Régulation des populations de Nématodes gastro
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N° d’ordre : 2346 THESE présentée pour obtenir LE TITRE DE DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE ÉCOLE DOCTORALE : SCIENCES ECOLOGIQUES, VETERINAIRES, AGRONOMIQUES ET BIOINGENIERIES Spécialité : Qualité et Sécurité des Aliments Par Mlle Caroline LACROUX Titre de la thèse Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux (Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis) dans deux races ovines, INRA 401 et Barbados Black Belly Soutenue le 15 Juin 2006 M. Alain MILON MM. Philippe DORCHIES devant le jury composé de : Président Directeur de thèse Jacques CABARET Rapporteur Christophe CHARTIER Rapporteur Jimmy DUNCAN Membre Philippe JACQUIET Membre 1 REMERCIEMENTS Et bien voilà, ce manuscrit est (quasiment) bouclé et c’est, comme toujours, au dernier moment et dans l’urgence, qu’il faut peauffiner les dernières bricoles et en particulier les remerciements. Au final, c’est toujours la partie la plus baclée. Mais bon, on va essayer d’oublier personne… A Philippe, pour ces quelques années de parasitologie, d’immunologie, de statistiques… Ouf, on y est arrivés… Merci de mettre des points au milieu de mes phrases trop longues et d’enlever tous les adverbes superflus. Néanmoins, toutefois et donc, enfin, merci pour tout… La bouteille de champagne du Vet Research est encore au frigo, c’est quand tu veux… A Mr Dorchies, pour son enthousiasme constant et sans faille vis à vis de ce travail, pour ses conseils judicieux, ses corrections entre la France et le Maroc… A tout le laboratoire de parasitologie de l’ENVT : Françoise, Christelle, Jean-Paul … Merci pour votre disponibilité, votre bonne humeur et votre aide au cours de ces quelques années. A Getachew, heureusement que tu sais quand il faut mettre « the » ou non avant les mots, et merci pour ton aide dans les manips. Bon courage pour la tienne de thèse, mais je ne me fais pas trop de souci… A tous les membres du domaine expérimental de Bourges-La Sapinière : Jean Claude Brunel, Yves Bourdillon, Hervé Morin, Thierry Fassier, Didier Marcon, Serge Py, Eric Thévenot, Alain Burtin, Jérôme Bernard, Bruno Bouquet,Stéphane Gressin… A l’équipe de parasitologie de Tours : Jacques Corté, Christine Sauvé et surtout Lucas Gruner, pour votre aide lors de notre première grosse manip… A Dominique François, pour une logistique parfaite d’expédition de moutons vers Toulouse. A Jacques Bouix, pour ses conseils avisés en matière de génétique lors des CSU de Bourges. A Sèv, Cécile, Pierrette et Cindy, merci de vous occuper de tout ce que je n’ai pas le temps de faire en général, merci pour votre soutien durant cette difficile (et longue) période de rédaction, pour les excursions vers la boulangerie entre midi et deux (plutôt deux d’ailleurs), pour les extases devant les estampes japonnaises de caillettes colorées au Giemsa (j’en veux un de tatouage…), pour l’écriture des cassettes (oui, je sais, dorénavant on ne prendra que celles où ça écrit bien…). Bref, heureusement que vous êtes là… Toutefois, je me demande encore s’il vaut mieux trois ou quatre roues !!! 2 A mon très cher et respecté « collègue de bureau », qui subit ma mauvaise humeur fréquente et mes coups de gueule. En (maigre) contre-partie je réponds au téléphone (!), c’est déjà ça. Trève de plaisanteries, sans vous je ne serais pas là. Merci pour tout et à nos futurs vaches, chèvres et moutons… A Paul Cabanié, professeur classé « X » comme il dit…, pour m’avoir délesté de matinées d’autopsie quand j’étais trop à la bourre. Il n’y a que vous que je peux appeler à 9h45 pour me remplacer au pied levé à 10h00… Promis, l’année prochaine je rendrai tous mes jours : bonne chasse… Merci aux Poupou’s (Poupou I, Poupou II La Peste, le petit Blackou, la Crevette… mais quand va t-on s’arrêter ?) et à vos biberons du soir qui clôturaient souvent mes journées d’ordinateur… A toute ma (grande) famille, mes parents et mon frère (Monsieur « Table des matières »), qui y ont toujours cru et m’ont toujours soutenue. Merci de m’avoir toujours laissé faire tout ce qui me passait par la tête. Avec tout mon amour… Enfin et surtout, à Olivier, ma « pleine lune à moi »…Sans toi je ne serais jamais arrivée au bout. Heureusement que tu as des solutions à tout (faire marcher des PCR bourrées d’inhibiteurs, des anticorps sans bruit de fond…)… Grumpfff… 3 SOMMAIRE CHAPITRE I : PREAMBULE ............................................................................................8 CHAPITRE II : CONTEXTE BIBLIOGRAPHIQUE .....................................................10 1. GENERALITES SUR LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX DES OVINS.........................11 1.1. Classification et critères d’identification des Trichostrongles gastro-intestinaux des ovins .............................................................................................................................11 1.2. Le cycle biologique des Trichostrongles gastro-intestinaux....................................13 1.3. Les deux espèces de Trichostrongles utilisées comme modèles dans nos travaux expérimentaux : Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis...................15 1.3.1. Haemonchus contortus et l’haemonchose ovine...............................................15 1.3.2. Trichostrongylus colubriformis et la trichostrongylose ovine...........................17 2. MOYENS DE LUTTE CONTRE LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX ...........................20 2.1. Les anthelminthiques et leur mode d’action............................................................20 2.2. Les limites d’utilisation des anthelminthiques ........................................................22 2.3. La résistance aux anthelminthiques : définition et mécanismes...............................22 2.4. Prévalence de la résistance aux anthelminthiques ..................................................24 3. METHODES ALTERNATIVES DE LUTTE CONTRE LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX .........................................................................................................................................26 3.1. Tarir les sources de contamination.........................................................................27 3.1.1. La gestion raisonnée des pâturages ..................................................................27 3.1.2. Les champignons et bactéries nématophages ...................................................28 3.2. Augmenter la résistance de l’hôte ..........................................................................29 3.2.1. La vaccination.................................................................................................29 3.2.2. Interactions nutrition-parasitisme ....................................................................33 3.2.3. La sélection de la résistance aux nématodes gastro-intestinaux ........................35 4. LA REPONSE IMMUNITAIRE DES OVINS FACE AUX STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX .49 4.1. Organisation générale de la réponse immunitaire ..................................................49 4.2. La réponse immunitaire innée ................................................................................49 4.3. La réponse immunitaire adaptative ........................................................................51 4.3.1. Présentation des antigènes parasitaires et initiation de la réponse immunitaire adaptative .................................................................................................................52 4.3.2. Orientation de la réponse immunitaire : Th1 ou Th2 ?.......................................54 4 4.3.3. Mise en place et rôle des effecteurs de l’immunité dans les strongyloses gastrointestinales................................................................................................................58 4.3.4. Conséquences de la réponse immunitaire adaptative sur les traits de vie des parasites : manifestations de l’immunité et régulation des populations de strongles ...70 4.3.4.1. Manifestations de l’immunité contre les nématodes parasites adultes........70 4.3.4.2. Manifestations de l’immunité contre les larves de nématodes parasites .....71 4.3.5. Régulation de la réponse immunitaire..............................................................73 4.3.5.1. Induction de types cellulaires immunomodulateurs par les strongles gastrointestinaux.............................................................................................................73 4.3.5.2. Production de molécules parasitaires immunomodulatrices.......................75 CHAPITRE III : OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THESE..........................................79 CHAPITRE IV : LES PROCEDURES EXPERIMENTALES (OUTILS METHODOLOGIQUES) ..................................................................................................82 1. MODELES EXPERIMENTAUX.........................................................................................83 1.1. Les animaux...........................................................................................................83 1.1.1. Ovins de race INRA 401 .................................................................................83 1.1.2. Ovins de race Barbados Black Belly................................................................83 1.1.3. Age et sexe des animaux .................................................................................84 1.2. Les parasites..........................................................................................................84 1.3. Infestations expérimentales ....................................................................................84 2. ETUDE DES POPULATIONS PARASITAIRES .....................................................................85 2.1. Comptage des œufs de strongles dans les matières fécales .....................................85 2.2. Mise en culture in vitro des œufs de Haemonchus contortus ...................................86 2.3. Etude quantitative et qualitative de la population parasitaire chez l’hôte (bilans parasitaires) .................................................................................................................87 2.4. Etude de la fécondité des femelles parasitaires adultes...........................................87 3. ETUDE DE PARAMETRES PHYSIOPATHOLOGIQUES CHEZ L’HOTE .................................88 3.1. Suivi de l’éosinophilie sanguine .............................................................................88 3.2. Suivi de l’hématocrite ............................................................................................88 4. ETUDE DE L’ORIENTATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ...........................................89 4.1. Principe de la PCR quantitative .............................................................................89 4.2. Du tissu à l’ARN….................................................................................................90 5 4.3. Isolement des cellules CD4 positives du nœud lymphatique abomasal pour extraction spécifique des ARN de cette fraction cellulaire .............................................91 4.4. De l’ARN à l’ADN complémentaire (ADNc)… .......................................................92 4.5. PCR quantitative....................................................................................................92 5. EXPLORATION DE LA REPONSE HUMORALE GENERALE GENERALE ET LOCALE............94 5.1. Collecte des prélèvements ......................................................................................94 5.2. Préparation des antigènes......................................................................................94 5.3. Détermination des conditions optimales pour l’ELISA ...........................................95 5.4. Technique ELISA ...................................................................................................98 6. ETUDE DE LA REPONSE CELLULAIRE LOCALE ..............................................................98 6.1. Histologie conventionnelle et immunohistochimie sur coupes en paraffine .............99 6.1.1. Collecte des prélèvements ...............................................................................99 6.1.2. Technique histologique ...................................................................................99 6.1.3. Colorations à l’Hémalun/Eosine et au Giemsa .................................................99 6.1.4. Immunohistochimie sur coupes en paraffine..................................................101 6.2. Immunohistochimie sur coupes en congélation.....................................................102 6.2.1. Collecte et technique des prélèvements..........................................................102 6.2.2. Immunohistochimie.......................................................................................102 7. ETUDE DE LA LYMPHOPROLIFERATION SPECIFIQUE D’ANTIGENES PARASITAIRES .....103 7.1. Principe ...............................................................................................................103 7.2. Technique ............................................................................................................104 7.2.1. Préparation des cellules .................................................................................104 7.2.2. Mise en culture et stimulation des cellules mononucléées..............................104 7.3. Interprétation des résultats ..................................................................................105 8. ANALYSES STATISTIQUES ...........................................................................................105 CHAPITRE V : RESULTATS.........................................................................................107 PARTIE I : ETUDE DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE CHEZ DES AGNEAUX DE RACE SENSIBLE, INRA 401, INFESTES PAR H. CONTORTUS OU T. COLUBRIFORMIS...........................................................................................................108 ARTICLE I :HAEMONCHUS CONTORTUS (NEMATODA : TRICHOSTRONGYLIDAE) INFECTION IN LAMBS ELICITS AN UNEQUIVOCAL TH2 IMMUNE RESPONSE ........................................111 6 ANNEXE A L’ARTICLE « HAEMONCHUS CONTORTUS (NEMATODA : TRICHOSTRONGYLIDAE) INFECTION IN LAMBS ELICITS AN UNEQUIVOCAL TH2 IMMUNE RESPONSE » ....................................................................................................................127 ARTICLE II : IMMUNE RESPONSES IN LAMBS INFECTED WITH TRICHOSTRONGYLUS COLUBRIFORMIS..............................................................................................................131 PARTIE II : ETUDE COMPARATIVE DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE CHEZ DES AGNEAUX DE RACE RESISTANTE, BARBADOS BLACK BELLY, ET DE RACE SENSIBLE, INRA 401, INFESTES PAR H. CONTORTUS....................................................................................................................165 ARTICLE III : DYNAMICS OF THE ADAPTIVE IMMUNE RESPONSE TO HAEMONCHUS CONTORTUS IN SUSCEPTIBLE INRA 401 AND RESISTANT BARBADOS BLACKBELLY LAMBS .......................................................................................................................................167 CHAPITRE VI : DISCUSSION GENERALE ................................................................197 1. REGULATION DES POPULATIONS DE NEMATODES CHEZ L’HOTE.................................198 1.1. Variations selon le parasite au sein de la race INRA 401 .....................................198 1.2. Variations selon la race pour un même parasite : Haemonchus contortus ............199 2. L’IMPLICATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE DANS LA REGULATION DES POPULATIONS DE NEMATODES GASTRO-INTESTINAUX....................................................200 2.1. Orientation de la réponse immunitaire adaptative : variations selon l’espèce de parasite considérée.....................................................................................................200 2.2. Orientation de la réponse immunitaire adaptative : variations selon la race ovine considérée ..................................................................................................................202 2.3. Rôle des mécanismes effecteurs dans la protection contre les nématodes gastrointestinaux ..................................................................................................................202 3. PERSPECTIVES DANS LA COMPREHENSION DE LA RESISTANCE ...................................205 3.1. Le rôle de la réponse immunitaire innée...............................................................205 3.2. Régulation de la réponse immunitaire adaptative.................................................206 3.3. L’exploration de la résistance : aspects génétiques et identification de gènes candidats ....................................................................................................................207 4. CONCLUSION ..............................................................................................................208 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................210 7 Préambule CHAPITRE I : PREAMBULE 8 Préambule Un problème économique … et scientifique La compréhension des mécanismes de résistance de certaines races ovines aux nématodes gastro-intestinaux représente un véritable défi scientifique avec des conséquences économiques non négligeables dans le contexte actuel d’extension des résistances aux principales molécules anthelminthiques dans les populations parasitaires. En effet, une meilleure connaissance de la réponse immunitaire des ovins (dont l’implication est supposée dans la protection contre les strongles chez des individus résistants) pourrait permettre à l’avenir de développer de nouvelles méthodes de lutte, comme la sélection d’animaux résistants ou la mise en place de schémas de vaccination efficaces et applicables à large échelle. Notre travail de thèse a ainsi principalement concerné la caractérisation et l’étude de la dynamique de la réponse immunitaire adaptative i) des ovins infestés soit par Haemonchus contortus, soit par Trichostrongylus colubriformis, et ii) les effets de cette réponse dans la régulation des populations de ces nématodes. Dans un premier temps, notre étude a été réalisée dans une race ovine (INRA 401) considérée comme sensible à ces deux espèces de strongles. Puis, dans un second temps, nous avons comparé les éléments de la réponse immunitaire adaptative entre cette race et une race « tropicale » (Barbados Black Belly) considérée comme résistante. Ce travail conduit au laboratoire de Parasitologie de l’UMR 1225 INRA/Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse est divisé en trois grandes parties. La première partie est un rappel bibliographique sur les deux nématodes utilisés comme modèles, les solutions de lutte envisagées comme alternatives aux traitements anti-parasitaires et les connaissances actuelles de la réponse immunitaire dans les strongyloses gastro-intestinales. Dans une deuxième partie sont exposés les principaux outils méthologiques utilisés et les résultats de nos travaux. Ces derniers sont présentés sous la forme de trois articles. Enfin, une discussion générale, au sein de laquelle sont également envisagées les perspectives pour la poursuite de ce travail, clôt le manuscrit. 9 Contexte bibliographique CHAPITRE II : CONTEXTE BIBLIOGRAPHIQUE 10 Contexte bibliographique 1. GENERALITES SUR LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX DES OVINS Le cheptel ovin français représente environ 9 millions d’animaux, dont 6 millions de brebis (majoritairement constituées de brebis allaitantes), répartis en plus de 50 000 exploitations (source OFIVAL, 2003). La région Midi-Pyrénées est la première région d’élevage ovin en France ; les autres grandes zones d’implantation étant la région Poitou-Charentes, le Limousin, l’Aquitaine, la région Provence-Alpes-Côte d’Azur et l’Auvergne. Une large part des dépenses en élevage conventionnel (7 à 12%) est attribuable aux pathologies ovines et à leur contrôle (Cabaret, 2004). Le contrôle des helminthes parasites, dont les nématodes, est considéré comme un élément essentiel de la gestion de la santé des troupeaux. Au sein des nématodoses, les strongyloses gastro-intestinales ovines représentent une pathologie dominante largement répandue. Les deux strongles les plus fréquents des petits ruminants, Trichostrongylus colubriformis et Teladorsagia circumcincta, sont présents dans tous les élevages ovins d’Europe tempérée. Les autres espèces de nématodes sont plus irrégulièrement rencontrées. C’est notamment le cas pour Haemonchus contortus, très pathogène chez les ovins, dont la répartition géographique irrégulière serait influencée par les conditions climatiques ou par des phénomènes plus aléatoires relatifs aux conduites d’élevage (introduction à un moment adéquat au sein d’un troupeau). De plus, Haemonchus contortus représente l’espèce majeure en région tropicale. 1.1. Classification et critères d’identification des Trichostrongles gastro-intestinaux des ovins La classification des Trichostrongles a été établie par Durette-Desset et Chabaud (1993) : Phylum Némathelminthes Classe Nématodes Sous-Classe Secernentea Ordre Strongylida Sous-Ordre Trichostrongylina Super-Famille Trichostrongyloidea Famille Trichostrongylidae La majorité des strongles gastro-intestinaux des ruminants appartiennent à la famille des Trichostrongylidae, subdivisée en quatre sous-familles (Haemonchinae, Trichostrongylinae, Ostertagiinae et Cooperiinae) (Tableau 1). 11 Contexte bibliographique Sous-famille Espèces Localisation chez l’hôte Hôtes Haemonchus contortus Caillette Ovins, caprins Haemonchus placei Caillette Bovins Haemonchus similis Caillette Bovins Haemonchus longistipes Caillette Dromadaires Trichostrongylus colubriformis Intestin grêle Ovins, caprins Trichostrongylus axei Caillette Bovins, ovins, caprins Teladorsagia circumcincta Caillette Ovins Ostertagia ostertagi Caillette Bovins (ovins, caprins) Cooperia curticei Intestin grêle Bovins, ovins, caprins Cooperia oncophora Intestin grêle Bovins, ovins Haemonchinae Trichostrongylinae Ostertagiinae Cooperiinae Tableau n°1 : Principales espèces de Trichostrongles parasites des ruminants. La distinction des différentes espèces de Trichostrongles est depuis longtemps réalisée à l’aide de caractéristiques morphologiques des vers adultes (longueur, aspect de la bourse caudale et de la capsule buccale, longueur des spicules…). La présence d’une bourse caudale avec des spicules caractéristiques au niveau de l’extrémité postérieure, rend les vers adultes mâles plus facilement identifiables que les femelles (Gibbons, 1979 ; Jacquiet et al., 1997). Chez certaines femelles (en particulier pour le genre Haemonchus), le polymorphisme des ornementations supra-vulvaires permet de définir trois morphotypes : lisse, boutonné et linguiforme (Roberts et al., 1954). La diagnose morphologique au stade œuf est difficile et limitée au genre (exemple : genre Haemonchus). L’identification des larves infestantes (L3) fait appel à des critères morphologiques et morphométriques (longueur totale, longueur de la queue ou de la gaine, forme des extrémités antérieure et postérieure, nombre et forme des cellules intestinales). A l’heure actuelle, le développement de techniques de phylogénie moléculaire permet d’affiner voire de réviser la classification des Trichostrongles par des outils moléculaires (Humbert et Cabaret, 1995 ; Durette-Desset et al., 1999 ; Gouÿ de Bellocq et al., 2001) sur la base du polymorphisme de l’ADN génomique ou des gènes eux-mêmes, du polymorphisme de certaines enzymes des Trichostrongles… 12 Contexte bibliographique 1.2. Le cycle biologique des Trichostrongles gastro-intestinaux Les Trichostrongles gastro-intestinaux des ovins ont un cycle monoxène (absence d’hôte intermédiaire) en deux phases : (i) une phase libre dans le milieu extérieur ou phase externe et (ii) une phase parasitaire chez l’hôte ou phase interne (Figure 1). Figure n°1 : Cycle biologique général des Trichostrongles gastro-intestinaux chez les ovins. Les photographies représentent les différents stades d’Haemonchus contortus. La phase libre débute avec l’élimination d’œufs pondus par les vers femelles dans les matières fécales de l’hôte. Ces œufs s’embryonnent, donnent naissance à des larves de stade 1 (L1) qui muent ensuite en 1 ou 2 jours en larves L2. Ces deux premiers stades se nourrissent de matières organiques et de micro-organismes des matières fécales, et sont peu résistants dans le milieu extérieur ce qui explique un taux de mortalité très élevé. Les larves L2 évoluent ensuite en larves infestantes L3 au cours d’une deuxième mue incomplète (la larve infestante reste engainée dans la gaine ou exuvie de L2 qu’elle perdra lors de son passage dans le tractus digestif proximal de l’hôte). Les larves de stade L3 sont très résistantes dans l’environnement puisque protégées par leur exuvie. Elles peuvent survivre plusieurs mois sur une pâture grâce à leurs réserves lipidiques. La durée de la phase libre dépend étroitement des conditions de température et d’humidité ambiantes (température supérieure à 18°C et degré d’humidité de 13 Contexte bibliographique plus de 70%). L’évolution de l’œuf en larve L3 s’effectue généralement en 8 à 10 jours. Pour H. contortus, cette évolution peut se faire plus rapidement (5-6 jours). La phase parasitaire proprement dite commence par l’ingestion des larves L3 par l’hôte lors du pâturage. Ces larves vont perdre leur exuvie lors du passage dans le rumen ou la caillette puis vont migrer dans la muqueuse digestive. Les larves L3 y subissent alors une nouvelle mue en larves L4. A ce stade, il est fréquent que les larves s’enkystent dans la muqueuse digestive et retardent leur développement (phénomène d’‘hypobiose larvaire’, ou de ‘développement retardé des larves’, observé en hiver, les larves ne reprenant leur développement normal qu’au printemps suivant). Les larves L4 évoluent alors en stades 5 dits juvéniles, avant de donner des adultes (mâles et femelles). Après fécondation, les femelles pondent des œufs qui sont excrétés dans les matières fécales de l’hôte et deviennent une nouvelle source de contamination du pâturage. La durée comprise entre l’ingestion des larves infestantes et la ponte par des femelles se définit comme la période prépatente ; en l’absence d’hypobiose au stade L4, celle-ci est d’environ 3 semaines (Bowman, 1999). Dans le cycle des Trichostrongles, la phase libre représente une étape décisive dont dépend l’épidémiologie des strongyloses. En revanche, ce sont les étapes de développement chez l’hôte, ainsi que la localisation et le régime alimentaire des larves et des adultes, qui vont conditionner la pathogénicité de chaque espèce et définir les interactions entre l’hôte et le parasite. Dans cet objectif, la connaissance des étapes clés du développement des parasites au sein de l’hôte est indispensable. Le tableau n°2 résume la chronologie du développement des différents stades parasitaires pour les deux espèces de Trichostrongles choisies comme modèles dans nos travaux. Présence des larves L3 dans l’organe cible après ingestion Mue des larves L3 en larves L4 Evolution des larves L4 en stades 5 juvéniles Apparition des premiers stades adultes Haemonchus contortus Trichostrongylus colubriformis 2ème jour 2 ème – 5 ème jours 4 ème – 5 ème jours 7 ème – 8 ème jours 9 ème - 11ème jours 15 ème jour 18 ème jour 20 ème jour Tableau n°2 : Etapes du développement d’Haemonchus contortus et de Trichostrongylus colubriformis chez leur hôte (d’après Veglia, 1915 et Soulsby, 1982). 14 Contexte bibliographique 1.3. Les deux espèces de Trichostrongles utilisées comme modèles dans nos travaux expérimentaux : Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis Dans nos travaux expérimentaux, nous nous sommes intéressés à ces deux parasites gastrointestinaux pathogènes du mouton, en raison : (i) de leur représentativité des strongles gastro-intestinaux des ovins , chacun dans leur habitat respectif (caillette pour H. contortus, et intestin grêle proximal pour T. colubriformis) (ii) de leur fréquence dans les élevages ovins sur le territoire français, à l’origine d’un impact médical et économique majeur et de la nécessité de leur contrôle. 1.3.1. Haemonchus contortus et l’haemonchose ovine Haemonchus contortus est un parasite de la caillette des petits ruminants (ovins et caprins). Ce parasite, hématophage dès le stade L4, est responsable de pertes importantes de production dans les élevages de petits ruminants (dégradation de l’état général des animaux ; troubles digestifs avec diarrhée et perte de poids ; laine de mauvaise qualité, altération des capacités de reproduction (Poppi et al., 1990), mais également de mortalité par anémie, notamment chez les agneaux au pâturage. Dans les zones tropicales, 45% de la mortalité des jeunes agneaux est attribuable à ce parasite (Vlassoff et McKenna, 1994). Sa distribution géographique est mondiale en raison de ses grandes capacités d’adaptation aux variations climatiques (Waller, 1997). Voici quelques caractéristiques notables du cycle biologique de ce Trichostrongle : (i) les œufs, excrétés dans les matières fécales, ont une température optimale de développement de 20-30°C (Veglia, 1916) ; les œufs embryonnés sont plus résistants que les œufs non embryonnés (Silverman et Campbell, 1959) ; toutefois, ils ne se développent pas lorsque la température est trop basse (Coyne et Smith, 1992a) d’où une forte mortalité au stade œuf dans des régions où les températures hivernales sont inférieures à 5°C. (ii) les larves infestantes sont relativement résistantes dans le milieu extérieur, notamment à la dessiccation, en raison de la présence de lipides dans leurs cellules intestinales (Veglia, 1916). (iii) ce parasite possède une forte propension à l’arrêt de développement au stade L4, ce qui est considéré par certains auteurs comme le principal moyen de survie à la période hivernale en régions tempérées (Blitz et Gibbs, 1971 ; 15 Contexte bibliographique Barger et Le Jambre, 1988), et par d’autres comme le résultat d’une résistance acquise de l’hôte (Dineen et al., 1965 ; Soulsby, 1966). (iv) les adultes sont facilement visibles à l’œil nu à la surface de la muqueuse abomasale en raison de leur taille (2-3 cm) et de leur coloration rougeâtre liée à leur mode d’alimentation hématophage ; en effet, juste avant leur dernière mue, ces parasites se dotent d’une dent vestigiale perforante dans leur capsule buccale, qui leur permet d’atteindre la lumière des capillaires sanguins de la muqueuse (Urquhart et al., 1996). (v) les vers femelles ont une fécondité très élevée par rapport aux autres espèces de strongles, avec en moyenne une production de 5000-7000 œufs par jour (Coyne et al., 1991) ; cette caractéristique permet de contrebalancer la mortalité des œufs excrétés dans les matières fécales, notamment lorsque les conditions climatiques ne sont pas favorables à leur développement. L’haemonchose ovine se manifeste essentiellement par un syndrome d’anémie (Chermette, 1982). Elle est connue sous trois formes : • Haemonchose suraiguë : forme peu fréquente, liée à des infestations massives chez des animaux apparemment en bonne santé, qui meurent de façon subite d’une gastrite hémorragique sévère. • Haemonchose aiguë : forme typique, caractérisée par une anémie avec chute progressive et dramatique de l’hématocrite, survenant généralement deux semaines environ après l’infestation ; malgré une stimulation compensatrice de l’érythropoïèse, la moelle osseuse est rapidement dépassée et l’hématocrite chute jusqu’à la mort de l’animal. Le phénomène est également aggravé par la perte continuelle en protéines et en fer. Symptômes généraux Faiblesse, essoufflement, amaigrissement Symptômes locaux Pâleur sévère des muqueuses (oculaire, buccale, vulvaire) ; apparition d’œdèmes en régions déclives (« signe de la bouteille » au niveau de l’auge) Paramètres hématologiques Anémie hypochrome et microcytaire, avec chute de la concentration en hémoglobine (30 à 50%), hyposidérémie, hématocrite entre 10 et 20% Evolution Variable mais généralement fatale en 1-6 semaines chez les animaux les plus faibles Tableau n°3 : Tableau clinique d’une forme aiguë d’haemonchose (d’après Chermette, 1982) 16 Contexte bibliographique Figure n°2 : Œdème de l’auge (« bottle jaw ») chez un ovin atteint d’haemonchose aiguë. • Haemonchose chronique : forme la plus fréquente, à l’origine des pertes économiques les plus importantes en raison d’une morbidité élevée. Elle apparaît de façon discrète et insidieuse et aboutit à une dégradation de l’état général rappelant la malnutrition. Le pouvoir pathogène d’Haemonchus contortus est principalement lié à son action spoliatrice sur l’hôte (mode d’alimentation hématophage ayant pour conséquence une spoliation de sang et une anémie) (Hoste et al., 1997), mais également à un effet traumatique local (lors de la phase parasitaire intra-muqueuse des stades larvaires et lors de la phase de nutrition des adultes). La perturbation des fonctions digestives abomasales (modification de la perméabilité de la muqueuse, altération des fonctions sécrétoires, troubles de la motricité et du débit abomaso-duodénal) est à l’origine d’une réduction de la dégradation des protéines alimentaires et d’une malabsorption et peut favoriser la survenue d’infections secondaires (Chermette, 1982 ; Bueno, 1982). 1.3.2. Trichostrongylus colubriformis et la trichostrongylose ovine Trichostrongylus colubriformis est un parasite de la portion proximale de l’intestin grêle des petits ruminants. Comme H. contortus, sa distribution géographique est mondiale. Cette espèce tolère des températures plus basses que le genre Haemonchus pour le développement des stades libres. Son cycle biologique est comparable au cycle général des Trichostrongles mais quelques particularités le distinguent de notre premier modèle : • les larves infestantes perdent leur gaine lors de leur passage dans la caillette avant de gagner leur habitat définitif, à savoir la muqueuse intestinale ; la phase parasitaire intra-muqueuse est courte et l’essentiel du cycle chez l’hôte est réalisé à la surface de la muqueuse digestive, 17 Contexte bibliographique • la tendance à l’hypobiose larvaire semble moins marquée que pour Haemonchus, en raison probablement d’une meilleure adaptation aux conditions climatiques tempérées (Soulsby, 1982), • les adultes, difficilement discernables à l’œil nu (longueur généralement inférieure à 7 mm, faible diamètre) se logent dans des tunnels créés entre les cellules épithéliales et s’accrochent à la muqueuse grâce à la présence des crêtes cuticulaires du synlophe ; ces parasites ont un régime alimentaire de type chymivore et sont ainsi dépourvus de capsule buccale, • la fécondité des femelles est moins importante que celles du genre Haemonchus : le nombre d’œufs excrétés dans les matières fécales excède rarement 100 œufs par femelle. Les manifestations cliniques de l’infestation des ovins par T. colubriformis sont moins spectaculaires que ce que l’on peut observer avec des parasites plus pathogènes comme Haemonchus contortus. Les infestations asymptomatiques sont d’ailleurs très fréquentes. Lors d’infestations importantes, les signes cliniques sont principalement un syndrome diarrhéique plus ou moins marqué, associée à un amaigrissement progressif. Quelques cas de mortalité aiguë sont rencontrés lors d’infestations sévères. Le pouvoir pathogène de ce parasite est lié au développement d’une entéropathie avec atrophie plus ou moins sévère des villosités intestinales. Macroscopiquement, la muqueuse intestinale peut apparaître épaissie et oedémateuse. L’augmentation de la perméabilité vasculaire, associée à l’atrophie villositaire, conduit à une fuite plasmatique vers la lumière donc à une perte de protéines et une hypoalbuminémie (Barker, 1973). La perte de poids est également accentuée par une stimulation de la sécrétion de cholecystokinine (CCK) qui déprime le centre de l’appétit au niveau cérébral. Enfin, une altération de la croissance osseuse (de type ostéoporose) est parfois constatée sur des agneaux en croissance. Elle est liée à une diminution de l’absorption du calcium et du phosphore (Coop, 1981). 18 Contexte bibliographique Les principaux Trichostrongles gastro-intestinaux des ovins appartiennent à quatre grandes sous-familles (Haemonchinae, Trichostrongylinae, Ostertagiinae, et Cooperiinae). Leur cycle biologique est un cycle monoxène, comprenant une phase libre dans le milieu extérieur (développement du stade œuf jusqu’au stade de larve infestante) et une phase parasitaire chez l’hôte (débutant par l’ingestion de larves infestantes et aboutissant à la maturation de stades adultes avec ponte d’œufs dans les matières fécales par les vers femelles). Parmi ces Trichostrongles, Haemonchus contortus et Trichostronglyus colubriformis sont deux espèces parasites majeures des ovins, dont la distribution géographique est mondiale, et qui sont à l’origine de pathologies graves entraînant des pertes économiques importantes en élevage. 19 Contexte bibliographique 2. MOYENS DE LUTTE CONTRE LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX En raison des pertes économiques engendrées, le contrôle des strongyloses gastro-intestinales est un enjeu majeur pour la rentabilité des élevages ovins. La mise en place de plans de prophylaxie est indispensable. Pendant de nombreuses années, l’emploi de molécules anthelminthiques de synthèse a été le moyen quasi-exclusif de lutte contre ces parasites. En effet, les anthelminthiques présentent de multiples avantages : efficacité sur un large spectre d’espèces de nématodes parasites, faible coût et relative simplicité d’utilisation (Hoste et Chartier, 1997). L’objectif de ces traitements n’est toutefois pas de faire disparaître complètement les parasites mais de limiter leur impact économique dans les élevages. La persistance d’une population parasitaire résiduelle demeure favorable dans le sens où elle permet le développement de mécanismes immunitaires protecteurs. 2.1. Les anthelminthiques et leur mode d’action Il existe à ce jour trois grandes familles de molécules anthelminthiques efficaces contre les strongles gastro-intestinaux des ovins (Lanusse et Prichard, 1993) : les benzimidazoles, les imidazothiazoles et les lactones macrocycliques. A cela, s’ajoute la famille des salicylanilides, molécules actives contre les strongles hématophages. Le tableau n°4 présente ces différentes molécules, les posologies recommandées chez les ovins et les contraintes d’utilisation (temps d’attente pour la consommation des viandes et abats et du lait). 20 Contexte bibliographique Posologie Famille Molécule Noms déposés recommandée et voie Temps d’attente d’administration Oxfendazole Oxfenil 5 mg/kg VO Synanthic Fenbendazole Panacur 5 mg/kg VO Fébantel Rintal 5 mg/kg VO Albendazole Valbazen 3.8 mg/kg VO Benzimidazoles Imidazothiazoles Lévamisole Lévamisole 7.5 mg/kg VO Némisol Viandes et abats : 14 jours Lait : nul Viandes et abats : 8 jours Lait : nul Viandes et abats : 10 jours Lait : nul Viandes et abats : 10 jours Lait : interdit* Viandes et abats : 3 jours Lait : interdit* Supaverm Salicylanilides Closantel (actifs contre les strongles (association de closantel et mébendazole) 10 mg/kg VO Seponver hématophages) Nitroxinil Ivermectine Dovenix 10 mg/kg SC Ivomec 0.2 mg/kg SC Oramec Lactones macrocycliques Viandes et abats : 28 jours Lait : interdit* Doramectine Dectomax Moxidectine Cydectine Viandes et abats : 28 jours Lait : 10 traites Viandes et abats : 3 jours 0.2 mg/kg VO Lait : interdit* Viandes et abats : 0.2 mg/kg IM ou SC 35 (IM) ou 56 (SC) jours Lait : interdit* Viandes et abats : 3 0.2 mg/kg VO ou SC jours Lait : interdit* Légende : VO : voie orale, SC : sous-cutanée ; IM : intra-musculaire Tableau n°4 : Principaux anthelminthiques actifs chez les ovins, noms déposés, posologies recommandées et temps d’attente à respecter (*molécules interdites chez les brebis laitières dont le lait est destiné à la consommation humaine) (Source Dictionnaire des médicaments Vétérinaires, 12ème édition, 2003). Les benzimidazoles agissent en bloquant certains systèmes enzymatiques du métabolisme anaérobie des parasites, les privant ainsi de leurs ressources énergétiques (Prichard, 1973), 21 Contexte bibliographique mais également en inhibant la formation des microtubules du cytosquelette des parasites, sans altérer ceux de l’hôte (Lacey, 1988 ; Martin et al., 1997) Le lévamisole (famille des imidazothiazoles) est un agoniste de l’acétylcholine ; en se fixant sur les récepteurs nicotiniques du parasite, il entraîne une paralysie spastique de celui-ci et sa mort (Martin, 1993 et 1997 ; Kohler, 2001). Cette molécule n’a en revanche aucun effet sur les larves inhibées. Les salicylanilides sont actifs contre les strongles hématophages (H. contortus); ils inhibent la phosphorylation oxydative du parasite sans affecter celle de l’hôte (Swan, 1999). Ces molécules présentent la particularité de se fixer à l’albumine plasmatique, ce qui leur confère une importante rémanence (Rothwell et al., 2000). Les lactones macrocycliques comprennent les avermectines (ivermectine et doramectine) et les milbémycines (moxidectine) (Blackhall et al., 2003). Elles sont agonistes du récepteur de l’acide gamma-aminobutyrique et du récepteur au glutamate. Elles entraînent une paralysie flasque du parasite en augmentant la perméabilité membranaire aux ions chlorures (Sangster, 1996 ; Martin, 1997 ; Beugnet et al, 1997). 2.2. Les limites d’utilisation des anthelminthiques Outre les restrictions d’emploi pour les brebis et les chèvres laitières, ainsi qu’en agriculture biologique, certaines interrogations concernant l’utilisation quasi-exclusive de la chimiothérapie anthelminthique ont vu le jour ces dernières années : - la préoccupation du public et des consommateurs vis à vis de l’usage de substances chimiques en agriculture et de la présence de résidus médicamenteux dans les denrées alimentaires d’origine animale est de plus en plus vive (Hoste et Chartier, 1997). - l’impact des résidus de certaines lactones macrocycliques toxiques pour les organismes responsables de la décomposition des fécès de ruminants au pâturage (coléoptères, diptères coprophages, lombriciens) (Lumaret et Errouissi, 2002). - enfin, l’apparition et le développement de résistances au sein des populations de parasites remet largement en cause leur efficacité et leur utilisation. 2.3. La résistance aux anthelminthiques : définition et mécanismes « Une population chimiorésistante est une population de parasites ayant génétiquement acquis la capacité de résister à des concentrations d’anti-parasitaires habituellement létales pour des individus de cette espèce » (Kelly et Hall, 1979). Plusieurs types de résistance ont 22 Contexte bibliographique été décrits selon les capacités des parasites à résister à une substance unique (résistance simple), à un groupe de substances ayant le même mode d’action (résistance de famille, la plus fréquente) ou à un ensemble de composés qui ont des modes d’action différents (résistance multiple) (Beugnet et Kerboeuf, 1997). Le déterminisme de la résistance est génétique (Dobson et al., 1996) et peut être considéré comme un phénomène pré-adaptatif (Jackson, 1993). La pression environnementale (comme l’utilisation des anthelminthiques) sélectionne certaines mutations dans une population de parasites. Le succès reproductif de ces individus résistants est plus important que celui des individus sensibles. Comme le temps de génération est court chez les strongles, la proportion d’individus résistants augmente rapidement dans la population (Prichard, 2001). La diffusion de gènes de résistance est un phénomène complexe dont on ne connaît pas tous les fondements. Plusieurs facteurs sont toutefois bien identifiés : - la fréquence d’utilisation d’un anthelminthique conduit à une pression de sélection élevée et favorise l’extension des résistances ; le risque maximal est représenté par une utilisation à une fréquence correspondant à la période pré-patente des parasites où, dans ce cas, chaque nouvelle génération est soumise à un traitement (Beugnet et Kerboeuf, 1997). Il est ainsi souvent recommandé d’alterner les molécules antiparasitaires mais dans ce cas, le risque de favoriser des multi-résistances est non négligeable. - l’utilisation de procédés rémanents comme les diffuseurs intra-ruminaux exerce une pression de sélection permanente (Beugnet et Kerboeuf, 1997). - les erreurs de dosage volontaires ou non (surdosage et sous-dosage) interviennent pour une large part pour favoriser la sélection de parasites chimiorésistants : les sousdosages permettent la survie d’individus hétérozygotes portant un allèle de résistance ; à l’inverse, les surdosages favorisent l’émergence d’individus extrêmement résistants (Jackson, 1993 ; Borgsteede et al., 1996). - évidemment, l’introduction d’ovins porteurs de strongles gastro-intestinaux résistants dans un troupeau est un facteur de risque important. L’adoption de mesures visant à utiliser les anthelminthiques de façon raisonnée est donc nécessaire pour limiter ces problèmes (Tableau n°5). En effet, le phénomène de réversion d’une population parasitaire vers un état à nouveau sensible est en général très lent et difficile à obtenir, voire impossible lorsque les allèles de résistance sont fixés (Sangster, 1999). 23 Contexte bibliographique *Une fréquence d’utilisation minimale : contrôler les parasites sans pour autant viser à leur éradication *Mise en œuvre des traitements lorsque les infestations sont maximales *Prise en compte de la rémanence de certains produits employés *Choisir des posologies adaptées pour les traitements en évitant les sous-dosages et les surdosages *Développer des méthodes zootechniques et agronomiques capables de diminuer les nombres de traitements *Préserver un « refuge de sensibilité » permettant de maintenir des gènes de sensibilité au sein de la population de parasites Tableau n°5 : Six mesures afin de limiter la sélection d’individus chimiorésistants (d’après Coles et al, 1994 ; Bjorn, 1994 ; Coles, 2005). 2.4. Prévalence de la résistance aux anthelminthiques La résistance aux anthelminthiques est un phénomène d’ampleur mondiale, en augmentation constante tant sur le plan géographique, qu’au niveau des espèces de parasites affectées et du spectre des molécules impliquées (Sangster, 1999). Ces résistances sont décrites chez la majorité des espèces de ruminants, mais sont plus sévères chez les ovins et les caprins que chez les bovins. Toutes les espèces de strongles ainsi que les trois grandes familles d’anthelminthiques sont concernées (Prichard, 1990). L’hémisphère sud (Australie, NouvelleZélande, Afrique du Sud) est la première zone concernée par ce phénomène (Wolstenholme et al., 2004). Les conditions climatiques et le mode intensif de l’élevage y favorisent la résistance de genres Haemonchus et Trichostrongylus (Jackson, 1993 ; Waller, 1997). Sur les continents nord et sud-américains, le phénomène est quasi-similaire : un fort degré de résistance aux benzimidazoles a été mis en évidence (Uhlinger et al., 1992). Les situations sont considérées comme critiques au Paraguay, voire alarmantes dans certains pays (Uruguay) (Waller, 1997). Le continent européen n’est pas épargné même si l’on considère que la résistance y est moindre. En France, cette résistance est toutefois bien réelle, tant dans des élevages ovins que caprins (Kerboeuf et Hubert, 1985 ; Kerboeuf et al., 1999 ; Chartier et al., 2001). 24 Contexte bibliographique Pendant de nombreuses années, les méthodes de lutte contre les strongles gastrointestinaux des ovins ont largement recouru à l’utilisation de molécules anthelminthiques (benzimidazoles, imidazothiazoles, lactones macrocycliques…). A l’heure actuelle, de nombreuses contraintes remettent en cause l’emploi à grande échelle de ces substances anti-parasitaires : ♣interdiction d’utilisation chez les brebis laitières dont le lait est destiné à la consommation humaine, ♣préoccupation de plus en plus vive des pouvoirs publics et des consommateurs vis à vis des résidus médicamenteux dans les denrées alimentaires d’origine animale, et impact de ces substances sur l’environnement et la faune non cible, ♣apparition et extension de résistances à ces molécules au sein des populations parasitaires à l’échelle mondiale. 25 Contexte bibliographique 3. METHODES ALTERNATIVES DE LUTTE CONTRE LES STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX Il existe aujourd’hui de fortes limites ou restrictions à l’usage des anti-parasitaires en élevage ovin. Les possibilités de synthèse, de mise au point et de commercialisation de nouvelles molécules efficaces semblent réduites dans un avenir proche (Geary et al., 1999 et 2003), bien que quelques molécules, comme l’émodepside (famille des cyclooctadepsipeptides) puissent avoir leur intérêt dans la lutte contre les nématodes gastro-intestinaux (Jeschke et al., 2005). La recherche de méthodes alternatives ou complémentaires aux anthelminthiques visant à contrôler le parasitisme gastro-intestinal est donc urgente (Van Wyk et al., 1997 et 1999). La figure n°3 résume les principaux axes de lutte contre les strongles gastro-intestinaux chez les ovins. Figure n°3 : Les trois principaux axes de lutte contre les strongles gastro-intestinaux (Hoste et Chartier, 1997 ; Jackson, 2000) 26 Contexte bibliographique 3.1. Tarir les sources de contamination 3.1.1. La gestion raisonnée des pâturages Elle consiste à minimiser le contact entre les ovins et les larves infestantes afin de maintenir la productivité à un niveau acceptable. Connue depuis longtemps, cette méthode est facilement et rapidement applicable et elle a un faible coût. Cependant, si cette gestion des pâturages est réalisée avec succès dans les régions tropicales où la durée de vie des larves infestantes est courte dans le milieu extérieur, il n’en va pas de même dans les régions tempérées où la survie de ces larves est bien plus longue (Hoste et Chartier, 1997). Certaines mesures recommandées, comme le ‘Treat and Move’ qui consiste à déplacer les animaux sur des parcelles saines après traitement, sont pertinentes en l’absence de résistances, mais peuvent favoriser une contamination exclusive du milieu extérieur avec des souches résistantes dans le cas contraire. Dans cet objectif, plusieurs catégories de méthodes ont été décrites (Yvore et al., 1996 ; Hoste et Chartier, 1997 ; Cabaret et al., 2002) : - méthode préventive, consistant à placer des animaux sains sur des parcelles exemptes de larves infestantes, - méthodes comme le ‘Treat and Move’ ou assainissements par mise au repos court ou prolongé des parcelles ; pratique du retournement des prairies par labour, - méthodes par dilution consistant en un pâturage mixte ou alterné avec plusieurs types d’hôtes (bovins et ovins, ou équins et ovins) ou avec un seul type d’hôte (la différence de sensibilité entre ovins jeunes et adultes peut être mise à profit afin de réduire la pression d’infection rencontrée par les animaux jeunes qui sont les plus réceptifs ; le principe général consiste à ce que les jeunes animaux précèdent toujours les adultes sur des parcelles saines). Le succès de ces méthodes repose avant tout sur une gestion rigoureuse des systèmes de pâturage. Cependant, cette gestion est en général établie selon des motifs agronomiques de valorisation des parcs fourragers et d’herbe sur pied ; la prise en compte du risque parasitaire n’étant en général considérée qu’en seconde intention. 27 Contexte bibliographique 3.1.2. Les champignons et bactéries nématophages Plus de 50 espèces de champignons sont capables de capturer et détruire les larves de nématodes sur les pâturages (Siddiqui et Mahmood, 1996). Parmi ceux-ci, Duddingtonia flagrans est probablement l’espèce sur laquelle se sont concentrées la majorité des études. Larsen et al. (1998) ont montré que les chlamydospores du champignon nématophage Duddingtonia flagrans étaient capables de survivre lors du passage dans le tractus digestif des ruminants. Ceci a ouvert la possibilité d’exploiter ce champignon comme agent biologique de contrôle des parasites nématodes sur les pâturages (Waller et al., 1994 et 2001). Son intérêt réside d’une part, dans la capacité des filaments mycéliens issus des spores à immobiliser ou envahir les larves de strongles dans les matières fécales et d’autre part, dans le caractère polyvalent de son action contre les strongles des ruminants, des équidés et des porcins. Dans l’espèce ovine, Larsen et al. (1998) ont constaté une réduction de plus de 80% du nombre de larves infestantes dans les matières fécales d’ovins expérimentalement infestés avec plusieurs espèces de nématodes et recevant par voie orale des spores de D. flagrans. De même, les capacités prédatrices du champignon Arthrobotrys cladodes var. macroides ont récemment été mises en évidence (Eslami et al., 2005). L’activité nématophage de cette espèce est identique à celle décrite pour D. flagrans : les conidies piègent les larves infestantes d’Haemonchus contortus dans les matières fécales en formant des boucles autour de celles-ci. Ces résultats sont similaires à ceux décrits par Mendoza-De Gives et VazquezPrats (1994) avec une autre espèce de champignon nématophage, Monacrosporium eudermatum. Par ailleurs, les cristaux protéiques contenus dans les spores de la bactérie Bacillus thuringiensis sont connus pour leur toxicité vis à vis d’une large variété d’insectes : ces protéines cristallines sont activées dans le tube digestif de l’insecte et se lient aux récepteurs membranaires intestinaux, entraînant la formation de pores et la mort de l’insecte (Schnepf et al., 1998). Certaines de ces protéines sont également toxiques pour les nématodes et les acariens (Feitelson et al., 1992). Dans une récente étude, Knotze et al. (2005) se sont intéressés à la toxicité in vitro des spores bactériennes vis à vis des trois espèces majeures de nématodes des ovins (H. contortus, T. colubriformis et T. circumcincta). La mise en évidence d’un réel pouvoir destructeur vis à vis des stades larvaires, mais également contre les nématodes adultes, pourrait faire de cette bactérie une alternative aux méthodes de contrôle classiques comme les anthelminthiques. Toutefois, même si l’on sait que B. thuringiensis est capable de traverser le tractus digestif de nombreuses espèces de mammifères et donc de 28 Contexte bibliographique germer dans les cultures de matières fécales pour former des colonies produisant les inclusions parasporales toxiques (Lee et al., 2002), des investigations plus poussées sont nécessaires pour trouver une méthode d’administration in vivo compatible avec une survie de la bactérie dans l’environnement acide et donc hostile de la caillette des ruminants. 3.2. Augmenter la résistance de l’hôte 3.2.1. La vaccination *La vaccination contre Haemonchus contortus : La vaccination contre ce parasite hématophage a fait l’objet de nombreuses études et certains antigènes potentiellement protecteurs sont bien caractérisés à l’heure actuelle. Trois grandes catégories d’antigènes peuvent être utilisés comme antigènes vaccinaux : les antigènes issus d’homogénats totaux de vers, les enzymes protéolytiques et autres produits d’excrétionsécrétion (PSE) de vers adultes ou de larves, et les antigènes dits « cachés », correspondant le plus souvent à des protéines du tractus digestif du parasite avec lesquelles le système immunitaire de l’hôte n’est pas directement en contact. ♣Homogénats totaux des vers Ces antigènes sont obtenus par gel filtration d’homogénats de vers entiers. Une fraction contenant des antigènes de faible poids moléculaire induit un fort niveau de protection chez des ovins préalablement infestés avec 20,000 larves infestantes d’H. contortus. Cet essai de vaccination a permis de réduire de 99,9% l’excrétion fécale d’œufs du parasite et de 97,6% le nombre total de vers retrouvés dans la caillette, par rapport à des ovins non vaccinés ou auxquels seul l’adjuvant avait été administré (Schallig et van Leeuwen, 1997). Toutefois, la protection conférée par ces antigènes n’était pas totale puisque un ovin sur les quatre vaccinés n’était pas protégé. ♣Enzymes protéolytiques et produits d’excrétion-sécrétion Deux protéines majeures, respectivement de 15 et 24 kDa, ont été caractérisées, isolées et produites sous forme de protéines recombinantes (Schallig et al., 1997a). La vaccination d’ovins adultes avec ces protéines a permis de réduire de plus de 70% l’excrétion fécale et le nombre total de vers (Schallig et al., 1997b). La fonction biologique de la protéine de 15 kDa n’est pas établie, mais se rapproche de deux antigènes de 11 et 30 kDa isolés dans les PES de 29 Contexte bibliographique T. colubriformis, qui confèreraient une protection significative chez le cobaye (Savin et al., 1990 ; Dopheide et al., 1991). La protéine de 24 kDa, uniquement détectée dans les stades adultes, immatures et L4, serait produite dans l’œsophage du parasite et aurait un rôle dans la phase d’alimentation (Takats et al., 1995). La protection induite après immunisation avec ces deux protéines (15 et 24 kDa) est âgedépendante : les ovins de 6 et 9 mois d’âge ont une réduction significative du nombre total de vers (respectivement 77 et 82%) après vaccination, alors que l’on observe aucune réduction de la charge parasitaire chez des ovins de 3 mois (Vervelde et al., 2001). ♣Les antigènes « cachés » Un antigène caché est défini comme un antigène non reconnu par l’hôte après infection. Les hôtes ne sont généralement pas exposés aux protéines de la membrane digestive des nématodes gastro-intestinaux. Cependant, si ces nématodes sont hématophages, comme H. contortus, la surface intestinale du parasite peut être exposée aux immunoglobulines de l’hôte et donc potentiellement à des anticorps spécifiquement dirigés contre ses propres constituants (Knox et al., 2003). L’utilisation de protéines de la membrane digestive a été utilisée pour la première fois dans des essais de vaccination contre les tiques et a permis l’obtention d’un vaccin contre Boophilus microplus (Willadsen et al., 1995). La même approche a permis de mettre en évidence plusieurs antigènes de la membrane digestive d’H. contortus, dont l’utilisation vaccinale est prometteuse. La plupart de ces antigènes ont été identifiés comme des enzymes impliquées dans la digestion du sang. L’activité de certaines enzymes peut être inhibée par des anticorps vaccinaux in vitro (Smith et al., 1997). Ce même mécanisme semble également efficace in vivo : il est possible que l’accumulation de complexes antigène/anticorps à la surface intestinale du ver agisse comme une barrière contre l’absorption des nutriments (Munn et al., 1987 ; Newton et Munn, 1999), conduisant alors à une privation alimentaire du parasite, à une réduction de la ponte par les femelles et à l’incapacité de résister aux contractions péristaltiques intestinales d’où une élimination physique des vers. L’établissement des larves infestantes n’est en revanche pas diminuée (Smith et Smith., 1993). L’immunité conférée par les antigènes cachés n’interfère pas avec l’immunité naturelle acquise contre le parasite (Smith et Smith, 1993). De même, la réponse vaccinale n’est pas entretenue par les infestations naturelles, ce qui rend les rappels indispensables au maintien d’une bonne immunisation. 30 Contexte bibliographique Le tableau n°6 présente les différents antigènes de membrane digestive identifiés chez H. contortus, ainsi que leurs caractéristiques biochimiques et le degré de protection obtenu dans différentes études. L’antigène H11 est celui qui a fait l’objet du plus grand nombre d’études et reste à ce jour le meilleur immunogène connu issu d’un nématode parasite. Il est clair que des progrès substantiels dans l’élaboration de vaccins basés sur des antigènes exprimés par la membrane digestive d’H. contortus ont été obtenus au cours des dernières décennies avec d’excellents niveaux de protection démontrés lors d’études sur le terrain. Toutefois, à l’heure actuelle, aucun vaccin commercialisable n’a vu le jour en raison notamment des difficultés d’obtention à large échelle de ces antigènes, soit sous forme native, soit sous forme de protéines recombinantes (Knox et al., 2003). Le facteur majeur déterminant la production de masse puis la commercialisation d’un vaccin issu de la technologie des protéines recombinantes, comme des stratégies d’atténuation ou d’inactivation de la virulence, est son coût de production. Cette constatation est particulièrement vraie pour la production de protéines recombinantes. Les systèmes de production procaryotes telles que les levures (Saccharomyces cerevisiae) ou les bactéries (E. coli) ont l’avantage de produire des protéines en grande quantité, mais l’inconvénient d’entraîner des glycosylations parfois très différentes de celles pratiquées par les parasites. L’immunogénicité de ces protéines recombinantes en est alors très diminuée. Pour remédier à ce problème, de nouveaux systèmes eucaryotes de production de protéines recombinantes ont vu le jour notamment avec Caenorhabditis elegans (Newton et Meeusen, 2003). Si la conformation et la glycosylation des protéines obtenues par cette approche alternative sont plus proches de celles des parasites cibles (Haslam et al., 1996), le rendement reste toutefois nettement inférieur à celui des systèmes procaryotes et, par conséquent, les coûts de production largement supérieurs. Une autre alternative à cette approche est de développer des lignées cellulaires du nématode parasite lui-même (Newton et Meeusen, 2003). Coyne et Brake (2001) ont créé une lignée cellulaire dérivée de larves infestantes d’H. contortus, maintenue in vitro pendant une période prolongée (>48 mois). Les antigènes obtenus à partir de cette lignée ont montré un pouvoir protecteur chez des ovins vaccinés (60% de réduction du nombre total de parasites dans la caillette). 31 Contexte bibliographique Nom de l’antigène Caractéristiques Activité Immunoprotection Immunogène isolé d’un nématode parasite le plus efficace à ce *Aminopeptidase jour microsomale (activités A et Forts niveaux de protection avec réduction de plus de 90% de Glycoprotéine membranaire de 110 kDa exprimée par M) l’excrétion fécale et de plus de 80% du nombre total de vers H11 les microvillosités intestinales des stades parasitaires *Homologues identifiés chez Permet d’éviter le « periparturient rise » observé chez les brebis T. circumcincta et O. gestantes et de protéger les agneaux nés de mères vaccinées ostertagi (transfert de l’immunité par le colostrum) Complexe natif d’environ 1000 kDa, comprenant 4 zones protéiques majeures (environ 230, 170, 45 et <35 kDa) ; activité protectrice altérée lorsque le complexe est dissocié. Expression par parasites *Aspartylprotéase (activité H-Gal-GP (Haemonchus adultes. hémoglobinase possible) Agneaux âgés de 6 mois : réduction de 93% de l’excrétion fécale et de 72% du nombre total de vers galactose-containing Contient des métalloprotéases 1 à 4 (3 nécessaire pour *Métalloprotéase glycoprotein complex) la protection), des molécules pepsinogène et *Cystéine protéase thrombospondine like (contribution +/- à la protection), des galectines et cystatine (absence de contribution à la protection). Protéine d’environ 60 kDa, entre dans la composition Agneaux âgés de 48-150 jours : réduction de 78% du nombre des filaments hélices du glycocalyx des microvillosités ? Contortine total de vers intestinales Agneaux âgés de 5 mois : réduction de 78% de l’excrétion Glycoprotéines membranaires de 46 et 52 kDa ? p46 et p52 fécale et de 33% du nombre total de vers *Cystéine protéase Thiol sepharose Produits des gènes hmcp 1, 4 et 6 (expression Agneaux (âge ?) : réduction de 77% de l’excrétion fécale et 47% prédominante binding proteins survenant lorsque le parasite devient hématophage) du nombre total de vers (TSBP) *Glutamate deshydrogénase Références Smith et al., 2001 Munn et al., 1997 Kabagambe et al., 2000 Smith et al., 1993 Andrews et al., 1995 Newlands et al., 1999 Smith et al., 1999 Smith et al., 1994 Munn et al., 1987 Jasmer et al., 1993 Knox et al., 1999 Skuce et al., 1999a et b Tableau n°6 : Principaux antigènes dérivés de la membrane digestive d’H. contortus, caractéristiques et degré de protection obtenus lors d’essais vaccinaux. 32 Contexte bibliographique *La vaccination contre Trichostrongylus colubriformis : Contrairement à H. contortus, très peu de données existent sur la vaccination des ovins contre les autres nématodes gastro-intestinaux et, en particulier, T. colubriformis (Emery, 1996). Plusieurs antigènes d’excrétion-sécrétion issus de larves ou de vers adultes de T. colubriformis ont toutefois été identifiés et isolés. C’est le cas de plusieurs antigènes de 11, 17, 30 et 37 kDa isolés à partir de PES de vers adultes, qui conféreraient une immunité protectrice de plus de 50% chez le cobaye (Savin et al., 1990 ; Dopheide et al., 1991 ; Frenkel et al., 1992). Chez le même hôte, un résidu de 94 kDa isolé de PES de larves L3 a donné une protection variable de 30 à 50% chez le cobaye (O’Donnell et al., 1989a). Une tropomyosine de 41 kDa isolée dans les mêmes conditions a permis d’obtenir des niveaux de protection similaires, toujours chez le cobaye (O’Donnell et al., 1989b). Cependant, les études dans l’espèce ovine restent très limitées et les essais d’immunisation sont en général cantonnés à des infestations expérimentales répétées avec des parasites vivants (et parfois tronquées) terminées par un traitement anthelminthique (Stankiewicz et al., 1996 ; McClure et al., 1998). 3.2.2. Interactions nutrition-parasitisme La régulation des populations de nématodes chez les ovins est un phénomène complexe, influencé par de nombreux facteurs, comme l’âge des animaux, leur race, leur statut immunitaire et leur statut nutritionnel. L’interaction entre le parasitisme et la nutrition peut être considérée sous deux aspects intrinsèquement liés : l’influence du parasite sur le métabolisme de l’hôte et l’effet de la nutrition de l’hôte sur les populations de parasites (Coop et Holmes, 1996). Chez les ruminants, l’infestation par des nématodes gastro-intestinaux est à l’origine (i) d’une diminution de l’ingestion volontaire de la ration, (ii) d’une malabsorption et d’une maldigestion des nutriments et (iii) d’une ré-orientation de l’anabolisme vers le maintien de l’homéostasie tissulaire et sanguine (Coop et Holmes, 1996 ; Coop et Kyriazakis, 1999 et 2001). Les déficits engendrés par les nématodes gastro-intestinaux sont principalement de nature protéique (Bown, et al., 1991). Une amélioration des apports protéiques, de façon quantitative ou qualitative, pourrait permettre aux animaux infestés de couvrir ces besoins supplémentaires. Plus récemment, l’incorporation de fourrages bio-actifs, et plus particulièrement des plantes riches en tannins, a été envisagée. En protégeant les protéines de la ration des dégradations ruminales et en favorisant leur absorption par l’intestin, ces composés contribueraient indirectement à une meilleure réponse face aux nématodes parasites du tractus digestif (Jones 33 Contexte bibliographique et Mangan, 1977). Une action anti-parasitaire directe de ces plantes est également suspectée (Athanasiadou et al., 2000 et 2001). De nombreuses plantes contiennent des mélanges complexes de tannins condensés et hydrolysables, dont la teneur varie en fonction des espèces et variétés végétales, de la partie végétale considérée, de leurs stades végétatifs et de conditions environnementales (Tableau n°7). Teneur en tannins condensés (en Espèces végétales Dénomination Légumineuses tempérées Lotus corniculatus (lotier corniculé) g/kg de matière sèche) Lotus pedunculatus (lotier des marais ou pédonculé) Onychobrychis viciifolia (sainfoin) Hedysarum cornarium (sulla) Légumineuses tropicales Plantes herbacées 48 77 29 51-84 Medicago sativa (luzerne) 0.5 Trifolium repens (trèfle rampant) 1.7 Lespedeza cuneata (Lespedeza de Chine) 46 Leucanea diversifolia 96 Desmodium ovalifolium 232 Lolium perenne (ray-grass) 1.8 Chicorium intybus (chicorée) 3.1 Tableau n°7 : Quelques exemples de plantes et leur teneur en tannins condensés (d’après Min et Hart, 2002). Les effets des tanins condensés sur le parasitisme gastro-intestinal ont été étudiés chez des ovins infestés de façon naturelle ou expérimentale. L’ingestion de légumineuses contenant ces molécules a été associée à de meilleures résistance et résilience aux strongles gastrointestinaux (Niezen et al., 1994, 1995, 1998a et b ; Robertson et al., 1995 ; Marley et al., 2003). La consommation de plantes riches en tannins par des moutons infestés par des Trichostrongles du tractus digestif a été corrélée dans la majorité des cas à une diminution de l’excrétion fécale des œufs, ainsi qu’à une diminution de la charge parasitaire totale. Par contre, la fécondité des femelles nématodes ne semble pas affectée par l’ingestion de tannins condensés. Certaines plantes diminueraient significativement le rendement d’éclosion des œufs ainsi que le développement larvaire dans les matières fécales (Niezen et al., 2002). 34 Contexte bibliographique 3.2.3. La sélection de la résistance aux nématodes gastro-intestinaux L’utilisation d’animaux génétiquement résistants représente une approche séduisante pour réduire considérablement l’utilisation des anthelminthiques et freiner la diffusion de la chimiorésistance dans les populations parasitaires. D’un point de vue épidémiologique, la sélection d’animaux résistants offre l’avantage de diminuer l’excrétion fécale d’œufs et par conséquent la contamination du pâturage (Barger, 1989). *Définition de la résistance et de la résilience : La résistance des ovins aux nématodes gastro-intestinaux est définie comme la capacité de l’hôte à réguler l’installation, le développement, la fécondité et la survie des nématodes (Douch et al., 1996a). La résilience est la capacité de l’hôte à maintenir son niveau de production tout en étant infesté (Albers et al., 1987 ; Bisset et al., 1994). Le terme de tolérance fait référence à l’aptitude de l’hôte à survivre malgré les infestations parasitaires. Ce terme ne doit toutefois pas être confondu avec la notion de tolérance immunologique, couramment employé pour définir l’absence de réponse paradoxale de l’hôte vis à vis d’antigènes du soi ou de la flore intestinale commensale (Baker, 1997). *Les bases de la résistance : La résistance est sous contrôle génétique (Wakelin, 1985 ; Gill, 1991 ; Bisset et al., 1996). Au sein d’une population d’hôtes, il existe une variabilité génétique sur laquelle la sélection naturelle peut agir en favorisant le succès reproductif de certains individus particulièrement bien adaptés à leur environnement (Kassai et Sréter, 1992). Les helminthes se répartissent dans une population d’hôtes selon une distribution agrégée qui suit une loi binomiale négative (Barger, 1985a ; Windon, 1990a) : une faible proportion d’animaux héberge la majorité de la population parasitaire tandis que la plupart des hôtes hébergent peu de parasites. Cette variabilité trouve son origine dans la différence de réponse immunitaire face aux infestations (Kassai et Sréter, 1992) mais aussi dans le caractère stochastique de l’ingestion des L3 sur le pâturage. La résistance semble indissociable de la réponse immunitaire mise en jeu lors d’infestations parasitaires. Ceci expliquerait que les ovins adultes ou âgés répondent plus efficacement et plus rapidement aux infestations parasitaires que les jeunes animaux (Gregg et al., 1978 ; Douch, 1988 ; Douch et Morum, 1993). Ainsi, la plupart des auteurs conçoivent la résistance 35 Contexte bibliographique en termes immunologiques (capacité d’acquérir et de « monter » une réponse immunitaire efficace contre les nématodes). Les variations de la résistance face aux strongles gastrointestinaux observées chez les ovins font donc appel à des notions quantitatives (degrés d’infestations variables selon les individus) et non à une notion du « tout ou rien » puisque la résistance absolue face aux strongles ne semble pas exister dans cette espèce animale. *Les races résistantes aux strongles gastro-intestinaux (variations entre races ovines) (Tableau 8A) : Les races ovines ne présentent pas toutes la même résistance aux parasites gastro-intestinaux, en particulier Haemonchus contortus, Teladorsagia spp et Trichostrongylus spp (Baker, 1997). Plusieurs races d’Afrique (Red Maasai, Djallonké, Sabi), des Caraïbes (Sainte Croix, Barbados Black Belly), des USA (Florida native, Navajo) et d’Inde (Garole) semblent être particulièrement résistantes aux strongles gastro-intestinaux. Les données chez les caprins sont nettement moins nombreuses et convaincantes. Mais là encore certaines races locales comme la « Small East African » ou la « West African Dwarf » semblent être également plus résistantes que les races européennes (Baker, 1997 et 1998). Il est intéressant de noter que la plupart des races connues pour leur résistance sont des races locales de milieu tropical, vraisemblablement soumises à une pression de sélection intense par les nématodes gastro-intestinaux (Baker, 1997). Les données obtenues proviennent de différentes expérimentations en infestations naturelles, ou en infestations expérimentales, uniques ou répétées. L’exposition préalable non contrôlée des animaux aux nématodes gastro-intestinaux dans la majorité des études rend l’interprétation de leur degré de résistance difficile. Toutefois, quelques études, peu nombreuses, semblent mettre en évidence l’existence de races ovines plus résistantes que d’autres dès la première exposition au parasite. Ainsi, les ovins de race Sainte-Croix ont une moindre excrétion fécale que celle des ovins de race Dorset, préalablement immunisés ou naïfs, lors de leur primo-infestation par H. contortus (Gamble et al., 1992). De même, chez les ovins de race Barbados Black Belly l’excrétion fécale des œufs d’H. contortus et de T. colubriformis est significativement inférieure à celle observée dans une race sensible (l’INRA 401) dès la première exposition aux parasites (Gruner et al., 2003). La résistance observée dans cette race a une origine génétique car les ovins issus du croisement entre les deux races ont une résistance intermédiaire (Gruner et al., 2003). 36 Contexte bibliographique TYPE D’INFESTATION ET LIEU DE L’ETUDE RACES ETUDIEES / SUJETS Maryland (Etats Unis) Sainte Croix et Dorset Agneaux Naturelle (pâture contaminée avec Hc) OPG Nombre total de vers Maryland (Etats Unis) Sainte Croix et Dorset Agneaux Expérimentale Ovins immunisés : 500 L3 Hc par jour / 5 jours / traitement / challenge avec doses identiques Ovins naïfs : challenge identique OPG Kenya Red Maasai et Dorper Louisiane (Etats Unis) Suffolk et Gulf Coast Native Texas (Etats Unis) Florida Native, Rambouillet, F1 et F2 Naturelle puis expérimentale (6,000 L3 Hc) OPG Nombre total de vers OPG Rambouillet > F1 > F2 > Florida Native Amarante et al. (1999) Nombre total de vers Rambouillet et F1 > F2 et Florida Native Ohio (Etats Unis) Exotiques (Sainte Croix, Barbados Black Belly et Florida Native) Locales (Finn-Dorset x Rambouillet) Croisées (1/2 exotiques – ½ locales) Naturelle (pâture contaminée avec plusieurs parasites dont Hc et Tspp dominants) OPG Nombre total de vers OPG significativement plus faibles chez les Florida Native Courtney et al. (1985) Nombre total de vers plus faibles chez les races exotiques Allemagne Rhön et Mérinoland Expérimentale (5,000 L3 Hc) OPG Nombre total de vers Ethiopie Horro et Menz Expérimentale (deux infestations avec Hc suivie d’une troisième avec Hc, Tc et L. elongata) OPG Nombre total de vers France Barbados Black Belly (BB), INRA 401 et F1 Ovins de 3.5 et 7 mois Expérimentale Hc, Tc et Oc (10,000 L3 / traitement AH / challenge avec 10,000 L3) OPG Nombre total de vers PARASITES Expérimentale (5,000 L3 Hc / traitement AH) puis naturelle (pâture contaminée avec Hc) Naturelle (pâtures différentes sur les 3 premières années puis pâture commune pendant 5 ans) Parasites dominants : Hc et Tspp PARAMETRES CONSIDERES OPG OPG CONCLUSIONS REFERENCE Ovins Ste Croix ont OPG et nombre total de vers significativement Gamble et al. (1992) inférieurs à ceux des Dorset 1ère infestation : pas de différences entre les deux races 2ème infestation : Ste Croix naïfs et Gamble et al. (1992) ovins des deux races immunisés ont OPG significativement inférieurs à ceux des Dorset naïfs OPG plus faibles chez les brebis Red Maasai que chez les Dorper, y compris Wanyangu et al. (1997) lors du periparturient rise OPG significativement plus faibles chez Miller et al. (1998) les ovins de race Gulf Coast Native OPG Rhön > OPG Mérinoland Pas de différences entre les deux races Gauly et al. (2002) en nombre total de vers Infestation 1 : OPG Menz > OPG Horro Infestations 2 et 3 : OPG idem ; charge Haile et al. (2002) parasitaire Hc Horro > Menz ; charge parasitaire Tc idem) OPG INRA 401 > F1 > BB (dès première infestation) Gruner et al. (2003) Nombre total vers F1 < INRA 401 (BB non disponibles) Tableau n°8A : Quelques études montrant la résistance entre races ovines face aux strongles gastro-intestinaux. AH : anthelminthique, Hc : Haemonchus contortus ; Tc : Trichostrongylus colubriformis, Tspp : Trichostrongylus spp. 37 Contexte bibliographique LIEU DE L’ETUDE Australie Australie Australie Australie Hongrie RACES ETUDIEES / SUJETS TYPE D’INFESTATION ET PARASITES Mérinos Expérimentale (15,000 L3 Hc, Brebis de 3 ans : brebis non 15,000 L3 Tc, 150,000 L3 Hc ou traitées comparées à brebis les deux) après exposition immunodéprimées à la naturelle faible dexaméthasone Mérinos Lignées de brebis IRH (Increased Resistance to Naturelle (pâture contaminée Haemonchus), DRH avec Hc) (Decreased resistance to Haemonchus) et contrôles (CH) Mérinos Agneaux nés soit de bélier Naturelle (pâtures contaminées résistant, soit de bélier avec Hc, Tc et Oc) sensible Mérinos Expérimentale (11,000 L3 Hc) 60 groupes d’agnelles demi-sœurs Expérimentale Mérinos Expérience 1 : double Lignées HR (highinfestation avec 7,000 L3 Hc responders) et LR (low Expérience 2 : double responders) infestation avec 15,000 L3 Tc PARAMETRESCONSIDERES CONCLUSIONS REFERENCE OPG Brebis Mérinos extrêmement résistantes à un challenge avec Hc Adams et al. (1990) ou Tc ou les deux, après exposition naturelle faible au pâturage OPG Brebis de lignée IRH ont un périparturient rise significativement Woolaston (1992) moins prononcé que les DRH ou les CH OPG Nombre total de vers Agneaux issus de bélier résistant ont OPG et nombre de vers plus faibles Gray et al. (1992) OPG Un groupe montre un fort niveau de résistance (bélier supposé porter un Albers et al. (1987) gène majeur de résistance) OPG OPG significativement plus faibles Sréter et al. (1994) chez ovins de lignée HR Tableau n°8B : Quelques études montrant la possibilité de sélectionner la résistance aux strongles gastro-intestinaux au sein d’une même race ovine. Hc : Haemonchus contortus, Tc : Trichostrongylus colubriformis, Oc : Ostertagia circumcincta 38 Contexte bibliographique *Sélection au sein d’une même race (Tableau 8B) : Il existe suffisamment de variation individuelle au sein d’une même race pour qu’une sélection génétique de la résistance aux nématodes gastro-intestinaux soit possible (Windon, 1996 ; Dominik, 2005). Ainsi, la sélection de lignées résistantes ou sensibles a été réalisée dans les races Romney (Bisset et al., 1991), Mérinos (Woolaston, 1992), Rhön (Gauly et Erhardt, 2001) ou Polish Long Wool (Bouix et al., 1998). Ces lignées divergentes sont fréquemment dénommées : - «high-responders» ou «increased resistance» pour les ovins identifiés comme résistants au sein d’une race - «low responders» ou «decreased resistance» pour les ovins considérés comme les plus sensibles au sein d’une race. *Identification des animaux résistants : La recherche de races résistantes comme la création de lignées divergentes au sein d’une race, posent le problème de l’identification du statut des individus d’une population (résistants ou sensibles). Il est donc nécessaire de définir quel(s) critère(s) ou caractère(s) doivent être sélectionnés. Ces critères sont regroupés sous le terme de marqueurs phénotypiques et sont à la base de la sélection phénotypique (individuelle ou généalogique). Le phénotype correspond à l’ensemble des caractéristiques d’un individu, que ce soit son apparence physique ou sa physiologie. Il est en partie déterminé par le fond génétique de l’individu, mais également par l’ensemble des facteurs environnementaux qui influent sur cet individu. Les marqueurs phénotypiques de résistance aux nématodes gastro-intestinaux peuvent être i) l’intensité de l’excrétion fécale des œufs de parasites, ii) la capacité à croître et à produire malgré une infestation parasitaire (dans ce cas, on parle plutôt de marqueurs de résilience), iii) l’intensité de la réponse immunitaire observée lors d’une infestation… ou la combinaison de plusieurs de ces marqueurs (Douch et al., 1996a). Idéalement, ces marqueurs doivent être faciles à mesurer, répétables et directement en rapport avec l’intensité du parasitisme. Ils doivent également permettre une mesure de la résistance, ou au moins une indication prédictive de celle-ci, qui soit indépendante à la fois de l’infection et des facteurs environnementaux (Windon, 1996). Pour finir, ces marqueurs doivent être héritables. L’héritabilité (h2) se définit comme la part de la variation phénotypique attribuable à la génétique ; elle s’exprime donc en valeur relative (comprise entre 0 et 1). Ainsi, plus sa valeur est élevée, plus le caractère étudié est sous 39 Contexte bibliographique dépendance génétique. On peut également la définir comme l’aptitude d’un caractère donné à se transmettre au cours des générations. Les niveaux d’héritabilité peuvent être divisés en trois grandes catégories : - h2 < 0,1 : Faible héritabilité : la variation du caractère phénotypique considéré est très peu influencée par la génétique et l’amélioration de celui-ci par un schéma de sélection sera très difficile car il existe peu de variabilité génétique dans la population. Dans ce cas, la sélection génétique est irréalisable. - 0,1 < h2 < 0,3 : Héritabilité modérée : le caractère est modérément influencé par la génétique mais il reste possible de différencier des animaux sur la base de celui-ci, même si le progrès génétique obtenu par la sélection sera lent. - h2 > 0,3 : Héritabilité forte : le caractère considéré est sous forte dépendance génétique ; les animaux à haut potentiel seront facilement ciblés dans la population d’origine et le progrès génétique escompté sera rapide. *Les marqueurs phénotypiques : Un grand nombre de paramètres parasitologiques, physiologiques ou immunologiques ont été testés comme marqueurs de résistance (Windon, 1990a ; Douch et al., 1996a). Ils peuvent être classés en marqueurs directs (ne nécessitant pas l’euthanasie des animaux) ou indirects (étudiés lors de programme de recherche puisque conditionnés par le sacrifice des animaux). ♣Marqueurs directs : Le caractère le plus fréquemment mesuré pour évaluer la résistance aux strongles gastrointestinaux est l’excrétion fécale des œufs de parasites (exprimée en nombre d’œufs par gramme ou OPG) (Kassai et Sréter, 1992 ; Douch et al., 1996a ; Baker, 1997). L’excrétion fécale des œufs de parasites est influencée par de nombreux facteurs : - le degré d’infestation de l’animal : même si les OPG semblent bien refléter la population parasitaire présente chez l’hôte (Douch et al, 1984), quelques réserves ont été émises sur son intérêt dans la recherche d’individus résistants (Gruner, 1991 ; Dargie, 1992) en raison notamment des phénomènes de densité-dépendance : la présence de très nombreux parasites chez un même animal peut conduire à une excrétion limitée d’œufs ; dans ce cas, les OPG ne 40 Contexte bibliographique sont pas représentatifs du nombre de vers présents chez l’hôte (Bishop et Stear, 2000) - la composition spécifique de la communauté de nématodes présente chez l’hôte - le stade d’infestation : l’excrétion fécale est nulle lors de la période pré-patente ou en période d’hypobiose - le statut immunitaire de l’hôte (influence sur le degré d’établissement larvaire, sur la fécondité des femelles…) - les facteurs diététiques et la gestion du pâturage - le statut physiologique de l’hôte et notamment la parturition chez les brebis. Enfin, les problèmes de stockage des matières fécales (incapacité de conserver des matières fécales sur de longues périodes) et l’impossibilité d’automatiser le comptage des œufs dans celles-ci représentent des inconvénients techniques non négligeables. Toutefois, la mesure de l’excrétion d’œufs reste le paramètre le plus utilisé à l’heure actuelle dans les schémas de sélection existants. Son héritabilité varie entre 0,2 et 0,4 selon les études. De nombreux autres marqueurs phénotypiques directs ont été évalués comme alternatives ou en complèment au dénombrement des œufs dans les matières fécales. Le comptage des polynucléaires éosinophiles circulants : l’éosinophilie sanguine et tissulaire est une caractéristique fréquemment observée chez les ovins en réponse à une infestation par des helminthes, en particulier avec les nématodes du tractus digestif (Schallig, 2000). Il semblerait que l’éosinophilie sanguine soit également inversement corrélée aux OPG (Buddle et al., 1992 ; Rothwell et al., 1993). Toutefois, des études ont démontré que le dénombrement des éosinophiles sanguins ne présentait aucun avantage par rapport aux OPG, puisque l’héritabilité estimée de ce paramètre n’est d’environ que de 0,2 (Dawkins et al., 1989 ; Woolaston et al., 1996). De plus, sa spécificité est relativement faible : l’éosinophilie sanguine peut être influencée par des infestations parasitaires autres que les strongyloses gastro-intestinales, par des phénomènes allergiques ou lors de syndromes éosinophiliques. Enfin, l’éosinophilie sanguine n’est pas un parfait reflet de l’éosinophilie tissulaire, car de faibles comptages d’éosinophiles sanguins peuvent être liés soit à une baisse de production de précurseurs par la moelle osseuse, soit à un recrutement tissulaire massif (Douch et al., 1996a). 41 Contexte bibliographique Les produits des mastocytes muqueux : l’hyperplasie des mastocytes muqueux et des globules leucocytes (considérés à l’heure actuelle comme des mastocytes intra-épithéliaux dégranulés) est également l’une des caractéristiques rencontrées dans les strongyloses du tractus digestif (Schallig, 2000). Leur localisation tissulaire ne permet pas leur dénombrement direct. Leur nombre peut être estimé de façon indirecte par le dosage des produits qu’ils libèrent dans la circulation générale lorsqu’ils sont activés : leucotriènes, histamine et protéinases (SMCP : sheep mast cell proteinases). Toutefois, même si les quantités de ces produits sont plus élevés dans la circulation générale lors d’infestation par les nématodes gastro-intestinaux (à l’exception des leucotriènes), ils ne semblent pas refléter les niveaux observés dans les tissus parasités (Douch et al., 1984) et donc n’apporteraient aucun avantage par rapport à la mesure de l’excrétion d’œufs. L’hématocrite : l’estimation du volume relatif de globule rouges dans le sang permet de quantifier l’anémie chez les ovins et pourrait représenter un bon indicateur de résistance aux parasites internes à condition que ceux-ci soient hématophages comme H. contortus, ce qui restreint son utilisation. De plus, les variations physiologiques de l’hématocrite en fonction des races ovines en font un marqueur phénotypique controversé. Réponses anticorps sériques spécifiques d’antigènes parasitaires : le développement de tests ELISA ainsi que la disponibilité d’anticorps monoclonaux dirigés contre les différents isotypes des immunoglobulines ovines a permis d’étudier la dynamique des anticorps dans le sérum des ovins en réponse aux infestations par les nématodes gastro-intestinaux (Beh, 1987 et 1988 ; Dawkins et al., 1988). Les lignées ovines sélectionnées pour leur résistance ou leur sensibilité aux infestations par les nématodes ont permis de comparer l’intensité des réponses anticorps sériques comme indicateurs potentiels de résistance (Gill, 1991 ; Douch et al., 1996a). Autres marqueurs phénotypiques directs : - le type d’hémoglobine (les ovins possédant une hémoglobine de type AA seraient plus résistants et auraient des excrétions d’œufs plus faibles que les ovins ayant une hémoglobine de type BB ou AB (Windon, 1990a)), - les antigènes lymphocytaires ovins ou OVA (les ovins high-responders porteraient plus fréquemment les allèles SY1a et SY1b alors que les low 42 Contexte bibliographique responders porteraient plutôt l’allèle SY2 (Outteridge et al., 1985, 1986 et 1988)). ♣Marqueurs indirects : Le paramètre de référence pour évaluer le degré de résistance des ovins aux strongles gastrointestinaux reste certainement le nombre total de vers présents chez l’hôte. Son évaluation est toutefois indissociable du sacrifice de l’animal, ce qui est totalement inconciliable avec un quelconque schéma de sélection à grande échelle (Kassai et Sréter, 1992). L’étude des réponses cytokiniques à l’échelle des tissus parasités, comme l’estimation de la réponse humorale locale, sont également le plus souvent conditionnées par des analyses post mortem et ne sont pas applicables, hormis dans des programmes de recherche, et sont limités à un nombre restreint d’animaux (Kassai et Sréter, 1992). *La sélection génétique : La variabilité génétique entre les individus d’un troupeau a été utilisée en vue d’une sélection d’ovins résistants en Australie (Windon, 1990a ; Windon et al., 1993 ; Woolaston and Eady, 1995), et en Nouvelle-Zélande (Bisset et al., 1991 ; Morris et al., 1995). Ces programmes de sélection ont pour objectifs: - d’estimer les corrélations entre la résistance aux nématodes et les paramètres de production, - de comprendre les mécanismes de résistance sous contrôle génétique, - d’identifier des marqueurs phénotypiques et génétiques associés à la résistance afin de les inclure dans des programmes de sélection commerciaux, - d’évaluer la spécificité de sélection. La sélection génétique d’ovins résistants aux nématodes gastro-intestinaux peut être envisagée selon trois approches différentes : - une approche polygénique - une approche oligogénique - une approche monogénique 43 Contexte bibliographique La sélection selon un modèle polygénique : Dans le modèle polygénique, on considère que les phénotypes observés résultent de l’expression d’une infinité de gènes, dont les effets individuels, faibles, s’additionnent pour donner le phénotype étudié, et auxquels s’ajoute un effet du milieu dans lequel les animaux évoluent. Cette sélection n’est évidemment possible qu’à partir de paramètres dont l’héritabilité est élevée. C’est une méthode relativement simple, également lente mais qui offre les avantages d’un possible retour en arrière et d’une estimation du progrès génétique au cours des années. La plupart de ces programmes expérimentaux de sélection mis en place sont basés sur cette approche. Ils font appel à la sélection phénotypique des animaux et à la création de lignées ovines divergentes, le plus fréquemment sur la base de l’excrétion d’œufs dans les matières fécales (Windon, 1996). La sélection selon un modèle oligogénique ou monogénique : Il peut être parfois avantageux de prendre en compte dans la sélection, en plus du fond polygénique habituel, l’existence d’un (modèle monogénique) ou plusieurs gènes (modèle oligogénique) ayant un effet individuel « fort » sur le caractère étudié (Le Roy et Elsen, 2000). La recherche de tels gènes a été entreprise depuis plus de 10 ans, mais elle est récemment devenue plus efficace grâce à l’établissement de cartes génétiques pour les espèces d’élevage. Une démarche de recherche systématique a alors pu être mise en œuvre, l’ensemble du génome étant alors balayé pour détecter les zones influençant le caractère : les Quantitative Trait Loci (QTL) (Goffinet et al., 1994 ; Dominik, 2005). La complexité des processus physiologiques suggèrent qu’un nombre important de gènes est impliqué dans les mécanismes de résistance aux nématodes (Dominik, 2005). Une grande partie de l’information sur la résistance aux nématodes gastro-intestinaux a été obtenue à partir de modèles murins (Behnke et al., 2003). La différence de sensibilité entre les hôtes peut être expliquée par des variations alléliques des gènes de la réponse immunitaire et/ou des voies de signalisation intra-cellulaire. Dans un modèle murin avec des souris F2 issues d’un croisement entre une lignée résistante (SWR) et une lignée sensible (CBA), infestées par Heligmosomoïdes polygyrus, une première étude a permis la mise en évidence de 7 QTL sur 6 chromosomes différents (1, 2, 8, 13, 17 et 19) (Iraqi et al., 2003), associés au contrôle de la survie des vers (nombre total de parasites à l’autopsie) et de leur fécondité (OPG). Cette étude a été complétée par la recherche, dans le même modèle, de QTL influençant la réponse immunitaire vis à vis de H. polygyrus (Menge 44 Contexte bibliographique et al., 2003). Quatre caractères ont été pris en compte : les niveaux sériques de MMCP1 (mucosal mast cell protease 1), d’IgG1, d’IgE et la formation de granulomes tissulaires associés à l’infestation. Des QTL associés à ces caractères ont été détectés sur plusieurs chromosomes, dont les chromosomes 1 (récepteurs du CD28 et de l’IL-1), 12 (chaînes lourdes des immunoglobulines), 13 (chaîne γ du T-cell recepteur), 17 (porteur du complexe majeur d’histocompatibilité ou CMH, du TNFα), suggérant l’implication possible de ces différents gènes dans le contrôle de la résistance au parasitisme. L’intérêt du modèle H. polygyrus chez la souris est qu’il est très proche des infestations par les Trichostrongylidés chez les animaux de rente. La recherche d’homologies entre les espèces de rente et la souris pourrait permettre la mise en évidence de gènes d’intérêt chez les ovins (Iraqi et al., 2003 ; Menge et al., 2003). Chez ces derniers hôtes, les résultats de recherche de QTL liés à la résistance aux nématodes gastro-intestinaux (Sonstegard et Gasbarre, 2001 ; Dominik, 2005) ont souvent été contradictoires. Ces différences trouvent probablement leur explication dans la diversité des protocoles expérimentaux mis en œuvre (différentes races ovines, différentes espèces de parasites utilisées, différents modes d’infestation, différents caractères de résistance étudiés et plusieurs approches analytiques pour la recherche de QTL) (Dominik, 2005). Des zones chromosomiques d’intérêt ont été détectées sur le chromosome 1 (Beh et al., 2002 ; DiezTascon et al., 2002), sur le chromosome 6 (Beh et al., 2002), mais également sur les chromosomes 3 et 20. Ces deux chromosomes sont porteurs respectivement des régions de l’IFNγ et du CMH. Dans des lignées divergentes d’ovins de race Romney, Paterson et al. (2001) ont détecté 5 QTL dans la région de l’IFNγ, en relation avec l’intensité de l’excrétion d’œufs. De même, une étude des niveaux d’IgA sériques mesurés après une infestation avec T. circumcincta sur des ovins de race Soay, a établi une association significative avec le premier intron de la région de l’IFNγ (Coltman et al., 2001). Cette zone chromosomique est ainsi la seule à avoir été identifiée dans plusieurs études (Beh et al., 1998 ; Crawford, 1998 ; Crawford et McEwan, 1998) chez les ovins, mais également chez l’homme lors d’infestation par Schistosoma mansoni (Quinnell, 2003). Des associations significatives entre divers caractères phénotypiques et la région du CMH II sur le chromosome 20 ont également été mises en évidence dans plusieurs travaux : associations entre les OPG lors d’infestation par T. circumcincta et le locus DRB1 du CMH (Schwaiger et al., 1995 ; Stear et al., 1996), associations similaires entre OPG et CMH (Feichtlbauer et al., 1998 ; Paterson et al., 1998 ; Charron et al., 2000). Toutefois, ces 45 Contexte bibliographique associations doivent être considérées avec précaution puisque d’autres travaux évoquent aucune ou une très faible influence du locus CMH sur les OPG chez les ovins (Hohenhaus et Outteridge, 1995 ; Crawford et al., 1997) ou chez la souris (Wakelin, 1988). Lorsque les gènes de résistance et leurs fonctions seront identifiés, de nouvelles avancées dans la compréhension des bases moléculaires de la résistance de l’hôte aux nématodes gastro-intestinaux seront possibles et auront d’importantes applications pour le développement de nouvelles stratégies de contrôle. Une approche récente (DNA Micro-array) devrait également contribuer à la découverte de gènes candidats impliqués dans cette résistance (Diez-Tascon et al., 2005). Intérêts de la sélection génétique : L’intérêt de la sélection génétique est double car elle induit : (i) une réduction durable de la contamination des pâtures. Une étude menée en Australie pendant 224 jours sur des jeunes ovins de race Mérinos, infestés par H. contortus, a démontré l’efficacité de la sélection d’ovins résistants. Les résultats indiquent que l’effet le plus large et le plus persistant sur l’excrétion fécale est obtenu par cette sélection (diminution de 69% des OPG), en comparaison avec une supplémentation protéique (diminution de 35% des OPG), un traitement anthelminthique à base de closantel et d’ivermectine (diminution de 28% des OPG) ou à une vaccination expérimentale des agneaux (aucun effet sur les OPG) (Eady et al., 2003). (ii) une résistance étendue à un groupe d’espèces proches. La résistance à T. circumcincta semble ainsi associée à une meilleure résistance à H. contortus (Scrivner, 1967) ; de même, la résistance à T. colubriformis semble corrélée à un certain degré de résistance à T. rugatus, T. axei, T. circumcincta, et, à un degré moindre, à H. contortus (Kassai et Sréter, 1992). Les limites de la sélection génétique : La sélection de la résistance aux strongles gastro-intestinaux ne pourrait-elle pas augmenter la sensibilité à d’autres pathogènes, viraux ou bactériens par exemple (Kassai et Sréter, 1992) ? Pour cela, les schémas de sélection basés sur des programmes de sélection polygénique offrent l’avantage d’une sélection relativement lente permettant de détecter précocement la sélection de caractères non souhaitables, avec un retour en arrière possible. 46 Contexte bibliographique Toutefois, le risque majeur réside dans l’apparition de communautés de parasites adaptées à des hôtes résistants (Kassai et Sréter, 1992 ; Beh et Maddox, 1996). La forte variabilité génétique des nématodes gastro-intestinaux, leur grand potentiel de reproduction et leur temps de génération relativement court ont déjà permis l’extension de la résistance aux molécules anti-parasitaires. Ces mêmes causes pourraient entraîner une adaptation des parasites à des hôtes sélectionnés pour leur résistance. Deux études de passages en série d’H. contortus sur des ovins immunisés n’ont pas permis de montrer une adaptation de ce parasite à des hôtes résistants (Adams, 1988 ; Albers et Burgess, 1988). De même, les passages en série (10 générations) de lignées d’H. contortus sur des ovins jumeaux monozygotes rendus résistants, ou sensibles par un traitement immuno-dépresseur, n’ont pas mis en évidence de différences dans les traits de vie des lignées parasitaires (Saulai et al., 2001). En revanche, certains auteurs font état d’un pouvoir infestant accru des larves de T. colubriformis issues d’animaux résistants (Windon, 1990b). Conséquences économiques de la sélection génétique : La résistance aux nématodes gastro-intestinaux ne semble pas avoir d’effets défavorables sur la productivité des animaux. Au contraire, les bénéfices de cette sélection devraient être d’autant plus importants que la pression d’infection est élevée : les animaux les plus résistants survivraient plus facilement dans un environnement infesté et auraient donc des pertes de production moins importantes. Les conséquences éventuelles de la sélection génétique sur la fertilité des animaux semblent par contre plus conflictuelles. En effet, une étude a montré une association négative entre la fertilité des brebis et la résistance (Piper, 1987). Néanmoins, en l’absence de données plus étayées, cette association mérite d’être ré-évaluée. Enfin, la réduction de 50 à 95% des OPG dans des troupeaux d’ovins sélectionnés pour leur résistance aux nématodes gastro-intestinaux a évidemment d’importantes conséquences en termes d’épidémiologie des infestations parasitaires : l’accumulation de larves infestantes sur les pâtures est réduite de façon durable, ainsi que les risques de pertes économiques ou de maladie clinique (Windon, 1990b). Ainsi, il est probable que l’exclusion des béliers et brebis « low-responders » des programmes de sélection devrait améliorer considérablement la situation épidémiologique. 47 Contexte bibliographique Les possibilités réduites de commercialisation de nouvelles molécules anthelminthiques efficaces dans un avenir proche rendent urgentes la recherche de méthodes alternatives ou complémentaires au traitement chimique pour la lutte contre les nématodes gastrointestinaux. Parmi ces méthodes, certaines sont lourdes à appliquer (gestion raisonnée des pâturages) ou encore cantonnées à des programmes de recherche expérimentaux et non utilisées à grande échelle (utilisation de champignons ou bactéries nématophages). D’autres méthodes alternatives semblent toutefois prometteuses : vaccination des animaux avec des antigènes parasitaires ou sélection d’animaux résistants aux strongles gastro-intestinaux. Là encore, les essais expérimentaux n’ont pas permis de développer des vaccins commercialisables et utilisables sur le terrain, et les programmes de sélection d’animaux résistants ne sont appliqués que dans certains pays comme l’Australie ou la Nouvelle-Zélande. Le frein majeur de l’utilisation de ces méthodes alternatives reste toutefois la méconnaissance des interactions hôte/nématodes et en particulier la réponse immunitaire des ovins face aux strongles gastro-intestinaux. 48 Contexte bibliographique 4. LA REPONSE IMMUNITAIRE DES OVINS FACE AUX STRONGLES GASTRO-INTESTINAUX 4.1. Organisation générale de la réponse immunitaire Il existe deux grandes composantes de la réponse immunitaire (Janeway, 2001a ; Goldsby et al., 2003 ; Tosi, 2005) : - la réponse immunitaire innée dans laquelle des mécanismes non spécifiques contre un pathogène sont rapidement mis en œuvre. L’immunité naturelle n’est pas toujours suffisante pour éliminer le pathogène, mais elle est indispensable pour mener à bien une première défense en attendant que l’immunité adaptative prenne le relais. - la réponse immunitaire adaptative, dans laquelle des réponses plus tardives et très spécifiques du pathogène rencontré sont mises en jeu. Cette réponse présente à la fois un haut degré de spécificité ainsi que la remarquable propriété de « mémoire » : la ré-exposition à un même antigène a pour conséquence une réponse mnémonique plus rapide et souvent plus efficace pour neutraliser l’agent pathogène en cause. Après une brève présentation de la réponse immunitaire innée, nous nous attacherons plus spécifiquement, dans ce chapitre, aux mécanismes de la réponse immunitaire adaptative, composante essentielle de la réponse face aux strongles gastro-intestinaux et objet de nos travaux de recherche. 4.2. La réponse immunitaire innée L’immunité naturelle représente la première ligne de défense de l’hôte face à un agent pathogène. Au niveau du tractus gastro-intestinal, cette ligne de défense est assurée par : - des moyens non immunologiques : l’épithélium digestif représente une barrière physique qui peut prévenir l’invasion par des organismes pathogènes ; cette barrière est également renforcée par le renouvellement rapide de cet épithélium, les sécrétions muqueuses présentes à sa surface (mucines en particulier), ainsi que le péristaltisme intestinal qui aident à l’expulsion des agents pathogènes (Béné et Faure, 2000 ; Basset et al., 2003 ; Sansonetti, 2004), - des moyens immunologiques complexes, véritables bases de l’immunité innée. 49 Contexte bibliographique Le système immunitaire inné repose sur une série de récepteurs (PRR : pattern recognition receptors, dont les Toll-like receptors ou TLR) qui reconnaissent des patterns moléculaires conservés, trouvés seulement chez les micro-organismes (PAMPs pour pathogen-associated molecular patterns) (Medzhitov et Janeway, 1998 ; Clark et Kupper, 2005). Les PRR ont été initialement définis comme des récepteurs de surface des cellules de l’immunité innée, mais cette définition a été étendue aux molécules sécrétées ou produites localement, qui initient de nombreuses étapes de l’inflammation (Janeway et Medzhitov, 2002). Du fait que les PAMPs ne sont produits que par des micro-organismes et non par l’hôte, leur reconnaissance par les PRR signale la présence de pathogènes. Cette reconnaissance permet alors d’activer directement les mécanismes de la réponse immunitaire innée, comme la phagocytose (rôle des monocytes, macrophages et polynucléaires neutrophiles), l’activation du système du complément, l’induction de la synthèse de peptides anti-microbiens, l’induction de la nitric oxyde synthétase dans les macrophages, la synthèse et la sécrétion de cytokines par les macrophages, la lyse des cellules infectées par les cellules Natural Killer (NK)… L’ensemble de ces mécanismes permet de détruire les cellules infectées par le microorganisme pathogène ou le pathogène lui-même (Figure n°4). Figure n°4 : Schématisation de la réponse immunitaire innée (d’après Tosi, 2005). Le contact initial entre l’hôte et un micro-organisme microbien, ou ses produits, résulte en une série de signaux d’activation qui mobilisent à la fois des effecteurs cellulaires et humoraux contre leur cible finale. Les composantes de la réponse de l’hôte sont figurées en grisé. Abréviations : TLR : Toll-like Receptor, Mφ : macrophages, AP : voie alterne du complément, MBLP : voie des lectines liées au mannose, MAC : complexe d’attaque des membranes). 50 Contexte bibliographique Dans le domaine des parasites métazoaires, le rôle de l’immunité innée est mal connu, même s’il est probable. En effet, des composés glycoconjugués immunogènes produits par les schistosomes induisent des réponses immunitaires innées caractéristiques chez l’hôte infecté (Hokke et Yazdanbakhsh, 2005). Pour les strongles gastro-intestinaux, la compréhension des mécanismes d’activation précoce des voies de l’immunité, ainsi que la découverte de patterns moléculaires spécifiques de type PAMPs, devraient permettre de confirmer à l’avenir le rôle de l’immunité innée dans les mécanismes de réponse (Gause et al., 2003). Des TLR ou autres PRR capables d’identifier certaines caractéristiques des antigènes helminthiques existeraient (MacDonald et al., 2002). Dans une étude récente, Jackson et al. (2005) ont démontré une association positive entre la réponse TNF-α et le ligand bactérien du TLR4 (LPS : lipopolysaccharide) chez des enfants de l’archipel de Pemba Island (Tanzanie) fortement exposés à différents nématodes du tractus gastro-intestinal (Ascaris lumbricoïdes, Trichuris trichuria, Ankyslostomatidés). Les résultats de cette étude montreraient que les nématodes gastro-intestinaux modulent les réponses immunitaires innées et donc pourraient induire des mécanismes interférant avec les réponses vis à vis d’autres agents pathogènes, en particulier bactériens. 4.3. La réponse immunitaire adaptative Les études sur modèles murins infestés par différents nématodes gastro-intestinaux (Trichinella spiralis, Heligmosomoïdes polygyrus, Nippostrongylus brasiliensis et Trichuris muris) ont fourni beaucoup informations sur les mécanismes immunitaires mis en jeu dans les nématodoses gastro-intestinales et leur régulation (Finkelman et al., 1997). Ainsi, quatre grandes étapes de la réponse immunitaire adaptative dans les strongyloses du tractus digestif ont été proposées (Figure n°5) : 1 – Présentation des antigènes parasitaires aux lymphocytes T CD4+ 2 – Orientation de la réponse immunitaire dans l’une des deux grandes voies de polarisation : Th1 ou Th2 3 – Mise en place des effecteurs de l’immunité représentés par les cellules et les anticorps 4 – Conséquences sur les traits de vie des strongles gastro-intestinaux : installation des larves, développement chez l’hôte, fécondité des femelles, excrétion fécale des œufs, survie des vers adultes. 51 Contexte bibliographique Figure n°5 : Organisation générale de la réponse immunitaire adaptative (d’après C. Lacroux et dessiné par Y. Gras, ENVT). Dans la suite de ce chapitre, nous allons envisager successivement ces quatre grandes parties de la réponse immunitaire, en mettant l’accent sur les éléments connus dans les modèles murins ou les infestations naturelles chez l’homme, que l’on retrouve dans les strongyloses gastro-intestinales des ruminants (ovins en particulier). Cependant, de nombreuses inconnues subsistent chez les ruminants. Une dernière partie sera consacrée aux mécanismes de régulation de la réponse immunitaire. En effet les parasites ont la capacité d’inhiber certains mécanismes effecteurs de l’immunité, les protégeant ainsi d’une élimination physique (Maizels et Yazdanbakhsh, 2003). 4.3.1. Présentation des antigènes parasitaires et initiation de la réponse immunitaire adaptative L’événement essentiel de l’initiation des réponses immunitaires adaptatives est l’expansion clonale de lymphocytes T spécifiques et leur différenciation vers une fonction effectrice (Liu 52 Contexte bibliographique et Janeway, 1992). L’expansion de lymphocytes T CD4+ est induite par des cellules présentatrices d’antigènes (CPA) qui présentent des fragments peptidiques d’antigènes étrangers, liés aux molécules de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH II), aux récepteurs des lymphocytes T (TcR : T cell receptor). L’expansion clonale est également conditionnée par la délivrance de signaux de co-stimulation aux lymphocytes T par les CPA (Jenkins et al, 1987 ; Liu et Janeway, 1991). De nombreuses études indiquent que la stimulation de lymphocytes T matures via leur TcR en l’absence de signal de costimulation spécifique aboutit à une inactivation clonale sous la forme d’une anergie ou d’une mort cellulaire (Liu et Janeway, 1990). La première étape de cette initiation consiste en une capture des antigènes parasitaires par les cellules présentatrices d’antigènes situées dans la muqueuse digestive. L’épithélium gastrointestinal et le mucus présent à sa surface constituant une barrière physique à la capture des antigènes, celle-ci s’effectue dans les structures lymphoïdes disséminées tout au long de la muqueuse digestive : les plaques de Peyer et autres formations lymphoïdes associées au tube digestif (GALT). Des cellules spécialisées, les cellules M, permettent le transport des antigènes vers les cellules présentatrices d’antigènes situées dans un dôme sous-épithélial où ont lieu les interactions initiales entre CPA et lymphocytes T (Owen, 1994 ; Onah et Nawa, 2000) (Figure n°6). Figure n°6 : Organisation d’une plaque de Peyer intestinale (d’après Mowat, 2003). Abréviations : SED : dôme sous-épithélial, TDA : zone thymo-dépendante. 53 Contexte bibliographique On ne connaît pas encore le mode de présentation des antigènes de nématodes gastrointestinaux dans le tube digestif des ruminants. A partir d’études in vitro, au moins quatre types cellulaires (cellules dendritiques, macrophages, lymphocytes B et cellules épithéliales) semblent capables de présenter des antigènes au sein du tissu lymphoïde associé au tube digestif (Owen, 1994). Cependant, en raison du nombre restreint d’études sur la capture, le processing et la présentation des antigènes de nématodes, il n’existe aucune preuve solide in vivo de l’implication de ces cellules dans la présentation antigénique (Miller, 1996a). De même, il reste à déterminer quels sont les types d’antigènes de nématodes capables d’initier ces mécanismes : antigènes cuticulaires, antigènes de liquide de mue, produits d’excrétionsécrétion larvaires ou de vers adultes ? (Onah et Nawa, 2000). Le rôle du CMH II dans le contrôle des réponses immunitaires contre les nématodes a largement été étudié chez la souris (Wakelin, 1992). Les niveaux d’expression élevés du CMH II par les cellules dendritiques confortent leur rôle dans la présentation d’antigènes parasitaires (Johansson et Kelsall, 2005). D’autres types cellulaires, dont les mastocytes et les polynucléaires éosinophiles, peuvent exprimer les molécules de classe II du CMH et donc présenter des peptides aux lymphocytes T CD4+ ( Del Pozo et al., 1992 ; Frandji et al., 1993). Leur capacité de présentation antigénique, et leur présence dans les muqueuses, notamment digestive, en font également de bons candidats pour l’initiation des réponses immunitaires dans ces sites (Coffman et von der Weid, 1997). En conclusion, il apparaît qu’il existe plusieurs voies d’induction de la réponse immunitaire adaptative au sein des muqueuses gastro-intestinales. 4.3.2. Orientation de la réponse immunitaire : Th1 ou Th2 ? La présentation de peptides aux lymphocytes CD4+ naïfs par une cellule présentatrice d’antigène, ainsi que les cytokines présentes dans le micro-environnement de ces cellules, déterminent l’orientation de la réponse immunitaire adaptative vers l’une des deux grandes voies Th1 ou Th2. Ce paradigme Th1/Th2 a été établi par l’analyse des cytokines produites par un panel de clones de lymphocytes T CD4+ murins : ces clones sécrètaient soit de l’interféron γ (IFN-γ) et de l’interleukine 2 (IL-2), soit de l’IL-4 (Mosmann et Coffman, 1989). Le premier type a été désigné Th1 et le second Th2 (Mosmann et al., 1986 ; Romagnani, 1997). D’une façon caricaturale, les réponses de type Th1 seraient initiées lors d’infections intra-cellulaires (virales, bactériennes, infections à protozoaires), alors que les 54 Contexte bibliographique réponses Th2 le seraient lors d’infections par des parasites métazoaires extra-cellulaires (Paul et Seder, 1994). Dans les réponses de type Th2, les lymphocytes T CD4+ produisent de l’IL-4 (cytokine clé de la polarisation Th2), mais aussi de l’IL-13, de l’IL-5 et de l’IL-9. Aussitôt après une infestation, les sources précoces d’IL-4 ne sont pas complètement connues (Coffman et von der Weid, 1997). Différents types cellulaires, dont des cellules non T, pourraient produire cette cytokine. Des études sur souris infectées par N. brasiliensis confirment qu’au moins trois types cellulaires produisent de l’IL-4 : les cellules lymphocytaires T CD4+, mais également les polynucléaires éosinophiles et les basophiles (Voehringer et al., 2004). L’IL-4 peut également être produite par les cellules T Natural Killer (NK), les lymphocytes T γδ et les mastocytes (Brown et al., 1987 ; Yoshimoto et Paul, 1994). La plupart de ces cellules semblent produire également de l’IL-13. Les récepteurs de l’IL-4 et de l’IL-13 ont en commun la même chaîne α et une même activation intra-cellulaire via Stat6. L’IL-13 pourrait avoir une importance au moins égale à celle de l’IL-4 pour la protection de l’hôte lors de certaines infestations par des helminthes gastro-intestinaux (Finkelman et al., 1999). L’importance relative de ces deux cytokines, du récepteur de l’IL-4 et de Stat6, a été prouvée sur des souris déficientes en l’un ou l’autre de ces composés, qui développent des réponses Th2 inefficaces contre les nématodes gastro-intestinaux (Urban et al., 1991 ; Bancroft et al., 1998 ; McKenzie et al., 1999 ; Urban et al., 2001). L’IL-4, seule, est toutefois capable d’induire des réponses Th2 caractéristiques, même en l’absence combinée d’IL-5, d’IL-9 et d’IL-13 (Fallon et al., 2002). La présence de cellules sources de cytokines Th2 ainsi que la concentration locale en cytokines dans un site anatomique donné, en particulier la muqueuse digestive, déterminent un micro-environnement cytokinique indispensable à l’orientation de la réponse immunitaire (Kourilsky et Truffa-Bachi, 2001) ; l’IL-4 étant nécessaire pour l’amplification des cellules Th2 (Gause et al., 2003). La différenciation de clones de lymphocytes T CD4+ naïfs en cellules productrices d’IL-4 est donc l’étape déterminante pour la mise en place d’une réponse Th2 efficace et protectrice. L’orientation de la réponse immunitaire lors d’infestations par des helminthes est clairement de type Th2 dans les modèles murins. La production d’IL-4 est nécessaire pour la protection de l’hôte et pour limiter la sévérité des infestations. A l’inverse, la production de cytokines 55 Contexte bibliographique Th1 (IL-12 et IFN-γ) inhibe cette immunité protectrice et favorise la survie des nématodes gastro-intestinaux (Urban et al., 1996 ; Finkelman et al., 1997). Toutefois, des variations importantes existent selon l’espèce de nématode en cause ou la souche murine utilisée en expérimentation (Gause et al., 2003). Nippostrongylus brasiliensis et Heligmosomoides polygyrus sont deux nématodes parasites largement utilisés comme modèles d’infestations gastro-intestinales chez la souris. Ils sont capables de déclencher des réponses Th2 hautement polarisées avec des niveaux élevés de production d’IL-4 et d’IL-13 (Svétic et al., 1993). Toutefois, alors qu’une infestation avec N. brasiliensis est éliminée en deux semaines après inoculation, une primo-infestation avec H. polygyrus se traduit par une infection chronique. Ces deux parasites, bien qu’initiant une réponse immunitaire similaire dans sa polarisation, établissent des interactions avec l’hôte très différentes. La réponse aiguë observée avec N. brasiliensis, parasite dont l’hôte habituel est le rat, pourrait être la conséquence d’une inadaptation à un environnement murin. Les différences de réponse entre souches murines vis à vis d’un même parasite sont mises en évidence lors d’infections avec Trichuris muris : une forte réponse Th2 avec expulsion rapide des vers est observée chez des souris BALB/c, une réponse mixte Th1/Th2 avec expulsion retardée des vers est mise en place chez des souris BL/6 alors qu’une réponse Th1 résultant en une infection chronique est initiée chez des souris AKR (Gause et al., 2003). Des intensités d’infestation différentes sont également la source de variations de réponses. En effet, des doses faibles de larves infestantes de T. muris génèrent des réponses de type Th1 alors que des doses plus fortes initient des réponses Th2 protectrices (Bancroft et al., 1994). Des souris primo-infestées avec des doses fortes sont résistantes à un challenge ultérieur, par des doses faibles ou fortes, alors que des souris infectées avec des doses faibles en primoinfection restent sensibles à un challenge ultérieur (Bancroft et al., 2001). Qu’en est-il des infestations par les helminthes dans les autres espèces et, en particulier, chez l’homme ? Cooper et al. (2000) ont montré que des cellules mononucléées sanguines humaines stimulées par des antigènes d’Ascaris lumbricoïdes donnent des réponses Th2 plus fortes chez des individus issus de communautés rurales d’Equateur que chez des individus non-infectés des environnements urbains. De même, l’intensité de production de cytokines Th2 (IL-4, 9, 10 et 13) est inversement corrélée à l’intensité de l’infection par A. lumbricoïdes chez des individus âgés de plus de 11 ans (Turner et al., 2003). Ces résultats sont retrouvés lors d’infestations par d’autres espèces de nématodes comme Trichuris trichuria et Necator 56 Contexte bibliographique americanus (Loukas et Prociv, 2001 ; Jackson et al., 2004 ; Quinnell et al., 2004) dans lesquelles l’IL-5 et l’IL-13 jouent un rôle majeur. Chez les ruminants, et en particulier chez les ovins, la polarisation de la réponse immunitaire adaptative ne semble pas aussi nette que dans des modèles murins ou lors d’infections naturelles chez l’homme. Il faut souligner que la dichotomie Th1/Th2 définie pour des clones de cellules T murines ainsi que les régulations mutuelles par les cytokines des deux types de réponses, n’ont pas été établis avec certitude chez les ruminants. En effet, la majorité de plus de 60 clones de cellules lymphocytaires T antigènes-spécifiques étudiés par Brown et al. (1998) chez des bovins co-expriment l’IL-4 et l’IFN-γ et des profils cytokiniques polarisés ne sont que rarement observés. De plus, les cytokines régulatrices majeures, IL-4, IL-10 et IL12, ne semblent pas exercer de façon sélective leur effets négatifs (IL-4 et IL-10) ou positifs (IL-12) sur des cellules Th1-like (Brown et al., 1998 ; Gill et al., 2000). L’existence d’une dichotomie claire entre Th1 et Th2 chez les ruminants est donc encore un sujet controversé ; l’orientation Th2 de la réponse immunitaire dans les strongyloses gastro-intestinales chez les ruminants, ainsi que son rôle dans la protection, reste à prouver. Chez les ovins, il est difficile de quantifier l’expression des cytokines au niveau protéique en raison d’un manque d’anticorps spécifiques pour cette espèce (Scheerlinck et al., 1998). Cependant, le clonage et le séquençage des gènes de plusieurs cytokines ovines, dont l’IL-4 et l’IFN-γ (McInnes et al., 1990 ; Seow et al., 1993), a rendu possible le développement d’anticorps (techniques ELISA) ou d’amorces spécifiques (techniques de PCR quantitative) applicables à cette espèce (Montagne et al., 2001 ; Konnai et al., 2003, Bendixsen et al., 2003) et donc l’étude de la polarisation de la réponse immunitaire adaptative dans les strongyloses gastro-intestinales. Les données disponibles quant à l’orientation de la réponse immunitaire dans divers modèles de strongyloses chez les ruminants apparaissent conflictuelles et ne permettent pas à l’heure actuelle d’affirmer qu’une immunité protectrice de type Th2, telle que prouvée dans les modèles murins, se met en place lors d’une infestation. Par exemple, lors d’une primo-infestation par Ostertagia ostertagi chez des veaux, l’analyse par RT-PCR de l’expression des ARNm de différentes cytokines dans des lymphocytes issus de la muqueuse abomasale, révèle une sur-expression à la fois des ARNm de l’IL-4 et de l’IFN-γ à 10 et 60 jours post-infestation (Almeria et al., 1997). Une sur-expression similaire des ARNm de ces deux cytokines est également constatée dans le nœud lymphatique drainant 57 Contexte bibliographique de la caillette (Canals et al., 1997). De façon similaire, une réponse mixte Th1/Th2 semble se mettre en place lors d’une infestation primaire par le nématode respiratoire Dictyocaulus viviparus chez des génisses (Johnson et al., 2005). Des réponses mixtes Th1/Th2 ont également été observées chez des ovins. Chez des ovins infestés par T. colubriformis, des cytokines Th2-like comme l’IL-4 semblent prédominer et déboucher sur une réponse Th2 typique après environ 4 semaines d’infestation, faisant suite à une réponse inflammatoire initiale médiée par l’IFN-γ (Pernthaner et al., 1997). De même, alors qu’une réponse Th1 non protectrice, caractérisée par une forte expression des ARNm de l’IL-2 et de l’IFN-γ, semble se mettre en place lors d’une primo-infestation par H. contortus chez des ovins, une infestation ultérieure induit une réponse protectrice Th2 avec un fort niveau d’expression de l’IL-4, mais pas d’IL-5 (Schallig, 2000). Enfin, dans une étude très récente, Pernthaner et al. (2005) ont démontré une sur-expression de deux cytokines de type Th2 (IL-5 et IL-13), mais pas de l’IL-4, par des cellules de la lymphe intestinale d’ovins sélectionnés pour leur résistance accrue à T. colubriformis. Toutefois, dans la plupart de ces études, les observations ont été réalisées sur des cellules isolées d’animaux à un seul ou lors de quelques points d’étude, puis cultivées in vitro et soumises à des stimuli spécifiques, ce qui conduit à certaines incertitudes sur la pertinence de tels modèles dans l’étude de la réponse immunitaire. En particulier, il n’est pas certain que ces observations reflètent précisément les modifications dynamiques qui surviennent in vivo sur de plus longues périodes. Comme le soulignait H. Schallig dans sa revue sur les réponses immunologiques des ovins face à H. contortus (Schallig, 2000), des études complémentaires des profils cytokiniques induits par les infestations et/ou la vaccination, sous la forme d’essais ELISA ou de RT-PCR (Bell et Ranford-Cartwright, 2002), sont nécessaires pour approfondir la connaissances des mécanismes qui sous-tendent l’immunité protectrice chez les ovins. 4.3.3. Mise en place et rôle des effecteurs de l’immunité dans les strongyloses gastrointestinales Les strongyloses gastro-intestinales sont traditionnellement accompagnées de réponses cellulaires et humorales, dont la mise en place dépend de la polarisation Th2 initiale de la réponse immunitaire (Finkelman et al., 1997 ; Schallig, 2000 ; Gause et al., 2003). Ces réponses sont caractérisées par : - une éosinophilie sanguine et tissulaire, 58 Contexte bibliographique - une mastocytose tissulaire, avec apparition de globules leucocytes intraépithéliaux (stade ultime supposé de la différenciation des mastocytes), - la production d’anticorps sériques ou locaux (sites tissulaires d’infiltration) dominés par des immunoglobulines de type IgG1, des IgA et des IgE. Ces effecteurs de l’immunité sont étroitement orchestrés par l’environnement cytokinique induit par la polarisation de la réponse immunitaire (Figure n°7). Figure n°7 : Séquence postulée des événements au cours d’une infestation intestinale par un nématode dans un modèle murin, de la présentation antigénique jusqu’à l’induction de la réponse effectrice. La production d’IL-4 par des cellules T naïves et/ou d’autres sources cellulaires non identifiées, polarise la réponse vers la voie Th2 et inhibe le développement des cellules Th1 (indiqué par le signe -). Les réponses de type Th2 sont protectrices et promeuvent une mastocytose, une éosinophilie, la production d’anticorps par les lymphocytes B et probablement l’hyperplasie des cellules à mucus. A l’inverse, les réponses de type Th1 sont associées à la susceptibilité vis à vis des nématodes intestinaux, induisent la production de forts niveaux d’IgG2a et activent les macrophages, résultant en une hypersensibilité retardée (d’après Else et Finkelman, 1998). Les cytokines de type Th2 ont de nombreuses activités biologiques sur les cellules lymphocytaires T ainsi que sur les précurseurs de cellules hématopoïétiques. Elles permettent la différenciation, l’activation et le recrutement dans les tissus infestés, des polynucléaires éosinophiles et des mastocytes. Ces cytokines ont également des effets sur les lymphocytes B, permettant la synthèse et la libération des immunoglobulines G1, A et E. Les rôles principaux des différentes cytokines de type Th2 sont résumées dans le tableau n°9. 59 Contexte bibliographique Cytokine Activité biologique IL-3 Facteur de croissance pour cellules souches hématopoïétiques Mastocytose Inhibition de la production d’IFN-γ et de la synthèse de cytokines inflammatoires (IL-1, TNF) par les macrophages Croissance, survie et différenciation des lymphocytes T en cellules Th2 Activation, croissance et commutation isotypique des lymphocytes B (production d’IgE et d’IgG1) Contraction des muscles lisses Hyperplasie des cellules à mucus Différenciation des lymphocytes B et production d’IgA Croissance, différenciation, survie, migration et activation des éosinophiles Hyperplasie des cellules à mucus Différentiation des lymphocytes B en plasmocytes produisant des immunoglobulines IL-4 IL-5 IL-6 IL-9 IL-10 IL-13 Eotaxine Stimulation de la production d’IgE Eosinophilie, mastocytose, hyperplasie des cellules à mucus Inhibition de la voie Th1 par les lymphocytes T Inhibition de la libération de cytokines par les macrophages Croissance des mastocytes Production d’IgE Hyperplasie des cellules à mucus Contraction des muscles lisses Chimio-attraction des éosinophiles dans les sites tissulaires Tableau n°9 : Activité biologique des principales cytokines Th2 (d’après Kishimoto et al., 1995 ; Garcia-Zepeda et al., 1996 ; Fradelizi et Theze, 1998 ; Janeway et al., 2001b). *Rôle des polynucléaires éosinophiles : L’augmentation du nombre de polynucléaires éosinophiles circulants ou présents dans les muqueuses digestives est une caractéristique constante des infestations par les nématodes gastro-intestinaux. Une cytokine, l’IL-5, et une chémokine, l’éotaxine, sont les facteurs principaux de la maturation, du recrutement et du chimiotactisme des polynucléaires éosinophiles. L’IL-5 permet l’augmentation du pool de polynucléaires éosinophiles dans la moelle osseuse et promeut leur maturation ainsi que l’éosinophilie sanguine (Sanderson, 1992). L’éotaxine est en revanche responsable de leur migration trans-endothéliale et de leur recrutement tissulaire (Dombrowicz et Capron, 2001). Les fonctions effectrices in vivo des polynucléaires éosinophiles font encore l’objet de débats, en dépit de leur capacité à tuer des larves d’helminthes in vitro : schistosomules de S. mansoni en présence d’anticorps de classe IgG (Butterworth et al., 1975) ou larves infestantes d’H. contortus (Rainbird et al., 1998 ; Meeusen et Balic, 2000). 60 Contexte bibliographique Figure n°8 : Immobilisation de larves d’H. contortus par des polynucléaires éosinophiles in vitro (microscopie électronique en balayage) (Photo C. Grisez et P. Jacquiet). Le mécanisme en cause serait la cytotoxicité cellulaire anticorps dépendante (ADCC : antibody dependant cellular cytotoxicity) dans lequel la fixation d’anticorps sur les récepteurs Fc de la surface des polynucléaires éosinophiles (IgG, IgE et IgA) permettrait la libération des protéines cationiques contenues dans leurs granulations cytoplasmiques (MBP : major basic protein ; ECP : eosinophil cationic protein ; EDN : eosinophil-derived neurotoxin…) ainsi que la génération de médiateurs néoformés. Ceux-ci auraient un effet cytolytique sur le tégument des parasites, induisant une immobilisation puis la mort des larves (Figure n°8) (Capron, 1993 ; Weller, 1994). Bien que ce mécanisme n’ait pas été démontré in vivo, le polynucléaire éosinophile est considéré comme une cellule protectrice pour l’hôte lors d’infestation parasitaire. Cette hypothèse est notamment étayée par l’observation histologique de parasites dans les tissus de l’hôte : de nombreux polynucléaires éosinophiles sont mis en évidence en association avec des parasites intacts ou endommagés et semblent dégranuler à proximité de ceux-ci in vivo (Butterworth, 1984). Toutefois, on ne sait pas si ces associations sont présentes au moment où le parasite est attaqué par les polynucléaires éosinophiles ou si elles sont une conséquence de la mort de celui-ci et des dommages tissulaires (Meeusen et Balic, 2000). Une preuve possible du rôle des polynucléaires éosinophiles dans la protection de l’hôte contre les helminthes du tractus digestif est également apportée par les corrélations significatives qui existent entre les variations génétiques de sensibilité à l’infection et l’intensité de la réponse éosinophilique (Meeusen et Balic, 2000). Dans les modèles murins, la résistance de souris à Trichuris muris (Else et Grencis, 1991) ou Nippostrongylus brasiliensis (Zhou et al., 1996) est positivement corrélée avec leur capacité à générer une éosinophilie 61 Contexte bibliographique tissulaire après infestation. De même, chez des souris sélectionnées comme résistantes ou sensibles à H. polygyrus, l’immunité était fortement corrélée à l’intensité de l’éosinophilie sanguine après une première ou une seconde infestation (Zhong et Dobson, 1996). Chez les ovins, l’éosinophilie sanguine et tissulaire semble liée à la résistance à T. colubriformis (Buddle et al., 1992), à T. circumcincta (Stear et al., 1995a) et à Nematodirus battus (Winter et al., 1997). Toutefois, il semble que l’IL-5 et les polynucléaires éosinophiles aient des effets différents selon l’helminthe cible. En effet, des études sur des modèles murins génétiquement modifiés ont permis d’aboutir à des conclusions différentes (Behm et Ovington, 2000) : - dans certaines infestations, comme avec Mesocestoides corti ou Toxocara canis, l’IL-5 et les polynucléaires éosinophiles ne semblent pas affecter de façon substantielle l’évolution des infestations, - il existe un certain degré de protection de l’hôte lié à l’IL-5, et aux polynucléaires éosinophiles, lors d’infestations par H. polygyrus et N. brasiliensis, - l’IL-5 et les polynucléaires éosinophiles seraient protecteurs chez des souris infestées par S. mansoni. A l’heure actuelle, le dogme « polynucléaire éosinophile / cellule protectrice » in vivo commence toutefois à être remis en question. Tout d’abord, les polynucléaires éosinophiles sont la cause de dommages tissulaires, comme ceux que l’on peut observer dans le parenchyme pulmonaire lors d’asthme allergique (Walsh, 1999). Lors d’infestation par les nématodes, il n’est pas exclu que les parasites puissent favoriser l’hyperéosinophilie tissulaire et ainsi contribuer à la pathogénie et aux lésions tissulaires. Les dommages muqueux locaux induits par les polynucléaires éosinophiles pourraient fournir un micro-environnement bénéfique au parasite (Klion et Nutman, 2004 ; Wildblood et al., 2005). Cette hypothèse pourrait être confortée par la démonstration récente que des extraits totaux de stades larvaires ainsi que les produits d’excrétion-sécrétion de parasites gastro-intestinaux des ovins (T. circumcincta et H. contortus) ont une puissante activité chimio-attractrice pour les polynucléaires éosinophiles in vitro, alors que ces mêmes produits issus d’un nématode libre non-parasite, Caenorhabditis elegans, n’en sont pas capables (Wildblood et al., 2005). Enfin, un rôle non négligeable et souvent négligé des polynucléaires éosinophiles in vivo est leur capacité de production de certaines cytokines (facteurs de croissance et de régulation 62 Contexte bibliographique cellulaire) dans leur environnement immédiat (Capron, 1993). En particulier, les polynucléaires éosinophiles produisent de l’IL-3 (Kita et al., 1991) et de l’IL-5 (Desreumaux et al., 1992), suggérant un rôle dans la mastocytose associée aux infestations helminthiques ainsi que dans l’amplification de l’éosinophilie via une activité IL-5 autocrine ou sur les autres polynucléaires éosinophiles (Weller, 1994). *Rôle des mastocytes et des globule leucocytes : L’infestation par des nématodes gastro-intestinaux se traduit également par une hyperplasie des mastocytes muqueux et des globule leucocytes intra-épithéliaux dans les muqueuses gastrique et intestinale et ce, quel que soit l’hôte ou le nématode considéré (Stankiewicz et al., 1995 ; Else et Finkelman, 1998 ; Schallig, 2000). L’origine cellulaire des globule leucocytes était au départ incertaine : plusieurs auteurs ont proposé que les globule leucocytes étaient des plasmocytes modifiés ou bien se développaient à partir de lymphocytes ; toutefois, il est à l’heure actuelle clairement admis que ce type cellulaire est dérivé des mastocytes muqueux sub-épithéliaux de la muqueuse digestive (Murray et al., 1968 ; Huntley et al., 1984). Cette mastocytose est contrôlée par plusieurs cytokines Th2, principalement IL-3, IL-4, IL-9 et IL-10 (Hamaguchi et al., 1987 ; Hultner et al., 1989 ; Thompson-Snipes et al., 1991). Les mastocytes sont responsables du développement de réponses d’hypersensibilité immédiates (de type I) à médiation IgE dans le tractus digestif lors d’infestations par des nématodes (Miller, 1996b). Ces réactions d’hypersensibilité au niveau des surfaces muqueuses sont généralement considérées comme protectrices vis à vis des infestations par des nématodes selon trois mécanismes : - les médiateurs de faible poids moléculaire libérés directement par des mastocytes (en présence d’anaphylatoxines C3a et C5a ou de certains antigènes parasitaires), ou lors de leur sensibilisation par des IgE et leur activation par des antigènes parasitaires, pourraient directement affecter la survie des vers (Rothwell, 1989). La libération de médiateurs préformés (histamine, protéoglycanes) ou néoformés (leucotriènes C4, D4 et E4) (Figure n°9) est également impliquée dans l’inhibition de la migration des larves des nématodes gastro-intestinaux chez le mouton (Douch et al., 1996b), - la sensibilisation des mastocytes par des IgE spécifiques est à l’origine des phénomènes d’hypersensibilité de type I impliqués dans l’expulsion rapide des vers chez la souris (Miller, 1984). En effet, les mastocytes muqueux sont étroitement liés au système nerveux autonome du tractus gastro-intestinal ; leur 63 Contexte bibliographique dégranulation entraîne une stimulation électrique importante des terminaisons nerveuses qui se traduit par une augmentation du péristaltisme et la sécrétion d’eau et d’ions (Baird et O’Malley, 1993), dont l’objectif est d’éliminer le pathogène présent dans la lumière digestive ou associé à la muqueuse par un effet purgatif (McKay et Bienenstock, 1994), - l’augmentation de la perméabilité muqueuse, en raison de protéases sécrétées ou de cytokines, comme le TNF-α, pourrait favoriser la passage de protéines plasmatiques vers la lumière digestive et, en particulier, la translocation d’anticorps anti-parasitaires qui compromettraient la survie des vers (Miller, 1996). Figure n°9 : Réponses biologiques des mastocytes activés (d’après Stevens et Austen, 1989). Ainsi les mastocytes muqueux ont longtemps été considérés comme des effecteurs possibles des surfaces muqueuses contre les nématodes du tractus digestif (Miller, 1984). Toutefois, chez les rongeurs de laboratoire, la période pendant laquelle la mastocytose est avérée varie en fonction des parasites et des hôtes expérimentaux considérés, et ne coïncide pas toujours avec le moment de l’expulsion des vers (Lee et Wakelin, 1982). De plus, il y a des exemples d’expulsion des vers en l’absence d’une mastocytose de la muqueuse, et inversement, des cas d’absence d’expulsion des vers malgré une mastocytose importante (Onah et Nawa, 2000). La 64 Contexte bibliographique suppression de la mastocytose au moyen d’anticorps anti-IL-3 ou anti-IL-4 lors d’une infestation primaire chez la souris par N. brasiliensis ne prévient pas l’expulsion des vers (Madden et al., 1991). A l’inverse, des souris Stat6 KO développent une forte mastocytose intestinale lors d’infestation par N. brasiliensis mais sont incapables d’éliminer leurs parasites (Urban et al., 1998). Chez les ovins, le nombre de globule leucocytes, mais pas de mastocytes muqueux, dans la muqueuse abomasale ou intestinale semble être un bon indicateur de la résistance des animaux face à H. contortus, T. circumcincta et T. colubriformis (Douch et al., 1986 ; Stear et al., 1995a). Cependant, le seul dénombrement de mastocytes muqueux et/ou de globule leucocytes ne renseigne pas sur les capacités fonctionnelles de ces cellules. Une mesure directe de l’activation et de la dégranulation mastocytaire est possible par le dosage chez les ovins de la SMCP (Sheep Mast Cell-Derived Proteases) (Huntley et al., 1987 et 1992). Stevenson et al. (1994) ont montré qu’il existe une corrélation négative entre le nombre total de vers retrouvés à l’autopsie chez des ovins infestés par T. circumcincta, et les concentrations en SMCP dans le mucus de la caillette, confortant ainsi l’hypothèse du rôle protecteur de ce type cellulaire dans les strongyloses du tractus digestif. Les ovins immunisés sont donc capables de sécréter des médiateurs inflammatoires dérivés des mastocytes en réponse à une infestation avec des nématodes gastro-intestinaux et l’intensité de cette réponse semble associée à la résistance vis à vis de ces parasites. L’effet de ces médiateurs mastocytaires peut être indirect par la création d’une environnement hostile pour la survie des parasites, ou bien direct en affectant la survie des parasites (Rothwell, 1989 ; Balic et al., 2000). *Rôle des réponses anticorps : Les infestations gastro-intestinales sont généralement accompagnées d’une élévation d’anticorps IgG1, IgE et IgA (Else et Finkelman, 1998 ; Schallig, 2000), ces isotypes étant initiés par les cytokines de type Th2. L’implication des anticorps dans la résistance aux infestations gastro-intestinales a été suspectée à la suite du transfert d’immunité protectrice chez les souris naïves grâce au sérum de souris pluri-infestées. Toutefois, certaines de ces expériences ont donné des résultats équivoques et le rôle protecteur des anticorps n’a pas toujours été démontré (Wakelin, 1978 ; Onah et Nawa, 2000). Ainsi, l’expulsion des vers adultes de Trichinella spiralis est permise par le transfert du sérum d’un donneur immunisé mais aussi de ses cellules immunitaires du nœud lymphatique mésentérique (Wakelin et Lloyd, 1976). Des expériences similaires ont montré la nécessité de transférer à la fois du 65 Contexte bibliographique sérum et des cellules immunitaires d’un donneur immunisé pour que l’immunité conférée au receveur naïf soit protectrice (Wang et Bell, 1988 ; Ahmad et al., 1990). En revanche, si le rôle de la réponse humorale systémique reste sujet à discussion, celui de la sécrétion d’anticorps à la surface des muqueuses (réponse humorale locale) est plus généralement admis (Else et Finkelman, 1998 ; Onah et Nawa, 2000). Chez les ovins, les études des réponses anticorps utilisent fréquemment des extraits totaux de différents stades parasitaires, ce qui rend les comparaisons difficilement interprétables entre études (méthodes d’extraction différentes, compositions antigéniques variables des différents pools d’extraits totaux de vers, dilution des antigènes d’intérêt par la présence de protéines non immunogènes dans les pools). La purification d’antigènes parasitaires, à partir d’antigènes d’excrétion/sécrétion de vers adultes ou de stades larvaires, permet des études plus homogènes des réponses anticorps lors d’infestations gastro-intestinales (Balic et al., 2000). Chez les ruminants, des immunoglobulines de classe et sous-classe IgG1, IgG2, IgM, IgA et IgE sont sécrétées. Toutefois, le rôle des IgM est souvent considéré comme d’importance mineure (Schallig et al., 1995). Les IgA : dans les modèles d’infestation par les strongles gastro-intestinaux chez les ruminants, les IgA sériques spécifiques sont souvent présentes à des concentrations très faibles et ne seraient pas très représentatives de la réponse locale (Schallig et al., 1995). Néanmoins, une corrélation modérée entre IgA sériques et IgA du mucus abomasal a été démontrée chez des ovins infestés par T. circumcincta (Sinski et al., 1995). Les moutons résistants à H. contortus présentent une augmentation très importante du nombre de plasmocytes à IgA dans la muqueuse abomasale par rapport à des moutons sensibles (Gill et al., 1994). Stear et al. (1995a) ont démontré que des ovins ayant des taux d’IgA locales contre des antigènes de L4 de T. circumcincta hébergeaient des vers adultes plus petits et moins prolifiques. En revanche, aucune corrélation entre la production d’IgA locales et le nombre total de vers n’a pu être mise en évidence. L’importance des IgA a également été démontrée dans la régulation de l’infestation de veaux par Ostertagia ostertagi : il existe une corrélation négative entre l’intensité de la réponse IgA locale et l’excrétion d’œufs dans les matières fécales ainsi que le nombre d’œufs par femelle adulte (Claerebout et al., 1999). Les IgG : chez les ovins résistants à H. contortus (Gill et al., 1993) ou à T. colubriformis (Douch et al., 1996a), les niveaux sériques d’IgG1 spécifiques sont plus élevés que chez des ovins sensibles. De même, chez la souris, la réponse IgG1 est le principal facteur 66 Contexte bibliographique de résistance à l’infestation par Heligmosomoïdes polygyrus (Williams et Behnke, 1983). En revanche, la résistance à T. circumcincta chez les ovins, et à O. ostertagi ou Cooperia oncophora chez des bovins, semble liée à une forte réponse IgG2 et à une faible réponse IgG1 (Claerebout et Vercruysse, 2000). Les IgE : le rôle des IgE dans l’expulsion rapide des vers adultes de T. spiralis chez la souris est bien connu (Else et Finkelman, 1998). De même, chez l’homme, des taux élevés d’IgE sériques spécifiques sont associés à la résistance contre les nématodes gastrointestinaux (Pritchard et al., 1995). La situation est en revanche beaucoup plus nuancée chez les ruminants. Dans le modèle ovin / H. contortus, la réponse IgE spécifique est rapidement mise en place (entre 2 et 4 semaines post-infestation) et les taux sériques d’IgE sont inversement proportionnels aux nombres de vers retrouvés à l’autopsie (Kooyman et al., 1997). Ces IgE sont majoritairement dirigées contre des antigènes d’excrétion-sécrétion de vers adultes et non contre des antigènes larvaires. Huntley et al. (1998) ont mesuré les concentrations en IgE dans le sérum et dans la lymphe gastrique de moutons infestés par T. circumcincta. Lors d’une primo-infestation, la réponse IgE est très faible tant vis à vis des antigènes larvaires que des antigènes de vers adultes. Lors d’une seconde infestation, ces auteurs notent une réponse IgE chez environ la moitié des animaux contre des antigènes larvaires et aucune réponse contre des antigènes de vers adultes. La réponse IgE systémique chez des ovins infestés par T. colubriformis est encore différente avec une forte réponse contre des antigènes de vers adultes en primo-infestation et une forte réponse à la fois contre des antigènes larvaires et de vers adultes en seconde infestation. Toutefois, dans ces deux derniers cas (T. circumcincta et T. colubriformis), aucune relation directe n’a pu être établie entre titres en IgE et protection contre ces deux nématodes. En conclusion, une élévation des anticorps sériques spécifiques, de classe ou sous-classe IgG1, IgG2 et IgE, est observée lors d’une primo-infestation chez les ruminants, avec en règle générale, une réponse accrue et accélérée lors d’une deuxième infestation. Les réponses IgA sont également généralement associées avec les infestations gastro-intestinales par des nématodes, mais sont observées de façon prédominante dans les muqueuses infestées (Balic et al., 2000). Les mécanismes d’action des anticorps sur les nématodes du tractus digestif ne sont pas bien connus. Toutefois, deux voies principales sont évoquées : 67 Contexte bibliographique - les IgA et IgG pourraient avoir un effet direct sur le parasite en neutralisant ou en inactivant des enzymes métaboliques d’H. contortus (Gill et al., 1993) ou en interférant avec les capacités des vers à se nourrir (Smith, 1988). Des IgG spécifiques pourraient inhiber la nutrition in vitro de T. colubriformis (Bottjer et al., 1985). - un rôle indirect des anticorps peut être proposé via la participation aux réactions d’hypersensibilité médiées par les mastocytes, ou la cytotoxicité dépendante d’anticorps médiée par les polynucléaires éosinophiles et les mastocytes (Meeusen et Balic, 2000 ; Klion et Nutman, 2004). *Rôle des cellules caliciformes et des mucines, rôle de la motricité du tractus digestif : Dans des modèles murins et ovins, l’activation du système immunitaire du tractus digestif lors d’infestation par des strongles gastro-intestinaux induit des altérations de la physiologie intestinale : augmentation de la motricité intestinale et de la production de mucus (Miller, 1996a ; Harrison et al., 1999 ; Khan et Collins, 2004). Les deux principales cytokines Th2, IL4 et IL-13, promeuvent l’hyperplasie des cellules caliciformes (cellules à mucus) et l’augmentation de la production de mucus (Khan et al., 1995 ; Ishikawa et al., 1997) ainsi que la contraction des muscles lisses intestinaux lors d’infestation par des nématodes (Zhao et al., 2003). Les mécanismes d’action du mucus dans la protection contre les strongles gastro-intestinaux sont encore mal définis ; toutefois il a été démontré que le mucus peut « piéger » les parasites, inhiber leur mobilité ainsi que leur capacité à se nourrir (Miller, 1987 ; Rothwell, 1989 ; Moncada et al., 2003). L’incorporation de médiateurs des cellules inflammatoires dans le mucus pourrait également avoir des effets délétères sur les vers (Douch et al., 1983). Lors d’une inflammation intestinale, l’hyper-contraction des muscles lisses est très importante dans la partie proximale de l’intestin grêle alors qu’elle est plus réduite en partie distale (iléon, côlon), augmentant ainsi la propulsion du contenu luminal et donc des parasites vers les parties distales du tractus digestif et favorisant leur expulsion. Chez la souris une association positive a été démontrée entre l’intensité de la contraction des muscles lisses intestinaux et la capacité de l’hôte à expulser les parasites : des souris NIH Swiss, expulsant très rapidement des T. spiralis adultes, ont un très fort degré de contraction musculaire, alors que des souris B10.BR ont une contraction moindre et expulsent moins rapidement les parasites (Vallance et al., 1997). 68 Contexte bibliographique Ainsi, l’association de ces deux mécanismes (hyper-production de mucus et augmentation de la contraction musculaire lisse), jouerait un rôle protecteur lors d’infestation gastrointestinale, en favorisant l’expulsion rapide des parasites (Figure n°10). Figure n°10 : Rôle des altérations de la physiologie digestive à médiation immunitaire dans la défense de l’hôte contre les infestations par les nématodes gastro-intestinaux. L’infestation génère une inflammation, active une réponse immunitaire Th2 qui altère la physiologie digestive et entraîne une hyper-contractibilité des muscles lisses de la paroi intestinale et une hyperplasie des cellules caliciformes. Le mucus peut piéger les vers et prévenir leur attachement à la surface de la muqueuse. L’augmentation de l’activité propulsive favorise l’expulsion ultérieure des vers (d’après Khan et Collins, 2004). Abréviations : EE cells : cellules entéro-endocrines. L’hyperplasie des cellules caliciformes, ainsi qu’une modification qualitative des mucines produites sont observées lors des infestations gastro-intestinales par des nématodes (Khan et Collins, 2004). Lors d’une infestation par N. brasiliensis chez le rat, par T. colubriformis chez des cobayes ou par H. contortus chez le mouton, la proportion de mucines sulfatées (acides) par rapport aux mucines neutres augmente, coïncidant quasiment avec la moment de l’expulsion des vers (Koninkx et al., 1988 ; Newlands et al., 1990 ; Manjili et al., 1998). Ces modifications qualitatives des mucines pourraient avoir un effet sur : 69 Contexte bibliographique - la liaison sélective des mucines à la surface des parasites, ce qui faciliterait leur immobilisation, - les fonctions chémo-réceptrices des parasites, indispensables à leurs activités biologiques et en particulier leur nutrition (Khan et Collins, 2004). 4.3.4. Conséquences de la réponse immunitaire adaptative sur les traits de vie des parasites : manifestations de l’immunité et régulation des populations de strongles Les manifestations de l’immunité adaptative contre les nématodes parasites du tractus gastrointestinal peuvent s’observer à la fois contre les parasites adultes et contre les larves. 4.3.4.1. Manifestations de l’immunité contre les nématodes parasites adultes L’immunité contre les parasites adultes peut se traduire par : l’expulsion des vers adultes, une réduction de la taille des vers adultes, et une diminution de la fécondité des femelles. *Expulsion des vers adultes : L’expulsion des vers adultes lors d’une primo-infestation est un phénomène fréquemment observé dans les modèles rongeurs (Onah et Nawa, 2000), alors qu’il est plus rare chez les ruminants et chez l’homme (Behnke et al., 1992). En effet, l’expulsion des vers adultes de T. spiralis, N. brasiliensis, Strongyloïdes ratti ou S. venezuelensis, s’effectue en général en 2 à 3 semaines après la primo-infestation (Onah et Nawa, 2000). La capacité d’expulsion des adultes de T. muris est déterminée génétiquement (Else et Wakelin, 1988) : certaines souches murines sont capables d’expulser ces vers avant qu’ils atteignent leur maturité sexuelle, alors que d’autres en sont incapables et développent des infestations chroniques (Wakelin, 1987). La seule exception chez les ovins est celle de Nematodirus battus : lors d’une primoinfestation, les vers adultes sont expulsés dans des périodes de 18-21, 24-28, ou plus de 72 jours, en fonction de la dose de larves infestantes initialement administrées (Balic et al., 2000). En revanche, l’expulsion des nématodes adultes chez les ruminants est largement dépendante de l’immunité acquise et représente donc une conséquence fréquente des infestations répétées. Ceci a été démontré pour H. contortus (Barger et al., 1985b), T. circumcincta (Seaton et al., 1989) et T. colubriformis (Dobson et al., 1990). 70 Contexte bibliographique *Réduction de la taille des vers adultes : Les observations de la modification de la morphologie des nématodes gastro-intestinaux chez les ruminants ont permis de décrire une réduction de la taille des nématodes adultes (Balic et al., 2000). Ce changement de morphologie, manifestation de l’immunité acquise, a été observé chez des ovins infestés par H. contortus (Coyne et Smith, 1992b), T. circumcincta (Seaton et al., 1989 ; Stear et al., 1995b), et T. colubriformis (Douch, 1988). De même, la taille des adultes d’O. ostertagi diminue chez des bovins après une longue exposition à ce strongle (Michel, 1969). Dans le cas des ovins infestés par T. circumcincta, la réduction de taille des adultes serait liée à l’intensité de la réponse IgA (Stear et al., 1995a) mais également à des phénomènes de densité-dépendance lors de très fortes infestations. Cette manifestation de l’immunité est également observée chez la souris lors d’infestation par T. spiralis, H. polygyrus et S. ratti (Onah et Nawa, 2000). *Diminution de la fécondité des femelles : La réduction de fécondité des vers femelles est considérée comme une forme de régulation majeure des populations de strongles gastro-intestinaux chez les ovins (Stear et al., 1997). Les mécanismes responsables de cette diminution de fécondité peuvent être la résultante soit d’une compétition densité-dépendante, soit de l’immunité acquise, soit des deux, bien que les données issues de différentes études soient conflictuelles (Balic et al., 2000). La diminution de la fécondité des femelles a été rapportée dans différents modèles de strongyloses gastrointestinales des ovins comme la conséquence d’infestations répétées par T. colubriformis (Barnes et Dobson, 1990 ; Bisset et al., 1996), H. contortus (Dineen et Wagland, 1966) et T. circumcincta (Stear et al., 1995b), mais également chez des souris infestées par S. ratti, S. venezuelensis ou H. polygyrus (Onah et Nawa, 2000). La diminution de fécondité des femelles peut être appréciée indirectement par la mesure de l’excrétion d’œufs dans les matières fécales (Claerebout et Vercruysse, 2000) ou directement par le comptage du nombre d’œufs présents dans l’utérus des femelles retrouvées chez l’hôte. 4.3.4.2. Manifestations de l’immunité contre les larves de nématodes parasites L’immunité contre les larves infestantes de nématodes se traduit principalement par la résistance à l’établissement de nouvelles larves et par l’arrêt de développement des larves au stade L4 (hypobiose larvaire). 71 Contexte bibliographique *Arrêt du développement des larves (hypobiose) : L’arrêt du développement des larves au stade L4 dans la muqueuse de l’hôte est un phénomène fréquent associé à la résistance de l’hôte chez les ruminants (Balic et al., 2000). Ce phénomène a été décrit chez des ovins infestés par H. contortus (Barger et al., 1985), T. circumcincta (Seaton et al., 1989) et T. colubriformis (Barnes et Dobson, 1993). La fréquence de ce phénomène parmi les strongles gastro-intestinaux des ruminants suggère qu’il représente une stratégie efficace de survie des parasites (Balic et al., 2000). L’arrêt de développement des larves n’est par contre pas décrit dans les modèles murins de strongyloses gastro-intestinales (Onah et Nawa, 2000). *Résistance à l’établissement de nouvelles larves : La réduction du nombre de larves qui s’installent puis se développent en adultes est la manifestation majeure et la plus aboutie de l’immunité acquise dans les strongyloses gastrointestinales des ruminants. Elle est également décrite chez la souris après une ré-infestation avec différentes espèces de Strongyloïdes ou N. brasiliensis (Onah et Nawa, 2000). Chez les ruminants, de nombreuses études sur la résistance aux larves infestantes ont permis d’établir plusieurs points clés (Balic et al., 2000) : - cette résistance à l’établissement larvaire est plus fortement exprimée à l’issue de contacts répétés sur de longues périodes avec des larves infestantes : ainsi on peut l’observer chez le mouton après des infestations expérimentales quotidiennes par T. circumcincta (Seaton et al., 1989) ou H. contortus (Barger et al., 1985) après six ou huit semaines ; en revanche, il faut 21 à 35 semaines d’exposition selon les bovins pour acquérir une résistance à l’installation des larves infestantes d’O. ostertagi (Claerebout et al., 1996), - la résistance générée contre une espèce de nématode peut agir contre des espèces hétérologues présentes dans le même tissu (résistance croisée à l’installation de larves d’autres espèces de nématodes), - plusieurs mécanismes d’expulsion existeraient permettant d’expliquer des délais variables de rejet des larves : par exemple, l’expulsion des larves d’H. contortus chez le mouton peut avoir lieu dans les heures qui suivent l’infestation (Miller et al., 1983) ou bien 4 à 7 jours après l’ingestion des larves (Adams, 1982). 72 Contexte bibliographique 4.3.5. Régulation de la réponse immunitaire La réponse immunitaire adaptative de l’hôte, et probablement, pour une part encore largement inconnue, la réponse immunitaire innée, régulent les populations de strongles gastrointestinaux. Cependant, il reste surprenant qu’en dépit d’un système immunitaire puissant et doté de mécanismes effecteurs efficaces, ces parasites aient exploité cet habitat potentiellement hostile que représente le tube digestif pour développer leur cycle sophistiqué, survivre et se reproduire (Else, 2005). Il devient évident à l’heure actuelle que les strongles gastro-intestinaux exercent des effets immunomodulateurs sur le système immunitaire de l’hôte afin de vivre en équilibre avec celui-ci. Le meilleur exemple de ces effets sur le système immunitaire est illustré par le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin grêle et de la maladie de Crohn par l’utilisation d’helminthes du tractus digestif (Summers et al., 2003 ; Weinstock et al., 2004 ; Summers et al., 2005). Dans les modèles murins, une possible explication des infestations chroniques et de longue durée observées pour T. muris et H. polygyrus, est l’existence d’un phénotype Th2 modifié qui résulterait de la capacité des parasites à contraindre ou à modifier la réponse Th2 initiée par l’hôte lors de leur présence (Maizels et al., 2004 ; Else, 2005 ; Maizels, 2005). Les parasites gastro-intestinaux seraient ainsi capables d’altérer ou de modifier la réponse immunitaire de l’hôte via deux types majeurs de mécanismes ciblant des étapes clés de la réponse immunitaire : - l’induction de types cellulaires immunomodulateurs - la production de molécules parasitaires immunomodulatrices. 4.3.5.1. Induction de types cellulaires immunomodulateurs par les strongles gastrointestinaux *Les macrophages alternativement activés (Mϕ ϕAA) : L’activation des lymphocytes T et B dépend étroitement des signaux de co-stimulation délivrés par les cellules présentatrices d’antigènes, qui représentent ainsi des cibles attractives pour la modulation par les parasites. Le concept de MϕAA induit par les nématodes a été bien caractérisé lors d’infestations par des filaires (Loke et al., 2000) ou par N. brasiliensis (Ehigiator et al., 2000): ces macrophages inhibent la capacité de prolifération des lymphocytes par un mécanisme dépendant des contacts cellulaires. Ces cellules sont opposées aux macrophages classiquement activés car ils ne présentent pas de production accrue de la nitric oxyde synthetase mais celle d’une enzyme régulatrice, l’arginase. Ce phénotype 73 Contexte bibliographique particulier a initialement été démontré in vitro mais plusieurs études ont démontré qu’il existe in vivo lors d’infestations helminthiques (Loke et al., 2002 ; Maizels et al., 2004). Les données obtenues suggèrent que ces MϕAA auraient au moins deux fonctions distinctes : comme cellules down régulatrices, ils pourraient inhiber la réponse inflammatoire dirigée contre les parasites ; enfin, ils pourraient être nécessaires pour la réparation des dommages tissulaires causés par ces helminthes (Maizels et al., 2004). *Cellules dendritiques promouvant la réponse Th2 : L’effet des produits parasitaires sur les cellules dendritiques commence à être étudié (Sher et al., 2003) : la maturation de ces cellules avec des antigènes d’excrétion-sécrétion de N. brasiliensis favorise le développement d’une population de cellules dendritiques pro-Th2 (Balic et al., 2004). Les raisons de l’existence d’antigènes parasitaires capables de favoriser le développement de cellules dendritiques pro-Th2 ne sont pas claires, puisque ceci exacerberait la génération de réponses Th2 anti-parasitaires. Toutefois, la régulation ultérieure possible de ces réponses dans l’environnement du tube digestif, par des MϕAA par exemple, pourrait être mise à profit par les parasites (Else, 2005). *Lymphocytes T régulateurs : Des études épidémiologiques chez l’homme suggèrent que les infestations helminthiques confèrent une protection contre les allergies (à médiation Th2) et contre les maladies autoimmunes (à médiation Th1) (Hagel et al., 1993). Deux hypothèses, non exclusives, sont avancées pour expliquer ce phénomène : la régulation immunitaire et la déviation immunitaire (Else, 2005). La régulation immunitaire implique l’induction par les helminthes de lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+ (Akdis et al., 2005 ; Chatila, 2005), qui diminuent les réponses Th1 et Th2 via des cytokines anti-inflammatoires comme l’IL-10 ou le TGFβ β. La déviation immunitaire propose une diminution des réponses Th1 par l’induction d’une réponse Th2 par les helminthes. La production de lymphocytes T régulateurs par les helminthes leur permettrait, dans cette hypothèse, de prolonger leur survie et de protéger l’hôte contre des réactions immunopathologiques potentiellement dommageables. L’existence directe de lymphocytes T régulateurs a été démontrée lors d’infection par des schistosomes (Hesse et al., 2004) ou lors d’onchocercose chez l’homme (Doetze et al., 2000). Leur existence lors 74 Contexte bibliographique d’infestations par des strongles gastro-intestinaux chez la souris est moins claire, bien que supposée lors d’infestations par H. polygyrus (Maizels et al., 2004). 4.3.5.2. Production de molécules parasitaires immunomodulatrices *Molécules parasitaires mimant des molécules de l’hôte : Certains strongles gastro-intestinaux seraient capables de sécréter une multitude de molécules ressemblant à celles de l’hôte afin de détourner les réponses immunitaires en leur faveur (Else, 2005). Certaines molécules parasitaires par exemple ont des épitopes communs avec l’IFN-γ et pourraient se lier spécifiquement à son récepteur : chez la souris, la production d’un homologue de l’IFN-γ par T. muris favoriserait le développement d’une réponse Th1 non protectrice et donc la survie des parasites (Grencis et Entwistle, 1997). Les extraits de ce même parasite contiennent un homologue du MIF (macrophage-migration inhibitory-factor) impliqué dans l’activation des macrophages et qui pourrait avoir un rôle dans le développement du phénotype « alternativement activé » des macrophages lors d’infestation (Pennock et al., 1998). La déviation des réponses Th2 de l’hôte vers un phénotype Th1 par les parasites est également illustrée lors d’infestation par N. americanus chez l’homme, qui sécrète une protéine se liant aux cellules natural killer et induisant la production d’IFN-γ (Hsieh et al., 2004). *Molécules parasitaires altérant le recrutement des cellules effectrices et protégeant les parasites de celles-ci : N. americanus produit également des facteurs entravant le recrutement des polynucléaires éosinophiles : ce sont des métalloprotéases qui clivent spécifiquement le CCL3 ou Eotaxine, principale chémokine des éosinophiles (Culley et al., 2000). Chez la souris, N. brasiliensis a adopté la même stratégie en sécrétant une PAF-acétylhydrolase qui inactive le PAF (platelet activating factor) et donc diminue l’inflammation du tube digestif (Blackburn et Selkirk, 1992). Une caractéristique fréquente des nématodes gastro-intestinaux, dont Trichirus suis, Ascaris sp. et Ankylostoma ceylanicum, est la possession d’inhibiteurs de protéases dont le rôle immunomodulateur sur la réponse de l’hôte est suggéré (Hawley et al., 1994 ; Rhoads et al., 2000 ; Milstone et al., 2000). 75 Contexte bibliographique *Molécules parasitaires ayant un rôle sur la modulation de la présentation antigénique : Certains nématodes gastro-intestinaux seraient capables d’interférer avec les cellules présentatrices d’antigènes en produisant des inhibiteurs de protéases à cystéine (cystatines). Ces protéases sont importantes dans la dégradation initiale des protéines/antigènes dans le compartiment endosomal-lysosomal des cellules présentatrices d’antigènes. Ces cystatines ont été identifiées chez N. brasiliensis et H. contortus (Hartmann et Lucius, 2003). Les nématodes gastro-intestinaux possèdent donc une large variété de mécanismes immunorégulateurs entraînant une modification du phénotype de la réponse immunitaire de l’hôte en leur faveur, ou la prévention des attaques immunitaires en rendant inefficace la réponse effectrice (Figure n°11). Ces mécanismes pourraient avoir pour implication principale la production de vaccins contre ces molécules immunomodulatrices pour permettre l’expression d’une réponse effectrice correcte de la part de l’hôte, sans provoquer de pathologie dommageable pour celui-ci. Les données actuelles concernant la régulation de la réponse immunitaire par les nématodes gastro-intestinaux proviennent essentiellement de l’étude des modèles murins et restent largement méconnues chez les ovins. Néanmoins, l’aptitude des nématodes gastro-intestinaux à réguler la réponse immunitaire de l’hôte dans cette espèce pourrait varier en fonction des races ovines et peut-être expliquer des différences de sensibilité / résistance des ovins face aux nématodes du tractus digestif. 76 Contexte bibliographique Figure n°11 : Immunomodulation de la réponse immunitaire de l’hôte par les nématodes gastro-intestinaux : induction de lymphocytes T régulateurs, modification du phénotype des macrophages, production de molécules parasitaires capables d’interférer avec la présentation antigénique, de mimer des cytokines de l’hôte, de détruire des facteurs chimio-attractifs et de désarmer les réponses effectrices potentielles (d’après Else, 2005). 77 Contexte bibliographique La réponse immunitaire dirigée contre les strongles gastro-intestinaux représente donc une interaction complexe entre l’hôte et les parasites, mais semble également être la résultante d’un équilibre subtil entre ces deux protagonistes, permettant à la fois : - un contrôle par l’hôte des populations de strongles gastro-intestinaux et donc d’éviter les manifestations pathologiques néfastes des infestations parasitaires, - l’installation des parasites et la réalisation de leur cycle afin de pérenniser leur espèce ; les capacités des parasites à moduler la réponse de l’hôte en leur faveur illustrent bien cette notion d’équilibre qui se crée avec l’hôte. Les connaissances actuelles sur la réponse immunitaire des hôtes face aux strongyloses gastro-intestinales proviennent principalement des études dans des modèles murins. Chez les ovins, de nombreuses questions subsistent : - l’orientation initiale de la réponse immunitaire adaptative vers l’une des deux grandes voies Th1 ou Th2 n’est pas aussi clairement établie que chez les rongeurs et reste controversée, - la cinétique des mécanismes effecteurs, cellulaires ou humoraux, ainsi que leur rôle dans le contrôle des strongyloses, ne sont pas complètement élucidés, - les phénomènes d’immunomodulation par les populations parasitaires commencent à être étudiés chez les rongeurs mais restent inconnus dans l’espèce ovine, - enfin, les variations de résistance aux nématodes gastro-intestinaux entre races ovines restent à ce jour inexpliquées et le rôle éventuel que pourrait jouer la réponse immunitaire adaptative dans cette résistance reste à élucider. 78 Objectifs des travaux de thèse CHAPITRE III : OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THESE 79 Objectifs des travaux de thèse La lutte contre les nématodes gastro-intestinaux dans l’espèce ovine représente dans le contexte actuel un véritable enjeu d’élevage, notamment en raison de l’extension de la résistance des parasites aux trois grandes familles de molécules anthelminthiques et des perspectives peu encourageantes de mise au point et de commercialisation de nouvelles molécules efficaces dans un avenir proche. Les méthodes de contrôle alternatives ou complémentaires aux anthelminthiques, telles que la vaccination des animaux ou la sélection d’ovins résistants, constituent aujourd’hui des pistes prometteuses. Néanmoins, l’absence de connaissances solides des mécanismes de la réponse immunitaire adaptative des ovins contre les strongles gastro-intestinaux, à l’instar des données obtenues dans des modèles de parasitisme murin, est un frein majeur au développement à large échelle de ces méthodes. En particulier, l’orientation de la réponse immunitaire (polarisation Th1 ou Th2), la mise en place des mécanismes immunitaires effecteurs, et les effets de cette réponse sur les populations de strongles, ne sont pas complètement élucidés dans l’espèce ovine. Enfin, l’existence de races ovines résistantes au parasitisme gastro-intestinal est bien connue, mais les raisons de cet état de résistance, ainsi que l’implication éventuelle de la réponse immunitaire adaptative dans celui-ci restent une énigme. Dans un premier temps, les objectifs de nos travaux de thèse ont été : i) de définir la polarisation de la réponse immunitaire adaptative chez des ovins de race sensible (INRA 401), ii) d’étudier la cinétique de la mise en place des mécanismes effecteurs, iii) de caractériser les effets de la réponse immunitaire adaptative sur les nématodes gastro-intestinaux présents chez l’hôte. Dans cette première partie, nous avons choisi deux modèles parasitaires : Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis, en raison de : i) leur fréquence dans les élevages ovins français et de leur impact médical et économique non négligeable, ii) leur habitat chez l’hôte (respectivement la caillette et l’intestin grêle proximal) permettant de comparer les réponses immunitaires induites dans deux organes différents, iii) leur mode de nutrition (respectivement hématophage et chymivore), impliquant un contact plus ou moins étroit avec le système immunitaire de l’hôte. 80 Objectifs des travaux de thèse Dans un deuxième temps, la réponse immunitaire adaptative mise en jeu lors des infestations par ces strongles gastro-intestinaux a été comparée entre des ovins de race résistante (Barbados Black Belly) et des ovins sensibles (INRA 401). Existe t-il des variations de la réponse immunitaire (précocité ou intensité des réponses cytokiniques polarisantes, des mécanismes effecteurs) susceptibles d’expliquer les différences de résistance / sensibilité aux strongles du tractus digestif ? La première expérience de comparaison INRA 401 / Barbados Black Belly a été réalisée en utilisant H. contortus. En raison d’un manque de temps et de disponibilité des ovins Black Belly, la comparaison de ces deux races lors d’une infestation par T. colubriformis n’a pu être effectuée à ce jour. 81 Procédures expérimentales CHAPITRE IV : LES PROCEDURES EXPERIMENTALES (OUTILS METHODOLOGIQUES) 82 Procédures expérimentales 1. MODELES EXPERIMENTAUX 1.1. Les animaux 1.1.1. Ovins de race INRA 401 La race INRA 401 est le produit d’un programme de recherche INRA initié en 1963 pour renforcer la productivité du troupeau ovin français. Elle a été créée au domaine expérimental INRA de Bourges-La Sapinière, par croisements réciproques entre une race prolifique (Romanov) et une race bouchère (Berrichon du Cher). A partir de 1980, cette race a été diffusée vers des élevages privés et à l’heure actuelle, on rencontre ce type d’ovins principalement dans le sud de la France (62%) (François et al., 1998). Dans notre travail, les ovins de race INRA 401 ont été utilisés comme exemple d’ovins sensibles au parasitisme gastro-intestinal et, en particulier, à Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis. Figure n°12 : Ovin de race INRA 401 (Photo C. Lacroux) 1.1.2. Ovins de race Barbados Black Belly Les ovins Barbados Black Belly représentent l’une des races ovines dites “à poils ou sans laine” rencontrées aux petites Antilles et doivent leur nom à leur robe fauve-acajou avec un ventre, des extrémités et des sourcils noirs. Ces ovins ont été introduits aux Antilles à partir du XVème siècle ; leur origine la plus probable serait la côte du golfe de Guinée en Afrique noire (Mahieu et al., 1997 ; Naves et al., 2001). Le noyau Black Belly, entretenu et multiplié sur le domaine INRA de la Sapinière (Cher), a été importé sous la forme d’embryons d’un élevage INRA de Guadeloupe dans le but initial 83 Procédures expérimentales d’études sur la saisonnalité de la reproduction. Toutefois, la résistance de ce type d’ovins au parasitisme gastro-intestinal en fait un excellent modèle d’étude de la réponse immunitaire et de la régulation des populations de strongles, par comparaison avec une race sensible comme l’INRA 401. Figure n°13 : Ovins de race Barbados Black Belly (Photo C. Lacroux) 1.1.3. Age et sexe des animaux Les animaux ont été inclus dans nos expérimentations à l’âge de 3-4 mois. Les deux premières expérimentations ont été effectuées sur des agnelles de race INRA 401, alors que la comparaison entre les deux races ovines a été effectuée sur des mâles , pour des raisons de disponibilité limitée des femelles de race pure Barbados Black Belly. 1.2. Les parasites Les larves d’H. contortus utilisées proviennent de la souche « Humeau » isolée d’un élevage caprin dans la région du Quercy. Pour T. colubriformis, les larves infestantes sont issues de la souche « Weybridge » au Royaume-Uni, souche maintenue dans l’unité de parasitologie de la station INRA BASE de Tours-Nouzilly. Les larves infestantes sont récoltées à partir de coprocultures des matières fécales d’ovins infestés expérimentalement. Les larves utilisées en expérimentation ont environ 1 à 2 mois d’âge et sont conservées à 4°C. 1.3. Infestations expérimentales Les ovins ont été infestés par voie orale à la seringue, avec des doses de 10 000 L3, en primo comme en ré infestation. Une telle dose est suffisante pour entraîner une réponse chez l’hôte, 84 Procédures expérimentales mais n’entraîne pas de signes cliniques extrêmes voire la mort des animaux au cours de l’expérimentation. Les animaux ont été divisés en trois groupes : - un groupe primo-infesté ou immunisé (Lot A) : ces animaux ont été infestés une première fois 45 jours avant le début de l’expérimentation (immunisation) ; au bout de 30 jours, ils ont reçu un traitement anthelminthique par voie orale (Lévamisole 7.5 mg/kg ou Ivermectine ORAMEC Ovin 0.2 mg/kg) visant à terminer cette première infestation. Après 15 jours de repos, ces animaux ont été ré-infestés avec une dose parasitaire similaire (J0). - un groupe naïf : ces animaux ont été infestés une seule fois en début d’expérimentation (J0) - un groupe contrôle : ovins non infestés. Afin de suivre la cinétique de la réponse immunitaire et de ses effecteurs, mais également l’évolution de la population parasitaire au sein de l’hôte, les expérimentations ont été conduites avec des points d’abattage des animaux correspondant aux grandes étapes de développement des parasites : transformation des larves de stade 3 en stade 4 (J3 pour H. contortus ; J4 pour T. colubriformis), apparition des premiers vers immatures (J7 et J10 respectivement), apparition des premiers vers adultes (J15 et J17 respectivement) et fin du développement parasitaire avec présence d’adultes mâles, et femelles excrétrices d’œufs (J28). 2. ETUDE DES POPULATIONS PARASITAIRES 2.1. Comptage des œufs de strongles dans les matières fécales Le nombre d’œufs de strongles par gramme de matières fécales (ou OPG) est évalué par la technique McMaster, modifiée par Raynaud (1970). Elle permet de suivre l’excrétion des œufs pendant la période de ponte des femelles adultes, qui fait généralement suite à une période dite prépatente, durant de 17 à 21 jours après l’infestation de l’hôte. Les matières fécales sont directement prélevées dans le rectum des ovins et sont pesées. Un volume de 42 mL de NaCl (d=1,19) est ajouté à une quantité d’environ 3 grammes de fèces (obtention d’une suspension de matières fécales diluées au 1/15ème) ; l’ensemble est homogénéisé à l’aide d’un agitateur puis filtré dans une passoire à thé. Cette solution saline, 85 Procédures expérimentales d’une densité supérieure à celle de la plupart des œufs de parasites (d=1,19), permet la remontée des éléments parasitaires, donc leur flottation, tout en laissant couler les débris fécaux. Un échantillon du surnageant ainsi obtenu permet de remplir les deux cellules de la lame de McMaster (environ 0.5 mL par cellule). Dans chaque cellule se trouve un réseau quadrillé correspondant à un volume de 0.15 mL. Le comptage des œufs est réalisé dans l’ensemble du réseau. Le nombre d’œufs par gramme (OPG) est alors donné par la formule : OPG = (nombre d’œufs/volume total du réseau)*(volume de NaCl + poids des fécès) / poids des fécès De façon plus simple, chaque cellule de la lame de McMaster a un volume connu de 0,15 mL donc, comme la solution est diluée au 1/15ème, le nombre d’œufs comptés est celui contenu dans un centième de gramme de fèces. Pour obtenir le nombre d’œufs par gramme, on multiplie le résultat obtenu lors du comptage sur une cellule par 100 (on conseille toutefois de compter les deux cellules ; le facteur de multiplication est alors de 50), soit : OPG = Nombre d’œufs dans les deux cellules de la lame de McMaster x 50 2.2. Mise en culture in vitro des œufs de Haemonchus contortus Le développement des œufs en larves infestantes L3 correspond à la phase libre du cycle parasitaire des Trichostrongles. Cette étape revêt une importance particulière puisque son échec peut mettre en péril l’ensemble du cycle parasitaire. Nous nous sommes intéressés à la capacité des œufs récoltés dans les matières fécales à se transformer en L3 afin de vérifier que des œufs issus d’ovins résistants (comme les Barbados Black Belly) ont ou non la même capacité à évoluer en L3 que des œufs excrétés par des animaux de race sensible. Les matières fécales prélevées sur les ovins sont pesées et le nombre d’œufs par gramme qu’elles contiennent est évalué. Elles sont alors placées à 23°C pendant une dizaine de jours, période au cours de laquelle elles sont régulièrement humidifiées. Au bout de 10 jours, les larves L3 ainsi obtenues sont récoltées par la méthode de Baermann sur une nuit. Le comptage des larves récoltées permet ainsi de calculer le pourcentage d’œufs présents au départ qui ont évolué en larve L3. 86 Procédures expérimentales 2.3. Etude quantitative et qualitative de la population parasitaire chez l’hôte (bilans parasitaires) L’analyse quantitative de la population de strongles chez l’hôte permet de calculer le taux d’installation des larves infestantes grâce au nombre total de vers recueillis dans l’organe cible, et donc de comparer l’installation entre races résistantes et sensibles, entre ovins immunisés et naïfs, ou entre animaux d’un même groupe. A l’autopsie, l’organe cible de l’infestation parasitaire (caillette pour H. contortus ; les cinq premiers mètres d’intestin grêle pour T. colubriformis) sont isolés. Pour chaque organe, les vers sont recherchés : (i) dans le contenu de l’organe (ainsi que dans les lavages des parois de celui-ci), (ii) mais également dans la paroi de l’organe, afin de récupérer et de dénombrer les stades parasitaires non encore matures dans la muqueuse. Pour cela, l’organe cible est digéré dans une solution d’acide chlorhydrique / pepsine pendant 6 heures à 37°C. Ces différentes fractions sont filtrées dans un tamis à mailles de 40 µm afin d’éliminer les débris alimentaires, puis préservées par addition d’un large volume d’éthanol 70° jusqu’à analyse. Leur volume est ensuite ajusté à 1 litre et le nombre total de vers est estimé dans un aliquot de 10%. En parallèle du nombre total de vers, une analyse qualitative de la population de strongles est réalisée en dénombrant les différents stades parasitaires : larves L4, vers immatures mâles et femelles, vers adultes mâles et femelles. Cette analyse, lorsqu’elle est effectuée sur des prélèvements en cinétique, permet d’apprécier le développement des vers sur la période considérée, ainsi que la concordance ou non avec le schéma habituel de maturation larvaire. 2.4. Etude de la fécondité des femelles parasitaires adultes Un des effets de la réponse immunitaire sur la population parasitaire est une diminution de la fécondité des vers femelles. Cette fécondité peut être appréciée par deux paramètres : - (i) la longueur totale des femelles, - (ii) le nombre d’œufs parasitaires qu’elles contiennent dans leur utérus. Lors des dénombrements des différents stades parasitaires, une vingtaine de femelles adultes par animal sont prélévées et conservées dans de l’éthanol à 70°. Ces femelles sont, dans un premier temps, mesurées, puis plongées dans une solution de sodium hypochloride 4% jusqu’à complète désintégration. Cette étape a pour but de libérer les œufs de l’utérus de la 87 Procédures expérimentales femelle. Leur paroi étant relativement épaisse, ils résistent plus facilement à la désintégration dans la solution d’eau de Javel que le corps de la femelle, et peuvent ainsi être dénombrés (Kloosterman et al ., 1978). 3. ETUDE DE PARAMETRES PHYSIOPATHOLOGIQUES CHEZ L’HOTE 3.1. Suivi de l’éosinophilie sanguine La réponse d’un hôte face à une infestation par un helminthe se manifeste à différents niveaux, et notamment par une hyperéosinophilie sanguine suivie d’une infiltration éosinophilique de la muqueuse de l’organe infesté. Le suivi de cette éosinophilie permet : - de vérifier l’efficacité de l’infestation des larves administrées chez l’hôte et ce, dès le 7ème jour, - d’étudier l’intensité et la précocité de la réponse de l’hôte et de la comparer entre différents groupes expérimentaux ou différentes races ovines. L’éosinophilie sanguine (ou nombre de polynucléaires éosinophiles par mL de sang total) est déterminée selon la méthode de Dawkins et al. (1989). Le sang de l’hôte est prélevé à la jugulaire sur un tube contenant un anti-coagulant (EDTA) ; ces tubes peuvent être conservés jusqu’à 4 jours à 4°C. Dans un premier temps, une solution d’éosine est préparée dans les proportions suivantes : - 2 mL d’Eosine 2% (Eosin Y, Sigma) - 3 mL de formaldéhyde saturé en CaCO3 (Rectapur, Prolabo) - 95 mL d’eau Dans un tube à hémolyse, sont mélangés 900 µL de solution d’éosine et 100 µL de sang total. Ce mélange est homogénéisé afin de colorer tous les polynucléaires éosinophiles. Un volume de 20 µL de ce mélange est déposé sur une lame Fast Read (ISL, Royaume-Uni). La lecture et le comptage sont effectués au microscope au grossissement 400. Les polynucléaires éosinophiles sont reconnaissables à leur taille (15 µm environ), leur noyau généralement bilobé et leur cytoplasme chargé de fines granulations éosinophiles (rose vif). 3.2. Suivi de l’hématocrite Haemonchus contortus est un parasite hématophage capable d’entraîner chez son hôte une anémie plus ou moins sévère, parfois létale. Cet impact négatif du parasite sur son hôte peut 88 Procédures expérimentales être estimé grâce à la mesure de l’hématocrite (ou pourcentage d’hématies dans le sang). Les valeurs physiologiques de l’hématocrite chez les ovins sont de 30-35%. Le sang est récupéré sur tube EDTA à la jugulaire (le tube servant à estimer l’éosinophilie sanguine peut également permettre la mesure de l’hématocrite). L’analyse doit cependant être réalisée dans la demi-journée suivant le prélèvement afin d’éviter l’hémolyse. Après homogénéisation, le sang est prélevé dans un tube capillaire aux extrémités colmatées par de la pâte à modeler. Une centrifugation pendant 5 minutes à 4000 rpm permet la séparation du culot de globules rouges, des globules blancs (buffy-coat) et du plasma. L’hématocrite est déterminé grâce à une grille de lecture et le résultat exprimé en pourcentage. 4. ETUDE DE L’ORIENTATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE Nous avons choisi d’étudier l’orientation de la réponse immunitaire (polarisation Th1 ou Th2) par une technique de PCR quantitative en système « TaqMan » (GeneAmp 5700 Sequence Detector, Perkin Elmer). Le terme de TaqMan représente, par abus de langage, une contraction des mots Taq Polymérase et PacMan, et désigne l’appareil de mesure utilisé dans cette technique. 4.1. Principe de la PCR quantitative La PCR correspond à l’amplification d’un fragment d’ADN spécifique, grâce à l’utilisation d’une ADN polymérase (Taq Polymérase), et d’un couple d’amorces (« primers ») spécifiques. L’intensité de l’amplification de l’ADN ainsi obtenue peut être représentée par une courbe d’allure sigmoïde, dépendante du nombre de cycles de PCR (abscisse) et de l’intensité de la fluorescence émise (ordonnée). La fluorescence est obtenue par l’utilisation d’un agent intercalant : le SYBR Green I, colorant qui ne devient fluorescent que lorsqu’il se lie à l’ADN double brin. L’utilisation de ce colorant permet de s’abstenir de la conception de sondes spécifiques. Toutefois, la fluorescence mesurée peut alors provenir d’une amplification non spécifique, d’où l’intérêt de s’assurer de la spécificité du couple d’amorces utilisé ainsi que des produits de PCR. 89 Procédures expérimentales Figure n°14 : Représentation schématique de l’amplification par PCR quantitative d’échantillons d’ADN. 4.2. Du tissu à l’ARN… Les échantillons collectés à l’autopsie (fragments de muqueuse, de nœud lymphatique) sont immédiatement congelés en azote liquide dans une solution de TRIzol Reagent (Invitrogen, référence 15596-018) puis conservés à –70°C jusqu’à utilisation. Les échantillons, placés dans des tubes à vis contenant des microbilles de céramique, sont alors broyés et homogénéisés par un ribolyseur (Hybaid RiboLyserTM), lors de deux cycles d’agitation de 30 secondes à une vitesse de 4.5. Pour éviter une dégradation des ARN lors de cette étape, la vitesse utilisée n’est pas maximale (ce qui évite l’échauffement des tubes) et les échantillons sont immédiatement placés sur la glace entre et après les cycles de broyage. L’extraction ultérieure d’ARN fait appel à une contraction de deux protocoles : une extraction classique manuelle utilisant un mélange TRIzol/chloroforme, suivie d’un passage sur des colonnes d’extraction prévues à cet effet. Brièvement, 50 µL d’échantillon broyé sont mélangés à 950 µL de TRIzol auxquels sont ajoutés 200 µL de chloroforme. Les échantillons sont alors centrifugés pendant 15 minutes à 12 000g à température ambiante. Cette étape permet de séparer les ARN (surnageant après centrifugation) des protéines et de l’ADN. Afin d’obtenir des ARN dénués au maximum d’inhibiteurs de PCR, classiquement présents dans le contenu digestif (sels biliaires par exemple …), cette première étape d’extraction est 90 Procédures expérimentales suivie d’un « nettoyage » des ARN selon le protocole RNA Clean Up Qiagen (RNEasy Mini Kit). La concentration en ARN de chaque échantillon est obtenue par spectrophotométrie à la longueur d’onde 260 nm. La qualité / dégradation des ARN peut également être évaluée par électrophorèse en gel d’agarose à 1%, comportant du bromure d’éthidium. 4.3. Isolement des cellules CD4 positives du nœud lymphatique abomasal pour extraction spécifique des ARN de cette fraction cellulaire Le nœud lymphatique abomasal est retiré lors de l’autopsie et plongé dans une solution de PBS (Phosphate Buffered Saline) 1X sur la glace. Il est broyé à l’aide d’un tamis cellulaire muni de pores de 40 µm de diamètre et les cellules obtenues sont collectées dans une solution d’HBSS (Hank´s Balanced Salt Solution). Après deux lavages, 1.107 cellules sont remises en suspension dans 500 µL de tampon FACS (PBS 1X, 2mM EDTA et 0.5 % de BSA (Bovine Serum Albumin)) et incubées pendant 30 minutes sur la glace en présence de l’anticorps primaire dirigé contre l’épitope CD4 marqué FITC (Mouse anti-ovine CD4 :FITC, SEROTEC, référence MCA2213F) dilué au 1/150ème. Après lavage, le culot cellulaire est repris dans 80 µL de tampon FACS et incubé 15 minutes à 4°C avec 20 µL de billes magnétiques couplées à un anticorps monoclonal anti-FITC (Anti-FITC Microbeads, Miltenyi Biotec, référence 130-048-701). Les cellules sont alors reprises sous un volume de 1 mL de tampon FACS après deux lavages, et triées au moyen d’un AUTOMACS (Miltenyi Biotec) selon le programme POSSEL-D (tri en double colonne, permettant d’obtenir un excellent degré de pureté). Brièvement, l’appareil de tri cellulaire est muni de deux colonnes de tri qui retiennent les billes magnétiques ayant accroché les cellules d’intérêt. L’élution ultérieure permet de récupérer une fraction positive (contenant dans notre cas les cellules positives CD4+) et une fraction négative (cellules non marquées par l’anticorps primaire). Toutes les étapes de lavage sont réalisées à 4°C afin de préserver au maximum l’intégrité des cellules. La fraction positive d’intérêt récupérée après tri cellulaire est alors conservée en tampon RLT à –70°C, à raison de 1.106 cellules dans 350 µL de RLT additionné de β-mercaptoéthanol. L’ARN de ces cellules sera alors extrait selon le protocole Qiagen décrit ci-dessus (Qiagen RNEasy Mini Kit). Après chaque tri cellulaire, une analyse de confirmation a été effectuée en cytométrie de flux (analyse FACS) sur un échantillon des fractions cellulaires obtenues, afin de vérifier la pureté 91 Procédures expérimentales des cellules CD4+ triées ainsi que le pourcentage d’enrichissement de ces cellules par rapport à la population ganglionnaire totale de départ. 4.4. De l’ARN à l’ADN complémentaire (ADNc)… Dans nos travaux, l’étape de RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) a été effectuée sur une quantité totale de 2 µg d’ARN pour chaque échantillon, ajustée à 16 µL dans de l’eau ppi. Les 2 µg d’ARN sont préalablement digérés pendant une heure à 37°C en présence d’1U de DNAse RNAse-free, afin d’éliminer toute trace d’ADN génomique. Un premier mix contenant les oligonucléotides (Random Primers, Invitrogen, référence 48190-011) est rajouté à chaque échantillon, suivi d’une incubation de 10 minutes à 65°C. Un deuxième mix, contenant des dNTP et l’enzyme de reverse transcription (M-MLV, Invitrogen, référence 28025-013, 400 unités/échantillon) est ensuite ajouté aux échantillons. Après une incubation d’une heure à 42°C, la réaction de transcription est stoppée par une incubation de 5 minutes à 95°C. Les ADNc ainsi obtenus sont alors congelés à –20°C en attente d’être utilisés pour la PCR quantitative. 4.5. PCR quantitative Les échantillons d’ADNc sont utilisés dilués au 1/100ème et en duplicate pour l’étape de PCR quantitative. Les couples d’amorces utilisées ont été dessinées à l’aide du logiciel Primer Express Software (Applied Biosystems) et sont listées dans le Tableau n°10. Pour être utilisables en système SYBR Green, ces primers doivent posséder certaines caractéristiques : - température d’hybridation d’environ 60°C - %GC entre 40 et 60 - absence d’hybridation des deux amorces entre elles (absence de dimérisation) et absence de repliement d’une amorce sur elle même (repliement en épingle). Dans le cas où la séquence du gène des cytokines d’intérêt était connue pour l’espèce ovine, les primers ont été déterminés directement à partir de celle-ci (cas des gènes de la β-actine, des interleukines (IL) 3, 4, 5, 10, 12, du TNF-α et de l’interféron-γ). Dans le cas contraire (IL13 et Eotaxine), l’alignement entre les séquences des gènes des cytokines connues dans d’autres espèces animales (bovin, caprin, souris, rat…) a permis d’obtenir une séquence dite « consensus » sur laquelle les primers ont été déterminés. Ceux-ci ont été utilisés en PCR classique sur des cellules sanguines ovines (Peripheral Blood Mononuclear Cells stimulés 92 Procédures expérimentales avec un mitogène tel que la Phytohématoagglutinine ou PHA) afin de tester leur compatibilité avec l’espèce ovine (obtention d’une bande sur gel au poids moléculaire de la cible attendue). Cytokine Séquence sens SEQUENCE ANTI-SENS Ovine Beta-actin ACCAGTTCGCCATGGATGAT AGCCGTTGTCAACCACGAG Ovine IFN-γ ATCTCTTTCGAGGCCGGAGA ATTGCAGGCAGGAGAACCAT Ovine IL-4 GGAGCTGCCTGTAGCAGACG TTCTCAGTTGCGTTCTTTGGG Ovine IL-10 CTGAGAACCATGGGCCTGAC TCTCCCCCAGCGAGTTCAC Ovine TNF-α CCCGTCTGGACTTGGATCCT TGCTTTTGGTGCTCATGGTG Ovine IL-12p40 GAATTCTCGGCAGGTGGAAG GTGCTCCACGTGTCAGGGTA Ovine IL-13 CACTCAGCATCCTCTTGGTCC TGATCAGCATCTCCAACTGCA Ovine Eotaxin ACAAGAAAATCTGTGTTGATCCCC CCATGGCATTCTGGACCC Ovine IL-5 CTGCTGATAGGTGATGGGAACTT GGTGATTTGTATGCTGAGGAGTAGG Ovine IL-3 AAGAATATCCTGGCGAATAAGAGC GAACGCTTTCAGGTTTGCCT Tableau n°10 : Séquences sens et anti-sens des amorces utilisées en PCR quantitative. La quantification des échantillons analysés en PCR quantitative a été réalisée au moyen d’une gamme externe standard de plasmide déterminée pour chaque cytokine testée (séries de dilution au 1/10ème, couvrant généralement un nombre de copies allant de 1.107 à 1.101) . Ces plasmides ont été obtenus après clonage des produits de PCR classique pour chaque cytokine en système TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen). Les résultats obtenus pour chaque cytokine ont été normalisés par rapport au niveau d’amplification du gène de ménage β-actine et donc exprimés en nombre de copies relatives à celle-ci. Enfin, pour chaque réaction ont été inclus des contrôles négatifs sans ADNc (Non 93 Procédures expérimentales template control ou NTC) afin de vérifier l’absence d’amplification non spécifique et l’absence de dimérisation des amorces. 5. EXPLORATION DE LA REPONSE HUMORALE GENERALE GENERALE ET LOCALE La réponse humorale ou réponse « anticorps » peut être étudiée à l’échelle de l’organisme (réponse générale ou systémique) ou à l’échelle de l’organe cible de l’infestation parasitaire (réponse locale) soit, dans notre cas, la caillette (H. contortus) ou le duodénum (T. colubriformis). Dans le sérum ou le mucus digestif sont ainsi mis en évidence des anticorps, principalement des immunoglobulines (Ig) A ou IgG, spécifiques des antigènes parasitaires, et correspondant à différents stades de développement des vers, par une méthode ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). 5.1. Collecte des prélèvements La réponse humorale générale est étudiée au niveau sérique. Une prise de sang sur tube sec est réalisée sur l’animal par ponction jugulaire, et le sérum est récupéré puis congelé à –20°C après une centrifugation de 5 minutes à 5000 rpm. La réponse humorale locale est explorée au niveau du mucus abomasal ou intestinal. Le mucus est récupéré sur des bandelettes de papier filtre de 5 cm de long sur 1 cm de large, imprégnées de PBS, déposées sur la muqueuse digestive pendant 5 minutes. Ces bandelettes sont ensuite placées dans une solution de PBS sous agitation pendant 2 heures à température ambiante. Les surnageants obtenus sont alors congelés à –20°C pour analyse ultérieure. 5.2. Préparation des antigènes Différentes préparations antigéniques ont été utilisées pour mettre en évidence des anticorps spécifiques : - produits d’excrétion-sécrétion de vers adultes (PES), - produits d’excrétion-sécrétion de larves de stade L4 (non disponibles pour H. contortus en raison de la grande difficulté d’isoler des larves L4 de la paroi de la caillette), - broyats totaux de larves L3. L’obtention de vers adultes est réalisée par infestation massive (50 000 larves infestantes) d’un mouton donneur, euthanasié 30 jours après le challenge. Les vers adultes sont isolés du contenu alimentaire abomasal ou duodénal. Après plusieurs lavages dans du PBS contenant 94 Procédures expérimentales de la pénicilline (100 UI/mL) et de la streptomycine (1 mg/mL), ces vers sont maintenus à 37°C, pendant une nuit environ (H. contortus) ou 48 heures (T. colubriformis), sous 5 % de CO2 dans la même solution de PBS à raison d’une densité maximale de 50 adultes par puits de plaque de culture cellulaire pour H. contortus, et de 200 adultes par puits pour T. colubriformis. Le surnageant de cette culture (produits d’excrétion-sécrétion) est alors collecté et filtré (0.2 µm). L’obtention des larves L4 nécessite également une infestation similaire d’un ovin donneur, avec une euthanasie réalisée seulement 4 jours après l’infestation. Les cinq premiers mètres d’intestin grêle sont mis à tremper dans du sérum physiologique à 37°C pendant 2 heures pour faire sortir les larves de la muqueuse. Le contenu intestinal est ensuite filtré sur un appareil de Büchner : brièvement, les larves ainsi que les débris alimentaires sont aspirés et retenus sur un filtre Wathmann par un système de pompe à vide. Une fois tout le contenu absorbé sur le papier, ce dernier est retourné dans une boîte de Pétri contenant une solution de PBS additionnée d’antibiotiques (concentrations identiques à celles décrites pour l’obtention des vers adultes). Les larves L4, mobiles, passent activement dans cette solution et sont ensuite mises en culture à raison de 1000 larves par puits de plaque de culture, pendant environ 48-72 heures. Le surnageant de culture obtenu contient les produits d’excrétion-sécrétion de ces larves. Les antigènes de larves L3 sont obtenus après trois cycles de congélation / décongélation des larves (-70°C ; 25°C), homogénéisation à 4°C et centrifugation à 30 000g pendant 30 minutes à 4°C. La concentration en protéines de ces surnageants est déterminée par la méthode de Lowry et al. (1951). 5.3. Détermination des conditions optimales pour l’ELISA Les concentrations optimales des réactifs utilisés (anticorps secondaire, conjugué), des préparations antigéniques et les dilutions des échantillons (mucus ou sérum) sont déterminées par séries de test sur des échantillons positifs (mucus ou sérum d’ovins immunisés avec le parasite d’intérêt) et négatifs (mucus ou sérum d’ovins contrôles, non-infestés). Les paramètres retenus sont présentés dans les tableaux n°11 (H. contortus) et n°12 (T. colubriformis). Ils permettent d’obtenir un bruit de fond minimal et une distinction maximale entre les échantillons positifs et négatifs. 95 Procédures expérimentales SERUM MUCUS IgG ISOTYPE IgA IgG IgA Type d’antigène ESP Ad CEL3 ESP Ad CEL3 ESP Ad CEL3 ESP Ad CEL3 Concentration de l’antigène (µg/mL) 2 2 5 2 5 0.5 5 2 Dilution du sérum ou mucus 1:100 1:100 1:5 1:5 1:1 1:1 1:1 1:1 Dilution de l’anticorps secondaire 1:1000 1:1000 1:100 1:100 1:1000 1:1000 1:250 1:250 Dilution du conjugué - - 1:500 1:500 - - 1:500 1:500 Tableau n°11 : Conditions optimales utilisées pour la détection d’IgA et IgG dans le sérum et le mucus, dirigées contre des antigènes d’excrétion-sécrétion de vers adultes (ESP Ad) ou contre des antigènes de broyat total de larves L3 (CEL3) d’H. contortus, par technique ELISA. 96 Procédures expérimentales SERUM ISOTYPE MUCUS IgG IgA IgG IgA Type d’antigène ESP Ad ESP L4 CEL3 ESP Ad ESP L4 CEL3 ESP Ad ESP L4 CEL3 ESP Ad ESP L4 CEL3 Concentration de l’antigène (µg/mL) 0.5 0.5 1 1 1 1 1 1 0.5 2 1 1 Dilution du sérum ou mucus 1:200 1:100 1:100 1:200 1:100 1:200 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 Dilution de l’anticorps secondaire 1:2000 1:2000 1:2000 1:250 1:250 1:250 1:1000 1:1000 1:1000 1:250 1:250 1:250 Dilution du conjugué - - - 1:500 1:500 1:500 - - - 1:500 1:500 1:500 Tableau n°12 : Conditions optimales utilisées pour la détection d’IgA et IgG dans le sérum et le mucus, dirigées contre des antigènes d’excrétion-sécrétion de vers adultes (ESP Ad), de larves L4 (ESP L4) ou contre des antigènes de broyat total de larves L3 (CEL3) de T. colubriformis, par technique ELISA 97 Procédures expérimentales 5.4. Technique ELISA La méthode employée dans nos travaux est un test ELISA de type indirect. Des plaques à fond plat (Nunclon, VWR International) sont coatées pendant une nuit à 4°C avec 100 µL/puits d’antigène dilué dans un tampon sodium carbonate. Ces plaques sont ensuite lavées deux fois avec du PBS pH=7.2 contenant 0.1% de Tween 20 (PBS-T). Afin de minimiser la fixation non spécifique des anticorps, les plaques sont ensuite incubées pendant une heure à 37°C avec 200 µL/puits de PBS-T contenant 5 % de lait écrémé (PBS-TM). Les plaques sont alors vidées de cette dernière solution, incubées pour une heure à 37°C avec le sérum ou le mucus, pur ou à la dilution optimale préalablement déterminée, puis lavées trois fois avec du PBS-T. - Mise en évidence des IgG totales : les plaques sont incubées avec 100 µL/puits d’anticorps secondaire directement couplé à HRP (donkey anti-sheep IgG-HRP, SIGMA, référence A3415) - Mise en évidence des IgA : 100 µL/puits de l’anticorps secondaire (mouse IgG1 antiIgA bovine/ovine, SEROTEC, référence MCA628) sont incubés pendant une heure avant d’appliquer 100 µL/puits de conjugué couplé à HRP (Goat anti-mouse IgG1-HRP, SEROTEC, référence STAR81P), ces deux étapes étant séparées par trois lavages des plaques. La révélation est alors réalisée selon une réaction colorimétrique par une incubation des plaques avec 100 µL/puits de 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS) pendant une heure à 37°C. La réaction est stoppée en plaçant les plaques pendant 15 minutes à 4°C. La densité optique est alors mesurée à la longueur d’onde 405 nm par un lecteur de plaques (Microplate Reader, Dynatech). Le résultat final a été exprimé en densité optique corrigée, c’est à dire la densité optique obtenue par le lecteur à laquelle a été retirée la valeur obtenue pour les puits « blancs » contrôles, ne contenant que du PBS initialement. 6. ETUDE DE LA REPONSE CELLULAIRE LOCALE La réponse cellulaire locale (dans la muqueuse abomasale lors d’infestation par H. contortus, et dans la muqueuse du duodénum proximal lors d’infestation par T. colubriformis) a été étudiée par un dénombrement des différentes populations cellulaires présentes dans la muqueuse. Ont été ainsi dénombrées : 98 Procédures expérimentales (i) des cellules inflammatoires ou cellules effectrices de l’immunité : polynucléaires éosinophiles, globule leucocytes et mastocytes ; ces cellules ont été comptées sur des lames traitées par histologie conventionnelle (colorations classiques Hémalun-éosine ou Giemsa) (ii) des cellules impliquées dans la réponse immunitaire non spécifique (macrophages) ou spécifique (lymphocytes T, ainsi que les deux sous-types lymphocytaires T CD4+ et CD8+, et les lymphocytes B). La différenciation de ces types cellulaires fait appel à des marquages immunohistochimiques, sur coupes en paraffine ou en congélation. Pour chaque type cellulaire, les comptages ont été effectués sur 5 champs sélectionnés de manière aléatoire sur la lame, au grossissement 400. Les résultats ont été exprimés par la somme du nombre de cellules d’intérêt des 5 champs microscopiques examinés. 6.1. Histologie conventionnelle et immunohistochimie sur coupes en paraffine 6.1.1. Collecte des prélèvements A l’autopsie, des fragments de tube digestif (paroi de la caillette en régions fundique, antrale et pylorique pour les études sur H. contortus ; paroi duodénale pour T. colubriformis) sont immédiatement plongés dans une solution de formaldéhyde à 10% jusqu’à fixation complète de l’échantillon. 6.1.2. Technique histologique Après déshydratation dans des bains successifs d’alcool de degrés croissants et de toluène (cycle automatisé complet de 18 heures), les échantillons sont inclus en paraffine. Des coupes de 3 µm d’épaisseur sont réalisées à partir des blocs à l’aide d’un microtome (Microm, France) et récupérées sur des lames prétraitées (lames Superfrost Plus, Labonord, France). 6.1.3. Colorations à l’Hémalun/Eosine et au Giemsa Pour le dénombrement des polynucléaires éosinophiles et des globule leucocytes, les lames sont colorées selon un protocole classique d’Hémalun-éosine. Les polynucléaires éosinophiles sont aisément reconnaissables grâce à leur noyau généralement bilobé et leur cytoplasme hébergeant de nombreuses granulations éosinophiles de petite taille (Figure n°15A). Les globule leucocytes, stade ultime de la différentiation des mastocytes, sont en général situés en position intra-épithéliale (épithélium superficiel ou épithélium glandulaire) (Figure n°15B). 99 Procédures expérimentales Ces cellules possèdent un noyau arrondi central et de nombreuses et volumineuses granulations arrondies, éosinophiles nettes. En revanche, les lames destinées au comptage des mastocytes ont été traitées selon une coloration de Giemsa, qui permet de mieux visualiser les granulations mastocytaires, qui prennent ainsi une teinte violet-pourpre vive (Figure n°15C). Figure n°15 : Coupes histologiques de caillette d’ovins infestés par H. contortus, mettant en évidence des polynucléaires éosinophiles (A, coloration Hémalun-Eosine, grossissement 400), des globule leucocytes (B, coloration Hémalun-Eosine, grossissement 400) et des mastocytes (C, coloration Giemsa, grossissement 400). 100 Procédures expérimentales 6.1.4. Immunohistochimie sur coupes en paraffine Le protocole utilisé pour l’immunohistochimie est celui décrit par Andréoletti et al. (2002). Les lames sont chauffées à 56°C pendant une nuit avant d’être déparaffinées et réhydratées (différents bains de 5 minutes : toluène, éthanol absolu, éthanol 95° puis rinçage à l’eau courante). Les sections tissulaires sont alors autoclavées pendant 10 minutes à 121°C dans une solution de tampon citrate 10mM (pH 6.15) afin de démasquer les épitopes antigéniques, la fixation au formaldéhyde pouvant créer des ponts méthylènes sur les protéines et ainsi « cacher » certains antigènes d’intérêt. Les peroxydases endogènes sont inhibées par incubation des lames dans une solution de peroxyde d’hydrogène 30% dans du méthanol pendant 30 minutes à température ambiante. Une incubation ultérieure de 20 minutes dans une solution de PBS contenant 20% de sérum normal de chèvre permet de bloquer les sites non spécifiques d’attache des anticorps primaires. L’incubation de l’anticorps primaire se fait à température ambiante pendant 1 heure. Elle est suivie d’une incubation de 30 minutes d’un anticorps secondaire de chèvre dirigé contre les chaînes lourdes d’immunoglobulines de souris et de lapin, dilué au 1/100ème. Un complexe streptavidine-peroxydase dilué également au 1/100ème est ensuite appliqué pendant 30 minutes. La révélation est réalisée avec de la 3,3’-diaminobenzidine (DAB) (ChemMate Detection Kit Peroxydase/DAB, DAKO, référence K5001). Les sections tissulaires sont finalement contre-colorées à l’Hématoxyline de Mayer. Dans notre travail, les anticorps primaires utilisés ont été : - un anticorps spécifique des macrophages / monocytes : mouse anti-human CD68, clone Ki-M6 (SEROTEC), dilution 1/150ème, - un anticorps spécifique des lymphocytes B : mouse anti-human CD20-like, clone BLA-36 (NOVOCASTRA), dilution 1/50ème, - un anticorps spécifique des lymphocytes T : rabbit anti-human CD3, A0542 (DAKO), dilution 1/100ème, La réactivité de ces différents anticorps contre les antigènes ovins avait été préalablement vérifiée (Ramos-Vara et al., 1994 ; Andréoletti et al., 2002 ; Tabouret et al., 2003 ; Valentine et McDonough, 2003). 101 Procédures expérimentales Figure n°16 : Coupes histologiques de caillette d’ovins infestés par H. contortus, mettant en évidence des macrophages (A, marquage immunohistochimique sur coupes en paraffine, anticorps Ki-M6, grossissement 400) et des lymphocytes B (B, marquage immunohistochimique sur coupes en paraffine, anticorps BLA-36, grossissement 400). 6.2. Immunohistochimie sur coupes en congélation 6.2.1. Collecte et technique des prélèvements Des fragments de muqueuse digestive, identiques à ceux prélevés pour histologie conventionnelle, ont été immédiatement congelés lors de l’autopsie dans de l’azote liquide, après avoir été placés sur des bouchons de liège préalablement imprégnés de Tissue-Tek (Labonord). Le support de liège permet de conserver une orientation correcte des prélèvements pour leur utilisation ultérieure (dans le cas particulier de la muqueuse digestive, conservation d’une orientation transversale nécessaire à l’observation microscopique des différentes couches de la paroi). Les échantillons sont alors conservés à –70°C jusqu’à la coupe. Celle-ci est effectuée à l’aide d’un cryomicrotome (Leika). Les sections de 5 µm d’épaisseur ainsi obtenues sont montées sur des lames prétraitées (Superfrost Plus, Labonord) et fixées pendant 20 minutes dans un bain d’acétone. 6.2.2. Immunohistochimie Le protocole utilisé sur des coupes obtenues en congélation est identique à celui décrit pour les coupes en paraffine, à la seule différence qu’il n’existe évidemment pas d’étapes de déparaffinage ni de démasquage antigénique. Cette technique est nécessaire pour la mise en 102 Procédures expérimentales évidence d’antigènes qui seraient détruits par une fixation préalable des échantillons, ce qui est le cas pour les marqueurs membranaires qui nous intéressaient : CD4+ et CD8+. Les anticorps primaires utilisés dans ces deux cas sont : - un anticorps spécifique des lymphocytes T CD4+ : mouse anti-ovine CD4, MCA2213 (SEROTEC), dilution 1/2000ème, - un anticorps spécifique des lymphocytes T CD8+ : mouse anti-bovine CD8, MCA837G (SEROTEC), dilution 1/800ème. Là encore, la réactivité de ces anticorps dans l’espèce ovine est connue et précisée par le fabricant. Figure n°17 : Coupe histologique de caillette d’ovin infesté par H. contortus mettant en évidence des lymphocytes CD4+ (marquage immunohistochimique sur coupe en congélation, anticorps anti-CD4, grossissement 1000). 7. ETUDE DE LA LYMPHOPROLIFERATION SPECIFIQUE D’ANTIGENES PARASITAIRES 7.1. Principe Nous avons choisi d’évaluer l’intensité de la réponse immunitaire par un test de transformation lymphoblastique in vitro, ou lymphoprolifération. Cette technique permet de déterminer la proportion de lymphocytes T spécifiques d’un antigène, capables de réagir à ce dernier par une expansion clonale. Elle est applicable aux lymphocytes sanguins, mais également aux lymphocytes tissulaires et, en particulier, ceux des structures ganglionnaires. L’antigène parasitaire est processé par des cellules présentatrices d’antigènes et présenté aux 103 Procédures expérimentales lymphocytes T via le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de type II. Les signaux transduits suite à l’interaction entre le CMH II et l’antigène via le récepteur lymphocytaire T entraîne leur activation et leur progression dans le cycle cellulaire. 7.2. Technique 7.2.1. Préparation des cellules - A partir du sang circulant : une prise de sang est effectuée à la jugulaire sur tube EDTA et dilué volume à volume dans du RPMI 1640. Le sang ainsi dilué est déposé sur de l’Histopaque 1.077 (Sigma Diagnostics) et centrifugé pendant 30 minutes à 1100g. Les cellules mononucléées sont recueillies et lavées deux fois dans du RPMI 1640 (deux centrifugations de 12 minutes à 200g et 4°C séparant les lavages). - A partir d’un nœud lymphatique : un fragment de nœud lymphatique est prélevé aseptiquement lors de l’autopsie et coupé en deux parties égales, qui sont broyées dans un gaze stérile au dessus d’une boîte de Pétri contenant du RPMI 1640. La suspension cellulaire obtenue est alors déposée sur l’Histopaque 1.077 et les cellules mononucléées sont obtenues et lavées comme précédemment décrit. 7.2.2. Mise en culture et stimulation des cellules mononucléées Les cellules sont re-suspendues dans un milieu de culture adapté (RPMI 1640, 20% de sérum de veau fœtal, 1% pénicilline-streptomycine, 1% glutamine). Leur viabilité est appréciée par une coloration d’exclusion au Bleu Trypan (colore en bleu les cellules mortes). Ces cellules sont mises en culture à raison de 12 x 105 cellules par puits dans des plaques 96 puits (Microtest 96, Flacon, Becton-Dickinson) pendant 7 jours à 37°C dans une atmosphère humide à 5% de CO2. Trois modalités de culture sont mises en place : - culture en présence d’un agent mitogène, la PHA (phytohémagglutinine, PHA-L, Sigma) à raison de 10 µg/mL : ces puits de culture représentent un témoin positif de prolifération des lymphocytes face à un mitogène non spécifique, - culture en présence d’antigènes parasitaires de vers adultes ou de larves 4 (antigènes d’excrétion-sécrétion), ou d’antigènes totaux de larves 3, issus de H . contortus ou T. colubriformis en fonction des expérimentations (concentrations d’antigènes variables entre 10 et 20 µg/mL), 104 Procédures expérimentales - culture en l’absence de tout mitogène ou antigène parasitaire (puits contrôles, 6 par plaque). Chaque modalité est réalisée en triplicate. 7.3. Interprétation des résultats La prolifération des cellules en fin de culture est évaluée par un test colorimétrique (CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega). La densité optique (DO) de chaque puits est déterminée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 450 nm. Les résultats sont exprimés par un index de stimulation (SI) déterminé par la formule : SI = ((DO moyenne des triplicates de culture en présence d’antigène parasitaire / DO moyenne des six puits contrôles) x100) –100 8. ANALYSES STATISTIQUES Les comparaisons entre les différents groupes expérimentaux et entre les différentes dates de la cinétique ont été effectuées au moyen de tests statistiques non paramétriques (KruskallWallis, Mann-Whitney) grâce au logiciel SYSTAT. Le suivi de certains paramètres (éosinophilie sanguine, coproscopies…) sur les mêmes animaux à des dates successives a fait l’objet d’une analyse de variance en données répétées (SYSTAT). Une probabilité inférieure à 5% a été considérée comme significative. Les analyses discriminantes ont été réalisées avec le logiciel STAT-ITCF (Institut Technique des Céréales et des Fourrages, 1991). L’interprétation de cette analyse multivariée a été faite selon Lebart et al. (1995). Elle permet de déterminer les corrélations entre les variables étudiées et de déterminer celles ayant un poids significatif dans l’analyse. Cette analyse détermine deux axes discriminants (nombre de groupes moins 1), qui sont des combinaisons linéaires entre les variables quantitatives mesurées. Ces deux combinaisons linéaires sont choisies pour permettre une discrimination optimale entre les différents groupes : variabilité maximale entre les groupes et variabilité minimale au sein d’un groupe donné. Les corrélations entre les différentes variables sont représentées par un cercle : les variables positivement corrélées entre elles sont très proches sur le cercle, alors que les variables négativement corrélées sont situées sur des côtés opposés du cercle (Figure n°18). 105 Procédures expérimentales Axis 2 (28% inertia) IL-5 Globule Leukocytes FIL-5 Ab2 IL-13 Mast cells Ab3 FIL-3 Bcells IL-10 Eotaxin Ab1 Ab6 Eosinophils Tcells Ab7 CD4 FIL-4 Axis 1 (72% inertia) IFN-γ IL-3 Ab4 0 Lymphocytes proliferation ImF CD8 IL-12 TNF-α Ab5 Length El4 FIL-13 Ll4 AdM ImM Eggs IL-4 Worms AdF Feotaxin Epg28 Macrophages Epg21 Figure n°18 : Exemple de cercle de corrélations obtenu par analyse discriminante. La détermination de deux axes discriminants (ainsi que leur inertie respective) permet de visualiser les variables positivement corrélées entre elles (proches sur le cercle, ex : Globule leucocytes et FIL-5) ou bien négativement corrélées entre elles (situées sur des côtés opposés du cercle, ex : FIL-4 et IFN-γ). Dans cet exemple, les variables discriminantes (ayant un poids dans l’analyse) étaient représentées par des triangles noirs. L’analyse discriminante permet également d’étudier la variabilité individuelle (entre les individus inclus dans l’analyse, soit dans notre cas, les différents ovins utilisés en expérimentation) Là encore, la représentation schématique des individus par leurs coordonnées sur les deux axes discriminants de l’analyse, et le calcul de leur distance (distance de Mahalanobis) par rapport au centre de gravité de chaque groupe, permet de déterminer un pourcentage d’individus bien classés (compatibilité entre le groupe d’origine et le groupe déterminé par l’analyse). 106 Résultats CHAPITRE V : RESULTATS 107 Résultats PARTIE I : ETUDE DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE CHEZ DES AGNEAUX DE RACE SENSIBLE, INRA 401, INFESTES PAR H. CONTORTUS OU T. COLUBRIFORMIS La réponse immunitaire mise en jeu lors d’infestations par des strongles gastro-intestinaux est classiquement décrite comme une réponse protectrice d’orientation Th2. Cette orientation a clairement été démontrée lors d’infestations expérimentales dans des modèles murins (Urban et al., 1996 ; Finkelman et al., 1997) ou lors d’infestations naturelles chez l’homme (Cooper et al., 2000). Au moment où ce travail a été initié, cette polarisation dans l’espèce ovine (et chez les ruminants en général) était supposée mais non démontrée (Brown et al., 1998 ; Gill et al., 2000 ; Schallig, 2000). Les degrés d’interactions entre l’hôte et son parasite, en relation avec la localisation et le mode de nutrition de ce dernier, pourraient influencer à la fois l’induction de la réponse immunitaire adaptative de l’hôte, et son efficacité à réguler les populations parasitaires. Deux strongles gastro-intestinaux, fréquemment rencontrés chez les ovins, illustrent parfaitement deux modèles distincts d’interaction hôte/parasite : - Haemonchus contortus : parasite de la caillette, très vulnérant, et dont le mode de nutrition hématophage dès le stade L4 laisse supposer un contact étroit avec le système immunitaire de l’hôte - Trichostrongylus colubriformis : parasite de surface de l’intestin grêle proximal, dont le mode de nutrition chymivore à l’état adulte suggère une interaction avec l’hôte plus limitée. En utilisant des infestations expérimentales par ces deux modèles, la dynamique de la réponse immunitaire adaptative a été étudiée chez des ovins de race sensible, INRA 401. Nous nous sommes principalement attachés : 108 Résultats - à la polarisation Th1/Th2 de la réponse immunitaire par la caractérisation en PCR quantitative de l’expression de l’ARNm des principales cytokines impliquées dans la balance Th1/Th2, - à la dynamique de mise en place des effecteurs de la réponse immunitaire, cellulaires (grâce au dénombrement des différents types cellulaires dans les organes cibles au moyen de techniques d’histologie classique ou d’immunohistochimie) et humoraux (cinétique d’anticorps sériques ou locaux par des techniques ELISA), - enfin, aux effets de la réponse immunitaire chez les ovins immunisés ou naïfs sur les populations de strongles présentes chez l’hôte (effets sur l’établissement des larves, le développement des parasites, la fécondité des femelles adultes). Ces travaux ont donné lieu à deux publications et deux communications : Caroline LACROUX, Thi Hai Chi NGUYEN, Olivier ANDREOLETTI, Françoise PREVOT, Christelle GRISEZ, Jean-Paul BERGEAUD, Lucas GRUNER, Jean-Claude BRUNEL, Dominique FRANCOIS, Philippe DORCHIES et Philippe JACQUIET « Haemonchus contortus (Nematoda : Trichostrongylidae) infection in lambs elicits an unequivocal Th2 immune response » Veterinary Research, In Press, 2006. Caroline LACROUX, Françoise PREVOT, Christelle GRISEZ, Olivier ANDREOLETTI, Jean-Paul BERGEAUD, Jacques CORTE, Christine SAUVE, Lucas GRUNER, Jean-Claude BRUNEL, Dominique FRANCOIS, Philippe DORCHIES et Philippe JACQUIET « Immune response in lambs infected with Trichostrongylus colubriformis” Soumis pour publication à Veterinary Parasitology Caroline LACROUX, Christelle GRISEZ, Françoise PREVOT, Olivier ANDREOLETTI, Jean-Paul BERGEAUD, Philippe DORCHIES et Philippe JACQUIET « Riposta immunitaria degli ovini infestati da Haemonchus contortus o Trichostrongylus colubriformis » Conférence invitée – Corso d’aggiornamento su Attualita sulle parassitosi 109 Résultats gastro-intestinali degli ovini e dei caprini – Milan, 03 Novembre 2005 – Sassari, 04 Novembre 2005. Caroline LACROUX, Christelle GRISEZ, Françoise PREVOT, Olivier ANDREOLETTI, Jean-Paul BERGEAUD, Philippe DORCHIES et Philippe JACQUIET “Immune responses of sheep infected with Trichostrongylus colubriformis or Haemonchus contortus” Symposium Toulouse-Munich-Saragosse – Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse – 17 Novembre 2005. 110 Vet. Res. 37 (2006) 1–16 © INRA, EDP Sciences, 2006 DOI: 10.1051/vetres:2006022 1 Original article Haemonchus contortus (Nematoda: Trichostrongylidae) infection in lambs elicits an unequivocal Th2 immune response Caroline LACROUXa, Thi Hai Chi NGUYENb, Olivier ANDREOLETTIa, Françoise PREVOTa, Christelle GRISEZa, Jean-Paul BERGEAUDa, Lucas GRUNERc, Jean-Claude BRUNELd, Dominique FRANCOISe, Philippe DORCHIESa, Philippe JACQUIETa* a UMR INRA-ENVT 1225 Interactions Hôtes Agents Pathogènes – École Nationale Vétérinaire de Toulouse, 23 chemin des Capelles, 31076 Toulouse Cedex 03, France b Université d’Agriculture et de Foresterie de Ho Chi Minh Ville, Vietnam c INRA, Écologie et Génétique des Parasites, BioAgresseurs Santé et Environnement, 37880 Nouzilly, France d INRA, Domaine Expérimental de la Sapinière, 18390 Osmoy, France e INRA, Station d’Amélioration Génétique des Animaux, BP 27, 31326 Castanet-Tolosan, France (Received 28 October 2005; accepted 7 February 2006) Abstract – Selection of resistant animals and host immunization have been proposed as alternative methods for the control of gastrointestinal nematode parasites. However, a better knowledge of the mechanisms involved in protective immunity against these parasites is required for the development of optimal strategies. In this study, 3 month old INRA 401 lambs (n = 81) were allocated into three groups: uninfected control, challenged either once (primary-infected animals) or twice (previouslyinfected animals) with 10 000 Haemonchus contortus L3. Uninfected control and challenged animals were sequentially sacrificed at 3, 7, 15 and 28 days post challenge. In both challenged groups, a clear Th2-oriented immune response was observed in the abomasal lymph node and mucosa. IL-4 and IL-13 mRNA over-expression, recruitment of eosinophils, mast cells and globule leukocytes and production of specific systemic IgG and mucosal IgA were observed earlier in previously-infected animals than in primary-infected ones. At 28 days post infection, no differences between intensities of these responses were observed between the challenged groups. Worm establishment rates were similar in previously-infected and primary-infected lambs. However, reductions of worm development, female fecundity and fecal egg output were observed in previously-infected sheep. We conclude that H. contortus infection in young INRA 401 lambs induced an unequivocal Th2 immune response resulting in the regulation of worm egg production without affecting their establishment. Haemonchus contortus / sheep / Th2 immune response / quantitative PCR / antibody and cellular response * Corresponding author: [email protected] 2 C. Lacroux et al. 1. INTRODUCTION Haemonchus contortus is a common nematode parasite of small ruminants that causes important losses of milk, meat and wool production and death in young animals [33, 37]. Due to the emergence of anthelmintic resistance [29, 39] and public concern about chemical residues in animal products, alternative control strategies are needed. Vaccination and genetic resistance of hosts have been viewed as sustainable methods of parasite control. Substantial progress and results have been obtained by using several H. contortus antigens, such as native H11 and H-gal-GP, to stimulate efficient levels of protective immunity in sheep [20]. Nevertheless, no commercial vaccine is yet available. Between and within breed differences in host resistance are currently reported throughout the world [22, 38] but the mechanisms underlying this resistance are not well known. The immune response against gastrointestinal nematodes has been extensively studied in rodents infected with Trichinella spiralis, Nippostrongylus brasiliensis, Heligmosomoïdes polygyrus and Trichuris muris. Protective immunity against these parasites is largely dependant on the activation of CD4+ T helper cells and on the Th2 polarization of the immune response [35], while a Th1 response is associated with the survival of these parasites and increased host susceptibility to infection [13, 14]. In humans, the protective immune response observed in natural Ascaris lumbricoïdes or Necator americanus infections is similarly associated with a high Th2-type cytokine polarization [11, 26]. In ruminants, the nature of the immune response towards gastrointestinal helminths is less clear and the existence of a true Th1/Th2 dichotomy was questioned in the late nineteen-nineties [9, 15, 24]. Few studies on the polarization of the adaptative immune response in H. contortus infected sheep are available and the results have failed to prove an unequivocal Th2 response [31]. Nevertheless, a Th2 polarization has been recently demonstrated in Trichostrongylus colubriformis infections in sheep [25]. In rodent models, Th2 immune responses are almost invariably accompanied by local and systemic eosinophilia and mucosal mast cell hyperplasia, but also with local and general specific antibody responses (mainly IgA, IgG1 and IgE) [23]. The same features are also encountered in sheep infected with H. contortus [31], Teladorsagia circumcincta [32] and Trichostrongylus colubriformis [8]. The impact of these effectors and their relative importance in host protection are still unclear. Moreover, sequences of the immune response and mobilization of the antibody and cellular effectors have not been systematically characterized in H. contortus infections. Therefore, the objectives of this study were (i) to define, using a quantitative reverse transcriptase (RT) PCR, the polarization of the immune response in lambs infected with H. contortus, (ii) to investigate the kinetics of Th2-type-associated effectors in the abomasal mucosa and (iii) to characterize the effects of this immune response on the nematode populations within the host. 2. MATERIALS AND METHODS 2.1. Experimental design 2.1.1. Animals Eighty-one 3-month old female INRA 401 lambs were randomly allocated into three experimental groups: Group A: previously-infected, anthelmintic-treated and then challenged sheep (n = 29), Group B: primary-infected sheep (n = 28), and Group C: uninfected control sheep (n = 24). All sheep were born, reared and maintained worm-free in three separate pens before the experiments. Limited infections with coccidia occurred in all groups despite diclazuril treatments (Vecoxan, Janssen-Cilag, Issy-les-Moulineaux, France, 1 mg/Kg BW) before the commencement of the experiment, Th2 response in H. contortus infected sheep 3 Table I. chematic description of the experimental design. Treatment and group Initial infection* Levamisole Challenge infection* –35 –7 0 3 7 15 28 Previously-infected (A) + + + 6 6 6 11 Primary-infected (B) – + + 6 6 6 10 Uninfected control (C) – + – 6 6 6 6 Days from challenge Number of sheep killed *10 000 H. contortus L3. but no clinical signs of coccidiosis were observed. Experimental lambs received granulated feed adapted to their age, as well as forage and tap water ad libitum. The animals were reared following European Union recommendations for animal welfare and under the supervision of the local INRA ethics committee. 2.1.2. Experimental infections and necropsies Lambs of group A (previously-infected) were orally infected with 10 000 H. contortus third-stage larvae (L3) of the Humeau strain (kindly provided by L. Gruner, INRA BASE, Tours-Nouzilly, France) 35 days before challenge. All lambs were treated with an oral administration of Levamisole (7.5 mg/kg) at day –7. The lambs of groups A (previously-infected) and B (primaryinfected) were orally infected with 10 000 H. contortus L3 at D0. Six animals of each group were humanely killed at each of days 3, 7 and 15 post challenge (dpc) by exsanguination following intravenous injection of 10 mg/kg pentobarbital sodium. At day 28, eleven lambs from group A, ten from group B and six from group C were killed (Tab. I). Necropsy days were chosen to conform with the expected development of the parasite within the host: only early fourthstage larvae (L4) at 3 dpc, majority of late L4 at 7 dpc, immature worms at 15 dpc, and adult worms at 28 dpc [10]. 2.2. Parasitological examinations Fecal samples from animals necropsied at 28 dpc were taken on days 21 and 28 post challenge to measure the nematode egg excretion. Fecal egg counts were performed according to the modified McMaster technique [28]. After necropsies, the contents and washings of the abomasum were collected and passed through a 40 µm sieve to eliminate coarse materials. The whole abomasum was digested in pepsin-hydrochloric acid solution (37 °C, 6 h) to collect the tissue dwelling nematode stages. The contents, washings and digested materials, were preserved in absolute alcohol. The volumes of these materials were then adjusted to 1 L and worms were counted in a 10% aliquot and classified as adult male or female, immature male or female, or early and late L4. Twenty adult female worms were randomly picked from each 28 dpc sample for total length measurement and egg counts in utero. For this purpose, individual female worms were allowed to disintegrate in sodium hypochloride 4% solution [19] and all eggs liberated from the uterus were counted for each worm. 2.3. Cytokine expression in abomasal lymph node and fundic mucosa 2.3.1. mRNA extraction and RT-PCR About 300 mg of the abomasal lymph node or fundic mucosa were snap frozen in 4 C. Lacroux et al. Table II. Forward and reverse primer sequences for quantitative reverse-transcriptase (RT) PCR. Cytokine Forward sequence Reverse sequence Tm amplicon (°C) Ovine Beta-actin ACCAGTTCGCCATGGATGAT AGCCGTTGTCAACCACGAG 78 Ovine IFN- ATCTCTTTCGAGGCCGGAGA ATTGCAGGCAGGAGAACCAT 77 Ovine IL-4 GGAGCTGCCTGTAGCAGACG TTCTCAGTTGCGTTCTTTGGG 79 Ovine IL-10 CTGAGAACCATGGGCCTGAC TCTCCCCCAGCGAGTTCAC 80 Ovine TNF-α CCCGTCTGGACTTGGATCCT TGCTTTTGGTGCTCATGGTG 75 Ovine IL-12p40 GAATTCTCGGCAGGTGGAAG GTGCTCCACGTGTCAGGGTA 80 Ovine IL-13 AGAACCAGAAGGTGCCGCT GGTTGAGGCTCCACACCATG 80 ACAAGAAAATCTGTGTTGATCCCC CCATGGCATTCTGGACCC 75 Ovine IL-5 CTGCTGATAGGTGATGGGAACTT GGTGATTTGTATGCTGAGGAGTAGG 74 Ovine IL-3 AAGAATATCCTGGCGAATAAGAGC GAACGCTTTCAGGTTTGCCT 75 Ovine Eotaxin 1 mL of Trizol Reagent (Invitrogen, CergyPontoise, France, reference 15596-018), and stored at –70 °C before use. Samples were homogenized using a Hybaid RiboLyserTM (two cycles of 30 s each at a speed of 4.5). Fifty µL of the obtained homogenate were mixed with 950 µL of Trizol before adding 200 µL of chloroform at room temperature for 10 min. The samples were then centrifuged for 15 min at 20 000 g at 4 °C. The supernatants were placed on an RNeasy Column (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Courtabœuf, France) and then processed using the Qiagen protocol for RNA cleanup. This complete protocol allows the recovery of highly pure RNA. The RNA concentration was measured by spectrophotometry at 260 nm and RNA quality was assessed by electrophoresis on 1.2% agarose gels stained with ethidium bromide. Two µg of total RNA were digested with 1U of RNase-free DNAse (Promega, Charbonnières, France) for 1 h at 37 °C to remove any trace of genomic DNA, and then incubated 10 min at 65 °C with DNase Stop Solution. Treated RNA was used as the template for single-stranded cDNA synthesis. They were incubated 10 min at 65 °C with Random Primer oligonucleotides (Invitrogen) and chilled on ice; a mixture containing M-MLV transcriptase (400 IU/ sample), 5× first-strand buffer (Life Technologies, Cergy-Pontoise, France), dithiothreitol (DTT) 0.1 M (Life Technologies), 40 U of RNase Out Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen), 10 mM of each four dNTP (Promega) was then added and the mixture was incubated for 1 h at 42 °C. The reaction was heat-inactivated at 95 °C for 5 min and kept at –20 °C until use. For quantitative PCR, cDNA were used at dilutions of 1:100. 2.3.2. PCR primers Specific primers and amplicon sizes are listed in Table II. For each target cDNA, a primer pair was determined using Primer Express Software (Applied Biosystems, Courtabœuf, France) for SYBR Green realtime PCR assay on a GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) and based on known ovine gene sequences (β-actin, IFN-γ , TNF-α, IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p40). Oligonucleotides were designed to amplify a product with a size of 51 bp, with a melting temperature (Tm) of 58–60 °C. When the ovine Th2 response in H. contortus infected sheep gene sequence was not known (Eotaxin, IL13), a consensus sequence was created, based on a minimum of three known sequences in other mammalian species. A first primer pair was then designed using Primer 3 Software in order to amplify the largest possible mRNA in all aligned sequences. PCR amplification on reverse transcript RNA obtained from ovine peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated with concanavalin A (ConA, 10 µg/mL, 24 h in a 5% CO2 and 37 °C atmosphere) was then performed. Amplicons were purified before cloning in the TopoCloning system (Invitrogen) and sequenced (using M13 universal primers). The sequences thus obtained were then compared with the GenBank database using blast to validate the identity of the amplified product. After validation, a new set of primers suitable for quantitative PCR was designed using the obtained sequence. For IL-13, the primers used were those published by Hein et al. [17]. 2.3.3. Quantitative PCR Quantitative PCR was performed on a GeneAmp 5700 (Applied Biosystems), using the double-stranded DNA binding dye SYBR Green I. PCR products corresponding to the different amplicons (see Tab. I) of target cytokines were cloned in PBR 2.1 plasmid (TopoClonA, Invitrogen) and sequenced (M13 universal primers). The plasmids harboring the cloned sequence were then quantified by spectrometry to establish the number of target copy/µL. Ten-fold dilution series were prepared from the stock plasmid solution corresponding to 107 to 101 copies of the target sequence. Serial dilution of the plasmid was then used as an external standard, allowing the determination of the number of copies of the target cDNA in each assay. Each sample for each investigated cytokine was performed in duplicate. Ovine Beta-actin was used as a housekeeping gene to normalize expression between different samples. The results obtained for each cytokine are 5 expressed as a ratio of the number of cytokine mRNA copies/Beta-actin mRNA copies. A non-template control reaction (NTC) was included in each run. Finally, the specificity of the amplification reaction was assessed by acquisition of a dissociation curve. Data was obtained by slowly increasing the temperature of the PCR reaction from 60 to 95 °C; denaturation of nonspecific PCR products is followed by a faster decrease of fluorescence than for specific products. The melting profile of the distinct PCR product was obtained by plotting the first derivative (-dF/dT) of fluorescence (F) versus temperature (T). 2.4. Detection of antibodies in mucus and serum by indirect ELISA A blood sample from each animal was recovered just before euthanasia and centrifuged for 5 min at 5 000 rpm. Serum was then frozen at –20 °C until analysis. A mucus sample from each animal was collected during necropsy using PBS impregnated filter paper strips of 4 cm2 each deposited between the folds of the abomasal fundic mucosa for 5 min. The strips were then gently agitated in 2 mL of PBS for 2 h at room temperature to dilute the mucus. The liquid was centrifuged and stored frozen at –70 °C until analysis. 2.4.1. Worm antigen preparation A donor sheep infected with 50 000 L3 of H. contortus (Humeau strain) was sacrificed and adult worms were harvested from the abomasum. These worms were thoroughly washed in PBS (pH 7.4) containing penicillin (100 IU/mL) and streptomycin (1 mg/mL). Fifty adult worms per milliliter of the same buffer were maintained in a 5% CO2 atmosphere at 37 °C overnight. Next, the supernatant (containing excretorysecretory products) was collected, filtered (0.2 µm) and stored at –70 °C until further use. A crude extract of H. contortus L3 (CEL3) was prepared after three cycles of freezing and thawing (–70 °C – +25 °C), 6 C. Lacroux et al. Table III. Reagents and procedures used for antigen ELISA detection in serum and mucus. Serum Isotype Type of antigen IgG IgA ESP Ad CEL3 ESP Ad CEL3 Concentration of antigen 2 2 (µg/mL) Dilution of serum or 1:100 1:100 mucus Dilution of secondary 1:1000 1:1000 antibody Dilution of conjugate Mucus – – IgG IgA ESP Ad CEL3 ESP Ad CEL3 5 2 5 0.5 5 2 1:5 1:5 1:1 1:1 1:1 1:1 1:100 1:100 1:1000 1:1000 1:250 1:250 1:500 1:500 – – 1:500 1:500 Type of antigens: ESP Ad: Excretory-secretory products from H. contortus adult worms; CEL3: crude extract of H. contortus infective third-stage larvae. For IgG determination, the secondary antibody is a Donkey anti-sheep IgG HRP-conjugated. For IgA determination, an anti-IgA bovine / sheep mouse IgG1 is first applied before a goat anti-mouse IgG1 HRP-conjugated. homogenization at 4 °C and centrifugation at 30 000 g for 30 min at 4 °C. The supernatant was used as the crude extract of the L3 antigen. The protein concentration of both antigenic preparations was determined with the method of Lowry et al. [21]. 2.4.2. Determination of optimal assay conditions and the ELISA technique The optimal concentrations of ELISA reagents and the optimal test conditions were determined by chequerboard titrations of H. contortus antigens, positive (group A at 28 dpc) and negative (group C) reference sera or mucus and specific conjugates (Tab. III). An indirect ELISA was used on serum and mucus samples, as described by Jacquiet et al. [18]. The results are expressed as optical densities (OD) for serum and mucus IgG and IgA minus the OD of PBS wells (corrected absorbance). chemistry (IHC), while the second was stored at –70 °C for frozen IHC. 2.5.1. Conventional histology and IHC with paraffin-embedded samples Abomasal tissue was paraffin-embedded and 3 µm sections were mounted on glass slides. Eosinophils and globule leukocytes were counted on haematoxylin-eosin stained slides whereas mast cells were counted after Giemsa staining. Immunohistochemistry was performed using antibodies already described for cell phenotyping on paraffin-embedded tissues in sheep [2, 27, 36]. This antibody set allows specific labeling of macrophages/monocytes (mouse anti-human CD68 antibody, clone Ki-M6, Serotec, Cergy-Saint-Christophe, France, 1:150 dilution), B lymphocytes (mouse anti-human CD20-like antibody, clone BLA-36, Novocastra, Le-Perray-enYvelines, France, 1:50 dilution), or T lymphocytes (rabbit anti-human CD3 antibody, A 0542, DAKO, 1:100 dilution). 2.5. Histology At necropsy, two tissue samples from the fundic area of the abomasal wall were taken; one was fixed in 10% formalin for conventional histology and immunohisto- 2.5.2. IHC on frozen samples Five µm sections of abomasal tissue were obtained using a Leika cryomicrotome. Slides were fixed for 20 min in a Th2 response in H. contortus infected sheep –20 °C acetone bath before drying. Slides were then directly processed for IHC. Monoclonal antibodies directed against CD4 (mouse anti-ovine CD4, SEROTEC, reference MCA2213, 1:2000 dilution), or CD8 (mouse anti-bovine CD8, SEROTEC, reference MCA837G, 1:800 dilution) antigens were used. For each type, cells were counted on five randomly selected fields at high magnification (× 400). The results are expressed as the sum of the five fields. 2.6. Statistical analysis Comparisons between the three groups (previously-infected, primary-infected and uninfected control) and between the killing times (3, 7, 15 and 28 dpc) within a group were performed using the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney non parametric tests (SYSTAT software). P < 0.05 was considered significant. For the 81 observations in this study, Spearman correlation coefficients (r) were statistically significant when r > 0.217 (P < 0.05) and r > 0.283 (P < 0.01). 3. RESULTS 3.1. Efficiency of experimental H. contortus challenge No worm or egg excretions were observed in uninfected control animals throughout the study (group C). All lambs in groups A and B became infected after challenge with establishment rates ranging from 4% to 28%. Highly variable individual worm counts were observed within each group and there were no significant differences between groups A and B (Tab. IV). 3.2. Cytokine mRNA transcription in abomasal lymph node and in fundic mucosa A clear increase of IL-4 m-RNA transcription was observed in the abomasal 7 lymph node and fundic mucosa of both challenged groups but not in uninfected control sheep (Figs. 1A and 1B). In the previously-infected group, an over-expression of IL-4 m-RNA was present as early as 3 dpc and remained significant and stable until the end of the experiment. In the primary-infected group, the IL-4 mRNA increase was not observed before 7 dpc but reached similar levels to previouslyinfected animals at 15 dpc. In fundic mucosa, IL-5 mRNA was higher (P < 0.05) in challenged lambs (groups A and B) than in uninfected control sheep at 7 dpc and 15 dpc (Fig. 1D). In the abomasal lymph node, the increase of IL-5 m-RNA was observed at 28 dpc only (data not shown). In fundic mucosa, IL-13 mRNA was higher in both challenged groups (A and B) than in uninfected control sheep (Fig. 1C) as early as 7 dpc, while no differences were recorded between the three groups in abomasal lymph node (data not shown). In both investigated tissues, no modifications of IL-3 or Eotaxin mRNA transcription were observed (data not shown). No significant group differences were recorded in the IFN-γ (Fig. 1E), IL-12 (Fig. 1F), IL-10 or TNF-α mRNA transcription profile during the whole experiment (data not shown). No cytokine mRNA transcription profiles could be directly correlated to the worm establishment rate, worm development or female fecundity. 3.3. Specific antibody detection in abomasal mucus and serum At 7 and 15 dpc, a significant (P < 0.05) and specific CEL3 IgA response (Fig. 2E) was observed in the mucus of previouslyinfected animals only. At 28 dpc, levels of specific CEL3 IgA in mucus were similar in both infected groups and significantly higher than in uninfected controls (P = 0.01). In challenged groups, significant (P < 0.05) systemic IgG and IgA and local antibody responses against excretory-secretory products (ESP) of adult worms were observed at 15 and 28 dpc (Figs. 2A, 2B, 2C and 2D). No 1149 ± 2845 86 ± 197 870 ± 2272 6165 ± 7485 – B – B – – – A – A – B – – 438 ± 231 2814 ± 2650 2169 ± 1950 955 ± 838 898 ± 940 1183 ± 750 1255 ± 1210 1126 ± 500 – 17.7 ± 2.7 15.9 ± 2.1 – – – – – 275.4 ± 154.3 174 ± 160.6 – – – – – – Number of eggs in utero (mean ± SD) 8.9 8 33.3 59.6 22 71 98.8 100 Early L4 (%) 4.6 8 18.7 20 78 29 0.2 – 11.7 11.3 16.5 8 – – – – Late Immature males L4 (%) (%) 12.5 20.3 30.6 12.4 – – – – Immature females (%) 25.6 29.4 0.4 – – – – – Adult males (%) 36.7 23 0.5 – – – – – Adult females (%) Group A: previously-infected and challenged sheep; Group B: primary-infected sheep. Six animals per group were sacrificed at 3, 7 and 15 days post challenge (dpc), and 11 and 10 sheep at 28 dpc for groups A and B respectively. Coprological examinations were performed at 21 and 28 dpc for sheep sacrificed at 28 dpc. 28 15 – B A A 3 7 – – Group Days post challenge Adult female Epg at 21 dpc Epg at 28 dpc Total worm burden length (mm) (mean ± SD) (mean ± SD) (mean ± SD) (mean ± SD) Table IV. Egg excretion, total worm burden, length and number of eggs in utero of adult female worms, stage and sex composition of Haemonchus contortus populations. 8 C. Lacroux et al. Th2 response in H. contortus infected sheep 9 Figure 1. Th1/Th2 cytokine mRNA transcription in the abomasal lymph node (ALN) and in the fundic mucosa (AFM) from previously-infected, primary-infected and uninfected control sheep. IL-4 mRNA (A: in ALN and B: in AFM), IL-13 mRNA in AFM (C), IL-5 mRNA in AFM (D), IFN-γ in ALN (E) and IL-12 in ALN (F) were quantified and measured in each duplicate sample using an external standard. The results are expressed after normalisation (ratio) with a housekeeping gene (ovine Beta-actin) (means and SD). a, b, c Values with no letter in common are significantly different (P < 0.05). 10 C. Lacroux et al. Figure 2. Local and systemic IgG and IgA responses to parasite (excretory-secretory products (ESP) of H. contortus adult worms or crude extract of L3 (CEL3)) antigens, in previously-infected, primaryinfected and uninfected control sheep. A: Total mucus IgG against ESP; B: Total systemic IgG against ESP, C: Mucus IgA against ESP; D: Systemic IgA against ESP, E: Mucus IgA against CEL3, F: Systemic IgA against CEL3 (means and SD). a, b, c Values with no letter in common are significantly different (P < 0.05). Th2 response in H. contortus infected sheep 11 significant systemic CEL3 specific IgA (Fig. 2F) or IgG (data not shown) response was observed during the study. Concentrations of mucus ESP or CEL3 specific IgA or IgG antibodies were significantly correlated with those found in the serum (ESP specific IgG (r = 0.606, P < 0.01), ESP specific IgA (r = 0.494, P < 0.01) and CEL3 specific IgA (r = 0.586, P < 0.01)). 3.4. Dynamics of the cellular abomasal infiltration In the abomasal mucosa of previouslyinfected sheep, eosinophils, mast cells and globule leucocytes were already present in significantly higher numbers than in primary-infected or uninfected control sheep (P < 0.01) at 3 or 7 dpc. In both challenged groups, a gradual increase of these cell populations was observed between 7 and 28 dpc. However, the cellular recruitment was delayed in the primary-infected group when compared to the previously-infected one. Eosinophil counts were higher in primaryinfected animals than those of uninfected control animals at 7 dpc, at 15 dpc for mast cells and at 28 dpc for globule leukocytes. At the end of the experiment (28 dpc), similar mucosal infiltrations (three cell types) were observed in previously-infected and primary-infected sheep (Figs. 3A, 3B and 3C). Significant correlations were established between mucosal IL-4 mRNA transcription level and recruitment of (i) eosinophils, mast cells and globule leucocytes at 3 and 7 dpc (P < 0.01), and (ii) mast cells and globule leucocytes at 15 dpc (P < 0.05). These correlations strongly suggest a relation between the Th2-cytokine level response and intensity and the rapidity of mucosal cellular infiltration. Concerning CD3+-T cells, BLA 36+-B cells, and CD68+-monocyte/macrophage cells, no significant differences between group A, B and C animals were observed (data not shown). The CD4+/CD8+ ratio (approximately 3:1) remained similar among the three groups and stable during the course of the experiment (data not shown). Figure 3. Cellular infiltration in the abomasal mucosa (fundus): mast cells (A), globule leukocytes (B) and eosinophils (C), in previouslyinfected, primary-infected and uninfected control sheep (means and SD). For each cell type, the evaluation of cell number was performed on five randomly selected fields at high magnification (× 400). The results are expressed as the sum of five fields. a, b, c Values with no letter in common are significantly different (P < 0.05). 3.5. Impact of immune responses on parasite populations 3.5.1. Similar total worm burdens in previously-infected and primary-infected lambs No significant difference in the total worm burden was observed between 12 C. Lacroux et al. Table V. Correlations between abomasal eosinophils, mast cells or globule leukocytes and worm parameters 28 days post challenge. Eosinophils % L4 worms % Immature worms 0.308 0.431* Mast cells 0.189 0.439* Globule leukocytes 0.019 0.297 % Adults worms –0.413* –0.332 –0.170 Total worm burden –0.086 –0.102 –0.129 Adult female length –0.589** –0.508** –0.676** Number of eggs in utero of adult females –0.477** –0.486** –0.592** Fecal egg output –0.378* –0.402* –0.369* * P < 0.05 and ** P < 0.01. previously-infected and primary-infected sheep. Total worm burdens were not significantly correlated with antibody responses, or with eosinophils, mast cells or globule leukocytes (Tab. V). 3.5.2. Delayed worm development At 3 and 7 dpc, only fourth-stage larvae (L4) were observed in the challenged animals. Both early and late stage L4 were observed at 7 dpc in groups A and B but the relative proportion of late L4 was significantly (P < 0.01) increased in group B (78%) compared to group A (29%). Similarly, the mean ratio of immature worms/L4 was 0.9 in primary-infected sheep and only 0.25 in previously-infected sheep (P < 0.01) at 15 dpc and several lambs from the primary-infected group already harbored adult worms while none were observed in the previously-infected group. At 28 dpc, the percentage of adult worms was higher in the primary-infected animals than in the previously-infected animals (Tab. IV). Taken together, these results suggest a delayed development of the parasite in previouslyinfected animals. The retarded development of early L4 to late L4 was associated with high eosinophil numbers in mucosa (7 dpc, r = 0.661, P < 0.01) and with increased IgA in the mucosa, both CEL3 (r = 0.553, P < 0.01, at 7 dpc and r = 0.881, P < 0.01 at 15 dpc) and ESP specific (r = 0.712, P < 0.01 at 15 dpc). In the late phase of the experiment (28 dpc), eosinophils and mast cell populations were positively correlated with the proportion of immature worms. Eosinophil counts were also negatively correlated with the proportion of adult worms (Tab. V). Systemic ESP specific IgG response and mucosal CEL3 specific IgA response were correlated with the proportion of immature worms (respectively r = 0.42, P < 0.05 and r = 0.59, P < 0.01). 3.5.3. Reduced female worm length and number of eggs in utero In previously-infected sheep, adult females were shorter than in the primary-infected group (15.9 ± 2.1 mm versus 17.7 ± 2.7 mm) and contained fewer eggs in their uterus (174 ± 160.6 versus 275.4 ± 154.3 eggs per female) but the differences were not significant. Worm length and number of eggs in the uterus were highly correlated (r = 0.847). Increased eosinophils, mast cells and globule leukocyte populations were negatively correlated with the female worm length and the in utero egg numbers (P < 0.01) (Tab. V). Mucus CEL3 specific IgA and systemic ESP specific IgG levels were correlated with the reduction of female worm length (respectively r = –0.36, P < 0.05 and r = –0.59, P < 0.01) (Tab. III). Th2 response in H. contortus infected sheep 3.5.4. Reduced fecal egg output At 28 dpc, the number of egg-excreting animals was the following: 8 of group A (90 to 9 650 epg) and 9 of group B (300 to 25 000 epg). Despite the variability between sheep, egg excretions were significantly different between the two groups (P < 0.05) with a seven-fold reduction in group A compared to group B. Eosinophils, mast cells and globule leukocyte numbers as well as the systemic IgG response against ESP of adult worms (r = –0.47, P < 0.05) were negatively correlated with the intensity of egg excretion in individual sheep (Tab. V). 4. DISCUSSION The main objectives of this work were (i) to establish the polarization of the adaptative immune response in H. contortus infected sheep, (ii) to describe the kinetics of immune effector mechanisms following a single H. contortus infection in primaryinfected or previously-infected sheep and (iii) to study the effects of these responses on parasite establishment, development and females fecundity. Few data were available on the orientation of the immune response in H. contortus challenged sheep. In a preliminary study using semi quantitative PCR, Schallig [31] observed a non-protective Th1 response in primary-infected H. contortus infected sheep. A second challenge induced a protective Th2 response with a high level of IL-4 mRNA expression without significant IL-5 over-expression. However, these results were obtained with a limited number of sheep. In our experiment, neither primaryinfected nor previously-infected H. contortus infected sheep showed a Th1 cytokine pattern. In contrast, a clear over transcription of the IL-4 gene was observed in the abomasal lymph node and in the mucosa in both primary-infected and previouslyinfected lambs. Furthermore, specific IgG and IgA antibody responses in mucus and 13 serum and higher mucosal recruitment of eosinophils, mast cells and globule leukocytes were observed in these two groups. Taken together, IL-4 mRNA over-transcription and immunoglobulin production/ cell recruitment strongly support a Th2 orientation of the immune response in lambs challenged with H. contortus [4]. In the present study, the over-expression of IL-5 and IL-13 in infected animals also suggested the Th2 polarization. Recently, Pernthaner et al. [25] described an increased expression of Th2 related cytokines, IL-5 and IL-13 (but not IL-4), in intestinal lymph cells of sheep selected for enhanced resistance to T. colubriformis. Data collected in these two nematode models support the hypothesis of a Th2 orientation in sheep, as reported in rodent [6, 14] or in human [11] gastro-intestinal nematode infections. The second objective of our study was to investigate the dynamics of the adaptative immune response after a single H. contortus infection. Repetitive or continuous infections are usually used to study the host immune response and to mimic natural infections as well as possible [1, 5, 7]. Nevertheless, single H. contortus infections were necessary in our experiment which was mainly designed to measure host immune response effects on worm development. IL-4 mRNA expression increased gradually from 7 dpc to 28 dpc in primaryinfected sheep but remained stable and high in previously-infected sheep from 3 to 28 dpc. Eosinophil, mast cell, and globule leukocyte recruitments were apparent at 7, 15 and 28 dpc respectively in primaryinfected animals while these cells were still present in previously-infected lambs at 3 dpc. Antibody responses were delayed and low in primary-infected lambs and rapid and higher in previously-infected ones as previously shown by Schallig et al. [30] and Gomez-Munoz et al. [16]. Consequently, while final response intensities were similar in both infected groups, recruitment of cells and secretion of immunoglobulins in previously-infected sheep were observed before their occurrence in primary-infected 14 C. Lacroux et al. sheep. This difference could be explained by (i) a rapid mobilization of immune mechanisms after challenge in group A compared to group B or from (ii) the presence of remaining cells and antibodies induced by the first infection. Unfortunately, our experimental design did not allow to state between these two hypotheses. Interestingly, this earlier mobilization of the immune effectors was associated with significant higher IL-4 mRNA levels at 3 dpc in previously-infected sheep. No differences in the establishment rates of worms were observed between previously-infected and primary-infected lambs in this experiment. Our data provide evidence that the parasite development and the female fecundity were depressed in previously-infected animals compared to primary-infected ones. This delay in parasite development has been shown after repeated exposure of lambs to H. contortus [30] or T. circumcincta [32]. Here we established that alterations of parasite life traits (development of worm and female fecundity) are related to the earliness of effector mobilization rather than to the final level of the responses. Eosinophils, mast cells and globule leucocyte recruitment are typically associated with helminth infections [3]. In our study, these cells were strongly and negatively correlated with adult female length and number of eggs in utero. Moreover, positive correlations were also observed between mast cell and eosinophil numbers and the relative proportion of immature worms while a strong negative correlation was seen between eosinophils and the proportion of adult worms (Tab. V). Thus, these cells may have a role in the delayed development of the parasite and the decrease of fecal egg output as previously shown by many authors [4, 12, 34]. In the present study, two antibody responses (CEL3 specific IgA response in abomasal mucus and ESP specific IgG in serum) were positively correlated to the proportion of immature worms and negatively correlated to the female length and number of eggs in utero suggesting that they could interfere with H. contortus development within the host. The importance of the local IgA response in host protection has already been indicated in T. circumcincta infected sheep, where the production of local IgA against somatic or L4 ESP molecules induced a reduction in the female parasite length and fecundity [32]. ACKNOWLEDGEMENTS We are very grateful to Gilles Aumont, Getachew Terefe and Mike Stear for their valuable contributions to the present manuscript. We are very indebted to the technical staff of La Sapinière INRA experimental station (INRA, Department of Animal Genetics) for rearing and providing INRA 401 lambs. This work was supported by the FEOGA program (Région Centre) “Résistance génétique aux nématodes”. REFERENCES [1] Adams D.B., Infection with Haemonchus contortus in sheep and the role of adaptive immunity in selection of the parasite, Int. J. Parasitol. 18 (1988) 1071–1075. 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Toutefois, il nous a paru intéressant de les présenter en annexe. *Mesure de la lymphoprolifération des lymphocytes sanguins et des lymphocytes isolés du nœud lymphatique abomasal : Les lymphocytes sanguins et les lymphocytes du nœud lymphatique abomasal ont été isolés, mis en culture et stimulés selon les techniques décrites dans la section « Matériel et Méthodes ». Pour les lymphocytes isolés du sang total, aucune différence significative de lymphoprolifération n’a pu être mise en évidence entre les trois lots expérimentaux aux % de lymphoprolifération / lymphocytes non stimulés différentes dates d’étude en raison d’une variabilité individuelle importante (Figure n°19). 25 20 15 Lot A 10 Lot B Lot C 5 0 3 dpc 7 dpc 15 dpc 28 dpc -5 Figure n°19 : Lymphoprolifération des lymphocytes sanguins suite à une stimulation par les produits d’excrétion-sécrétion d’H. contortus adultes(10 µg/ml). Pour les lymphocytes isolés du nœud lymphatique abomasal, les lymphoproliférations observées sont totalement différentes entre 3 et 7 jours post-challenge (dpc) : aucun signal n’est détecté à 3 dpc alors qu’un pic est observé à 7 dpc chez les animaux des lots A et B 127 Résultats (animaux primo-infestés et animaux naïfs). La lymphoprolifération à 7 dpc est significativement différente entre les trois lots (P < 0.05). Celle-ci diminue ensuite à 15 dpc et 28 dpc et à ces dates, aucune différence statistique entre les trois lots expérimentaux n’est % de lymphoprolifération / lymphocytes non stimulés notée (Figure n°20). a 20 15 b 10 Lot A Lot B 5 Lot C c 0 -5 3 dpc 7 dpc 15 dpc 28 dpc Figure n°20 : Lymphoprolifération des lymphocytes du nœud lymphatique abomasal suite à une stimulation par les produits d’excrétion-sécrétion d’H. contortus adultes(20 µg/ml). L’expansion clonale des lymphocytes T spécifiques des produits d’excrétion-sécrétion des vers adultes est donc limitée dans le temps (J7) et en intensité (+12% en moyenne pour les animaux lors de la seconde infestation). Des réponses limitées dans le temps (une semaine après infestation) ont également été retrouvées par McClure et al. (1998). *Analyse statistique discriminante : L’analyse statistique discriminante permet d’obtenir une représentation graphique (cercle) de la corrélation entre les différentes variables étudiées, grâce à la détermination de deux axes discriminants qui sont une combinaison linéaire de l’ensemble de ces variables quantitatives. Ces deux combinaisons linéaires sont choisies pour permettre la meilleure discrimination entre les groupes expérimentaux : variabilité maximale entre les groupes et variabilité minimale au sein d’un groupe donné. 128 Résultats Les corrélations entre les variables sont représentées sur un cercle : les variables positivement corrélées entre elles occupent une position proche sur le cercle, alors que des variables négativement corrélées sont situées sur les côtés opposés du cercle. Dans notre étude, le cercle de corrélation obtenu par analyse discriminante a permis : - de déterminer les variables ayant un poids réel dans l’analyse (variables discriminantes) : à elles seules, ces variables permettent d’expliquer une grande partie de la variation entre les trois groupes expérimentaux. Elles sont représentées par un triangle noir et une police en gras sur le schéma (Figure n°21). - d’observer les corrélations entre ces différentes variables quantitatives. Les données obtenues confirmaient celles issues des corrélations effectuées par le test de Spearman. Axis 2 (28% inertia) IL-5 Globule Leukocytes FIL-5 IL-13 Ab2 Mast cells Ab3 FIL-3 Bcells IL-10 Eotaxin Ab1 Ab6 Eosinophils Tcells Ab7 CD4 Axis 1 (72% inertia) IFN-γ IL-3 FIL-4 Ab4 0 Lymphocytes proliferation ImF CD8 IL-12 TNF-α Ab5 Length El4 FIL-13 Ll4 AdM ImM Eggs IL-4 Worms AdF Feotaxin Epg28 Macrophages Epg21 Figure n°21 : Cercle de corrélation obtenu par analyse statistique discriminante. L’analyse discriminante permet de résumer les principales observations de l’étude. La combinaison linéaire des variables sur les deux axes discriminants est plus efficace pour différencier les trois groupes expérimentaux que n’importe quelle variable quantitative 129 Résultats étudiée prise isolément (Pseudo-F = 174.54 alors que le plus grand des F de variable isolée n’est que de 17.45). La présence des vers est positivement corrélée à une augmentation de l’expression des gènes de l’IL-4 et de l’IL-5 dans la muqueuse abomasale et le nœud lymphatique abomasal, ce qui confirme que l’infestation par H. contortus est associée à une réponse immunitaire de type Th2. La présence des vers est également positivement corrélée au recrutement de mastocytes, globule leucocytes et polynucléaires éosinophiles dans la muqueuse abomasale, et à des réponses IgA et IgG locales et systémiques. En revanche, il est intéressant de noter que l’expression des cytokines de type Th1 et pro-inflammatoires (IL-12, IFN-γ et TNF-α) est en opposition avec la majorité des autres variables sur le cercle et en particulier, avec les paramètres parasitologiques. 130 Résultats Article II : Immune responses in lambs infected with Trichostrongylus colubriformis Caroline LACROUXa, Françoise PREVOTa, Christelle GRISEZa, Olivier ANDREOLETTIa, Jean-Paul BERGEAUDa, Jacques CORTEb, Christine SAUVEb, Lucas GRUNERb, Jean-Claude BRUNELc, Dominique FRANCOISd, Philippe DORCHIESa and Philippe JACQUIETa* a – UMR INRA-ENVT 1225 Interactions Hôtes Agents Pathogènes – Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse – 23, chemin des Capelles – 31076 Toulouse Cedex 03, France b – INRA, Ecologie et Génétique des Parasites, BioAgresseurs Santé et Environnement – 37880 Nouzilly, France c – INRA, Domaine Expérimental de la Sapinière, 18390 Osmoy, France d – INRA, Station d’Amélioration Génétique des Animaux , BP 27, 31 326 Castanet-Tolosan, France *Corresponding author : P. Jacquiet ([email protected]) Tel : (33) 5 61 19 39 67 ; Fax : (33) 5 61 19 39 44 Submitted to Veterinary Parasitology 131 Résultats Abstract The sheep immune response towards gastro-intestinal nematodes has became of great importance in the current context of extensive resistances to anthelmintic molecules in parasite populations and the need of alternative strategies such as vaccination or selective breeding for resistance. In this study, 3 month old INRA 401 lambs (n=79) were randomly allocated into three groups: uninfected control, challenged either once (primary-infected animals) or twice (previously-infected animals) with 10,000 Trichostrongylus colubriformis L3. Uninfected control and once and twice challenged animals were sequentially sacrificed at 4, 10, 17 and 28 days post challenge. No clear polarization of the adaptive immune response was detected in infected lambs. Nevertheless, delayed cellular and humoral responses corresponding to well-known described Th2-type effectors were observed in previouslyinfected sheep and were strongly correlated to a significant decrease in faecal egg excretion. No differences in worms’ establishment or worms’ development were noticed between the two challenged groups. We conclude that two successive exposures to this parasite are probably not sufficient to induce an unequivocal and detectable Th2 cytokine response in young lambs but that the effect of this response could limit the larval burden on pastures by decreasing the faecal egg output. Keywords : Trichostrongylus colubriformis / sheep / immune response / real-time quantitative PCR / antibody response 132 Résultats 1. INTRODUCTION Due to the emergence of anthelmintic resistance in parasite populations (Sangster, 1999 ; Jackson and Coop, 2000) and increased public concern about chemical residues in animal products, the knowledge of immune mechanisms involved in gastrointestinal helminthic infections has become of crucial importance for their control in sheep. The characterization of the underlying immune response to parasitic infections is also a prerequisite for the development of alternative and effective control strategies such as vaccination or selective breeding for resistance. Immune response to gastrointestinal nematodes has been extensively studied in rodents models where protective immunity against these parasites is dependent on the activation of CD4+ T helper cells, and on the Th2 polarization of the immune response (Urban et al., 1992 ; Finkelman et al., 1997 ; Else and Finkelman, 1998). Similar features are also encountered in natural human nematode gut infections (Cooper et al., 2000 ; Quinnell et al., 2004). In sheep, the nature of the immune response towards gastrointestinal helminths, like the existence of a true Th1/Th2 dichotomy, were discussed (Brown et al., 1998 ; Gill et al., 2000). In a previous study, we have shown that 5-6 months old INRA 401 lambs developed an unequivocal Th2 immune response following an experimental H. contortus infection. This response was characterized by high levels of Th2 cytokines mRNA transcription (IL-4, IL-5 and IL-13), and a rapid and intense mobilization of cellular (mast cells, eosinophils and globule leukocytes) and humoral Th2 effectors (Lacroux et al., 2006). The intensities of these immune effectors were negatively correlated to the development of worms, the size and the fecundity of females and to the egg excretion (Lacroux et al., 2006). However, data concerning the polarization of the immune response in Trichostrongylus colubriformis infections in sheep are more conflicting and most of them are coming from infections in 133 Résultats divergent sheep lines, selected for their enhanced or decreased resistance to T. colubriformis (Pernthaner et al., 1997 ; 2005). The latter study concluded for a Th2-like orientation of the immune response, as indicated by the over-expression of IL-5 and IL-13 by efferent intestinal lymph cells, but without IL-4-detected over-transcription (Pernthaner et al., 2005). As these studies were performed using selected sheep lines and a reduced number of animals, without control of the immunization (two years-old animals or more, kept on pasture with multiple infections), results cannot be extended to fully susceptible sheep exposed for the first time to the parasite. Therefore, in this experiment, young INRA 401 lambs bred in controlled worm-free conditions were submitted to one or two successive mono-specific challenges with T. colubriformis separated by anthelmintic treatment. The in vivo polarization of the immune response and kinetics of immune-associated humoral and cellular effectors were investigated. In the meanwhile, the effects of the immune response on nematode populations life-traits were characterized. 134 Résultats 2. MATERIAL AND METHODS 2.1. Experimental design 2.1.1. Animals Seventy-nine 3 month old female INRA 401 lambs were randomly allocated in three experimental groups (Table 1) : Group A : previously-infected, anthelmintic-treated and then challenged sheep (n=27), Group B : primary-infected sheep (n=28), and Group C : uninfected control sheep (n=24). All sheep were born, reared and maintained worm-free in three separate pens before the experiments. Limited infections with coccidia occurred in all groups despite diclazuril treatments (Vecoxan, Janssen-Cilag, 1 mg/kg BW) before the experiment start, but no clinical coccidiosis signs were observed. Lambs received granulated feed adapted to their age, as well as forage and tap water ad libitum. Animals were cared following European Union recommendations for animal welfare and under the supervision of the local INRA ethics committee. 2.1.2. Experimental infections and necropsies Lambs of group A (previously-infected) were orally infected with 10,000 T. colubriformis third-stage larvae (L3) of Weybridge strain (kindly provided by L. Gruner, INRA BASE Tours-Nouzilly) 35 days before challenge. All lambs were treated with an oral administration of Levamisole (7.5 mg/kg) at day –7. Lambs of group A (previously-infected) and B (primary-infected) were then orally infected with 10,000 T. colubriformis L3 at day 0. Six animals of each group were humanely killed at 4, 10, 17 days post challenge (dpc) by exsanguination following intravenous injection of 10 mg/kg pentobarbital sodium. At day 28, nine lambs from group A, ten lambs of group B and six lambs form group C were killed. Necropsy days were chosen to conform with the expected development of the parasite within the host (Soulsby, 1982). 135 Résultats 2.2. Parasitological measurements Faecal samples were taken on all sheep killed on days 17 and 28 after the start of experiment to measure the nematode egg excretion. Faecal egg counts were performed using the modified MacMaster technique (Raynaud, 1970). After necropsies, the contents and washing of the first five meters of duodenum were collected and passed through a 40 µm sieve to eliminate coarse materials. The duodenum segment was digested in pepsinhydrochloric acid solution (37°C, 6 h) to collect the tissue dwelling nematode stages. The contents, washings and digested materials were preserved in absolute alcohol. The volumes of these materials were then adjusted to 1L and worms were counted in a 10% aliquot and classified as adult male or female, immature male or female, or L4. 2.3. mRNA cytokine transcription in duodenal mesenteric lymph node and duodenal mucosa 2.3.1. mRNA extraction and RT-PCR About 300 mg of the duodenal mesenteric lymph node or duodenal mucosa were snap frozen in 1 mL of Trizol Reagent (Invitrogen, reference 15596-018), and stored at –70°C before use. Samples were homogenized using a Hybaid RiboLyserTM (two cycles of 30s each at a speed of 4.5). Fifty µL of the obtained homogenate was mixed with 950 µL of Trizol before adding 200 µL of chloroform at room temperature for 10 min. Samples were then centrifuged for 15 min at 20,000g at 4°C. Supernatants were placed on a RNeasy Column (Rneasy Mini Kit, Qiagen, reference 74106) and then processed using the Qiagen protocol for RNA clean-up. That complete protocol allows the recovery of highly pure RNA. The RNA concentration was measured by spectrophotometry at OD260 and RNA quality was assesses by gel electrophoresis on 1.2% agarose gels stained with ethidium bromide. Two µg of total 136 Résultats RNA were digested with 1U of RNase-free DNAse (Promega) for 1h at 37°C as to remove any trace of genomic DNA, and then incubated 10 min at 65°C with DNase Stop Solution. Treated RNA was used for single-stranded cDNA synthesis. They were incubated 10 min at 65°C with Random Primers oligonucleotides (Invitrogen, reference 48190-011) and chilled on ice; a mix containing M-MLV transcriptase (400 IU/sample, Invitrogen, reference 28025013), 5x first-strand buffer (Life Technologies), dithiothreitol (DTT) 0.1 M (Life Technologies), 40 U of RNase Out Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen, reference 10777-019), 10 mM of each four dNTPs (Promega) was then added and the mixture incubated for 1h at 42°C. Reaction was heat-inactivated at 95°C for 5 min and kept at –20°C until used. For quantitative PCR, cDNA were used at dilutions of 1:100. 2.3.2. PCR primers Specific primers are listed in Table 2. For each target cDNA, a primer pair was determined using Primer Express Software (Applied Biosystems) for SYBR Green real-time PCR assay on a GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) and based on known ovine gene sequences (β-actin, IFN-γ, TNF-α, IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p40). In cases where the ovine gene sequence was not known (IL-13), a consensus sequence was created, based on a minimum of three known sequences in other mammalian species. A first primer pair was then designed using Primer 3 Software as to amplify the largest possible mRNA in all aligned sequence. PCR amplification on reverse transcript RNA obtained from ovine peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated with concanavalin A (ConA, 10 µg/mL, 24 hours in a 5% CO2 and 37°C atmosphere) was then performed. Amplicons were purified before cloning in TopoCloning system (Invitrogen) and sequenced (using M13 universal primers). The sequences thus obtained were then compared with GenBank database as to validate the nature of the amplified product. After validation a new set of primers suitable for quantitative PCR was designed using the obtained sequence. 137 Résultats 2.3.3. Quantitative PCR Real-time quantitation was performed on a GeneAmp 5700 (Applied Biosystems), using the double-stranded DNA binding dye SYBR Green I. PCR products corresponding to the different amplicons (see Table 1) of target cytokines were cloned in PBR 2.1 plasmid (TopoClonA, Invitrogen) and sequenced (M13 universal primers). The plasmid harboring the cloned sequence were then quantified by spectrometry as to establish the number of target copy/µl. From the stock plasmid solution 10-fold dilution series were prepared corresponding to 107 to 101 copies of the target sequence. Serial dilution of the plasmid was then used as an external standard, allowing the determination of the number of copies of the target cDNA in each assay. Each sample for each investigate cytokine was performed in duplicate. Ovine Beta-actin was used as a housekeeping gene to normalize expression between different samples. The results obtained for each cytokine are expressed as a ratio of the number of cytokine mRNA copies / Beta-actin mRNA copies. A non-template control reaction (NTC) was included in each run. Finally, specificity of amplification reaction was assessed by acquisition of a dissociation curve. Data was obtained by slowly increasing the temperature of PCR reaction from 60 to 95°C ; denaturation of non-specific PCR products was followed by a faster decrease of fluorescence than for specific products. The melting profile of distinct PCR product is obtained by plotting the first derivative (-dF/dT) of fluorescence (F) versus temperature (T). 2.4. Antibodies detection in mucus and serum by indirect ELISA A blood sample from each animal were taken just before euthanasia and centrifuged for 5 min at 5000 rpm. Serum was then frozen at –20°C until analysis. A mucus sample from each animal was collected during necropsy using PBS-impregnated filter paper strips of 4 cm2 deposited onto the duodenal mucosa for 5 min. The strips were then gently agitated in PBS 138 Résultats for 2h at room temperature for eluting the mucus. The liquid was then centrifuged and stored frozen at –70°C until analysis. 2.4.1. Worm antigen preparation Two donor sheep infected respectively with 50,000 and 100,000 T.colubriformis L3 (Weybridge strain) were sacrificed, and adult and L4 worms were respectively harvested from the duodenum. These worms were thoroughly washed in PBS (pH 7,4) containing penicillin (100 IU/ml) and streptomycin (1 mg/ml). Two hundred adults/mL and 2000 L4/mL were then maintained in the same buffer in a 5% CO2 atmosphere at 37°C overnight. Next, the supernatant (containing excretory-secretory products (ESP)) was collected, filtered (0,2 µm) and stored at –70°C until further use. A crude extract of T. colubriformis L3 (CEL3)was prepared after three cycles of freezing and thawing (-70°C / +25°C), homogenisation at 4°C and centrifugation at 30,000g for 30 min at 4°C. The supernatant was used as crude extract of L3 antigen. The protein concentration of these three antigenic preparations was determined with the method of Lowry et al. (1951). 2.4.2. Determination of optimal assay conditions The optimal concentrations of ELISA reagents and the optimal tests conditions were determined by chequerboard assays using serial dilutions of T. colubriformis antigens, of positive (group A at 28 dpc) and negative (group C) reference sera or mucus and of specific conjugates. These concentrations and dilutions are presented in Table 3. 2.4.3. ELISA technique An indirect ELISA was used on serum and mucus samples, as described by Jacquiet et al. (2005). Briefly, each well of a flat-bottomed microtitre plate (Nunclon Distr. VWR International, France) was coated overnight with 100 µL of antigen diluted in sodium carbonate buffer at 4°C. The plates were washed twice in PBS pH 7.2 containing 0.1% Tween 20 (PBS-T). To minimize non-specific binding of the antibody, the plates were then incubated 139 Résultats for 1h at 37°C with 200 µL of 5% skimmed milk PBS-T (PBS-TSM). Subsequently the PBSTSM was discarded and the plates dried, before adding 100 µL of serum diluted in PBS-TSM or undiluted mucus to each well for 1h at 37°C. After three washes with PBS-T (the third being of 5 minutes), the plates were subsequently incubated for 1,5h with 100 µL of Donkey anti-sheep IgG HRP (Sigma, reference A3415) (IgG determination) or for two periods of 1h with the first (Mouse IgG1 anti-IgA bovine/ovine, Serotec, reference MCA628) and the second (Goat anti-mouse IgG1 HRP, Serotec, reference STAR81P) conjugates separated by three washings in PBS-T (IgA determination). Finally, the plates were washed three times with PBS-T and 100 µL of 2-2’-azino-bis (3-ethylbenylthiazoline-6-sulphonic acid, ABTS) in 100 mM citrate buffer (Sigma, reference 104.4) containing 0.01% H2O2 was added to each well. The colour was allowed to develop for 1h at 37°C. To stop the reaction, the plates were placed 15 min at 4°C. The optical density was measured at 405 nm using a Microplate Reader (System Dias, Dynatech). 2.5. Histology At necropsy, two tissue samples from duodenum (between 50 and 100 cm from the pylorus) were taken ; the first one was fixed in a 10% formalin for conventional histology and immunohistochemistry (IHC), and the second was frozen at –70°C for frozen IHC. 2.5.1. Conventional histology and IHC with paraffin-embedded samples Duodenal tissue was embedded in paraffin wax and tissue sections of 3 µm were mounted on glass slides. Eosinophils and globule leukocytes were counted on haematoxylin/eosin stained slides, whereas mast cells were counted on Giemsa stained slides. Immunohistochemistry was performed using antibodies already described for cell phenotyping on paraffin-embedded tissues in sheep (Lacroux et al., 2006). This antibody set allows specific labelling of macrophages/monocytes (mouse anti-human CD68 antibody, 140 Résultats clone Ki-M6, Serotec, 1:150 dilution), B lymphocytes (mouse anti-human CD20-like antibody, clone BLA-36, Novocastra, 1:50 dilution), or T lymphocytes (rabbit anti-human CD3 antibody, A 0542, DAKO, 1:100 dilution). 2.5.2. IHC on frozen samples Five µm sections of duodenal tissue were obtained using a Leika cryomicrotome. Slides were fixed for 20 min in an acetone bath then directly processed for IHC with the same method as for paraffin-embedded samples, using monoclonal antibodies directed against CD4 (mouse anti-ovine CD4, SEROTEC, reference MCA2213, 1:600 dilution) or CD8 (mouse anti-bovine CD8, SEROTEC, reference MCA837G, 1:800 dilution) antigens. For each cell type, cells were counted on ten randomly selected optical fields at high magnification (x400), equally distributed between deep and superficial lamina propria. The results were expressed as a sum of the ten fields. 2.6. Statistical analysis Comparisons between the three groups (previously-infected, primary-infected and uninfected control) and between the necropsy dates within a group was tested using the nonparametric tests of Kruskall-Wallis and Mann-Withney (SYSTAT Software). P<0.05 was considered significant. For the 79 observations in this study, Spearman correlation coefficients (r) were statistically significant when r>0.217 (P<0,05) and r>0.283 (P<0,01). A discriminant analysis (DA) was performed with STAT-ITCF Software (1991). Interpretations of this multivariable analysis were as described by Lebart et al. (1995) and allowed individual analysis. Using Mahalanobis distances between the individuals and the gravity centres of each group, each individual was 141 Résultats reallocated and a percentage of well-classified individuals (agreement between the group of origin and the allocated group by analysis) was estimated. 142 Résultats 3. RESULTS 3.1. Dynamics of the worm population (Table 4) No worm and no egg excretion were recorded in uninfected control lambs during the whole experiment. All lambs challenges were followed by a worm establishment with efficiency rates ranging from 3% to 85% (mean 40%) ; a high individual variability among total worm counts was observed within each group but no differences in the total worm burdens were observed between the groups A and B. Furthermore, the development of worms was similar in the two infected groups : only fourth-stage larvae (L4) were recovered at 4 days post challenge (dpc) ; a majority of immature forms were present at 10 dpc ; a majority of adult worms were observed at 17 dpc and almost only adult worms at 28 dpc. Nevertheless at 10 dpc, one lamb of group A harboured few adult worms. Some differences were observed in faecal egg output between both infected groups. At 17 dpc, three lambs of the primary-infected group, but none of the previously-infected sheep, shed egg in their faeces. At the end of the experiment (28 dpc), all lambs of groups A and B shed eggs in their faeces but the difference between these two groups in egg excretion was statistically significant (395 +/- 360 versus 795 +/- 272 for groups A and B respectively, P<0.01). 3.2. mRNA cytokine transcription in duodenal mesenteric lymph node and in duodenal mucosa (Fig. 1) In the duodenal mucosa, the mean IL-5 mRNA expression was systematically higher in the two infected groups when compared to the uninfected control one at each time point of the experiment (Fig. 1A). However, IL-5 over-transcription was observed in some but not all animals within infected groups. Similarly, an higher expression of IL-5 mRNA was observed 143 Résultats in the duodenal mesenteric lymph node of some previously-infected lambs at 17 and 28 dpc, when compared to the primary-infected and uninfected control sheep (Fig. 1B). Due to this great individual variability, theses differences were not statistically significant. In both duodenal mucosa or lymph node, no qualitative or statistical differences were observed in the transcription of IL-4 mRNA (Fig. 1C and 1D), IFN-γ, IL-12, IL-10, TNF-α and IL-13 (data not shown) between the three experimental groups. 3.3. Specific antibody detection in duodenal mucus and in serum (Fig. 2) A late and significant (P<0.05) production of local specific total IgG and IgA towards CEL3 and excretory-secretory products of L4 (L4 ESP)was observed in the previously-infected group at 28 dpc (Fig. 2A, 2B, 2D and 2E). A significant higher level of mucosal IgA and IgG production against ESP of adult worms was already present at 17 dpc in the previouslyinfected group (Fig. 2C and 2F) and was maintained at 28 dpc. No modifications of total IgG and IgA levels were observed in primary-infected and uninfected control sheep during the whole experiment. In serum, a significant (P<0.05) higher level of IgA was observed in the previouslyinfected group as soon as 10 dpc with the L4 ESP antigen and as soon as 17 dpc with the CEL3 antigen. No detectable seric IgA levels against adult worms ESP were observed for the three groups during the whole experiment (data not shown). Concerning seric IgG production, significant higher levels (P<0.05) were observed in the previously-infected group as soon as 10 dpc with the CEL3 antigen, and as soon as 17 dpc with L4 ESP antigen. The production of seric IgG towards adult worms ESP antigen was similar as the IgG production observed in the mucus (data not shown). 144 Résultats 3.4. Dynamics of the duodenal cellular infiltration (Fig. 3) Late but significant eosinophil and mast cell recruitments in the duodenal mucosa (P<0.05) were observed in the previously-infected sheep (28 dpc), when compared to primary-infected and uninfected control sheep (Fig. 3A and 3B). The infiltration by globule leukocytes was earlier in previously-infected sheep (as soon as 10 dpc) and remained significantly different (P<0.05) until the end of the experiment, while no differences were observed in primary-infected and uninfected control lambs (Fig. 3C). Concerning CD3+-T cells, BLA36+-B cells and CD68+-monocyte/macrophage cells, no significant differences were noticed between the three experimental groups (data not shown). Similarly, no modifications of CD4+ and CD8+ T cells numbers were observed in this study (data not shown). 3.5. Relationships between immune response and parasitological data (Table 5) No modifications of total worm burdens between the two infected groups (A and B) were observed. Similarly worm development was apparently not delayed by the immune response elicited after the first challenge. The only significant difference between the two groups was a significant decrease of the faecal egg output in primary-infected lambs, at 17 and 28 dpc. Interestingly at 17 dpc, mucosal IgA production (raised against CEL3 and L4 ESP antigens) were significantly and negatively correlated to the number of excreted eggs (P<0.01). At 28 dpc, significant negative correlations were noted between egg excretion and eosinophil / mast cell recruitment, as well as between egg excretion and the majority of seric and mucosal antibody response (Table 5). No correlations were observed between the cytokine expression level, either Th1 or Th2, and the egg excretion. 145 Résultats 3.6. Discriminant analysis Individual re-arrangement revealed that 89.9% of animals were well-classified by the multivariate analysis. All lambs of the uninfected control group were considered as noninfected animals. In the previously-infected group, 25/27 lambs were well-classified, one was considered as primary-infected and one as uninfected control. These two sheep could be considered as low-responders. In the primary-infected group, 22/28 lambs were effectively considered as primaryinfected, while 2 animals had characteristics comparable to previously-infected sheep (highresponders), and four sheep were comparable to uninfected controls (low-responders). 146 Résultats 4. DISCUSSION In this study, no clear Th2 polarized response evaluated at the mRNA cytokine gene transcription level was observed. This is in contradiction to descriptions in rodent models (Urban et al., 1992) and in previous studies using T. colubriformis infected sheep (Pernthaner et al., 2005). Moreover, these results are conflicting with our previous study of H. contortus infected lambs, where an unequivocal Th2 immune response was demonstrated by using identical experimental design and molecular tools (Lacroux et al., 2006). Thishis failure in detection of a clear polarized immune response could find its origin in different but non exclusive explanations. First, the immune response induced by T. colubriformis could require longer or repetitive exposures to be expressed in sufficient detectable levels. Our experiment was ended after a short course of infection challenge (28 days). This immunization protocol is clearly different from repeated or continuous infections, as carried out in many studies of the immune response towards this parasite (Dobson et al., 1990a, b, c ; Emery et al., 1992 ; McClure et al., 1998). This could explain the low although significant effector humoral and cellular responses obtained in this study. A priming infection of four weeks is also probably too short do develop anti-larval responses and could explain why no differences in larval establishment were noticed between previously-infected and primary-infected lambs. Indeed, a 12 weeks exposure to infection was shown to be necessary for developing resistance to incoming larvae to develop, while worms removed by anthelmintic treatment after only 1 to 4 weeks of infection were completely replaced (Barnes and Dobson, 1993). In this way, our protocol is also clearly different from Pernthaner’s experiments in which previously-infected sheep were obtained after 1 or 2 years of free grazing onto naturally infected pastures (Pernthaner et al., 2005). Secondly, despite similar technical investigations, differences in immune polarization were observed between H. contortus and T. colubriformis infections. 147 Résultats This could be linked to the parasite biology and interaction with his host. For H. contortus, the host-parasite relationships (L4, immature and adult worms are blood feeding) imply repetitive breakings of the abomasal mucosa basal membrane to reach the lamina propria blood vessels. On the contrary, T. colubriformis adult stages of are living in the sub epithelial region of the intestinal mucosa, without impairment of the basal membrane and without contact with the lamina propria (Miller, 1984). This particularity could lead to limited contacts with the immune system and immune cells of the lamina propria and then require several exposures to initiate effective and detectable cytokine gene mRNA transcriptions. This could also explain that these transcriptions could only be detectable after amplification on selected specific cell subsets, like immune cells in efferent intestinal lymph (Pernthaner et al., 2005) and not in the whole intestinal mucosa or draining lymph node like in our experiments. Finally, the specific cytokinic response induced by the nematode infection could be drowned in the whole cytokinic background of the intestinal environment and the limited coccidia infections observed in our lambs may have impaired also the cytokine balance. Nevertheless, despite no significant group differences, some animals of the previouslyinfected group had an increased IL-5 gene expression in both investigated tissues at the end of our experiment (28 dpc). This data support those of Pernthaner et al. (2005) and plead although for a classical Th2 orientation of the immune response. However, in total duodenal mucosa or lymph node (our study) or in intestinal lymph cells (Pernthaner et al., 2005), no differences were observed in the expression of IL-4 mRNA cytokine considered as the key of the Th2 orientation pathway. Despite an equivocal polarization of the adaptive immune response in this study, the effector mobilization (antibodies and cellular recruitment in duodenal mucosa) support a Th2 mechanism, similar to features encountered in rodent models. In mice, gastrointestinal 148 Résultats nematode infections elicit Th2 immune responses and are almost invariably accompanied by local and systemic eosinophilia, mucosal mast cell hyperplasia, and local and general specific antibody responses (mainly IgA, IgE and IgG1) (Urban et al., 1991). Similar features are described in sheep infected with Haemonchus contortus (Schallig, 2000 ; Lacroux et al., 2006), Teladorsagia circumcincta (Stear et al., 1995) and with T. colubriformis (Bendixsen et al., 1995). In our study, mast cell and globule leukocytes hyperplasia, mucosal eosinophilia and specific antibodies levels are detected at the end of the experiment (17 or 28 dpc) in previously-infected sheep only. No significant cellular and humoral responses were observed in the primary-infected group, as well as in uninfected control lambs, suggesting that a first exposure to the parasite is not sufficient to induce significant Th2-type effector modifications. The last objective of this study was to measure the effects of recruited cells or antibodies on parasite establishment, development and fecundity. No differences in the establishment rate of worms were observed between previously-infected and primary-infected lambs. Moreover, the parasite development within the host was not delayed during the secondary infection in contrast to other studies using H. contortus (Schallig et al., 1995 ; Lacroux et al., 2006) or T. circumcincta infections (Stear et al., 1995). However, a significant decrease in faecal egg output was observed in previously-infected lambs as soon as 17 dpc, suggesting a stunting effect on female size and a reduced fecundity as demonstrated in H. contortus infected lambs (Lacroux et al., 2006). These results corroborate previous observations stating that young lambs are unable to control total worm burden due a constitutive immunological hyporesponsiveness (Colditz et al., 1996), but are able to influence parasite life traits like adult female worm length and then faecal egg output (Stear et al., 1999). Strong negative correlations were observed between eosinophils, mast cells, a large range of IgA and IgG antibody responses and the egg excretion at 28 dpc (Table 5), 149 Résultats reinforcing the role of these immune effectors in decreasing the faecal egg output. Eosinophils and mast cells are considered to play an important role in the response against gastrointestinal nematode infections (Douch et al., 1986 ; Dawkins et al., 1989 ; Pfeffer et al., 1996 ; Balic et al., 2000), as these cell types may kill infective larvae by releasing toxic proteins against the target parasite, as least in vitro (Butterworth et al., 1975 ; Capron et al., 1984 ; Rainbird et al., 1998). Traditionally the effector responses seems to act against incoming larvae and influence their expulsion. In our study, as no differences in worms establishment are recorded, these cells could also have a role on established parasites. Similarly, IgA and IgG antibodies could have a direct effect i) on the immune rejection of incoming larvae (Harrison et al., 2003) and ii) on established parasites by neutralizing or inactivating vital metabolic enzymes (Gill et al., 1993) or by interfering with the worm’s ability to feed (Smith, 1988). In conclusion, two successive one-month long T. colubriformis infections in young lambs are sufficient to induce the mobilization of Th2 cellular and antibody responses, to reduce the faecal egg excretion and then the larval contamination of pastures. Nevertheless using this immunization protocol, no reduction of the total worm burden, nor modifications of parasite development, are demonstrated, so benefits at the individual level remain limited. No clear polarization of the immune response can be ruled out when considering a whole given group, but individual variability observed in the previously-infected sheep for IL-5 mRNA transcription, cellular and antibody responses, plead nevertheless for a Th2-type pathway orientation. Repetitive or higher exposures may be required to initiate a strong Th2 protective immune response in young INRA 401 lambs. 150 Résultats REFERENCES Balic, A., Bowles, V. M. and Meeusen, E. N. 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Treatment and group Initial infection* Levamisole Challenge infection* Number of sheep killed -35 -7 0 4 10 17 28 + + + 6 6 6 9 - + + 6 6 6 10 - + - 6 6 6 6 Days from challenge Previously infected (A) Primary infected (B) Uninfected control (C) *10,000 T. colubriformis L3 155 Résultats Table 2 : Forward and reverse primer sequences for quantitative reverse-transcriptase (RT) PCR. Cytokine Forward sequence Reverse sequence Tm amplicon (°C) Ovine Beta-actin ACCAGTTCGCCATGGATGAT AGCCGTTGTCAACCACGAG 78 Ovine IFN-γ ATCTCTTTCGAGGCCGGAGA ATTGCAGGCAGGAGAACCAT 77 Ovine IL-4 GGAGCTGCCTGTAGCAGACG TTCTCAGTTGCGTTCTTTGGG 79 Ovine IL-10 CTGAGAACCATGGGCCTGAC TCTCCCCCAGCGAGTTCAC 80 Ovine TNF-α α CCCGTCTGGACTTGGATCCT TGCTTTTGGTGCTCATGGTG 75 Ovine IL-12p40 GAATTCTCGGCAGGTGGAAG GTGCTCCACGTGTCAGGGTA 80 Ovine IL-13 AGAACCAGAAGGTGCCGCT GGTTGAGGCTCCACACCATG 80 Ovine IL-5 CTGCTGATAGGTGATGGGAACTT GGTGATTTGTATGCTGAGGAGTAGG 74 Ovine IL-3 AAGAATATCCTGGCGAATAAGAGC GAACGCTTTCAGGTTTGCCT 75 156 Résultats Table 3 : Reagents and procedures used for antibody ELISA detection in serum and mucus. SERUM ISOTYPE MUCUS IgG Type of antigen ESP Ad ESP L4 IgA CEL3 ESP Ad ESP L4 IgG CEL3 ESP Ad ESP L4 IgA CEL3 ESP Ad ESP L4 CEL3 Concentration of antigen (µg/mL) 0.5 0.5 1 1 1 1 1 1 0.5 2 1 1 Dilution of serum or mucus 1:200 1:100 1:100 1:200 1:100 1:200 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:2000 1:2000 1:2000 1:250 1:250 1:250 1:1000 1:1000 1:1000 1:250 1:250 1:250 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500 Dilution of secondary antibody Dilution of conjugate - - - - - - Types of antigens : Excretory-secretory products from T. colubriformis adult (ESP Ad) or fourth-stage larvae (L4) worms (ESP L4), and crude extract of T. colubriformis infective third-stage larvae (CEL3) were tested. For IgG determination, secondary antibody is a Donkey anti-sheep IgG HRP-conjugated (Sigma, reference A3415). For IgA determination, an anti-bovine/sheep IgA mouse IgG1 (Serotec, reference MCA628) is first applied before a goat anti-mouse IgG1 HRP-conjugated (Serotec, reference STAR81P). 157 Résultats Table 4 : Egg excretion, total worm burden, stage and sex composition of Trichostrongylus colubriformis populations. Days post challenge Group Epg (mean +/- SD) Total worm burden (mean +/- SD) L4 (%) Immature males (%) Immature females (%) Adult males (%) Adult females (%) A - 2715 ± 611 100 - - - - B - 2270 ± 810 100 - - - - A - 4920 ± 2409 2.2 40.4 40.0 7.1(1) 10.4(1) B - 4600 ± 1260 2.5 43.9 53.6 - - A -* 3827 ± 2644 - 3.1 4.5 37.3 55.1 B 33+/-64 * 6815 ± 1590 - 0.5 0.5 41 58 A 395+/-360 * 4036 ± 1027 0.85 - 0.05 45.1 54 B 795+/-272 * 4448 ± 631 - - - 45.1 54.1 4 10 17 28 Group A : previously-infected sheep. Group B : primary-infected sheep. Six animals per group were sacrificed at 4, 10 and 17 days post challenge ; 9 and 10 sheep were sacrificed at 28 days post challenge for groups A and B respectively. (1) Adult worms in group A at 10 days post challenge were observed in only one sheep. *p<0.01 158 Résultats Table 5 : Correlations between cellular / antibody responses and the faecal egg excretion at 28 days post challenge. Mucus Serum IgG IgA Eosinophils Epg (eggs per gram) at 28 dpc -0.554** Mast cells -0.500* IgA IgG Globule leukocytes CEL3 L4 ESP Adult ESP CEL3 L4 ESP Adult ESP CEL3 L4 ESP Adult ESP CEL3 L4 ESP Adult ESP -0.026 -0.518* -0.502* -0.565** -0.203 -0.610** 0.497* -0.365 -0.622** -0.680** -0.182 -0.318 -0.557** Legend : CEL3 : crude extract of T. colubriformis third-stage larvae ; L4 ESP : excretory-secretory products of four –stage larvae ; Adult ESP : excretory-secretory products of adult worms. For 19 observations at 28 dpc, *p<0.05 (when correlation coefficient is >0.433) and **p<0.01 (when correlation coefficient >0.548). 159 Résultats CAPTIONS TO FIGURES Fig. 1 : Th2 cytokine mRNA transcriptions in the duodenal mucosa (DM) and in the duodenal mesenteric lymph node (MLN) from previously-infected, primary-infected and uninfected control sheep. IL-5 mRNA (A : in DM and B: in MLN), IL-4 mRNA (C: in DM and D : in MLN), were quantified and measured in each duplicate sample using an external standard. Results are expressed after normalization (ratio) with a housekeeping gene (ovine Beta-actin) Small black squares represent the mean of each group. Fig. 2 : Mucosal IgG and IgA responses to parasite (excretory-secretory products (ESP) of T. colubriformis fourth-stage larvae (L4) or adult worms, or crude extract of L3 (CEL3)) antigens, in previously-infected, primary-infected and uninfected control sheep. A : Total mucus IgG against CEL3 ; B : Total mucus IgG against L4 ESP ; C : Total mucus IgG against adult worms ESP ; D : Mucus IgA against CEL3 ; E : Mucus IgA against L4 ESP and F : Mucus IgA against adult worms ESP . Small black squares represent the mean of each group. Asterisks are mentioned when a significant statistical difference exists between the three groups (P<0.05). Fig. 3 : Cellular infiltration in the duodenal mucosa : eosinophils (A), mast cells (B) and globule leukocytes (C) in previously-infected, primary-infected and uninfected control sheep. For each cell type, the evaluation of cell number evaluation was performed on ten randomly selected fields at high magnification (x 400). The results were expressed as the sum of five fields. Small black squares represent the mean of each group. Asterisks are mentioned when a significant statistical difference exists between the three groups (P<0.05). 160 Résultats PARTIE II : ETUDE COMPARATIVE DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE CHEZ DES AGNEAUX DE RACE RESISTANTE, BARBADOS BLACK BELLY, ET DE RACE SENSIBLE, INRA 401, INFESTES PAR H. CONTORTUS Le contrôle des strongyloses gastro-intestinales chez les petits ruminants est fondé sur l’utilisation de molécules anthelminthiques. Cependant, l’apparition de parasites résistants aux trois grandes familles d’anthelminthiques, la diffusion rapide de ces résistances au sein des populations de strongles ainsi qu’une demande croissante de la part des consommateurs d’obtenir des denrées alimentaires exemptes de résidus chimiques (Waller, 1997 ; Sangster, 1999 ; Wolstensholme et al., 2004) orientent les acteurs des filières ovines vers des méthodes alternatives de lutte contre les parasites gastro-intestinaux. Parmi ces méthodes, la sélection d’animaux résistants représente une approche séduisante. La résistance de certaines races ovines vis-à-vis de parasites gastro-intestinaux est connue depuis longtemps. Ainsi, les ovins de races tropicales (Gulf Coast Native, Sainte-Croix…) semblent plus résistants que la plupart des ovins de races européennes (Radhakrishnan et al., 1972 ; Bradley et al., 1973 ; Courtney et al., 1984 et 1985 ; Burke et Miller, 2002). Les ovins Barbados Black Belly, élevés dans les Caraïbes, présentent également une plus grande résistance à H. contortus que les ovins de race INRA 401. Cette résistance s’étend à d’autres espèces de nématodes comme T. colubriformis et T. circumcincta (Gruner et al., 2003). Les mécanismes responsables de cette plus grande résistance demeurent toutefois inconnus. Parmi les hypothèses avancées, une meilleure capacité de ces ovins à générer une réponse immunitaire adaptative face aux strongles gastro-intestinaux peut être envisagée. Dans cette seconde partie, des ovins de race sensible (INRA 401) et résistante (Barbados Black Belly) ont été infestés par H. contortus afin : - de comparer la dynamique de la réponse immunitaire adaptative dans ces deux races, - de mettre en évidence des différences d’intensité ou de précocité de la réponse immunitaire et de ses mécanismes effecteurs, susceptibles d’expliquer la plus forte résistance des ovins Barbados Black Belly. 165 Résultats Ces travaux ont donné lieu à une publication et à un enseignement post-universitaire : Caroline LACROUX, Getachew TEREFE, Olivier ANDREOLETTI, Christelle GRISEZ, Françoise PREVOT, Jean-Paul BERGEAUD, Juliette PENICAUD, Virginie ROUILLON, Lucas GRUNER, Jean-Claude BRUNEL, Dominique FRANCOIS, Philippe DORCHIES et Philippe JACQUIET « Dynamics of the adaptative immune response to Haemonchus contortus in susceptible INRA 401 and resistant Barbados Black Belly lambs» Manuscrit en préparation. Caroline LACROUX et Philippe JACQUIET « Résistance génétique des ovins aux nématodes gastro-intestinaux » Cours au CEAV de Pathologie Animale en Régions Chaudes – Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse – Février 2004, Février 2005 et Février 2006. 166 Résultats Article III : Dynamics of the adaptive immune response to Haemonchus contortus in susceptible INRA 401 and resistant Barbados Blackbelly lambs Running title: Immune response in INRA 401 and Barbados Blackbelly lambs infected by Haemonchus contortus. Caroline LACROUX1*, Getachew TEREFE1*, Olivier ANDREOLETTI1, Christelle GRISEZ1, Françoise PREVOT1, Jean-Paul BERGEAUD1, Juliette PENICAUD1, Virginie ROUILLON1, Lucas GRUNER2, Jean-Claude BRUNEL3, Dominique FRANCOIS4, Philippe DORCHIES1 and Philippe JACQUIET1** 1 - UMR INRA-ENVT 1225 Interactions Hôtes Agents Pathogènes – Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse – 23, chemin des Capelles – 31076 Toulouse Cedex 03, France 2 – INRA, Ecologie et Génétique des Parasites, BioAgresseurs Santé et Environnement – 37880 Nouzilly, France 3 – INRA, Domaine Expérimental de la Sapinière, 18390 Osmoy, France 4 – INRA, Station d’Amélioration Génétique des Animaux, BP 27, 31 326 Castanet-Tolosan, France *Both authors contributed equally to this study Manuscrit en préparation **Corresponding author: P. Jacquiet ([email protected]) Tel: (33) 5 61 19 39 67; Fax: (33) 5 61 19 39 44 167 Résultats ABSTRACT Breeding for resistance has been viewed as an attractive alternative method to control gastrointestinal nematode infections in sheep. Tropical breeds, like Barbados Blackbelly (BBB), are well known for their enhanced resistance to gastrointestinal strongyles such as Haemonchus contortus. However, the mechanisms underlying such phenomenon remain unknown. Here we report the comparison in the dynamics of the adaptive immune response between susceptible (INRA 401) and resistant (BBB) lambs infected by H. contortus. BBB lambs were more resistant to H. contortus than INRA 401 lambs as early as the first exposure. A dramatically lower egg excretion (coupled to reduced size and fecundity of female worms) was observed in these animals. Conversely to what was observed in INRA 401 lambs, a second infection did not further enhance the resistance of BBB lambs. The general cytokine patterns were similar in the two breeds except for the persistence and higher intensity during the whole infection-period of Th2 cytokine (IL-4, IL-5 and IL-13) mRNA over-transcriptions in BBB lambs. The IL-5 mRNA over-transcription in BBB lambs was linked to a high and long lasting blood eosinophilia. However, no clear-cut differences were observed in the abomasal cellular recruitment between the two breeds at 4 and 30 days post infection. Key-words: Barbados Blackbelly sheep– Haemonchus contortus – Adaptive immune response – Th2 polarization – Genetic resistance. 168 Résultats 1 - INTRODUCTION The control of parasitic diseases has often suffered from the development of drug resistant parasites and the increasing consumer concern about drug residues in food products of animal origin. The use of nematode resistant sheep breeds has recently been considered as one alternative method for limiting the significant losses due to parasites. In this respect, Santa Ines sheep were shown to better resist to Haemonchus contortus infections compared to Suffolk or Ile de France sheep (Amarante et al., 2004). Other tropical breeds, such as the Gulf Coast Native or the St. Croix, are also more resistant to H. contortus than the Suffolk, Rambouillet, Finn-Dorset x Rambouillet, Dorset or Dorper breeds (Courtney et al., 1985a,b; Gamble and Zajac, 1992; Burke and Miller, 2002). A simultaneous study carried out in Guadeloupe (using Barbados Blackbelly (BBB) sheep) and in France (using INRA 401 sheep) by Aumont et al. (2003) has indicated that the BBB breed was more resistant to both allopatric and sympatric isolates of H. contortus than the INRA 401 breed. This was later confirmed by Gruner et al. (2003) in their study on both breeds in France, where the resistance was further extended to Trichostrongylus colubriformis and, to a lesser extent, to Teladorsagia circumcincta. However, the mechanisms underlying such inter-breed differences in the response to parasitic infections are still poorly understood. One possible explanation for this difference could be the observation that lambs from tropical breeds develop resistance to H. contortus at an age when they are thought to be immune incompetent (Bahirathan et al., 1996). CD4+ T helper cells have been found to be important in the genetic control of the development of immunity against H. contortus in Merino lambs (Gill et al., 1993), which is associated to an increase in the number of mast cells, blood and tissue eosinophils as well as specific antibody levels (Schallig, 2000). In a previous study, we have shown that susceptible INRA 401 lambs developed an unequivocal Th2 immune response following a H. contortus infection (Lacroux 169 Résultats et al., 2006). While comparisons were made to elucidate differences in parasitological parameters between H. contortus resistant BBB sheep and susceptible INRA 401 sheep, little or no attempt has been made to discover the potential immune mechanisms underlying such differences between these two breeds. Therefore, the aims of the experiments reported here were first to confirm the higher resistance of BBB lambs compared to INRA 401 lambs, as observed by Aumont et al. (2003). The cytokine polarization of the adaptive immune response and the kinetics of the cellular effectors have been explored and compared between the two breeds to define if i) BBB sheep develop a clear Th2 immune response and if ii) differences in the timing or intensity of this response explain the higher resistance observed in BBB sheep. 170 Résultats 2 - MATERIALS AND METHODS 2.1. Experimental design 2.1.1. Animals Six months old INRA 401 (n=28) and Barbados Blackbelly (BBB) male lambs (n=25) were randomly allocated into three experimental groups for each breed: Group A: previouslyinfected, anthelmintic-treated and then challenged sheep, Group B: primary-infected sheep, and Group C: uninfected control sheep. All sheep were born, reared and maintained wormfree in three separate pens before the experiments. Limited infections with coccidia occurred in all groups despite diclazuril treatments (Vecoxan, Janssen-Cilag, 1 mg/Kg BW) before the beginning of the experiment, but no clinical signs of coccidiosis were observed. Lambs received granulated feed adapted to their age, as well as forage and tap water ad libitum. Animals were handled following European Union recommendations for animal welfare and under the supervision of the local INRA ethics committee. 2.1.2. Experimental infections and necropsies For the initial infection, lambs of group A (previously-infected) received orally 10,000 H. contortus third-stage larvae (L3) of Humeau strain at day 0. All lambs were treated with an oral administration of Ivermectin (Oramec 0.2 mg/kg, Merial SAS) at day 30. Lambs of group A (previously-infected) and B (primary-infected) were then orally challenged with 10,000 H. contortus L3 at day 45. Animals were humanely killed at Day 49 (4 days post challenge (dpc)) and Day 75 (30 dpc) by intravenous injection of 10 mg/kg pentobarbital sodium followed by exsanguinations (Table 1). 171 Résultats 2.2. Parasitological monitoring Egg counts were performed according to the modified McMaster technique (Raynaud, 1970) on fecal samples collected twice a week from D15 to D30 for the previously-infected groups (INRA 401 and BBB groups A) and from D60 to D75 for all three groups. Immediately after necropsies, the contents and washings of the abomasum were collected and passed through a 40 µm sieve to conserve the coarse material containing worms. The whole abomasum was digested in pepsin-hydrochloric acid solution (37°C, 6 h) to collect the tissue dwelling nematode stages. The contents, washings and digested materials, were preserved in absolute alcohol. The volume of these materials was then adjusted to 1 L and worms were counted in a 10% aliquot and classified as adult male or female, immature male or female, or L4. Furthermore, twenty adult female worms were randomly picked from each D75 sample for total parasite length measurement and counting of eggs in utero. For this purpose, individual female worms were allowed to disintegrate in 200 µL of 20% Milton Sterilizing fluid (Milton Pharmaceutical LTD, contains 2% w/v sodium hypochlorite and 16% w/v sodium chloride) in distilled water (Kloosterman et al., 1978) and all eggs liberated from the uterus were counted for each worm. 2.3. Fecal egg hatch test At the end of experiment, fecal samples were collected during necropsy directly from the rectum. 3g of each sample was taken for eggs per gram (EPG) determination, while the remaining material was weighed and cultured at 23°C for 10 days with regular humidification. The samples were then transferred to a Baermann apparatus for collecting infective larvae of H. contortus. 24 hours later, all the fluid contained in the apparatus was collected and larvae were counted in 500µL of the suspension. To maximize the number of counted larvae, the remaining fecal material (after Baermann) was weighed again and 1g was dissolved in 100 ml 172 Résultats of water. Larvae were counted in 10 ml of this suspension and the total value was added to the previous corresponding value. Finally, the percentage of larvae obtained was calculated as: % of larval output = 100 x total number of larvae counted / (EPG x quantity of fecal material cultured) 2.4. Blood eosinophilia monitoring Blood samples were collected once a week from D0 to D75 for the previously-infected groups (INRA 401 and BBB groups A) and from D45 to D75 for all groups in EDTA coated tubes. 100 µL of each blood sample was mixed in 900µL of eosin Y 0.5% (Carpenter’s solution, Thermo Electron Corporation) and allowed to stain for 5 minutes. The solution was then diluted with similar volume of PBS (1 mL) to facilitate cell visualization, and the mixture was filled into a FAST READ 102 cell counting chamber (ISL UK). Eosinophils were counted in the grids containing 1 µL of the mixture (Dawkins et al., 1989). 2.5. Cytokine expression in total abomasal lymph node and CD4+ cells isolated from the abomasal lymph node and fundic mucosa 2.5.1. mRNA extraction and RT-PCR About 300 mg of the total abomasal lymph node or fundic mucosa were snap frozen in 1 mL of Trizol Reagent (Invitrogen, reference 15596-018), and stored at –70°C before use. Samples were homogenized using a Hybaid RiboLyserTM (two cycles of 30s each at a speed of 4.5). Fifty µL of the obtained homogenate was mixed with 950 µL of Trizol before adding 200 µL of chloroform at room temperature for 10 min. Samples were then centrifuged for 15 min at 20,000 g at 4°C. Supernatants were placed on a RNeasy Column (RNeasy Mini Kit, Qiagen) and then processed using the Qiagen protocol for RNA clean-up. This complete protocol allows the recovery of highly pure RNA. The RNA concentration was measured by 173 Résultats spectrophotometry at 260 nm and RNA quality was assessed by electrophoresis on 1.2% agarose gels stained with ethidium bromide. Two µg of total RNA were digested with 1U of RNase-free DNAse (Promega) for 1h at 37°C to remove any trace of genomic DNA, and then incubated 10 min at 65°C with DNase Stop Solution. Treated RNA was used as the template for single-stranded cDNA synthesis. They were incubated 10 min at 65°C with Random Primers oligonucleotides (Invitrogen) and chilled on ice; a mix containing M-MLV transcriptase (400 IU/sample), 5x first-strand buffer (Life Technologies), dithiothreitol (DTT) 0.1 M (Life Technologies), 40 U of RNase Out Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen), 10 mM of each four dNTPs (Promega) was then added and the mixture incubated for 1h at 42°C. Reaction was heat-inactivated at 95°C for 5 min and kept at –20°C until used. For quantitative PCR, cDNA were used at dilutions of 1:100. 2.5.2. CD4+ cells isolation from the abomasal lymph node Immediately after death, a fragment of the abomasal lymph node of each animal was placed in a 1X PBS solution and chilled on ice. The abomasal lymph node was then gently crushed on a 40 µm cell strainer. Cells were collected in 50 mL HBSS and washed two times. Approximately 1x107 cells were re-suspended in 500 µL FACS Buffer (PBS with 2mM EDTA and 0.5% BSA) and incubated 30 minutes on ice with an anti-CD4 FITC-labeled antibody 1:150 diluted (mouse anti-ovine CD4-FITC, Serotec, reference MCA2213F). After washing, the cell pellet was re-suspended in 80µL FACS Buffer and incubated 15 minutes at 4°C with 20 µL magnetic micro-beads coupled to an anti-FITC monoclonal antibody (antiFITC micro-beads, Miltenyi Biotec, reference 130-048-701). After two washes in FACS Buffer, CD4+ cells were sorted using AUTOMACS Cell Sorter (Miltenyi Biotec). About 1x106 cells of this positive fraction were conserved at –70°C in 350 µL RLT Buffer with 1% β-Mercaptoethanol. Total RNA from this cell fraction was extracted using the Qiagen 174 Résultats protocol. The purity of the CD4+ cell fraction was analyzed on a FACScalibur flow cytometer (BD Biosciences). 2.5.3. PCR primers Specific primers and amplicon sizes are listed in Table 2. For each target cDNA, a primer pair was determined using Primer Express Software (Applied Biosystems) for SYBR Green real-time PCR assay on a GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) and based on known ovine gene sequences (β-actin, IFN-γ, TNF-α, IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p40). Oligonucleotides were designed to amplify a product with a size of 51 bp, with a melting temperature (Tm) of 58-60°C. When the ovine gene sequence was not known (Eotaxin, IL-13), a consensus sequence was created, based on a minimum of three known sequences in other mammalian species. A first primer pair was then designed using Primer 3 Software in order to amplify the largest possible mRNA in all aligned sequence. PCR amplification on reverse transcript RNA obtained from ovine peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated with concanavalin A (ConA, 10 µg/mL, 24 hours in a 5% CO2 and 37°C atmosphere) was then performed. Amplicons were purified before cloning in TopoCloning system (Invitrogen) and sequenced (using M13 universal primers). The sequences thus obtained were then compared with Gene Bank database using blast to validate the identity of the amplified product. After validation, a new set of primers suitable for quantitative PCR was designed using the obtained sequence. For IL-13, primers used were those published by Hein et al. (2004). 2.5.4. Quantitative PCR Quantitative PCR was performed on a GeneAmp 5700 (Applied Biosystems), using the double-stranded DNA binding dye SYBR Green I. PCR products corresponding to the different amplicons of target cytokines were cloned in PBR 2.1 plasmid (TopoClonA, Invitrogen) and sequenced (M13 universal primers). The plasmids harboring the cloned 175 Résultats sequence were then quantified by spectrometry to establish the number of target copy/µl. 10fold dilution series were prepared from the stock plasmid solution corresponding to 107 to 101 copies of the target sequence. Serial dilution of the plasmid was then used as an external standard, allowing the determination of the number of copies of the target cDNA in each assay. Each sample for each investigated cytokine was performed in duplicate. Ovine Betaactin was used as a housekeeping gene to normalize expression between different samples. The results obtained for each cytokine are expressed as a ratio of the number of cytokine mRNA copies / Beta-actin mRNA copies. A non-template control reaction (NTC) was included in each run. Finally, specificity of amplification reaction was assessed by acquisition of a dissociation curve. Data was obtained by slowly increasing the temperature of PCR reaction from 60 to 95°C; denaturation of non-specific PCR products is followed by a faster decrease of fluorescence than for specific products. The melting profile of distinct PCR product was obtained by plotting the first derivative (-dF/dT) of fluorescence (F) versus temperature (T). 2.6. Histology At necropsy, two tissue samples from the fundic area of the abomasal wall were taken; one was fixed in 10% formalin for conventional histology and immunohistochemistry (IHC), while the second was stored at –70°C for frozen IHC analysis. 2.6.1. Conventional histology and IHC with paraffin-embedded samples Abomasal tissue was paraffin-embedded and 3 µm sections were mounted on glass slides. Eosinophils and globule leukocytes were counted on haematoxylin-eosin stained slides whereas mast cells were counted after Giemsa staining. Immunohistochemistry was performed using antibodies already described for cell phenotyping on paraffin-embedded tissues in sheep (Lacroux et al., 2006). This antibody set allows specific labeling of 176 Résultats macrophages/monocytes (mouse anti-human CD68 antibody, clone Ki-M6, Serotec, 1:150 dilution), B lymphocytes (mouse anti-human CD20-like antibody, clone BLA-36, Novocastra, 1:50 dilution), or T lymphocytes (rabbit anti-human CD3 antibody, A 0542, DAKO, 1:100 dilution). 2.6.2. IHC on frozen samples Five µm sections of abomasal tissue were obtained using a Leika cryomicrotome. Slides were fixed for 20 min in an –20°C acetone bath before drying and directly processed for IHC. Monoclonal antibodies directed against CD4 (mouse anti-ovine CD4, SEROTEC, reference MCA2213, 1:2000 dilution), or CD8 (mouse anti-bovine CD8, SEROTEC, reference MCA837G, 1:800 dilution) antigens were used. For each type, cells were counted on five randomly selected fields at high magnification (x 400). The results were expressed as the sum of five fields. 2.7. Statistical analysis Comparisons between the three groups (previously-infected, primary-infected and uninfected control), between the two necropsy dates (D49 and D75) within a group, and between the two breeds for a given group were performed using Kruskal-Wallis non parametric tests (SYSTAT software). P < 0.05 was considered significant. Kinetics of egg excretions and blood eosinophil counts were compared between groups using analysis of variance with repeated values (SYSTAT software). 177 Résultats 3 – RESULTS 3.1. Parasitological values 3.1.1. Fecal egg excretion No fecal egg excretion was recorded in lambs of groups C (uninfected controls) throughout the experimental period. This was confirmed later by the absence of worms in the abomasum. During the initial infection, fecal egg excretion started on D19 in INRA 401 (group A) lambs while it was delayed for about 4 days (D23) in BBB (group A) lambs (Figure 1A). Furthermore, fecal egg counts (FEC) in the BBB breed were significantly lower than that of INRA 401 (P < 0.001). During the challenge infection, i.e. the second phase of the experiment, the first fecal egg excretion was observed on D64 for INRA 401 lambs and on D66 for BBB lambs (Figure 1B) i.e. respectively 19 and 21 days post secondary infection. The difference between previously-infected and primary-infected groups within a breed was not significant. Similar to that observed during the initial infection of group A, FEC were lower in the BBB group B lambs than in INRA 401 group B lambs (P = 0.005). Nevertheless, FEC were not different between BBB and INRA 401 groups A. 3.1.2. Worm burden, size and fecundity of adult females On D49 (4 days post challenge), only L4 stages of the parasite were found in the abomasum of the two breeds of lambs. Both groups (A and B) of BBB lambs exhibited significantly lower worm counts than their INRA 401 counterparts (P < 0.05), while there was no group difference within breeds (Table 3). On D75 (30 days post challenge), there was no significant difference for worm burdens between previously-infected and primary-infected INRA 401 lambs. Surprisingly, higher worm burden was registered (P < 0.05) in previously infected BBB lambs compared to the primary-infected group. Moreover, only primary-infected BBB lambs had fewer worms than INRA 401 (P < 0.05). Thirty days after challenge (D75), worms at any developmental stages 178 Résultats (L4 to adults) were present in all groups of lambs. Higher percentages of L4 and immature stages were observed in INRA 401 group A (P = 0.011) and BBB group B (P < 0.05) suggesting a delayed worm development (Table 3). Female worms harbored by previouslyinfected INRA 401 lambs were significantly shorter and contained fewer eggs in utero than those in INRA 401 primary-infected lambs (P < 0.05). This difference was not noticed between the two BBB groups. While they were statistically lower than those in INRA 401 group B lambs (P < 0.01), numbers of eggs in utero for worms in the BBB groups were comparable to those of the previously-infected INRA 401 lambs (Table 3). A similar pattern of statistical difference to eggs in utero was noted for female worm size except that worms in BBB group B lambs were also found shorter than those in INRA 401 group A lambs. 3.1.3. Development of H. contortus eggs in infective larvae. The proportions of H. contortus eggs developing into third stage larvae after 10 days of culture ranged from 24.5 to 44.4% but were not different between breeds and groups. 3.2. Patterns of cytokine gene expression 3.2.1. Cytokines in the total abomasal lymph node and isolated CD4+ cells Expression patterns or transcription intensities were similar between the cDNA samples stemming from the total abomasal lymph node and those stemming from CD4+ cells isolated from this lymph node, suggesting that mRNA expression at the level of this cell type reflects correctly the mRNA transcription of the whole lymph node (data not shown). Then, only values obtained in the total abomasal lymph node are given. 3.2.2. Cytokine mRNA transcription in abomasal lymph node and abomasal fundic mucosa For both breeds, H. contortus infections were followed by a significant increase in Th2 cytokine (IL-4, IL-5 and IL-13) gene expressions (Figure 3). This over-expression was 179 Résultats present as early as 4 days post-challenge in the previously-infected groups (groups A). In contrast, higher mRNA gene expression was only observed at 30 dpc in the primary-infected groups (groups B) and reached similar or higher levels compared to those of groups A. Thirty days post challenge, the IL-4, IL-5 and IL-13 mRNA transcription levels were significantly higher in the abomasal lymph nodes of infected BBB lambs than in infected INRA 401 lambs (P < 0.05). At least for IL-5, this breed difference was associated to a sharp drop in the level of cytokine transcription in both INRA 401 groups compared to its level at 4 dpc. In contrast, no breed differences were encountered for these cytokines in the abomasal fundic mucosa. Similarly, no significant group or breed differences were noticed in IFN-γ, IL-12, IL-10, TNF-α and Eotaxin mRNA transcription profiles both at 4 and 30 dpc. 3.3. Effector cells recruitment in blood and abomasal tissues 3.3.1. Kinetics of blood eosinophilia during infections In the control groups, blood eosinophil counts remained low and stable during the whole experiment (Figure 2). Nevertheless, these counts for control animals were higher in BBB lambs when compared to those of INRA 401 lambs (P < 0.001) throughout the experimental period. Each experimental infection was followed one week later by an increase in blood eosinophil counts. Peak values were attained two to three weeks after infection. In spite of the strong individual variability observed in infected groups, blood eosinophilia was higher in BBB than in INRA 401 lambs in initial as well as in challenge infections (P < 0.01). After anthelminthic treatment, eosinophil counts returned to pre-infection levels in INRA 401 lambs but remained higher than control values in BBB lambs. Moreover, the challenge infection in BBB was followed by further increase in blood eosinophils counts (P = 0.04) compared to the initial infection, which later declined but remained still higher than the control values. In contrast, no difference was observed between the two successive infections 180 Résultats in INRA 401 lambs and blood eosinophilia returned to the level of control values at the end of the experiment. 3.3.2. Cellular recruitment in the abomasal mucosa Numbers of mast cells, globule leucocytes and eosinophils in the abomasal mucosa were very low in uninfected control animals (Figure 4). At 4 dpc, higher numbers of these cell types were already present in the abomasal mucosa of previously-infected lambs (Groups A) when compared to controls while in primary-infected lambs (groups B), the increase in cellular infiltrations was only evident at 30 dpc in both breeds. Following the first exposure to H. contortus, no difference in the cellular recruitment was noticed between the two breeds at both 4 and 30 dpc except for mast cells where higher counts were noticed in INRA 401 lambs than in BBB lambs (Figure 4A). During the second exposure (groups A), higher numbers of mast cells were counted in BBB lambs at 4 dpc compared to INRA 401 lambs (P < 0.05) whereas values for globule leucocytes and eosinophils did not differ between breeds both at 4 and 30 dpc (Figure 4A, 4B and 4C). Cell counts were comparable between breeds and between groups including control animals for CD3+-T cells, BLA36+-B cells, CD68+monocyte/macrophage cells and CD4+/CD8+ ratio (data not shown). 181 Résultats 4 – DISCUSSION The resistance of Barbados Blackbelly sheep to H. contortus infections has been successfully demonstrated in previous studies (Yazwinsky et al., 1980; Courtney et al., 1985a, b; Notter et al., 2003). In our study, the resistance status of BBB lambs to Haemonchus contortus was compared with INRA 401 breed. In the primary-infected BBB animals, the lower number of worms in the abomasum, the reduced female worm size and number of eggs in utero registered after autopsy strongly justify the drastic reduction in FEC compared to that in INRA 401 group B. Complementary to this, is the retarded worm development as reflected by the number of immature worms and the longer prepatent period in the tropical breed. The lower FEC and worm establishment rate in the primary-infected BBB lambs compared to corresponding INRA 401 group agrees with the reports of Aumont et al. (2003). After the secondary infection, reductions in worm development and female fecundity observed in INRA 401 lambs confirm our previous observations (Lacroux et al., 2006). Contrary to that observed in INRA 401, the regulation of Haemonchus contortus infection was not improved in challenged BBB lambs. This may suggest that the mechanisms governing resistance to this parasite was efficient enough in the first exposure and was not enhanced during a secondary infection. In a similar vein, Bahirathan et al., (1996) demonstrated that the Gulf Coast Native suckling lambs developed resistance to H. contortus infection at first exposure. Moreover, Amarante et al. (1999) observed that Florida Native lambs had lower FEC compared to the Rambouillet breeds during first exposure to natural infection while there was no difference between the two breeds of lambs after the second natural infection. This is in contrast to the findings of Gauly et al. (2002) for Rhön and Merinoland lambs, Aumont et al. (2003) for Blackbelly and INRA 401 lambs and Gamble and Zajac (1992) for St. Croix and Dorset lambs, where animals infected for the second time have demonstrated better resistance and breed differences than the primary-infected animals. While there are differences in the 182 Résultats experimental protocols, age and breed of experimental animals that could potentially cause variations in the outcomes of different experiments, the origin for the discrepancy in different works mentioned above is not clear. The second objective of our study was to compare the adaptive immune responses in BBB and INRA 401 lambs. CD4+ T helper cells are involved in the genetic control of sheep immunity to H. contortus (Gill et al., 1993). Therefore, we hypothesized that the higher resistance of BBB lambs could arise from a quicker and/or more intense Th2 polarization and mobilization of Th2 effector cells. Following both initial and secondary infections, a clear Th2-type immune response characterized by cytokine gene expressions and effector cell mobilisation was demonstrated in the two breeds and this was consistent with previous data for the INRA 401 genotype (Lacroux et al., 2006). mRNA cytokine transcriptions for IL-4, IL-5 and IL-13 were moderately higher at 30 dpc in primary infected and previously-infected BBB lambs than in their INRA 401 counterparts. As to our knowledge, this is the first work comparing the cytokine gene expression in resistant and susceptible sheep breeds to H. contortus infections. Similar works were already reported for Trichostrongylus colubriformis resistant and susceptible Romney sheep lines (Pernthaner et al., 2005) in which animals of the resistant category were found to develop stronger Th2-polarised cytokine (IL-5 and IL-13 but not IL-4) gene expressions than the susceptible lines. Recently, Moreno et al. (2006) have detected a QTL for resistance to H. contortus on ovine chromosome 5 in the INRA 401 x Barbados Blackbelly backcross lines. The proximal most likely location of this QTL corresponded to the IL-3/IL-4/IL-5 region. In this study, IL-5 gene over-expression was apparent following H. contortus exposure and its level remained high in the Blackbelly sheep till 30 dpc, while it was down regulated to very low values in INRA 401 lambs. In line with the persistent IL-5 cytokine gene expression pattern, a higher and long lasting blood eosinophilia was observed in BBB compared to INRA 401 lambs. Negative correlations were 183 Résultats demonstrated between circulating eosinophil number and in utero egg counts in the BBB group A (r = -0.856), FEC in BBB group B (r =-0.836) and female worm length in INRA 401 group A (r = -0.971) suggesting the possible role of these cells in the control of various aspects of parasite development. Aumont et al. (2003) has also reported higher blood eosinophil levels in the Blackbelly breed than in the INRA 401 lambs. On the other hand, such differences in peripheral blood eosinophilia between resistant and susceptible breeds were not observed in other works (Bahirathan et al., 1996; Rocha et al., 2004). In the present study, the recruitment of effector cells into the abomasal mucosa was measured at 4 and 30 dpc. The absence of significant breed differences in eosinophil counts in the abomasal mucosa at both periods of examination does not conform to the persistent blood eosinophilia, and reduced parasitological values observed in the Blackbelly group B. Eosinophils are likely involved in protection against some tissue-dwelling nematodes (Klion and Nutman, 2004), and they specifically congregate around invading larvae (Balic et al., 2002). Negative correlations were previously reported between abomasal eosinophil counts and adult female length, number of eggs in utero and faecal egg output (Lacroux et al., 2006). Huge differences in abomasal globule leucocytes counts between St Croix and Dorset lambs (Gamble and Zajac, 1992) and in abomasal eosinophil and globule leucocytes counts between Corriedale and Crioula Lanada sheep (Bricarello et al., 2004) have been observed. In contrast to these findings, similar mean values of these inflammatory cells were found in Santa Ines, Suffolk and Ile de France breeds of sheep (Amarante et al., 2005) as in our study. Whereas challenge infection resulted in a more pronounced cellular recruitment (mast cells, globule leucocytes and eosinophils) than during the primary infection in both breeds, there was no further corresponding reduction in parasitological values for the BBB sheep while INRA 401 (group A) sheep were able to reduce worm development and fecundity in 184 Résultats terms of female size, egg in utero and higher number of immature worms when compared to primary infection. In general, the BBB lambs proved their strong resistance to H. contortus but the regulation of parasite populations seems to occur very quickly and the involvement of a strong innate immune response could not be excluded (Tosi, 2005). Both breeds of animals have demonstrated a clear Th2 type immune response characterized by an increase in Th2polarized cytokine gene expressions and corresponding recruitment of effector cells. Th2 cytokine expression in the resistant breed appeared persistent while it was generally downregulated through time in the susceptible breed. This could be due to down-regulatory cytokines released by CD4+CD25+ T regulatory cells that switch off inflammatory and protective immune responses such as IL-5 dependent blood eosinophilia (Maizels et al., 2004). Irrespective of the difference in blood eosinophil levels, the recruitment of effector cells especially eosinophils remained similar between breeds. Nevertheless, further experiments, including cell counts at other time points such as in the middle of the experimental period (10 to 20 dpc), and in vitro tests to assess the parasite killing potential of these cells on infective larvae, are necessary to complete these findings. 185 Résultats REFERENCES Amarante, A.F.T., Craig, T.M., Ramsey, W.S., El-Sayed, N.M., Desouki, A.Y., Bazer, F.W., 1999. 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Cytokine Forward sequence Reverse sequence Tm amplicon (°C) Ovine Beta-actin ACCAGTTCGCCATGGATGAT AGCCGTTGTCAACCACGAG 78 Ovine IFN-γ ATCTCTTTCGAGGCCGGAGA ATTGCAGGCAGGAGAACCAT 77 Ovine IL-4 GGAGCTGCCTGTAGCAGACG TTCTCAGTTGCGTTCTTTGGG 79 Ovine IL-10 CTGAGAACCATGGGCCTGAC TCTCCCCCAGCGAGTTCAC 80 Ovine TNF-α α CCCGTCTGGACTTGGATCCT TGCTTTTGGTGCTCATGGTG 75 Ovine IL-12p40 GAATTCTCGGCAGGTGGAAG GTGCTCCACGTGTCAGGGTA 80 Ovine IL-13 AGAACCAGAAGGTGCCGCT GGTTGAGGCTCCACACCATG 80 Ovine Eotaxin ACAAGAAAATCTGTGTTGATCCCC CCATGGCATTCTGGACCC 75 Ovine IL-5 CTGCTGATAGGTGATGGGAACTT GGTGATTTGTATGCTGAGGAGTAGG 74 Ovine IL-3 AAGAATATCCTGGCGAATAAGAGC GAACGCTTTCAGGTTTGCCT 75 190 Résultats Table 3 : Total worm burden, length and number of eggs in utero of adult female worms, stage and sex composition of Haemonchus contortus populations. Days post challenge Breed Group Total worm burden (mean +/SD) Adult female length (mean +/- SD) Number of eggs in utero (mm) (mean +/- SD) L4 (%) Immature males (%) Immature females (%) Adult males (%) Adult females (%) A 1650 ± 467a - - 100 - - - - B 1892 ± 535a - - 100 - - - - A 695 ± 458b - - 100 - - - - B 1205 ± 246b - - 100 - - - - A 4370 ± 902a 16.8 ± 1.2a 334 ± 201a 15 6 7 34 38 B 5558 ± 1763a 19.8 ± 1.4b 713 ± 129b 6 2 4 41 47 A 4274 ± 1980b 14.8 ± 1.9a 234 ± 120a 8 4 5 40 43 B 2465 ± 1623a 14.6 ± 1.2a 180 ± 70a 10 12 13 35 30 INRA 401 4 dpc (D49) BBB INRA 401 30 dpc (D75) BBB a b , : At a given date, means with different letters on the same column are significantly different (P < 0.05). 191 Résultats Captions of figures : Figure 1: Faecal egg excretions: (A) during the initial infection in BBB and INRA 401 groups A, and (B) following primary infection (groups B) and challenge infection (groups A) of the two breeds. Each infected animal was orally drenched with 10.000 L3 of H. contortus. Figure 2: Mean blood eosinophilia in BBB lambs (A) and INRA 401 lambs (B) during the initial and challenge infections in groups A, and following primary infection in groups B of the two breeds. Eosinophilia in control groups was also evaluated during the period of the challenge infection. Figure 3: Cytokine mRNA transcriptions for IL-4, IL-5 and IL-13 in the abomasal fundic mucosa (AFM: A, C, E) and total abomasal lymph node (ALN: B, D, F) in all infected and control groups at 4 and 30 dpc. Assays were performed in duplicate samples using an external standard and results were expressed after normalisation (ratio) with a housekeeping gene (ovine beta-actin). Asterisks indicate significant statistical differences between the two breeds (P<0.05) Figure 4: Cellular recruitment in the abomasal fundic mucosa: mast cells (A), globule leucocytes (B) and eosinophils (C) in infected and control animals. Cell counts were performed on five randomly selected microscopic fields (X400) and the results were expressed as the sum of the five fields. Asterisks indicate significant statistical differences between the two breeds (P<0.05) 192 Résultats 30000 A 25000 Epg 20000 15000 10000 5000 0 D0 D16 D19 D21 D23 D26 D28 D30 Initial infection INRA Group A INRA Group B 30000 B BBB Group A 25000 BBB Group B Epg 20000 15000 10000 5000 0 D45 D61 D64 D66 D68 D71 D73 D75 Challenge infection Figure 1 193 Résultats Number of eosinophils per ml of whole blood BBB Group A 500x103 BBB Group B A Anthelmintic treatment BBB Group C 400x103 300x103 200x103 100x103 0 D0 D5 D9 D16 D23 Number of eosinophils per ml of whole blood Initial infection 500x103 D43 D47 D52 D59 D66 D73 D75 Challenge infection INRA Group A B INRA Group B 400x103 INRA Group C 300x103 Anthelmintic treatment 200x103 100x103 0 D0 D5 D9 Initial infection Figure 2 D30 D16 D23 D30 D43 D47 D52 D59 D66 D73 D75 Challenge infection 194 Résultats 195 Résultats 196 Discussion générale CHAPITRE VI : DISCUSSION GENERALE 197 Discussion générale 1. REGULATION DES POPULATIONS DE NEMATODES CHEZ L’HOTE 1.1. Variations selon le parasite au sein de la race INRA 401 L’objectif principal de nos travaux était d’étudier les mécanismes de régulation des populations de strongles gastro-intestinaux en comparant des ovins exposés pour la première fois au parasite et des ovins soumis à deux infestations successives séparées par un traitement anti-parasitaire. Pour cela, la population parasitaire présente chez l’hôte a été évaluée par le nombre total de vers et donc l’installation larvaire, le développement des vers chez l’hôte, la fécondité des femelles et, in fine, l’intensité de l’excrétion fécale d’œufs. Au cours de nos deux premières expérimentations, nous avons pu caractériser cette régulation dans la race INRA 401 pour deux modèles de parasites : H. contortus et T. colubriformis. Dans ces deux études, aucune différence d’installation larvaire n’a pu être mise en évidence entre les animaux préalablement immunisés et les animaux naïfs, ce qui suggère que, chez les jeunes ovins, la réponse immunitaire ne permet pas de contrôler l’intensité de l’infestation. Certains auteurs estiment en effet que les jeunes ovins ne sont pas capables, de façon constitutive, de réguler le nombre total de parasites qu’ils hébergent (Dineen et al., 1978 ; Schallig, 2000). En revanche, dans le modèle H. contortus, le développement du parasite chez l’hôte était clairement ralenti, avec une plus forte proportion de parasites immatures et la présence de femelles plus courtes et moins prolifiques chez les agneaux préalablement immunisés. Ce retard de développement a déjà été constaté chez des agneaux infestés par H. contortus (Schallig et al., 1995) ou T. circumcincta (Stear et al., 1995a). Ainsi, dès la seconde exposition au parasite, des agneaux de race INRA 401 sont capables d’influer sur divers traits de vie des parasites en ralentissant leur développement et en diminuant la fécondité des femelles adultes. Cette régulation se traduit notamment par un allongement de la période prépatente et surtout par une nette diminution de l’excrétion fécale d’œufs, avec toutes les conséquences bénéfiques que cela peut avoir sur la contamination ultérieure des pâturages et des autres animaux. Les mécanismes de régulation de la population parasitaire semblent être toutefois différents chez des ovins INRA 401 infestés par T. colubriformis. En effet, dans ce modèle les intensités d’infestation observées entre des ovins préalablement exposés et des ovins naïfs étaient identiques, tout comme le développement des vers chez l’hôte. Aucun retard de développement, analogue à celui constaté avec les infestations par H. contortus n’a été noté. La régulation des populations de ce parasite est toutefois réelle puisque, là encore, nous avons mis en évidence un allongement de la période pré-patente ainsi qu’une réduction de 198 Discussion générale l’excrétion fécale d’œufs lors de la deuxième infestation. Ceci suggère une réduction de la taille et une diminution de la fécondité des femelles de T. colubriformis, comme ce que nous avions démontré avec H. contortus. Dans ce modèle, des infestations répétées ou plus massives semblent être nécessaires pour obtenir un effet marqué sur les divers traits de vie des parasites. 1.2. Variations selon la race pour un même parasite : Haemonchus contortus Les mécanismes de régulation des populations parasitaires entre races ovines ont pu être appréhendés lors de notre dernière expérimentation d’infestations d’ovins sensibles (INRA 401) et résistants (Barbados Black Belly). Malheureusement, nous n’avons pu comparer la régulation de T. colubriformis entre ces deux races, faute de temps et de disponibilité d’animaux de race pure Barbados Black Belly. Toutefois, les données obtenues avec le modèle H. contortus nous ont permis de confirmer la résistance des ovins de race Barbados Black Belly aux nématodes gastro-intestinaux, comme l’avaient déjà constaté d’autres auteurs (Yazwinski et al., 1979 ; Yazwinski et al., 1980 ; Romjali et al., 1996 ; Aumont et al., 2003 ; Gruner et al., 2003 ; Vanimisetti et al., 2004). Toutes ces études s’accordent pour montrer que l’excrétion fécale dans cette race est nettement inférieure à celle que l’on peut constater chez des individus de race sensible, comme les INRA 401. Cette diminution d’excrétion fécale peut trouver son origine dans divers mécanismes non exclusifs affectant les traits de vie suivants du parasite : - moindre installation des larves infestantes et donc charge parasitaire réduite chez les animaux résistants, - retard du développement des vers avec présence de vers adultes en plus faibles proportions, - taille réduite des femelles qui contiennent moins d’oeufs dans leur tractus génital. Les traits de vie affectés lors d’infestations de Barbados Black Belly par H. contortus ne sont pas connus avec certitude car de nombreuses discordances existent entre les études disponibles. En effet, dans notre expérimentation, les ovins Barbados Black Belly exposés pour la première fois à H. contortus ont une intensité d’infestation légèrement inférieure à celle d’ovins de race INRA 401 préalablement immunisés, mais surtout des femelles beaucoup plus courtes et moins prolifiques. Une infestation ultérieure des Barbados Black Belly n’entraîne pas de résistance accrue, ce qui suggère que les mécanismes de régulation qui influent sur les traits de vie des parasites sont actifs dès la première infestation dans cette race, contrairement aux ovins d’une race sensible comme les INRA 401. En ce sens, nos résultats 199 Discussion générale sont en désaccord avec l’étude de Aumont et al. (2003) pour qui une seconde infestation se traduisait par une résistance accrue avec notamment une réduction de l’installation larvaire chez des animaux préalablement immunisés. De nouvelles infestations chez des animaux de race Barbados Black Belly, d’âges et de sexes différents, ainsi que l’analyse exhaustive des paramètres parasitologiques (nombre total de vers, cinétique du développement des vers chez l’hôte, taille et fécondité des femelles adultes, excrétion fécale) devraient à terme éclairer les mécanismes gouvernant la moindre excrétion fécale chez les individus résistants. 2. L’IMPLICATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE DANS LA REGULATION DES POPULATIONS DE NEMATODES GASTRO-INTESTINAUX La comparaison de la dynamique de la réponse immunitaire adaptative i) entre deux modèles de nématodes au sein d’une même race et ii) entre des ovins de race résistante et de race sensible infestés par H. contortus, nous a permis de mieux cerner le rôle de cette réponse dans la régulation des populations de strongles gastro-intestinaux. 2.1. Orientation de la réponse immunitaire adaptative : variations selon l’espèce de parasite considérée Nos travaux ont permis de démontrer clairement l’existence d’une réponse immunitaire adaptative de type Th2 chez des ovins infestés par H. contortus. Cette réponse a été pleinement caractérisée chez des ovins de race sensible (INRA 401) et de race résistante (Barbados Black Belly). Cette infestation s’accompagne d’une transcription relativement précoce et élevée des gènes des principales cytokines qui signent l’orientation Th2 (IL-4, IL-5 et IL-13). Elle est également associée à la mise en place d’effecteurs particuliers, avec une éosinophilie sanguine et tissulaire marquée, ainsi qu’une infiltration par des mastocytes et des globule leucocytes dans les muqueuses parasitées, et des réponses anticorps-spécifiques (IgA et IgG) à la fois locales et systémiques. Dans ce modèle, nos travaux sont donc pleinement en accord avec les données issues d’expérimentations sur modèles rongeurs (Finkelman et al., 1997) et celles d’infestations naturelles chez l’homme (Cooper et al., 2000). Ils permettent également de lever l’ambiguïté relative à l’existence ou non d’une dichotomie Th1/Th2 chez les ruminants et en particulier chez les ovins (Brown et al., 1998 ; Gill et al., 2000). Dans notre modèle d’infestation des ovins par T. colubriformis, l’orientation de la réponse immunitaire adaptative semble moins claire, bien que la mise en place des réponses 200 Discussion générale effectrices, cellulaires et humorales, semblent aller dans le sens d’une polarisation de type Th2. En effet, en dépit de l’utilisation des mêmes techniques de détection, il ne nous a pas été possible de démontrer l’existence d’une augmentation de la transcription des gènes des cytokines Th2 dans la muqueuse duodénale ou le nœud lymphatique mésentérique drainant des ovins infestés par ce parasite. L’absence de réponse Th2 apparente pourrait être la conséquence de phénomènes non exclusifs : - l’intensité de la réponse induite par ce parasite dans la muqueuse intestinale et le système lymphatique associé pourrait être trop faible pour être détectée par les techniques que nous avons mises en œuvre. En effet, la muqueuse intestinale, contrairement à la muqueuse abomasale, représente le site majeur de présentation de nombreux antigènes du non-soi (en particulier antigènes de la flore commensale, antigènes alimentaires…). Les réponses initiées dans ce site du tube digestif sont donc variées et complexes et pourraient masquer une réponse spécifique initiée par T. colubriformis. - les deux modèles de parasites que nous avons étudié diffèrent également par le degré de contact avec leur hôte, notamment au stade adulte. H. contortus est en effet un parasite qui dès le stade L4 se nourrit du sang de l’hôte. Les effractions répétées de la membrane basale abomasale par le parasite pour atteindre les vaisseaux sanguins du chorion multiplient donc ses contacts avec l’hôte et son système immunitaire. A l’inverse, la localisation intra-épithéliale des adultes de T. colubriformis (Miller, 1984), sans effraction de la membrane basale intestinale, limitent le contact de ce parasite avec les cellules immunitaires de l’hôte présentes dans le chorion. Ce contact plus limité pourrait donc être à l’origine de réponses plus faibles de la part de l’hôte et expliquer la non détection d’une réponse Th2 claire dans nos expérimentations. Les travaux récents menés sur des ovins de lignées résistantes ou sensibles infestés par T. colubriformis plaident toutefois pour une orientation de type Th2 de la réponse immunitaire dans ce modèle (expression accrue des gènes de l’IL-5 et de l’IL-13) sans toutefois de mise en évidence d’une expression augmentée du gène de IL-4, cytokine pourtant considérée comme clé de la réponse Th2 (Pernthaner et al., 2005) Le protocole expérimental utilisé dans cette étude n’est cependant pas comparable avec nos travaux : utilisation de lignées divergentes résistante et sensible au parasite, animaux plus âgés (environ 2 ans) et protocole d’immunisation non maîtrisé (animaux laissés au pâturage). Des expériences d’immunisation répétées avec T. colubriformis, ou avec des doses infestantes plus importantes, ainsi que 201 Discussion générale l’infestation d’ovins résistants comme les Barbados Black Belly avec ce parasite (expérimentation que nous n’avons pu mettre en place dans nos travaux de thèse) pourraient, éventuellement, prouver l’existence d’une réelle polarisation Th2 dans ce modèle. 2.2. Orientation de la réponse immunitaire adaptative : variations selon la race ovine considérée Même s’il est évident que les Barbados Black Belly régulent plus efficacement leurs populations parasitaires que des INRA 401, l’implication de la réponse immunitaire adaptative dans ce phénomène demeure complexe. Lors d’une infestation, une réponse non équivoque de type Th2 se met en place dans les deux races, avec une transcription des gènes des principales cytokines impliquées dans cette polarisation. Toutefois, si l’intensité de cette réponse cytokinique semble identique entre les deux races, la persistance accrue de l’expression de ces gènes dans la race Barbados Black Belly pourrait être à l’origine d’une meilleure efficacité de polarisation et donc de recrutement des effecteurs ayant un rôle dans la régulation des populations parasitaires. Nous ne pouvons pas comparer nos travaux aux données de la littérature puisqu’aucune étude ne s’est intéressée, à notre connaissance, à la réponse cytokinique chez des races ovines considérées comme résistantes. 2.3. Rôle des mécanismes effecteurs dans la protection contre les nématodes gastrointestinaux La cinétique des mécanismes effecteurs (réponses cellulaires locales et réponses humorales, locales et systémiques) a pu être analysée au cours de nos deux premières expérimentations sur des ovins de race INRA 401, infestés soit par H. contortus, soit par T. colubriformis, mais également chez des ovins résistants Barbados Black Belly infestés par H. contortus. Malgré l’absence d’orientation claire de la réponse immunitaire adaptative dans le modèle T. colubriformis, les mécanismes effecteurs mis en jeu lors d’infestations par les deux parasites que nous avons étudiés sont comparables et identiques à ceux classiquement décrits dans les modèles rongeurs (Finkelman et al., 1997 ; Else et Finkelman, 1998). Nous observons en effet un recrutement de mastocytes, polynucléaires éosinophiles et globule leucocytes dans les muqueuses parasitées, qui s’accompagne d’une production accrue d’anticorps spécifiques de classe IgA et IgG dans ces muqueuses et dans le sang circulant. La cinétique de ces mécanismes effecteurs demeure toutefois différente entre des ovins préalablement exposés au parasite et des ovins le rencontrant pour la première fois. En effet, 202 Discussion générale chez des ovins naïfs, les réponses cellulaires et humorales se mettent en place progressivement au cours de l’infestation par H. contortus. Chez des ovins préalablement immunisés par cette espèce, ces réponses sont généralement présentes dès le premier point d’étude (dans notre cas, 3 ou 4 jours après le challenge), plus intenses que chez les ovins naïfs et se maintiennent à un niveau élevé tout au long de l’infestation. Toutefois, le dispositif expérimental ne nous a pas permis de statuer entre i) une re-mobilisation rapide des effecteurs cellulaires et humoraux lors d’une seconde infestation et ii) une persistance de ces effecteurs entre les deux infestations successives malgré un traitement anthelminthique entre les deux. Lors d’infestation par T. colubriformis, les mécanismes effecteurs ne se mettent en place réellement que lors de la seconde infestation. Dans nos trois expérimentations, des corrélations négatives ont été observées entre l’infiltration cellulaire locale (mastocytes, éosinophiles et globule leucocytes) et la longueur des femelles adultes et le nombre d’œufs qu’elles hébergeaient dans leur tractus génital. De plus, des corrélations positives entre ces mêmes types cellulaires et la proportion de vers immatures chez l’hôte ont été constatées. Ces données suggèrent que ces effecteurs cellulaires pourraient jouer un rôle dans le retard de développement parasitaire chez l’hôte et la réduction de l’excrétion fécale (Douch et al., 1996a ; Bricarello et al., 2004). Les polynucléaires éosinophiles, comme les mastocytes / globule leucocytes sont considérés comme des éléments importants de la réponse contre les infestations helminthiques et sont fréquemment associés à l’expression de la résistance contre les strongles (Dawkins et al., 1989 ; Pfeffer et al., 1996 ; Balic et al., 2000). Les polynucléaires éosinophiles sont même parfois considérés comme les principales cellules effectrices de l’immunité protectrice contre les helminthes (Butterworth et al., 1975) car elles peuvent tuer des larves d’helminthes in vitro en libérant des protéines toxiques après dégranulation (Capron et al., 1984 ; Rainbird et al., 1998). Les réponses anticorps locales et systémiques sont également positivement associées à la proportion de vers immatures et négativement associées à la longueur des femelles adultes et au nombre d’œufs contenus dans leur tractus génital. Ceci suggère que ces réponses pourraient interférer avec le développement du parasite chez l’hôte. Toutefois, les mécanismes par lesquels les IgG et les IgA influenceraient le développement et la fécondité des parasites ne sont pas clairs : effet direct par neutralisation ou inactivation d’enzymes métaboliques vitales du parasite (Gill et al., 1993), interférence avec la capacité du parasite à se nourrir (Smith, 1988), participation aux réactions d’hypersensibilité associées aux mastocytes ou aux polynucléaires éosinophiles (Meeusen et Balic, 2000 ; Klion et Nutman, 203 Discussion générale 2004) ? La réponse IgE n’a pas été envisagée dans nos travaux mais semble également importante lors d’infestations par H. contortus, T. colubriformis (Kooyman et al., 1997) et T. circumcincta (Huntley et al., 1998). Leur rôle dans l’expulsion rapide des adultes de T. spiralis chez la souris est également bien connu (Else et Finkelman, 1998). L’étude de la cinétique et de l’intensité des réponses IgE spécifiques dans nos modèles, ainsi que dans des races ovines résistantes, serait nécessaire pour complèter l’étude globale des réponses anticorps lors d’infestations par les nématodes gastro-intestinaux. Dans ce domaine, nos travaux permettent de décrire une cinétique claire de mise en place des mécanismes effecteurs (cellules et réponses anticorps-spécifiques) et d’établir des corrélations avec les paramètres parasitologiques, mais ne démontrent pas avec certitude le rôle de ces effecteurs sur la population parasitaire. L’exploration in vitro des effets des polynucléaires éosinophiles sur la mobilité et le pouvoir infestant des larves L3, devrait permettre prochainement de mieux comprendre le rôle de ces cellules sur les parasites. D’ores et déjà, il semble que des larves infestantes d’H. contortus mises au contact pendant 24 heures avec des fractions cellulaires enrichies en polynucléaires éosinophiles aient un taux d’installation nettement inférieur à celui des larves infestantes n’ayant pas subi ce contact. De plus, une autre étude menée avec des ovins Barbados Black Belly traités quotidiennement avec du cromoglycate de sodium (famille des cromones), nous a permis de montrer que l’administration de ces molécules levait de façon partielle la résistance de ces ovins. Le cromoglycate de sodium est un stéroïde anti-allergique utilisé pour la prophylaxie de l’asthme et des désordres inflammatoires gastro-intestinaux en médecine humaine. Son utilisation permet de réduire la dégranulation mastocytaire, la libération précoce d’IL-5 dans le sang et donc la mobilisation ultérieure des polynucléaires éosinophiles. Les résultats de cette étude confortent donc le rôle des cellules mastocytaires, et probablement des polynucléaires éosinophiles, dans la protection contre les nématodes gastro-intestinaux. Dans notre expérimentation de comparaison inter-raciale, nous avons mesuré la transcription des gènes des principales cytokines impliquées dans les deux grandes voies Th1/Th2 et la dynamique et l’intensité du recrutement cellulaire dans la muqueuse abomasale à deux dates seulement : J4 et J30. Ces mesures n’ont pas permis d’impliquer de façon certaine la réponse immunitaire adaptative dans les différences parasitologiques majeures entre les deux races. De nouvelles expérimentations comparant la réponse immunitaire adaptative entre race sensible et race résistante sont nécessaires. L’addition d’un point de cinétique intermédiaire 204 Discussion générale entre J4 et J30 (en particulier à J15, lors du pic d’éosinophilie sanguine) permettrait de vérifier si un événement majeur surivent à ce moment de l’infestation. De même, le premier point d’étude à 4 jours post-challenge est peut-être trop tardif pour mettre en évidence des manifestations précoces de la réponse immunitaire. 3. PERSPECTIVES DANS LA COMPREHENSION DE LA RESISTANCE Dans notre hypothèse initiale, l’intensité et la dynamique de la réponse immunitaire adaptative étaient impliquées dans la différence de résistance observée entre les races Barbados Black Belly et INRA 401. Or, dans notre dernière expérimentation, nous n’avons pas mis en évidence de différences majeures dans les deux races étudiées. Dans un premier lieu, il conviendrait de répéter ces expérimentations afin de confirmer nos premiers résultats. La confirmation de ceux-ci permettrait alors d’envisager d’autres pistes pour la poursuite de nos travaux dans la compréhension des mécanismes de résistance. Plusieurs points non explorés ou en cours d’exploration mériteraient une attention particulière : - le rôle de la réponse immunitaire innée, - les mécanismes de régulation différentielle de la réponse immunitaire adaptative, - et enfin, les différences d’expression géniques au moyen de techniques de DNA micro-array ou de détection de régions du génome en relation avec la résistance (QTL) pourraient nous orienter vers de nouveaux mécanismes de résistance. 3.1. Le rôle de la réponse immunitaire innée Dans notre étude, les ovins Barbados Black Belly sont résistants à H. contortus dès la première exposition à ce parasite. En effet, une immunisation préalable de ces animaux n’entraîne pas de résistance accrue par comparaison avec des ovins naïfs, à l’inverse de ce que nous avons pu observer dans la race INRA 401. Ainsi, le rôle de la réponse immunitaire innée dans l’explication du phénomène de résistance n’est pas à écarter (Tosi, 2005). Plusieurs aspects pourraient avoir leur importance dans une résistance innée : - le rôle de la réponse inflammatoire précoce (24-48 heures) lors d’une infestation et en particulier le rôle des cellules phagocytaires (macrophages, et à un degré moindre polynucléaires neutrophiles). Ces cellules représentent des effecteurs essentiels de l’immunité innée (Basset et al., 2003). Les macrophages possèdent des PRR qui leur permettent de reconnaître spécifiquement certains micro205 Discussion générale organismes et de déclencher toute une cascade de mécanismes oxydatifs et nonoxydatifs. De plus, les cytokines qu’ils sécrétent (IL-1β, TNF-α, IL-8…) pourraient orienter très précocèment la réponse immunitaire et donc permettre la mise en place rapide de mécanismes effecteurs dirigés contre les larves infestantes (Basset et al., 2003). - l’épithélium gastro-intestinal constitue la première ligne de défense de l’hôte (Basset et al., 2003). Les mucines, sécrétées à sa surface par les cellules caliciformes, sont variables à la fois dans leur quantité mais aussi dans leur nature. Chez le cobaye, des différences quantitatives et qualitatives des mucines de l’intestin ont été montrées entre lignées résistantes et sensibles à une infestation par T. colubriformis. La proportion de mucines sulphonées augmente plus précocément et plus intensément chez des cobayes de lignées résistantes dès la première exposition au parasite (Manjili et al., 1998). Ainsi, la composition chimique et la quantité de ces mucines pourraient être physiologiquement différentes entre les races ovines. - l’environnement gastro-intestinal (pH, motricité musculaire lisse…) pourrait également être impliqué dans la protection contre l’installation des larves infestantes. Chez la souris, une association positive a été démontrée entre l’intensité de la contraction des muscles lisses intestinaux et la capacité de l’hôte à expulser les parasites : des souris NIH Swiss, expulsant très rapidement des T. spiralis adultes, ont un très fort degré de contraction musculaire, alors que des souris B10.BR ont une contraction moindre et expulsent moins rapidement les parasites (Vallance et al., 1997). Là encore, des variations physiologiques interraces chez les ovins pourraient être impliquées dans les mécanismes innés de résistance. 3.2. Régulation de la réponse immunitaire adaptative La régulation de la réponse immunitaire adaptative est un concept relativement récent et son implication dans le contrôle de la réponse immunitaire mise en jeu lors d’infestations parasitaires commence à être étudié dans des modèles rongeurs (Maizels et al., 2004). Le rôle des lymphocytes T régulateurs (CD4+CD25+) en particulier semble intéressant. Ces lymphocytes sécrètent des cytokines anti-inflammatoires telles que l’IL-10 et le TGF-β, qui ont la particularité de diminuer les réponses Th1 et Th2 (Akdis et al., 2005 ; Chatila, 2005). Leur induction lors d’infestations par des nématodes gastro-intestinaux est supposée chez la 206 Discussion générale souris infestée par H. polygyrus (Maizels et al., 2004). Les effets de cette population lymphocytaire sur les mécanismes effecteurs de la réponse immunitaire adaptative pourraient expliquer l’atténuation des réponses observées chez les ovins parasités et la survie prolongée des strongles. Dans nos travaux, nous avons effectivement constaté une diminution, généralement à 30 jours post-infestation, de l’expression des gènes des cytokines Th2 chez les ovins INRA 401, alors que cette expression semblait plus persistante chez des Barbados Black Belly. Dans cette dernière race, l’induction des lymphocytes T régulateurs pourrait être moins intense ou moins précoce et i) expliquer une meilleure persistance du recrutement des cellules effectrices et favoriser leur action anti-parasitaire et ii) in fine jouer un rôle majeur dans la régulation des populations parasitaires. L’exploration de cette population particulière de T lymphocytes entre races ovines pourrait se faire notamment par techniques de cytométrie de flux sur des fractions lymphocytaires, isolées soit du sang total, soit des noeuds lymphatiques. L’analyse couplée de l’expression du marqueur CD25+ au sein de la population de lymphocytes CD4+ apporterait de premiers renseignements sur leur présence et leur nombre entre races ovines. 3.3. L’exploration de la résistance : aspects génétiques et identification de gènes candidats Les différences de résistance aux strongles gastro-intestinaux entre races ovines trouvent vraisembablement leur origine dans des variations d’ordre génétique. Ainsi, l’exploration du génome de ces ovins constitue une nouvelle piste de recherche dans la compréhension des phénomènes de résistance. Au cours de la dernière décennie, de nombreux travaux ont mis en évidence, soit par études d’associations (Coltman et al., 2001 ; Paterson et al., 2001 ; Benavides et al., 2002) soit par détection de QTL (Beh et al., 2002 ; Davies et al., 2006), l’existence de gènes impliqués dans la résistance aux parasites internes chez les ovins. La plupart des scans génomiques, complets ou partiels, révèlent l’existence de QTL sur les chromosomes 1, 3, 6, 19 et 20 pour l’intensité de l’excrétion d’oeufs lors d’infestations par T. colubriformis ou H. contortus. Les associations entre ces QTL et des marqueurs ou gènes sont souvent fréquentes pour la région de l’IFN-γ (Coltman et al., 2001) ou le CMH (Schwaiger et al., 1995 ; Stear et al., 1996 ; Charon et al., 2000), ce qui conforte les hypothèses de l’implication de la réponse immunitaire dans les mécanismes de résistance aux strongles gastro-intestinaux. Une étude très récente de recherche de QTL sur 1046 ovins backcross Barbados Black Belly x INRA 401 infestés par H. contortus, a mis en évidence un QTL sur le chromosome 5, dans la région des gènes de l’IL-3, IL-4 et IL-5 (Moreno et al., 2006), qui pourraient être des gènes candidats 207 Discussion générale d’importance majeure, ainsi que l’avaient suspecté Benavides et al. (2002) par des études d’associations. La technologie des DNA micro-arrays est également devenue un outil majeur pour répondre à des questions biologiques complexes grâce à l’analyse de l’expression de milliers de gènes (Diez-Tascon et al., 2005). Les premiers résultats obtenus avec cette technique montrent une expression différentielle de certains gènes entre des ovins de race résistante et de race sensible lors de parasitisme gastro-intestinal. Diez-Tascon et al. (2005) démontrent notamment une expression différente de gènes impliqués dans le développement de la réponse immunitaire adaptative (CMH) et la structure de la musculature lisse intestinale. Ces résultats confortent d’une part l’implication probable de la réponse immunitaire dans la résistance aux nématodes gastro-intestinaux, mais également la possible implication de mécanismes physiologiques différents entre races, comme l’effet des contractions musculaires lisses de l’intestin. Toutefois, les DNA micro-arrays disponibles à l’heure actuelle sont développés dans l’espèce bovine, pour laquelle le génome complet a été décrypté. La mise au point future de DNA micro-arrays spécifiques ainsi que le séquençage complet du génome ovin seront évidemment indispensables pour des études plus poussées dans cette espèce. Ces techniques relativement récentes de recherche de QTL ou de gènes candidats impliqués dans la résistance aux nématodes gastro-intestinaux n’en sont qu’à leurs débuts et la poursuite des investigations entre races sensibles et résistantes par ces nouvelles technologies pourrait, dans un avenir proche, permettre de mieux comprendre les bases de la résistance de certaines races ovines lors de parasitisme gastro-intestinal. 4. CONCLUSION Nos travaux de thèse ont permis de mieux caractériser la dynamique et l’orientation de la réponse immunitaire adaptative des ovins lors d’infestations par deux espèces de nématodes gastro-intestinaux, H. contortus et T. colubriformis. Sans apporter d’explication mécanistique du contrôle des populations de strongles, ils nous ont permis de conforter le rôle probable de certains types cellulaires (mastocytes et polynucléaires éosinophiles notamment) ainsi que des réponses humorales dans la protection de l’hôte lors d’infestations parasitaires. La comparaison entre deux races ovines, l’une résistante, l’autre sensible, a mis en évidence une réponse immunitaire adaptative relativement comparable, qui ne nous permet toutefois pas d’expliquer les différences parasitologiques majeures observées entre ces deux races. Les moyens de lutte contre les strongles gastro-intestinaux pourraient à l’avenir se baser sur la sélection d’animaux résistants ou sur des schémas de vaccination efficaces. Toutefois, la 208 Discussion générale connaissance imparfaite des mécanismes de réponse immunitaire et de régulation des populations parasitaires, et de la nature des antigènes parasitaires protecteurs, constituent encore un frein majeur à l’application de ces méthodes. Dans ce domaine, les investigations se multiplient et les résultats obtenus sont très encourageants quant à l’aboutissement, à plus ou moins court terme, de moyens de lutte alternatifs aux traitements anthelminthiques. 209 Références bibliographiques REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 210 Références bibliographiques Adams, D.B., 1982, Time of onset and target of immune reactions in sheep with acquired immunity against Haemonchus contortus. Int J Parasitol 12, 439-443. 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La première partie de nos travaux a démontré une orientation Th2 claire lors d’infestation par Haemonchus contortus et plus équivoque lors d’infestation par Trichostrongylus colubriformis. Dans un second temps, les réponses immunes adaptatives de moutons de race sensible (INRA 401) et résistante (Barbados Black Belly) lors d’infestation par H. contortus ont été comparées. Des différences d’expression des gènes de l’IL-4, IL-5 et de l’IL-13, et d’éosinophilie sanguine ont été enregistrées entre les deux races. Mots clés : Nématodes gastro-intestinaux – Ovins – Haemonchus contortus – Trichostrongylus colubriformis – Réponse immunitaire – Polarisation Th2 – Résistance génétique. Regulation of gastro-intestinal nematode populations (Haemonchus contortus and Trichostrongylus colubriformis) in two ovine breeds, INRA 401 and Barbados Black Belly. Abstract: Gastrointestinal nematodes are major parasites of sheep industry. Current control is mainly based on chemical molecules. Due to the extension of anthelmintic resistance in nematode populations all around the world, alternative strategies, such as selective breeding of resistant sheep, are now necessary. Nevertheless, the imprecise knowledge of sheep immune mechanisms towards these parasites limits their development. The first part of this study demonstrated a clear Th2 polarization of the sheep immune response to Haemonchus contortus infection. In another hand, the response to Trichostrongylus colubriformis was more equivocal. In a second time, adaptative immune responses to H. contortus infection were compared between a susceptible breed (INRA 401) and a resistant one (Barbados Black Belly). Differences in IL-4, IL-5 and IL-13 gene expressions and blood eosinophilia were noticed between the two breeds. Key words : Gastrointestinal nematodes – Sheep - Haemonchus contortus – Trichostrongylus colubriformis – Immune response – Th2 polarization – Genetic resistance.
