Université Bordeaux Segalen Facultés de Médecine et de Pharmacie Première Année Commune aux Études de Santé UE2: La Cellule et Les Tissus LE CYTOSQUELETTE Dr D. CAPPELLEN, Lundi 21 Novembre 2011 PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 1 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine • Les filaments intermédiaires • Les microtubules • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 2 LE CYTOSQUELETTE: Introduction • Réseau complexe de filaments et tubules protéiques • S'étend dans tout le cytoplasme et face interne enveloppe nucléaire • Structure très dynamique, réorganisation continue (Division, Migration...) Contrôle Illustration du remodelage du cytosquelette en réponse à un ligand induisant ici la migration Le nom du ligand et les réactifs de marquage ne sont pas à connaître + Héréguline Actine Tubuline Actine: marquage phalloïdine, vert; Tubuline: marquage anticorps, rouge ADN: marquage DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride), bleu Cellules de carcinome mammaire migrant en réponse à l’Héréguline Photographies en microscopie à fluorescence Dr Ali Badache INSERM U 891, Université Aix-Marseille PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 3 LE CYTOSQUELETTE: Introduction • Constitué de trois types principaux de structures protéiques • Ces assemblages protéiques résultent de la polymérisation d'éléments monomériques en des structures allongées Les microfilaments: 5 à 8 nm de diamètre, polymères d’actine Les filaments intermédiaires: 10 nm de diamètre, Monomères constituant variables selon le type cellulaire Les microtubules: 25 nm de diamètre, polymères de tubuline • Noms de ces structures liés à leur aspect en microscopie électronique, technique qui a permis leur mise en évidence PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 4 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine - Nature et structure - Polymérisation de l’actine - Protéines associées - Organisation - Rôles • Les filaments intermédiaires • Les microtubules • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 5 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Microfilaments d’actine (cellule de carcinome mammaire en culture) Photographies en microscopie à fluorescence Dr Ali Badache INSERM U 891, Université Aix-Marseille Actine: marquage phalloïdine, vert ADN: marquage DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride), bleu Illustration: les réactifs de marquage ne sont pas à connaître PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 6 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine • Dans la plupart des cellules animales, l'actine est la protéine la plus abondante (en moyenne, ≥ 5 % de la masse protéique totale) • Les microfilaments d'actine sont des structures dynamiques… …qui peuvent être stabilisés par des protéines associées (par exemple dans les microvillosités et les cellules musculaires) • 3 classes d'actine (monomères), codées par différents gènes: α-actine (cellules musculaires striées & lisses) β-actine Coexistent dans la plupart des types cellulaires γ-actine • 90% d'identité dans la séquence peptidique (variation des 30 acides aminés N-terminaux, sur 375 résidus au total) • Des protéines de liaison interviennent dans la polymérisation, la stabilisation et le couplage des filaments d'actine entre eux PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 7 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine • L’actine monomérique est une molécule globulaire (Actine G) 2 lobes reliés par un segment Un profond sillon (fixation ATP, ADP, Mg2+) Toujours liée à un nucléotide, ATP ou ADP sans lequel elle se dénature Sillon Lobes + Actine G • En présence de KCl, ATP et Mg2+, un complexe catalyseur se fixe du côté (-) des monomères d‘Actine G → formation d'une amorce constituée de trois monomères liés (site de nucléation pour la formation de longs polymères) Trimère d’Actine • Cette amorce sert de site de nucléation → formation de longs polymères: filament d'actine ou Actine-F (actine fibrillaire ou filamenteuse) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 8 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Zone rétrécie (±6 nm) Sillon Lobes 37 nm + 5.5 nm Zone renflée (±8 nm) Zone rétrécie (±6 nm) Actine G Décalage des monomères → 2 spirales à la surface du filament (aspect de deux filaments torsadés) Actine F Les mesures précises ne sont pas à connaître. Retenir ordre de grandeur et périodicité des zones rétrécies et renflées (Cf organisation du filament) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 9 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine - Nature et structure - Polymérisation de l’actine - Protéines associées - Organisation - Rôles • Les filaments intermédiaires • Les microtubules • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 10 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine • La polymérisation de l’actine dépend de la concentration [monomère] Elongation [Actine G] critique (concentration seuil) Polymérisation [Actine G] Dépolymérisation → en concentration suffisante (et conditions adéquates), l’actine polymérise PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 11 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine • La polymérisation de l’actine atteint un équilibre Elongation Phase d’équilibre (plateau) (polymérisation=dépolymérisation) (Polymère) Phase de croissance (polymérisation) très rapide (+~1000 monomères d’actine/sec/filament) Temps (Monomère) Phase de latence (nucléation) • La phase de latence est due au processus de nucléation de trois monomères → amorce pour la formation des longs polymères Actine G monomérique Dimère d’Actine → Liaison faible Trimère d’Actine → Forme stable PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN Polymère (Actine F) 12 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine • La polymérisation de l’actine requiert la présence d’ATP → Monomères d'actine doivent être rechargés en ATP afin de polymériser • Dans le filament, l’actine se comporte comme un ATPase lente Au moment de l’incorporation dans le filament, forme Actine-ATP Dans le filament, forme majoritaire des monomères = Actine-ADP • Après la polymérisation → hydrolyse aléatoire de l'ATP → Libération de phosphate (Pi); l’ADP reste lié à l’actine dans le polymère • L‘hydrolyse de l’ATP est un mécanisme de déstabilisation qui participe à la dépolymérisation → Actine-ADP se détache du polymère aux extrémités des filaments → Si analogue non hydrolysable de l’ATP*, stabilisation des filaments formés (*molécule similaire à l’ATP mais dans laquelle la liaison entre phosphates n’est pas clivable) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 13 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine • La polymérisation de l’actine est un phénomène polarisé • Les sillons des monomères, contenant les nucléotides, sont tous orientés vers la même extrémité du filament Extrémité (+) Sillon Lobes Polymérisation Actine F + Actine G Extrémité (-) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 14 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine • Polymérisation: principalement au niveau de l’extrémité (+) • Au niveau de l’extrémité (-): surtout dépolymérisation → Changements de conformation lors de l’association/dissociation Extrémité (+) Conformation compatible → Incorporation monomère n → Changement de conformation → Incorporation du monomère n+1 … → Croissance rapide (+) (concentration seuil basse) Sous-unité d’Actine G libre Sous-unité d’Actine G incluse dans le polymère Extrémité (-) Actine F (-) Conformation peu compatible → Croissance lente, voire négative (concentration seuil 8x › extrémité +) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 15 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine • La polymérisation de l’actine est un phénomène réversible Dépolymérisation Monomère Actine G Nucléation → Trimère d’Actine Polymérisation → Filament d’Actine F PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 16 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine - Nature et structure - Polymérisation de l’actine - Protéines associées - Organisation - Rôles • Les filaments intermédiaires • Les microtubules • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 17 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Les protéines associées aux microfilaments • Protéines sensibles au [Ca2+] intracellulaire intervenant dans les mécanismes de contraction ou déplacements Troponines → Inhibition de l’association actine/myosine, levée par liaison du Ca2+ (rôle dans l’amorçage la décontraction musculaire) Myosines Myosine II (cellules musculaires+++, mais aussi autres cellules) → Déplacement de groupes de filaments d’actine orientés de façon opposée (contraction musculaire, anneau contractile lors de la mitose…) Myosine I → Déplacement de vésicules le long de filaments d’actine → Attachement de filaments d’actine à la membrane plasmique → Alignement rapproché et glissement de filaments d’actine PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 18 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Les protéines associées aux microfilaments • Myosine II: contraction 1) Etat de repos Dimère de Myosine II (-) (+) Filament d’Actine F (+) (-) 2) Hydrolyse d’ATP: Pivotement des têtes de myosine II → Glissement de la myosine II sur les filaments d’actine, vers extrémité + de l’actine (-) Déplacement de l’Actine (+) (+) (-) Déplacement de l’Actine PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 19 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Les protéines associées aux microfilaments • Myosine I: transport de vésicules le long de filaments d’actine Hydrolyse d’ATP: → Glissement de la myosine I et donc de la vésicule sur les filaments d’actine Filament d’Actine F (-) (+) Tête de myosine I (glissement sur actine) Myosine I Domaine de myosine I ancré à membrane de vésicule (pas de glissement) Transport de la vésicule Vésicule Déplacement de la myosine I (et vésicule associée) vers extrémité + de l’actine PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 20 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Les protéines associées aux microfilaments • Myosine I: → Attachement de filaments d’actine à la membrane plasmique → Alignement rapproché et glissement de filaments d’actine Myosine I Membrane plasmique (-) Filament d’Actine F (+) Tête de myosine I (glissement sur actine) (+) Domaine de myosine I ancré à actine (pas de glissement) (-) (-) (+) Déplacement de la tête de myosine I vers extrémité + d’un filament d’actine: entraîne glissement de ce filament vers l’extrémité + de l’autre filament PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 21 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Les protéines associées aux microfilaments • Protéines régulant la croissance des microfilaments d’actine Thymosine: inhibition de la polymérisation par fixation sur monomère (fixation à l'extrémité - de l'actine G, empêche les échanges de nucléotides) Gelsoline: fragmentation des filaments d’actine (activée par [Ca2+]i) (reste fixée à l'extrémité (+) et évite ainsi la re-polymérisation rapide de l'actine) → Rôle dans exocytose par dissolution locale du cytosquelette sous-membranaire Profiline: fixation à l'actine G, aide à la réintégration dans le polymère Protéines d’association (et leur fonction) à connaître en rouge PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 22 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Les protéines associées aux microfilaments • Protéines stabilisant les microfilaments d’actine et permettant leur ancrage à la membrane plasmique Tropomyosine: s'enroule autour de l'hélice d'actine; rôle stabilisateur CapZ: liaison à l'extrémité (+), stabilisation, prévention dépolymérisation α-actinine: interaction actine-myosine, actine-intégrines Fimbrine, Villine: maintient les filaments serrés d'actine fasciculée Filamine: réseaux réticulés de filaments lâches Spectrines: accrochage des filaments d’actine à la membrane plasmique ancrage latéral des filaments d’actine entre-eux Dystrophine: point d'ancrage de protéines du cytosquelette, maintien de l'architecture des fibres musculaires → Mutations:▪Myopathie de Duchenne (protéine tronquée instable peu/pas exprimée) ▪ Myopathie de Becker (protéine exprimée mais moins fonctionnelle) (Affaiblissement progressif des muscles, grave incapacité motrice et cardio-respiratoire) Protéines d’association (et leur fonction) à connaître en rouge PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 23 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine - Nature et structure - Polymérisation de l’actine - Protéines associées - Organisation - Rôles • Les filaments intermédiaires • Les microtubules • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 24 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Organisation • Les filaments d'actine sont organisés selon trois types d'arrangements 1) Faisceaux parallèles Fimbrine Filamine 2) Réseau de filaments d’actine réticulés (mailles) Alpha actinine Myosine II Microfilaments d’actine Tropomyosine 3) Faisceau de filaments contractiles PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 25 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Organisation • Les faisceaux parallèles dans les microvillosités Rôle → Augmentation +++ de la surface cellulaire apicale Plateau strié (épithélium digestif, capture des nutriments) Bordure en brosse (tube contourné proximal rénal, réabsorption) Microvillosités intestinales (microscopie électronique) Pr D. Louvard (CNRS-Institut Curie, Paris) • Armature des microvillosités: filaments d'actine Associés en faisceaux parallèles Liés entre eux par la fimbrine Orientés avec la même polarité, côté (+) distal Liaison latérale à la membrane plasmique via la myosine I Stabilisés par des protéines de coiffage à leurs extrémités Ancrés sur un réseau de filaments périphériques sous-membranaires (actine corticale) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 26 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Organisation • Les faisceaux parallèles dans les microvillosités Zone dense (protéines de coiffage, empêchent la dépolymérisation) Actine Faisceaux parallèles de filaments d'actine polarisés, côté (+) distal Fimbrine, Villine Liaison latérale à la Myosine I Membrane plasmique Protéines d’association (Fimbrine, Villine) Membrane plasmique Microvillosité en coupe, vue de dessus Protéines d’ancrage latéral (Spectrine) Faisceau d'actine sous-membranaire Filaments intermédiaires (Kératines) Ce schéma –et légendes associées- est une illustration et n’est pas à connaître PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 27 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Organisation • Les réseaux formant des mailles: Trouvés dans les lamellipodes, le réseau sous-membranaire (actine corticale) Filaments organisés en un arrangement relativement lâche, nombreuses interconnexions orthogonales via la filamine Renflement (ruffle) (lamellipode en formation) Faisceau en arc Complexe focal Lamellipode Fibre de tension (=fibres de stress) Réseau lâche Faisceau concave Adhésions focales (=adhérences focales) Complexe focal Filopode (faisceaux serrés parallèles) Schéma de certaines organisations du cytosquelette d’actine: Les détails ne sont pas à connaître. Retenir existence et aspect des lamellipodes (aspect d’éventail), fibres de stress et adhésions focales PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 28 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Organisation • Les réseaux formant des mailles: Queue des filaments d’actine Polymérisation des filaments d’actine Réseau sous-membranaire (actine corticale) → Rôle dans phagocytose et endocytose (grosses vésicules ≠ vésicules recouvertes) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 29 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Organisation • Les faisceaux contractiles : Sarcomères (unité de contraction des fibres musculaires) Ceintures d'adhérence, Anneau contractile mitotique Fibres de tension. • Filaments arrangés avec des polarités opposées, espacés de 40 nm grâce à une liaison à un dimère d'α-actinine • Un complexe bipolaire de plusieurs molécules de myosine-II (protéine motrice) est inséré entre les filaments et engendre la contraction • Contraction repose sur le glissement, entraîné par l'hydrolyse de l'ATP, des filaments d'actine imbriqués avec la myosine-II PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 30 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine Organisation • Les faisceaux contractiles: → Points de contacts focaux et fibres de tension (Contraction/traction sur MEC, essentiel pour cicatrisation) Compartiment intracellulaire Protéines d’association (dont α-actinine…) Myosine II Fibres d’actine dites "de tension" α-actinine (+) (+) Membrane plasmique Intégrines (dimères α/β) Matrice Extracellulaire (MEC) Point focal d’adhérence Protéines MEC (Collagènes…) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 31 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine - Nature et structure - Polymérisation de l’actine - Protéines associées - Organisation - Rôles • Les filaments intermédiaires • Les microtubules • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 32 LE CYTOSQUELETTE: Les microfilaments d’actine • Principaux rôles des microfilaments d’actine : Transport intracellulaire Maintien de la structure de la membrane plasmique Maintien de la forme et des différenciations cellulaires Phagocytose/endocytose (grosses vésicules)/exocytose Interaction cellule-matrice extracellulaire Motilité cellulaire Cytodiérèse PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 33 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine • Les filaments intermédiaires - Nature et structure - Polymérisation - Composition, types - Fonctions • Les microtubules • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 34 LE CYTOSQUELETTE: Les filaments intermédiaires Filaments intermédiaires de kératines (kératinocytes en culture) Photographies en microscopie à fluorescence Dr K.J. Green, Northwestern University School of Medicine, Chicago Filaments de kératine: marquage anticorps, rouge Desmoplakine (desmosomes): marquage anticorps, vert (jaune= superposition avec rouge) ADN: marquage DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride), bleu Illustration: les réactifs de marquage ne sont pas à connaître PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 35 LE CYTOSQUELETTE: Les filaments intermédiaires • Les filaments intermédiaires Polymères protéiques résistants et durables 10 nm de diamètre (compris entre celui des filaments d'actine et celui des microtubules) Réseau extensif dans le cytoplasme de la plupart des cellules Entourent le noyau et s'étendent jusqu'à la périphérie cellulaire Egalement reliés aux desmosomes et hémi-desmosomes Doublent aussi la face interne de l'enveloppe nucléaire (lamines) (non visible sur la photographie ci-dessus car marquage kératines & desmosomes) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 36 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine • Les filaments intermédiaires - Nature et structure - Polymérisation - Composition, types - Fonctions • Les microtubules • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 37 LE CYTOSQUELETTE: Les filaments intermédiaires • La polymérisation des filaments intermédiaires Les protéines qui les constituent = molécules fibreuses très allongées (≠ actine et tubuline, protéines globulaires, nombre d’acides aminés voisin) Leur séquence favorise la formation de dimères superenroulés Au cours de l'étape d'assemblage, Association de 2 dimères superenroulés de manière antiparallèle → sous unité tétramérique = protofilament (3 nm de diamètre) Les tétramères s'ajoutent à un filament en cours d'élongation → 8 protofilaments → filament intermédiaire (10 nm de diamètre) Domaine bâton (310 acides aminés) Tétramères Dimères COOH NH2 Monomères Protofilament (3 nm) Filament (10 nm) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 38 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine • Les filaments intermédiaires - Nature et structure - Polymérisation - Composition, types - Fonctions • Les microtubules • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 39 LE CYTOSQUELETTE: Les filaments intermédiaires • Les composants des filaments intermédiaires Ont toujours tendance à rejoindre un filament en cours de polymérisation (rarement présents à l’état de monomère libre) Toutefois, les composants assemblés peuvent également se dissocier L’assemblage comme la dissociation sont des processus très lents (plusieurs minutes, ≠ quelques secondes pour actine et tubuline) Les processus d’assemblage et la dissociation peuvent être régulés par des modifications post-traductionnelles des protéines (e.g.: phosphorylation) Phosphorylation des lamines (noyau) favorise la dissociation Phosphorylation empêche la dissociation des neurofilaments PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 40 LE CYTOSQUELETTE: Les filaments intermédiaires • Les différents types de filaments intermédiaires Les gènes codant les filaments intermédiaires se sont diversifiés (≠ actine et tubuline dont les gènes ont été bien conservés au cours de l'évolution) Famille d'environ 50 membres subdivisée en 6 classes différentes Classes I et II: Kératines acides et basiques (18 gènes chacune) → S’associent avec des kératines de l’autre classe → Caractéristiques des cellules épithéliales Classe III: 1 gène pour chaque membre → Vimentine: ++ dans cellules fibroblastiques → Desmine: cellules musculaires → GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein): cellules gliales (astrocytes, cell. de Schwann) → Forment essentiellement des homopolymères PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 41 LE CYTOSQUELETTE: Les filaments intermédiaires • Les différents types de filaments intermédiaires (suite…) Classe IV: Neurofilaments (3 gènes: NF-H, -M, -L, pour heavy, medium, light) → Sous-unités de cette classe s’associent entre elles → Le plus souvent sous forme d’hétéropolymères. → Caractéristiques des neurones Classe V: Lamines (3 gènes, LMNA/C, LMNB1, LMNB2) → Forment des homopolymères → Présentes dans toutes les tous types de cellules qui ont un noyau Classe VI: Nestine (1 gène) → Forme des homopolymères → Présente dans les neurones embryonnaires, myocytes PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 42 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine • Les filaments intermédiaires - Nature et structure - Polymérisation - Composition, types - Fonctions • Les microtubules • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 43 LE CYTOSQUELETTE: Les filaments intermédiaires • Fonctions des filaments intermédiaires Maintien de l'intégrité cellulaire et tissulaire de l'épithélium Cytosquelette + molécules d'adhérence → Maintien mécanique de la cellule et du tissu Filaments intermédiaires: 2 types de jonctions d'ancrage → Desmosomes: interaction cellule-cellule, via cadhérines → Hémi-desmosomes: interaction cellule-lame basale, via intégrines (dans les cellules épithéliales) Ex. pathologie: "épidermolyse bulleuse" (maladie génétique) ► Mutations ponctuelles des gènes des kératines 5 et 14 → Désorganisation du réseau de filaments intermédiaires (kératinocytes basaux de l'épiderme) → Sensibilisation+++ aux forces mécaniques - Rupture des cellules à la moindre pression - Inflammation, formation d'ampoules cutanées... (Illustration: cette maladie, les gènes impliqués et atteintes ne sont pas à connaître) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 44 LE CYTOSQUELETTE: Les filaments intermédiaires • Fonctions des filaments intermédiaires Soutien de l'enveloppe nucléaire La lamina nucléaire (double la face interne de l'enveloppe nucléaire) → Treillis de polymères de lamine → Soutient l'enveloppe, donne sa forme au noyau → Se désagrège en début de mitose (phosphorylation des lamines par complexe Cycline/Kinase –CDK-) → Désintégration permet l’entée en jeu des microtubules (séparation des chromosomes) → Réassociation permet ensuite la reconstitution du noyau (en fin de mitose: télophase) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 45 LE CYTOSQUELETTE: Les filaments intermédiaires • Fonctions des filaments intermédiaires Formation des ongles, cheveux et couche cornée de la peau Les filaments de kératine sont formés en excès par → Les cellules épidermiques (kératinocytes) → Les cellules de l'assise génératrice dans le follicule pileux Cet excès de filaments de kératine… → Entraîne la mort des cellules qui restent assemblées (desmosomes) → Formation progressive de… - Couche cornée, ongles, cheveux/poils Note: Caractéristiques physico-chimiques des filaments intermédiaires → Résistance aux tensions et détergents, insolubilité dans l'eau → Protection de l'organisme contre les agressions physiques et chimiques PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 46 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine • Les filaments intermédiaires • Les microtubules - Nature - Assemblage - Polymérisation - Protéines associées - Fonctions • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 47 LE CYTOSQUELETTE: Les microtubules Microtubules (cellule de carcinome mammaire en culture) Photographies en microscopie à fluorescence Dr Ali Badache INSERM U 891, Université Aix-Marseille Tubuline: marquage anticorps, rouge ADN: marquage DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride), bleu Illustration: les réactifs de marquage ne sont pas à connaître PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 48 LE CYTOSQUELETTE: Les microtubules • Les Microtubules Particulièrement abondants dans les cellules eucaryotes (10-20 % des protéines totales dans les cellules nerveuses) Polymères cylindriques, creux et rigides (tubes) Constitués de dimères de tubulines, protéines globulaires Chaque dimère résulte de l'association d'α- et β-tubuline (les tubulines α et β existent chacune sous différentes formes) Il existe également des tubulines γ, δ et ε → Présentes dans les structures centriolaires, pas dans les microtubules Les tubulines α et β lient le GTP Le GTP de l' α-tubuline est enfoui à l'intérieur, donc non échangeable Le GTP de la β-tubuline est exposé en surface et échangeable PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 49 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine • Les filaments intermédiaires • Les microtubules - Nature - Assemblage - Polymérisation - Protéines associées - Fonctions • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 50 LE CYTOSQUELETTE: Les microtubules • Assemblage des microtubules Les microtubules = structures polarisées: Extrémité (+) capable de croissance rapide Extrémité (-) le plus souvent enchâssée dans le centrosome Compartiment extra-cellulaire Noyau (microtubule-organizing center) Membrane plasmique Compartiment intra-cellulaire (= Cytoplasme, composé de hyaloplasme -cytosol+cytosqueletteet organites) Réticulum endoplasmique granuleux (REG) Appareil de Golgi Endosome Endomembranes Centrosome ou MTOC Lysosome Schéma d’après Y. Bassaglia, Biologie Cellulaire. Eds. Maloine PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 51 LE CYTOSQUELETTE: Les microtubules • Assemblage des microtubules Le Centrosome est un complexe protéique Au voisinage du noyau, approximativement au centre cellulaire (d’où son nom) Organisé autour de deux structures appelées centrioles → Constitués de plusieurs formes de tubulines (α, β, γ, δ et ε) En périphérie du centrosome → tubuline-γ (complexe TuRC) → Tubulin Ring Complex: gabarit pour polymérisation des microtubules Centrioles Matériel péri-centriolaire Microtubules Centrosome Tubuline γ Complexe γ-TuRC PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 52 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine • Les filaments intermédiaires • Les microtubules - Nature - Assemblage - Polymérisation - Protéines associées - Fonctions • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 53 LE CYTOSQUELETTE: Les microtubules • Polymérisation des microtubules Au niveau cytoplasmique, formation d’hétérodimères de tubuline α/β, (β chargée en GTP) A partir d'un centrosome, association des dimères de tubuline (β orienté vers pôle plus) → Protofilaments, qui s'assemblent latéralement entre eux → feuillets → Repliement progressif des feuillets → microtubule Plusieurs centaines de microtubules polymérisent en permanence 25 nm de diamètre Extrémité (+) GTP Mg2+ Assemblage de 13 protofilaments β α Hétérodimère Extrémité (-) Protofilament Microtubule PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 54 LE CYTOSQUELETTE: Les microtubules • Dépolymérisation des microtubules Les microtubules se dépolymérisent et se re-polymérisent continuellement (à vitesse variable, de quelques secondes à quelques minutes) Hydrolyse du GTP (tubuline β) à la base de cette "instabilité dynamique" → Change la conformation des sous-unités et affaiblit les liaisons dans le polymère → Séparation des protofilaments, libération des dimères de tubuline (extrémité +) Extrémité (+) Hydrolyse de GTP, dissociation des protofilaments Dépolymérisation GDP GTP β α Extrémité (-) Re-polymérisation PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 55 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine • Les filaments intermédiaires • Les microtubules - Nature - Assemblage - Polymérisation - Protéines associées - Fonctions • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 56 LE CYTOSQUELETTE: Les microtubules • Protéines associées aux microtubules Stabilisation/déstabilisation des microtubules In vitro, dimères se détachent en masse, qualifié de "catastrophe" Si cette dissociation rapide ne s'arrête pas → Désagrégation complète du microtubule Modification de cette instabilité dynamique par protéines "MAP" ("microtubule-associated proteins" présentes sur toute leur longueur) - Exemple: Protéine Tau (axones). → Présence réduit d’un facteur 50 la probabilité de dissociation brutale Protéines qui ajustent la déstabilisation - Exemple: MCAK (mitotic centromere-associated kinesin) → Dissociation ajustée des microtubules kinétochoriens (durant la séparation des chromosomes en anaphase) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 57 LE CYTOSQUELETTE: Les microtubules • Protéines associées aux microtubules Protéines motrices 2 familles de protéines "motrices" interagissent avec les microtubules - Kinésines: se déplacent vers l'extrémité (+) du microtubule - Dynéines: se déplacent vers l'extrémité (-) (vers le centrosome) Toujours associées à d'autres protéines - Kinésines: associées à une chaîne protéique légère → Fixation des organites cellulaires à transporter - Dynéines: complexe avec 6 chaînes intermédiaires et 6 légères Utilisent l'énergie dérivée de cycles répétés d'hydrolyse d'ATP pour se déplacer le long du microtubule (cf myosine-II/actine) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 58 LE CYTOSQUELETTE: Les microtubules • Protéines associées aux microtubules : Protéines motrices Chaines intermédiaires β α Chaines légères (+) Déplacement (-) Domaine moteur (têtes, ATPase) Dynéines Déplacement (+) (-) Chaines légères Kinésines (homodimères enroulés par la queue) Dynéines → Mécanisme d’action pas encore élucidé Interaction kinésine/β-tubuline en absence d'ATP + ATP → mouvement de semi-rotation. Hydrolyse de l'ATP → séparation kinésine/β-tubuline Illustration: cette diapositive n’est pas à connaître PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 59 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine • Les filaments intermédiaires • Les microtubules - Nature - Assemblage - Polymérisation - Protéines associées - Fonctions • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 60 LE CYTOSQUELETTE: Les microtubules • Exemples de fonctions des microtubules Mouvement le long de microtubules Via l’intermédiaire des dynéines et kinésines → Filaments intermédiaires, réticulum endoplasmique, membrane plasmique, appareil de Golgi, vésicules de sécrétion et chromosomes (kinétochores) Importance du transport le long de l'axone du neurone → Microtubules particulièrement nombreux et stables* (* protéine Tau) - Kinésines: transport vers l'extrémité (+) des microtubules = Transport antérograde (du corps cellulaire vers l'arborisation terminale) - Dynéines: transport vers l'extrémité (-) des microtubules = Transport rétrograde (vers le corps cellulaire) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 61 LE CYTOSQUELETTE: Les microtubules • Exemples de fonctions des microtubules Battements des cils et flagelles Flagelles Cils Épithélium Respiratoire Spermatozoïdes (Photo Pr Guy Mayer, Bordeaux) Due à la flexion de leur faisceau de microtubules Ondulation coordonnée des cils de l’épithélium respiratoire (trachée, bronches) → Déplacement unidirectionnel (vers l'extérieur) du mucus bronchique Phénomène actif, suivi d'une phase de récupération passive (retour du cil à sa position initiale) → Mouvement produit par la flexion de sa partie centrale, l'axonème PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 62 LE CYTOSQUELETTE: Les microtubules • Exemples de fonctions des microtubules Battements des cils et flagelles Extension en doigt de gant de la membrane plasmique Axonème Membrane plasmique Doublets de microtubules périphériques (n= 9) Doublet de microtubules central Dynéine (bras externe et interne) Nexine Plaque basale (Coupe transversale) Corpuscule basal 9 triplets de microtubules + protéines associées (Coupe transversale) Ce schéma –et légendes associées- est une illustration et n’est pas à connaître Structurée par un axonème → Constitué d'une armature de doublets de microtubules → Doublets adjacents glissent l’un sur l'autre via interactions avec dynéines (cf transport des vésicules) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 63 LE CYTOSQUELETTE: Les microtubules • Exemples de fonctions des microtubules Séparation des chromosomes pendant la mitose → Rôle essentiel des microtubules et protéines motrices Cellule animale Microtubules (anticorps) Chromosomes (DAPI) Pôle du fuseau mitotique avec paire de centrioles Microtubules kinétochoriens Microtubules polaires Matériel péri-centriolaire amorphe Microtubules astraux Photographie et schéma du Dr M. Pastuglia, UR254 INRA, Versailles Ce schéma est une illustration et n’est pas à connaître PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 64 LE CYTOSQUELETTE: Les microtubules • Quelques unes des autres fonctions des microtubules Intégrité de l’appareil de Golgi Migration de certaines cellules Maintien de la forme des cellules différenciées Maintien de la polarité cellulaire Transport dirigé des ARNm (ex. axones des neurones) PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 65 LE CYTOSQUELETTE • Introduction • Les microfilaments d’actine • Les filaments intermédiaires • Les microtubules • Conclusion PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 66 LE CYTOSQUELETTE • Conclusion: implications et applications en pathologie Pouvoir pathogène de certaines bactéries → Listeria monocystogenes: Colonise les tissus par diffusion de cellule à cellule; Nécessite la formation d'une queue d'actine qui propulse la bactérie Détermination du phénotype cellulaire (diagnostic) Ex: immuno-histochimie des protéines de filaments intermédiaires → Kératines pour identification du type de carcinome… Pathogenèse et ciblage thérapeutique Perturbation des phénomènes de polymérisation dépolymérisation Microfilaments d’actine: Toxines fungiques - Phalloïdine: bloque la dépolymérisation (utilisée pour marquages) - Cytochalasines: bloquent la polymérisation Microtubules: - Anti-mitotiques (thérapeutique cancers: Vinblastine, Vincristine, Taxol) - Colchicine (diagnostic: en cytogénétique, réalisation de caryotypes) Noms de bactérie, toxines fungiques et autres molécules ne sont pas à connaître PACES, Année Universitaire 2011-2012. UE2: La Cellule et Les Tissus. Le cytosquelette (Cours de 2h). Enseignant: Dr D. CAPPELLEN 67
