' apoptose
c) Insensibilité aux facteurs d'inhibition de la croissance
d) Invasion tissulaire et métastases
e) Potentiel de réplication sans limite
f) Angiogénèse augmentée
7
2.2. L'incidence du cancer du sein
Le cancer du sein est la maladie maligne la plus fréquemment diagnostiquée chez la femme
à travers le monde (22 % de tous les cancers féminins). Il est responsable de 7 % des décès
par cancer emegistrés (7,6 millions/année), quoique la mortalité tend à décroître dans les
pays développés (Canadian Cancer Society, National Cancer Institute of Canada et al.
2007). Bien que le cancer du sein puisse affecter les hommes, il est 100 fois plus fréquent
chez la femme. Des prédispositions génétiques majeures (mutation dans le gène BRCA2)
ou la présence de deux chromosomes X (syndrome de Klinefelter) sont responsables de la
plupart des cas de cancer du sein masculins (Weiss, Kirsten et al. 2005).
En 2006 seulement, les États-Unis ont vu le nombre de cancers du sein s' accroître de
212 000 nouveaux cas et causer la mort de plus de 40 000 femmes. Le taux d ' incidence du
cancer du sein chez les États-uniennes est le plus élevé de la planète (141 ,1 pour 100 000
femmes blanches) (Smigal, Jemal et al. 2007).
Selon la Société canadienne du cancer, 22 300 nouveaux cas de cancer sont répertoriés au
Canada chaque année (taux d'incidence: 104 pour 100 000 femmes). Environ 29 % de tous
les cas de cancer diagnostiqués chez les Canadiennes touchent le sein. Cette pathologie est
responsable de 5 300 décès par année. Une femme sur neuf développera le cancer du sein
au cours de sa vie et une femme sur vingt-huit en mourra. (Canadian Cancer Society,
National Cancer Institute of Canada et al. 2007)
À l'opposé, l'Asie est l'une des régions où les taux de cancers du sein sont le plus bas. Les
Asiatiques ne sont toutefois pas totalement à l'abri de cette maladie puisqu'un des faits
épidémiologiques les plus notables des dernières années est la hausse prononcée de
l'incidence du cancer du sein dans plusieurs pays d'Asie. Par exemple, l'incidence du
cancer du sein a plus que doublé entre 1959-1960 et 1983-1987 au Japon. Ce changement
rapide laisse présumer que plusieurs nouveaux facteurs de risque environnementaux
influenceraient à la hausse le développement de nouveaux cas de cancer du sein (Nagata,
Kawakami et al. 1997).
8
Différents types de cancers du sein peuvent être diagnostiqués. Généralement, les cancers
du sein naissent aux niveaux des cellules épithéliales des tissus glandulaires et portent le
nom d'adénocarcinomes. Les cellules cancéreuses peuvent alors se développer dans les
tissus lobulaires (lobular carcinomas) ou encore se développer dans les canaux
galactophores et dans les canaux interlobulaires (ductal carcinomas). Ce dernier type est le
plus fréquent. (Canadian Cancer Society 2009)
Ceci dit, le cancer du sein reste une maladie trop souvent fatale dont l' incidence continue
malheureusement d' augmenter de façon graduelle dans les pays les plus industrialisés,
indépendamment de l' ethnicité.
9
3. Les estrogènes
Plusieurs types de cancers sont hormono-dépendants; c' est-à-dire que certaines hormones,
généralement impliquées dans l' induction de la croissance cellulaire et dans la mitose, sont
responsables de la genèse de la tumeur, ou du moins, responsables de l' augmentation de la
division des cellules cancéreuses. Les cancers se développant dans les organes de la
reproduction · ont de grandes probabilités d' être hormono-dépendants à leur stade initial
puisque la croissance de ces organes est déjà fortement régulée par l' environnement
hormonal avant l' apparition d' un état cancéreux (p. ex. ovaires, prostate, seins, testicules,
endomètre, etc.).
Parmi les hormones impliquées dans l'étiologie du cancer du sein, les estrogènes sont sans
doute les plus importantes. En fait, environ 95 à 97 % des cancers du sein sont dépendants
des estrogènes durant leur stade initial (Pasqualini 2004).
3. 1. La signalisation hormonale
Les hormones sont définies comme étant toutes les molécules sécrétées par une cellule qui
peuvent entraîner des modifications physiologiques suite à leur liaison à un récepteur. Elles
jouent un véritable rôle de messager chimique: elles sont émises par des cellules sources
suite à un stimulus et voyagent jusqu' à des cellules cibles, soit par simple diffusion dans les
fluides intercellulaires ou par transport dans le réseau vasculaire, afin de transmettre
l' information nécessaire à la coordination entre les différents constituants du corps. Les
hormones permettent de maintenir l 'homéostasie essentielle à la survie des organismes.
Elles sont impliquées dans tous les aspects de la vie : reproduction, crOIssance,
métabolisme, mobilité, etc. (Baulieu 1990)
Il existe quatre voies différentes de sécrétion hormonale : la sécrétion endocrine, paracrine,
autocrine et intracrine (figure 4). (Labrie 1991)
a) La voie endocrine est la voie « classique » de sécrétion : les hormones produites par des
')
glandes spécialisées sont . libérées dans la circulation et transportées à des cellules cibles
10
situées à une certaine distance des cellules .sécrétrices (p. ex. : l' insuline. Elle est produite
par le pancréas, elle est libérée en circulation sanguine et elle se lie aux récepteurs de
l' insuline !etrouvés sur la plupart des cellules de l' organisme, enclenchant aInSI une
'réponse cellulaire qui est, dans ce cas, la pénétration et l' utilisation du glucose).
b) Dans la voie paracrine, les hormones sécrétées par une cellule affectent les cellules
voisines sans être relâchées dans la circulation systémique (p. ex. : la testostérone. Elle est
sécrétée par les .cellules de Leydig dans les testicules et elle agit directement sur les tubules
séminifères adjacents pour stimuler la spermatogenèse).
c) Dans la voie autocrine, les hormones sécrétées se lient aux récepteurs situés sur la cellule
sécrétrice. Cette dernière est à la fois la cellule source et la cellule cible (p. ex . :
l' interleukine 1. Elle est sécrétée par un monocyte suite à un stimulus mais elle peut se lier
à ce même monocyte pour causer une rétro-inhibition de sa sécrétion).
d) La dernière voie de sécrétion, la voie intracrine, a été décrite comme étant un système où
les hormones exercent leurs actions dans la cellule même qui les synthétise sans être
excrétées dans le milieu extracellulaire (p. ex. plusieurs cellules de carcinomes mammaires
possèdent la machinerie enzymatique pour produire l' estrogène nécessaire à leur propre
croissance). Ce système est très économique car les hormones fabriquées ne sont pas
diluées dans le milieu extracellulaire ou dans la circulation systémique. Il faut donc un
minimum d'hormones pour atteindre une réponse maximale.
ENDOCRIHE
PARACRINE
AUTOCRINE
Figure 4 : Les quatre voies de sécrétion hormo~ale. (Labrie 1991)
INTRACRINE
Il
Quatre familles d' hormones sont connues à ce jour:
a) Les protéines et peptides (p. ex. : insuline, glucagon)
b) Les lipides (p. ex. : stéroïdes, eicosanoïdes)
c) Les dérivés des acides aminés (p. ex. : sérotonine)
d) Les gaz [p. ex. : oxyde nitrique (NO)]
3.2. Les hormones sféroïdiennes
Les estrogènes sont des hormones liposolubles à 18 atomes de carbone faisant partie de la
classe des stéroïdes, une catégorie d·' hormones dérivées du cholestérol. Les principaux
estrogènes naturels sont l'estrone . (estra triène-1 ,3,5 01-3 one-17) (El), l'estradiol (estra
triène-1 ,3,5 diol-3 , 17) (E2), et l'estriol (estra triène-1 ,3,5 triol-3 ,6, 17) (E3).
CH OH
3
CH OH
3
·"· OH
HO
HO
Estrone(E 1 )
HO
Estradiol (E2)
Estriol (E3)
Figure 5 : Structures des trois principaux estrogènes naturels. Les fonctions retrouvées au-dessus du plan sont
appelées « P » et sont symbolisées par une ligne grasse. Les fonctions retrouvées au-dessous du plan sont
appelées « a » et symbolisées par un trait coupé. L'affinité d'un stéroïde pour les enzymes et les récepteurs
dépend fortement de sa configuration spatiale.
Le cholestérol, précurseur des estrogènes et des stéroïdes en général, est une molécule
constituée d' un squelette commun à toutes les hormones stéroïdiennes : le cyclo-pentanophénanthrène (4 cycles de carbones, dont 3 cycles à' 6 carbones et un cycle à 5 carbones).
Tous les organes du corps sont en mesure de synthétiser du cholestérol, mais le foie est le
site majeur de sa production, fournissant 25 % de la production journalière. Le cholestérol
peut également provenir de l'alimentation. La diète quotidienne moyenne d'un NordAméricain adulte contient en effet de 300 à 500 mg de cholestérol provenant de la viande,
des œufs et des produits laitiers (Wilson and Rudel 1994).
12
HO
Cholestérol
Cyclo-pentano-phénanthrène
Figure 6 : Structures du cholestérol et du cyclo-pentano-phénanthrène. Les atomes de carbones sont
numérotés de 1 à 27 pour le cholestérol et de 1 à 17 pour le cyclo-pentano-phénanthrène. Les cycles de
carbones sont quant à eux classés de A à D.
En plus des estrogènes (18 carbones), la classe des stéroïdes regroupe d'autres familles
d'hormones différenciées selon le nombre d'atomes de carbone les constituant. Il y a les
cholestanes (27 carbones), les prégnanes (21 carbones) et les androgènes (19 carbones). Le
cholestérol fait partie des cholestanes. Parmi les prégnalJ.es~ on retrouve la progestérone qui
joue un rôle important lors de la grossesse, et la prégnènol9ne. On retrouve également les
minéralocorticoïdes (p. ex. : aldostérone) qui régulent la rétention du sodium et l'excrétion
du potassium au niveau des reins, et les glucocorticoïdes (p. ex. : cortisol) qui régulent le
métabolisme des hydrates de carbone et l'homéostasie corporelle. Les androgènes (p. ex.
testostérone, dihydrotestostérone) jouent quant à eux un rôle essentiel dans la
différentiation et le développement sexuel, principalement mâle. Les androgènes sont
également des précurseurs de la synthèse des estrogènes.
Les estrogènes ont longtemps été considérés comme étant des hormones sexuelles
« femelles» puisqu'ils sont retrouvés en grande quantité chez la femme et sont impliqués
dans la différentiation sexuelle et la reproduction féminine; à la puberté, les estrogènes
amorcent le développement physiologique de la femme adulte et son cycle menstruel. En
fait, selon l'encyclopédie Universalis.fr : « l'appellation de ces substances dérive du terme
œstrus (ou estrus) qui désigne, chez les mammifères femelles, la période où 1'ovulation et la
réceptivité vis-à-vis du mâle coïncident» (Encyclopédie Universalis s.d.). Il fut cependant
démontré que plusieurs tissus « mâles » produisent également des estrogènes, ce qui remet
en question l'intérêt ou la nécessité de sexualiser les hormones.
13
3.3. L'implication des estrogènes dans le cancer du sein
Plusieurs observations ont permis d' impliquer les estrogènes dans l' étiologie du cancer du
sein. La surexposition des cellules mammaires aux estrogènes (particulièrement l' estrogène
le plus puissant, l' E2, a été reconnue comme étant un facteur de risque important de
développer cette maladie maligne.
3.3.1. Les SERM dans le traitement du cancer
L' efficacité d' agents anti-estrogéniques de la famille des « modulateurs sélectifs des
récepteurs des estrogènes » (SERM), des antagonistes compétitifs des récepteurs des
estrogènes (ER), pour prévenir le cancer du sein a permis de prouver l' implication des
estrogènes dans la multiplication des cellules cancéreuses.
a) Suite à l'injection de la lignée cellulaire mammaire cancéreuse « MCF-7 » chez des
souris athymiques immunodéficientes, une prolifération des cellules MCF -7 directement
proportionnelle à l' administration de doses croissantes d'E2 a été observée. Cette
prolifération pouvait cependant être freinée par l'injection de tamoxifène (famille des
SERM) (Soule and McGrath 1980; Shafie and Grantham 1981; Osborne, Hobbs et al.
1985).
b) Aux États-unis, l'usage préventif du tamoxifène pour contrer le cancer du sein est
recommandé depuis 1998 par l'Agence états-unienne de la nourriture et des médicaments
[« Food and Drug Administration », (FDA)]. Cette recommandation est basée sur une étude
effectuée par l'Institut nationale du cancer [« National Cancer Institute », (NCI)] qui
démontra une diminution de 44 % des probabilités de développer un cancer du sein chez les
femmes à haut risque employant du tamoxifène (FDA and
Human Services October 29, 1998).
U~S.
Deparment of Health and
14
3.3.2. Les facteurs de risque reliés aux estrogènes
Plusieurs facteurs reconnus pour leur capacité à accentuer les risques de développer le
cancer du sein influencent directement l'exposition de la glande mammaire aux estrogènes.
Ces facteurs ont été, pour la plupart, identifiés lors d' observations cliniques ou d' études
épidémiologiques. Ils permettent d'étoffer la preuve de l' implication des estrogènes dans la
carcinogenèse.
Ménarche précoce : Plus l'âge de la ménarche est précoce, plus les risques de développer
un cancer du sein sont importants. Cette constatation vient du fait que la ménarche
correspond au début de la production d'estrogènes par les ovaires. Si la ménarche survient
tôt (p. ex. : Il ans), l' exposition globale de la glande mammaire aux estrogènes sera plus
longue que si la ménarche survient à un âge avancé (p. ex. : 15 ans). Il a ainsi été démontré
que les risques d' avoir le cancer du sein chez des femmes pré-ménopausées peuvent être
réduits jusqu'à 7 % pour chaque année supplémentaire passée avant la ménarche (par
rapport à l'âge de Il 'ans) (Brinton, Schairer et al. 1988; Titus-Emstoff, Longnecker et al.
1998; Clavel-Chapelon and E3N-EPIC group 2002; Beji and Reis 2007).
Ménopause tardive : Selon la même logique, une ménopause survenant tardivement est
aussi un facteur de risque quant au cancer du sein, car la fenêtre d'exposition aux
estrogènes qui débute à la ménarche et se termine à la ménopause est plus longue. Il a été
démontré qu'une femme qui atteint la ménopause à l'âge de 55 ans est exposée à un risque
deux fois plus élevé de développer un cancer du sein qu'une femme dont la ménopause
survient à 45 ans (Trichopoulos, MacMahon et al. 1972; Brinton, Schairer et al. 1988).
Qu'elle soit naturelle ou provoquée, il semble que la ménopause reste toujours une
protection non négligeable vis-à-vis du cancer du sein (Titus-Ernstoff, Longnecker et al.
1998).
Thérapies de
re~placement
hormonal (HRT) : Plusieurs études démontrent qu'un apport
exogène d' estrogènes provenant des HRT utilisées pour traiter les symptômes de la
ménopause augmente les risques de cancer chez les utilisatrices. Quelques exemples sont
15
2
détaillés dans le tableau 1 . Ces études démontrent que plus la période d' utilisation de HRT
est longue, plus les risques de développer un cancer du sein sont élevés. L' ajout d'un
progestatif en plus des estrogènes ne semble pas apporter de protection supplémentaire et
peut même augmenter les risques du cancer. L' activité mitotique dans le sein est en effet à
son maximum durant la phase lutéale du cycle menstruel, lorsque les niveaux de
progestérone et d' estrogène sont les plus élevés (Navarrete, Maier et al. 2005).
Pour un tableau récapitulatif encore plus exhaustif des études épidémiologiques mettant en relation les HRT
et le cancer du sein, voir: Colditz, G. A. (2005). "Estrogen, estrogen plus progestin therapy, and risk ofbreast
cancer." Clin Cancer Res Il: 909-917.
2
16
Femmes
Études
(Colditz,
Hankinson
al. 1995)
Types
Cohorte,
et
Prospective
(population)
Infirmières
États-uniennes
Casffémoins
Résultats
Thérapies
(95 % CI)
ERT
RR = 1,32 (1 ,14-1 ,54)
CHRT
RR= 1,41 (1,15-1 ,74)
Progestine
RR = 2,24 (1 ,26-3,98)
1935/725 550
personnes/années
OR l -24 mois d'utilisation =
ERT
(Magnusson,
Baron ~t al. Cas-Témoins
1999)
OR120moisd'utilisation =
OR I - 24 mois d'utilisation =
Suède
2563/2845
ORl20moisd'utilisation =
OR I -24 mois d'utilisation =
OR l20 mois d'utilisation =
HRT
Cas-Témoins
Ménopausées
Los Angeles,
Etats-Unis
1897/1637
OR5 aosd'utilisation=
(Dinger,
Heinemann et Cas-Témoins
al. 2006)
Allemagne
3593/9098
2,95 (1,84-4,72)
1,29 (1,05-1,59)
2,43 (1 ,79-3,30)
1,10 (1,02-1 ,18)
OR5ansd'utilisation =
1,06 (0,97-1,15)
CHRT
OR5 aosd'utilisation =
1,24 (1,07-1,45)
OR5 aosd'utilisation =
1,38 (1,13-1 ,68)
OR5ansd'utilisation =
1,09 (0,88-1 ,35)
SEPRT
50 ans et plus
North
869/48812
Jutland, Danemark
(suivi x=7,6 ans)
Registre danois
des cancers
1,25 (0,96-1,63)
ERT
ceRT
(Ewertz,
Cohorte,
Mellemkjaer et
Prospective
al. 2005)
2,70 (1,47-4,96)
CHRT
SEPRT
(Ross,
Paganini-Hill
et al. 2000)
1,72 (1,13-2,62)
HRT
RR = 1,40 (1,22-1,61)
ERT
RR = 1,01 (1,01-0,80)
SEPRT
RR = 1,52 (1,21-1,93)
HRT
oRo,5 ans d'utilisation = 1,2 (1,1-1,3)
o~ ans d'utilisation = 1,2 (1, 1-1 ,4)
Tableau 1: Études ayant associé les HRT aux risques de développer le cancer du sein.
HRT. Thérapie de remplacement hormonal (tous les types confondus)
ERT. Thérapie de remplacement estrogénique (estrogènes seulement)
CHRT. HRT combinées (inclus SEPRT et/ou CCRT);
SEPRT. CHRT séquentiels (alternance: estrogène / estrogène + progestatif)
CCRT. CHRT continues (estrogène + progestine en continue)
OR. Rapport des chances
RR. Risque relatif
Absence de grossesse: Des études effectuées dans diverses populations ont mis à jour le
fait qu'une femme nullipare est plus à risque de développer le cancer du sein qu'une femme
ayant enfanté.
17
•
Étude de population chez 95 000 États-uniennes. L' incidence du cancer est de
141 ,9 x 100 000
femme~années
chez les femmes n' ayant jamais enfanté et de
90,7 x 100 000 femmes-années chez celles ayant 5 enfants et plus (Trapido 1983).
•
Étude prospective chez 63 090 Norvégiennes - 20 ans de suivi. Une très forte
association inverse a été observée entre le nombre de grossesses et les risques de
développer le cancer du sein (Kvale, Heuch et al. 1987).
•
Étude cas-témoins chez des Suédoises (12 782 cas et 5 fois plus de témoins).
Chaque grossesse diminue d' environ 10 % les probabilités de développer le cancer
du sein (Lambe, Hsieh et al. 1996).
Durant le premier tiers de la grossesse, les niveaux d'E2 augmentent rapidement. Par la
suite, au fur et à mesure que la grossesse progresse, les niveaux d' E2 libre diminuent et la
concentration de la globuline se liant aux hormones sexuelles (SHBG) augmente. Au
moment de la parturition, le résultat net est un bénéfice. De plus, une lactation prolongée
réduit également le nombre de cycles ovulatoires et donc l'exposition aux estrogènes
(Feigelson and Henderson 1999a).
Plusieurs autres études ont mis à jour la relation entre les estrogènes et le cancer du sein en
mesurant des concentrations plus élevées d'El et/ou d'E2 circulant chez des femmes
atteintes que chez des témoins (Toniolo, Levitz et al. 1995; Dorgan, Longcope et al. 1996;
Manjer, Johansson et al. 2003). Le chapitre 4 du livre « Endocrinology of Breast Cancer»
récapitule en détails les principales études qui ont permis d'impliquer les estrogènes dans
l'étiologie du cancer du sein (Feigelson and Henderson 1999b).
3.4. Les mécanismes d'induction du cancer par les estrogènes
Deux principales voies, une indirecte et l'autre directe, ont été décrites pour expliquer
comment les estrogènes peuvent être impliqués dans l'initiation de la carcinogenèse et dans
la prolifération des cellules tumorales aux stades précoces des cancers. Dans la première
voie, les estrogènes ne sont pas directement responsables de la transformation maligne mais
ils augmentent plutôt les risques de cancer par l'induction de la prolifération cellulaire.
18
Dans la deuxième VOle, les estrogènes jouent directement un rôle de carcinogène en
détériorant l'ADN.
3.4.1. La carcinogenèse lors de la prolifération cellulaire 3
Les estrogènes jouent un rôle crucial dans l' initiation de la prolifération cellulaire des
cellules épithéliales mammaires. Lors de la prolifération, les cellules sont beaucoup plus à
risque de subir des erreurs de transcription et des mutations génétiques. Si de telles erreurs
se produisent dans des gènes responsables de la régulation de la prolifération cellulaire ou
de l' apoptose, il est possible de se retrouver avec une prolifération effrénée et un phénotype
malin. La carcinogenèse peut donc être due à une action indirecte des estrogènes via la mise
en branle de la mitose.
Figure 7 : Effet prolifératif des estrogènes sur les lactocytes. Durant la prolifération, les lactocytes
développent des variations de génotype dues à des erreur's de réplication ou aux réarrangements
chromosomiques. Après plusieurs cycles de prolifération, les lactocytes peuvent développer un phénotype
malin. (Henderson, Ross et al. 1988)
L'initiation de la prolifération cellulaire par les estrogènes se fait par deux VOles
principales: la voie génomique et la voie non-génomique (figure 8).
a) Dans la voie génomique (voie classique), les estrogènes exercent leurs effets biologiques
via l'induction des récepteurs des estrogènes : ER-a et/ou ER-p. Ces deux récepteurs
appartiennent à la superfamille des récepteurs nucléaires (NR). Ils sont généralement en
solution dans le cytoplasme car les estrogènes peuvent facilement passer au travers de la
3
L' information sur l'induction de la prolifération cellulaire par les estrogènes est majoritairement tirée de :
•
Pasqualini, J. R. (2004). "The selective estrogen enzyme modulators in breast cancer: a review."
Biochim Biophys Acta 1654(2): 123-143.
•
Chen, G. G. , Q. Zeng, et al. (2008). "Estrogen and its receptors in cancer." Med Res Rev.
19
membrane de phospholipides qui entoure les cellules. -Les ERs sont sous le contrôle de
protéines chaperonnes [protéines de choc thermique (HSP)] qui empêchent leur
dimérisation. Une fois que les estrogènes lient les ERs, il y a une perte de régulation par les
HSP et les récepteurs se dimérisent et transfèrent au noyau où ils vont se lier à une
séquence d' ADN retrouvée dans les promoteurs de plusieurs gènes nommée « élément de
réponse aux estrogènes» (ERE) (voie classique). Dès que le contact ER-ERE est effectué,
des protéines régulatrices ainsi que des protéines impliquées dans la transcription
(polymérase, hélicase, etc.) s' associent aux promoteurs de ces gènes pour pouvoir débuter
la synthèse d' ARNm.
De récentes observations démontrent que les ERs peuvent également activer la transcription
de gènes sans l' intermédiaire de la séquence ERE (voie alternative). Il peut en effet y avoir
une interaction entre les ERs et d' autres facteurs de transcription (p. ex. : fos, myc, jun) qui
se lient et enclenchent la transcription de gènes ayant des éléments de liaisons tels que APl ou SP-1 (Carroll and Brown 2006).
Les gènes dont la transcription dépend de l'activation des ER par les estrogènes sont
principalement impliqués dans les processus de différenciation, de prolifération et de
croissance cellulaire. Puisque la voie génomique de réponse aux estrogènes nécessite la
transcription de gènes, les effets surviennent quelques heures après le stimulus hormonal.
b) Dans la voie non génomique, les estrogènes lient des ER membranaires (récepteurs ne
faisant pas partie de la famille des NR) ou activent des protéines non-ER attachées à la
membrane cellulaire. La réponse induite consiste alors en l' activation de cascades de
kinases ainsi que l'augmentation des niveaux intracellulaires de seconds messagers comme
le calcium (Ca2+) et le NO. La phosphorylation par les kinases et l'augmentation des
seconds messagers ont le pouvoir d'activer des protéines impliquées dans la différentiation,
la prolifération, la motilité cellulaire ainsi que l' apoptose. Cette réponse est beaucoup plus
rapide que la voie génomique puisque la transcription de gènes n'est pas nécessaire
(quelques minutes).
20
n n-
""
",
~
Réponse ceUulaire.
"'~I------
Figure 8 : Initiation de la prolifération cellulaire par les estrogènes. Voie génomique, rouge; Voie non
génomique, bleu.
3.4.2. La génotoxicité des métabolites des estrogènes
Il a été démontré que les estrogènes et leurs métabolites peuvent agir directement comme
carcinogènes en causant des bris à l'ADN. Par exemple, des souris n'ayant pas de ERs
(ERs knock-out) développent des cancers de la glande mammaire suite )à l'injection d'E2. Il
a été également observé que des souris ovariectomisées traitées à l'E2 développent des
cancers plus rapidement que des souris témoins, et ce, même si on leur administre un
antagoniste des ER (p.ex. : ICI-182,780). Plusieurs autres études expérimentales ont permis
de démontrer que certains des métabolites des estrogènes, plus particulièrement les
estrogènes-3,4-quinone (E-3,4-Q) et les estrogènes-2,3-quinone (E-2,3-Q) peuvent causer
des mutations importantes à l'ADN. L'E-3,4-Q, par exemple, forme des liaisons instables
avec les adénines et les guanines, menant à une dépurination de l'ADN. La toxicité de
métabolites des estrogènes pour l'ADN vient également du fait que des étapes du
métabolisme produisent des espèces réactives de l'oxygène pouvant créer des dommages
oxydatifs à l'ADN. (Russo and Russo 2006; Yager and Nancy 2006)
21
4. La biosynthèse classique de·s estrogènes
Réduire l'exposition aux estrogènes est la méthode généralement employée pour contrer le
développement des cancers du sein hormono-dépendants. Pour ce faire, il est essentiel de
connaître les deux voies maj eures de leur synthèse :
La voie classique (endocrine) : les estrogènes sont produits à partir du cholestérol par des
glandes spécialisées, les ovaires et le placenta (chez la femme enceinte), et sont libérés dans
la circulation ou dans les fluides extracellulaires. Cette voie inclut également la production
par les glandes surrénales d'androgènes inactifs qui sont des précurseurs des estrogènes
dans la voie intracrine.
La voie intracrine : les estrogènes sont produits directement dans les tissus cibles à partir de
précurseurs androgéniques provenant majoritairement des glandes surrénales, sans qu' il n' y
ait de sécrétion extracellulaire (cette voie sera détaillée dans la section 5.).
4. 1. Les enzymes P450 à fonction mono-oxygénase
La figure 10 présente les principales réactions impliquées dans la synthèse des estrogènes et
des autres stéroïdes à partir du cholestérol. Parmi les différentes enzymes nécessaires à la
synthèse de l'E2, trois sont de la famille des cytochromes P450 [le cytochrome P450
scindeur de la chaîne latérale (P450scc), l 'hydroxylase des 17a-stéroïdes / lyase 17-20
(P450cI7) et l'aromatase]. Ces enzymes possèdent une activité mono-oxygénase, c'est-àdire qu'elles catalysent l'ajout d'un atome d'oxygène provenant de 1'02 à un substrat
organique (R) selon l'équation suivante: R-H + O2 + NADPH + H+ -7 R-OH + NADP+ +
H 20.
Pour pouvoir interagir avec les molécules d'02, les cytochromes P450 sont associés à un
groupement prosthétique, l'hème qui est constitué d'un ion Fe3+ encerclé par un anneau
organique. L'ion · Fe3+ doit être réduit afin de pouvoir lier 1'02. Il existe deux moyens
différents de réduire l'hème selon la localisation subcellulaire de l'enzyme P450.
22
a) Si l'enzyme P450 est mitochondriale, la réductase d'adrénodoxine (AdRed), une
flavoprotéine couplée à la membrane mitochondriale, arrache un électron au NADPH et les
transfère à une protéine sulfo-ferrique, l' adrénodoxine (Adx). L' Adx est en mesure de lier
les P450 mitochondriales et de leur transmettre l'électron, permettant la réduction de l' ion
Fe3+ (figure 9A).
b) Si l' enzyme P450 est associée aux microsomes [fragments de membrane du réticulum
endoplasmique (RE)] , une protéine P450 oxydoréductase est utilisée pour transférer
directement les électrons provenant du NADPH à l' ion Fe3+ des P450 (figure 9B).
NADPH
Oxydé
Oxydé
NADP+
Réduit
Réduit
A
NADPH
B
NADP+
Figure 9 : Mécanismes de réduction de l'hème. A) Transfert d'électrons provenant du NADPH aux enzymes
P450 à localisation mitochondriale. B) Transfert d'électrons provenant du NADPH aux enzymes P450 à
localisation microsomale.
H]C
CH:J
~
CH]
ciO"
~
(1)
HO
.......
o
C/J
Cholesterol side-chain cleavage enzyme
,
(j
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(1),
a
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o
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CH]
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~
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17 a-hydroxylase
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OH
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Aldosterone
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OH
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1»
'S.
1»
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CI)
1
11 -deoxycortisol
II)
(t
Cort isol
17,201yase
17,20 Iyase
J,HJr
~
J,
]I
HJ
~
Dehydroepi androsterone
~----?­
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'<
II)
dehydrogenase
J,
CD
~
CH:J
0-:::-
(;
X
1
17~-Hydroxysteroid
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~
'<
~
'<
a.
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17 al pha hydroxy
Proqesterone
1
HO /"
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~
~
:
Corti costerone
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17 alpha hydroxy
Pregnenolone
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~
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II)
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1
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OH
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An drostenedlone
HOJXy-
~ Androstanediol
1
I ~
#
HO """
Estrone
1
1
17~-Hydroxysteroid
(;
17~-Hydroxysteroid
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J,
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dehydrogenase
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o
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Testosterone
dehydrogenase
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o
3
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HO"""
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#
Estradiol
5a-~u~se
OH
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1
if-<>
o~
H
DH T
l'V
W
24
4.2. La synthèse ovarienne des estrogènes
La synthèse ovarienne des estrogènes débute à la puberté et s' effectue selon un système
nommé « Two-cell type theory ». Comme son nom l' indique, ce système exige la
coopération de deux types cellulaires, les cellules de la granulosa et les cellules de la
thèque, afin d' exécuter toutes les réactions enzymatiques nécessaires à la transformation du
cholestérol en estrogène (Short 1962) (figure Il).
circulation ~....~~
'0 _ _--.,.
THÈQUE
GRANULOSA
cholesœrol
""
}
P4.50scc
+ cAr~
F>rrOle
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--
KI
l
E2
prégnènolone
A
P4.50c11 1
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111>HSD
17-0H-prégnènolone
._~-.. P4.50cl1 ~
DHEA
3 ~-HSD
!
~4-dione
i
i
SH
J
El
aromatase
00(-
~
P 0 el
K.inase A
~4-dione
Figure Il : Théorie des deux cellules. Les cellules de la thèque, sous le contrôle de la LH, produisent de la
à partir du cholestérol. La ~4-dione par sécrétion paracrine, est intemalisée dans les cellules de la
granulosa où elle est transformée en E2, sous le contrôle de la FSH. Abréviations : cAMP, « adénosine
monophosphate cyclique» LH, «' hormone leutéinisante »; FSH, « hormone folliculo-stimulante ».
[Traduction libre de (Khan-Sabir and Carr 2005)].
~4-dione
4.2.1. Réactions ayant lieu dans les cellules de la thèque
Le premier type cellulaire impliqué dans la synthèse ovarienne de l' E2 - les cellules de la
thèque - est responsable de la fabrication d'androstènedione (L14-dione) à partir du
cholestérol en utilisant trois enzymes, la P450scc, la P450c17 et la 3~-HSD2.
a) P450scc [CYPIIA1 , 15q23-24; cholestérol~prégnènolone] (Miller 2002)
La première étape de la production de tous les stéroïdes est la coupure de la chaîne latérale
du cholestérol pour créer un stéroïde à 21 carbones, la prégnènolone. Cette réaction est
catalysée par l'enzyme « cytochrome P450 scindeur de la chaîne latérale » (P450scc) en
trois hydroxylations successives, libérant une molécule de prégnènolone et une molécule
d'isocaproaldéhyde (3 moles de NADPH sont nécessaires par mole de cholestérol).
La P450scc se retrouve au niveau de la membrane interne des mitochondries. La « protéine
régulatrice de la stéroïdogenèse» (StAR) permet d' importer le cholestérol dans la
25
mitochondrie et est donc essentielle à la stéroïdogenèse. Une mutation du gène encodant la
protéine StAR peut causer une . déficience dans la synthèse des stéroïdes et mener à
l'hyperplasie surrénalienne congénitale « congenital adrenal hyperplasia (CAH) ».
b) P450c 17 [CYP 17, 10q24-25 prégnènolone-7 DHEA] (Miller 2002)
La « 17a-steroid hydoxylase / 17-20-lyase » (P450c17) est une enzyme qui possède deux
activités : 1) L' activité 17a-hydroxylase : conversion de la prégnènolone en 17-0Hprégnènolone. 2) L' activité 17-20-lyase
transformation de la 17-0H-prégnènolone en
déhydroépiandrostérone (DHEA). Cette enzyme se retrouve dans les microsomes du
réticulum endoplasmique (RE) et emploie donc le système P450 oxydoréductase.
c) 3p-H,SD2 [HSD3B2, 1p13.1 ; DHEA-7~4-dione] (Thomas, Huether et al. 2007)
L' enzyme « 3p-hydroxysteroid dehydrogenase /
~5-~4-isomerase
de type 2 » (3P-HSD2)
catalyse principalement la conversion de la DHEA en . ~4-dione mais également la
transformation de la prégnènolone en progestérone et de la 17-0H-prégnènolone en 17OH-progestérone. Cette enzyme n'est pas membre de la famille des P450. Chacune des
réactions catalysée par la 3p -HSD2 se fait en deux étapes: 1) Déshydrogénation en position
C3; 2) Transfert de la double liaison C=C en position 5,6 à la position 4,5 sur le cycle A.
Ces réactions se font dans le RE et utilisent le NAD+ comme cofacteur.
Il existe un autre sous-type de 3p-HSD, la 3p-HSD de type 1 (3P-HSD1). Cette enzyme est
retrouvée principalement dans les tissus périphériques où elle est impliquée dans la voie
intracrine de production des stéroïdes sexuels.
4.2.2. Réactions aya.nt lieu dans les cellules de la granulosa .
Grâce au mode de sécrétion paracrine, la
~4-dione
formée par les cellules de la thèque
migre vers les cellules de la granulosa où elle sera transformée en estrogène :
a) Aromatase [CYP19A, 15q21.1; ~4-dione-7E1 , testosterone-7E2]
L'aromatase est l'enzyme responsable de la création des estrogènes à partir des androgènes
(C 19 -7 C 18). Cette enzyme aromatise le cycle A du
~4-dione
et de la testostérone pour
26
former de l'El et de l'E2 respectivement: 1) Double hydroxylation du groupe méthyle en
position C 19; 2) Hydroxylation en position 2 menant à la perte du carbone C 19 et à
l' aromatisation du cycle A. L' aromatase est localisée au niveau du RE et utilise donc la
P450 oxydoréductase comme transporteur des électrons provenant des NADPH.
L ' E 1 produite par l' aromatase peut être relâchée en circulation ainsi ou être sulfatée par la
sulfotransférase d' estrone (ESTlEl) avant d' être relâchée. L' El-sulfate (El-S) possède un
temps de demi-vie (tl/2) accru par rapport à l'El non conjuguée (Pasqualini and Chetrite
2005). L' El et l' El-S sont utilisées comme précurseurs pour la synthèse d' E2 dans la voie
intracrine.
b) l7p-HSDl ,7,12
Finalement, la double liaison c=o retrouvée en C17 sur l' El peut être réduite par les
« l7p-hydroxysteroid dehydrogenase » (17P-HSD) de type 1, 7 ou 12, transformant ainsi
l'El en E2 (cofacteurs utilisés: NADH ou NADPH). La réduction en position C17 des
stéroïdes à 18 carbones et à 19 carbones est la seule étape de la stéroïdogenèse qui est
réversible (la l7p -HSD2 catalyse la réaction inverse).
La l7p-HSDI [HSD17Bl , 17q1l-12], un membre de la superfamille des « short-chain alcohol
dehydrogenase », est retrouvée en abondance dans lés cellules de la granulosa des ovaires.
On
l~
retrouve également dans certains tissus périphériques comme le placenta et la glande
mammaire. Son action est spécifique aux estrogènes (El
1q23]
~
E2). La l7-pHSD7 [HSD17B7,
est retrouvée dans les ovaires, la glande mammaire, le placenta, les testicules, la
prostate et le foie. Elle produit également de l' E2 à partir de l' El. Par surcroît, elle possède
une activité 3-céto-réductase lui permettant d'inactiver l' androgène le plus puissant, la
dihydrotestostérone (DHT) (DHT
[HSD 17B 12, Il P 11-2]
~
3p-an,drostènediol). Finalement la
l7~-HSD12
qui a été découverte récemment est très fortement exprimée dans les
ovaires, ce qui suggère qu'elle joue un rôle majeur dans la formation de l'E2 chez la femme
(Luu-The, Tremblay et al. 2006). (Luu-The 2001)
27
4.3. La synthèse surrénalienne de précurseurs des estrogènes
Le cortex des glandes surrénales est un site qui synthétise des hormones stéroïdiennes à
partir du cholestérol, à l'instar des ovaires et des testicules. Il est divisé en trois parties
distinctes : la zone fasciculée responsable de la synthèse des minéralocorticoïdes (21
carbones), la zone glomérillée responsable de la synthèse
~es
glucocorticostéroïdes (21
carbones) et la zone réticulée responsable de la synthèse de stéroïdes-C 19 sans activités
endogènes appelés aussi « androgènes surrénaliens »
[~4-dione,
DHEA, DHEA-sulfate
(DHEA-S)]. Les androgènes surrénaliens sont des précurseurs pour la synthèse intracrine
des estrogènes bioactifs. L ' enzyme P450c17 est responsable de la synthèse de types de
stéroïdes différents en fonction des zones de la glande surrénale:
Zone glomérulée : La zone glomérulée de la glande surrénale n'exprime pas la P450c 17 et
produit ainsi des 17a-désoxystéroïdes C21 comme l'aldostérone (figure 12, boîte jaune).
Zone fasciculée: La P450c 17 est liée au RE et utilise les protéines P450 oxydoréductase ou
le cytochrome B5 comme donneurs d'électrons. La zone fasciculée exprime la P450c17
mais seulement l' activité 17a-hydroxylase y est induite, possiblement à cause d' une
concentration de P450 oxydoréductases trop faible, d' un manque de cytochromes B5 (un
type de P450 réductase) ou d'une phosphorylation différente dans cette zone. Des 17ahydroxystéroïdes C21 comme le cortisol y sont produits (figure 12, boîte rose).
Zone réticulée: La zone réticulée exprime la P450c17 et autant l'activité 17a-hydroxylase
que l' activité 17-20 lyase y sont induites. Cette enzyme cause la transformation de la
prégnènolone en DHEA (figure 12, boîte verte).
La quantité négligeable de stéroïdes à 19 carbones retrouvée chez des individus atteints de
mutations sévères dans le gène de la P450c 17 démontre que cette enzyme est le seul moyen
significatif d'effectuer la conversion des C21 en C19 (Gupta, Geller et al. 2001).
28
P4SOs.cc
pr6gnII . . . .
P4S0c17
31'
proge
17.QH.pNg1• • •
trone
P4S0c17
3
(actJvitt 17 a-hydroxylase)
{actNit' 7-20Iyase}
3
- - - - - - . . . . . . . 17-oH1nI1I8It:6ral,.
P4S0c21
P4S0c21
l1-cMsoxycortlcosUtone
l1-d6soxycottjsol
P45Oc l 1 CVP 181
P4SOcl1 ; CYP1181
cortisol
P45Oc l 1· CVP 182
aIdostM'one
Figure 12 : Biosynthèse des stéroïdes dans le cortex de la glande surrénale. Couleurs: zone glomérulée, boîte
jaune; zone fasciculée, boîte rose; zone réticulée, boîte verte. Chez l'humain et les primates, la formation des
androgènes surrénaliens à partir du cholestérol suit préférentiellement la voie des ~5 (flèches rouges grasses).
L'enzyme 3p -HSD2 catalyse des transformations différentes selon la zone du cortex des
glandes surrénales :
~
progestérone
•
Zone glomérulée : prégnènolone
•
Zone fasciculée: 17a-OH-prégnènolone
•
Zone réticulée: DHEA
~
17a-OH-progestérone
~ ~4-dione
La ~4-dione produite dans la zone réticulée peut être libérée en circulation et captée par des
tissus périphériques où elle serait impliquée dans la synthèse intracrine des stéroïdes
sexuels.
Chez les espèces autres que les primates, la production de stéroïdes-C 19 se fait
principalement par la voie
~4
: la prégnènolone est tout d'abord transformée en
progestérone par la 3p-HSD2 et la progestérone est par la suite transformée en ~4-dione par
la P450c17 (figure Il, flèche rouge mince). Cette différence explique notamment pourquoi
on ne retrouve pratiquement pas de DHEA chez les rongeurs. Il semble que chez plusieurs
espèces, la P450c 17 possède une spécificité pratiquement exclusive pour la progestérone et
ne peut donc pas lier la prégnènolone (p. ex. cochon d'inde) (Gilep, Estabrook et al. 2004).
Une activité plus élevée de la 3p -HSD2 transformant la prégnènolone en progestérone
serait également en cause.
29
5. La synthèse intracrine des estrogènes
Parallèlement à la voie classique de synthèse des stéroïdes sexuels, il existe également la
voie de synthèse intracrine. Le terme « intracrinologie » [préfixe latin « intra » (à
l'intérieur) et « crine », du grec krinein, (sécrété)] a été mentionné pour la première fois en
1988 suite à l'observation d'une synthèse de DHT accrue chez des rats gonadectomisés
après l'administration de DHEA (Labrie, Bélanger et al. 1988). Cette voie diffère de la voie
de production endocrinienne classique par deux points majeurs:
a) la production a lieu directement dans les tissus périphériques cibles plutôt que dans
les structures glandulaires classiques;
b) les hormones synthétisées de façon intracrine agissent dans les tissus les ayant
produites sans être libérées dans la circulation.
Chez la femme, la formation intracrine compte pour ·75 % de la production totale
d'estrogènes avant la ménopause et près de 100 % après la ménopause (Labrie 2006).
La synthèse intracrine des estrogènes est un facteur important dans l'étiologie du cancer du
sein puisque la plupart des cancers du sein se développent chez la femme après la
ménopause (arrêt de la production ovarienne d'estrogènes). Des études ont démontré que
chez des femmes ménopausées, la concentration d'E2 mesurée dans les carcinomes
mammaires est dix fois plus élevée que la concentration d'E2 mesurée dans le plasma
sanguin. De même, la concentration d'E2 mesurée chez des patientes atteintes du cancer du
sein est deux fois plus élevée à l'intérieur des carcinomes que dans les tissus de glandes
mammaires considérés encore normaux. Ces observations suggèrent fortement que les
carcinomes auto-produisent les hormones nécessaires à leur propre croissance (Suzuki,
Miki et al. 2008).
La production intracrine des estrogènes actifs dans le cancer du sein se fait selon deux
voies: la voie de l'aromatase et la voie de la sulfatase des stéroïdes (STS) (figure 13).
30
Circulation
Sanguine
Cellule C~éreuse
l\l ammaire
DHEA-S..
SIS
~
DHEA
JAl
p..H D
DH
M -dione .....+ - - - - - - - .M-dione
Aroma Jase
EI-S......-++-~EI ·S .
.. El 41.~===='!
ESTl El
17fJ-HSD 2
Figure 13 : Production intracrine d ' E2 dans une cellule mammaire cancéreuse. Deux voies sont utilisées : 1)
La voie de l' aromatase utilise des androgènes (~4-dione et DHEA) et les convertit en El par aromatisation
(boîte bleue). 2) La voie de la STS utilise quant à elle l' El-S comme précurseur et la convertit en El par
désulfatation (boîte rose). La DHEA-S peut également être utilisée comme précurseur mais elle doit passer
par les deux voies : d' abord il y a désulfatation (boîte jaune), ensuite, aromatisation (boîte bleue). La
transformation de l' El en E2 par les l7~-HSD 1, 7 et 12 est une étape essentielle aux deux voies.
5.1. ,L a voie de l'aromatase
La voie de l'aromatase utilise des androgènes surrénaliens inactifs (DHEA,
~4-dione)
ou
encore la testostérone pour former des estrogènes (figure 13, boîte bleue).
o
HO
And ros ten e d io ne
19-01
19-al
Estrone
Figure 14 : Réactions catalysées par l' aromatase.
Cette voie est très importante dans l' étiologie du cancer du sein pUIsque l' aromatase
localisée dans les tissus périphériques est responsable de la totalité de la production des
estrogènes après la ménopause, lorsque la plupart des cancers du sein surviennent. De plus,
environ 70 % des carcinomes mammaires expriment fortement l' aromatase et l' ARNm de
cette enzyme est significativement surexprimée dans les carcinomes par rapport à la glande
mammaire normale (Suzuki, Miki et al. 2008).
31
L' inhibition de cette voie est considérée comme un traitement alternatif pour lutter contre
le cancer du sein chez les femmes post-ménopausées, particulièrement lorsque les
bloqueurs des ER (SERM) ont échoué. En effet, environ 30 % des patients insensibles aux
bloqueurs .des ER répondent aux inhibiteurs de l' aromatase. Deux principaux types
d' inhibiteurs ont été créés : les inhibiteurs stéroïdiens qui bloquent le site de liaison des
androgènes ' et les inhibiteurs non-stéroïdiens qui perturbent les propriétés catalytiques de
l 'hème associée à l' aromatase (Chen, Zeng et al. 2008).
5.2. La voie de la sulfatase des stéroïdes
5.2.1. Information générale
La STS [Xq22.3-qter;
stéroide-sulfate~stéroide libre]
ou arylsulfatase C fait partie de la famille
. des enzymes arylsulfatase qui inclut au moins cinq autres membres (A, B, D, E et F). Cette
enzyme microsomale est exprimée de façon ubiquitaire dans la plupart des organes
retrouvés chez les mammifères (foie, ovaires, os, prostate, tissu adipeux, placenta etc.) et
particulièrement dans la glande mammaire (Pasqualini and Chetrite 2005). La STS possède
le pouvoir d'hydrolyser plusieurs types de stéroïdes sulfonatés comme la DHEA-S (Km
=
1.7 JlM) , le cholestérol-S (Km = 2.0 JlM) et particulièrement l' E1-S (Km = 0.8 JlM)
(Dibbelt and Kuss 1991).
Plusieurs observations suggèrent que l'implication de la voie de la STS est particulièrement
importante dans l'étiologie du cancer du sein (figure 13, boîte rose).
Premièrement, le principal substrat de la STS, l'El-S, est l'estrogène le plus abondant en
circulation chez la femme ménopausée, au moment où la maj orité des cancers du sein
surviennent. L' El-S circulant agit comme réservoir de substrat pour la STS, ce qui
s' explique par une production intracrine d'E1-S soutenue dans les tissus adipeux [DHEA {3P-HSD}-7
~4-dione
-{aromatase}-7 El -{SULT}-7 E1-S] et parce que l'E1-S possède
un temps de demi-vie qui est beaucoup plus long que celui des estrogènes non sulfatés (T 1/2
EI-S:
10-12 h; T1/2 El : 20-30 min).
32
Deuxièmement, les niveaux d' E1-S sont 10 à 40 fois plus élevés dans les tumeurs que dans
le plasma ou que dans les tissus mammaires normaux chez un même individu. Il semble
donc que les carcinomes produisent ou captent tout particulièrement cette molécule.
Finalement, puisque que l'E1-S n' a pas d' activité biologique due à son incapacité à lier et
activer les ER sans être préalablement désulfatée, la présence de la STS dans les
carCInomes
semble
essentielle
pour
la production intracrine
d' estrogène
actif.
Conséquemment, l' activité de la STS est retrouvée dans une grande majorité des tumeurs
mammaires (Tseng', Mazella et al. 1983; Evans, Rowlands et al. 1994; Saeki, Takashima et
al. 1999; Suzuki, Nakata et al. 2003 ; Yamamoto, Yamashita et al. 2003). En fait le niveau
de STS intratumoral est un facteur de pronostic indépendant pour le cancer du sein.
(Pasqualini and Chetrite 2005)
5.2.2. Inhibiteurs de la STS
La STS est une cible intéressante pour le traitement du cancer du sein. Plusieurs molécules
ont déjà été identifiées comme ayant une activité inhibitrice. En voici quelques exemples:
En 2006, le STX64, un inhibiteur irréversible de la STS fut le premier agent anti-STS à être
sélectionné pour poursuivre des études cliniques de stade 1 chez des patientes ménopausées
atteintes du cancer du sein. La médiane de l'inhibition de la STS dans les tumeurs
mammaires et dans les lymphocytes en périphérie fut d'environ 99 %. Cette étude a
démontré une diminution significative de la concentration plasmatique d'estrone,
d'estradiol, d' androsténédiol, de
~4-dione,
de DHEA et de testostérone lors de l'usage du
STX64 (Stanway, Purohit et al. 2006).
Plusieurs progestatifs déjà utilisés comme contraceptifs oraux ou comme agent
thérapeutique dans le traitement des cancers du sein ou de l'endomètre ont démontré un
pouvoir d'inhibition de la STS (figure 15) (Pasqualini and Chetrite 2005).
33
4A, E2 formed
T-470 cells
100
(22) (
75
•
00
OF INHIBITION)
El S
-+
E2
(~) (32)
.
,"
50
25
o
Figure 15 : Progestatifs inhibiteurs de la STS. Prog., progestérone; Promeg., promégestone; DHD, 20dihydro-dydrogestérone; NOMAC, acétate de nomégestrol; MPA, acétate de médroxyprogestérone; Medrog. ,
médrogestone; Noreth., norethistérone; Org OM38, isomère du tibolone; NGMN, norelgestromine; Org
4094, 3a-OH métabolite du tibolone; Org 30126, 3p-OH métabolite du tibolone. (Pasqualini and Chetrite
2005).
Une diminution significative de la croissance tumorale fut observée suite à l'administration
d'un potentiel inhibiteur de la sulfatase, le (p-O-sulfamoyl)-N-tetradecanoyl tyramine, à des
souris ayant préalablement reçu une transplantation de cellules mammaires humaines
cancéreuses, (voir figure 16) (Nakata, Takashima et
al. 2003).
I.S
(p-O-sulfamoyl)-N-tetradecanoyl tyramine
17 20 23 26
Jours suivant l'administration
29
Figure 16 : Activité anti-tumorale du (p-O-sulfamoyl)-N-tetradecanoyl tyramine. [Traduction de (Nakata,
Takashima et al. 2003)].
-0 = aucun traitement;
-. = E1-S O.lmg/Kg;
-. = (p-O-sulfamoyl)-N-tetradecanoyl tyramine 25mg/kg + E1-S O.lmg/Kg.
34
6. Les sulfotransférases
À l'opposé de la STS, les sulfotransférases (SUL T) sont des enzymes qui catalysent la
liaison d'un groupement sulfonate (R-S0 20-) provenant d' une molécule donneuse à un
groupement hydroxyle ou amine d'une molécule accepteuse. Le principal donneur de
sulfonates est le 3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate (PAPS) (voir la figure 17). La
sulfonation augmente la solubilité aqueuse des composés et ainsi leur excrétion rénale. Elle
permet également de contrôler les concentrations de stéroïdes actifs en fonction des besoins
des organes.
Les SULT sont regroupées en deux grandes familles selon leur localisation cellulaire:
a) SULT associés à la membrane cellulaire. Principaux substrats : les glycosaminoglycans,
les glycoprotéines et les résidus tyrosine retrouvés sur certaines protéines.
b) SULT cytoplasmiques. Principaux substrats : les xénobiotiques, les neurotransmetteurs
monoamines (p. ex. la dopamine) et les hormones stéroïdiennes.
Parmi les SULT cytoplasmiques, quatre sont en mesure de catalyser l'ajout d' un
groupement sulfate aux hydroxystéroïdes et aux estrogènes pour ainsi les inactiver : la
SULTIA1 , la SULTIA2, la SULT2Al et la ESTIEI. Les SULTIAI et lA2 possèdent une
grande affinité pour les hormones stéroïdiennes phénoliques et la SULT2Al possède
surtout une grande affinité pour la DHEA. Ces enzymes peuvent également ajouter un
groupement sulfate aux estrogènes lorsque ces hormones sont retrouvées en concentrations
suffisantes (pouvoir catalytique maximal à l'échelle micromolaire). Cependant, c' est la
ESTIEI qui a la plus grande affinité pour les estrogènes, avec une activité maximale à une
concentration d'estrogène aussi basse que 15nM. (Dooley, Haldeman~Cahill et al. 2000)
L'ESTIEI semble jouer un rôle protecteur dans l'étiologie du cancer du sein. Sa très forte
affinité pour les estrogènes (Km à l'échelle nanomolaire) lui permet d' inactiver
efficacement ces hormones en les rendant incapables de lier et d'activer leurs récepteurs. La
présence de la ESTIEI fut notée dans des lignées cellulaires cancéreuses (ZR75 , MCF-7)
ainsi que dans des tumeurs manimaires et des tissus de seins normaux (Suzuki, Nakata et al.
35
2003). La présence de la ESTIEI dans les carcinomes fut positivement corrélée avec un
meilleur pronostic (Suzuki, Nakata et al. 2003; Hudelist, Wülfing et al. 2008). Il a été
également démontré que des cellules MCF-7 transformées avec un vecteur contenant le
gène ESTIE I nécessite l'administration d'une plus grande concentration d' E2 pour
stimuler leur croissance que les cellules MCF -7 non transformées (Falany and Falany
1997).
o
HO
o
(E~
E1
~
~
~o1''O
0-
PAPS
~
\00
EtranQé=:l
E1-S
(-f~
~
l-f;
NJlrt"'o1'-.
~0---J
0- t---0~NJlN
«"
~
opol
OH
Figure 17 : Réaction catalysée par la ESTIEI.
~
opol
OH
3',5'.ADP
36
Chapitre Il - Étude sur la STS et l'EST1 E1
37
1. Avant Propos
Ce chapitre, rédigé en anglais, est en fait la retranscription d'un manuscrit dernièrement
soumis au journal « Libertas Academica - Breast Cancer: Basic and Clinical Research »,
manuscrit approuvé pour publication en date du 5 novembre 2008. Ce chapitre est donc
structuré à la façon d'un article scientifique (résumé, introduction, matériel et méthodes,
résultats, discussion et conclusion). Il traite principalement de l' expression des enzymes
STS et ESTI E I dans le cancer. Il inclut des comparaisons de l'expression de ces enzymes
entre des carcinomes humains et des tissus mammaires normaux adjacents. Des corrélations
sont également mesurées entre l'expression tumorale de ces enzymes et différents
paramètres clinicopathologiques.
Ma participation à cet article est très importante. J'ai d'abord réalisé les expérimentations
irnrnunohistochimiques permettant de déterminer l'expression de la STS et de la ESTIEI
sur l' ensemble des échantillons. J' ai aussi déterminé l' expression des récepteurs stéroïdiens
et de CDC47 sur la majorité des échantillons. J'ai effectué les analyses statistiques et
interprété leurs significations. J'ai également rédigé le manuscrit et effectué les corrections
demandées par l'éditeur en chef du journal.
Dr V. Luu-The et son équipe ont développé les anticorps spécifiques 'contre la STS et
l' ESTIEI. D. Song a participé à l'acquisition d'informatjons sur l'expression des
récepteurs stéroïdiens et de CDC47. B. Han, S. Li et Dr G. Liu nous ont fourni les
échantillons humains et ont déterminé certains paramètres cliniques et pathologiques tels
que le stage et le type tumoral. Dr F. Labrie a participé à l'élaboration du design de l'étude.
Finalement, Dr G. Pelletier a participé au design de 1'étude, à la révision du manuscrit et à
la coordination.
38
2. Article - Title and Authors
Expression of estrogen sulfotransferase 1Eland steroid sulfatase ln breast cancer: a
immunohistochemical study
Poisson Paré Dl , Song Dl , 2, Luu-The VI , Han BI , 2, Li SI , 2, Liu G2, Labrie FI ,
Pelletier G 1.
1
Molecular Endocrinology and Oncology Research Center, Laval University
Hospital Research Center, 2705 Laurier blvd, Quebec City, Qc, Canada, G 1V 4G2
2
First Hospital of Jilin University, Changchun, China.
David Poisson Paré
david.poisson-pare.l @ulaval.ca
Song Dong
[email protected]
Luu-The Van
[email protected]
Han Bing
[email protected]
Sijie Li
[email protected]
Guojin Liu
[email protected]
Labrie Fernand
[email protected]
Georges Pelletier
georges. [email protected]
Corresponding author:
Dr. Georges Pelletier, Oncology and Molecular Endocrinology Laboratory, CHUL
Research Center, 2705 Laurier Boulevard, Québec, Qc, Canada, G 1V 4G2
Tel: (418) 654-2296
Fax: (418) 654-27?1
E-mail: [email protected]
39
3. Résumé
La sulfatase · des stéroïdes (STS) et la sulfotransferase des estrogènes (ESTIEl) sont
communément exprimées dans les carcinomes mammaires. La STS et la ESTI E I
maintiennent un équilibre entre les estrogènes ayant un groupement sulfate en position 3
(inactifs) et les estrogènes non conjugués (actifs), et pourraient avoir un impact sur le
développement des cancers mammaires hormono-dépendants.
Méthode: Nous avons étudié l'expression de la STS et de la ESTIEI dans 88 carcinomes
mammaires ainsi que dans 57 tissus mammaires non malins adjacents aux carcinomes. Les
résultats ont été corrélés avec l' expression tumorale des récepteurs des estrogènes alpha
(ER-a) et bêta (ER-P), les récepteurs de la progestérone A (PR-A) et B (PR-B), le
marqueur de prolifération CDC47, les types et les stages tumoraux ainsi que l' âge à la
chirurgie.
Résultats: L' expression de la STS était plus élevée dans les carcinomes que dans les tissus
adjacents, quoiqu'à un niveau non significatif (p=0.064). L'expression tumorale de la STS
a été associée avec l'expression de CDC47 (p < 0.05). Ces observations supportent
l'hypothèse que la STS est surexprimée dans les cancers du sein et associée à un mauvais
pronostic.
La ESTIEI a été observée pour la première fois dans les noyaux de cellules épithéliales
tumorales. L'expression de l'ESTlEl dans les cellules cancéreuses a été positivement
corrélée avec ER-p (p < 0.01) ainsi que PR-B (p < 0.05), deux récepteurs stéroïdiens déjà
associés avec un bon pronostic pour le cancer du sein.
Conclusion: Contrôler la surexpression de la STS dans les carcinomes pourrait être un
moyen d'inhiber la croissance du cancer. Les associations significatives entre la ESTIEI et
ER-p et PR-B devraient être étudiées d'avantage puisque ces deux récepteurs sont des
activateurs de transcription qui pourrait réguler l'expression d'enzymes protecteurs telle
que la ESTlEl.
40
4. Abstract
It is known that the steroid sulfatase (STS) and the estrogen sulfotransferase (EST1E1) are
commonly expressed in human breast carcinomas. STS and EST1E1 combined action
could maintain the equilibrium between sulfated (inactive) and unconjugated (active)
estrogens, which might have effects .on development of hormone dependent breast cancer.
We studied the expression of the STS and EST1E1 in 88 breast carcinomas and 57 adjacent
non-malignant tissues by immunohistochemistry. The results \vere correlated with the
tumor expression of estrogen receptor u (ER-u) and p (ER-P), progesterone receptor A
(PR-A) and B (PR-B) and the proliferation marker CDC47, the tumoral type and stage and
the age at surgery.
STS expreSSIon was higher in carCInoma specimens than in adjacent normal tissues,
although not to a significant level (p = 0.064) and it was positively associated with CDC47
expression (p < 0.05). These observations support the hypothesis that STS is overexpressed
in breast cancer and associated with a worse prognosis.
EST1E1 was observed for the first time in the nuclei of epithelial and tumoral cells. Tumor
expression ofEST1E1 was positively correlated with ER-~ (p < 0.01) and PR-B (p < 0.05),
two steroid receptors already associated with an improve prognosis for breast cancer.
Controlling the STS overexpression in carcinomas could be a way to inhibit cancer growth.
The significance of the association between EST1E1 and ER-p or PR-B should be further
studied since these two receptors are transcription activators and may regulate the
expression of protecti ve enzymes like EST 1E 1.
~---
41
5. Background
It is weIl documented that increased exposure to estradiol (E2), the most potent estrogen, is
an important risk factor fotthe development ofbreast cancer. Approximately 95% ofbreast
cancers are estrogen-dependent in their early stage, whether in premenopausal or
postmenopausal women (Pasqualini 2004). However, two-thirds of breast cancers are
diagnosed after menopause, when the ovarian exhaustion leads to a dramatic decrease of E2
serum levels. Interestingly, it was determined that the intratumoral E2 concentration in
postmenopausal patients is however maintained at a level similar to that found in
premenopausal patients (Pasqualini, Chetrite et al. 1996). This observation suggests an
intratumoral biosynthesis of E2.
One important feature responsible for the tumoral production of E2 is the desulfation of the
inactive estrone sulfate (E1-S) by the steroid sulfatase [steryl sulfatase, EC 3.1.6.2 (STS)] ,
an enzyme ubiquitously expressed in many organs and particularly in breast carcinoma
tissue (Pasqualini and Chetrite 2005). Estrone (E 1) is synthesized in peripheral tissues
following the aromatization of androstenedione
(~4-dione)
and subsequently sulfated
(Labrie 1991). E l-S is the most abundant circulating estrogen in postmenopausal women
and its levels are 7 to Il times higher in tumor tissues than in circulation (Pasqualini,
Chetrite et al. 1996). Once desulfated, Elis subsequently reduced into E2 by the 17phydroxysteroid dehydrogenases (17P-HSD) types 1, 7 and 12 (Luu-The, Tremblay et al.
2006). The presence of the 17p-HSD enzymes in breast tumor has been previously shown,
supporting the potential role of the STS pathway (Labrie, Luu-The et al. 2000; Suzuki,
Moriya et al. 2000; Luu-The, Tremblay et al. 2006; Song, Liu et al. 2006).
STS can also convert the sulfated compound dehydroepiandrosterone (DHEA-S) in
unconjugated DHEA, an inactive androgen that can be transformed in
~4-dione,
the main
estrogen precursor (Labrie 1991). STS can then affect E2 production at two different levels:
direct transformation of conjugated estrogens in active estrogens (E l-S to El , E2-S to E2)
and increase of ~4-dione, which can be subsequently aromatized into El. Previously, the
expression of STS has been reported in a large proportion of breast cancer cases (Tseng,
42
Mazella et al. 1983; Evans, Rowlands et al. 1994; Saeki, Takashima et al. 1999; Suzuki,
Nakata et al. 2003; Yamamoto, Yamashita et al. 2003). Furthermore, high levels of STS
were linked to po or prognosis and increased risks of recurrence (Utsumi, Yo shimura et al.
1999; Miyoshi, Ando et al. 2003; Suzuki, Nakata et al. 2003).
In opposition to the STS action, El and E2 can be transformed into inactive E1-S or E2-S
by sulfotransferases (SUL T). So far, several SUL T enzymes have been identified, including
SULTlAl , lA2, IA3 and lEI. However, the lEI enzymes, also known as estrogen
sulfotransferase (ESTIEI) [EC 2.8.2.4] is the one which have the highest affinity for
estrogens (Dooley, Haldeman-Cahill et al. 2000). The estrogen sulfonation is .an important
feature to protect peripheral tissues from possible excessive estrogenic effect since the
addition of the sulfonate group prevents the binding of the estrogen to its receptor (Falany
1997). Expression of ESTIEI has been found in normal human mammary epithelial cells
(Falany and Falany 1996; Miki, Nakata et al. 2002) and in breast cancer tissue (Suzuki,
N akata et al. 2003; Hudelist, Wülfing et al. 2008) where it has been associated with an
improve prognosis.
STS and ESTlEI combined action could maintain the equilibrium between sulfated and
unconjugated estrogens, which might have effects on genesis and development of hormone
dependent breast cancer. The main purpose of this study is to pro vide more information
about the involvement ofthese enzymes in breast cancer. To accomplish this, we developed
specific antibodies against STS and ESTlE1 that we used to analyze the expression of
these
enzymes
in human carcinomas and
adjacent normal breast tissues
by
immunohistochemical localization studies. To the best of our knowledge, no studies have
already compared the expression of EST1E1 between breast carcinomas and adjacent
normal tissues from the same patients, although such an analysis .has been already
performed for the STS (Chetrite, Cortes-Prieto et al. 2000; Utsumi, Yoshimura et al. 2000;
Miyoshi, Ando et al. 2003).
The expression of STS and EST1El evaluated in breast carcinomas were also correlated
with clinicopathological parameters such as estrogen receptor a (ER-a), estrogen receptor
43
P (ER-P), progesterone receptor A (PR-A), progesterone receptor B (PR-B) and cell
division control prote in 47 (CDC47) expression as weIl as type and stage of the tumors and
age and estimated menopausal status of the patients at surgery.
44
6. Material -and Methods
6. 1 Patients
This study was approved by the institutional review board at the First Teaching Hospital of
Jilin University and Tumor Hospital of Jilin Province, Changchun, China. This study was
also approved by the ethical committee of the "Centre hospitalier de l'université Laval"
(CHUL) Research Centre. Eighty-height women with primary breast cancer agreed to
participate in this research project and gave us an informed consent. Patient characteristics
are summarized in table 2. Menopausal status was unknown for most of the patients so it
was assumed that 50-year-old patients and older were usualIy menopaused. AlI patients
underwent modified radical mastectomy without any preoperative therapy at the First
Hospital of Jilin University and Tumor Hospital of Jilin Province (China) during the year
2004. The samples of tumors and adjacent non-neoplastic tissues taken out at more than 5
cm from the tumors were collected at surgery from patients with a mean age of 50.9 years
(range 32-73). AlI samples were fixed in 10% formol in 0.2M phosphate buffer (pH 7.4) for 24 hours. They were then dehydrated through increasing concentrations of ethanol and
toluene and finally embedded in paraffine
Cases (%)
Age
<5~
years
~50 years
Missing value
Tumor stage
1
45 (51.1)
42 (47.7)
1 (1.1)
II
III
7 (8.0)
68 (77.3)
12 (136)
Missing value
1 (1.1)
Histological type
Infiltrating ductal
Infiltrating lobular
7'8 (88.6)
4 (4.5)
Others
5 (5.7)
Missing value
1 (1.1)
Table 2: Patient characteristics.
Among the 88 adjacent tissues taken out at more than 5 cm of the tumors, 17. samples
contained only fat without acini, 12 samples showed inflammation signs and 2 contained
45
only skin with sebaceous glands. These tissues were excluded while the 57 other adjacent
normal tissues were included in our analysis.
6.2 Immunohistochemistry
The breast carcinomàs and adjacent breast paraffin sections (5 J.!m of thickness) were first
deparaffinized in toluene, hydrated and then treated with 3% H20 2 in methanol for 20
minutes in order to eliminate the endogenous peroxidase.
For CDC47 and hormone receptor localization, these steps were Jollowed by a treatment
for antigen retrieval, as previously described (Tacha and Chen 1994). Tissues were then
incubated with commercial antibodies against CDC47, ER-a, ER-p , PR-A or PR-B
(table 2). Commercial detection system kit (Covance Research Products, Inc., Dedham,
Massachusetts) using the streptavidin-biotin amplification method was used afterward for
the localization of CDC47 and the receptor. Finally, the antigen-antibody complex was
visualized with a solution of PBS IX containing 20mg/l00ml of 3,3-diaminobenzidine and
3% H202. Nuclei were counterstained with hematoxylin.
Source
Catalog no.
Antibody
Dilution
ER-a
1:1000
Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz (CA)
SC-543
ER-~
1: 100
Abcam (Cambridge, MA)
Ab288
PR-A
1:50
Medicorp (Montréal, Canada)
MS-197
PR-B
1:50
Medicorp (Montréal, Canada)
MS-192
CDC-47
1:500
Medicorp (Montréal, Canada)
MS-862
Table 3: List of primary antibodies.
The specificity of the antiserum against ESTIEI used in this study has , been described
previously (Takase, Luu-The et al. 2007). The antibody against STS was raised in New
Zealand rab bits using the peptide sequence corresponding to amino acids 38-165 of the
human sulfatase. It was made by exactly the same method previously used for the
development ofESTIEl antibody (Takase, Luu-The et al. 2007). The antibody's specificity
was verified by Westem Blot (figure 18) and by immunoabsorption immunohistochemical
studies (figure 19). STS and ESTIEI antibodies were diluted 1:250 and l: 100 respectively
in this study.
46
For STS and ESTIEI , no antigen retrieval was performed. Furthermore, goat anti-rabbit
antibodies linked to the horseradish peroxidase were used instead of the commercial kit for
STS and ESTIEI localization. The antigen-antibody complex was visualized with a
solution ofPBS IX containing 20mg/IOOml of3 ,3-diaminobenzidine "and 3% H2 0 2 . Nuclei
were counterstained with hematoxylin.
M
85 kDa46 kDa-
Figure 18: Validation of the STS antibody specificity by Western blot. Western Blot analysis ofproteins from
untransfected or transfected HK293 cells stably expressing human STS (Mw : 62 kDa). The antiserum
specifically reacts with the overexpressed enzyme.
Figure 19: Immunoabsorption study to validate the STS specificity. A) Immunostaining with the STS
antibody in human breast carcinoma. (dilution 1: 100). Positive reaction is observed in the cytoplasm of
cancerous cells (c). B) Immunoabsorption of the antiserum with art excess of antigen (10- 6 M) has completely
prevented immunostaining in an adjacent section. (400X)
For aIl the immunohistochemical experiments,
~egative
controls wete performed on
adjacent sections by using commercial normal rabbit serum or normal mouse serum instead
of the primary antibodies. These sections were negative (results not shown).
47
6.3 Scoring of immunoreactivity
The data were generated after fuUy reviewing the complete sections of each human
carcinoma and adjacent tissue. According to previous studies (Suzuki, Moriya et al.
2000 ~
Suzuki, Nakata et al. 2003), two researchers independently classified the STS and EST1E1
in three groups : <1 % positive ceUs, no immunoreactivity; 1-50% positive ceUs, 1+; more
than 50% positive ceUs, 2+. Scoring of ER-a, ER-p , PR-A, PR-B and CDC47 was
performed using the same classification method. The intensity of labeling was not
considered due to variations in the background staining between sections.
Inter-observer differences between 1+ and 2+ occurred in 17.9% of SIS cases and in 7.1 %
of EST1E1 cases. This discrepancy was mainly due to the fact that the real percentage of
positive ceUs was ·often located at the interstice of these two groups (around 50%). Interobserver differences between negative and 1+ or between negative and 2+ occurred in less
than 5% of STS and EST1E1 cases. These differences appeared only when the staining was
very weak or the background very high. Duplicates of immunohistochemistry were
performed for these cases. AU the cases with different estimations between observers were
discussed and reevaluated until consensus.
6.4 Statistical analyses
The Chi-square (X2) test or the Fisher' s exact test were used to compare the enzyme
expression between the carcinomas and the normal tissues and to assess associations
between categorical variables. The association between enzyme expression and age
(continuous variable) was analyzed using Spearman correlation coefficients. AU analyses
were perforrned using SPSS software (Version 16.0).
48
7. Results
7.1. Expression of STS and EST1E1
Immunostaining for STS was almost exclusively cytoplasmic (figtn"e 20). It was seen in the
cytoplasm of malignant cells in all the cancer cases: 31 invasive carcinomas (35.2%) were
1+ (1-50% cells stained) and 57 (64.8%) were 2+ (more than 50% stained cells). In nonmalignant adjacent tissues, STS staining was se en in the epithelial cells of both acini and
ducts in 55 out of57 samples (96.5%): 28 (49.1%) were 1+ (1-50% cells stained) and 27
(47.4%) were 2+ (more than 50% stained cells). The percentage of stained cells was higher
in the invasive carcinomas than in the normal adjacent tissues, although not to a significant
level (p = 0.064) (figure 22A).
Cytoplasmic and nuclear staining for ESTIEI (> 1% cells stained) was observed in 83 out
of 88 invasive carcinomas (94.30/0): 30 (34.1 %) had between 1-50% stained cells and 53
(60.2%) had more than 50% stained cells (figure 21).
ESTIEI immunoreactivity was also found in 55 out of 57 adjacent normal tissue samples
(96.5%). The staining was detected in the cytoplasm and nuclei of stromal cells and
epithelial cells in both acini and ducts. Among the positive tissues, 23 (40.4%) had between
1-50% stained cells and 32 (56.1 %), had more than 50% stained cells. We could not
measure any significant differences ~etween the ESTIEI expression in invasive carcinomas
and that observed in adjacent normal tissues (figure 22B).
49
c------
------e
20A
20B
--------e
c------
21A
21B
Figure 20: Localization of STS in carcinoma (A) and in adjacent breast tissue (B). Immunostaining is
observed in the cytoplasm of cancerous cells (c) (A) and in the cytoplasm of epithelial cells (e) (B). (400X)
Figure 21: Localization of ESTIEI in carcinoma (A) and in adjacent breast tissue (B). Immunostaining is
detected in the cytoplasm and nuc1ei of cancerous cells (c) (A) and in both the cytoplasm and nuclei of
epithelial (e) and stromal cells (s) (B). (400X)
50
STS
100
90
c
Cl)
80
0
"Cl)
.s 70
ln
60
Cl)
ln
cu 50
0
40
0
"30
Cl)
.c
E . 20
:l
10
c
-...
64,8
• Carcinoma
• Normal Tissue
~
o
1
Negati\€
1-50%
>50%
percentage of positive cells
A
EST1E1
-...
c
Cl)
~
Cl)
.s
ln
Cl)
ln
cu
0
'to!o
0
"-
Cl)
.c
E
:l
c
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
60,2 56,1
• Carcinoma
• Normal Tissue
Negati\€
B
1-500/0
percentage of positive cells
Figure 22: STS (A) and ESTIEI (B) expression between cancer and adjacent tissue.
7.2. Expression of steroid receptors and CDC47
Immunostaining for ER-a, PR-B as weIl as CDC47 was exclusively observed in nuclei of
epithelial ceIls in both non-tumoral adjacent tissues and carcinomas. Immunoreactivity for
ER-~
and PR-A was also found in normal epithelial ceIls and in tumoral cells but the
staining was both nuclear and cytoplasmic.
51
As previously observed, the expression of CDC47 was significantly higher in tumors than
in adjacent normal tissues (p < 0.001) (Song, Liu et al. 2006). The expression of ER-a was
also significantly higher in the carcinomas than in the adjacent non-malignant breast tissues
(p < 0.001). For an the other receptors, we could not measure any significant differences.
ER-a
ER-p
PR-A
PR-B
CDC47
Cancers
Adjacent Tissues
Negative
15 (17.0%)
1 (1.8%)
1-50%
28 (31.8%)
48 (84.20/0)
50%+
45 (51.10/0)
8 (14.0%)
0.001
Cancers
Adjacent Tissues
2 (2.3%)
3 (5.3%)
43 (48.9%)
21 (36.8%)
43 (48.9%)
33 (57.9%)
N.S.
Cancers
50 (56.8%)
31(35.2%)
7 (8.0%)
Adjacent Tissues
25 (43.9%)
28 (49.10/0)
4 (7.0%)
N.S.
Cancers
Adjacent Tissues
45 (51.1%)
26 (45.6%)
29 (33.0%)
20 (35.1%)
14 (15.9%)
Il (19.3%)
N.S.
Cancers
Adjacent Tissues
1 (1.1%)
0(0.0%)
64 (72.70/0)
57 (100%)
23 (26.1%)
0(0.0%)
0.001
P
Table 4: ERs, PRs and CDC47 expression between cancer and adjacent tissues.
7.3. Correlations between STS, EST1E1, and the other parameters
evaluated
Correlations between STS immunoreactivity and clinicopathological parameters are
sumrnarized in table 5. No significant correlations were observed between STS
irnrnunoreactivity and age, histological type and tumor stage. Furthermore, there was no
correlation between STS expression and the expression of ER-a, ER-p, PR-A and PR-B. A
positive association was however observed between STS and CDC47 (p < 0.05) and
between SIS and EST1E1 (p < 0.05).
As for STS, no significant correlation between EST1E1
immunoreactivity and
clinicopathological pararneters such as age, histological type and tumor stage could be
observed (table 6). However, EST1E1 was positively correlated with CDC47 (p < 0.05),
PR-B (p < 0.05) and particularly ER-p (p < 0.005). There was no correlation between
EST1E1 expression and PR-A or ER-a.
52
STS immunoreactivityt
1-50% (n=31)
500/0+ (n=57)
Type *
Infiltrative ductal
Infiltrative lobular
28 (99.3 %)
1 (3.3%)
Others
P
N. S.
1 (3.3%)
50 (87.7%)
3 (5.3 %)
4 (7.00/0)
II
III
1 (3.2%)
23 (74.2%)
6 ( 19.4%)
6 (10.5%)
45 (78.9%)
6 (10.5%)
N.S.
Age*
Years ( average)
51.3±8.3
50.8±9.7
N S.
Menopause
No (S 49-years-old)
14 (46.7%)
3 1 (54.4%)
16 (53.3%)
26 (45.7%)
Negative
1-50%
50%+
8 (25.8%)
Il (35.5%)
12 (38.7%)
7 (12.3%)
17* (29.8%)
33 (57.9%)
N.S.
Negative
1-500/0
50%+
1 (3.2%)
18 (58.1%)
12 (38.7%)
1 (1.8%)
25 (43.9%)
31 (54.4%)
N. S.
Negative
1-50%
50%+
19 (61.30/0)
10 (32.3%)
2 (6.5%)
31 (54.4%)
21 (36.8%)
5 (8.8%)
NS.
Negative
1-50%
50%+
20 (64.5%)
9 (29.0%)
2 (6.5%)
25 (43.9%)
20 (35.1%)
12 (21.1 %)
NS
Negative
1-50%
50%+
1 (3.2%)
26 (83.9%)
4 (12.9%)
0(0.0%)
38 (66.7%)
19 (33.3%)
<0.05
Negative
1-50%
50%+
4 (12.9%)
14 (45.2%
13 (41.9%
1 (1.75%)
16 (28.1%)
40 (70.2%)
<0.05
Stage *
status*t
ER-a
ER-p
PR-A
PR-B
CDC47
EST1E1
Yes
(~
50-years-old)
N S.
Table 5: Correlation between STS immunoreactivity and clinical parameters. (in breast carcinomas)
*Histological type, tumor stage and age at surgery were unknown for one patient.
t No cancer tissues were negative for STS; that's why there is no «negative» column.
t Menopausal status was unknown for aIl patients. It was assume that 50-year-old patients and older were
menopaused while 49-year-old and younger were not menopaused.
53
EST1E1 immunoreactivity
Negative (n=5) 1-50% (n=30) 50%+
Type *
Menopause
status* ~
ER-a
ER-~
PR-A
PR-B
CDC47
STS
P
4 (80.0%)
0(0%)
1 (20%)
28 (93.3 %)
0(0.0%)
2 (6.7%)
46 (88.5%)
3 (5.8%)
II
III
0(0%)
4 (80.0%)
1 (20%)
1 (3 .30/0)
26 (86.7%)
3 (10.0%)
6 (11:5%)
38 (73.1 %)
8 (15.40/0)
N.S.
Years ( average)
52.4±7.8
50.7±8.6
51.0±9.8
NS
No (:s 49-years-old) 2 (40%)
Yes (2:: 50-years-old) 3 (60%)
15 (50%)
28 (54%)
15 (50% )
2 4 (46% )
Stage*
Age*
(n~ 53)
Infiltrative ductal
Infiltrative lobular
Others
NS
3 (5.8%)
N.S
Negative
1-50%
50%+
2 (40%)
2 (40%)
1 (20%)
5 (16.7%)
9 (30.0%)
16 (53.3%)
8 (15.1%)
17(32.1%)
28 (52.8%)
Negative
1-500/0
50%+
1 (20%)
1 (20%)
3 (60%)
1 (3.3%)
21 (70%)
8 (26.7%)
0(0.0%)
21 (39.6%)
Negative
1-50%
50%+
4 (80.0%)
1 (20%)
0(0%)
18 (600/0)
Il (36.7%)
1 (3.30/0)
28 (52.8%)
19 (35.8%)
6 (11.3%)
N.S
Negative
1-50%
50%+
3 (600/0)
2 (40%)
0(0%)
21 (70%)
7 (23.3%)
2 (6.70/0)
21 (39.60/0)
20 (37.8%)
12 (22.6%)
<0.05
Negative
1-50%
50%+
1 (200/0)
4 (80.0%)
0(0%)
0(0.0%)
26 (86.7%)
4 (13.30/0)
0(0.0%)
34 (64.2%)
19 (35.8%)
<0.05
Negative
1-50%
50%+
0(0%)
4 (80.0%)
1 (20%)
o (00/0)
0(0%)
13 (24.5%)
40 (75.5%)
<0.05
14 (46.7%)
13 (53.3%)
NS
<0.005
32 (60.4%)
Table 6: Correlation between EST1E1 immunoreactivity and c1inical parameters. (in breast carcinomas)
*Histological type, tumor stage and age at surgery were unknown for one patient.
~ Menopausal status was unknown for aU patients. It was assume that 50-year-old patients and older were
menopaused while 49-year-old and younger were not menopaused.
54
8. Discussion
The enzymes STS and EST1E1 are both involved in the intratumoral equilibrium between
sulfated and unconjugated estrogens. STS generates bioactive El from E1-S while EST1E1
is responsible for the inverse reaction.
8.1. STS
ln this study, aIl the invasive carcinomas were positive for STS, which is in agreement with
Tseng et al. (Tseng, Mazella et al. 1983) who measured STS activity ranging from 0.2 to
4.6 nrnol/mg tissue protein per hr in 66 breast carcinomas. The percentage of positive cases
that we obtained (100%) is however higher than others previously found (Evans, Rowlands
et al. 1994) (89%); (Saeki, Takashima et al. 1999) (880/0); (Yamamoto, Yamashita et al.
2003) (59%); (Suzuki, Nakata et al. 2003) (74%). The inherent heterogeneity between the
studied cohorts and the difference in the antibodies used may partly explain these
differences. Furthermore, Yamamoto et al. have considered negative the cases with less
than 10% of positive cells while we have considered negative the cases with less than 1%
of positive cells (Yamamoto, Yamashita et al. 2003).
Irnrnunohistochemical analyses have showed that STS expression is higher in carcinomas
than in adjacent normal tissues (p = 0.064), although not to a significant level. This
observation is consistent with the results reported by Utsumi et al. who found a higher STS
mRNA level in breast cancers than in normal tissues adjacent to carcinomas (Utsumi,
Yoshimura et al. 2000). Our results are also in agreement with those of Tseng et al. and
Chetrite et al. who reported that STS activity was higher in tumors than in normal adjacent
tissues. CDC47 which is implicated in DNA replication has been used to study the cell
proliferation in breast cancer section (Tseng, Mazella et al. 1983; Chetrite, Cortes-Prieto et
aL 2000). Since STS was positively associated .with CDC47 expression, it might be
hypothesjzed that the overexpression of STS can lead to an increased estrogen-dependent
proliferation of cancer.
As previously reported by other groups, we did not observe any associations between STS
expression and age, tumor type or tumor stage (Suzuki, Nakata et al. 2003 ; Takase, Luu-
55
The et al. 2007). On the other hand, Myoshi et al. have previously reported a positive
correlation between STS mRNA levels and tumor stage (Miyoshi, Ando et al. 2003). As for
other groups, we could not establish any link between STS and steroid receptor status
(Evans, Rowlands et al. 1994; Saeki, Takashima et al. 1999; Suzuki, Nakata et al. 2003 ;
Yamamoto, Yamashita et al. 2003).
We could not compare the tumoral STS expression with tumor size or risk of recurrence
because these informations were lacking for most of our cases. Other groups have found a
significant positive correlation between STS levels and tumor size or a worsened prognosis
(Utsumi, Yoshimura et al. 1999; Miyoshi, Ando et al. 2003 ; Suzuki,
Nakat~
et al. 2003).
The association between STS and the mitotic marker CDC47 that we found support the
relevance of these observations.
8.2. EST1E1
In the present study, 94.3% of the carcinoma samples were positive for EST1El. This
percentage is higher than those reported by Hudelist et al. (79.4%) and Suzuki et al.
(44.2%) (Suzuki, Nakata et al. 2003; Hudelist, Wülfing et al. 2008). The difference in
antibodies used could probably explain this discrepancy. In fact, besides the cytoplasmic
localization, we have observed a strong reaction in the nuclei of both normal and cancer
samples. This is of interest because the observations previously reported showed only a
cytoplasmic localization of immunoreactive EST1E1 in breast cells ((Suzuki, Nakata et al.
2003; Hudelist, Wülfing et al. 2008). Nuclear EST1E1 localization has been previously
found in guinea pig adrenal cortex (Whitnall, Driscoll et al. 1993) and in rat hepatocytes
(Mancini, Song et al. 1992), supporting our observations that EST1E1 could have both
nuclear and cytoplasmic subcellular localization. The high concentration ofEST1E1 found
in breast epithelial cell nuclei suggests that this enzyme play a role in modulating the ability
of estrogens to regulate gene expression.
According to previous studies, high EST1E1 expression in cancer is associated with smaller
tumors and a better prognosis (Suzuki, Nakata et al. 2003; Hudelist, Wülfing et al. 2008).
This seems logical since, as a consequence of the ESTIEI activity, cell proliferation should
56
be inhibited following E2 inactivation. Our results are however in contradiction with these
observations because EST1E1 was positively associated with CDC47 and STS expression
in breast cancer (p < 0.05). It is important to keep in mind that immunohistochemical
studies show only the expression of the protein and carinot give any information about the
activity of the enzymes. It is possible that a high concentration of EST1E1 is produced to
decrease the E2 concentration in high-grade tumors but these enzymes are not functional.
Moreover, it cannot be excluded that other EST, such as EST1A1 might be involved in E2
level regulation in breast cancer'(Lehmann and Wagner 2008).
A high positive association was found between EST1E1 and ER-p (p < 0.005).
The
involvement of ER-J3 in the development and progression of breast carcinoma cells is
currently not weIl understood. Sorne groups have already observed a significant increase of
EST1E1 when the tumors were ER+ (Adams, Pewnim et al. 1979), or ER+/PR+ (Pewnim,
Adams et -al. 1980; Tseng, Mazella et al. 1983). Rowever, the antibodies used before the
discovery of the ER-J3 subtype in 1996 by Kuiper et al. (Kuiper, Enmark et al. 1996) could
probably recognize both ER-a and ER-p. There are studies indicating that ER-J3 expression
is linked with smaller tumors showing lower histological grade and better disease-free and
overall survival (Jarvinen, Pelto-Huikko et al: 2000; Sugiura, Toyama et al. 2007). Our
observations suggest that ER-J3 can play its protective role by increasing the expression of
enzymes which inactivate estrogens, such as EST1E1. This hypothesis should be further
investigated.
Interestingly, there was a higher percentage of positive cells for EST1E1 among invasive
carcinomas expressing high PR-B level than among invasive carcinomas ·expressing lower
PR-B level (p < 0.05). Ropp et al. have already determine that PR-B act as a str9ng
transcriptional activator while PR-A act as a transcriptional repressor and that a high PRA:PR-B ratio is associated with a poorer diagnosis for breast cancer (Ropp, Weiss et al.
2004). According to our data, we can hypothesize that PR-B activates the transcription of
protective enzymes in breast carcinomas, such as EST1 E 1. This receptor could be downregulated in the worst cases of cancer, leading to a decrease of protective enzymes like
EST1E1. This hypothesis should be further investigated. Finally, PR-A and PR-B
57
expression correlated with each other in breast cancers which also support Hopp et al. who
have observed the same phenomenon (Hopp, Weiss et al. 2004).
58
9. Conclusions
In surnmary, we report that STS and ESTIEI are commonly expressed in human breast
cancer. STS is overexpressed in carcinomas and associated with a high proliferation index.
Controlling the STS overexpression could be a possible approach to decrease the hormonedependent cancer growth.
We have observed for the first time a nuclear localization of ESTIEI in both normal and
cancerous human mammary cells. Moreover, we have observed a positive association
between two nuclear receptors, ER-p and PR-B, and the enzyme ESTIEI. These new
findings should lead to further investigations about the involvement of these receptors and
their relation with protective enzyme in cancer growth and development.
10. Acknowledgements
The authors are grateful to Johanne Ouellet and Li Songyun for their excellent tecluiical
assistance. The present study was funded by Endorecherche.
59
Chapitre III -Androgène, DHEA et développement
mammaire
60
1. Avant Propos
Ce chapitre présente succinctement un deuxième projet sur lequel j ' ai eu la chance de
travailler. L' objectif principal de ce projet est de vérifier l' action principale de l'E2, de la
DHT et de la DHEA sur la prolifération des cellules épithéliales mammaires. Le modèle
utilisé est la souris ovariectomisée (afin de limiter l' action des estrogènes et des androgènes
endogènes). Trois types de souris sont utilisés: des souris sauvages, des souris knock-out
pour le récepteur des estrogènes alpha et des souris knock-out pour le récepteur des
estro gènes bêta.
Ce chapitre contient donc une brève introduction sur les androgènes ainsi que sur la
création de souris knock-out. S' en suit un article scientifique rédigé en anglais qui est en
fait la retranscription d' un manuscrit dernièrement soumis au « Journal of molecular
histology », manuscrit toujours en attente d' une approbation finale pour la publication (en
date
d~
9 novembre 2008). Cette section est donc structurée à la façon d' un article
scientifique (résumé, introduction, matériel et méthodes, résultats, discussion et
conclusion).
Ma participation à cet article scientifique est très importante. J' ai d'abord réalisé les
expérimentations immunohistochimiques permettant de déterminer l'expression de CDC47
et de AR sur l'ensemble des échantillons. J'ai également déterminé le pourcentage de
cellules positives pour chaque échantillon. J'ai effectué les analyses statistiques et
interprété leur signification. J'ai également rédigé le manuscrit et effectuer les corrections
demandées par l' éditeur en chef du journal.
D. Phaneuf a participé aux traitements des différents types de souris. C. Martel et F. Labrie
ont travaillé à l'élaboration du protocole et des principales hypothèses de recherche.
Finalement, Dr G. Pelletier a parti.cipé au design de l' étude, à la révision du manuscrit et à
la coordination.
61
2. Les androgènes
2. 1. Information générale
Al' opposé des estrogènes qui sont des hormones femelles, les androgènes sont des
hormones mâles car ils stimulent et contrôlent principalement le développement des
phénotypes sexuels masculins (voie génitale, caractéristiques sexuelles secondaires et
fertilité) chez les vertébrés. Cependant, la notion d'hormone « mâle» devrait être revue
puisque les androgènes sont également retrouvés en concentration significative chez la
femme. La production ovarienne d' androgènes est même plusieurs fois supérieure à la
production ovarienne d'estrogènes (Dimitrakakis, Zhou et al. 2003), quoique les estrogènes
sont beaucoup plus puissants et agissent à beaucoup plus faible concentration.
La classe des androgènes est composée des stéroïdes ayant 19 atomes de carbone. Les
principaux androgènes bioactifs sont la testostérone et la dihydrotestostérone (DHT)
(l'androgène le plus puissant). Tel que mentionné précédemment, la
~4-dione
et la DHEA
sont également considérés comme des androgènes par plusieurs mais ces stéroïdes ne
possèdent pas d'activité androgénique suite à leur incapacité de lier les récepteurs des
androgènes (AR). La
~4-dione
et la DHEA peuvent cependant être transformées en
androgènes bioactifs (tout comme en estrogènes bioactifs) dans les tissus périphériques
(voie intracrine).
La testostérone est produite à partir de i14-dione, suite à la réduction de la double liaison
C::::;:Q retrouvée en C17. Cette réaction est principalement catalysée par la 17p-HSD de type
3 dans les cellules de Leydig, cellules responsables de la production d'environ 50 % de la
testostérone totale chez l'homme (Suzuki, Miki et al. 2005). En périphérie (chez l'homme
comme chez la femme), cette réaction est principalement catalysée par la 17p -HSD de type
5 [AKRIC3 ,
lOp15-14, L\4-dione ' ~ Testostérone]
(une enzyme aussi connue sous les noms: « 3a-
HSD de type 2 », « prostaglandin 11-ketoreductase » et « dihydrodiol dehydrogenase »).
Cette enzyme est retrouvée, entre autres, dans la prostate, dans les cellules de Leydig et
62
dans la glande mammaire (Pelletier, Luu-The et al. 1999) ainsi que dans 65 à 83 % des
carcinomes mammaires (Ji, Aoyama et al. 2004).
La testostérone peut être transformée ensuite en DHT par les enzymes 5a-réductases de
type 1 (5aRedl) [SRD5AI , 5pI5, testostérone
~ DHT].
~ DHT]
et 2 (5aRed2) [SRD5A2, 2p23 , testostérone
Alors que la 5aRed2 est surtout exprimée dans la prostate et en plus faible
concentration dans le foie et dans la peau, la 5aRed 1 est retrouvée dans une panoplie de
tissus périphériques tels que le foie, les reins, la peau, le cerveau, la glande mammaire, etc.
Il est intéressant de noter qu' un nouveau type de 5a-réductases (le type 3) vient récemment
d' être caractérisé chez l'humain et qu' il aurait une implication dans l' étiologie du cancer de
la prostate (Uemura, Tamura et al. 2008)
o
OH
..
..
1 7~H SD
~
o
5a-réductase
o
Ll4-dione
OH
o
Testostérone
H DHT
Figure 23 : Production des androgènes bioactifs.
2.2. La dualité de l'effet des androgènes sur la glande mammaire
Même si une grande partie de l'attention scientifique est tournée vers les estrogènes, il
semble que les androgènes ont également un rôle important à jouer dans le développement
de la glande mammaire. Les connaissances actuelles démontrent cependant une dualité
importante en ce qui à trait aux effets des androgènes sur les cellules mammaires: d' une
part, les androgènes peuvent provoquer une stimulation estrogénique suite à leur
aromatisation en E2 dans les tissus mammaires selon la voie intracrine, mais d' autre part,
les androgènes provoqueraient un effet inhibiteur sur la croissance de la glande mammaire
directement via l'activation des récepteurs des androgènes. Voici quelques observation,s
appuyant l' existence d' un effet inhibiteur direct des androgènes:
a) Des études ont démontré que le récepteur des androgènes est exprimé dans 85 % des
tissus mammaires normaux ainsi que dans 75 % à 90 % des carcinomes mammaires (Lea,
Kvinnsland et al. 1989; Song, Liu et al. 2006; Gonzalez, Corte et al. 2008). La présence de
63
ces récepteurs dans les tissus mammaires est obligatoire pour que les androgènes puissent
influencer directement la croissance et le développement des cellules mammaires normales
et cancéreuses. Les carcinomes exprimant fortement AR sont ass~ciés à un index mitotique
plus bas et à un meilleur pronostic (Suzuki, Miki et al. 2006).
b) L' administration de DHT - l'androgène non aromatisable le plus puissant - cause un
arrêt de la croissance et du développement des lignées de cellules cancéreuses mammaires
ZR-75-1 (Poulin, Baker et al. 1988; de Launoit, Dauvois et al. 1991 ; Birrell, Bentel et al.
1995), T47-D (Birrell, Bentel et al. 1995) et MCF-7 (Ando, de Amicis et al. 2002).
c) Le risque de cancer du sein est plus élevé chez les hommes ayant une déficience en
androgènes associée à une dysfonction testiculaire (Thomas, Jimenez ' et al. 1992;
Lobaccaro, Lumbroso et al. 1993; Karamanakos, Mitsiades et al. 2004).
d) Une concentration circulante élevée d'androgènes, notamment chez des athlètes féminins
s'administrant des stéroïdes androgéniques-anabolisants ou encore chez des ·transsexuelles
« de-femme-à-homme » traitées durant de longue période avec des androgènes, cause une
diminution marquée de la quantité de tissu glandulaire mammaire (Sapino, Pietribiasi et al.
1990; Korkia and Stimson 1997; Slagter, Gooren et al. 2006).
Des études ont démontré, à l'inverse, une corrélation directe entre l'exposition à la
testostérone et l'incidence du cancer du sein (Secreto, Toniolo et al. 1991; Berrino, Muti et
al. 1996) ou l' augmentation de la densité mammaire (Xie, Tsao et al. 1999). Cependant,
puisque la testostérone peut être directement aromatisée en E2 dans plusieurs tissus
périphériques, il est impossible de déterminer si ces corrélations sont dues à une activité
directe de la testostérone ou plutôt à une activité estrogénique suivant l'aromatisation. Ces
limites expérimentales peuvent être évitées en utilisant la DHT (non aromatisable) plutôt
que la testostérone lors d'études expérimentales. De plus, toutes les corrélations
épidémiologiques sont basées sur les mesures de testostérone par radioimmuno-étalonnage
qui peuvent manquer de précision lors de la mesure des bas niveaux de testostérone
retrouvés chez la femme.
64
Finalement, il est important de mentionner que quelques articles rapportent une stimulation
de la prolifération mammaire suite à l' administration de DHT, notamment chez les lignées
cellulaires MCF-7, EFM-9 et MDA-MB-453 (Hackenberg, Hofmann et al. 1988; Birrell,
. Bentel et al. 1995). Selon Birrel et al. 1995, ce phénomène s' explique par le fait que
certains métabolites du pHT (p. ex. le 3a-androstane-3p ,17P-diol) possèderaient une
activité estrogénique, causant une augmentation de la prolifération cellulaire VIa
l' activation des ERs.
65
3. Les souris knock-out
Une souris « knock-out» est une souris dont les deux allèles d' un ou de plusieurs gènes
ciblés ont été remplacés génétiquement par des allèles inactifs afin d'éliminer tout
simplement l' expression de ces gènes. Cette technique est connue sous les noms
d' ipvalidation ou de knock-out de gènes ..L'intérêt de l' invalidation d' un gène consiste en la
possibilité de déterminer son rôle et sa fonction en observant les nouveaux phénotypes
résultant de l' invalidation de ce dit gène. Voici comment créer des souris knock-out:
a) La première étape pour invalider un gène consiste à fabriquer un vecteur contenant une
version incomplète et non fonctionnelle du gène ciblé. Ce vecteur peut être, par exemple,
un plasmide bactérien contenant la région promotrice ainsi que la région en aval du gène à
invalider ainsi qu'un gène rapporteur.
Gène rapporteur (p.ex. Lac Z)
Promoteur du gène à invalider
Séquence en aval du gène à invalider
Plasmide
Figure 24 : Vecteur pouvant être utilisé pour invalider un gène. (Furelaud s.d.)
b) L' étape suivante consiste à insérer le vecteur dans des cellules souches de souris,
habituellement par électroporation (c.-à-d. , . par l'application d'impulsions électriques
contrôlées afin de perméabiliser la membrane cellulaire). Le gène rapporteur situé sur le
plasmide permet de détecter les cellules qui ont intégré le vecteur dans leur génome parmi
toutes celles qui ne l'ont pas intégré.
66
, , li
""I
f1
;cJl - 11,1
rt't.'UIII hii,ai,\ tm
humulu lÛt'
r
ne A
Figure 25 : Création de cellules possédant un allèle knock-out. A) Le vecteur est transfecté dans les cellules
souches. B) Dans certaines cellules, une recombinaison homologue à lieu; le gène reporteur est inséré à la
place du gène cible. C) Les cellules ayant réalisé la recombinaison homologue sont sélectionnées grâce au
gèn~ rapporteur. Abréviations: ES, Souche embryonnaire; Prom., promoteur. (Furelaud s.d.)
c) Ensuite, il faut créer une première lignée de souris génétiquement modifiées. Pour ce
faire, les cellules souches ayant un gène invalidé sont injectées dans le blastocèle (première
cavité formée lors du développement embryonnaire) d' embryons de souris. Les embryons
sont ensuite réimplantés dans des mères porteuses. A la parturition, les souris naissantes
sont dites « mosaïques » car elles présentent des tissus dérivants des cellules normales et
des tissus possédant l'allèle muté. Parmi les souris mosaïques, il faut ensuite déterminer
lesquelles possèdent des cellules germinales provenant des cellules souches ayant l' allèle
muté.
d) L' étape suivante consiste à croiser les souris dont les. cellules sexuelles possèdent un
allèle invalidé avec des souris sàuvages. La progéniture sera alors composée de deux types
de souris : 50 % seront hétérozygotes pour le gène à invalider et 50 % seront homozygotes
pour le gène normal (figure 25A).
e) La dernière étape consiste alors à croiser les souris hétérozygotes entre elles. Parmi la
progéniture, 50 % des souris seront hétérozygotes, 25 % seront homozygotes pour le gène
sauvage et 25 % seront homozygotes pour le gène invalidé (figure 25B).
67
Souris mosaïques
50
B)
0
/0
50
0
/0
x
50 0/ 0
25
0/0
: Souris hétérozygote
(un allèle normal et un allèle invalidé)
Souris homozygote knock out
(deux allèles invalidés)
.: Souris homozygote
- (deux allèles normaux)
Figure 26 : Production de souris knock-out à partir de souris mosaïques. A) Une souris mosaïque dont les
cellules germinales possèdent un allèle invalidé est croisée avec une souris homozygote normale (type
sauvage). La progéniture résultante est composée à 50 % de souris hétérozygotes. B) Deux souris
hétérozygotes sont croisées ensemble. La progéniture résultante est composée à 25 % de souris knock-out.
68
4. Article - Title and Authors
Androgen receptor expression in mammary gland in wild-type, estrogen receptor a
knockout and estrogen receptor
P knockout
female mi ce following administration of sex
steroid hormones
Poisson Paré D, PhaneufD, Martel C, Labrie F, Pelletier G
Molecular Endocrinology and Oncology Research Center, Laval · University Hospital
Research Center, 2705 Laurier blvd, Quebec City, Qc, Canada, G 1V 4G2
David Poisson Paré
[email protected]
Daniel Phaneuf
[email protected]
Céline Martel
[email protected]
Labrie Fernand
femand.labrie@crchul. ulaval.ca
Georges Pelletier
georges.pelletier@crchul. ulaval.ca
Corresponding author:
Dr. Georges Pelletier, · Oncology and Molecular Endocrinology Laboratory, CHUL
Research Center, 2705 Laurier Boulevard, Québec, Qc, Canada, G 1V 4G2
Tel: (418) 654-2296
Fax: (418) 654-2761
E-mail: [email protected]
69
5. Résumé
Nous avons examiné par immunohistochimie l' effet de l'administration de trois hormones
stéroïdiennes -l' estradiol (E2), la dihydrotestostérone (DHT) et la dehydroepiandrostérone
(DHEA) - sur l'expression du récepteur des androgènes chez des souris ovariectomisées de
type sauvage .(WT), ERaKO et ERf3KO.
L ' administration de la DHT a significativement augmenté le 'nombre de cellules exprimant
AR chez tous les types de souris. L' administration de l'E2 n' a eu aucun effet sur le nombre
de cellules exprimant AR. L' administration de la DH~A a augmenté l' expression de AR de
195 % chez les souris WT, de 183 % chez les souris ERf3KO et de 401 % chez les souris
ERaKO. De manière intéressante, le pourcentage de cellules exprimant AR était plus bas
chez les souris ERf3KO que chez les souris WT, et ce, indépendamment du traitement
hormonal.
En conclusion, l' E2 ne semble pas moduler l'expression de AR chez les cellules
épithéliales mammaires. ER-p semble jouer un rôle important dans le maintien des niveaux
normaux de AR. La DHT augmente l' expression de son propre récepteur dans la glande
mammaire. La DHEA augmente l'expression de AR, probablement suite à sa conversion en
androgènes actifs.
70
6. Abstract
We examined by immunohistochemistry the effects of a 28-day administration of two
steroid hormones - dihydrotestosterone (DHT) and estradiol (E2) and a precursor of sex
steroids, dehydroepiandrosterone (DHEA) - on the expression. of androgen receptor (AR)
in wild type (WT), estrogen receptor (ER)a Knock-Out (ERaKO) and ERt3KO
ovariectomized mice.
The administration of DHT significantly increased the number of epithelial cells expressing
AR in all mouse types. The administration of E2 slightly increased the expression of AR,
but only in WT mice. DHEA markedly stimulated the expression of AR by 195% in WT,
183% in ERf3KO and 401% in ERaKO OVX mice. Interestingly, the percentage of AR
positive cells was significantly lower in ERP KO mice when compared with WT mice,
regardless of treatment.
In conclusion, DHT increases the expression of its own receptor in mouse mammary gland
while E2 has only a minor effect. DHEA, on the other hand, upregulates the expression of
AR probably following its conversion into androgens. The presence of
necessary to maintain normal AR levels in the mou.se mammary gland.
ER-~
appears
7. Introduction
Estradiol (E2), the most potent-natural estrogen, plays an essential role in stimulating
marnrnary epithelial proliferation and breast growth at puberty and during sexual maturity.
An increased length and/or level of exposure to estrogens may even lead to breast cancer
(Russo and Russo 2006). As a proof of concept, the most effective drugs against breast
cancer either decrease E2 biosynthesis' or block the ligand binding site of ER. E2 acts on
cell function through activation of estrogen receptor (ER). Two nuclear ER subtypes have
been identified: estrogen receptor a (ER-a) and estrogen receptor
p
(ER~P)
(Kuiper,
Enrnark et al. 1996).
Androgen receptor (AR) is a transcriptional factor that also belongs to the nuclear receptor
superfamily. AR is expressed in normal breast cells and is present in more than 75% of
primary breast tumors, suggesting that it could also play a role in, the control of breast
cancer proliferation (Kimura, Mizokami et al. 1993; Song, Liu et al. 2006). Unfortunately,
the functional significance of AR in normal breast and in breast malignancies growth and
development is poorly understood. There is an important discrepancy among the
observations reported in the scientific literature. On one hand, numerous clinical
observations (Sapino, Pietribiasi et al. 1990; Thomas, Jimenez et al. 1992; Lobaccaro,
Lumbroso et al. 1993; Korkia and Stimson 1997; Karamanakos, Mitsiades et al. 2004;
Slagter, Gooren et al. 2006) or experimentations (Dauvois, Li et al. 1989; de Launoit,
Dauvois et al. 1991; Birrell, Bentel et al. 1995; Anda, de Amicis et al. 2002; Dimitrakakis,
Zhou et al. 2003) suggest that androgens exert an inhibitory effect on mammary gland
growth. On
t~e oth~r
hand, other studies have reported a significant proliferative effect on
marnrnary cells following androgen administration (Hackenberg, Hofmann et al. 1988;
Birrell, Bentel et al. 1995; Xie, Tsao et al. 1999; Baratta, Grolli et al. 2000).
Understanding how the steroid hormones regulate AR expression in the mammary gland
could bring useful information about the role played by androgens and their receptor in this
tissue. Previously, itwas observed that both AR mRNA and protein were highly
downregulated following dihydrotestosterone (DHT) administration in cancer cell lines
72
whereas estradiol (E2) had a slight or no effect (Hackenberg, Hawighorst et al. 1992; Hall,
Tilley et al. 1992). Other groups, however, have observed an increase in the expression of
AR in the rat mammary gland following the administration of testosterone (T), either alone
or in combination with estradiol (E2) (Xie, Tsao et al. 1999; Wong and Xie 2001), although
it is possible that T was locally aromatized into estrogens in the breast tissues.
Primates including humans are the only speCles having adrenals which secrete
dehydroepiandrosterone (DHEA), an inactive steroid precursor converted in peripheral
tissues into both androgens and/or estrogens. Plasma DHEA-sulfate levels in women are
10 000 higher than those of T and 3 000 to 30 000 higher than those of E2, forming a
significant substrate reservoir for the cells which can convert it into physiologically active
sex steroids (Labrie 2006). According to previous observations, DHEA seems to have
mainly an inhibiting action on mammary epithelial cell growth via its transformation into
active androgens (Boccuzzi, Di Monaco et al. 1993; Li, Yan et al. 1993; Couillard, Labrie
et al. 1998). However, our group has previously observed an increase in proliferation of
mammary epithelial cells following the administration of DHEA to ovariectomized rats that
could be reversed by the antiandrogen flutamide (Sourla, Martel et al. 1998). Note that this
observation was not repeated in one of our recent studies on the effect of chronic
administration of DHEA to intact female rats (Pelletier, Labrie et al. 2008) while the
previous data were obtained in ovariectomized animaIs.
In this report, we studied the action of E2, the non-aromatizable androgen DHT and the
estrogenlandrogenprecursor DHEA
on mammary
gland
expression of AR
in
ovariectomized mice. In order to evaluate the involvement of ER subtypes, ER-a and ERJ3 , in the effects of those sex steroids, we have used as an experimental model wild-type
(WT), ER-a knockout (ERaKO) and ER-J3 knockout (ER{3KO) mice. AR expression was
evaluated by immunohistochemistry.
73
8. Methods
8. 1. Animal treatments
Female WT (25 animaIs), ERaKO (23 animaIs) and ERf3KO (21 animaIs) mice, aged of 17
to 22 weeks at start of the treatments, were used. The preparation of ERaKO and ERf3KO
mice has already been described (Pelletier, Li et al. 2003). The mice were housed
individually in a controlled room (temperature: 22 ± 3 oC; humidity: 50 ± 20%; 12 h light 12 h dark cycles, lights on at 7: 15 h). The animaIs had free access to tap water and a
commercial pellet diet (#2018). The experiment was conducted in an animal facility
approved by the Canadian Council on Animal Care (CCAC) and the Association for
Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). The study was
performed in accordance with the CCAC Guide for Care and Use of Experimental AnimaIs.
Independently for each type of animaIs (WT, ERaKO and ERf3KO), mice were randomized
and assigned to 5 groups of 5 (WT) or 4-5 (ERaKO and ERf3KO) animaIs each as
fbllowed: 1) sham-ovariectomized control (SHAM-OVX); 2) ovariectomized control
(OVX); 3) OVX + DHT; 4) OVX + E2; 5) OVX + DHEA (table 7). On the first day of the
study, animaIs were bilaterally ovariectomized (or SHAM-OVX) under isoflurane
anesthesia. Prior to the necropsy performed on day 29 of the study, mice received a daily
subcutaneous injection (27 injections in total - 0.2 ml/mouse) of the vehicle alone [5%
ethanol - 0.4% methylcellulose (group 1-2)], DHT [0.1 mg/mouse (groupe 3) - DHT dose
was selected following a previous dose-range study in mice (Azzi, EI-Alfy et al. 2005)], E2
[0.00005 mg/mouse (groupe 4) - Normal physiological concentration of E2 was used to
determine the dose (Ivanga, Labrie et al. 2007)] or DHEA [3 mg/mouse (groupe 5) DHEA dose was selected according to the results obtained in previous rat studies (Sourla,
Martel et al. 1998; Pelletier, Labrie et al. 2008)
On day 29 of the study, mice under isoflurane anesthesia were exsanguinated at the
abdominal aorta followed by cervical dislocation. The mammary glands were then removed
and immediately immersed in a solution of 10% buffered formalin for 48 h. After fixation,
74
mammary gland tissue was dehydrated in a tissue processor and embedded in paraffin
blocs.
Sham-OVX
OVX
Controls
Controls
DHT
E2
DHEA
WT
5
5
5
5
5
ERaKO
4
4
5
4
4
ERI3KO
4*
4
4
5
4
Table 7: Mice distribution following the randomization. *One ERI3KO SHAM-OVX sample contained only
adipose tissue. This sample was excluded of our analysis (3 mice left for this group).
8.2. Immunohistochemistry
Mammary glands were cut in sections of 5 f.lm of thickness. They were deparaffinized in
toluene, hydrated and then treated with 3% H20 2 in methanol for 20 minutes in order to
eliminate the endogenous peroxidase. These steps were followed by a treatment for antigen
retrieval, as previously" described (Tacha and Chen 1994).
The sections were then incubated ovemight at 4°C with commercial rabbit-anti-mouse AR
antibodies (Santa Cruz Biotechnology, SC-816, dilution 1:200). Commercial antibodies
against ER-a and ER-p were also applied to sorne randomly chosen cases of ERaKO and
ERf3KO to confirm that mice were real knockout. These cases were negative (not shown).
A commercial detection system kit (Covance Research Products, Inc., Dedham,
Massachusetts) using the streptavidin-biotin amplification method was used as second
antibody. Finally, the antigen-antibody complex was visualized with a solution of IX PBS
containing 0.2 mg/ml of 3,3-diaminobenzidine and 3% H2 0 2 . Nuclei were counterstained
with hematoxylin.
75
8.3. Scoring of immunoreactivity
WT and ERf3KO: About 10 acini or ducts were photographed for each mammary gland
sample using light microscopy (X400). Afterwards, aU the positive and negative epithelial
ceUs were count manuaUy on a computer screen and the positive-ceUs/total-ceUs ratio was
calculated. One ERf3KO SHAM-OVX sample contained only adipose tissue. This sample
was excluded from our analysis.
ERaKO: In the adult ERaKO female, the mammary gland is undeveloped: the acini are
lacking and the ducts are highly atrophied and hardly identifiable (Bocchinfuso and Korach
1997). For this reason, it was impossible to count epithelial ceUs as for WT and ERf3KO
mice. Therefore, we randomly chose 10 fields (200 / 270 f.lm) for each sample and we
count aU the positive ceUs, regardless of the ceU types. U sing this method, we counted
mostly · stromal ceUs, sorne blood vessel ceUs and possibly sorne epithelial ceUs of
unrecognizable atrophied ducts.
76
9. Results
The mouse mammary gland reaches its histological and functional differentiation and
maturity at the age of 3 months. The mature WT and ERf3KO mammary glands (17-22
weeks old) contained a normal-Iooking network of epithelial ducts and lobular structures.
We have qualitatively noticed that ovariectomy led to a decrease in the surface covered by
ducts and glands for both types of mice. Such a decrease was previously observed in wild
type ovariectomized mice (Luo, Souda et al. 1998). In contrast, the ERaKO samples were
devoid of any ductal structures and alveolar development. Only fibrous stroma with an
inconstant amount of adipocytes was observed.
Figure 27 shows, for the three types of mi ce [WT (Fig. 27A), ERf3KO (Fig. 27B) and
ERaKO (Fig. 27C)] , the average percentage of epithelial cells immunoreactive for AR
(WT and ERf3KO) or the average total number of AR-positive cells found in.an area of200
/ 270 J.lm (ERaKO), following the different treatments applied.
OVX did not influence the average percentage of epithelial cells expressing AR in both WT
and ERf3KO groups when compared to intact mice. However, AR positive cell number was
significantly reduced in the mammary gland of ERaKO mice following OVX (-69.4%,
p < 0.001).
Administration of a daily dose of 0.1 mg of DHT to OVX mice significantly increased the
percentage of cells expressing AR in comparison with the OVX 'controls [+247.7%,
p<O.OOl (WT); +314.7%, p<O.OOl (ERf3KO)] and the absolute number of cells
expressing AR [+332.2%, P < 0.001 (ERaKO)].
At the daily dose of 0.05 J.lg, E2 slightly increased the percentage of immunoreactive
epithelial cells for AR in the mammary gland of OVX WT mice (+ 17.8 %, p < 0.05), while
it caused no significant effect on AR expression in ERPKO or ERaKO mice.
77
Following DHEA administration, AR expression in the marnrnary gland of the three types
of mice was significantly enhanced in comparison with the OVX controls
[+ 194.8%,
p < 0.001 (WT); + 182.6%, p < 0.001 (ERPKO); +400.7%, P < 0.001 (ERaKO)].
A) wild type
60
B) ERl3KO
###***
~
###
***
50
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0
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'wa 40
'wa 40
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*
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Il.
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. 21 ,78
~
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10
13,29
Il.
0:::
0:::
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[ Intact]
Controls
DHT
E2
[Intact]
DHEA
[OVX]
C) ERaKO
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18
16
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[Intact]
[ OVX]
Figure 27: Effect of hormonal treatments on AR expression. For WT (A) and ERf3KO (B) mice, the
percentage of epithelial cells expressing AR was measured. For ERaKO (C) mice, the absolute number of
cells expressing AR in 200/270 Jlm area was counted. (*, P < 0.05 ; ***, P < 0.001 vs. OVX controIs; #,
P < 0.05; ###, P < 0.001 vs. intact mice).
For each group of mice, the average percentage of epithelial cells positive for AR was
lower in ERPKO mammary glands when compared to WT mammary glands although not
to a significant level for the OVX+DHT groups. [-28.1 %, p < 0.05 (SHAM-OVX); -29.7%,
78
p<0.05 (OVX); -16.1%, p<0.08 (OVX+DHT); -74.8%, p<O.OOl (OVX+E2); -32.6%,
P < 0.05 (OVX+DHEA)] (Fig. 28).
1
D WT 0 ERbKO
1
60
***
~ 50
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10
Il::
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[ Intact]
Controls
[OVX]
DHT
E2
DHEA
Figure 28: Comparison of the AR expression between WT and ERJ3KO mice. (*, P < 0.05 ; ***, P < 0.001)
10. Discussion
Our results strongly suggest that ER-p is involved in the modulation of AR expression in
the mouse mammary gland. In the intact and 'O VX control groups, AR levels were 28.1 %
and 29.7% lower in the ERf3KO mammary gland than in the WT mammary gland,
respectively. Furthermore, the gap in the AR expression between these two groups became
especially pronounced when E2, the main ER-p ligand, was administrated (74.8% more AR
'expression in the WT mammary gland cells than in the ERPKO mammary gland cells).
79
Previous reports show that AR is correlated with ER expression in cancer celllines (Hall,
Tilley et al. 1992) ane! in primary breast cancer (Ogawa, Hai et al. 2008). According to our
results, we hypothesized that these correlation are more related to
ER-~
than to ER-a. In
the future, we suggest that the groups which study AR expression in breast cancer consider
ER-a and
ER-~
as two different clinicopathological parameters. Furthermore, previous
studies have demonstrated that ER -~ expression is linked with smaller tumors showing
lower histological grade and better disease-free and overall survival (Jarvinen, PeltoHuikko et al. 2000; Sugiura, Toyama et al. 2007). Our observations suggest that
ER-~
, could increase the AR level in breast epithelial cells, increasing by the same time the
inhibitory response of androgen on cell proliferation.
DHT was shown to significantly increase the numb~r of cells expressing AR in aIl the types
ofmice (247.7%, WT; 314.7%, E~KO; 332.2%, ERaKO). These results are in agreement
with the findings of Xie et al. who measured an increase of AR in
t~e
rat mammary gland
following T administration (Xie, Tsao et al. 1999; Wong and Xie 2001) but different from
other groups which reported a decrease in AR receptor following androgen treatment in
human breast cancer cells (Hackenberg, Hawighorst et al. 1992; Hall, Tilley et al. 1992). It
is possible that the androgen regulation of AR could be different .between species.
E2 increased slightly the percentage of epithelial cells positive for AR in the WT mice, but
had no effect on the expression of AR in the ERaKO and ERf)KO mammary gland,
suggesting an involvement of both ER types in the effect of E2. The mammary expression
of AR increased in aIl the mice which received DHEA (+194.8%, WT; +182.6%, ERPKO;
+400.7%, ERaKO). Because DHT had an important positive effect on the AR expression,
we could reasonably submit the hypothesis that DHEA could stünulate the expression of
AR via its transformation into androgens.
80
11. Conclusion
In summary, we report that ER-p exerts a positive influence in the expression of AR in the
mouse mammary gland. The potent androgen DHT increases the expression of its own
receptor in mammary gland while the potent estrogen E2 had a minor effect and only in
WT mice. Finally, DHEA upregulates the expression of AR in mammary gland probably
following its conversion into androgens.
81
12. Acknowledgement
The authors are grateful to Genome Canada and Genome Quebec which suppo.rted the
present study.
82
Conclusion
Le cancer du sein est la maladie maligne la plus fréquemment diagnostiquée chez la femme
à travers le monde. Au Canada, une femme sur neuf risque d'avoir un cancer du sein au
cours de sa vie et une femme sur vingt-huit en mourra. Ces simples statistiques démontrent
avec éloquence l' impératif de comprendre et de traiter cette terrible maladie. Les deux
études arborées tout au long de ce mémoire avaient pour but de documenter certains aspects
de la régulation hormonale contrôlant les fonctionnements normaux et malins de la glande
mammaIre.
La première étude a permis d' exposer la complexité de la régulation des estrogènes actifs
par le système de sulfoconjugaison dans le cancer du sein. Nous avons observé par
immuhistochimie que la STS et la ESTIEI sont toutes deux couramment exprimées dans le
cancer du sein et que ces enzymes sont surexprimées dans le cancer par rapport aux tissus
normaux adjacents. Nous avons également constaté que l' enzyme ESTIEI est positivement
corrélée avec ER-p et PR-B, deux récepteurs associés à un meilleur pronostic pour le
cancer du sein. Nous avons toutefois identifié plusieurs limites à cette étude_: petite taille de
l' échantillon, méthode immunohistochimique qui ne tient pas compte de l' activité des
enzymes, marquage difficile à quantifier (semi-quantitatif), informations manquantes
(survie, statut de la ménopause, traitements hormonaux). Cependant, les corrélations
observées démontrent clairement qu' une reprise de cette étude avec un plus grand
échantillon et une méthode plus facilement quantifiable serait appropriée.
La deuxième étude ne portait pas directement sur le cancer mais sur la régulation du
récepteur des androgènes dans la glande mammaire. Cette étude est importante puisque les
androgènes sont présents chez la femme et auraient possiblement un rôle anti-prolifératif
dans les cellules mammaires normales et/ou cancéreuses. En utilisant des souris exposées à
différents traitements hormonaux, nous avons constaté que ER-p est important pour
maintenir des niveaux normaux de AR. Il serait intéressant de vérifier s'il existe une
corrélation entre les récepteurs ER-p et AR dans la glande mammaire humaine et dans- le
cancer du sein. Le maintien de niveau de AR pourrait expliquer en partie les résultats
83
antérieurs qui démontrent que les tumeurs
ER-~-.
ER-~+
sont moins agressives que les tumeurs
La DHEA et la DHT augmentent également les niveaux de AR. L' utilisation de ces
hormones dans le traitement du cancer serait une autre piste à explorer.
En conclusion, ces études ont permis d' augmenter un peu plus la documentation existante
sur le cancer' du sein. Au-delà des observations et des résultats que nous avons obtenus, ces
deux études auront permis de favoriser les discussions entre les différents intervenants
travaillant au sein - j eu de mots facile! - de notre laboratoire (professeurs, assistants à la
recherche,
collègue~
étudiants), mais
égale~ent
avec des collaborateurs d'autres pays
(collègues français et chinois) ainsi qu' avec des membres de la communauté scientifique
internationale lors de différentes conférences. Que la recherche continue!
84
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