Pr. Izaabel Hassan e mail : [email protected] Cours de Génomique structurale • La génomique est l'étude exhaustive du génome, des différentes séquences qui le compose et en particulier, de l'ensemble des gènes, de leur structure, de leur disposition sur les chromosomes, de leur séquence, de leur fonction et de leur rôle. • Références : • • • • • • • • Génétique (8e édition) de W. Klug, M. Cumming et C. Spencer Gènes V de Lewin Précis de génomique de Gibson & Muse Expression du gènome de Herbomel Gènes & Gènome de Singer et Berg Biologie moléculaire et médecine de J.C Kaplan et M. Delpech Génétique moléculaire Humaine de T. Strachan et A.P. Read Introduction à l’analyse génétique de Griffiths, Miller et al Chapitre I Structure fine de la chromatine et régulation de l’expression génique. • Chapitre I : Structure fine de la chromatine et régulation de l’expression génique. I. I. Généralités Dans le noyau : – le DNA n’est jamais nu, mais toujours associé à des protéines et même à des ARN. – L’ensemble constituant ce que l’on appelle la chromatine. La vie cellulaire impose qu’à tout moment l’information adéquate soit trouvée parmi les 3 milliards de paires de bases, puis lue de manière régulée. • Cette information doit être protégée, réparée en cas d’altération et enfin pérennisée dans les cellules filles. • Tout cela est l’œuvre - au moins en très large part - des protéines de la chromatine qui joue un rôle centrale. • Ce n’est que par la connaissance détaillée de leur structure que l’on pourra comprendre la régulation de l’expression des gènes. La chromatine se présente (au stade interphasique) le plus souvent sous la forme d'une matière sans structure particulière. A certains moments de la vie de la cellule (aux moments des multiplications (ou stade métaphasique), la chromatine perd son aspect diffus et se condense en structures bien définies: les chromosomes. La fibre de la chromatine observée au microscope électronique a un diamètre de 100nm. Dans certains conditions expérimentales cette fibre peut présenter soit un diamètre de 30nm (300A°) ou 10nm (100A°). Ces différentes valeurs sont très supérieures au diamètre de la double hélice de l’ADN qui est de 20A°. 100 nm 30 nm 10 nm Chapitre I : Structure fine de la chromatine et régulation de l’expression génique. I. I. Généralités I. II. Structure de base de la fibre chromatinienne. 1. Structure du Nucléosome Digestion de la chromatine par la Nucléase de Microcoque. L’ADN est coupé en des fragments dont la taille est un multiple d’une unité de longueur, après fractionnement par électrophorèse sur gel d’agarose, on obtient une échelle s’étendant sur une dizaine de bandes successives de l’ordre de 200 pb. La digestion par la nucléase de Microcoque. génère une échelle nucléosomale. Quand la chromatine digérée par la nucléase de microcoque est fractionnée sur un gradient de sucrose, on obtient une série de pics discrets correspondant à des monomères, des dimères, des trimères, des tétramères etc.… L’ADN extraite de ces fractions migrent au même niveau que les fragments obtenues par digestion par la nucléase de Microcoque. Si on digère du DNA du foie de rat par la nucléase de microcoque, ¾ en 30s de digestion on obtient des fragments de 200 pb. ¾ Une digestion plus prolongée aboutie à une bande de 146 pb. Conclusion : L’ADN du nucléosome = ADN coeur fixe de 146pb + l’ADN de liaison (linker) qui est variable. Lorsque la chromatine est traitée dans des conditions relativement douces par de l'ADNase de Micrococcus aureus, (nucléase de Microcoque) de petites particules d’un diamètre de 100A° sont libérées. • ¾ ¾ ¾ Ces particules sont constituées par : de l’ADN long d’environ 200 paires de bases, de 8 molécules d’histones (2 H2A, 2 H2B, 2 H3 et 2 H4) de quelques protéines non histones. La forme du nucléosome correspond à un disque plat ou un cylindre dont le diamètre est d’environ 11nm et de hauteur de 6nm. L’ADN d’environ 200 pb (=67 nm) ce qui est le double de la circonférence de la particule égale à 34 nm. Tous ceci suggère que l’ADN se situ à l’extérieur du corps protéique. L'unité fondamentale de la chromatine est donc le nucléosome qui est composé d'ADN et d'histones. Il constitue le premier niveau de compaction de l'ADN dans le noyau. Eléments de définition du nucléosome et du chromatosome. L’ADN a besoin d'être protégé par des protéines lorsqu'il n'est pas utilisé comme modèle pour l'expression des gènes ou la réplication. Cette protection se fait par enroulement autour de protéines basiques capables de se lier avec l’ADN. Des octamères d'histones sont au centre de particules qu'on trouve tous les 200 nucléotides et autour desquels l’ADN s'enroule. La structure évoque un « collier de perles ». Chaque nucléosome est constitué d'un fragment d’ADN de 146 paires de nucléotides et de huit molécules d'histones. • Chapitre I : Structure fine de la chromatine et régulation de l’expression génique. I. I. Généralités I. II. Structure de base de la fibre chromatinienne. 1. Structure du Nucléosome 2. Protéines histones. Caractéristiques des histones de mammifères Type Nombre d’acides aminés Poids moléculaire (KD) Nombre d’acides aminés basiques Rapport Lys/Arg Nombre d’acides aminés acides H1 (lapin) 213 23.0 65 21 12 H2A (vache) 129 14.0 26 1.2 20 H2B (vache) 125 13.8 28 2.5 16 H3 (vache) 135 15.3 32 0.7 18 H4 (vache) 102 11.3 26 0.8 10 Caractéristiques typiques des histones de mammifères ¾Les histones sont les protéines les plus abondants du noyau. ¾Elles sont de petites taille (11 à 28 kDa). ¾Elles possèdent un caractère très basique (pHi > 10). ¾Une éléctrophorèse à pH acide montre qu’il existe cinq types appelés respectivement H1, H2A, H2B, H3 et H4. ¾Ces cinq histones sont retrouvées chez tous les eucaryotes. ¾Les séquences primaires des cinq histones de différentes espèces ont été entièrement déterminées, ce qui a permis de montrer leur très grande conservation au cours de l’évolution. ¾Les histones les plus conservées sont H3 et H4. Les modifications post-traductionnelles des nucléosomes Chaque histone peut subir toute une série de modifications posttraductionnelles: méthylation, acétylation ou phosphorylation. Toutes ces modifications concernent les domaines flexibles N – et Cterminaux. La charge totale de la protéine peut se trouver réduite par ces modifications. Les modifications post-traductionnelles des nucléosomes Séquences primaires des extrémités N-terminales des histones nucléosomales. Les nombres indiquent la position des acides aminés. • Les modifications post-traductionnelles sont indiqués (ac en rouge = sites d'acétylation ; p en bleu = sites de phosphorylation ; m en vert = sites de méthylation) Les modifications post-traductionnelles des nucléosomes • Chapitre I : Structure fine de la chromatine et régulation de l’expression génique. I. I. Généralités I. II. Structure de base de la fibre chromatinienne. 1. Structure du Nucléosome 2. Protéines histones. 3. Organisation des histones dans le nucléosome. Organisation des Histones dans le Nucléosome ¾Les histones présentent une grande habilité d’agrégation : On obtient facilement des tétramères ( H32-H42). ¾Les histones riches en lysine forment plutôt des dimères (H2A-H2B) avec une tendance à former des tétramères (H2A2-H2B2). ¾Des octamères d’histones (former in vitro) peuvent être dissociés pour générer des hexamères ayant perdu un dimère de H2A-H2B, après les autres H2A-H2B sont libérés indépendamment en générant H32-H42. Organisation des Histones dans le Nucléosome Tous ceci suggère l’existence d’une forme d’organisation où le nucléosome présente une « graine » centrale constituée d’un tétramère (H32-H42) associé à deux indépendants (H2A-H2B). Une cinquième histone, l'histone H1, vient sceller et relier les nucléosomes. ¾ H1 est deux fois plus grande que les autres histones (24 kD au lieu de 10-12 kD). ¾ H1 interagit avec 10 pb à l'entrée et à la sortie du nucléosome, de sorte que l'ADN fait désormais deux tours complets autour de l'octamère, scellés à leur base par H1. ¾ Ensuite, les molécules d'H1 associées à chaque nucléosome peuvent interagir entre elles, sans doute par leur bras C-terminal flexible, reliant ainsi les nucléosomes. • Chapitre I : Structure fine de la chromatine et régulation de l’expression génique. I. I. Généralités I. II. Structure de base de la fibre chromatinienne. 1. Structure du Nucléosome 2. Protéines histones. 3. Organisation des histones dans le nucléosome. 4. Organisation des nucléosomes sur la fibre chromatinienne. a . Facteur de compaction du génome et niveaux de condensation Facteur de compaction du génome et niveaux de condensation Au-delà du nucléosome, les niveaux supérieurs de condensation de la chromatine résultent de la proportion des nucléosomes à s'empiler régulièrement les uns sur les autres, dans plusieurs directions, et au rôle joué par l'histone Hl dans ces empilements. • Le premier niveau d'empilement, en colonne, conduit à ce qu'on appelle la fibre de 11 nm de diamètre (largeur d'un nucléosome). Organisation des nucléosomes sur la fibre chromatinienne Fibre de 10nm Au-delà, la microscopie électronique révèle des structures fibreuses, dont la fibre de 30 nm : fibre torsadée large de six nucléosomes, Ceci constituerait le premier niveau de condensation audelà de l'empilement simple. Organisation des nucléosomes sur la fibre chromatinienne Fibre de 30nm Un modèle de diverses structures enroulées de la chromatine. La rangée hélicoïdale plus condensée du brin de 10 nm formant la structure en solénoïde d'un diamètre de 30 nm La forme partiellement enroulée, la brin de 10 nm de diamètre, A noter la façon dont les histones Hl, associées aux nucléosomes, interagissent pour favoriser l'enroulement des fibres de 10 nm, formant les fibres plus condensées de 30 nm. • Dans la fibre de 30 nm, le facteur de compaction de l'ADN est de 40 fois. • On estime que le facteur de compaction global de la chromatine dans le noyau est de l'ordre de 1000 fois • Il s'accroît encore de 10 fois lorsque s'individualisent les chromosomes à la mitose. • Au-delà des nucléosomes, l'organisation compacte de la chromatine dépend fortement de son interaction intime avec le réseau de protéines non histones qui constitue ce qu'on appelle la matrice nucléaire. Niveaux d'organisation de la chromatine dans le noyau • Chapitre I : Structure fine de la chromatine et régulation de l’expression génique. I. I. Généralités I. II. Structure de base de la fibre chromatinienne. 1. Structure du Nucléosome 2. Protéines histones. 3. Organisation des histones dans le nucléosome. 4. Organisation des nucléosomes sur la fibre chromatinienne. a . Facteur de compaction du génome et niveaux de condensation b . Organisation des Nuclé Nucléosomes en Phase. Organisation des Nucléosomes en Phase. • Supposant que la séquence d’ADN soit organisée dans les nucléosomes selon une seule configuration particulière de telle sorte que chaque site sur l’ADN soit toujours localisé sur une position déterminée du nucléosome. Les produits d’une double digestion par la nucléase de microcoque et par l’enzyme de restriction sont séparés par électrophorèse sur gel. Une sonde qui représente la séquence immédiatement adjacente au site de restriction est utilisée pour identifier le fragment correspondant dans la double digestion. Organisation des Nucléosomes en Phase. l’identification d’une seule bande nette et étroite démontre que la position du site de restriction est précisément déterminée par rapport à l’extrémité de l’ADN nucléosomal Donc le nucléosome possède bien une séquence particulière d’ADN. • Chapitre I : Structure fine de la chromatine et régulation de l’expression génique. I. I. Généralités I. II. Structure de base de la fibre chromatinienne. 1. Structure du Nucléosome 2. Protéines histones. 3. Organisation des histones dans le nucléosome. 4. Organisation des nucléosomes sur la fibre chromatinienne. a . Facteur de compaction du génome et niveaux de condensation b . Organisation des Nuclé Nucléosomes en Phase. c . Organisation des Nuclé Nucléosomes au hasard. Organisation des Nucléosomes au hasard. Qu’arrive-il si le nucléosome n’est pas localisé en une position unique? Donc Sur chaque fibre, le nucléosome est positionné différemment double digestion par la nucléase et par l’enzyme de restriction et séparation par électrophorèse sur gel. • Les fragments de liaison (entre les nucléosomes) sont maintenant constitués de différentes séquences d’ADN dans chaque copie du génome. • Ainsi, à chaque fois, la position du site de restriction est différente • en fait, toutes les localisations sont possibles par rapport aux extrémités de l’ADN nucléosomal monomérique. Organisation des Nuclé Nucléosomes au hasard. La double digestion engendrera donc une large traînée allant des plus petits fragments détectables (20 bases) jusqu’à la longueur du monomère d’ADN. Les nucléosomes sont donc organisés au hasard
