Réactions immunologiques utilisant des anticorps marqués N.M Introduction ▪ ▪ ▪ Techniques immuno analyses utilisant un traceur détectable pour révéler et quantifier la réaction Ac-Ag. Avantage : très performantes « sensibilité + fiabilité + rapidité » Marqueur : entité « atome, molécule, ion… » lié chimiquement à un Ag ou Ac, et délivrant un signal direct ou indirect, quantitavement mesurable Caractérisées par : ✓ Sensibilité : la capacité à détecter et à doser des concentrations très faibles de l’analyte ✓ Exactitude : l’étroitesse de l’accord entre une valeur mesurée et une valeur vraie d’un analyte. ✓ Fidélité- précision : la variation des valeurs obtenues lors de mesures répétées effectuées dans des conditions expérimentales bien déterminées. ✓ Spécificité : la spécificité d’une technique est sa capacité à mesurer sélectivement un analyte. I-Méthodes d’immunofluorescence ▪ ▪ Un Ac est couplé à un fluorochrome qui est excité par une lumière UV, va émettre une lumière fluorescente. Ex : fluoresceine (lumière verte) et la rodamine (lumière rouge) Observation au microscope à UV 1 Principe Fluorochrome / Fluorophore = luminophore susceptible d’émettre une lumière fluorescente sous l’effet d’une énergie excitatrice lumineuse. ▪ ▪ ▪ ▪ Les anticorps pouvaient être marqués par des molécules qui ont la propriété d’êtres fluorescentes, appelées Fluorophores ou Fluorochromes. Elles absorbent la lumière d’une certaine longueur d’onde (excitation) et émettent de la lumière d’une autre longueur d’onde (émission) La fluorescence est un phénomène physique caractérisé par l’émission d’une lumière de plus faible énergie que celle absorbée. La molécule excitée retourne à son état de repos, en passant par un état intermédiaire. Etapes : 1) Passage des électrons à un état excité 2) Absorption d’une lumière avec une faible longueur d’onde 3) Retour à l’état de base par émission d’une lumière fluorescente avec une longueur d’onde plus grande Spectre d’absorption Spectre d’émission 2- Méthodes de l’Immunofluorescence : : ce sont des techniques qualitatifs 1/ Méthode Directe : 𝑨𝒈 𝒑𝒓é𝒍𝒆𝒗é 𝒅𝒖 𝒑𝒂𝒕𝒊𝒆𝒏𝒕 (𝒑𝒓é𝒔𝒆𝒏𝒕 𝒅𝒂𝒏𝒔 𝒔𝒆𝒔 𝒄𝒆𝒍𝒍𝒖𝒍𝒆𝒔) + 𝑨𝒄 𝒔𝒚𝒏𝒕𝒉é𝒕𝒊𝒒𝒖𝒆 𝒎𝒂𝒓𝒒𝒖é 𝒂𝒖 𝒇𝒍𝒖𝒐𝒓𝒐𝒄𝒉𝒓𝒐𝒎𝒆 ▪ Marquage des Ac spécifiques de chaque Ag ▪ Permet de détecter l’Ag : s’il y a fluorescence donc l’Ag est présent → C’est une technique qualitative. Avantages : ✓ Une seule réaction est effectuée. ✓ Le contrôle de spécificité est plus simple. Applications : ✓ Identifier un germe. ✓ Analyser dans une biopsie tissulaire les dépôts d’immunoglobulines et de complément. ✓ Immuno phenotypage des LB, LT « CD4 et CD8 ». 2/ Méthode Indirecte : 𝐶𝑒𝑙𝑙𝑢𝑙𝑒𝑠 𝑠𝑦𝑛𝑡ℎé𝑡𝑖𝑞𝑢𝑒𝑠 (𝑝𝑜𝑟𝑡𝑎𝑛𝑡 𝑙 ′ 𝑨𝒈) + 𝑆é𝑟𝑢𝑚 𝑑𝑢 𝑝𝑎𝑡𝑖𝑒𝑛𝑡 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑎𝑛𝑡 𝑙 ′ 𝑨𝒄 + 𝑨𝒄 𝒂𝒏𝒕𝒊 𝑨𝒄 𝑚𝑎𝑟𝑞𝑢é𝑠 𝑝𝑎𝑟 𝑢𝑛 𝒇𝒍𝒖𝒐𝒓𝒐𝒄𝒉𝒓𝒐𝒎𝒆 ▪ Technique la plus utilisée, surtout pour la recherche d’auto Ac Avantages : Plus grande sensibilité que la méthode directe (4 à 10 fois supérieure), car de multiples molécules de fluorochrome se lient à chaque molécule d’anticorps primaires (le 1er Ac sert ici d’antigène avec plusieurs sites antigéniques) 3/ Réactions double marquage : 𝟐 𝒕𝒚𝒑𝒆𝒔 𝒅′ 𝑨𝒈 𝑝𝑟é𝑙𝑒𝑣é 𝑑𝑢 𝑝𝑎𝑡𝑖𝑒𝑛𝑡 + 𝟐 𝒕𝒚𝒑𝒆𝒔 𝒅′ 𝑨𝒄 𝑚𝑎𝑟𝑞𝑢é𝑠 𝑝𝑎𝑟 𝟐 𝒇𝒍𝒖𝒐𝒓𝒐𝒄𝒉𝒓𝒐𝒎𝒆𝒔 𝒅𝒊𝒇𝒇é𝒓𝒆𝒏𝒕𝒔 ▪ Utilisation de plusieurs marqueurs fluorescents dans la même réaction simultanément ou successivement ▪ ▪ Dans ce cas on recherche sur le même frottis ou la même coupe 2 Ag différents On utilise alors 2 réactifs différents : 1. Un Ac contre le premier antigène marqué à la fluorescéine 2. Un Ac marqué à la rhodamine Les 2 conjugués peuvent être ajoutés successivement ou ensemble 3- Application de l’Immunofluorescence 1/ Auto immunité : En pratique : Détection des AAN sur cellules HEp2 2/ En immunologie cellulaire : Immunophénotypage lymphocytaire par cytométrie en flux II-Méthodes immuno-enzymatique ▪ ▪ ▪ ▪ Méthodes pratiques et simples qui ont remplacé les radios immunologiques qui étaient toxiques On mesure l'activité enzymatique grâce à une réaction colorée, à partir d’un substrat incolore initialement « chromogène » qui sera catalysé par une enzyme et donne un produit coloré La spectrophotométrie permet la mesure de la densité optique DO du signal coloré qui est corrélée avec la quantité de la molécule mesurée Il existe plusieurs variantes : directe, indirecte, en sandwich et par compétition Différents types de conjugués : a. Conjugue Simple : Anticorps – Enzyme : on fixe un Ac à l’enzyme et on rajoute le chromogène. b. Conjugue Associant le couple Avidine-Biotin : ▪ ▪ ▪ ▪ L’Ac est couplé à la biotine L’enzyme sera conjugué à l’avidine L’avidine a une forte capacité de se lier à la biotine. L’intérêt est que l’avidine peut fixer plusieurs biotines, ce qui permet d’amplifier le signal par rapport à un conjugué classique, ce qui permet d’augmenter la sensibilité de la technique ▪ ▪ La révélation consiste à mesurer l'activité catalytique de l'enzyme par spectrophotométrie. Calcul : Le principe général consiste à établir une courbe d'étalonnage Méthodes d’immuno-enzymatique : 1/ ELISA directe : dosage de l’Ag -Il est possible de fixer la totalité de l’Ag présent dans l'échantillon à doser sur la paroi du support, puis de révéler cet Ag par l'Ac marqué à une enzyme. -Etapes : ✓ Ag du patient fixé sur un support solide + Ac marqués par des enzymes ✓ Lavage : pour se débarasser de tous ce qui n’est pas fixé et pour ne pas fausser la réaction ✓ Rajout du substrat (chromogène) qui sera catalysé par l’enzyme en un produit coloré ✓ Mesure de la DO (densité optique) et extrapolation de la valeur 2/ ELISA indirecte : dosage de l’Ac : -C’est la technique la plus fréquemment utilisée en pratique. Le conjugué se fixe à l’Ac à doser. -Etapes : ✓ Ag synthétique en excès fixé sur un support solide + sérum du patient contenant les Ac ✓ Lavage ✓ Rajout des Ac marqués par l’enzyme + Substrat (chromogène) → Produit coloré ✓ On mesure la DO et extrapolation de la valeur 3/ ELISA par compétition 1-Dosage des Ac : Technique par défaut d’Ag : Etapes : ✓ Ag en quantité limitée, fixé au support solide + Ac marqués par l’enzyme + Ac à doser (sérum du patient) ✓ Compétition entre les Ac marqués et les Ac non marqués, car les sites de l’Ag sont limités ✓ Rajout du substrat → Les Ac marqués par l’enzyme donnent un produit coloré La concentration de la molécule à doser est inversement proportionnelle à l’intensité du signal mesuré : ✓ ↑ Densité de la couleur → ↓ Quantité d’Ac non marqués ✓ ↓ Densité de la couleur → ↑ Quantité d’Ac non marqués 2-Dosage des Ag : Technique par défaut d’Ac : Etapes : ✓ Ac en quantité limitée, fixé au support solide + Ag marqués par l’enzyme + Ag à doser du patient ✓ Compétition entre les Ag marqués et les Ag non marqués, car les sites de l’Ac sont limités ✓ Rajout du substrat → Les Ag marqués par l’enzyme donnent un produit coloré ▪ ▪ ▪ 4/ ELISA Sandwich : Dosage de l’Ag : 2 Ac fixés sur un support solide + Ag du patient + Ac marqués par l’enzyme + Substrat → Produit coloré Mesure de la DO qui est directement proportionnelle à la quantité d’Ag mesuré L’Ag doit posséder 2 épitopes différents, il est pris en sandwich entre 2 Ac : ✓ Ac 1 reconnait épitope 1 sur l’Ag ✓ Ac 2 reconnait épitope 2 sur l’Ag ENZYMO-IMMUNOASSAY EIA ELISA direct Peu d’étapes donc : plus rapide et risque d’erreur diminué ELISA indirect -Sensibilité augmentée car plus d’un conjugué peut se fixer par Ac -Flexible : même conjugué pour plusieurs Ac primaires -Peu couteuse ELISA Sandwich Spécificité augmentée car 2 Ac par Ag ELISA compétition Flexibilité maximale (direct, indirect, sandwich) Conjugué haptène-enzyme : technique EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique) ✓ Dans ces méthodes (toutes trois servent à doser des antigènes), il n'y a pas de phase de lavage. ✓ Dans les deux premiers cas, le signal augmente avec [Ag], dans le troisième il diminue lorsque [Ag] croît. III-Méthodes immuno-radiologiques ▪ ▪ ▪ Radio-isotopes sont des atomes dont les noyaux sont énergétiquement instables, qui émets par un processus spontané l’énergie excédentaire sous forme de rayonnement ionisants. Ultrasensibles : dosage des hormones, médicaments, marqueurs tumoraux…… Radio-isotope : iode 125 et la thymidine tritiée. 1-RIA (Radio Immuno Assay) : Méodthe par compétition -Permet le dosage d’Ag ou d’Ac -Etapes : ex : dosage Ag ✓ Ac en quantité limitée sur un support solide + Ag marqué par le radio-isotope + Ag du patient ✓ Compétition entre les Ag marqués et les Ag non marqués ✓ Mesure de la radioactivité qui est inversement proportionnelle à la quantité d’Ag à doser (du patient). 2-IRMA (Immunoradiometric Assay) : Méthode sandwich non compétitive : En excès d’Ac ✓ Ac en excès fixés sur un support solide + Ag à doser (sérum) ✓ Lavage et Rajout d’Ac marqué par le radioactif ✓ L’Ag à doser est pris en sandwich entre les Ac fixés et Ac marqués ✓ La radioactivité liée est directement proportionnelle à la concentration de la molécule à doser. Avantages : ✓ ✓ ✓ ✓ Inconvénients : Sensibilité très élevée L’isotope permet un marquage facile. Signal direct Signal spontané : ne faisant pas intervenir une source d’énergie externe ✓ Les précautions et surveillances nécessaires lors de la manipulation. ✓ Le temps de mesure du signal isotopique est long ✓ Gestion des déchets radio actifs. IV-Méthodes chimiluminiscentes ▪ ▪ ▪ L’excitation des molécules est due à un apport d’énergie chimique La chimiluminescence se caractérise seulement par un spectre d’émission et c’est une technique quantitative L’émission de lumière commence, immédiatement, après le début de la réaction chimique. L’intensité d’émission : ✓ Augmente, rapidement ✓ Passe par un maximum ✓ Pour, ensuite, diminuer et s’annuler en quelques secondes. Le signal luminescent L’émission lumineuse peut provenir, soit : ✓ Du marqueur (Luminophore) ✓ D’une molécule transformée par une enzyme spécifique utilisée comme marqueur Luminophore : Les plus utilisés sont : ✓ Luminol ✓ Isoluminol ✓ Dérivés substitués de l’isoluminol Luminol ▪ Par des réactions d’oxydation en présence d’H2O2 (peroxyde d’hydrogène) et d’un catalyseur. Ces molécules sont transformées en espèces excitées qui se désexcitent, ensuite, avec émission de photons Avantages : ▪ ▪ ▪ La chimiluminescence étant, seulement, caractérisée par un spectre d’émission (pas de lumière d’excitation) n’est, donc, pas perturbée par la lumière parasite Une grande spécificité du signal La durée d’émission est variable d’une seconde à quelques dizaines de secondes permettant une lecture rapide Inconvénients : Un problème de la reproductibilité du signal : ✓ La lecture est rapide mais unique car l’émission lumineuse est fugace et d’intensité maximale fluctuante (variable au cours de la réaction chimique). ✓ Lecture à l’aide d’un automate qui contrôlerait : l’injection du réactif et la chronologie de mesure de la lumière émise Conclusion Enzymatique Traceur - Peroxydase - Phosphatase alcaline - Iode 123 - Thymidine tritiée Radioactif - Chélates de Lanthanide (Europium) Fluorescent - Luminol - Dioxétanes Luminescent Avantages - simplicité du marquage - pas d’appareillage spécialisé - sensibilité - faible encombrement stérique - signal direct et spontané - précision - sensibilité Inconvénients - très dépendant des conditions opératoires - faible dynamique du signal - législation - Gestion des risques (commandes et élimination des déchets) - facilité du marquage - stabilité du traceur (mesure répétée plusieurs fois en quelques secondes) - précision - sensibilité - mesure rapide - stabilité du traceur - signal très spécifique - acquisition rapide et très grande dynamique du signal - sensibilité - interférences - faible dynamique du signal - appareillage spécialisé - signal fugace - appareillage spécialisé
