TECHNOLOGIE ET TECHNIQUES BIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES

Concours « Agro-Véto »
AT - 0413
1 / 3 T.S.V.P.
TECHNOLOGIE ET TECHNIQUES BIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES
Durée : 3 heures
Notes :
- L’usage d’une calculatrice, d’abaques et tables est interdit pour cette épreuve.
- Le sujet comprend de nombreuses questions indépendantes.
Si, au cours de l'épreuve, un candidat repère ce qui lui semble être une erreur d'énoncé, il le signale sur sa copie et
poursuit sa composition en expliquant les raisons des initiatives qu'il a été amené à prendre.
Chaque candidat est responsable de la vérification de son sujet d’épreuve : pagination et impression de chaque
page. Ce contrôle doit être fait en début d’épreuve.
En cas de doute, il doit alerter au plus tôt le chef de centre qui contrôlera et éventuellement remplacera son sujet.
PARTIE A. Méthodes de mesure de biomasse
(4 points)
Présenter les deux méthodes usuelles de quantification d’une suspension bactérienne, l’une par
évaluation quantitative du trouble, l’autre par numération d'unités formant colonie. Décrire ensuite deux
autres méthodes de quantification reposant au choix sur des dosages d'enzymes ou des dosages de
métabolites ou des réactions d’amplification d’ADN.
Insister sur les intérêts et les limites de chacune des méthodes.
La réponse devra être soigneusement organisée. Le candidat devra apporter le plus grand soin à la
rédaction.
PARTIE B. Plantes et biofilms à Bacillus subtilis
(6 points)
On se propose d’étudier les relations entre des plantes cultivées et la bactérie tellurique Bacillus
subtilis. La souche sauvage Bacillus subtilis NCIB3610 présente deux modes de vie, l'un planctonique et
l'autre communautaire appelé biofilm. Dans ce dernier mode, les bactéries vivent enchâssées dans une
matrice composée de polyosides et de protéines extracellulaires synthétisés par les bactéries elles-mêmes.
1. Présentation de la souche bactérienne utilisée
Des tests ont été réalisés à l’aide de la souche sauvage Bacillus subtilis NCIB3610 modifiée
génétiquement pour exprimer de façon constitutive la protéine fluorescente mKate.
Les caractéristiques de la protéine mKate sont données dans le document n° 1.
1.1 Justifier l’intérêt d’utiliser une telle souche de Bacillus subtilis pour l’étude des biofilms. Analyser les
spectres présentés et proposer une valeur approchée des longueurs d’onde d’excitation et d’émission
optimales.
1.2 Dessiner une carte fonctionnelle du vecteur d'expression procaryote utilisé.
2. Culture de plants de tomates
La tomate est la plante choisie pour étudier les relations plantes cultivées - Bacillus subtilis. Des
graines stérilisées de tomates sont mises à germer dans un milieu synthétique de Murashige et Skoog
gélosé dont la composition est donnée au document n°2.

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2.1 Relever les différentes sources d’azote et de carbone apportées par le milieu de culture.
2.2 Rappeler la relation trophique des végétaux chlorophylliens vis-à-vis des sources de carbone et
d’azote.
2.3 Justifier l’intérêt de l’addition de sources non minérales au milieu de culture.
3. Culture mixte plantule - Bacillus subtilis
Des jeunes plantules sont placées en milieu Murashige et Skoog liquide en présence de Bacillus
subtilis et incubées 2 jours selon les conditions du document n°3. Les racines sont alors observées en
microscopie (fluorescence) afin mettre en évidence l’éventuel biofilm de Bacillus entourant les racines.
Les résultats sont présentés dans ce même document n° 3.
3.1 Analyser les résultats.
3.2 Préciser, en justifiant, si le qualificatif saprophyte s'applique à la souche Bacillus subtilis lors de
l’association Bacillus-plantule ?
4. Relation plante - bactérie
4.1 Analyser les documents n°4 et n°5.
4.2 En déduire le mode de relation entre la plante et la bactérie tellurique Bacillus subtilis. Qualifier alors
le type d’association Bacillus-plantule.
PARTIE C.
Activité enzymatique peroxydase et conjugués anticorps - peroxydase
(10 points)
Les peroxydases obtenues à partir de racine de raifort (Armoracia rusticana) sont très largement
utilisées pour la réalisation de conjugués anticorps enzyme. Ce sont des protéines de petite taille. Elles
catalysent l'oxydation de différents substrats contre la réduction du peroxyde d'hydrogène (H2O2). Les
produits oxydés obtenus permettent des révélations chromogéniques classiques ou des révélations en
fluorescence ou en chimioluminescence. Les peroxydases existent sous différentes formes
isoenzymatiques et dans le sujet il est question de la forme isoenzymatique dite forme C, qui sera
dénommée HRP.
1- Fabrication d'un conjugué anticorps - peroxydase
Le document n°6 présente la fabrication d'un conjugué immunoglobuline G-peroxydase (IgG-HRP).
1.1 La conjugaison fait intervenir les fonctions -NH2 accessibles des IgG.
Rappeler les résidus acides aminés d'une protéine qui peuvent présenter cette fonction chimique.
Expliciter le sens du terme « accessible » dans le contexte de la technique de conjugaison proposée.
1.2 Définir le terme dialyse. Indiquer l'intérêt de l'étape de dialyse ?
1.3 Quelle(s) est(sont) la(les) masse(s) moléculaire(s) attendue(s) pour les conjugués ?

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1.4 Expliciter le terme chromatographie d'exclusion diffusion (encore appelée perméation de gel ou
tamisage moléculaire) à l'aide d'un schéma annoté.
1.5 A l'aide d'un graphe exprimant les courbes Absorbance280 nm = f(volume d'élution) et
Absorbance403 nm = f(volume d'élution), proposer l'allure du profil d'élution obtenu lors de l'étape
d'exclusion diffusion.
Donnée : le support Sépharose CL-6B présente un domaine de perméation sélective couvrant l'intervalle
des masses moléculaires protéiques depuis 1.104 jusqu'à 4.106 Da.
2- Validation du conjugué obtenu
10 mL de conjugué ont été finalement obtenus. Le document n°7 présente le mode opératoire
utilisé pour la détermination de l’activité catalytique du conjugué obtenu. La mesure a été réalisée sur une
dilution au 1/200. On a mesuré respectivement pour l’essai et le blanc : (ΔA/Δt)essai = 0,378 min-1 et
(ΔA/Δt)blanc = 0,010 min-1.
2.1 Donner, en utilisant un système d’unités adapté, la formule littérale permettant de calculer la
concentration en activité catalytique (b) du conjugué.
2.2 En déduire la concentration en activité catalytique (b) du conjugué (l'application numérique finale est
très simple).
2.3 Montrer alors que le rendement de la fabrication du conjugué est d'environ 30 % sachant que la
préparation initiale d'HRP titrait 1000 U.mg-1.
3- A propos des mesures d'activités catalytiques peroxydase
et de quelques propriétés de l'enzyme HRP
3.1 Expliquer pourquoi les mesures d'activités catalytiques nécessitent des standards strictement définis.
3.2 Les documents n°8 et n°9 présentent deux études cinétiques de catalyse en présence d’HRP. Analyser
et interpréter ces deux études. Dans le standard de mesure des activités catalytiques peroxydase en
UABTS (document n°7), la concentration en H2O2, dans le milieu réactionnel de catalyse, est de 2,9
mmol/L et celle d'ABTS de 8,7 mmol/L. Commenter.
FIN DE L’ÉPREUVE