Analyse et contrôle du lait cru : exercice de biotechnologie

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T BTK
AT de biotechnologies
Analyses et contrôles sur le lait cru
Contexte :
Le lait cru, ou lait de ferme, est un lait
animal (le plus souvent de vache) non
transformé qui conserve donc toutes ses
qualités nutritionnelles. Il est embouteillé
directement à la ferme et est conservé par
simple réfrigération. Les consommateurs
montrent un regain d’intérêt pour le lait
cru qui est même vendu dans des
distributeurs automatiques en libre service.
Or le lait peut subir différentes contaminations d’ordre microbiologique :
-transmission de germes dans le lait directement par des vaches malades (atteintes
de mammite par exemple),
-contamination du lait par manque d’hygiène lors de la traite du lait.
 Ces contaminants entrainent des risques pour le consommateur, mais entraînent
également des modifications des caractéristiques physico-chimiques du lait, qui peut donc
être déstabilisé et ainsi nuire à ses qualités organoleptiques et nutritionnelles.
L’absence de traitement, notamment de traitements de conservation, fait du lait cru un
produit sensible soumis à des contrôles stricts pour vérifier l’absence de fraudes chez les
producteurs et ainsi garantir une qualité optimale pour le consommateur.
Le tableau ci-dessous résume les principaux critères admissibles pour un lait cru :
Lait cru
(au stade conditionnement)
Lait cru
(à la DLC : Date Limite de
Consommation)
Flore totale à 30°C 90.000 / mL 300.000 / mL
E.coli Pas de critère Pas de critère
S.aureus 100 / mL 500 / mL
L’objectif de la séance est de réaliser sur un lot de lait cru :
-des contrôles microbiologiques (flore totale, E.coli , S.aureus ) pour vérifier l’hygiène du
produit (J1),
-des contrôles biochimiques pour vérifier que la présence de flores microbiennes n’entraine
pas d’impact sur les qualités physico-chimiques du produit (J2).
Liste des documents ressources :
-Fiche fournisseur du milieu ColiID ou TBX,
-Fiche technique d’utilisation d’un Pétrifilm.

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Jour 1 : Contrôles microbiologiques sur le lait cru
I-Dénombrement de la flore aérobie totale à 30°C
• Le dénombrement de la flore aérobie totale est un indicateur de la qualité sanitaire globale
d’un lait. Il est réalisé par dénombrement en masse en milieu PCA (Plat Count Agar) à 30°C.
Le lait cru testé étant au stade conditionnement, et en supposant qu’il soit juste à la limite
d’acceptabilité, prévoir la dilution décimale à réaliser pour avoir entre 15 et 300 UFC
comptables. Prévoir un encadrement à ± 1 dilution.
• Réaliser les dilutions décimales en eau peptonée ordinaire de 9 mL, puis ensemencer en
masse, en double essai, les milieux PCA. Incuber 48 H à 30°C.
Exploitation :
Rendre un tableau de résultats, puis exprimer les résultats du dénombrement en UFC / mL.
Conclure à l’aide du document 1.
II-Dénombrement de la flore totale du lait cru par cytométrie directe (technique
de Breed)
Cette technique est utilisée pour un dénombrement approximatif de la flore du lait cru et des
yaourts.
1-Principe
Un volume déterminé d’échantillon de 0,01 mL est étalé sur 1 cm
2
à la surface d’une lame.
Le frottis est coloré puis est ensuite observé au microscope : les micro-organismes sont
comptés sur plusieurs champs de surface connue. Il est possible alors de calculer le nombre
de micro-organismes par mL.
2-Technique
-Délimiter un carré de 1 cm de coté au marqueur indélébile sur une lame.
-Stériliser la lame à la flamme.
-Homogénéiser le lait et prélever exactement 0,01 mL avec une pipette automatique.
-Déposer ce volume sur la face non marquée, au centre du carré observé par transparence.
-Etaler le volume déposé avec la pointe du cône sur toute la surface du carré sans déborder.
-Sécher le frottis ainsi réalisé à l’étuve à 55°C pendant 5 min environ. Il est très important
qu’il soit bien sec pour que la coloration adhère bien.
-Laisser refroidir, puis recouvrir le frottis de bleu de méthylène pendant 30 secondes
-Egoutter la lame jusqu’à ce qu’elle soit complètement sèche.
-Laver sous un très léger filet d’eau.
-Sécher et examiner à l’immersion.
-Compter les micro-organismes présents dans une vingtaine de champs microscopiques (une
chainette ou un amas = 1 micro-organisme). Faire la moyenne des résultats sur les champs
comptés.

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3-Exploitation
-Sachant que le diamètre d’un champ microscopique à l’objectif x1000 est de 180 µm,
déterminer la surface d’un champ microscopique (surface cercle = 3,14 x r
2
)
-A l’aide de la moyenne des micro-organismes comptés par champ, calculer le nombre total
de micro-organismes déposés sur 1 cm
2
, puis exprimer la concentration en micro-organismes
/ mL de lait cru.
-Comparer ce résultat avec les résultats du dénombrement de flore totale sur milieu PCA en
J2.
III-Recherche et dénombrement des coliformes et E.coli
1-Intérêt de la recherche des coliformes et d’ E.coli en microbiologie alimentaire
Les coliformes sont des entérobactéries appartenant à différents genres : Citrobacter ,
Enterobacter , Escherichia … que l’on retrouve fréquemment dans l’environnement, ainsi que
dans l’intestin des mammifères, dont l’homme.
 Cf supports théoriques « Les flores de contamination »
Parmi ces différentes bactéries, E.coli est très intéressante car elle est le seul coliforme
totalement spécifique de l’intestin : c’est donc un témoin de contamination fécale. De plus,
E.coli est un germe relativement fragile, qui ne peut survivre longtemps dans
l’environnement.
La recherche d’ E.coli est donc très intéressante : si la bactérie est présente dans un aliment,
cela signifie que celui-ci a été récemment contaminé par des matières fécales et que d’autres
pathogènes peuvent être présents : on parle de contamination fécale récente. Il faudra
donc ensuite rechercher la source de la contamination et corriger la situation.
 la recherche d’E.coli dans un lait cru est donc un critère important permettant
de vérifier que celui-ci a été prélevé et stocké dans de bonnes conditions
d’hygiène.
2-Méthodes d’étude des coliformes et d’ E.coli
Il existe de nombreuses méthodes d’étude des coliformes et d’ E.coli utilisant des milieux
variés. Les normes récentes permettent d’utiliser de nouveaux milieux de culture dits
chromogéniques, qui permettent de différencier directement E.coli des coliformes (exemple
du milieu de culture ColiID de Bio-Mérieux ou du milieu TBX).
3-Dénombrement sur milieu ColiID ou TBX
On réalisera le dénombrement en surface, en simple essai, à partir des dilutions 10
-1
, 10
-2
et
10
-3
. Incuber selon les recommandations proposées dans la fiche fournisseur.

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Exploitation :
-A l’aide de la fiche fournisseur, identifier les colonies caractéristiques de E.coli sur TBX ou
ColiID.
-Rendre un tableau de résultats, puis exprimer les résultats du dénombrement en UFC / mL
par calcul classique, puis à l’aide de la formule AFNOR ci-dessous. Comparer les résultats
obtenus.
-Le tableau en introduction ne mentionne aucun critère pour E.coli . Quel est donc l’intérêt de
ce dénombrement ?
Formule AFNOR
Σ c
N =
(n1 + 0,1 n2) x V x d
IV-Recherche et dénombrement de Staphylococcus aureus
1-Intérêt de la recherche de Staphylococcus aureus en microbiologie alimentaire
S.aureus est une bactérie commensale de l’homme : on la retrouve dans les cavités ORL à
partir desquelles elle est disséminée en aérosols sur la peau, y compris les mains. Elle peut
être pathogène dans certaines circonstances et au niveau de certains tissus (pathogène
opportuniste).
Dans l’industrie alimentaire, pour se préserver de S.aureus , l’hygiène des opérateurs doit
donc être irréprochable : lavage des mains, lavage des bottes, désinfection des matériels,
port d’équipement spéciaux (masques, charlottes, etc.).
Dans le cadre d’un dénombrement sur du lait cru, cette recherche permet donc de vérifier
les bonnes conditions d’hygiène du personnel dans le local de traite.
2-Dénombrement sur Pétrifilm Staph express
A l’aide de la fiche technique fournie, proposer le protocole à mettre en œuvre pour
dénombrer S.aureus sur Pétrifilm Staph express. On testera la dilution 10
0
en simple essai.
Exploitation :
-A l’aide de la fiche fournisseur, identifier les colonies caractéristiques de S.aureus sur
Petrifilm Staph express.
-Rendre un tableau de résultats, puis exprimer les résultats du dénombrement en UFC / mL,
à l’aide de la formule AFNOR. Conclure.
N =
concentration en
UFC /mL
Σ c : somme des colonies comptées sur les boites choisies
n1 = nombre de boites comptées à la première dilution
n2 = nombre de boites comptées à la deuxième dilution
V = volume d’inoculum par boite
d = première dilution

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Jour 2 : Contrôles biochimiques portant sur le lactose
La concentration massique normale en lactose du lait représente environ 50 g/L. Ce glucide
est un diholoside, de formule développée suivante (représentation de Haworth) :
Lorsque le lait cru subit une contamination importante, les micro-organismes à l’aide de leur
β galactosidase peuvent dégrader le lactose en libérant ses oses constitutifs. Ces oses sont
ensuite consommés par les germes pour former de l’acide lactique, ce qui acidifie le lait et
peut à terme le faire cailler.
Deux contrôles biochimiques seront réalisés pour vérifier que le lait cru n’a pas subit
d’altérations (par binôme) :
-une caractérisation du lactose par chromatographie sur couche mince (élève 1),
-un dosage du lactose par méthode spectrophotométrique (élève 2).
I-Défécation préliminaire
La couleur blanche opaque du lait empêche d’y mesurer une absorbance. Cette opacité
provient des grosses protéines lactiques (caséines) et d’émulsions de matières grasses : on
élimine donc au préalable ces composés parasites par précipitation + centrifugation (=
défécation)
Protocole
Introduire dans un tube centrifugeable,
-5 mL de lait cru (préalablement stérilisé pour éliminer les micro-organismes),
-5 mL de solution défécante (solution de sulfate de cuivre et de zinc)
Laisser agir au moins 5 minutes pour précipiter les protéines et les matières grasses, puis
centrifuger à 4500 rpm pendant 5 min.
Récupérer le filtrat.
La préparation de ce tube a été réalisée à partir du lait cru du J1 : le filtrat est fourni prêt à
l’emploi.
II-Caractérisation du lactose du lait par chromatographie sur couche mince
Réactifs Pictogrammes de sécurité
Molish
Solvant de migration