QUELQUES OUTILS DE LA BIOLOGIE CELLULAIRE 1) Immunocytochimie Après une fixation sur lamelles, la perméabilisation des cellules a lieu avec un détergent. On incube alors les cellules avec un premier anticorps spécifique de la protéine étudiée, puis on révèle les sites où le premier anticorps s’était fixé avec un second anticorps (dirigé contre les parties constantes des anticorps spécifiques) qui peut être couplé à un fluorochrome. Le résultat est alors observé en microscopie à fluorescence. Cette technique permet détecter et de localiser des protéines dans des cellules et tissus, in situ. 2) Immunoprécipitation (IP) La présence d’une protéine donnée (A) dans un extrait cellulaire peut être mise en évidence à l’aide d’un anticorps dirigé contre cette protéine (Anticorps-antiA) ; cette technique permet aussi de mettre en évidence les protéines associées directement (B) ou indirectement (C) à la protéine A. Il en résulte la formation d’un complexe Anticorps-AntiA/complexe A-B-C. Ce complexe après avoir été isolé (par centrifugation) peut être analysé en électrophorèse. Pour ce faire, le complexe doit être dissocié en vue de libérer toutes les protéines afin qu’elles puissent migrer dans un gel soumis à champ électrique (les complexes trop volumineux ne rentrent pas dans les mailles du gel et l’analyse ne peut se faire). 3) Electrophorèse en SDS- PAGE (technique du Western) a) Les protéines dénaturées se chargent négativement et uniformément par le SDS (Dodecyl sulfate de sodium) ; dans ces conditions, elles migrent vers le pôle positif en fonction de leur masse moléculaire (MM). Pour estimer la taille des protéines on fait migrer en parallèle des protéines dont la MM est connue. b) Transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose qui lie fortement les protéines ; on récupère alors une image fidèle du gel sur le filtre. c) Repérage des protéines en traitant la membrane avec des anticorps spécifiques (immunoblot). Les anticorps se fixent spécifiquement sur la protéine, c’est à dire au niveau de la bande ; la visualisation s’effectue avec l’utilisation d’un deuxième anticorps dirigé contre les parties constantes des anticorps spécifiques. Ces anticorps ont été préalablement marqués (par couplage à un enzyme par exemple). La réaction enzymatique se fait en présence du substrat qui donnera un produit coloré ; le produit coloré sera trouvé dans la région où se trouve l’enzyme c’est à dire au niveau de la protéine recherchée. Cette technique est très sensible et permet la détection de fiables quantités de protéines. Elle peut être rendue quantitative. 4) Northern Blot Il permet de mesurer un taux d’ARNm (c’est à dire un équilibre entre synthèse et dégradation). Les ARNs sont extraits. Ils sont séparés selon leur taille sur un gel d’agarose, transférés sur une membrane (support hydrophobe solide). La membrane est ensuite hybridée avec la sonde spécifique de l’ARNm étudié (marquée au 32P) et autoradiographiée. On hybride, en même temps ou après, cette membrane avec une sonde de référence (par exemple spécifique d’un ARN ribosomal) afin de tenir compte de l’efficacité des techniques d’extraction et de l’importance de la dégradation des ARNs (molécules fragiles) au cours de ce processus. 5) Run on Il s’agit de mesurer la synthèse d’ARNm, c’est à dire le taux d’initiation de la transcription. Les noyaux, c’est à dire la machinerie transcriptionnelle, sont extraits des cellules puis incubés avec des ribonucléotides dont un (généralement l’UTP) est radiomarqué (32P). On dépose sur une membrane des ADNc de référence et l’ADNc du gène étudié. On hybride la membrane avec les ARN préparés à l’opération précédente. La membrane est autoradiographiée. Un effecteur agit au niveau transcriptionnel si cette expérience montre une synthèse augmentée c’est-à-dire une hybridation plus intense par rapport au contrôle. LEXIQUE Transcription : synthèse de RNA par une RNA polymérase à partir d’une matrice d’ADN Trans (facteurs agissant en) : facteur diffusible capable de moduler l’activité (en + ou en -) s’un ou de plusieurs gènes en interagissant avec leur(s) séquence(s) régulatrice(s). Cis (regulation en) : action régulatrice des séquences DNA non codantes s’exerçant sur un ou plusieurs promoteurs situés à proximité sur le même chromosome. Promoteur : région d’ADN en amont des gènes comportant le site de fixation de la RNA polymérase ainsi que les sites de fixation de protéines régulatrices de la transciption (facteurs trans) Enhancer (séquence stimulatrice) : séquence d’ADN stimulant en cis la transcription de certains gènes eucarytotes quelles que soient son orientation, sa localisation en amont ou en aval du site d’inititation, et, dans une certaine limite, la distance qui le sépare du promoteur. Certains facteurs protéiques interagissant avec eux peuvent leur conférer une spécificité tissulaire. Dans des constructions in vitro ils conservent leur pouvoir stimulateur sur des promoteurs hétérologues. Silencer : séquence d’ADN ayant, au contraire d’un enhancer, un effet cis-inhibiteur sur la transcription d’un gène Consensus (séquence) : courte séquence nucléotidique, d’ADN ou d’ARN, impliqué dans un mécns ADNc (cDNA) : séquence d’ADN complémentaire d’un ARNmessager obtenue par transcription inverse (transcriptase inverse). Elle correspond à une version du gène débarassé de ses introns. Vecteur : Séquence nucléotidique capable de s’autorépliquer, utilisé pour la recombinaison in vitro du DNA et son alplification extra-chromosomique Plasmides : fragments de DNA extra-chromosomique (épisomal) circulaire présent dans les bactéries, susceptibles de se répliquer de façon autonome. Ils peuvent porter des gènes de résistances aux antibiotiques. Expérimentalement ils sont utilisés comme vecteurs. Ils peuvent contenir des régions cis-régulatrices, un cDNA… Transfection : technique expérimentale consistant à faire pénétrer un fragment de DNA (vecteur…) dans une cellule eucaryote Cotransfection : transfection simultanée de plusieurs séquences d’ADN dont un gène marqueur le plus souvent sélectionnable (gène de résistance à la néomycine etc…) Vecteur d’expression : insertion d’un ADNc d’intérêt en aval d’un promoteur fort (promoteur viral en général inductible ou non). Après transfection, la séquence d’ADNc est transcrite puis traduite. On peut ainsi tester l’activité de protéines sauvages ou mutées dans des modèles cellulaire. Gène rapporteur (encore appelé reporter) : Se dit d’un gène indicateur introduit dans des vecteurs d’expression pour servir de témoin de l’effet régulateur d’une séquence donnée. Technique du gène rapporteur : différents fragments de promoteur sont insérés dans un plasmide en amont d’un gène rapporteur (le plus souvent CAT ou luciférase). Ce gène code une enzyme bactérienne qui n’est pas présente dans les cellules eucaryotes. Les cellules eucaryotes sont transfectées par ces plasmides. Les transfections peuvent être transitoires si le plasmide ne contient pas de gène de sélection ni de dispositif d’intégration dans le génome eucaryotes (LTR viraux) ou permanentes si il contient un gène permettant d’effectuer la sélection des cellules transfectées (1 % des cellules, résistance à la néomycine par exemple). Les procédés de transfection sont multiples. La mesure de l’activité CAT ou luciférase permet d’évaluer l’activité de transactivation des éléments du promoteur insérés en amont Sonde : séquence d’acide nucléique, d’au moins 15 nucléotides, homologue à une séquence d’ADN ou d’ARN, avec laquelle elle s’hybride de façon stable et spécifique par réassociation entre bases complémentaires. Amorces (primer) : courte séquence d’ADN ou d’ARN complémentaire du début d’un matrice servant de point de départ à son recopiage par une polymérase. Retard sur gel : technique permettant d’objectiver la présence et la spécificité d’une interaction entre une protéine et une séquence d’ADN.
