QUELQUES OUTILS DE LA BIOLOGIE CELLULAIRE
1) Immunocytochimie
Après une fixation sur lamelles, la perméabilisation des cellules a lieu avec un détergent. On incube alors les cellules
avec un premier anticorps spécifique de la protéine étudiée, puis on révèle les sites où le premier anticorps s’était
fixé avec un second anticorps (dirigé contre les parties constantes des anticorps spécifiques) qui peut être couplé à un
fluorochrome. Le résultat est alors observé en microscopie à fluorescence.
Cette technique permet détecter et de localiser des protéines dans des cellules et tissus, in situ.
2) Immunoprécipitation (IP)
La présence d’une protéine donnée (A) dans un extrait cellulaire peut être mise en évidence à l’aide d’un anticorps
dirigé contre cette protéine (Anticorps-antiA) ; cette technique permet aussi de mettre en évidence les protéines
associées directement (B) ou indirectement (C) à la protéine A.
Il en résulte la formation d’un complexe Anticorps-AntiA/complexe A-B-C. Ce complexe après avoir été isolé (par
centrifugation) peut être analysé en électrophorèse. Pour ce faire, le complexe doit être dissocié en vue de libérer
toutes les protéines afin qu’elles puissent migrer dans un gel soumis à champ électrique (les complexes trop
volumineux ne rentrent pas dans les mailles du gel et l’analyse ne peut se faire).
3) Electrophorèse en SDS- PAGE (technique du Western)
a) Les protéines dénaturées se chargent négativement et uniformément par le SDS (Dodecyl sulfate de sodium) ; dans
ces conditions, elles migrent vers le pôle positif en fonction de leur masse moléculaire (MM). Pour estimer la taille
des protéines on fait migrer en parallèle des protéines dont la MM est connue.
b) Transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose qui lie fortement les protéines ; on récupère alors une
image fidèle du gel sur le filtre.
c) Repérage des protéines en traitant la membrane avec des anticorps spécifiques (immunoblot). Les anticorps se
fixent spécifiquement sur la protéine, c’est à dire au niveau de la bande ; la visualisation s’effectue avec l’utilisation
d’un deuxième anticorps dirigé contre les parties constantes des anticorps spécifiques. Ces anticorps ont été
préalablement marqués (par couplage à un enzyme par exemple). La réaction enzymatique se fait en présence du
substrat qui donnera un produit coloré ; le produit coloré sera trouvé dans la région où se trouve l’enzyme c’est à dire
au niveau de la protéine recherchée.
Cette technique est très sensible et permet la détection de fiables quantités de protéines. Elle peut être rendue
quantitative.
4) Northern Blot
Il permet de mesurer un taux d’ARNm (c’est à dire un équilibre entre synthèse et dégradation). Les ARNs sont
extraits. Ils sont séparés selon leur taille sur un gel d’agarose, transférés sur une membrane (support hydrophobe
solide). La membrane est ensuite hybridée avec la sonde spécifique de l’ARNm étudié (marquée au
32
P) et
autoradiographiée. On hybride, en même temps ou après, cette membrane avec une sonde de référence (par exemple
spécifique d’un ARN ribosomal) afin de tenir compte de l’efficacité des techniques d’extraction et de l’importance
de la dégradation des ARNs (molécules fragiles) au cours de ce processus.
5) Run on
Il s’agit de mesurer la synthèse d’ARNm, c’est à dire le taux d’initiation de la transcription. Les noyaux, c’est à dire
la machinerie transcriptionnelle, sont extraits des cellules puis incubés avec des ribonucléotides dont un
(généralement l’UTP) est radiomarqué (
32
P). On dépose sur une membrane des ADNc de référence et l’ADNc du
gène étudié. On hybride la membrane avec les ARN préparés à l’opération précédente. La membrane est
autoradiographiée. Un effecteur agit au niveau transcriptionnel si cette expérience montre une synthèse augmentée
c’est-à-dire une hybridation plus intense par rapport au contrôle.
LEXIQUE
Transcription : synthèse de RNA par une RNA polymérase à partir d’une matrice d’ADN
Trans (facteurs agissant en) : facteur diffusible capable de moduler l’activité (en + ou en -) s’un ou de plusieurs
gènes en interagissant avec leur(s) séquence(s) régulatrice(s).
Cis (regulation en) : action régulatrice des séquences DNA non codantes s’exerçant sur un ou plusieurs promoteurs
situés à proximité sur le même chromosome.