Réactions Immunologiques : Anticorps Marqués

Réactions immunologiques utilisant des anticorps marqués
Introduction
▪ Techniques immuno analyses utilisant un traceur détectable pour révéler et quantifier la réaction Ac-Ag.
▪ Avantage : très performantes « sensibilité + fiabilité + rapidité »
▪ Marqueur : entité « atome, molécule, ion… » lié chimiquement à un Ag ou Ac, et délivrant un signal direct ou
indirect, quantitavement mesurable
Caractérisées par :
✓ Sensibilité : la capacité à détecter et à doser des concentrations très faibles de l’analyte
✓ Exactitude : l’étroitesse de l’accord entre une valeur mesurée et une valeur vraie d’un analyte.
✓ Fidélité- précision : la variation des valeurs obtenues lors de mesures répétées effectuées dans des conditions
expérimentales bien déterminées.
✓ Spécificité : la spécificité d’une technique est sa capacité à mesurer sélectivement un analyte.
I-Méthodes d’immunofluorescence
▪ Un Ac est couplé à un fluorochrome qui est excité par une lumière UV, va émettre une lumière fluorescente.
Ex : fluoresceine (lumière verte) et la rodamine (lumière rouge)
▪ Observation au microscope à UV
1 Principe
Fluorochrome / Fluorophore = luminophore susceptible d’émettre une lumière fluorescente sous l’effet d’une
énergie excitatrice lumineuse.
▪ Les anticorps pouvaient être marqués par des molécules qui ont la propriété d’êtres fluorescentes, appelées
Fluorophores ou Fluorochromes.
▪ Elles absorbent la lumière d’une certaine longueur d’onde (excitation) et émettent de la lumière d’une autre
longueur d’onde (émission)
▪ La fluorescence est un phénomène physique caractérisé par l’émission d’une lumière de plus faible énergie que
celle absorbée.
▪ La molécule excitée retourne à son état de repos, en passant par un état intermédiaire.
Etapes :
1) Passage des électrons à un état excité
2) Absorption d’une lumière avec une faible longueur d’onde
3) Retour à l’état de base par émission d’une lumière fluorescente avec une longueur d’onde plus grande
N.M

2- Méthodes de l’Immunofluorescence : : ce sont des techniques qualitatifs
1/ Méthode Directe :
𝑨𝒈 𝒑𝒓é𝒍𝒆𝒗é 𝒅𝒖 𝒑𝒂𝒕𝒊𝒆𝒏𝒕 (𝒑𝒓é𝒔𝒆𝒏𝒕 𝒅𝒂𝒏𝒔 𝒔𝒆𝒔 𝒄𝒆𝒍𝒍𝒖𝒍𝒆𝒔) + 𝑨𝒄 𝒔𝒚𝒏𝒕𝒉é𝒕𝒊𝒒𝒖𝒆 𝒎𝒂𝒓𝒒𝒖é 𝒂𝒖 𝒇𝒍𝒖𝒐𝒓𝒐𝒄𝒉𝒓𝒐𝒎𝒆
▪ Marquage des Ac spécifiques de chaque Ag
▪ Permet de détecter l’Ag : s’il y a fluorescence donc l’Ag est présent → C’est une technique qualitative.
Avantages :
✓ Une seule réaction est effectuée.
✓ Le contrôle de spécificité est plus simple.
Applications :
✓ Identifier un germe.
✓ Analyser dans une biopsie tissulaire les dépôts d’immunoglobulines et de complément.
✓ Immuno phenotypage des LB, LT « CD4 et CD8 ».
2/ Méthode Indirecte :
𝐶𝑒𝑙𝑙𝑢𝑙𝑒𝑠 𝑠𝑦𝑛𝑡ℎé𝑡𝑖𝑞𝑢𝑒𝑠 (𝑝𝑜𝑟𝑡𝑎𝑛𝑡 𝑙′𝑨𝒈)+ 𝑆é𝑟𝑢𝑚 𝑑𝑢 𝑝𝑎𝑡𝑖𝑒𝑛𝑡 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑎𝑛𝑡 𝑙′𝑨𝒄
+𝑨𝒄 𝒂𝒏𝒕𝒊 𝑨𝒄 𝑚𝑎𝑟𝑞𝑢é𝑠 𝑝𝑎𝑟 𝑢𝑛 𝒇𝒍𝒖𝒐𝒓𝒐𝒄𝒉𝒓𝒐𝒎𝒆
▪ Technique la plus utilisée, surtout pour la recherche d’auto Ac
Avantages :
Plus grande sensibilité que la méthode directe (4 à 10 fois supérieure), car de multiples molécules de fluorochrome
se lient à chaque molécule d’anticorps primaires (le 1er Ac sert ici d’antigène avec plusieurs sites antigéniques)
3/ Réactions double marquage :
𝟐 𝒕𝒚𝒑𝒆𝒔 𝒅′𝑨𝒈 𝑝𝑟é𝑙𝑒𝑣é 𝑑𝑢 𝑝𝑎𝑡𝑖𝑒𝑛𝑡 + 𝟐 𝒕𝒚𝒑𝒆𝒔 𝒅′𝑨𝒄 𝑚𝑎𝑟𝑞𝑢é𝑠 𝑝𝑎𝑟 𝟐 𝒇𝒍𝒖𝒐𝒓𝒐𝒄𝒉𝒓𝒐𝒎𝒆𝒔 𝒅𝒊𝒇𝒇é𝒓𝒆𝒏𝒕𝒔
▪ Utilisation de plusieurs marqueurs fluorescents dans la même réaction simultanément ou successivement
▪ Dans ce cas on recherche sur le même frottis ou la même coupe 2 Ag différents
▪ On utilise alors 2 réactifs différents :
1. Un Ac contre le premier antigène marqué à la fluorescéine
2. Un Ac marqué à la rhodamine
Les 2 conjugués peuvent être ajoutés successivement ou ensemble
Spectre d’absorption
Spectre d’émission

3- Application de l’Immunofluorescence
1/ Auto immunité : En pratique : Détection des AAN sur cellules HEp2
2/ En immunologie cellulaire : Immunophénotypage lymphocytaire par cytométrie en flux
II-Méthodes immuno-enzymatique
▪ Méthodes pratiques et simples qui ont remplacé les radios immunologiques qui étaient toxiques
▪ On mesure l'activité enzymatique grâce à une réaction colorée, à partir d’un substrat incolore initialement «
chromogène » qui sera catalysé par une enzyme et donne un produit coloré
▪ La spectrophotométrie permet la mesure de la densité optique DO du signal coloré qui est corrélée avec la quantité
de la molécule mesurée
▪ Il existe plusieurs variantes : directe, indirecte, en sandwich et par compétition
Différents types de conjugués :
a. Conjugue Simple : Anticorps – Enzyme : on fixe un Ac à l’enzyme et on rajoute le chromogène.
b. Conjugue Associant le couple Avidine-Biotin :
▪ L’Ac est couplé à la biotine
▪ L’enzyme sera conjugué à l’avidine
▪ L’avidine a une forte capacité de se lier à la
biotine.
▪ L’intérêt est que l’avidine peut fixer plusieurs
biotines, ce qui permet d’amplifier le signal par
rapport à un conjugué classique, ce qui permet
d’augmenter la sensibilité de la technique

▪ La révélation consiste à mesurer l'activité catalytique de l'enzyme par
spectrophotométrie.
▪ Calcul : Le principe général consiste à établir une courbe d'étalonnage
Méthodes d’immuno-enzymatique :
1/ ELISA directe : dosage de l’Ag
-Il est possible de fixer la totalité de l’Ag présent dans l'échantillon à doser sur la paroi du support, puis de révéler
cet Ag par l'Ac marqué à une enzyme.
-Etapes :
✓ Ag du patient fixé sur un support solide + Ac marqués par des enzymes
✓ Lavage : pour se débarasser de tous ce qui n’est pas fixé et pour ne pas fausser la réaction
✓ Rajout du substrat (chromogène) qui sera catalysé par l’enzyme en un produit coloré
✓ Mesure de la DO (densité optique) et extrapolation de la valeur
2/ ELISA indirecte : dosage de l’Ac :
-C’est la technique la plus fréquemment utilisée en pratique. Le conjugué se fixe à l’Ac à doser.
-Etapes :
✓ Ag synthétique en excès fixé sur un support solide + sérum du patient contenant les Ac
✓ Lavage
✓ Rajout des Ac marqués par l’enzyme + Substrat (chromogène) → Produit coloré
✓ On mesure la DO et extrapolation de la valeur
3/ ELISA par compétition
1-Dosage des Ac : Technique par défaut d’Ag :
Etapes :
✓ Ag en quantité limitée, fixé au support solide + Ac marqués par l’enzyme + Ac à doser (sérum du patient)
✓ Compétition entre les Ac marqués et les Ac non marqués, car les sites de l’Ag sont limités
✓ Rajout du substrat → Les Ac marqués par l’enzyme donnent un produit coloré
La concentration de la molécule à doser est inversement proportionnelle à l’intensité du signal mesuré :
✓ ↑ Densité de la couleur → ↓ Quantité d’Ac non marqués
✓ ↓ Densité de la couleur → ↑ Quantité d’Ac non marqués

2-Dosage des Ag : Technique par défaut d’Ac :
Etapes :
✓ Ac en quantité limitée, fixé au support solide + Ag marqués par l’enzyme + Ag à doser du patient
✓ Compétition entre les Ag marqués et les Ag non marqués, car les sites de l’Ac sont limités
✓ Rajout du substrat → Les Ag marqués par l’enzyme donnent un produit coloré
4/ ELISA Sandwich : Dosage de l’Ag :
▪ 2 Ac fixés sur un support solide + Ag du patient + Ac marqués par l’enzyme + Substrat → Produit coloré
▪ Mesure de la DO qui est directement proportionnelle à la quantité d’Ag mesuré
▪ L’Ag doit posséder 2 épitopes différents, il est pris en sandwich entre 2 Ac :
✓ Ac 1 reconnait épitope 1 sur l’Ag
✓ Ac 2 reconnait épitope 2 sur l’Ag
Conjugué haptène-enzyme : technique EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique)
✓ Dans ces méthodes (toutes trois servent à doser des antigènes), il n'y a pas de phase de lavage.
✓ Dans les deux premiers cas, le signal augmente avec [Ag], dans le troisième il diminue lorsque [Ag] croît.
III-Méthodes immuno-radiologiques
▪ Radio-isotopes sont des atomes dont les noyaux sont énergétiquement instables, qui émets par un processus
spontané l’énergie excédentaire sous forme de rayonnement ionisants.
▪ Ultrasensibles : dosage des hormones, médicaments, marqueurs tumoraux……
▪ Radio-isotope : iode 125 et la thymidine tritiée.
1-RIA (Radio Immuno Assay) : Méodthe par compétition
-Permet le dosage d’Ag ou d’Ac
-Etapes : ex : dosage Ag
✓ Ac en quantité limitée sur un support solide + Ag marqué par le radio-isotope + Ag du patient
✓ Compétition entre les Ag marqués et les Ag non marqués
✓ Mesure de la radioactivité qui est inversement proportionnelle à la quantité d’Ag à doser (du patient).
ENZYMO-IMMUNOASSAY EIA
ELISA direct
ELISA indirect
ELISA Sandwich
ELISA compétition
Peu d’étapes donc :
plus rapide et risque
d’erreur diminué
-Sensibilité augmentée car plus
d’un conjugué peut se fixer par Ac
-Flexible : même conjugué pour
plusieurs Ac primaires
-Peu couteuse
Spécificité augmentée
car 2 Ac par Ag
Flexibilité maximale (direct,
indirect, sandwich)