Spectrophotométrie

Spectrophotométrie
La spectrophotométrie est une méthode permettant de mesurer la quantité de lumière absorbée par
une substance chimique en mesurant l’intensité de la lumière lorsqu’un faisceau de lumière traverse
une solution d’échantillon. Le principe de base est que chaque composé absorbe ou transmet la
lumière sur une certaine plage de longueur d’onde. Cette mesure peut également être utilisée pour
mesurer la quantité d’une substance chimique connue. La spectrophotométrie est l’une des
méthodes d’analyse quantitative les plus utiles dans divers domaines tels que la chimie, la
physique, la biochimie, le génie des matériaux et la chimie et les applications cliniques.
Introduction
Chaque composé chimique absorbe, transmet ou réfléchit la lumière (rayonnement
électromagnétique) sur une certaine gamme de longueurs d’onde. La spectrophotométrie est une
mesure de la quantité d’absorption ou de transmission d’une substance chimique. La
spectrophotométrie est largement utilisée pour l’analyse quantitative dans divers domaines (par
exemple, chimie, physique, biologie, biochimie, génie des matériaux et chimique, applications
cliniques, applications industrielles, etc.). Toute application traitant de substances ou de matériaux
chimiques peut utiliser cette technique. En biochimie, par exemple, il est utilisé pour déterminer les
réactions catalysées par les enzymes. Dans les applications cliniques, il est utilisé pour examiner le
sang ou les tissus à des fins de diagnostic clinique. Il existe également plusieurs variantes de la
spectrophotométrie telles que la spectrophotométrie d’absorption atomique et la spectrophotométrie
d’émission atomique.
Un spectrophotomètre est un instrument qui mesure la quantité de photons (l’intensité de la
lumière) absorbée après son passage à travers la solution échantillon. Avec le spectrophotomètre, la
quantité d’une substance chimique connue (concentrations) peut également être déterminée en
mesurant l’intensité de la lumière détectée. Selon la gamme de longueur d’onde de la source
lumineuse, elle peut être classée en deux types différents :
o Spectrophotomètre UV-visible : utilise la lumière sur la gamme ultraviolette (185 – 400 nm)
et la gamme visible (400 – 700 nm) du spectre de rayonnement électromagnétique.
o Spectrophotomètre IR : utilise la lumière dans la gamme infrarouge (700 – 15000 nm) du
spectre de rayonnement électromagnétique.
En spectrophotométrie visible, l’absorption ou la transmission d’une certaine substance peut être
déterminée par la couleur observée. Par exemple, un échantillon de solution qui absorbe la lumière
sur toutes les gammes visibles (c’est-à-dire, ne transmet aucune des longueurs d’onde visibles)
apparaît noir en théorie. D’autre part, si toutes les longueurs d’onde visibles sont transmises (c’est-
à-dire qu’elles n’absorbent rien), l’échantillon de solution apparaît blanc. Si un échantillon de
solution absorbe la lumière rouge (~ 700 nm), il apparaît vert car le vert est la couleur
complémentaire du rouge. Les spectrophotomètres visibles, en pratique, utilisent un prisme pour

réduire une certaine gamme de longueurs d’onde (pour filtrer d’autres longueurs d’onde) afin que
le faisceau de lumière particulier passe à travers un échantillon de solution.
Principes de la spectrophotométrie
La spectrophotométrie est une technique d’analyse qualitative et quantitative, de substances
absorbant un rayonnement électromagnétique de longueur d’onde comprise entre 300 et
900 nm avec le type d’appareil utilisé. Lorsqu’une substance absorbe dans le domaine du
visible (400 nm < l < 700 nm), l’œil ne perçoit en regardant cette substance, que les
radiations non absorbées, c’est pourquoi celle-ci apparaît colorée, de la couleur
complémentaire à celle de la radiation absorbée.
1.1) Principe
Soit un faisceau parallèle de lumière monochromatique (de longueur d’onde l ) d’intensité
P
0
traversant une solution absorbante de concentration C sur une longueur de cuve de 1
cm. L’intensité du faisceau émergeant est P . On définit la transmittance par:

A   ℓC
On définie l’absorbance de la façon suivante :
1.2) Loi de Beer-Lambert
Elle permet de déterminer A grâce à la relation empirique suivante :
C : concentration (mol.L
-1
) dans un solvant non absorbant ou dont l’absorption est
compensée.
e : coefficient d’extinction molaire du soluté.
ℓ : longueur de la cuve (cm).
e dépend de la substance absorbante, de la longueur d’onde du faisceau l et de la
température. La loi de Beer-Lambert est une loi limite, valable si la solution est diluée et
si on se place à une longueur d’onde proche du maximum d’absorption.
1.3) Loi d’additivité des densités optiques
Dans le cas de mélanges homogènes dilués, les densités optiques des différentes espèces
contenues sans le mélange sont additives A = ℓ
!ei Ci
.
i
Le solvant est souvent lui-même absorbant. Pour connaître l’absorbance d’un soluté, il faut
compenser l’absorbance du solvant en réglant le « zéro » de l’appareil.
Par la suite, on notera absorbance ou densité optique d’une espèce, la valeur de l’absorbance
due uniquement à la contribution de cette espèce (absorbance totale diminuée de
l’absorbance du solvant).
1.3) Utilisation du spectrophotomètre
L’appareil comprend :
Une source lumineuse (lampe à iode)
Un dispositif optique (prisme ou réseau) permet de sélectionner une longueur d’onde,
afin de disposer d’un faisceau quasi monochromatique.
Après avoir traversé une cuve contenant le solvant seul ou la solution étudiée, le faisceau
arrive sur une cellule photoélectrique permettent de mesurer l’intensité lumineuse
émergente.
Il est préférable de tenir les cuves par l’extrémité supérieure afin de ne pas laisser de traces
de doigts sur la partie traversée par le faisceau lumineux. Les cuves doivent être
remplies avec précaution afin d’éviter la formation de bulles. On les essuie avec du
papier Joseph avant de les introduire dans le porte-cuve.

2) Vérification de la loi de Beer-Lambert
On dispose d’une solution colorée de concentration
C0
= 5 ´ 10
-4
mol.L
-1
de KM O .
A
l’aide d’une fiole jaugée de 50 mL et des pipettes disponibles, réaliser des solutions
diluées de concentration C0 / 2, C0 /5 et C0 /10 .
Sachant que l’on a besoin seulement de quelques mL de chaque solution pour effectuer
une
mesure d’absorbance, on peut prélever une fraction de solution diluée pour réaliser
une solution encore plus diluée.