Spectrophotométrie La spectrophotométrie est une méthode permettant de mesurer la quantité de lumière absorbée par une substance chimique en mesurant l’intensité de la lumière lorsqu’un faisceau de lumière traverse une solution d’échantillon. Le principe de base est que chaque composé absorbe ou transmet la lumière sur une certaine plage de longueur d’onde. Cette mesure peut également être utilisée pour mesurer la quantité d’une substance chimique connue. La spectrophotométrie est l’une des méthodes d’analyse quantitative les plus utiles dans divers domaines tels que la chimie, la physique, la biochimie, le génie des matériaux et la chimie et les applications cliniques. Introduction Chaque composé chimique absorbe, transmet ou réfléchit la lumière (rayonnement électromagnétique) sur une certaine gamme de longueurs d’onde. La spectrophotométrie est une mesure de la quantité d’absorption ou de transmission d’une substance chimique. La spectrophotométrie est largement utilisée pour l’analyse quantitative dans divers domaines (par exemple, chimie, physique, biologie, biochimie, génie des matériaux et chimique, applications cliniques, applications industrielles, etc.). Toute application traitant de substances ou de matériaux chimiques peut utiliser cette technique. En biochimie, par exemple, il est utilisé pour déterminer les réactions catalysées par les enzymes. Dans les applications cliniques, il est utilisé pour examiner le sang ou les tissus à des fins de diagnostic clinique. Il existe également plusieurs variantes de la spectrophotométrie telles que la spectrophotométrie d’absorption atomique et la spectrophotométrie d’émission atomique. Un spectrophotomètre est un instrument qui mesure la quantité de photons (l’intensité de la lumière) absorbée après son passage à travers la solution échantillon. Avec le spectrophotomètre, la quantité d’une substance chimique connue (concentrations) peut également être déterminée en mesurant l’intensité de la lumière détectée. Selon la gamme de longueur d’onde de la source lumineuse, elle peut être classée en deux types différents : o o Spectrophotomètre UV-visible : utilise la lumière sur la gamme ultraviolette (185 – 400 nm) et la gamme visible (400 – 700 nm) du spectre de rayonnement électromagnétique. Spectrophotomètre IR : utilise la lumière dans la gamme infrarouge (700 – 15000 nm) du spectre de rayonnement électromagnétique. En spectrophotométrie visible, l’absorption ou la transmission d’une certaine substance peut être déterminée par la couleur observée. Par exemple, un échantillon de solution qui absorbe la lumière sur toutes les gammes visibles (c’est-à-dire, ne transmet aucune des longueurs d’onde visibles) apparaît noir en théorie. D’autre part, si toutes les longueurs d’onde visibles sont transmises (c’està-dire qu’elles n’absorbent rien), l’échantillon de solution apparaît blanc. Si un échantillon de solution absorbe la lumière rouge (~ 700 nm), il apparaît vert car le vert est la couleur complémentaire du rouge. Les spectrophotomètres visibles, en pratique, utilisent un prisme pour réduire une certaine gamme de longueurs d’onde (pour filtrer d’autres longueurs d’onde) afin que le faisceau de lumière particulier passe à travers un échantillon de solution. Principes de la spectrophotométrie La spectrophotométrie est une technique d’analyse qualitative et quantitative, de substances absorbant un rayonnement électromagnétique de longueur d’onde comprise entre 300 et 900 nm avec le type d’appareil utilisé. Lorsqu’une substance absorbe dans le domaine du visible (400 nm < l < 700 nm), l’œil ne perçoit en regardant cette substance, que les radiations non absorbées, c’est pourquoi celle-ci apparaît colorée, de la couleur complémentaire à celle de la radiation absorbée. 1.1) Principe Soit un faisceau parallèle de lumière monochromatique (de longueur d’onde l ) d’intensité P0 traversant une solution absorbante de concentration C sur une longueur de cuve de 1 cm. L’intensité du faisceau émergeant est P . On définit la transmittance par: On définie l’absorbance de la façon suivante : 1.2) Loi de Beer-Lambert Elle permet de déterminer A grâce à la relation empirique suivante : A ℓC C : concentration (mol.L-1 ) dans un solvant non absorbant ou dont l’absorption est compensée. e : coefficient d’extinction molaire du soluté. ℓ : longueur de la cuve (cm). e dépend de la substance absorbante, de la longueur d’onde du faisceau l et de la température. La loi de Beer-Lambert est une loi limite, valable si la solution est diluée et si on se place à une longueur d’onde proche du maximum d’absorption. 1.3) Loi d’additivité des densités optiques Dans le cas de mélanges homogènes dilués, les densités optiques des différentes espèces contenues sans le mélange sont additives A = ℓ ! e i Ci . i Le solvant est souvent lui-même absorbant. Pour connaître l’absorbance d’un soluté, il faut compenser l’absorbance du solvant en réglant le « zéro » de l’appareil. Par la suite, on notera absorbance ou densité optique d’une espèce, la valeur de l’absorbance due uniquement à la contribution de cette espèce (absorbance totale diminuée de l’absorbance du solvant). 1.3) Utilisation du spectrophotomètre L’appareil comprend : Une source lumineuse (lampe à iode) Un dispositif optique (prisme ou réseau) permet de sélectionner une longueur d’onde, afin de disposer d’un faisceau quasi monochromatique. Après avoir traversé une cuve contenant le solvant seul ou la solution étudiée, le faisceau arrive sur une cellule photoélectrique permettent de mesurer l’intensité lumineuse émergente. Il est préférable de tenir les cuves par l’extrémité supérieure afin de ne pas laisser de traces de doigts sur la partie traversée par le faisceau lumineux. Les cuves doivent être remplies avec précaution afin d’éviter la formation de bulles. On les essuie avec du papier Joseph avant de les introduire dans le porte-cuve. 2) Vérification de la loi de Beer-Lambert On dispose d’une solution colorée de concentration = 5 ´ 10-4 mol.L-1 de KM O . C0 A l’aide d’une fiole jaugée de 50 mL et des pipettes disponibles, réaliser des solutions diluées de concentration C0 / 2, C0 /5 et C0 /10 . Sachant que l’on a besoin seulement de quelques mL de chaque solution pour effectuer une mesure d’absorbance, on peut prélever une fraction de solution diluée pour réaliser une solution encore plus diluée. En vous plaçant au maximum d’absorption de la substance colorée, indiquée sur le flacon de la solution initiale, mesurer les absorbances des 4 solutions de concentration différentes. Vérifier ainsi la loi de Beer-Lambert. 3) Détermination du pKa d’un indicateur coloré 3.1) Principe L’indicateur coloré est le bleu de bromothymol (BBT) qui est jaune en milieu acide et bleu en milieu basique. La détermination du rapport se fait à partir des valeurs des absorbances des trois solutions suivantes, pour une longueur d’onde donnée. Solution 1 BBT à pH connu (7,2) Solution verte Les deux formes colorées présentes le sont à des concentrations molaires du même ordre de grandeur. [HIn]1 + [In–]1 = C Absorbance A1 Solution 2 Solution 3 BBT à pH = 1 solution jaune [In–]<<[HIn] BBT à pH = 14 solution bleue [HIn] << [In–] Forme majoritaire : HIn [HIn]2 » C Absorbance A2 Forme majoritaire In– [In–]3 » C Absorbance A3 3.2) Protocole opératoire Þ La solution mère de bleu de bromothymol est à 1 g.L-1. Þ La solution tampon de pH = 7,2 est obtenue en mélangeant 50 mL d'une solution d'hydrogénophosphate de sodium (2Na+ + HPO2-) à 4×10-1 mol.L-1 avec 50 mL d'une solution d'acide chlorhydrique à 2×10-1 mol.L-1. On a alors pH = pKa du couple H2PO- / HPO2- . On prépare 100 mL de chacune des solutions. fiole2- jaugée de 100 mL rincée avec le milieu tampon Solution Dans une H PO / HPO 2 S1 4 4 , introduire 5 mL de la solution mère de BBT. Compléter avec la solution tampon, homogénéiser. On obtient une solution verte S1 dont le pH est de 7,2. Solution Dans une fiole jaugée de 100 mL rincée avec de l'acide S2 chlorhydrique à 0,1 mol.L-1, introduire 5 mL de la solution mère de BBT. Compléter avec la solution d'acide chlorhydrique et homogénéiser. On obtient la solution jaune S2 dont le pH » 1. Solution Dans une fiole jaugée de 100 mL rincée avec une solution de S3 soude à 1 mol.L-1, introduire 5 mL de la solution mère de BBT. Compléter avec de la soude et homogénéiser. On obtient la solution bleue dont le pH » 14. Pour chacune des trois solutions, on trace le spectre d'absorption A = f (l ) à l'aide du spectrophotomètre. On superpose les trois spectres: les résultats obtenus se trouvent sur la page suivante. Remarque: Le blanc réactif est fait en prenant pour S1 la solution tampon pH =7,2 ; en prenant pour S2, l'acide chlorhydrique 0,1 mol.L-1; en prenant pour S3, la soude 1 mol.L-1. Limites Plusieurs facteurs peuvent dégrader la loi de Beer-Lambert et limiter la validité de la spectrophotométrie : le domaine de mesure idéal est pour les valeurs de T situées entre 20 et 60 % ; plusieurs aberrations optiques liés à la diffusion, la réflexion et la diffraction de la lumière peuvent fausser la mesure ; les phénomènes de fluorescence ainsi que d'autres particularités chimiques liées aux substances absorbantes peuvent interférer ; plus la densité du soluté est importante, plus le faisceau de lumière incident sera réfracté avec une valeur donnée. Cette tendance est normalement infime mais devient plus prononcée avec les hautes concentrations. Ainsi, la réfraction réduit l'intensité de la lumière transmise et l'instrument indique faussement une absorbance plus élevée. Généralement, ce phénomène peut être évité en travaillant avec des concentrations inférieures à 0,01 mol.L−1 Les domaines d’application En biologie Le spectromètre est utilisé lors de la réalisation du test MTT. En biologie moléculaire, Il est utilisé lors de l'extraction d'ADN, pour quantifier l'ADN et déterminer sa pureté. On utilise la longueur d'onde 260 nm qui est la zone d'absorbance maximale des acides nucléiques. Une seconde mesure à 280 nm permet de contrôler la pureté de l'extraction, à savoir la présence de protéines résiduelles dans la solution d'ADN. Pour une solution d'ADN purifiée, le rapport R. doit être compris entre 1,8 et 2. Si R est nettement inférieur à 1,8 alors des protéines contaminent probablement la solution. Supérieur à 2, ce rapport indique une probable contamination par des ARN. R = (A260 - A320)/(A280 - A320) R est simplifié lorsque (cas fréquent) A320 = 0. La concentration d'ADN peut être calculée à partir de la mesure à 260 nm en utilisant un facteur de corrélation : ADN double-brin : 1 Abs = 50 ng/µl ADN simple-brin : 33 ng/µl (comme l'ARN simple brin) ARN : 1 Abs = 40 ng/µl. En biochimie, il est utilisé lors de la purification de protéines, pour les quantifier (longueur d'onde 280 nm) et déterminer leur niveau de pureté (longueur d'onde 260 nm). En médecine L'analyse cinétique de différentes enzymes sanguines, dosage de la phosphatase alcaline : cholestase, lactate déshydrogénase : infarctus du myocarde, hémolyse. En physique L'analyse de la lumière permet de déterminer les composants chimiques à l'origine de l'émission lumineuse : par exemple, la composition chimique des étoiles. En chimie L'analyse de l'absorption des solutions à une longueur d'onde donnée permet le dosage de ces solutions selon la loi de Beer-Lambert (la concentration est proportionnelle au logarithme de l'absorption lumineuse). Il y a donc relation directe entre la quantité de lumière absorbée et la concentration en composé chimique de la solution. Le suivi dans le temps de l'absorption est une méthode de caractérisation de la vitesse de réactions chimiques (cinétique). Un balayage en fréquence permet de caractériser l'espèce présente en solution en remontant à la nature de la transition énergétique considérée. Dans les industries graphiques Il permet de mesurer les couleurs afin de calibrer des périphériques de sortie tels que les traceurs. Bibliographie Georges Bruhat, Optique, sixième édition, collection les cours de référence, Dunod, 2005, 1152 p.
