Stress oxydatif chez des plantules de Vicia faba L. soumises à

République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Université d’Oran Es-Sénia
Faculté des Sciences
Département de Biologie
Mémoire en vue de l’obtention du diplôme de Magister en Biologie
Option : Biochimie végétale appliquée
Thème
Stress oxydatif chez des plantules de Vicia faba L. soumises à
différentes contraintes abiotiques (stress salin, stress hydrique
et stress aux métaux lourds)
Présenté par :
M me BENAHMED Fatiha.
Soutenu le : 14 /12 / 2010
Mr
devant le jury:
BELKHODJA Moulay
Prof. Université d’Oran
Président
M me BENNACEUR Malika
M.C. Université d’Oran
Examinatrice
M me IGHIL-HARRIZ Zohra
M.C. Université d’Oran
Examinatrice
Mr
Prof. Université d’Oran
Rapporteur
MAROUF Abderrazak
Année universitaire : 2010 – 2011
Remerciements
Au terme de ce travail, je voudrai remercier mon directeur de thèse Professeur
Abderrazak MAROUF et lui exprimer ma gratitude pour sa très grande disponibilité, son
soutien scientifique, son excellent sens critique et sa rigueur scientifique.
Je tiens également à remercier le Professeur Moulay BELKHODJA de l’Université
d’Oran pour sa grande disponibilité et d’avoir aimablement accepter de présider ce jury; qu’il
me soit permis de lui témoigner mon sincère et profond respect.
Mon sentiment profond va à Madame Malika BENNACEUR, maître de conférences au
Département de Biologie d’Oran, Université Es-Sénia, qui a eu l’amabilité en me faisant
l’honneur d’examiner ce mémoire.
Je tiens à remercier Madame Zohra IGHIL-HARIZ, maître de conférences au Département de
Biologie d’Oran, Université Es-Sénia, qui a bien voulu faire part, de ce jury et examiner mon
travail.
Je remercie vivement Madame le Professeur Fatima zohra ELKEBIR ma Directrice de
Laboratoire de Biologie du Développement et de la Différenciation qui m’a encouragé et qui
m’a beaucoup aidé tout au long de ce mémoire, qu’elle trouve dans ces quelques mots
l’expression de ma sincère gratitude.
A tous les membres du Laboratoire de Biologie du Développement et de la Différenciation :
Tewfik SAHRAOUI, Rachid SENHADJI, Dalia DERKAOUI, Mme Farida MESLI et
Mohcen GHALEK et Mme Ould Kadi Houria de m’avoir aidé tout au long de ce travail .
A Mme le Maitre de conférence Luisa BOUABDELLAH pour tous ces précieux conseils tout
au long de ma vie professionnel.
A Monsieur Omar KHAROUBI maitre de conférence à au Département de Biologie à
l’université d’Oran qui m’a beaucoup encouragé.
Je tiens à remercier tous mes collègues du Département de BIOLOGIE : Fatiha ATTOU,
Houria AMEZIANE, Khadidja BELHADJ, Nacéra , Oumria et Kheira ,Abdelkader, Ahmed.
Mes remerciements les plus sincères à Mme Maya.
Je voudrais exprimer ma gratitude à Madame Farida BOUKORT, maitre de conférences au
Département de Biologie à l’université d’Oran qui m’a beaucoup encouragé et aidé à mener à
terme ce sujet ainsi qu’à Mme le professeur Ait YAHIA Dalila.
Je voudrais remercier toutes les personnes qui n’ont en aucun cas douté de mes compétences :
Mme Zoubida EL-HADJ et son mari et Monsieur KARKACHI et sa femme et Nadia AITHAMADOUCHE.
Je veux remercier du fond du cœur mes meilleurs amis avec qui je n’oublierai jamais cette
expérience humaine très enrichissante pour moi : Fatima kerrroum meilleur amie avec
laquelle j’ai partagé les moments les plus difficiles (,t’as été toujours là quand j’avais besoin
tu es la personne qui m’a toujours soutenu) à Wahiba RACHED (, je sais que t’iras loin) ,
Faiza CHAIB (j’ai appris à te connaître j’en suis ravi, t’es plein de qualités).
Les autres personnes indispensables à la vie du laboratoire sont bien entendu les étudiants et
les thésards je voudrais remercier :
Nawel FASLA ( je ne sais pas quoi dire de toi, tu le sais…) ; Fatimus ZEGHADA (je suis ravi
et très heureuse de ta connaissance et de ton amitié, …), Houari BENAMAR (je te souhaite
beaucoup de réussite, peut être un prix Nobel à partager) à Amine BENGAG et Belkheir , on
ne t’oublieras jamais.
A la mémoire de Madame Malika KHOUAIDJIA, toujours présente dans notre cœur.
Ce travail n’aurait pu être mené à bien sans l’aide et la sympathie de mes collègues
enseignants et ingénieurs de l’Université d’Oran , Saliha MELIANI, Amina TEHARI (je te
souhaiterai beaucoup de réussite).
DEDICACES
Avant de dédier ce travail Je tiens d’abord à remercier ,‫ﺍﻟﻠﻪ‬, le Tout Puissant, qui nous a permis de mener à
bien ce modeste travail.
A la mémoire de mes parents
A la mémoire de ma sœur Khadidja
A mon mari.
A mes deux enfants Djamel Eddine et Kawtar.
Liste des abréviations
1
O2 = oxygène singulet
ADN= Acide Désoxyribonucleique.
AFNOR= Association Française de Normalisation.
AOX = Oxydase Alternative
APX = Ascorbate Peroxydase
ASC = Ascorbate ou Acide L Ascorbique
ATP = Adénosine Tri Phosphatase
ATP = Adénosine Tri Phosphate
CAT = Catalase
CTE = Chaine de Transport d’Electrons
CuAo = Amine oxydase à cuivre
CuZnSOD = SOD à cuivre et à zinc
DHA = Dehydroascorbate
DHAR = Déhydroascorbate Reductase
ERA = Espèces Réactives à l’azote
ERO = Espèces Réactives à l’oxygène
H2O2 = Peroxyde d’hydrogène
HgCl2= Chlorure de mercure
IM = Indice Mitotique
LH = acide gras polyinsaturés
LOO’ = lipoperhydoxyle
LOOH = Hydroxyperoxyde lipidique
LOX = Lipoxygénase
MDA = Malondialdehyde
MDHA = radical mondehydroascorbate
MDHAR = mondehydroascorbate réductase
MN = Micronoyaux
MnSOD = SOD à manganèse
NaCl = Chlorure de Sodium
NAD (P) = Nicotinamide Adenine Dinucléotide phosphate
NADH (P) = Nicotinamide Adenine Dinucléotide réduite phosphate
NADH déshydrogénase = Nicotinamide Adenine Dinucléotide réduite déshydrogénase
NOX = NADPH Oxydase
O2 .- = Anion radical superoxyde
O2- = ion oxyde
O2 = Oxygène
O2 2- = Ion peroxyde
OH - = anion hydroxyle
OH . = radical hydroxyle
OxO = Oxalate oxydase
PAO = Polyamine Oxydase
PEG= polyéthylène glycol
POX = Peroxydase
SOD = Superoxyde Dismutase
TBARS = Thiobarbituric Reactive Species
XOD = Xanthine Oxydase
Figure 1
: Schématisation de la balance entre les espèces réactives oxygénées (ERO) et les
antioxydants.
Figure 2
: Produits de la réduction du dioxygène.
Figure 3
: Sites de production intra-organites des formes réactives de l’oxygène dans la
cellule végétale .
Figure 4
: Les différentes étapes de la peroxydation lipidique.
Figure 5
: Réaction entre le MDA et l’acide thiobarbiturique.
Figure 6
:. Les trois principaux points d’intervention des antioxydants phénoliques dans la
protection des lipides contre la dégradation oxydative.
Figure 7
: les polyphénols face aux stress biotiques et abiotiques
Figure 8
: Chélation des radicaux libres par les flavonoïdes.
Figure 9
: Feuilles de Pistacia atlantica Desf.
Figure 10
: Teneurs en polyphénols dans la partie hypocotylédones et épicotylédones chez
les plantules V. faba soumis à différents stress.
Figure 11
: Teneurs en flavonoides dans les parties hypocotylédone et épicotylédone chez
les plantules V. faba soumis à différents stress.
Figure 12
: Teneurs en polyphénols au niveau des hypocotylédones et des épicotylédones
des plantules de V. faba exposées au chlorure de mercure à 15 mg/L et traitées
par l’extrait aqueux de Pistacia atlantica.
Figure 13
: Teneurs en flavonoides au niveau des hypocotylédones et des épicotylédones
des plantules de V. faba exposées au chlorure de mercure à 15 mg/L et traitées
par l’extrait aqueux de Pistacia atlantica.
Figure 14
: Apex racinaire de Vicia faba avec micronoyaux coloré au réactif de Feulgen au
grossissement x100.
Figure 15
: Nombre de micronoyaux (MN ‰ ± ES) des cellules méristématiques de Vicia
faba exposées à une solution au chlorure de mercure (HgCl2) à 15 mg/L et
traitées par l’extrait aqueux des feuilles de Pistacia atlantica à 1%.
Figure 16
: Teneurs en polyphénols totaux et en flavonoïdes exprimées en mg/g de poudre
lyophilisée.
INTRODUC TION
1
CHAPITRE I: ÉTUDE BIBLIOGRAPH IQUE
1. Définition du stress oxydatif
4
2. Définition des espèces réactives de l’oxygène
5
2.1. Radicaux libres
5
2.2. Formation des espèces réactives de l’oxygène
6
2.2.1. Anion superoxyde (°O2 -)
7
2.2.2. Peroxyde d’hydrogène (H2O2)
7
2.2.3. Radical hydroxyle (°OH)
7
2.3. Sources des espèces réactives de l’oxygène dans la cellule végétale
7
2.3.1. Chloroplastes et l’appareil photosynthétique
8
2.3.2. Peroxysomes
8
2.3.2.1. β-oxydation
9
2.3.2.2. Photorespiration
9
2.3.3 Mitochondries et chaîne respiratoire
9
3. Conséquences du stress oxydatif
10
3.1. Peroxydation lipidique (lipoperoxydation)
10
3.1.1. Phase d’initiation
11
3.1.2. Phase de propagation
11
3.1.3. Phase de terminaison
11
3.2. Marqueurs de la lipoperoxydation
12
3.2.1. Intérêts du dosage du malondialdéhyde (MDA)
12
3.3. Oxydation des protéines
12
3.4. Oxydation de l’ADN
12
3.4.1. Test de micronoyaux
13
4. Mécanismes de défense contre le stress oxydatif
14
4.1. Systèmes de défense par des enzymes antioxydants
15
4.1.1. Superoxyde dismutase (EC : 1.15.1.1)
15
4.1.2. Catalase (EC 1.11.1.6)
15
4.1.3. Peroxydase (POX) (EC 1.11.1.x)
16
4.2.. Les composés phénoliques et la détoxification des formes activées de
l’oxygène
16
4.2.1. Flavonoïdes
18
4.2.1.1. Capture directe de radicaux libres
19
4.2.1.2. Inhibition enzymatique
19
5. Principaux stress environnementaux auxquels les plantes sont confrontées
19
5.1. Stress biotique
20
5.2. Stress abiotique
20
5.2.1. Stress par déficit hydrique
20
5.2.2. Stress salin par le chlorure de sodium (NaCl)
20
5.2.3. Stress par le chlorure de mercure (HgCl2)
20
CHAPITRE II : RAPPEL BOTANIQUE
1. Description de la famille des Anacardiacées
2. Genre de Pistacia (Pistachier)
3. Monographie de Pistacia atlantica Desf.
3.1. Position systématique de Pistacia atlantica Desf. selon APGII (2005)
3.2. Noms vernaculaires
3.3. Description botanique
3.4. Aire de répartition géographique
3.5. Phytochimie et propriétés thérapeutiques
3.6. Utilisations traditionnelles et propriétés pharmaceutiques
CHAPITRE III:MATÉRIEL ET MÉTHODES
1. Modèle expérimentale
1.1. Choix du modèle expérimentale
1.2. Culture et échantillonnage
2. Application des stress
3. Mesure de la défense antioxydante
3.1. Dosage des polyphénols et des flavonoïdes
3.1.1. Dosage des polyphénols totaux
3.1.2. Dosage des flavonoïdes
4. Effet antioxydant de Pistacia atlantica (Desf.)
5.1. Préparation de l’extrait aqueux de Pistacia atlantica
5.2. Identification des principaux constituants de l’extrait aqueux lyophilisé de
Pistacia atlantica par chromatographie sur couche mince (CCM)
5.2.1. Préparation des échantillons
5.2.2 Révélation
6. Évaluation de l’activité antioxydante de l’extrait aqueux des feuilles de Pistacia
atlantica sur Vicia faba stressée au chlorure de mercure (HgCl2)
7. Test de micronoyaux
8. Analyse statistique
24
24
24
24
25
25
25
25
26
28
28
28
28
29
29
29
30
30
30
31
31
31
32
33
33
CHAPITRE IV: RÉSULTATS
1. Défense antioxydante
35
1.1. Teneurs en polyphénols dans les différents organes
35
1.1.1. Plantes stressées au NaCl à 100 mM
35
1.1.2. Plantes stressées au stress hydrique (PEG 10 %)
35
1.1.3. Plantes stressées au chlorure de mercure (HgCl2)
35
1.2. Teneur en flavonoïdes
36
1.2.1. Plantes stressées au NaCl à 100 mM
36
1.2.2. Plantes stressées au stress hydrique (PEG à 10 %)
36
1.2.3. Plantes stressées au chlorure de mercure (HgCl2) à différentes
concentrations
36
2. Évaluation de l’activité antioxydante de l’extrait aqueux des feuilles de Pistacia 37
atlantica à 1 % sur les plantules de Vicia faba stressées par le chlorure de mercure
(HgCl2 à 15 mg/L)
2.1. Teneur en polyphénols
37
2.2. Teneur en flavonoïdes
37
3. . Test des micronoyaux
4. Analyse phytochimique de l’extrait aqueux de Pistacia atlantica
38
5. Teneur en polyphénols totaux et en flavonoïdes chez Pistacia atlantica
39
CHAPITRE V : DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQU ES
ANNEXES
41
50
52
INTRODUCTION
Le stress oxydatif désigne l’ensemble des perturbations physiologiques, métaboliques
ou provoquées dans un organisme par des agents biotiques (parasites, pathogènes) ou
abiotiques (salinité, sécheresse, température, pollution, etc.) (Marouf & Reynaud, 2007).
Dans les systèmes biologiques le stress oxydant est la conséquence d’un déséquilibre
entre la production d’espèces réactives oxygénées (ERO) et leur destruction par des systèmes
de défense antioxydants (Bonnefont-Rousselot et al., 2003).
Le stress oxydatif est à l’origine de plusieurs stress abiotiques (salinité, métaux lourds,
stress hydrique…), d’où la mise en œuvre par la cellule végétale de plusieurs systèmes de
détoxification tels que les métabolites secondaires, qui jouent un rôle crucial dans la
détoxification des espèces réactives de l’oxygène.
Comme chez le règne animal, les plantes possèdent également de nombreux composés
et enzymes capables d’empêcher la production des ERO ou de la contrôler. Parmi ces
composés, nous nous somme intéressés particulièrement aux polyphénols et plus
particulièrement aux flavonoïdes, connus pour leur fort pouvoir à piéger les radicaux libres.
La problématique de notre travail s’inscrit dans une thématique plus générale,
développée au sein du Laboratoire de Biochimie Végétale et des Substances Naturelles, visant
à caractériser un extrait de plante et à évaluer son impact sur la protection contre les effets
néfastes des radicaux libres chez une plante modèle, Vicia faba.
Cette étude s’est effectuée en parallèle et en complément des travaux des autres
membres du laboratoire notamment ceux portant sur l’évaluation du potentiel antioxydant et
l’activité anticholenestérase des plantes médicinales qui nous ont permis de sélectionner, à
partir d’un screening réalisé sur 56 échantillons, une espèce à fort pouvoir antioxydant, en
l’occurrence, Pistacia atlantica.
Dans ce contexte, la base de notre projet est d’évaluer l’impact de différents stress
abiotiques à générer un stress oxydatif sur une plante modèle Vicia faba, d’où l’objectif s’est
développé sur deux volets :
1
INTRODUCTION
Ø Dans un premier temps, il s’agit d’étudier, à l’aide de plusieurs biomarqueurs de
stress, l’état physiologique des plantules de Vicia faba soumises à différents stress au
stade juvénile,
Ø Dans un second temps, notre hypothèse était de mettre en évidence le rôle joué par
Pistacia atlantica après un stress au chlorure de mercure (HgCl2), à une concentration
de 15 mg/L, à piéger les espèces réactives de l’oxygène.
Quatre parties composent ce mémoire. La première partie présente une synthèse
bibliographique sur les principaux aspects inhérents au stress oxydatif chez les plantes. Une
présentation du matériel végétal et des techniques utilisées pour répondre à nos objectifs font
l’objet de la seconde partie. La troisième partie présente nos résultats suivis de leur discussion
La dernière partie du manuscrit propose une conclusion sur l'ensemble des résultats et suggère
quelques perspectives à ce travail.
2
INTRODUCTION
Le stress oxydatif désigne l’ensemble des perturbations physiologiques, métaboliques
ou provoquées dans un organisme par des agents biotiques (parasites, pathogènes) ou
abiotiques (salinité, sécheresse, température, pollution, etc.) (Marouf & Reynaud, 2007).
Dans les systèmes biologiques le stress oxydant est la conséquence d’un déséquilibre
entre la production d’espèces réactives oxygénées (ERO) et leur destruction par des systèmes
de défense antioxydants (Bonnefont-Rousselot et al., 2003).
Le stress oxydatif est à l’origine de plusieurs stress abiotiques (salinité, métaux lourds,
stress hydrique…), d’où la mise en œuvre par la cellule végétale de plusieurs systèmes de
détoxification tels que les métabolites secondaires, qui jouent un rôle crucial dans la
détoxification des espèces réactives de l’oxygène.
Comme chez le règne animal, les plantes possèdent également de nombreux composés
et enzymes capables d’empêcher la production des ERO ou de la contrôler. Parmi ces
composés, nous nous somme intéressés particulièrement aux polyphénols et plus
particulièrement aux flavonoïdes, connus pour leur fort pouvoir à piéger les radicaux libres.
La problématique de notre travail s’inscrit dans une thématique plus générale,
développée au sein du Laboratoire de Biochimie Végétale et des Substances Naturelles, visant
à caractériser un extrait de plante et à évaluer son impact sur la protection contre les effets
néfastes des radicaux libres chez une plante modèle, Vicia faba.
Cette étude s’est effectuée en parallèle et en complément des travaux des autres
membres du laboratoire notamment ceux portant sur l’évaluation du potentiel antioxydant et
l’activité anticholenestérase des plantes médicinales qui nous ont permis de sélectionner, à
partir d’un screening réalisé sur 56 échantillons, une espèce à fort pouvoir antioxydant, en
l’occurrence, Pistacia atlantica.
Dans ce contexte, la base de notre projet est d’évaluer l’impact de différents stress
abiotiques à générer un stress oxydatif sur une plante modèle Vicia faba, d’où l’objectif s’est
développé sur deux volets :
1
INTRODUCTION
Ø Dans un premier temps, il s’agit d’étudier, à l’aide de plusieurs biomarqueurs de
stress, l’état physiologique des plantules de Vicia faba soumises à différents stress au
stade juvénile,
Ø Dans un second temps, notre hypothèse était de mettre en évidence le rôle joué par
Pistacia atlantica après un stress au chlorure de mercure (HgCl2), à une concentration
de 15 mg/L, à piéger les espèces réactives de l’oxygène.
Quatre parties composent ce mémoire. La première partie présente une synthèse
bibliographique sur les principaux aspects inhérents au stress oxydatif chez les plantes. Une
présentation du matériel végétal et des techniques utilisées pour répondre à nos objectifs font
l’objet de la seconde partie. La troisième partie présente nos résultats suivis de leur discussion
La dernière partie du manuscrit propose une conclusion sur l'ensemble des résultats et suggère
quelques perspectives à ce travail.
2
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Définition du stress oxydatif
Le stress oxydatif chez les plantes fait l’objet de très nombreuses revues
bibliographiques (Bartosz, 1997; Bolwell et Wojtaszek, 1997; Van Breusegem et al.,
2001; Potters et al., 2002; Schutzendubel et Polle, 2002; Blokhina et al., 2003; Apel et
Hirt, 2004; Foyer et Noctor, 2005; Pitzschke et al., 2006; Wormuth et al., 2007) et de
plusieurs livres (Inze et Montagu, 2001; Smirnoff et al., 2005).
Dans les systèmes biologiques, le stress oxydant est la conséquence d’un
déséquilibre entre la production d’espèces réactives oxygénées (ERO) et leur destruction
par des systèmes de défense antioxydants (Bonnefont-Rousselot et al., 2003).
Les espèces réactives oxygénées (ERO) peuvent engendrer des dommages
importants dans la structure et le métabolisme cellulaire en dégradant de nombreuses
cibles : protéines, lipides et acides nucléiques (Cadenas & Davies, 2000 ; Pincemail &
al., 1999).
Dans les conditions quotidiennes normales, les espèces réactives oxygénées (ERO)
sont produites en faible quantité comme des médiateurs tissulaires ou des résidus des
réactions énergétiques ou de défense, et cela sous le contrôle de systèmes de défense
adaptatifs par rapport au niveau de radicaux présents. Dans ces conditions, on dit que la
balance pro-oxydant/anti-oxydants est en équilibre. Cette dernière peut être rompue pour
diverses raisons en faveur du système pro-oxydant, et est alors à l’origine d’un stress
oxydant (Favier, 2003) (Figure 1).
Figure 1 : Schématisation de la balance entre les espèces réactives oxygénées (ERO) et
les antioxydants (Pourrut, 2008).
4
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
2. Définition des espèces réactives de l’oxygène
Les espèces réactives de l’oxygène (ERO) est utilisé pour la description des formes
d’oxygène qui sont énergétiquement plus réactives que l’oxygène moléculaire. Parfois,
elles sont appelées espèces oxygénées actives (EOA). Elles regroupent l’ensemble des
dérivés radicalaires de l’oxygène mais également d’autres composés non radicalaires très
réactifs (Asada, 2000 ; Foyer et Noctor, 2003 ; Edreva, 2005).
Certaines espèces réactives de l’azote (ERA ou RNS en anglais pour Reactive
Nitrogen Species) sont parfois mentionnées comme appartenant à cette classification
puisqu’elles possèdent un atome d’oxygène et qu’elles se comportent de manière similaire
(espèces généralement radicalaires, pouvoir oxydant important, générées et régulées par
l’organisme) aux ERO vis-à-vis du stress oxydant (Smirnoff, 2005).
2.1. Radicaux libres :
Les radicaux libres sont des espèces chimiques (atomes ou molécules) qui possèdent
un ou plusieurs électrons célibataires (électron non apparié) sur leurs couches externes et
capables d’existence indépendante (Halliwell et Gutteridge, 1999).
Ils peuvent être dérivés de l’oxygène (ERO) ou d’autres atomes comme l’azote
(ERN). La présence d’un électron célibataire confère aux radicaux libres une grande
réactivité (demi-vie courte) et ils peuvent être aussi bien des espèces oxydantes que
réductrices. Cette instabilité rend difficile leur mise en évidence au niveau des différents
milieux biologiques (Bonnefont-Rousselot et al., 2003) (Tableau 1).
Tableau 1: Espèces réactives de l’oxygène radicalaire et non radicalaire (Halliwell,
2006).
ERO (radicalaire)
Formule chimique
3
Oxygène moléculaire
Dioxygène singulet
Anion superoxyde
Radical hydroxyle
Radical hydroperoxyde
Radical peroxyle
Radical alkoxyle
Radical oxyde nitrique
Peroxinitrite
ERO (non radicalaires)
Hydroperoxyde
Hypochlorite
Ozone
Peroxyde d’hydrogène
O2
O2
°
O2 
OH
HOO°
ROO°
RO°
NO°
ONOO°
Formule chimique
ROOH
ClOH
O3
H2O2
1
5
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
2.2. Formation des espèces réactives de l’oxygène :
Le métabolisme cellulaire chez les végétaux produit à l’état physiologique plusieurs
variétés d’ERO (Figure 2). Dans le cas d’un stress oxydatif, ces ERO peuvent être
modulés qualitativement et quantitativement. Tous les ERO ne sont pas extrêmement
réactifs, cette réactivité étant très variable selon la nature du radical. Parmi les radicaux
formés chez les végétaux on distingue (Smirnoff, 2005) :
Ø Anion superoxyde (°O2-) ;
Ø Peroxyde d’hydrogène (H2O2) ;
Ø Radical hydroxyle (°OH).
Figure 2 : Produits de la réduction du dioxygène (R. Heller et al., 1998).
2.2.1. Anion superoxyde (°O2-) :
La source principale de la production de l’anion superoxyde est la chaîne
respiratoire mitochondriale. Il résulte de l’addition d’un électron à l’oxygène moléculaire
qui est catalysée par le cytochrome oxydase (réaction1).
Cytochrome oxydase
O2 +
e-
O2-
Réaction (1)
Il existe généralement deux sources de l’anion superoxyde : le système enzymatique
xanthine/xanthine oxydase et le système non enzymatique comme le phénazine
méthosulphate-NADH ou potassium superoxyde selon les réactions 2 et 3.
Xanthine oxydase
Acide urique + 2O2°- + 2H+
Xanthine + 2O2 + H2O
Réaction (2)
NADPH oxydase
2O2 + NADPH
2O2°- + NADP+ H+
6
Réaction (3).
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
2.2.2. Péroxyde d’hydrogène (H2O2) :
La combinaison du radical superoxyde avec deux protons (H+) conduit à la
formation du peroxyde d’hydrogène (H2O2).
H2O2 n’est pas un radical libre mais une molécule avec tous ses électrons appariés
qui présente une toxicité par l’intermédiaire des réactions de type Fenton (5) (présence de
cations métalliques comme Fe2+ ou Cu2+) (Wardman et Candeias, 1996).
SOD
2O2- + 2 H
H2O2 ·- + O2
Réaction (4)
Fe 2+ + H2O2
Fe 2++ OH-+°OH
Réaction (5)
2.2.3. Radical hydroxyle (°OH):
Le radical hydroxyle (°OH) est très réactif, il se forme soit par la dégradation du
peroxyde d’hydrogène en présence de métaux de transition sous leur forme réduite
(réaction 5), ou par son action avec le radical superoxyde selon la réaction de Haber
Weiss
(Réaction 6).
HO-OH + O2°-
O2+-OH+°OH
Réaction (6)
2.3. Sources des espèces réactives de l’oxygène dans la cellule végétale
Chez les plantes, il existe plusieurs sources cellulaires d’espèces réactives de
l’oxygène localisées à divers endroits de la cellule (figure 3, tableau 2), et qui sont
produites de façon permanente durant le métabolisme normale et durant les périodes de
stress. Ces sources incluent :
Ø Les chaînes de transport d’électrons (CTE) des chloroplastes;
Ø Les chaînes de transport d’électrons (CTE) des mitochondries;
Ø La photorespiration dans les peroxysomes ;
Ø Certaines enzymes comme les glycolate oxydases, la xanthine oxydase et les
enzymes de l’oxydation des acides gras dans le peroxysome ;
Ø L’amine oxydase et l’oxalate oxydase dans l’apoplaste ;
Ø Les molécules photosensibilatrices comme la chlorophylle.
7
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Tableau 2: Origines et localisations des espèces réactives de l’oxygène (Smirnoff ,
2005).
Origine
Localisation
ERO
Photosynthèse, PSI ou PSII
Chloroplaste
O2°
Respiration (transport d’électrons)
Mitochondrie
O2°
Glycolate oxydase
Peroxysome
H2O2
Chlorophylles excitées
chloroplaste
O2°
NADPH oxydase
Membrane cellulaire
O2°
Peroxysome
H2O2
b-oxydation des acides gras
Oxalate oxydase
Apoplaste
H2O2
Xanthine oxydase
Peroxysome
O2°
2+
Peroxydases, Mn et NADH
Membrane cellulaire
H2O2
Amine oxydase
Apoplaste
H2O2, O2°
2.3.1. Chloroplastes et l’appareil photosynthétique
Le chloroplaste est souvent considéré comme étant la principale source d’ERO chez
les organismes photosynthétiques (Foyer & Noctor, 2003; Edreva, 2005; Asada, 2006).
En effet, de nombreuses situations de stress abiotiques entraînent une inhibition de la
photosynthèse et les électrons qui ne participent plus à la fixation du CO2 vont entraîner la
production et l’accumulation de ROS. Durant les conditions de photoinhibition, la
carboxylation du ribulose 1,5-biphosphate (RuBP) est inhibée, favorisant son oxygénation
et entraînant la production de phosphoglycolate. Celui-ci est transporté vers le
peroxysome où il est converti en glyoxylate par la glycolate oxydase, produisant ainsi le
peroxyde d’hydrogène. Les chloroplastes et les peroxysomes sont ainsi considérés comme
« capteurs » des changements environnementaux (figure 3). Les ROS se comportent donc
comme signaux
« rédox », dérivés des chloroplastes, et sont susceptibles de réguler
l’expression de gènes de la réponse et de l’adaptation au stress (Parent & al., 2008).
2 .3.2.Peroxysomes
Les peroxysomes sont des vésicules cytoplasmiques minuscules (0,5 µm de
diamètre) entourées d’une membrane simple contenant des oxydases et des enzymes
spécifiques du métabolisme du peroxyde d’hydrogène (Marouf & Reynaud, 2007). Ils
sont le siège d’une forte activité métabolique très centrée sur le métabolisme oxydatif
(Corpas & al., 2001; Nyathi & Baker, 2006), et ils possèdent de nombreux systèmes
antioxydants et prooxydants.
8
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les deux principales sources d’espèces réactives oxygénées peroxysomales sont la
β-oxydation des acides gras et la photorespiration (Corpas & al., 2001; Nyathi & Baker,
2006).
2.3.2.1. β-oxydation
La β-oxydation est un processus fondamental et commun chez les animaux, les
levures et les plantes. Les composés dérivés de la β-oxydation sont impliqués dans un très
grand nombre de processus cellulaires parmi lesquels l’oxydation de l’acyl CoA par la
l’acyl CoA-oxydase qui entraîne la réduction du FAD en FADH2 (Baker et al., 2006). La
régénération du cofacteur s’effectue par la réduction d’une molécule d’O2 entraînant la
formation d’H2O2 (Foerster & al., 1981; Baker & al., 2006).
Acyl CoA + FAD
O2 + FADH2
2-trans-enoyl CoA + FADH2
H2O2 + FAD
Réaction (7)
Réaction (8)
2.3.2.2. Photorespiration :
La photorespiration est une réaction étroitement liée à la photosynthèse et qui chez
les végétaux supérieurs, conduit à la fixation enzymatique de l’oxygène (O2) et au rejet de
dioxyde de carbone (CO2), interférant avec le processus photosynthétique et diminuant
son efficacité (Marouf & Reynaud, 2007). La photorespiration est un processus vital
pour les plantes. Bien qu’il apparaisse comme un mécanisme coûteux en énergie et peu
rentable, ce mécanisme physiologique remplit le rôle de « soupape de sécurité » du
photosystème, en évitant la saturation de la CTE chloroplastique (Wingler & al., 2000).
La photorespiration est un processus complexe illustrant bien les échanges de métabolites
entre les différents composants cellulaires. Elle se déroule dans quatre compartiments
cellulaires : chloroplastes, peroxysomes, mitochondries (figure 3), auxquels s’adjoint le
cytosol en tant que milieu de transit (Foyer et Noctor, 2000).
2.3.3 Mitochondries et chaîne respiratoire :
Chez les animaux, les mitochondries constituent la source principale de ROS. Chez
les plantes, la production de ROS par les mitochondries a été historiquement minimisée
par rapport à celle des chloroplastes. Cependant, avec l’identification de l’alternative
oxydase (AOX), la mitochondrie pourrait devenir un acteur important dans la régulation
9
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
du stress oxydatif chez les plantes. En effet, cette enzyme agit comme une « soupape de
sécurité », contrôlant la réduction du pool d’ubiquinone, source importante de ROS. Pour
cette raison, la mitochondrie a été proposée comme médiateur entre les changements
métaboliques, la production de ROS et l’induction de gènes. Cependant, la contribution de
la mitochondrie à la production de ROS lors de la réponse au stress reste encore mal
définie (Parent et al., 2008).
Figure 3: Sites de production intra-organites des formes réactives de l’oxygène dans la
cellule végétale (Bolwell, 2002). APX: ascorbate peroxydase; PSI: photosystème I; PSII :
photosystème II ; AOX : alternative oxydase ; Fd : ferodoxyne (RuBP) ribulose 1,5-biphosphate.
3. Conséquences du stress oxydatif :
Lors d’un stress oxydant, les espèces réactives oxygénées endommagent les
macromolécules dans les cellules, notamment les lipides, les protéines et l’ADN.
3.1. Peroxydation lipidique (lipoperoxydation):
Les lipides et, principalement, les acides gras polyinsaturés de la membrane
cellulaire représentent la première ligne attaquée par les ERO induisant des processus de
péroxydations lipidiques et conduisant à la formation de plusieurs produits : aldéhydes,
alkènes, hydroxyalkenols et d’autres incluant des composés utilisés comme marqueurs de
10
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
la lipopéroxydation. C’est le cas du malondialdehyde (MDA) et du 4-hydroxynonénal
(4HNE). Ce processus se déroule en trois phases (Spiteller, 1998) (figure 8):
Ø Phase d’initiation ;
Ø Phase de propagation ;
Ø Phase de terminaison.
3.1.1. Phase d’initiation :
Cette phase consiste en la formation d’un composé radicalaire (radical lipidique)
très réactif activé par un initiateur radicalaire comme l’oxygène singulet (réaction (1)).
Initiateur (I)
RH
IH+R°
Réaction (9)
3.1.2. Phase de propagation :
Au cours de cette phase le radical hydroxyle arrache un atome d’hydrogène entre
deux doubles liaisons est oxydé en radical peroxyle (réaction). Cette réaction forme une
réaction en chaîne car le radical peroxyle formé se transforme en peroxyde au contact d'un
autre acide gras qui forme un nouveau radical (réaction 2).
R°
+ O2
ROO°+ RH
ROO°
Réaction (10)
ROOH + R°
Réaction (11)
3.1.3. Phase de terminaison :
Cette phase correspond à une rencontre entre deux composés radicalaires pour la
formation des composés stables (réactions 12, 13 et 14).
ROO° + ROO°
ROO° + R°
R°
Réaction (12)
Produits non radicalaires.
+ R°
Réaction (13)
Réaction (14)
Figure 4: Les différentes étapes de la peroxydation lipidique (Spiteller, 1998).
11
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
3.2. Marqueurs de la lipoperoxydation:
Intérêts du dosage du malondialdéhyde (MDA):
Le dosage du malondialdéhyde (MDA), ou des substances réagissant à l’acide
thiobarbituriques (TBARS) est utilisé depuis les années cinquante pour estimer la
péroxydation des lipides dans les membranes et les systèmes biologiques (Roussselot &
al., 2003).
Le MDA est formé à partir d’une auto-oxydation et d’une dégradation
enzymatique des acides gras polyinsaturés dans les cellules, lors d’un stress oxydatif. Le
dosage permet donc de mettre en évidence les stress environnementaux pouvant induire
une variation de ce niveau d’oxydation des lipides
Figure 5 : Réaction entre le MDA et l’acide thiobarbiturique.
3.3. Oxydation des protéines :
Les ERO sont en effet capables de réagir avec différents acides
aminés des
chaînes de protéines, altérant également leur fonction. Les protéines les plus touchées sont
celles comportant un groupement sulphydryle (-SH), comme c’est le cas pour de
nombreuses enzymes et protéines de transport (Stadtman & Levine, 2000). Le peroxyde
d’hydrogène, mais surtout le radical hydroxyle sont capables d’oxyder ces groupements,
conduisant à l’inactivation de certaines enzymes. En particulier, la présence de radicaux
hydroxyles est à l’origine de dégradations irréversibles des protéines, par la formation de
groupements carbonyles sur la chaîne latérale de certains acides aminés.
3.4. Oxydation de l’ADN :
L’ADN, qu’il soit nucléaire ou mitochondrial, est également une cible majeure des
ERO. Ceux-ci peuvent en effet interagir avec les désoxyriboses de l’ADN mais aussi avec
ses bases puriques et pyrimidiques. L’atteinte de l’ADN implique le franchissement
préalable de toutes les barrières de défense mises en place par les végétaux, la potentialité
12
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
de détoxication des cellules ou de l’organisme et enfin du potentiel des systèmes de
réparation de l’ADN de l’organisme. Plusieurs altérations ont été observées :
Ø Une formation de bases oxydées ;
Ø Des sites abasiques qui sont une partie de l’ADN dépourvue d’une base purique
ou pyrimidique et ayant perdu l’information génétique par rupture de la liaison entre une
base et le désoxyribose.
Ø Des cassures au niveau des brins d’ADN, qui peuvent être double ou simple
brin.
Ø Une Apparition d’adduits à l’ADN. Ils correspondent à la formation de produits
d’addition entre le polluant et les nucléotides (adduits pour addition et produits), suite à
la peroxydation des lipides.
Ø Des pontages « ADN-protéines ».
Ces lésions au niveau de l’ADN entraînent des ruptures de chromosomes en
fragments acentriques générant des micronoyaux lors de la division cellulaire. Ce sont des
entités nucléaires indépendantes qui se retrouvent hors du noyau, dans le cytosol
(Lagadic & al., 1997). Ils apparaissent sous forme de petits noyaux à côté du noyau
principal.
Les micronoyaux peuvent aussi résulter d’un dysfonctionnement au cours de la
division cellulaire gênant la migration chromosomique (Cotelle & Ferrard, 2001). Ils
proviennent alors de chromosomes entiers ou de fragments et qui, du fait de leur
migration incomplète, se retrouvent hors du noyau.
Les lésions au niveau de l’ADN peuvent également provoquer des aberrations
chromosomiques, c'est-à-dire un nombre ou une structure anormale des chromosomes,
mais également des échanges de chromatides soeurs, qui consistent en un échange
symétrique entre le matériel chromosomique entre deux chromatides sœurs.
Les agents capables de générer des dommages sur l’ADN sont dits génotoxiques.
3.4.1. Test de micronoyaux :
Des tests de génotoxicité ont été fondés sur la détection des micronoyaux. Chez
les végétaux, elle a été utilisée comme bioessai chez une macrophyte des eaux douces,
Tradescantia, afin d’étudier divers mutagènes et cancérogènes potentiels présents en
milieu aquatique à travers l’étude des anomalies méiotiques se rencontrant dans les
tétrades lors de la méiose dans les inflorescences de cette phanérogame (Ma & al., 1995).
13
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Le test de numération des micronoyaux a été proposé comme marqueur biologique
d’effets génotoxiques (Knasmüller & al., 1998). C’est un test ancien, car l’analyse des
micronoyaux était déjà utilisée par Evans et al. dès 1959 pour évaluer des dommages
génétiques chez Vicia faba (Bekaert, 1999). Actuellement, c’est un biomarqueur
régulièrement utilisé en écotoxicologie.
Il a été d’abord mis au point sur le triton (Jaylet, 1986), normalisé en 1992 par
l’AFNOR. Ce test a ensuite été étendu au Xénope par Zoll et al. en 1988 et a obtenu une
norme AFNOR en 2000 (Chenon, 2001). Pour le réaliser, on expose les organismes aux
substances que l’on veut tester, puis on laisse croître pendant une période suffisante pour
permettre la formation des micronoyaux dans les cellules en interphase par la
fragmentation chromosomique.
Les végétaux supérieurs sont également de bons systèmes génétiques pour évaluer
et surveiller les polluants environnementaux (Missini & al., 1997). C’est un test simple,
reproductible, demandant peu de matériel. De plus, il détecte des effets mutagènes très
faibles.
El Hajjouji et al. (2007) ont quant à eux montré la génotoxicité de résidus de
fabrication d’huile d’olive, qui contiennent de nombreux composés phénoliques.
Fasla (2009), a montré l’effet antimitotique et génotoxique d’extraits aqueux de
cinq plantes médicinales : Tetraclinis articulata (Vahl) Masters (feuilles); Withania
frutescens Pauquy (feuilles); Peganum harmala L. (graines); Ruta chalepensis L (feuilles)
et Haloxylon scoparium Pomel (parties aériennes) en utilisant
des cellules
méristématiques d’apex racinaires d’Allium cepa L.
4. Mécanismes de défense contre le stress oxydatif :
La plante réagit au stress en mettant en œuvre diverses stratégies de défense,
constitutives ou induites. La plante perçoit un stimulus qui engendre l’émission de
signaux. Ceux-ci sont transmis à l’intérieur de la cellule déclenchant l’activation de gènes
codant pour des enzymes du métabolisme secondaire pour synthétiser diverses molécules
de défense. (Kangasjarvi & al., 1994; Pell et al., 1997; Noctor & al., 1998 ).
Cette ligne de défense est constituée principalement de trois enzymes : la
superoxyde dismutase (SOD), la catalase et les peroxydases (POX). Ces enzymes agissent
directement sur les espèces réactives, mais leur action est parfois insuffisante. Des
14
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
systèmes plus complexes entrent alors en jeu faisant intervenir, outre des enzymes
spécialisées, des composés connus sous le nom d’antioxydants non enzymatiques.
4.1. Systèmes de défense par des enzymes antioxydants :
Les enzymes antioxydantes ont une action complémentaire sur la cascade
radicalaire au niveau du superoxyde et du peroxyde d’hydrogène, conduisant finalement à
la formation d’eau et d’oxygène moléculaire.
4.1.1. Superoxyde dismutase (EC : 1.15.1.1)
Ainsi nommée parce qu’elle opère une dismutation, c'est-à-dire une oxydoréduction
entre deux molécules identiques, dont l’une oxyde (O2-→O2) et l’autre se réduit (O2→H2O2) selon la réaction suivante (Bowler & al., 1994; Arora & al., 2002):
SOD
2O2°- + 2H+
H2O2 + O2.
Réaction (15)
Il existe plusieurs SOD, qui se différencient par la nature du métal qu’elles
contiennent et leur localisation intracellulaire (Tableau 3).
Tableau 3 : Les types de superoxyde dismutase.
Superoxyde
dismutase
Cu/Zn-SOD
Fe-SOD
Mn-SOD
localisation intracellulaire
référence
cytosol
Duke & Salin, 1983; Bowler &
al., 1994
chloroplastes, (détectable dans Salin, 1988; Bowler & al., 1994;
mitochondries et le cytosol)
Asada, 2000
exclusivement mitochondriales
Bowler & al., 1994; Del Rio et
al., 2003
4.1.2. Catalase (EC 1.11.1.6)
Les catalases sont des enzymes majoritairement peroxysomales catalysant la
dismutation du peroxyde d'hydrogène (Arora & al., 2002). Elles sont formées de quatre
chaînes polypeptidiques d’environ 500 acides aminés, comportant chacune un groupe
héminique comprenant un atome de fer. Pour catalyser la réaction, l’atome de fer réalise
une coupure hétérolytique de la liaison O-O du peroxyde d'hydrogène, créant de ce fait
15
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
une molécule d’eau et un groupement Fe(IV)=O hautement oxydant. Ce dernier peut
ensuite oxyder une autre molécule de peroxyde d'hydrogène pour donner du dioxygène et
de l’eau.
Le rôle principal de la CAT est de détoxiquer le peroxyde d’hydrogène produit à
proximité par la CTE chloroplastique, et surtout par les processus peroxysomaux de
β–oxydation et de photorespiration (Smirnoff, 1998).
2 H2O2
2 H2O + O2
Réaction (16)
4.1.3. Peroxydase (POX) (EC 1.11.1.x)
Les POX sont une large famille multigénique d’enzymes héminiques catalysant la
réduction d’un substrat oxydé en utilisant de nombreux co-substrats comme donneurs
d’électrons. Pour la majorité de ces enzymes, le substrat optimal est le peroxyde
d’hydrogène, mais elles peuvent facilement réduire des hydroperoxydes organiques ou
des peroxydes lipidiques.
4.2.. Les composés phénoliques et la détoxification des formes activées de l’oxygène
Une des originalités majeures des végétaux réside dans leurs capacités à produire
des substances naturelles très diversifiées. En effet, à côté des métabolites primaires
classiques (glucides, protides, lipides et acides nucléiques), ils accumulent fréquemment
des métabolites dits « secondaires ». Ces métabolites jouent souvent un rôle de défense de
la plante qui les fabrique (figure 7).
Une des caractéristiques des composées phénoliques, qu’ils partagent avec
l’ensemble des métabolites secondaires ; est de montrer une répartition très inégale chez
les différentes espèces, et, pour une même espèce, selon la variété et le stade d’évolution
physiologique.
De nombreuses données in vitro montrent que les flavonoïdes et de nombreux autres
composés phénoliques sont des antioxydants pouvant neutraliser les formes activées et
toxiques de l’oxygène.
Ils jouent à ce titre un rôle dans la santé humaine, soient en tant que composant de
la ration alimentaire, soit en entrant dans la composition de médicaments.
Bien que les antioxydants phénoliques puissent protéger diverses molécules
biologiques de la dégradation oxydative, en particulier l’ADN, une de leur intervention
16
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
majeur concerne les lipides (Shahidi & al., 1992), qu’il s’agissent des lipides cellulaires
ou de ceux que l’on trouve dans les produits dérivés de plantes ou des animaux.
Le caractère antioxydant des composés phénoliques se manifeste à différents
niveaux de cette chaîne, par leur action réductrice, leur capacité à piéger et neutraliser les
formes toxiques de l’oxygène, et les formes radicalaires des lipides par la chélation
possible des ions métalliques. Par ailleurs, certains d’entre eux peuvent également inhiber
la lipooxygénase : une enzyme qui catalyse l’oxydation des acides gras (Figure 6).
Dégradation oxydative des lipides (RH)
O2, lumière, ions métallique, lipooxygénase
1. Blocage ou ralentissement de
l’initiation de l’oxydation
Radicaux libres d’origine lipidique (R°, ROO°)
Propagation de l’oxydation des lipides et attaque des autres constituants fragiles
2. Réduction des radicaux libres
en forme non radicalaire moins
agressifs
Formes lipidiques non radicalaires (ROH, ROOH)
3. Réduction de certains
produits de dégradation
Produits finaux de dégradation des lipides
(Couleurs et saveurs souvent désagréables)
Figure 6 : Les trois principaux points d’intervention des antioxydants phénoliques dans la
protection des lipides contre la dégradation oxydative (Shahidi & al., 1992).
17
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Figure 7 : les polyphénols face aux stress biotiques et abiotiques. (Paiva et Dixon, 1999).
4.2.1. Flavonoïdes
Les flavonoïdes, classe importante des polyphénols, sont reconnus pour leurs
nombreuses activités biologiques telles que: les activités antivirales, anti-inflammatoires
et anticancéreuses. Ces activités sont attribuées, en partie, à la capacité de ces composés
naturels à piéger les radicaux libres. Leur activité antioxydante en tant que piégeurs de
radicaux libres et également en tant qu'inhibiteurs d’enzymes responsables de la formation
de ces espèces nocives (Favier, 2005).
Les flavonoïdes peuvent agir de différentes façons dans les processus de régulation
du stress oxydant par :
Ø Capture directe des espèces réactives de l’oxygène,
Ø Chélation de métaux de transition comme le fer (empêchant ainsi la réaction de
Fenton),
Ø Inhibition de l’activité de certaines enzymes responsables de la production des
ERO.
18
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
4.2.1.1. Capture directe de radicaux libres :
C’est la structure chimique aromatique qui confère aux flavonoïdes leurs potentiels
anti-radicalaires, c’est pourquoi les propriétés antioxydantes des flavonoïdes sont souvent
associées à leurs potentiels antiradicalaires, c'est-à-dire leur capacité à piéger les espèces
réactives de l’oxygène.
Figure 8: Chélation des radicaux libres par les flavonoïdes (Pokorny, 2001).
4.2.1.2. Inhibition enzymatique :
La xanthine oxydase (XO) catalyse l’oxydation de l’hypoxanthine et de la xanthine
en acide urique.
Plusieurs études ont montrés la relation entre la structure chimique des flavonoides
et leur activité inhibitrice de la xanthine oxydase.
5. Principaux stress environnementaux auxquels les plantes sont confrontées :
De nombreuses situations de stress biotique ou abiotique peuvent être à l’origine de
l’introduction ou de la production des ERO dans la cellule végétale :
5.1. Stress biotique :
De nombreux agents pathogènes pénètrent dans la plante, soit par voie mécanique
en forçant la résistance physique des barrières histologiques, soit par l’excrétion
d’enzymes dégradant la cuticule. Le végétal attaqué peut alors répondre par des réactions
qui limitent la pénétration du parasite, par exemple lignification des parois, ou en
sécrétant diverses substances chimiques ; soit toxiques pour le parasite (polyphénols,
19
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
phytoalexines, dérivés de phénylalanine, etc.), soit inhibitrices de protéases, amylases,
cellulases, etc., qui privent le parasite de la possibilité de se nourrir en dégradant la plante
hôte (Laval-Martin et Mazliak, 1995).
5.2. Stress abiotique :
Plusieurs stress abiotiques peuvent à l’origine du stress oxydatif, parmi ces stress, le
stress aux UV, le stress thermique, le stress par déficit hydrique, le stress aux métaux
lourds, etc.
5.2.1. Stress par déficit hydrique :
En cas de stress hydrique, on note une accumulation de radicaux libres et une
peroxydation de lipides membranaires intenses. (Sreenivasulu et al., 1999 ; Chen et al.,
2007), une dégradation de protéines (Jiang et Zhang, 2001) et des dommages au niveau
de l’ADN (Hagar et al., 1996), d’où apparition d’un stress oxydatif.
Une conséquence importante des réductions de photosynthèse en cas de sécheresse
est la synthèse de composés toxiques oxydants dans les cellules. Si l'énergie solaire captée
par les photosystèmes de la feuille n'est plus utilisée entièrement par la photosynthèse, des
formes toxiques de l'oxygène peuvent apparaître, radicaux superoxydes (O2 -), peroxyde
d'hydrogène (H2O2) et radicaux hydroxyles (OH°) (Apel et Hirt, 2004).
Différents mécanismes permettent de contrecarrer cette accumulation de radicaux
toxiques. Les caroténoïdes sont impliqués dans ce mécanisme via le cycle des
xanthophylles (Munné-Bosch et Alegre, 2000).
5.2.2. Stress salin par le chlorure de sodium (NaCl)
La salinité constitue l’un des stress abiotiques les plus répandus au niveau de la
planète et limite fortement les rendements.
Les ERO sont produites au cours du stress salin qui change la perméabilité
sélective des biomembranes en produisant une fuite membranaire qui change l’activité
enzymatique (ZhongQun et al., 2007).
5.2.3. Stress par le chlorure de mercure (HgCl2)
20
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les métaux lourds (dont la masse atomique et supérieure à 50), présents dans
l’environnement à l’état de traces (oligoéléments), sont très toxiques lorsque, absorbés par
la plante, leur concentration endocellulaire dépasse un certain seuil. (Heller et al., 1998).
Parmi l’ensemble des métaux lourds, une vingtaine d’entre eux sont indispensables
aux processus physiologiques majeurs, en particulier la respiration, la photosynthèse ou
l’assimilation des macronutriments (ex. azote, soufre, etc.) (Kabata-Pendias et Pendias,
2001). Nombre de ces métaux, Cu, Zn, Ni, Fe, Co, Se et Ba sont aussi impliqués au
niveau de processus moléculaires tels que le contrôle de l’expression des gènes ; la
biosynthèse des protéines, des acides nucléiques, des substances de croissance, de la
chlorophylle et des métabolites secondaires ; le métabolisme lipidique ou la tolérance au
stress (Rengel, 1999).
En outre, certains éléments trace peuvent se présenter sous différents états
d’oxydation. En effet, les cations comme Fe, Cu, Cr ou Mn sont capables de céder un ou
plusieurs électrons susceptibles de réduire l’oxygène et ses dérivés. La plus connue de ces
réactions est la réaction de Fenton qui se produit en présence de fer ferreux et qui conduit
à la réduction du peroxyde d’hydrogène (H2O2) en radical hydroxyle (°OH) et en anion
hydroxyle (OH-) :
Cu2+ + e
-
Cu+
Ils jouent ainsi un rôle d’accepteurs ou de donneurs d’électrons, très importants
dans les multiples systèmes enzymatiques mettant en jeu des réactions d’oxydoréduction
(Chaignon, 2001).
Les métaux lourds n’ont pas tous une fonction connue à ce jour dans le métabolisme
de la plante, et malgré la grande diversité des besoins et des niveaux de tolérance aux
métaux lourds chez les plantes, certains restent considérés comme des poisons cellulaires
pour lesquels les doses admissibles sont très faibles. On retrouve parmi les plus toxiques,
Hg, Cr, Ni, Pb et Cd (Kabata-Pendias et Pendias, 2001).
Plusieurs travaux ont montré la sensibilité de Vicia faba, aux métaux lourds, donc
c’est une espèce sensible non accumulatrice de métaux.
Parmi ces travaux, Pourrut et al. (2008) montrent la production des ROS, lors du
stress au plomb, ainsi que la génotoxicité du mercure chez la même espèce montrée par le
test de micronoyaux.
Certaines plantes accumulent des quantités inhabituelles d’éléments métalliques ;
100 mg/kg de matière sèche pour le Cd, 1000 mg/kg pour le Ni, le Cu, le Co ainsi que 10
21
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
000 mg/kg. Pour le Zn et le Mn. Ces espèces sont alors qualifiées de plantes
«hyperaccumulatrices » (ex. Alyssum bertolonii, Sebertia acuminata, Silene cobalticola,
Thlaspi caerulescens, Brassica napus, Pteris vittata) (Brooks, 1998). Ainsi, plus de 400
espèces hyperaccumulatrices sont recensées, dont plus de 300 pour le nickel et seulement
une pour le cadmium.
22
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Définition du stress oxydatif
Le stress oxydatif chez les plantes fait l’objet de très nombreuses revues
bibliographiques (Bartosz, 1997; Bolwell et Wojtaszek, 1997; Van Breusegem et al.,
2001; Potters et al., 2002; Schutzendubel et Polle, 2002; Blokhina et al., 2003; Apel et
Hirt, 2004; Foyer et Noctor, 2005; Pitzschke et al., 2006; Wormuth et al., 2007) et de
plusieurs livres (Inze et Montagu, 2001; Smirnoff et al., 2005).
Dans les systèmes biologiques, le stress oxydant est la conséquence d’un
déséquilibre entre la production d’espèces réactives oxygénées (ERO) et leur destruction
par des systèmes de défense antioxydants (Bonnefont-Rousselot et al., 2003).
Les espèces réactives oxygénées (ERO) peuvent engendrer des dommages
importants dans la structure et le métabolisme cellulaire en dégradant de nombreuses
cibles : protéines, lipides et acides nucléiques (Cadenas & Davies, 2000 ; Pincemail &
al., 1999).
Dans les conditions quotidiennes normales, les espèces réactives oxygénées (ERO)
sont produites en faible quantité comme des médiateurs tissulaires ou des résidus des
réactions énergétiques ou de défense, et cela sous le contrôle de systèmes de défense
adaptatifs par rapport au niveau de radicaux présents. Dans ces conditions, on dit que la
balance pro-oxydant/anti-oxydants est en équilibre. Cette dernière peut être rompue pour
diverses raisons en faveur du système pro-oxydant, et est alors à l’origine d’un stress
oxydant (Favier, 2003) (Figure 1).
Figure 1 : Schématisation de la balance entre les espèces réactives oxygénées (ERO) et
les antioxydants (Pourrut, 2008).
4
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
2. Définition des espèces réactives de l’oxygène
Les espèces réactives de l’oxygène (ERO) est utilisé pour la description des formes
d’oxygène qui sont énergétiquement plus réactives que l’oxygène moléculaire. Parfois,
elles sont appelées espèces oxygénées actives (EOA). Elles regroupent l’ensemble des
dérivés radicalaires de l’oxygène mais également d’autres composés non radicalaires très
réactifs (Asada, 2000 ; Foyer et Noctor, 2003 ; Edreva, 2005).
Certaines espèces réactives de l’azote (ERA ou RNS en anglais pour Reactive
Nitrogen Species) sont parfois mentionnées comme appartenant à cette classification
puisqu’elles possèdent un atome d’oxygène et qu’elles se comportent de manière similaire
(espèces généralement radicalaires, pouvoir oxydant important, générées et régulées par
l’organisme) aux ERO vis-à-vis du stress oxydant (Smirnoff, 2005).
2.1. Radicaux libres :
Les radicaux libres sont des espèces chimiques (atomes ou molécules) qui possèdent
un ou plusieurs électrons célibataires (électron non apparié) sur leurs couches externes et
capables d’existence indépendante (Halliwell et Gutteridge, 1999).
Ils peuvent être dérivés de l’oxygène (ERO) ou d’autres atomes comme l’azote
(ERN). La présence d’un électron célibataire confère aux radicaux libres une grande
réactivité (demi-vie courte) et ils peuvent être aussi bien des espèces oxydantes que
réductrices. Cette instabilité rend difficile leur mise en évidence au niveau des différents
milieux biologiques (Bonnefont-Rousselot et al., 2003) (Tableau 1).
Tableau 1: Espèces réactives de l’oxygène radicalaire et non radicalaire (Halliwell,
2006).
ERO (radicalaire)
Formule chimique
3
Oxygène moléculaire
Dioxygène singulet
Anion superoxyde
Radical hydroxyle
Radical hydroperoxyde
Radical peroxyle
Radical alkoxyle
Radical oxyde nitrique
Peroxinitrite
ERO (non radicalaires)
Hydroperoxyde
Hypochlorite
Ozone
Peroxyde d’hydrogène
O2
O2
°
O2 
OH
HOO°
ROO°
RO°
NO°
ONOO°
Formule chimique
ROOH
ClOH
O3
H2O2
1
5
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
2.2. Formation des espèces réactives de l’oxygène :
Le métabolisme cellulaire chez les végétaux produit à l’état physiologique plusieurs
variétés d’ERO (Figure 2). Dans le cas d’un stress oxydatif, ces ERO peuvent être
modulés qualitativement et quantitativement. Tous les ERO ne sont pas extrêmement
réactifs, cette réactivité étant très variable selon la nature du radical. Parmi les radicaux
formés chez les végétaux on distingue (Smirnoff, 2005) :
Ø Anion superoxyde (°O2-) ;
Ø Peroxyde d’hydrogène (H2O2) ;
Ø Radical hydroxyle (°OH).
Figure 2 : Produits de la réduction du dioxygène (R. Heller et al., 1998).
2.2.1. Anion superoxyde (°O2-) :
La source principale de la production de l’anion superoxyde est la chaîne
respiratoire mitochondriale. Il résulte de l’addition d’un électron à l’oxygène moléculaire
qui est catalysée par le cytochrome oxydase (réaction1).
Cytochrome oxydase
O2 +
e-
O2-
Réaction (1)
Il existe généralement deux sources de l’anion superoxyde : le système enzymatique
xanthine/xanthine oxydase et le système non enzymatique comme le phénazine
méthosulphate-NADH ou potassium superoxyde selon les réactions 2 et 3.
Xanthine oxydase
Acide urique + 2O2°- + 2H+
Xanthine + 2O2 + H2O
Réaction (2)
NADPH oxydase
2O2 + NADPH
2O2°- + NADP+ H+
6
Réaction (3).
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
2.2.2. Péroxyde d’hydrogène (H2O2) :
La combinaison du radical superoxyde avec deux protons (H+) conduit à la
formation du peroxyde d’hydrogène (H2O2).
H2O2 n’est pas un radical libre mais une molécule avec tous ses électrons appariés
qui présente une toxicité par l’intermédiaire des réactions de type Fenton (5) (présence de
cations métalliques comme Fe2+ ou Cu2+) (Wardman et Candeias, 1996).
SOD
2O2- + 2 H
H2O2 ·- + O2
Réaction (4)
Fe 2+ + H2O2
Fe 2++ OH-+°OH
Réaction (5)
2.2.3. Radical hydroxyle (°OH):
Le radical hydroxyle (°OH) est très réactif, il se forme soit par la dégradation du
peroxyde d’hydrogène en présence de métaux de transition sous leur forme réduite
(réaction 5), ou par son action avec le radical superoxyde selon la réaction de Haber
Weiss
(Réaction 6).
HO-OH + O2°-
O2+-OH+°OH
Réaction (6)
2.3. Sources des espèces réactives de l’oxygène dans la cellule végétale
Chez les plantes, il existe plusieurs sources cellulaires d’espèces réactives de
l’oxygène localisées à divers endroits de la cellule (figure 3, tableau 2), et qui sont
produites de façon permanente durant le métabolisme normale et durant les périodes de
stress. Ces sources incluent :
Ø Les chaînes de transport d’électrons (CTE) des chloroplastes;
Ø Les chaînes de transport d’électrons (CTE) des mitochondries;
Ø La photorespiration dans les peroxysomes ;
Ø Certaines enzymes comme les glycolate oxydases, la xanthine oxydase et les
enzymes de l’oxydation des acides gras dans le peroxysome ;
Ø L’amine oxydase et l’oxalate oxydase dans l’apoplaste ;
Ø Les molécules photosensibilatrices comme la chlorophylle.
7
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Tableau 2: Origines et localisations des espèces réactives de l’oxygène (Smirnoff ,
2005).
Origine
Localisation
ERO
Photosynthèse, PSI ou PSII
Chloroplaste
O2°
Respiration (transport d’électrons)
Mitochondrie
O2°
Glycolate oxydase
Peroxysome
H2O2
Chlorophylles excitées
chloroplaste
O2°
NADPH oxydase
Membrane cellulaire
O2°
Peroxysome
H2O2
b-oxydation des acides gras
Oxalate oxydase
Apoplaste
H2O2
Xanthine oxydase
Peroxysome
O2°
2+
Peroxydases, Mn et NADH
Membrane cellulaire
H2O2
Amine oxydase
Apoplaste
H2O2, O2°
2.3.1. Chloroplastes et l’appareil photosynthétique
Le chloroplaste est souvent considéré comme étant la principale source d’ERO chez
les organismes photosynthétiques (Foyer & Noctor, 2003; Edreva, 2005; Asada, 2006).
En effet, de nombreuses situations de stress abiotiques entraînent une inhibition de la
photosynthèse et les électrons qui ne participent plus à la fixation du CO2 vont entraîner la
production et l’accumulation de ROS. Durant les conditions de photoinhibition, la
carboxylation du ribulose 1,5-biphosphate (RuBP) est inhibée, favorisant son oxygénation
et entraînant la production de phosphoglycolate. Celui-ci est transporté vers le
peroxysome où il est converti en glyoxylate par la glycolate oxydase, produisant ainsi le
peroxyde d’hydrogène. Les chloroplastes et les peroxysomes sont ainsi considérés comme
« capteurs » des changements environnementaux (figure 3). Les ROS se comportent donc
comme signaux
« rédox », dérivés des chloroplastes, et sont susceptibles de réguler
l’expression de gènes de la réponse et de l’adaptation au stress (Parent & al., 2008).
2 .3.2.Peroxysomes
Les peroxysomes sont des vésicules cytoplasmiques minuscules (0,5 µm de
diamètre) entourées d’une membrane simple contenant des oxydases et des enzymes
spécifiques du métabolisme du peroxyde d’hydrogène (Marouf & Reynaud, 2007). Ils
sont le siège d’une forte activité métabolique très centrée sur le métabolisme oxydatif
(Corpas & al., 2001; Nyathi & Baker, 2006), et ils possèdent de nombreux systèmes
antioxydants et prooxydants.
8
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les deux principales sources d’espèces réactives oxygénées peroxysomales sont la
β-oxydation des acides gras et la photorespiration (Corpas & al., 2001; Nyathi & Baker,
2006).
2.3.2.1. β-oxydation
La β-oxydation est un processus fondamental et commun chez les animaux, les
levures et les plantes. Les composés dérivés de la β-oxydation sont impliqués dans un très
grand nombre de processus cellulaires parmi lesquels l’oxydation de l’acyl CoA par la
l’acyl CoA-oxydase qui entraîne la réduction du FAD en FADH2 (Baker et al., 2006). La
régénération du cofacteur s’effectue par la réduction d’une molécule d’O2 entraînant la
formation d’H2O2 (Foerster & al., 1981; Baker & al., 2006).
Acyl CoA + FAD
O2 + FADH2
2-trans-enoyl CoA + FADH2
H2O2 + FAD
Réaction (7)
Réaction (8)
2.3.2.2. Photorespiration :
La photorespiration est une réaction étroitement liée à la photosynthèse et qui chez
les végétaux supérieurs, conduit à la fixation enzymatique de l’oxygène (O2) et au rejet de
dioxyde de carbone (CO2), interférant avec le processus photosynthétique et diminuant
son efficacité (Marouf & Reynaud, 2007). La photorespiration est un processus vital
pour les plantes. Bien qu’il apparaisse comme un mécanisme coûteux en énergie et peu
rentable, ce mécanisme physiologique remplit le rôle de « soupape de sécurité » du
photosystème, en évitant la saturation de la CTE chloroplastique (Wingler & al., 2000).
La photorespiration est un processus complexe illustrant bien les échanges de métabolites
entre les différents composants cellulaires. Elle se déroule dans quatre compartiments
cellulaires : chloroplastes, peroxysomes, mitochondries (figure 3), auxquels s’adjoint le
cytosol en tant que milieu de transit (Foyer et Noctor, 2000).
2.3.3 Mitochondries et chaîne respiratoire :
Chez les animaux, les mitochondries constituent la source principale de ROS. Chez
les plantes, la production de ROS par les mitochondries a été historiquement minimisée
par rapport à celle des chloroplastes. Cependant, avec l’identification de l’alternative
oxydase (AOX), la mitochondrie pourrait devenir un acteur important dans la régulation
9
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
du stress oxydatif chez les plantes. En effet, cette enzyme agit comme une « soupape de
sécurité », contrôlant la réduction du pool d’ubiquinone, source importante de ROS. Pour
cette raison, la mitochondrie a été proposée comme médiateur entre les changements
métaboliques, la production de ROS et l’induction de gènes. Cependant, la contribution de
la mitochondrie à la production de ROS lors de la réponse au stress reste encore mal
définie (Parent et al., 2008).
Figure 3: Sites de production intra-organites des formes réactives de l’oxygène dans la
cellule végétale (Bolwell, 2002). APX: ascorbate peroxydase; PSI: photosystème I; PSII :
photosystème II ; AOX : alternative oxydase ; Fd : ferodoxyne (RuBP) ribulose 1,5-biphosphate.
3. Conséquences du stress oxydatif :
Lors d’un stress oxydant, les espèces réactives oxygénées endommagent les
macromolécules dans les cellules, notamment les lipides, les protéines et l’ADN.
3.1. Peroxydation lipidique (lipoperoxydation):
Les lipides et, principalement, les acides gras polyinsaturés de la membrane
cellulaire représentent la première ligne attaquée par les ERO induisant des processus de
péroxydations lipidiques et conduisant à la formation de plusieurs produits : aldéhydes,
alkènes, hydroxyalkenols et d’autres incluant des composés utilisés comme marqueurs de
10
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
la lipopéroxydation. C’est le cas du malondialdehyde (MDA) et du 4-hydroxynonénal
(4HNE). Ce processus se déroule en trois phases (Spiteller, 1998) (figure 8):
Ø Phase d’initiation ;
Ø Phase de propagation ;
Ø Phase de terminaison.
3.1.1. Phase d’initiation :
Cette phase consiste en la formation d’un composé radicalaire (radical lipidique)
très réactif activé par un initiateur radicalaire comme l’oxygène singulet (réaction (1)).
Initiateur (I)
RH
IH+R°
Réaction (9)
3.1.2. Phase de propagation :
Au cours de cette phase le radical hydroxyle arrache un atome d’hydrogène entre
deux doubles liaisons est oxydé en radical peroxyle (réaction). Cette réaction forme une
réaction en chaîne car le radical peroxyle formé se transforme en peroxyde au contact d'un
autre acide gras qui forme un nouveau radical (réaction 2).
R°
+ O2
ROO°+ RH
ROO°
Réaction (10)
ROOH + R°
Réaction (11)
3.1.3. Phase de terminaison :
Cette phase correspond à une rencontre entre deux composés radicalaires pour la
formation des composés stables (réactions 12, 13 et 14).
ROO° + ROO°
ROO° + R°
R°
Réaction (12)
Produits non radicalaires.
+ R°
Réaction (13)
Réaction (14)
Figure 4: Les différentes étapes de la peroxydation lipidique (Spiteller, 1998).
11
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
3.2. Marqueurs de la lipoperoxydation:
Intérêts du dosage du malondialdéhyde (MDA):
Le dosage du malondialdéhyde (MDA), ou des substances réagissant à l’acide
thiobarbituriques (TBARS) est utilisé depuis les années cinquante pour estimer la
péroxydation des lipides dans les membranes et les systèmes biologiques (Roussselot &
al., 2003).
Le MDA est formé à partir d’une auto-oxydation et d’une dégradation
enzymatique des acides gras polyinsaturés dans les cellules, lors d’un stress oxydatif. Le
dosage permet donc de mettre en évidence les stress environnementaux pouvant induire
une variation de ce niveau d’oxydation des lipides
Figure 5 : Réaction entre le MDA et l’acide thiobarbiturique.
3.3. Oxydation des protéines :
Les ERO sont en effet capables de réagir avec différents acides
aminés des
chaînes de protéines, altérant également leur fonction. Les protéines les plus touchées sont
celles comportant un groupement sulphydryle (-SH), comme c’est le cas pour de
nombreuses enzymes et protéines de transport (Stadtman & Levine, 2000). Le peroxyde
d’hydrogène, mais surtout le radical hydroxyle sont capables d’oxyder ces groupements,
conduisant à l’inactivation de certaines enzymes. En particulier, la présence de radicaux
hydroxyles est à l’origine de dégradations irréversibles des protéines, par la formation de
groupements carbonyles sur la chaîne latérale de certains acides aminés.
3.4. Oxydation de l’ADN :
L’ADN, qu’il soit nucléaire ou mitochondrial, est également une cible majeure des
ERO. Ceux-ci peuvent en effet interagir avec les désoxyriboses de l’ADN mais aussi avec
ses bases puriques et pyrimidiques. L’atteinte de l’ADN implique le franchissement
préalable de toutes les barrières de défense mises en place par les végétaux, la potentialité
12
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
de détoxication des cellules ou de l’organisme et enfin du potentiel des systèmes de
réparation de l’ADN de l’organisme. Plusieurs altérations ont été observées :
Ø Une formation de bases oxydées ;
Ø Des sites abasiques qui sont une partie de l’ADN dépourvue d’une base purique
ou pyrimidique et ayant perdu l’information génétique par rupture de la liaison entre une
base et le désoxyribose.
Ø Des cassures au niveau des brins d’ADN, qui peuvent être double ou simple
brin.
Ø Une Apparition d’adduits à l’ADN. Ils correspondent à la formation de produits
d’addition entre le polluant et les nucléotides (adduits pour addition et produits), suite à
la peroxydation des lipides.
Ø Des pontages « ADN-protéines ».
Ces lésions au niveau de l’ADN entraînent des ruptures de chromosomes en
fragments acentriques générant des micronoyaux lors de la division cellulaire. Ce sont des
entités nucléaires indépendantes qui se retrouvent hors du noyau, dans le cytosol
(Lagadic & al., 1997). Ils apparaissent sous forme de petits noyaux à côté du noyau
principal.
Les micronoyaux peuvent aussi résulter d’un dysfonctionnement au cours de la
division cellulaire gênant la migration chromosomique (Cotelle & Ferrard, 2001). Ils
proviennent alors de chromosomes entiers ou de fragments et qui, du fait de leur
migration incomplète, se retrouvent hors du noyau.
Les lésions au niveau de l’ADN peuvent également provoquer des aberrations
chromosomiques, c'est-à-dire un nombre ou une structure anormale des chromosomes,
mais également des échanges de chromatides soeurs, qui consistent en un échange
symétrique entre le matériel chromosomique entre deux chromatides sœurs.
Les agents capables de générer des dommages sur l’ADN sont dits génotoxiques.
3.4.1. Test de micronoyaux :
Des tests de génotoxicité ont été fondés sur la détection des micronoyaux. Chez
les végétaux, elle a été utilisée comme bioessai chez une macrophyte des eaux douces,
Tradescantia, afin d’étudier divers mutagènes et cancérogènes potentiels présents en
milieu aquatique à travers l’étude des anomalies méiotiques se rencontrant dans les
tétrades lors de la méiose dans les inflorescences de cette phanérogame (Ma & al., 1995).
13
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Le test de numération des micronoyaux a été proposé comme marqueur biologique
d’effets génotoxiques (Knasmüller & al., 1998). C’est un test ancien, car l’analyse des
micronoyaux était déjà utilisée par Evans et al. dès 1959 pour évaluer des dommages
génétiques chez Vicia faba (Bekaert, 1999). Actuellement, c’est un biomarqueur
régulièrement utilisé en écotoxicologie.
Il a été d’abord mis au point sur le triton (Jaylet, 1986), normalisé en 1992 par
l’AFNOR. Ce test a ensuite été étendu au Xénope par Zoll et al. en 1988 et a obtenu une
norme AFNOR en 2000 (Chenon, 2001). Pour le réaliser, on expose les organismes aux
substances que l’on veut tester, puis on laisse croître pendant une période suffisante pour
permettre la formation des micronoyaux dans les cellules en interphase par la
fragmentation chromosomique.
Les végétaux supérieurs sont également de bons systèmes génétiques pour évaluer
et surveiller les polluants environnementaux (Missini & al., 1997). C’est un test simple,
reproductible, demandant peu de matériel. De plus, il détecte des effets mutagènes très
faibles.
El Hajjouji et al. (2007) ont quant à eux montré la génotoxicité de résidus de
fabrication d’huile d’olive, qui contiennent de nombreux composés phénoliques.
Fasla (2009), a montré l’effet antimitotique et génotoxique d’extraits aqueux de
cinq plantes médicinales : Tetraclinis articulata (Vahl) Masters (feuilles); Withania
frutescens Pauquy (feuilles); Peganum harmala L. (graines); Ruta chalepensis L (feuilles)
et Haloxylon scoparium Pomel (parties aériennes) en utilisant
des cellules
méristématiques d’apex racinaires d’Allium cepa L.
4. Mécanismes de défense contre le stress oxydatif :
La plante réagit au stress en mettant en œuvre diverses stratégies de défense,
constitutives ou induites. La plante perçoit un stimulus qui engendre l’émission de
signaux. Ceux-ci sont transmis à l’intérieur de la cellule déclenchant l’activation de gènes
codant pour des enzymes du métabolisme secondaire pour synthétiser diverses molécules
de défense. (Kangasjarvi & al., 1994; Pell et al., 1997; Noctor & al., 1998 ).
Cette ligne de défense est constituée principalement de trois enzymes : la
superoxyde dismutase (SOD), la catalase et les peroxydases (POX). Ces enzymes agissent
directement sur les espèces réactives, mais leur action est parfois insuffisante. Des
14
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
systèmes plus complexes entrent alors en jeu faisant intervenir, outre des enzymes
spécialisées, des composés connus sous le nom d’antioxydants non enzymatiques.
4.1. Systèmes de défense par des enzymes antioxydants :
Les enzymes antioxydantes ont une action complémentaire sur la cascade
radicalaire au niveau du superoxyde et du peroxyde d’hydrogène, conduisant finalement à
la formation d’eau et d’oxygène moléculaire.
4.1.1. Superoxyde dismutase (EC : 1.15.1.1)
Ainsi nommée parce qu’elle opère une dismutation, c'est-à-dire une oxydoréduction
entre deux molécules identiques, dont l’une oxyde (O2-→O2) et l’autre se réduit (O2→H2O2) selon la réaction suivante (Bowler & al., 1994; Arora & al., 2002):
SOD
2O2°- + 2H+
H2O2 + O2.
Réaction (15)
Il existe plusieurs SOD, qui se différencient par la nature du métal qu’elles
contiennent et leur localisation intracellulaire (Tableau 3).
Tableau 3 : Les types de superoxyde dismutase.
Superoxyde
dismutase
Cu/Zn-SOD
Fe-SOD
Mn-SOD
localisation intracellulaire
référence
cytosol
Duke & Salin, 1983; Bowler &
al., 1994
chloroplastes, (détectable dans Salin, 1988; Bowler & al., 1994;
mitochondries et le cytosol)
Asada, 2000
exclusivement mitochondriales
Bowler & al., 1994; Del Rio et
al., 2003
4.1.2. Catalase (EC 1.11.1.6)
Les catalases sont des enzymes majoritairement peroxysomales catalysant la
dismutation du peroxyde d'hydrogène (Arora & al., 2002). Elles sont formées de quatre
chaînes polypeptidiques d’environ 500 acides aminés, comportant chacune un groupe
héminique comprenant un atome de fer. Pour catalyser la réaction, l’atome de fer réalise
une coupure hétérolytique de la liaison O-O du peroxyde d'hydrogène, créant de ce fait
15
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
une molécule d’eau et un groupement Fe(IV)=O hautement oxydant. Ce dernier peut
ensuite oxyder une autre molécule de peroxyde d'hydrogène pour donner du dioxygène et
de l’eau.
Le rôle principal de la CAT est de détoxiquer le peroxyde d’hydrogène produit à
proximité par la CTE chloroplastique, et surtout par les processus peroxysomaux de
β–oxydation et de photorespiration (Smirnoff, 1998).
2 H2O2
2 H2O + O2
Réaction (16)
4.1.3. Peroxydase (POX) (EC 1.11.1.x)
Les POX sont une large famille multigénique d’enzymes héminiques catalysant la
réduction d’un substrat oxydé en utilisant de nombreux co-substrats comme donneurs
d’électrons. Pour la majorité de ces enzymes, le substrat optimal est le peroxyde
d’hydrogène, mais elles peuvent facilement réduire des hydroperoxydes organiques ou
des peroxydes lipidiques.
4.2.. Les composés phénoliques et la détoxification des formes activées de l’oxygène
Une des originalités majeures des végétaux réside dans leurs capacités à produire
des substances naturelles très diversifiées. En effet, à côté des métabolites primaires
classiques (glucides, protides, lipides et acides nucléiques), ils accumulent fréquemment
des métabolites dits « secondaires ». Ces métabolites jouent souvent un rôle de défense de
la plante qui les fabrique (figure 7).
Une des caractéristiques des composées phénoliques, qu’ils partagent avec
l’ensemble des métabolites secondaires ; est de montrer une répartition très inégale chez
les différentes espèces, et, pour une même espèce, selon la variété et le stade d’évolution
physiologique.
De nombreuses données in vitro montrent que les flavonoïdes et de nombreux autres
composés phénoliques sont des antioxydants pouvant neutraliser les formes activées et
toxiques de l’oxygène.
Ils jouent à ce titre un rôle dans la santé humaine, soient en tant que composant de
la ration alimentaire, soit en entrant dans la composition de médicaments.
Bien que les antioxydants phénoliques puissent protéger diverses molécules
biologiques de la dégradation oxydative, en particulier l’ADN, une de leur intervention
16
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
majeur concerne les lipides (Shahidi & al., 1992), qu’il s’agissent des lipides cellulaires
ou de ceux que l’on trouve dans les produits dérivés de plantes ou des animaux.
Le caractère antioxydant des composés phénoliques se manifeste à différents
niveaux de cette chaîne, par leur action réductrice, leur capacité à piéger et neutraliser les
formes toxiques de l’oxygène, et les formes radicalaires des lipides par la chélation
possible des ions métalliques. Par ailleurs, certains d’entre eux peuvent également inhiber
la lipooxygénase : une enzyme qui catalyse l’oxydation des acides gras (Figure 6).
Dégradation oxydative des lipides (RH)
O2, lumière, ions métallique, lipooxygénase
1. Blocage ou ralentissement de
l’initiation de l’oxydation
Radicaux libres d’origine lipidique (R°, ROO°)
Propagation de l’oxydation des lipides et attaque des autres constituants fragiles
2. Réduction des radicaux libres
en forme non radicalaire moins
agressifs
Formes lipidiques non radicalaires (ROH, ROOH)
3. Réduction de certains
produits de dégradation
Produits finaux de dégradation des lipides
(Couleurs et saveurs souvent désagréables)
Figure 6 : Les trois principaux points d’intervention des antioxydants phénoliques dans la
protection des lipides contre la dégradation oxydative (Shahidi & al., 1992).
17
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Figure 7 : les polyphénols face aux stress biotiques et abiotiques. (Paiva et Dixon, 1999).
4.2.1. Flavonoïdes
Les flavonoïdes, classe importante des polyphénols, sont reconnus pour leurs
nombreuses activités biologiques telles que: les activités antivirales, anti-inflammatoires
et anticancéreuses. Ces activités sont attribuées, en partie, à la capacité de ces composés
naturels à piéger les radicaux libres. Leur activité antioxydante en tant que piégeurs de
radicaux libres et également en tant qu'inhibiteurs d’enzymes responsables de la formation
de ces espèces nocives (Favier, 2005).
Les flavonoïdes peuvent agir de différentes façons dans les processus de régulation
du stress oxydant par :
Ø Capture directe des espèces réactives de l’oxygène,
Ø Chélation de métaux de transition comme le fer (empêchant ainsi la réaction de
Fenton),
Ø Inhibition de l’activité de certaines enzymes responsables de la production des
ERO.
18
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
4.2.1.1. Capture directe de radicaux libres :
C’est la structure chimique aromatique qui confère aux flavonoïdes leurs potentiels
anti-radicalaires, c’est pourquoi les propriétés antioxydantes des flavonoïdes sont souvent
associées à leurs potentiels antiradicalaires, c'est-à-dire leur capacité à piéger les espèces
réactives de l’oxygène.
Figure 8: Chélation des radicaux libres par les flavonoïdes (Pokorny, 2001).
4.2.1.2. Inhibition enzymatique :
La xanthine oxydase (XO) catalyse l’oxydation de l’hypoxanthine et de la xanthine
en acide urique.
Plusieurs études ont montrés la relation entre la structure chimique des flavonoides
et leur activité inhibitrice de la xanthine oxydase.
5. Principaux stress environnementaux auxquels les plantes sont confrontées :
De nombreuses situations de stress biotique ou abiotique peuvent être à l’origine de
l’introduction ou de la production des ERO dans la cellule végétale :
5.1. Stress biotique :
De nombreux agents pathogènes pénètrent dans la plante, soit par voie mécanique
en forçant la résistance physique des barrières histologiques, soit par l’excrétion
d’enzymes dégradant la cuticule. Le végétal attaqué peut alors répondre par des réactions
qui limitent la pénétration du parasite, par exemple lignification des parois, ou en
sécrétant diverses substances chimiques ; soit toxiques pour le parasite (polyphénols,
19
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
phytoalexines, dérivés de phénylalanine, etc.), soit inhibitrices de protéases, amylases,
cellulases, etc., qui privent le parasite de la possibilité de se nourrir en dégradant la plante
hôte (Laval-Martin et Mazliak, 1995).
5.2. Stress abiotique :
Plusieurs stress abiotiques peuvent à l’origine du stress oxydatif, parmi ces stress, le
stress aux UV, le stress thermique, le stress par déficit hydrique, le stress aux métaux
lourds, etc.
5.2.1. Stress par déficit hydrique :
En cas de stress hydrique, on note une accumulation de radicaux libres et une
peroxydation de lipides membranaires intenses. (Sreenivasulu et al., 1999 ; Chen et al.,
2007), une dégradation de protéines (Jiang et Zhang, 2001) et des dommages au niveau
de l’ADN (Hagar et al., 1996), d’où apparition d’un stress oxydatif.
Une conséquence importante des réductions de photosynthèse en cas de sécheresse
est la synthèse de composés toxiques oxydants dans les cellules. Si l'énergie solaire captée
par les photosystèmes de la feuille n'est plus utilisée entièrement par la photosynthèse, des
formes toxiques de l'oxygène peuvent apparaître, radicaux superoxydes (O2 -), peroxyde
d'hydrogène (H2O2) et radicaux hydroxyles (OH°) (Apel et Hirt, 2004).
Différents mécanismes permettent de contrecarrer cette accumulation de radicaux
toxiques. Les caroténoïdes sont impliqués dans ce mécanisme via le cycle des
xanthophylles (Munné-Bosch et Alegre, 2000).
5.2.2. Stress salin par le chlorure de sodium (NaCl)
La salinité constitue l’un des stress abiotiques les plus répandus au niveau de la
planète et limite fortement les rendements.
Les ERO sont produites au cours du stress salin qui change la perméabilité
sélective des biomembranes en produisant une fuite membranaire qui change l’activité
enzymatique (ZhongQun et al., 2007).
5.2.3. Stress par le chlorure de mercure (HgCl2)
20
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les métaux lourds (dont la masse atomique et supérieure à 50), présents dans
l’environnement à l’état de traces (oligoéléments), sont très toxiques lorsque, absorbés par
la plante, leur concentration endocellulaire dépasse un certain seuil. (Heller et al., 1998).
Parmi l’ensemble des métaux lourds, une vingtaine d’entre eux sont indispensables
aux processus physiologiques majeurs, en particulier la respiration, la photosynthèse ou
l’assimilation des macronutriments (ex. azote, soufre, etc.) (Kabata-Pendias et Pendias,
2001). Nombre de ces métaux, Cu, Zn, Ni, Fe, Co, Se et Ba sont aussi impliqués au
niveau de processus moléculaires tels que le contrôle de l’expression des gènes ; la
biosynthèse des protéines, des acides nucléiques, des substances de croissance, de la
chlorophylle et des métabolites secondaires ; le métabolisme lipidique ou la tolérance au
stress (Rengel, 1999).
En outre, certains éléments trace peuvent se présenter sous différents états
d’oxydation. En effet, les cations comme Fe, Cu, Cr ou Mn sont capables de céder un ou
plusieurs électrons susceptibles de réduire l’oxygène et ses dérivés. La plus connue de ces
réactions est la réaction de Fenton qui se produit en présence de fer ferreux et qui conduit
à la réduction du peroxyde d’hydrogène (H2O2) en radical hydroxyle (°OH) et en anion
hydroxyle (OH-) :
Cu2+ + e
-
Cu+
Ils jouent ainsi un rôle d’accepteurs ou de donneurs d’électrons, très importants
dans les multiples systèmes enzymatiques mettant en jeu des réactions d’oxydoréduction
(Chaignon, 2001).
Les métaux lourds n’ont pas tous une fonction connue à ce jour dans le métabolisme
de la plante, et malgré la grande diversité des besoins et des niveaux de tolérance aux
métaux lourds chez les plantes, certains restent considérés comme des poisons cellulaires
pour lesquels les doses admissibles sont très faibles. On retrouve parmi les plus toxiques,
Hg, Cr, Ni, Pb et Cd (Kabata-Pendias et Pendias, 2001).
Plusieurs travaux ont montré la sensibilité de Vicia faba, aux métaux lourds, donc
c’est une espèce sensible non accumulatrice de métaux.
Parmi ces travaux, Pourrut et al. (2008) montrent la production des ROS, lors du
stress au plomb, ainsi que la génotoxicité du mercure chez la même espèce montrée par le
test de micronoyaux.
Certaines plantes accumulent des quantités inhabituelles d’éléments métalliques ;
100 mg/kg de matière sèche pour le Cd, 1000 mg/kg pour le Ni, le Cu, le Co ainsi que 10
21
CHAPITRE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
000 mg/kg. Pour le Zn et le Mn. Ces espèces sont alors qualifiées de plantes
«hyperaccumulatrices » (ex. Alyssum bertolonii, Sebertia acuminata, Silene cobalticola,
Thlaspi caerulescens, Brassica napus, Pteris vittata) (Brooks, 1998). Ainsi, plus de 400
espèces hyperaccumulatrices sont recensées, dont plus de 300 pour le nickel et seulement
une pour le cadmium.
22
CHAPITRE II : RAPPEL BOTANIQUE
1. Description de la famille des Anacardiacées :
La famille principalement tropicale d’arbres et arbustes comprend environ quatre
cent trente espèces renfermant des résines ou une sève laiteuse acide et des écorces
résineuses. Feuilles habituellement alternes, simples ou composées. Fleurs petites en
grappes, tétramères mais généralement à10 étamines. Ovaires uniloculaire avec 1 ovule
ou rarement 2-5 loges ; 1-3 styles, largement séparés. Fruit généralement charnu avec un
noyau (Seigue, 1985).
2. Genre de Pistacia (Pistachier) (Polunin et Huxley, 1971):
Le genre Pistacia de la famille d’anacardiacées, comprend onze espèces. Son aire
est discontinue et compte quatre régions phytogéographiques : Méditerranéenne, iranotouranienne, sino-japonaise et mexicaine.
Le genre est dioïque. Il est caractérisé par des feuilles composées, pennées,
généralement persistantes de 3-25 folioles, style persistant au sommet du fruit ; pétales
absents Les grappes de fleurs males sont généralement compactes et plus petites que celle
des fleurs femelles qui sont toujours lâches, érigées ou dispersées latéralement sur les
rameaux. Les fruits sont des drupes.
Dans le bassin méditerranéen ; on trouve, à l’état spontané, Pistacia lentiscus,
Pistacia atlantica, Pistacia terebinthus, Pistacia khinjuk, Pistacia palestina. Enfin
Pistacia vera, originaire de l’Iran et de l’Inde, cultivé pour ses fruits, est subspontané dans
presque tous les pays méditerranéens.
3. Monographie de Pistacia atlantica Desf. :
3.1. Position systématique de Pistacia atlantica Desf. selon APGII (2005):
Embranchement
Sous-embranchement
Classe
Sous classe
Ordre
Famille
: Spermaphytes
: Angiospermes.
: Eu-dicotylédones.
: Rosidae.
: Sapindales.
: Anacardiaceae.
24
CHAPITRE II : RAPPEL BOTANIQUE
3.2. Noms vernaculaires:
Nom arabe: betoum.
Nom Local : betouma
Nom Berbère : Igth
Nom Français : Pistachier de l'Atlas.
Nom Anglais: Atlas mastic tree.
3.3. Description botanique :
C’est un bel arbre dioïque, à odeur résineuse,
Son tronc bien individualisé et à frondaison hémisphérique peut mesurer 1m de
diamètre.
Les feuilles à rachis finement ailé à folioles (lancéolées) impaires 3-5 ×1-1.5cm,
obtuses au sommet (figure9).
Le fruit est une drupe globuleuse, sensiblement ovoïde, de 5-6 mm, jaune puis bleu
foncé à maturité, elle contient un seul noyau osseux ne contenant qu’une seule graine.
Cette espèce préfère les terrains argileux et les alluvions de plaines (Quezel et
Santa, 1963; Seigue, 1985).
3.4. Aire de répartition géographique :
Native dans le maquis méditerranéen et l’est méditerranéen en Grèce, à Chypre, en
Turquie, en Syrie, Palestine, Crimée, dans le Caucase, en Iran, Afghanistan et jusqu’en
Inde.
Existe également dans le sud d’Afrique à l’état disséminé dans l’étage aride et
subaride. En Algérie, on le retrouve dans la région de Djelfa ; Laghouat et Ghardaïa
(Monjauze, 1980 ; Hadj Hassan et Kardouch, 1995), trouvé dans les hauts-plateaux et
l'Atlas saharien en association avec le Zizyphus lotus et le pin d'Alep, peut vivre dans des
conditions climatiques les plus sévères
Il peut atteindre une altitude de 2000m dans l’Atlas saharien.
Les conditions climatiques de la plupart des régions agricoles montagneuses et semi
arides de notre pays resté favorable pour son extension (Belhadj; 2003).
3.5. Phytochimie et propriétés thérapeutiques:
Cette plante est caractérisée par :
25
CHAPITRE II : RAPPEL BOTANIQUE
Ø Abondance des flavonoïdes glycosides, de l’acide gallique et ses dérivés ainsi que
des coumarines (Umadevi et al., 1988 ; Kawashty et al., 2000;. Benhammou et al.,
2008).
Ø La présence de plusieurs composés des huiles essentielles comme α-pinene a été
récemment rapportée par (Delazar et al., 2004),
Ø Des monoterpènes et des sesquiterpènes comme terpinen-4-ol et elemol (Barrero
et al., 2003).
3.6. Utilisations traditionnelles et propriétés pharmaceutiques :
Cette plante est utilisée dans le traitement de l’ulcère peptique, les maladies du
système
broncho-pulmonaire
et
pour
soigner
les
problèmes
bucco-gingivaux
(Bellakhdar, 1997 ; Delazar et al., 2004).
Elle comprend une activité hypoglycémiante qui est probablement en relation avec
l’activité l’inhibitrice de l’α amylase (Hamdan et Afifi, 2004).
Une étude faite par (Benhammou et al., 2008) a rapporté que les feuilles de P.
atlantica possèdent des propriétés antioxydante et antimicrobienne.
Les fruits sont utilisés comme anti-diarrhéique (Yousfi et al., 2002).
Photo 1: Photographie de Pistacia atlantica Desf.
i
Figure 9: Feuilles de Pistacia atlantica Desf. (Seigue, 1985).
i
http://www.anpe.nat.tn/arboretum/Plantes.htm
26
CHAPITRE III : MATERIEL ET METHODES.
1. Modèle expérimentale :
1.1. Choix du modèle expérimentale :
La littérature concernant la réponse précoce des plantes à divers stress abiotiques
nous a permis de choisir Vicia faba comme modèle expérimental.
Vicia faba fait partie des bioessais validés par le programme AFNOR (asssociation
française de normalisation a été crée en 1926) en 2004 (AFNOR NF T 90-327).
A l’échelle internationale, son utilisation dans des études d’écotoxicologie est
croissante depuis plusieurs années. (Loudes, 2002; Pourrut, 2003; El Hajjouji et al.,
2007; Marcato, 2007; Cecchi, 2008)
Vicia faba présente de nombreux intérêts:
Ø Biomasse importante ;
Ø Croissance rapide ;
Ø sensibilité aux métaux ;
Ø Taille cellulaire importante qui facilite l’utilisation de la technique des
micronoyaux.
1.2. Culture et échantillonnage :
Les graines de Vicia faba (Aguadulce) sélectionnées de même taille sont mises à
imbiber pendant vingt-quatre heures dans de l’eau potable, à température ambiante. Elles
sont ensuite écossées, rincées à l’eau puis plongées dans une solution d’hypochlorite de
sodium à 2% pendant 10 mn et rincées plusieurs fois à l’eau distillée.
180 graines sont réparties dans 12 boites de Pétri à raison de quinze graines par
boite sur du papier filtre imbibé d’eau distillée stérile et mises dans l’étuve dont la
température est maintenue à 22 °C pendant sept jours.
Au cours de la germination, l’arrosage se fait tous les deux jours à l’eau distillée,
jusqu’à apparition des premières feuilles.
2. Application des stress :
Ø Stress salin : les jeunes plantules sont arrosées avec une solution au chlorure
de sodium à une concentration de 100 mM,
Ø Stress hydrique : une solution au Polyéthylène glycol (PEG 6000) préparée
à une concentration de 10 %,
28
CHAPITRE III : MATERIEL ET METHODES.
Ø Stress aux métaux lourds : ce stress a été réalisé par l’utilisation du
chlorure de mercure (HgCl2), à concentrations croissantes : 5,10 et 15 mg/L.
Les jeunes plantules ont été arrosées avec ces différentes solutions pendant 48
heures à une température de 22 °C parallèlement au témoin arrosé avec de l’eau distillée
stérile.
3. Mesure de la défense antioxydante :
3.1. Dosage des polyphénols et des flavonoïdes :
Le dosage des polyphénols et des flavonoides a été réalisé sur les deux parties,
épicotylédones et hypocotylédones (figure 10).
50 mg des parties prélevées sont pesés, broyés dans 2,5 mL d’éthanol à 95°, puis
centrifugés à l’aide d’une centrifugeuse de type MLW à 3000 tours/mn. Le surnageant
récupéré a été utilisé pour le dosage des polyphénols et des flavonoïdes.
Figure 10: Plantule de Vicia faba après sept jours de germination.
3.1.1. Dosage des polyphénols totaux :
Le dosage des polyphénols totaux est réalisé selon la méthode décrite par Chandler
et Dodds modifié par Shety et al. (2004).
La méthode de Folin-Ciocalteu a été choisie pour doser les polyphénols pour les
raisons suivantes ; (i) c’est une méthode qui satisfait aux critères de faisabilité et de
reproductibilité, (ii) la disponibilité du réactif de Folin et la méthode est bien standardisée,
(iii) la grande longueur d'onde (725nm) d'absorption du chromophore permet de
minimiser les interférences avec la matrice d'échantillon qui est souvent coloré, (iv) c’est
un test largement pratiqué dans les laboratoires de recherche d’antioxydants des plantes
médicinales. (Charpentier
29
CHAPITRE III : MATERIEL ET METHODES.
En milieu alcalin, les polyphénols réduisent l’acide phosphomolybdique du réactif
Folin-Ciocalteu. Cette réduction se traduit par l’apparition d’une coloration bleu foncée.
(Ribéreau-Gayon , 1968)
A 1mL du surnageant sont ajoutés : 1 mL d’éthanol 95°, 1 mL d’eau distillée, et
500 µL de réactif de Folin ciocalteau à 50 % Après 5 mn de réaction, 1 mL de solution de
carbonate de sodium (NaCO3) à une concentration de 5 % est ajoutée. La lecture de
l’absorbance a été réalisée à 725 nm à l’aide d’un spectrophotomètre (UV-visible 8500)
après 60 mn d’incubation à température ambiante.
La détermination de la teneur en polyphénols a été faite en se référant à une courbe
étalon dressée à partir d’une série de solutions standard d’acide gallique à 1 mg/mL.
3.1.2. Dosage des flavonoïdes :
L’analyse quantitative des flavonoides est réalisée par le dosage
spectrophotométrique selon la méthode décrite par Kim et al. (2003).
Dans des tubes à essai, sont déposés 500 µL de surnageant (dissout dans
l’éthanol à raison de 50 mg/2,5 mL d’éthanol), 1500 µL d’eau distillée, et 150 µL
de nitrate de sodium NaNO2 à 5 % (m/v) dans l’eau. Après 5 minutes sont
ajoutées : 150 µL de trichlorure d’aluminium AlCl3 à 10 % (m/v). Après 11 min de
réaction, l’addition de 500 µL de soude NaOH (1M) donne une coloration rose qui
absorbe à 510 nm.
La teneur en flavonoïdes de l’extrait éthanolique est déterminée par interpolation à
l’aide d’une courbe étalon réalisée par des solutions ascendantes de catéchine.
5. Effet antioxydant de Pistacia atlantica (Desf.) :
5.1. Préparation de l’extrait aqueux de P. atlantica:
Les feuilles de la plante sont débarrassées de toutes impuretés (terre, parties
mortes, etc.), séchées à l’étuve à 50 °C pendant 24 heures puis broyées à l’aide d’un
broyeur à couteaux « Culatti type MFC ».
Dix grammes de poudre végétale sont pesés et mises dans un ballon en verre
contenant 100 mL d’eau distillée. L’extraction sous reflux est répétée trois fois pendant 30
mn afin de solubiliser le maximum de substances.
Le filtrat obtenu est réparti dans des ballons rodés, congelé puis lyophilisé à l’aide
d’un lyophilisateur (Virtis) et enfin conservé au congélateur jusqu’à utilisation.
30
CHAPITRE III : MATERIEL ET METHODES.
5.2. Identification des principaux constituants de l’extrait aqueux lyophilisé de P.
atlantica par chromatographie sur couche mince (CCM) :
5.2.1. Préparation des échantillons :
La phase stationnaire utilisée correspond à des plaques de Silicagel 60 F254 prêtes
à l’emploi d’une épaisseur de 0,25 mm sur support en aluminium (Merck). Cette phase est
incorporée d’un produit fluorescent excitable à 254 nm ce qui permet la visualisation des
composés séparés.
La phase mobile ou le solvant de migration utilisé est choisi en fonction de la
polarité des substances à séparer. C’est un mélange de trois ou quatre solvants de polarités
différentes: acétate d’éthyle, acide acétique, méthanol et H2O (100 :11 :11 :26) pour
donner une meilleure séparation.
100 µg d’échantillon sont solubilisés dans le méthanol et déposés sous forme de
trait à l'aide d'une pipette pasteur. Les dépôts sont immédiatement séchés à l’aide d’un
sèche cheveux.
Les plaques sont placées verticalement sans remous dans la cuve contenant la
phase mobile. La migration ne doit pas dépasser le front du solvant et le séchage des
plaques est effectué sous hotte.
5.2.2 Révélation :
L'observation des substances séparées se fait selon différentes méthodes : soit à
l’œil nu, si les substances sont colorées ; soit à l'aide de révélateurs, si elles sont incolores
afin de les transformer en taches colorées. L'emploi de plaques munies de produits
fluorescents permet aussi la mise en évidence de plusieurs substances aux l'UV à 254 nm
et 366 nm. Les spots des échantillons sont cernés à l’aide d’un crayon avant et après
révélation. Le rapport des fronts est calculé selon l’équation.
Rf = d/D
d : distance parcourue par les substances (cm) depuis la ligne de dépôts.
D : distance parcourue par le solvant (cm) depuis la ligne de dépôts.
Rf : rapport des fronts.
31
CHAPITRE III : MATERIEL ET METHODES.
Tableau 4 : Systèmes d’élution et révélateurs utilisés en CCM pour l’identification des
substances extraites à partir de Pistacia atlantica selon Wagner et Bladt, (1996).
Substance naturelle
Acides phénoliques libres
Alcaloïdes
Coumarines
Dérivés anthracéniques
anthrones et anthranols
Flavonoïdes
Glycosides cardiotoniques
Quinones
Lignanes
Saponines
Sesquiterpènes lactones
Triterpènes
Système d’élution
AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O
(100 : 11 : 11 : 26). Séparation sous UV (365)
CH2Cl2-MeOH-NH4OH
(95 :5 :0.5)
AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O
(100 : 11 : 11 : 26)
AcOEt- MeOH- H2O
(100 :13.5 :10)
AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100 :11:11:26)
AcOEt- MeOH- H2O
(100:13,5:10)
AcOEt-MeOH-H2O
(100 :17 :13)
CHCl3-MeOH-H2O
(70 :30 : 4)
CHCl3-MeOH-H2O
(64 :40 :8))
AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O
(100 :11 :11 :26)
AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O
(100 :11:11:26)
Révélateur
Folin-Ciocalteu
Dragendorff
KOH
KOH
Neu
Chlorure
d’antimoine III
Vaniline-H2SO4
Komarowsky
Zimmermann
Anisaldéhyde
NB : L’identification des acides phénoliques a été réalisée en utilisant des témoins tels
que : l’acide caféique, l’acide cinnamique, l’acide férulique et l’acide sinapique.
6. Évaluation de l’activité antioxydante de l’extrait aqueux des feuilles de P. atlantica
sur V. faba stressée au chlorure de mercure (HgCl2) :
Les graine de Vicia faba germées sont réparties en quatre groupes :
Ø
Graines traitées par de l’eau distillée stérile, considérées comme témoin ;
Ø Graines stressées par le chlorure de mercure à une concentration de 15 mg/L ;
Ø Graines stressées par le chlorure de mercure à une concentration de 15 mg/L et
traitées par l’extrait aqueux de P. atlantica à 1 % pendant 48 heures;
Ø Graines traitées par l’extrait aqueux de Pistacia atlantica seulement.
Toutes les jeunes plantules ont été arrosées avec ces différentes solutions pendant
48 heures à une température de 22 °C.
La mesure de la défense antioxydante par le dosage des polyphénols et
flavonoides, et l’évaluation de la peroxydation lipidique par le test TBARS a été aussi
réalisée.
32
CHAPITRE III : MATERIEL ET METHODES.
7. Test de micronoyaux :
Les mêmes traitements des graines de V. faba pour l’évaluation de l’activité
antioxydante de l’extrait aqueux des feuilles de Pistacia atlantica sur V. faba stressée au
chlorure de mercure (HgCl2), ont été utilisés dans l’étude des micronoyaux, après 24
heures de traitement seulement.
Les apex racinaires traités d’un centimètre (1 cm) de long sont fixés dans une
mixture fraîchement préparée d’acide acétique glacial et d’éthanol (1 : 3 v/v) pendant 24
heures. Ce matériel peut être conservé dans l’éthanol 70 % durant plusieurs mois au
réfrigérateur à 4 °C.
La coloration de Feulgen nécessite d’abord une hydrolyse des apex racinaires dans
l’HCl 1N à 60 °C pendant 12 mn. La coloration dans le réactif de Schiff dure 10 minutes à
l’obscurité (Jahier, 1992).
La partie méristématique (2 mm environ) hydrolysée et colorée est isolée à l’aide
d’un scalpel, déposée sur une lame dans une goutte de carmin acétique à 45 % et écrasée
entre lame et lamelle afin d’étaler les cellules.
Les observations sont réalisées au moyen d’un microscope Olympus CH20 avec
un grossissement x 40. L’analyse des lames permet de dénombrer le nombre total de
cellules, et de cellules comportant un ou des micronoyaux.
Ce comptage permet de calculer la fréquence de micronoyaux (MN, exprimée en
‰).
Le nombre de cellules analysées est d’environ 2 500 cellules par plante (500 cellules par
lame) (Ma et al., 1995).
8. Analyse statistique:
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± erreur standard (M±ES)
calculée sur la moyenne de trois expériences (pour le dosage des polyphénols et des
flavonoides et MDA). Les données expérimentales sont présentées sous forme de tableaux
et d’histogrammes.
33
CHAPITRE IV : RÉSULTATS
1. Défense antioxydante
En plus du système enzymatique, la cellule végétale accumulent fréquemment des
métabolites dits « secondaires ». Ces métabolites jouent souvent un rôle de défense de la
plante qui les fabrique.
1.1. Teneurs en polyphénols dans les différents organes :
1.1.1. Plantes stressées au NaCl à 100 mM :
Le taux en polyphénols est très important au niveau épicotylédones et
hypocotylédone sous la contrainte saline en comparaison avec le témoin (Tableau 6).
1.1.2. Plantes stressées au stress hydrique (PEG 10 %) :
Le taux des polyphénols est très important au niveau des hypocotylédones des
plantules de V. faba traitées par le PEG à 10 % (3,53 ± 0,01 mg/g), par contre au niveau
épicotylédones, le taux en polyphénols est très faible (3,517 ± 0,018) comparativement
aux témoins respectifs (0,86 et 7.86 mg/g) (tableau 6).
1.1.3. Plantes stressées au chlorure de mercure (HgCl 2) :
Le taux de polyphénols est très important au niveau hypocotylédones
à la
concentration de 15mg/L et dans une moindre mesure à la concentration de 5 et 10mg/L,
par contre au niveau épicotylédones le taux augmente d’une façon très significative à la
concentration de 15 mg/L (8.98 ± 0,28 mg/g) comparativement au témoin (tableau 6).
Tableau 6: Taux de polyphénols (mg/g) au niveau des deux parties, hypocotylédones et
épicotylédones chez Vicia faba soumis à différents stress.
Témoin
NaCl
100 mM
hypocotylédones 0.86±0.003 1.91±0.01
épicotylédones
7.86±0.67
HgCl2 (mg/L)
PEG 10%
3.53±0.01
5mg/L
10mg/L
15mg/L
1.59±0.05
3.89±0.244
1.32±0.47
9.081±0.039 3.517±0.018 1.283±0.049 1.970±0.011 8.98±0.289
Chaque valeur représente la moyenne±ES
35
CHAPITRE IV : RÉSULTATS
1.2. Teneur en flavonoïdes :
1.2.1. Plantes stressées au NaCl à 100 mM :
L’accumulation des flavonoides est très importante au niveau des hypocotylédones
des plantules de V. faba exposés à une solution de NaCl 100 mM (1,05 ± 0,03 mg/g) en
comparaison avec le témoin, à l’inverse de la partie épicotylédones où on ne remarque pas
une différence significative (tableau 7).
1.2.2. Plantes stressées au stress hydrique (PEG à 10 %) :
Le stress hydrique se traduit par une légère augmentation au niveau de la partie
hypocotylédone (0,724 ± 0,01 mg/g) en comparaison avec le témoin, avec une faible
teneur dans la partie épicotylédones (1,301 ± 0,06 mg/g).
1.2.3. Plantes stressées au chlorure de mercure (HgCl2) à différentes concentrations :
Le taux de flavonoides s’accumule davantage dans les parties hypocotylédonaire
lorsque la concentration du milieu augmente. En effet, sa teneur passe de 0,629 mg/g dans
la partie hypocotylédones des plantules témoins à 0,81 mg/g chez les plantules traitées à
15 mg/L de HgCl2. A u niveau épicotylédones, c’est la concentration de 15 mg/L que le
taux en flavonoïdes est très important. (tableau 7).
Tableau 7: Taux des flavonoïdes (mg/g) au niveau des hypocotylédones et
épicotylédones chez V. faba soumis à différents stress.
Témoin
NaCl
100 mM
HgCl2 (mg/L)
PEG 10%
5
10
15
hypocotylédon 0.629±0.05 1.05±0.03 0.724±0.01 0.31±0.05 0.72±0.030 0.81±0.05
épicotylédons
1.94±0.162 1.89±0.10 1.301±0.06 0.40±0.00 0.97±0.033 3.41±0.007
Chaque valeur représente la moyenne ±ES de 3 essais par groupe
36
CHAPITRE IV : RÉSULTATS
2 . Évaluation de l’activité antioxydante de l’extrait aqueux des feuilles de Pistacia
atlantica à 1 % sur les plantules de Vicia faba stressées par le chlorure de mercure
(HgCl2 à 15 mg/L) :
3.1. Teneur en polyphénols :
Au niveau des hypocotylédones des plantules de V. faba, les teneurs en
polyphénols ont augmenté chez les groupes traités avec l’extrait aqueux des feuilles de
Pistacia atlantica par rapport aux groupes exposés au chlorure de mercure seulement
(HgCl2) (2,24 ± 0,091 et 1,32 ± 0,47 mg/g respectivement) (Tableau 8).
La teneur en polyphénols et très importante au niveau des épicotylédones des
plantules de V. faba traitées par l’extrait aqueux des feuilles de Pistacia atlantica par
rapport à celles exposées au chlorure de mercure seul (tableau 9).
Tableau 8: Teneur en polyphénols au niveau des hypocotylédones et
épicotylédones des plantules de V.faba exposées au chlorure de mercure à 15mg/L et
traitées par l’extrait aqueux de Pistacia atlantica
HgCl2 (15mg/L)
HgCL 2(15mg/L)+P.atlantica 1%
1.32±0.47
8.98±0.289
2.24±0.091
11.497±0.756
hypocotylédones
épicotylédones
Chaque valeur représente la moyenne ±ES de 3 essais par groupe
3.2. Teneur en flavonoïdes
La teneur en flavonoïdes est très importante au niveau hypocotylédones et
épicotylédones après le traitement avec l’extrait aqueux de Pistacia atlantica, en
comparaison avec le traitement avec le chlorure de mercure à la concentration de 15 mg/L
(tableau 9).
Tableau 9: Teneur flavonoïdes au niveau des hypocotylédones et épicotylédones des
plantules de V.faba exposées au chlorure de mercure à 15mg/L et traitées par l’extrait
aqueux de P. atlantica.
HgCl2 15mg/L
hypocotylédones
épicotylédones
HgCL 2 (15mg/L) +P. atlantica 1%
0.812±0.05
3.413±0.007
1.962±0.054
4.12±0.114
Chaque valeur représente la moyenne ±ES de 3 essais par groupe
37
CHAPITRE IV : RÉSULTATS
5. Test des micronoyaux :
L’exposition des cellules méristématiques de V. faba à une solution de HgCl2 à 15
mg/L se traduit par une forte augmentation du taux des micronoyaux comparativement au
témoin et à celles exposées à l’extrait aqueux de Pistacia atlantica à 1 % seulement.
La présence de l’extrait de Pistacia atlantica couplé avec la solution de HgCl2, a
pour effet une diminution très significative du taux de micronoyaux dans les cellules
méristématiques de V. faba (Figure 16).
Micronoyau
Figure 16 : Apex racinaire de Vicia faba avec micronoyaux coloré au réactif de Feulgen
au grossissement x100.
Figure 17: Nombre de micronoyaux (MN ‰ ± ES) des cellules méristématiques de Vicia
faba exposées à une solution au chlorure de mercure (HgCl2) à 15 mg/L et traitées par
l’extrait aqueux des feuilles de Pistacia atlantica à 1%.
38
CHAPITRE IV : RÉSULTATS
6. Analyse phytochimique de l’extrait aqueux de Pistacia atlantica :
Les tests préliminaires sur CCM effectués sur l’extrait aqueux des feuilles de P.
atlantica, ont permis de mettre en évidence deux groupes phytochimiques : les
flavonoïdes et les coumarines (tableau 12).
En ce qui concerne les autres métabolites, il existe deux éventualités : soit ils sont
absents, soit leur faible teneur ne permet pas de les détecter avec la technique utilisée
et/ou avec l’extrait utilisé qui est sensé ne contenir principalement que les produits très
polaires.
Tableau 10 : Composition phytochimique de l’extrait aqueux des feuilles de P. atlantica.
Phytoconstituant Révélateur F365
Rf
KOH
Jaune orange 0.72
0.53
Coumarines
0.46
0.37
Neu
Jaune vert
081
Jaune vert
0.74
Flavonoide s
Jaune
0.67
Jaune vert
0.54
jaune
0.42
F365 : fluorescence à 365 nm ; Rf : rapport des fronts.
7. Teneur en polyphénols totaux et en flavonoïdes chez Pistacia atlantica :
La teneur en polyphénols est très importante chez cette espèce comparée à celle
des flavonoides (figure 18).
quantitée en mg/g
teneur en polyphénols et flavonoides de
pistacia atlantica
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
polyphénols
flavonoides
polyphénols
flavonoides
Figure 18 : Teneurs en polyphénols totaux et en flavonoïdes exprimées en mg/g
de poudre lyophilisée
39
CHAPITRE V : DISCUSSION
V. Discussion
La première partie de ce mémoire a été de caractériser l’effet des différents stress
abiotiques (NaCl à 100mM, PEG à 10% et le stress au chlorure de mercure à différentes
concentrations) sur notre plantule V.faba à induire un stress oxydatif, Nous avions donc
choisi de mesurer spécifiquement des paramètres couramment employés dans l’évaluation
du niveau de stress oxydatif d’un organisme végétal.
Un dosage des polyphénols totaux et des flavonoïdes a été effectué. La raison principale
pour le choix de ces substances réside dans le fait que la majorité des propriétés
antioxydantes des plantes leur sont attribués.
Dans un second lieu, nous nous somme proposé d’évaluer, si l’administration d’un
extrait aqueux lyophilisé des feuilles de Pistacia atlantica peut améliorer le statut redox
par l’augmentation du taux de polyphénols et de flavonoïdes, et la diminution du taux de
de micronoyaux induits par le stress au chlorure de mercure à 15 mg/L.
Une exposition de 48 heures des jeunes plantules de V.faba à différents stress
induit peu de modification à l’échelle macroscopique, ceci peut-être expliqué par la
richesse de cette plante en polyphénols, ceci a été montré par Shetty et collaborateur
(2002) qui ont montré que des jeunes plantules de V.faba soumises au stress UV, montre
une accumulation en polyphénols.
Il est bien admis que les contraintes abiotiques (sécheresse, salinité, température
élevée et ensoleillement) sont capables de stimuler la biosynthèse des polyphénols
(De Abreu & Mazzaferra, 2005).
Les polyphénols sont un groupe de métabolites secondaires caractérisés par la
présence d’au moins un noyau aromatique (six atomes de carbone liés en un hexagone)
possédant un ou plusieurs groupes hydroxyles, substitués ou non ; en font partie les
flavonoïdes, les tanins, les dérivés phénylpropanoïdes tels que les lignanes, les esters et
amides hydroxycinamiques, les stilbènes, les coumarines, les acides hydroxybenzoiques,
les xanthones et de nouveaux composés sont identifiés continuellement (Marouf &
Reynaud, 2007).
42
CHAPITRE V : DISCUSSION
En tant qu'antioxydants, tous les polyphénols sont capables de piéger les radicaux
libres générés en permanence par l’organisme végétal face aux stress biotique et abiotique
(Dixon et Paiva, 1995). Ces métabolites se trouvent en grande quantité dans les
différentes parties de la plante sous l’effet des différents stress (Smirnoff, 2005).
L’accumulation de polyphénols au niveau des hypocotylédones exposés directement aux
différents stress est expliquée par la stimulation de la production de la polyphénoloxydase qui est une enzyme clé de la voie métabolique conduisant à la formation des
polyphénols (Levent-Tuna, 2008).
Dans ce travail, la teneur en polyphénols est très importante chez les groupes traités
avec le chlorure de sodium (NaCl) à la concentration de 100 mM comparé au groupe
témoin. Le stress salin entraîne des dommages au niveau de la cellule végétale ce qui se
traduit par une accumulation en polyphénols. En effet, Falleh et collaborateurs, (2008) ont
montré une augmentation en polyphénols chez une plante de la famille des Asteraceae,
Cynara cardunculus ayant subi un stress au NaCl, ce qui prouve que les métabolites
secondaires jouent un rôle dans la tolérance des espèces sensibles au stress salin de
protection contre les radicaux libres (Parida et al., 2004). Par ailleurs, Djeridane et al.
(2007) ont rapporté que l’accumulation des polyphénols chez la famille des Asteraceae
dépend de la concentration du sel dans le milieu.
Lors d’un travail réalisé par Cheruth Abdul Jaleel (2007), il a été montré que le
traitement au NaCl chez Catharanthus roseus induit un stress oxydatif exprimé par
l’accumulation de la proline et d’alcaloïdes indoliques.
Le stress salin induit une accumulation importante des flavonoïdes dans les parties
hypocotyles de V. faba. Ce résultat concorde avec celui de Ksouri et collaborateurs.
(2006) qui ont démontré qu’il y a une augmentation des teneurs en polyphénols, en
flavonoïdes et en tanins.
Le stress salin et le stress au HgCl2 à la concentration de 15mg/L, les épicotyles
des plantules de V. faba ont montré une augmentation en polyphénols, probablement due
à une forme de défense des parties aérienne contre ces stress, donc on peut dire qu’il ya
présence d’une translocation du sel et du mercure de la partie hypocotylédonaire à la
partie aérienne et ceci par le phénomène dose-dépendante. Piechalak et collaborateurs
(2002), ont montré que la proportion de plomb dans les parties aériennes de fèves était de
0,25 % après 96 heures de traitement au plomb, alors qu’elle représentait 2 % au bout de
43
CHAPITRE V : DISCUSSION
24 heures, de même que pour le stress salin, plusieurs travaux ont montré une stimulation
de la synthèse des polyphénols surtout chez les espèces tolérantes (Navaro et al., 2006).
Le peroxyde d’hydrogène (H2O2), est très rapidement produit lors des différents
stress (Schutzendubel et Polle, 2002; Clemens, 2006; Maksymiec, 2007). Plusieurs
études montrent que le stress salin induit une production excessive de peroxyde
d’hydrogène (H2O2), d’où une peroxydation lipidique qui va affecter la perméabilité
membranaire, ce qui va induire un stress oxydatif (Gomez et al., 1999).
Le stress hydrique chez V. faba réduit la taille et la longueur des feuilles
(Karamanos, 1978; Husain et al., 1988), le stress hydrique est obtenue par l’absence
d’eau, l’effet similaire est produit par osmose en présence du polyéthylène glycol 6000
(PEG 6000) dans le milieu de culture (Michel et Kaufmann, 1973 ; Carpita et al., 1979;
Nepomuceno et al., 1998; Nayyar, 2003).
Au niveau des épicotylédones, lors du stress hydrique, le taux des polyphénols a
diminué comparativement au témoin qui montre un taux en polyphénols très important.
V. faba apparaît donc comme une plante riche en polyphénols en comparaison avec
d’autres Légumineuses (Shetty et al., 2001) .
Eckey-Kalteubach et collaborateur. (1994) ont montré que la pollution
atmosphérique induit la biosynthèse des flavonoïdes et des furocoumarines chez le persil
suite à un stress aux UV.
L’augmentation de la quantité des flavonoïdes a été décrite chez de nombreuses
espèces végétales à cause d’un déficit en eau (Ingram et Bartels, 1996 ; Horner, 1990,
Kennedy et Filippis, 1999). Le stress hydrique peut moduler l’expression des gènes
impliqués dans le métabolisme secondaire, notamment au niveau de la biosynthèse des
flavonoïdes.
La tolérance à la sécheresse est le résultat de mécanismes physiologiques,
biochimiques et moléculaires complexes. L’expression de différents gènes et
l'accumulation de divers osmolytes (l’ajustement osmotique) couplé à un système
antioxydant efficace sont souvent les principaux mécanismes de tolérance au déficit
hydrique (Tardieu, 2005).
Une conséquence des stress environnementaux, comprenant le stress hydrique, est
44
CHAPITRE V : DISCUSSION
l’apparition d’un stress oxydatif, c’est-à-dire l'accumulation d’espèces réactives de
l'oxygène (ROS), qui endommagent les structures cellulaires (Appel et Hirt, 2004). Dans
des conditions optimales, les feuilles sont dotées d’enzymes et de métabolites
antioxydants suffisants pour faire face aux ROS. De nombreux travaux montrent que des
enzymes telles que des superoxide dismutases (SOD), des ascorbate peroxydases (APX),
des catalases (CAT), des glutathion-Stransférases (GST) et des glutathion peroxydases
(GPX) s’accumulent pendant le stress hydrique (Flexas et al., 2006). La capacité du
système
antioxydant
est
déterminante
pour
maintenir
l’intégrité
du
système
photosynthétique lors d’une contrainte hydrique.
Plusieurs auteurs (Sgherri et al., 2007) ont constaté une forte teneur en
polyphénols au niveau des hypocotylédones des plantules de V. faba soumises à un stress
aux métaux lourds, comparés au témoin. Cependant, bien que V. faba soit une plante très
sensible, elle n’est pas accumulatrice de métaux lourds (Pourrut et al., 2008).
Nos résultats montrent que pour le stress au chlorure mercure (HgCl2), à la
concentration de 15 mg/L, il y a une accumulation de flavonoïdes, concordant ainsi avec
l’étude faite par Morris (1995) montrant que les flavonoïdes sont de bons chélateurs de
métaux lourds.
Pour la concentration de 5 mg/L de HgCl2, une diminution du taux de flavonoïdes
est observée au niveau des deux parties hypocotyle et épicotyle ; ceci pourrait être
expliqué soit par la résistance des plantules à cette concentration (Isabel et al., 2007). La
réponse des plantules face à ce stress varie donc d’une concentration à une autre.
Le traitement des racines de Ginseng Pnanax par le cuivre à 3000 ppm augmente le
taux des polyphénols et de flavonoïdes à 26 % et 83 %, respectivement, comparativement
au témoin et ceci après 40 jours de traitement (Ali et al., 2006).
La bibliographie suggère l’implication du stress oxydatif dans la toxicité des
métaux lourds (Stohs et Bagchi, 1995; Ercal et al., 2001; Galaris et Evangelou, 2002;
Valko et al., 2006).
La contamination aux métaux lourds est un excellent moyen pour l’examination de
la machinerie antioxydative responsable de l’adaptation physiologique de la majorité des
45
CHAPITRE V : DISCUSSION
espèces végétales (Stomk, 2007). A cet effet, l’extrait aqueux lyophilisé de P. atlantica
(1 %), a été ajouté aux plantules stressées au chlorure de mercure à 15 mg/L en raison de
la forte activité antioxydante de cette plante (Rached, 2010). C’est la première fois à
notre connaissance, qu’une telle étude est effectuée sur des végétaux.
D’autres analyses faites par Benhassaini et Raho Ghalem (2006), ont montré que
les graines de P. atlantica sont très riches en protéines et en lipides avec une grande
teneur en acides gras mono-insaturés et en phytostérols, teneurs comparables à celles de
l’huile d’olive, d’où son intérêt thérapeutique et nutritionnelle.
Chez les mammifères, les espèces réactives de l’oxygène sont connues comme
jouant un rôle important dans la toxicité des métaux et en particulier dans leur
génotoxicité (Xu et al., 2008).
Nous nous sommes donc intéressés à la génotoxicité induite par le chlorure de
mercure, chez Vicia faba. L’utilisation du test des micronoyaux (MN) a révélé un effet
génotoxique très rapide du chlorure de mercure à la concentration de 15mg/L ,
démontrant ainsi l’existence d’un effet clastogène. Ce résultat concorde avec ceux de
nombreuses études chez plusieurs espèces (Patra et Sharma, 2000). Ramel (1972),
montre que lors de l’exposition des racines de V. faba à l’hydroxyde méthylique de
mercure, il y a inhibition de la mitose. Panda et collaborateurs (1988), lors du traitement
des racines d’Eichhornia crassipes et d’Allium cepa par le mercure, obtiennent une
augmentation du taux de micronoyaux. De même, Loudes (2002), a montré l’effet
clastogène du plomb chez V. faba.
Lors de l’addition de l’extrait aqueux des feuilles de P. atlantica dans une solution
au chlorure de mercure à 15 mg/L à une concentration de 1 %, le taux de polyphénols et
de flavonoïdes a significativement augmenté.
En effet, les composés phénoliques et plus particulièrement les flavonoïdes sont
reconnus comme des substances potentiellement antioxydantes ayant la capacité
de piéger les espèces radicalaires et les formes réactives de l’oxygène.
L’effet scavenger des flavonoïdes (FLOH) est attribué à leur faible potentiel redox
qui les rend thermodynamiquement capable de réduire les radicaux libres (R•) par un
transfert d’atome d’hydrogène à partir des groupements hydroxyle. Cette réaction donne
46
CHAPITRE V : DISCUSSION
naissance au radical aroxyle (FLO•) et à la molécule radicalaire rendu stable (RH), le
FLO• subira par la suite un réarrangement structurale permettant la redistribution de
l’électron célibataire sur le cycle aromatique et la stabilisation de radicaux aroxyle
(Javanovic et al., 1994).
Ce phénomène peut être expliquer par un changement du comportement de
l’extrait de l’effet antioxydant à l’effet prooxydant ou par le faite que le pourcentage de
molécules prooxydantes dépasse largement celui des molécules antioxydantes à un certain
seuil de concentration d’extrait Ceci n’est pas vraiment surprenant dans la mesure où les
composés phénoliques agissent généralement comme antioxydants à faible concentration,
mais à forte concentration ils peuvent devenir prooxydants par leur autooxydation
conduisant à la formation de semiquinone et du radical superoxyde (Mochizuki et al.,
2002 ; Jayaprakasha et Patil, 2007). De même, Chen et Yen (2007) ont rapporté que les
extraits des feuilles de Psidium guajava possèdent des propriétés scavenger significatives
sur les radicaux peroxyles mais lorsque la concentration dépasse 10µg/ml ces extraits se
comportent comme prooxydants.
L’effet piégeur des espèces oxygénées réactives par des composés purs contenus
dans les huiles essentielles a été largement étudié. La thymoquinone, l’un des composés
majoritaires de ces huiles, inhibe la génération du radical O2•¯par le système
xanthine/xanthine oxydase, sans avoir le moindre effet sur l’activité de l’enzyme elle
même à cette dose (Badary et al., 2003). De même la thymoquinone et son dimère la
dithymoquinone montrent également des propriétés proches de celles de la SOD, appelées
‘SOD like’ en piégeant le radical O2•¯ alors que le thymol possède un effet scavenger de
l’oxygène singulier (Kruk et al, 2000).
La capacité chélatrice est très importante du fait qu’elle réduit la concentration de
métaux de transitions catalyseurs de la peroxydation lipidique. En effet, le fer peut
stimuler l’oxydation des lipides par la réaction de Fenton, et accélère également cette
oxydation en décomposant les hydroperoxydes en radicaux peroxyles et alcoxyles qui
peuvent à leur tour entretenir la réaction en chaîne (Elmastaş et al, 2006). Il a été rapporté
que les agents chélateurs qui forment une liaison de type σ avec les métaux sont actifs
comme antioxydants secondaires car ils réduisent le potentiel redox et stabilisent la forme
oxydée de l’ion métallique (Suresh-Kumar et al, 2008).
Selon la littérature, les composés phénoliques s’avèrent comme de bons chélateurs
des ions métalliques (Morris, 1995; Brown, 1998).
47
CHAPITRE V : DISCUSSION
Les composés phénoliques ne sont pas les principaux chélateurs présents dans les
extraits qui sont en fait un mélange complexe d’acides organiques (acides citrique,
malique, tartrique, oxalique, lipoique et phytique..etc.), d’acides aminés et de sucres qui
peuvent contribuer également à la séquestration des métaux de transition (Wong et
al.,2006). Les composés contenants le nitrogène sont généralement des chélateurs plus
puissants que les composés phénoliques (Chan et al., 2007). De plus, la capacité chélatrice
d’un composé phénolique dépend de la disponibilité d’un certain nombre de groupements
fonctionnels convenablement orientés (Van Acker et al., 1996). Donc un échantillon riche
en composés phénoliques ne pourrait pas chélater les métaux de transition si ses
polyphénols ne disposent pas les groupements fonctionnels nécessaires pour l’activité
chélatrice. Les ligands bidentates sont des chélateur plus puissants que les monodentates,
par exemple un groupent catéchol se lie fortement au fer contrairement à un groupement
phénol, de même la conjugaison d’un composé phénolique avec une partie
glucidphénolique avec une partie glucidique entraîne la perte de l’activité chélatrice
(Wong et al.,2006).
En tenant compte des résultat obtenus, il parait que L’augmentation de la capacité
antioxydante de V.Faba, est probablement attribuée à une élévation du taux
d’antioxydants exogènes tel que l’acide ascorbique, les caroténoïdes, la vitamine E et
également les flavonoïdes ou les composés phénoliques, acquis suite au traitement par
l’ extraits aqueux de Pistacia atlantica des (extrait brut aqueux) dont les propriétés
antioxydantes ont été déjà démontrées dans notre étude in vitro
Ces résultats restent préliminaires, Il serait intéressant de tester l'activité des
fractions chromatographiées et d’isoler les molécules qui sous tendent les diverses
activités détectées dans les différents extraits. De plus, des études complémentaires
approfondies concernant l’identification des composés phénoliques par des méthodes plus
performantes sont nécessaires. Des études approfondies sur la pharmacocinétique et la
pharmacodynamique de ces principes actifs seraient utiles pour la détermination des doses
Un antioxydant peut être défini comme toute substance capable, à concentration
relativement faible, d’entrer en compétition avec d’autres substrats oxydables et ainsi
retarder ou empêcher l’oxydation de ces substrats (Berger, 2006).
Les cellules utilisent de nombreuses stratégies anti-oxydantes et consomment
beaucoup d’énergie pour contrôler leurs niveaux d’espèces réactives de l’oxygène. La
nature des systèmes antioxydants diffère selon les tissus et les types cellulaires et selon
qu’on se trouve dans le milieu intracellulaire ou extracellulaire.
48
CHAPITRE V : DISCUSSION
Ces résultats sont en accord avec ceux de Pourrut et collaborateur (2008), qui
après un stress au plomb additionné de la vitamine E (un puissant antioxydant), ont noté
une inhibition de la peroxydation lipidique.
En effet, la vitamine E ne possède pas seulement la capacité de détoxiquer les
ERO, du fait de sa localisation membranaire, mais elle est également l’antioxydant le plus
important dans la prévention de la peroxydation lipidique (Fryer, 1992). Elle serait aussi
l’antioxydant le plus important dans la tolérance des végétaux aux métaux (Collin et al.,
2008). Un prétraitement des suspensions cellulaires de tabac et d’Arabidopsis thaliana
avec le diphenylene iodonium (DPI, 12 µM) qui est un inhibiteur de la NADPH oxidase
(enzyme produisant des ROS), réduit la libération des ROS dans le milieu cellulaire.
49
CONCLUSION S ET PERSPECTIFS
Soumises au stress salin, les plantules de Vicia faba ont présenté une induction de la
production de polyphénols dans les deux parties de la plante : hypocotyle et épicotyle.
Le stress hydrique induit par le PEG, provoque une augmentation très importante en
polyphénols au niveau de l’hypocotyle, contrairement à l’épicotyle.
De même, une induction de l’accumulation des polyphénols a été enregistrée chez les
plantules soumises à un stress au chlorure de mercure.
L’addition d’un extrait aqueux de Pistacia atlantica dans le milieu a bien montré l’effet
antiradicalaire, par l’augmentation des métabolites secondaires qui sont les polyphénols et les
flavonoïdes. P. atlantica, est doué d’une activité antioxydante très prometteuse, d’où la
nécessité de procéder à un fractionnement de l’extrait brut en vue de tester individuellement
ses différents constituants.
P. atlantica, apparaît également jouer un rôle dans la réparation de l’ADN, par la
diminution du taux de micronoyaux chez les plantules soumises au chlorure de mercure.
En conclusion, pour mener à bien cette étude, il serait intéressant d’élargir
l’investigation à d’autres méthodes d’analyse et aux autres marqueurs de stress oxydatif
(dosage des carbonyles, dosage des différents enzymes antioxydantes, dosage de la vitamine
E,…).
L’utilisation des outils moléculaires, comme le test de Comète, doit aussi être envisagé
pour montrer l’implication des ERO dans l’effet clastogène.
51
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ANNEXES
1.
Protocole de dosage des polyphénols par la méthode de Folin ciocalteu :
1ml acide gallique
1ml d’éthanol à 95°
5ml eau distillée
500µl du réactif de Folin
Ciocalteu à 50 %
Laisser agir pendant 5mn à température ambiante
Ajouter 1ml de la solution de
Carbonate de sodium à 5%
Laisser agir pendant 60mn à l’obscurité
La lecture au spectrophotomètre est effectuée à une longueur
d’onde de 725nm
65
ANNEXES
2. Protocole de dosage des flavonoïdes :
A 500µl d’extrait
+
1500µl d’eau distillée
On ajoute,
A t=o
150µl de NaNO2 à 5%
A t = 5 min
150µl de AlCl3 à 10%
Et à t = 11 min
500µl de NaOH 1M
Sont additionnés
Mélanger au vortex
La lecture au spectrophotomètre est effectuée à une longueur d’onde de 510nm
66
ANNEXES
v Expression des résultats des polyphénols totaux :
On prend comme un exemple Pistacia atlantica(feuilles) (Présente la plus forte
teneur en polyphénols) qui présente une DO de 1,667
D’après la courbe d’étalonnage on a l’équation suivante :
y = 80,466x – 0,0151
x = (y + 0,0151)/80,466 avec y = DO
x = (1,667+0,0151)/80,466
= 0,0209 mg/ml
On divise cette valeur par 1/21 qui correspond au facteur de dilution de notre
échantillon (δ = 100 µL (volume déposé de l’échantillon) / 2100 µL (volume réactionnel)
= 1/21)
Donc x’= x /1/21 = 0,0209 × 21 = 0,438 mg/ml
La solution mère de Pistacia atlantica (feuilles) est à 2 mg/ml
La valeur de l'absorbance obtenue à partir de cette solution est supérieur à 2 donc on a fait
une dilution de 2 fois et on a obtenu une A=1,66.
On a 0,438 mg/ml
x’’
10-3 g/ml
1g
x’’= 0,438 1/ 10-3
= 438 mg/g
Donc Pistacia atlantica. (feuilles) contient 438mg de polyphénols totaux par g de
poudre lyophilisée.
v Expression des résultats des flavonoïdes:
On prend l’exemple Pistacia atlantica qui présente une DO de 1,42
D’après la courbe d’étalonnage on a l’équation suivante :
y = 0,067x – 0,1791
x = (y + 0,1791) / 0,067 avec y = DO= 1,42.
x = (1,42 + 0,1791) / 0,067
= 23, 867 µg/ml
On divise cette valeur par 5,6 qui correspond au facteur de dilution de notre
échantillon (δ = 500 µL (volume déposé de l’échantillon) / 2800 µl (volume réactionnel)
= 1/5,6)
67
ANNEXES
Donc x’= x × 5,6 = 23, 867 × 5,6 = 133,655µg/ml
La solution mère de Pistacia atlantica) est à 2 mg/ml
On a 133,655 10-6g/ml
x’’
2 10-3 g/ml
1g
x’’= 133,655 10-3 / 2 g
= 66,82 mg
Donc l'extrait aqueux des racines de Pistacia atlantica contient 66,82 mg de
flavonoïdes par g de poudre lyophilisée.
68
Résumé
Nous avons étudié dans un premier temps les conséquences des stress abiotiques
(stress salin, stress hydrique et stress aux métaux lourds), sur l’activité des polyphénols et
flavonoïdes. Les résultats obtenus montrent une accumulation importante des polyphénols
et flavonoïdes dans les différentes organes des plantules de Vicia faba.
Ces résultats soulignent le rôle important des métabolites secondaires dans la
défense contre le stress oxydatif, causé par les différents stress abiotiques, dans la
détoxification des espèces réactif de l’oxygène (ERO) en condition de stress, et dans un
deuxième temps notre démarche nous a conduits à privilégier l’extrait de Pistacia
atlantica. décrite lors des dosages faites par son fort pouvoir antioxydant comparé avec
d’autres extraits, introduit au plantule stressé par le chlorure de mercure à la concentration
de 15mg/L, pendant 48 heures, Nous avons montré que le chlorure de mercure, pénétrait
rapidement dans le système racinaire et générait, après seulement 24 heures, un important
stress oxydatif par l’induction d’effets génotoxiques dans les cellules racinaires, les
résultats obtenues ont montré qu’il ya eu une réparation de l’ADN, en présence de
l’extrait aqueux de Pistacia atlantica , avec une augmentation du taux de polyphénols et
des flavonoïdes.
Mots clé : stress oxydatif, Vicia faba, polyphénols, flavonoïdes, MDA, micronoyaux.