FSMPN.TUN.T.B.Jihene.REJEB.ABIDI.2013

Introduction
Introduction
Les maladies cardiovasculaires (MCV), au premier rang desquelles les cardiopathies
ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux, constituent la principale cause de décès
dans la plupart des pays développés, et apparaissent, aujourd’hui, comme une cause
importante de décès dans certains pays en voie de développement. Les cardiopathies
ischémiques pourraient être la plus importante cause de morbidité à l’échelle mondiale d’ici
l’an 2015 (Marmot and Mustard, 1996; OMS, 2007).
L’athérosclérose est l’étiologie majeure des MCV et de leurs complications cliniques
(accident cérébrovasculaire, infarctus du myocarde). Dans le monde, plus de 16 millions de
personnes décèdent chaque année de ces maladies, ce qui représente près d’un tiers de tous les
décès. Dans les pays industrialisés, l’athérosclérose est responsable d’environ 50% des décès
(Morozova et al., 2004). Elle apparaît ainsi comme la première cause des décès dans les pays
occidentalisés et apparaît en nette progression dans les pays en voie de développement,
comme si cette pathologie était le reflet inéluctable du progrès social. Elle est cependant très
ancienne dans l'histoire des maladies, et apparaît en fait comme une maladie dégénérative de
l'homme. Elle se définit comme l’occlusion progressive de la lumière vasculaire due à la
formation d’une plaque dite athéromateuse (Bonnet, 2005).
La Tunisie a vécu une phase de transition épidémiologique caractérisée par la
régression des maladies transmissibles et l’accroissement de celles non transmissibles. Parmi
ce groupe de maladies chroniques non transmissibles qui représentent plus de 60 % des causes
de décès enregistrées en Tunisie, les MCV sont en nette progression d’où l’importance
d’instaurer des mesures préventives efficaces. IL est donc capital de cerner les différents
facteurs de risque (FR) (Ben Romdhane, 2001, Ben Romdhane et al., 2005; Lihioui et al.,
2007). Dans cet esprit, nous nous intéressons, dans le cadre d’une unité de recherche du
ministère de la santé publique (MSP UR28/04) dirigée par le Professeur Ali Bouslama, aux
FR biologiques et génétiques des maladies coronariennes.
Cette épidémie des MCV peut s’expliquer, en grande partie, par le vieillissement de la
population et par l’accroissement de l’exposition à un certain nombre de FR. Cependant, les
différences d’incidences constatées entre pays, au sein d’un même pays et selon les époques,
indiquent que les MCV dépendent fortement des caractéristiques sociales, culturelles et
économiques mais aussi génétiques (Marmot and Mustard, 1996).
-1-
Introduction
L’athérosclérose est une maladie multifactorielle. Plusieurs FR peuvent faciliter
l’apparition de la strie lipidique et de son évolution en plaque athéromateuse. Certains FR,
appelés facteurs classiques, séparés en paramètres non modifiables (le sexe, l’âge et les
facteurs héréditaires) et modifiables (le tabagisme, l’obésité, le diabète, l’hypertension
artérielle (HTA) et l’hypercholestérolémie), sur lesquels une intervention thérapeutique ou
autre est susceptible d’agir, sont connus depuis longtemps alors que les FR dits émergents ou
en cours de validation (plus de 200 facteurs) ne sont connus que depuis quelques années et
font encore l’objet de plusieurs études (Bauduceau et al., 2004). Le syndrome métabolique, en
tant que FR émergent comportant un risque cardiovasculaire élevé, a connut un intérêt
croissant notamment en santé publique (Reaven, 2002).
Les lipoprotéines assurent le transport des lipides (composés hydrophobes) à travers
les divers compartiments extracellulaires de l'organisme (plasma, lymphe et liquide
interstitiel) pour leurs utilisations ou leur stockage (Lagrost et al., 2003).
La lipoprotéine de haute densité (HDL) est l’élément clé du transport inverse du
cholestérol (TIC) qui est une voie métabolique qui permet l’élimination du cholestérol par le
foie à partir des cellules ou des tissus non hépatiques. Les constituants majeurs de cette voie
sont l’apolipoprotéine AI (apoAI), la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP), la
lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT), le transporteur adénosine triphosphate binding
cassette de la sous-famille A, membre 1 (ABCA1) et le récepteur à HDL (Scavenger Receptor
BI : SR-BI)
Depuis qu’il a été établi une corrélation inverse entre la concentration plasmatique des HDL
et le risque cardiovasculaire (Gotto, 2001), l’intérêt pour les mécanismes régulant les
concentrations des HDL n’a cessé d’augmenter. Par la réduction de l’accumulation du
cholestérol dans les artères, le TIC peut prévenir le développement de l’athérosclérose.
Toute anomalie touchant cette voie, surtout les anomalies génétiques (polymorphismes),
entraînant des dysfonctionnements des acteurs de cette voie va entraîner l’accumulation du
cholestérol. En outre, la particule HDL a des propriétés anti oxydantes qui peuvent être dues à
son association à des enzymes anti-oxydantes telle que la paraoxonase qui est l’enzyme
responsable de la plus grande partie du pouvoir anti-oxydant des HDL
L’objectif principal de mon travail de doctorat est d’étudier, à côté des FR classiques, les
facteurs émergents tels que le syndrome métabolique où la voie inverse semble être perturbée
et surtout les polymorphismes génétiques touchant les acteurs du métabolisme du TIC
(ApoAI, LCAT, CETP, ABCA1, SR-BI), ainsi que la paraoxonase, enzyme liée aux HDLs.
-2-
Introduction
Ce mémoire comporte quatre parties :
• Une première partie bibliographique organisée en quatre chapitres. Le premier chapitre est
consacré pour les définitions des différentes lipoprotéines ainsi que leurs métabolismes. Dans
le deuxième chapitre, nous définirons les MCV et l’athérosclérose et nous détaillerons les FR
cardiovasculaires classiquement reconnus et ceux en cours de validation, en portant notre
attention sur le syndrome métabolique. Le troisième chapitre concerne les propriétés
athéroprotectrices des HDL classiquement attribuées à leur rôle central dans le TIC, leur
préservation de la fonction endothéliale et leurs propriétés anti-oxydantes. La voie du TIC
sera bien détaillée dans ce chapitre. Enfin, le quatrième chapitre présente les acteurs associés
au TIC auxquels nous nous sommes intéressés, à savoir l’apoAI, la LCAT, la CETP,
l’ABCA1 et le récepteur SR-BI ainsi que la paraoxonase 1 et 2.
• Une seconde partie décrivant les matériels et méthodes utilisés lors du travail expérimental.
• Une troisième partie exposant les résultats et les discussions. Elle comporte d’une part la
mise en évidence de quelques polymorphismes des différents gènes des acteurs déjà définis
dans le chapitre quatre de la partie bibliographique et d’autre part l’étude de l’association de
ces polymorphismes avec le profil lipidique, certains FR cardiovasculaires et la sténose
coronaire chez notre population d’étude.
• Une quatrième et dernière partie conclusive et ouvrant sur plusieurs perspectives.
-3-
Chapitre I: Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
I.1. Les lipoprotéines
Les graisses alimentaires absorbées et les lipides synthétisés surtout par le foie,
l’intestin et les tissus adipeux, doivent être véhiculés entre les différents organes pour leurs
utilisations ou leur stockage. Les lipides étant insolubles dans l’eau, leur transport dans un
environnement aqueux comme le plasma sanguin nécessite l’association de lipides non
polaires, de lipides amphipathiques avec des protéines pour former des lipoprotéines
miscibles dans l’eau.
I.1.1. Historique :
La première étude concernant le transport de graisse dans le sang a été réalisée
par Boyle en 1665 qui remarqua l’aspect laiteux du sang d’animaux après un repas. En
1774, Henson montra que ce fluide laiteux contenait de la graisse (cité par Olson, 1998).
Le cholestérol fut découvert par Poulletier de la Salle, en 1769, à partir de
calcul biliaire (cité par Olson, 1998), puis redécouvert par Chevreul, en 1815, qui l’appela
cholestérine. Le cholestérol fut trouvé dans le sang en 1833 (Boudet, 1833). Berthelot,
en 1859, rapporta que la cholestérine était un alcool et son nom devenait cholestérol. En
1901, suite à des travaux de digestion du plasma à la pepsine, Nerking conclut que les
lipides plasmatiques étaient liés à des protéines mais n’arriva pas à isoler une lipoprotéine
(cité par Olson, 1998).
En 1924, Gage et Fish montrèrent que le sang humain prélevé après un repas riche
en graisses contenait de fines particules d’1µm de diamètre qu’ils nommèrent chylomicrons.
Macheboeuf, de l’Institut Pasteur de Paris, isola, en 1929, pour la première fois, une
lipoprotéine à partir de sang de cheval qui s’avèrera être une lipoprotéine de haute densité
(HDL) (cité par Olson, 1998). Pendant la seconde guerre mondiale, l’équipe de Cohn, à la
Harvard Medical School, isola de nombreux complexes lipides-protéines (Cohn et al.,
1946) dont les lipoprotéines de basse densité (LDL), en 1950 (Oncley et al., 1950). La
première classification des lipoprotéines fut proposée par Blix qui montra que les lipides
d’un plasma normal ont une migration électrophorétique équivalente à celle des α1 et β
globulines (Blix et al., 1941).
Par la suite, Gofman et al., développèrent la séparation des lipoprotéines par
gradient de densité grâce à l’ultracentrifugeuse mise au point par le physico-chimiste
suédois Swedberg et ils furent capables d’associer certaines fractions avec l’athérosclérose
(Gofman et al., 1949; 1950). Une avancée majeure a été réalisée lorsque l’équipe de Havel
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Chapitre I: Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
a montré que l’on pouvait séparer grâce à cette technique trois fractions de lipoprotéines de
densités différentes, les HDL, les LDL et les lipoprotéines de très basse densité (VLDL)
(Havel et al., 1955).
Par la suite, de nombreux travaux ont tenté d’identifier les composantes protéiques des
lipoprotéines. L’apopeptide A fut associé premièrement aux α-lipoprotéines (HDL) (Baker
et al., 1973) et l’apopeptide B aux β-lipoprotéines (LDL, VLDL) (Jackson et al., 1976).
Brown et Goldstein découvrirent et caractérisèrent le récepteur des LDL (R-LDL)
(Goldstein et al., 1974 ; Brown and Goldstein, 1976) qui leur vaudra le prix Nobel de
Médecine en 1985.
A partir des années 1950, le nombre d’études sur les lipoprotéines, leurs constituants,
leurs fonctions ou leurs métabolismes a augmenté de façon exponentielle, menant ainsi à
l’ensemble de connaissances dont nous disposons à l’heure actuelle pour appréhender le
transport lipidique dans sa complexité (Lamant M., 2006).
I.1.2. Structures et fonctions des lipoprotéines :
Une lipoprotéine mature est une particule sphérique composée d’un cœur central de
lipides, triglycérides (TG) et esters de cholestérol, recouvert d’une surface constituée d’une
couche de phospholipides, de cholestérol non estérifié et de protéine appelé apoprotéine ou
apolipoprotéine (apo). Les lipoprotéines ont des caractères structuraux communs mais
diffèrent quant à leurs métabolismes et leurs rôles physiologiques (figure 1, p.6). Les
lipoprotéines sont classées en cinq grandes catégories en fonction de leurs propriétés, taille
(Rouffy et al., 1983), densité (Havel et al., 1955), composition (Alaupovic et al., 1972)
(tableau I, p.7). Les lipoprotéines transportent les lipides d’un tissu à l’autre, permettant le
transport de composés hydrophobes (les lipides) dans un milieu hydrophile (le plasma
sanguin). Pendant leur voyage, les lipoprotéines subissent des modifications complexes qui
affectent leur composition, leur structure et leur fonction. Arrivées à destination, les
lipoprotéines sont captées par des récepteurs spécifiques ou non-spécifiques, afin de délivrer
leur contenu aux cellules. Ce contenu est alors utilisé par la cellule pour la production
d’énergie, le stockage de composés énergétiques, la production et le maintien de la membrane
cellulaire et la fabrication de différentes substances endogènes, tels que les hormones
stéroïdiennes et les acides biliaires.
Les apo représentent la partie « active » de la particule. Elles jouent un rôle central à la fois
dans le métabolisme des lipides, dans les interactions entre les particules lipoprotéiniques et
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Chapitre I: Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
les récepteurs cellulaires et jouent aussi le rôle d’un ligand pour certains récepteurs (tableau
II, p.8).
Figure 1. Représentation des différentes lipoprotéines et de leurs constituants
(Lamant M., 2006).
Les lipides, cholestérol et triglycérides, circulent dans le sang grâce à des transporteurs
appelés lipoprotéines. Ces dernières sont composées d’une couche externe hydrophile et d’un
noyau central hydrophobe. Elles sont classées en fonction de leur taille et de leur densité
(chylomicrons, VLDL, LDL, HDL). Différentes apoprotéines sont présentes à la surface des
lipoprotéines et elles assurent une fonction de cohésion et une fonction métabolique car elles se
fixent sur les récepteurs cellulaires ou sur les sites d’activation des enzymes du métabolisme des
lipides.
-6-
Chapitre I: Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
Tableau I. Caractéristiques des différentes classes de lipoprotéines
(Mayes and Botham, 2003; Lamant M., 2006; Voet and Voet, 2011).
Lipoprotéines de Haute Densité
(HDL)
Lipoprotéines de Basse Densité
Lipoprotéines
Chylomicrons
Remnants de
chylomicron
VLDL
IDL
LDL
Lp(a)
HDL1
HDL2
HDL3
PréβHDL
Densité (g.cm-3)
<0.95
<0.019
0.951.006
1.0061.019
1.0191.063
1.07
1.0191.063
1.0631.125
1.1251.21
>1.21
Diamètre (nm)
90-1000
45-100
30-90
25-30
20-25
27-30
20-25
10-20
5-10
<5
Masse (kDa)
400000
400000-80000
1000080000
500010000
2300
36004000
Mobilité
électrophorétique
origine
pré-β
pré-β
lent
β
pré-β/
β
Sources
Intestin
Foie,
intestin
VLDL
VLDL,
IDL
Foie,
LDL
Chylomicrons
175-360
α
pré-β
Foie, intestin, VLDL, chylomicrons
COMPOSITION
Protéines (%)
1-2
6-8
7-10
11
21
29
32
33
57
70
Lipides totaux (%)
98-99
92-94
90-93
89
79
71
68
67
43
30
COMPOSITION PROTEIQUE (% en protéines totales)
Apolipoprotéines
majeures
A (10%): A1,
A2,
B48 (20%),
C (66%) : C1,
C2, C3, D, E
A1
B100 (33
(a)
A (15 %):
A (75 %): A1, A2,
A (10%): A1, (10%),
%), B100 (90 (25A1, A2,
C (15 %): C1, C2,
A2,
B100 (33 C (50%): %), C 60%), C (10 %): C1,
C3,
B48 (20%),
%),
C1, C2, (5%),
B100
C2, C3, D
D (5%),
C (66%) : C1, C (50%): C3, E
D, E
(40(5%),
E (5%)
C2, C3, D, E C1, C2,
(5%)
75%)
E (70%)
C3, E
(5%)
COMPOSITION LIPIDIQUE (% en lipides totaux)
Triglycérides
dans le noyau
Esters de
cholestérol dans le
noyau
Phospholipides en
surface
Cholestérol libre
en surface
Acides gras libres
88
80
56
29
13
14
2
16
13
0
3
4
15
34
48
48
34
31
29
0
8
11
20
26
28
22
53
43
46
83
1
0
4
1
8
1
9
1
10
1
10
6
11
0
10
0
6
6
17
0
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Chapitre I: Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
Tableau II. Caractéristiques des principales apolipoprotéines
(Dominiczak and Caslake, 2011)
Apo
Gènes
Structure
Synthèse
Lipoprotéines
Fonctions
ApoAI
Chr. 11,
gène cluster
A1/C3/A4/A5
243 AA,
28 kDa
ApoAII
Chr. 1
77 AA,
17.4 kDa
Foie,
intestin
HDL (20%),
chylomicrons,
VLDL
Protéine de
structure des HDL,
Activateur de la
LCAT,
Ligand d’ABCA1
et SR-BI
Protéine de
structure des HDL,
Activation de la LH
46 kDa
Foie,
intestin
HDL,
chylomicrons,
Activation de la
LCAT
39 kDa
Foie
HDL, VLDL,
chylomicrons
4536AA,
550 kDa
Foie
VLDL, IDL,
LDL
Chr. 2
2152 AA,
264 kDa
Intestin
Chr. 19
57 AA,
7.6 kDa
Foie,
intestin
chylomicrons,
VLDL, HDL
ApoCII
Chr. 19
79AA,
8.9 kDa
Foie,
intestin
ApoCIII
Chr. 1,
gène cluster
A1/C3/A4/A5
Chr. 19,
gène cluster
E/C1/C2/C4
79 AA,
8.7 kDa
Foie, intestin
chylomicrons,
VLDL, HDL
chylomicrons,
VLDL, HDL
remnants
chylomicrons,
VLDL, HDL
remnants
Activateur de la
LPL
Protéine de
structure des VLDL
et LDL, Ligand du
récepteur LDL
Protéine de
structure des
chylomicrons et des
chylomicrons
remnants
Activateur de la
LCAT,
Inhibiteur de la
CETP
Activation de la
LPL
Inhibiteur de la
LPL
Chr. 11,
gène cluster
A1/C3/A4/A5
ApoAV
Chr. 11,
gène cluster
A1/C3/A4/A5
ApoB100
Chr. 2
Foie,
intestin
HDL (70%),
chylomicrons,
VLDL
ApoAIV
ApoB48
Chylomicrons
et
chylomicrons
remnants
ApoCI
ApoE
299AA,
34.2 kDa
Foie,
macrophage,
cerveau
Ligand des
récepteurs LDL et
LRP
AA : acides aminés ; ABCA1 : transporteur Adénosine triphosphate Binding Cassette A1 ; CETP : protéine de
transfert des esters de cholestérol ; Chr. : chromosome; HDL : lipoprotéine de haute densité ; kDa : kilo dalton ;
LCAT : Lécithine Cholesterol Acyl Transférase; LDL : lipoprotéine de basse densité ; LH : lipase hépatique ;
LPL : lipoprotéine lipase ; LRP : LDL receptor related peptide ; SR-BI : Récepteur scavenger de classe B, type I;
VLDL : lipoprotéine de très basse densité
-8-
Chapitre I: Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
I.1.2.a. Les chylomicrons :
Les chylomicrons sont les plus grandes lipoprotéines. Leur noyau lipidique est
constitué à plus de 80% de TG associé à du cholestérol exogène fournis par l’alimentation. La
protéine structurale majoritaire est l’apoB48. Les chylomicrons sont synthétisés et sécrétés
par les intestins. Les chylomicrons qui se forment dans la muqueuse intestinale maintiennent
en suspension, en solution aqueuse, les TG et le cholestérol exogène. Les chylomicrons sont
libérés dans la lymphe intestinale ou chyle qui est convoyé par les vaisseaux lymphatiques
avant de se déverser dans le système veineux par le canal thoracique. Après leur entrée dans le
courant sanguin, les chylomicrons adhèrent à l’endothélium des capillaires du muscle
squelettique et du tissu adipeux. Les TG des chylomicrons intravasculaires sont ensuite
hydrolysés par une lipase liée à l’endothélium vasculaire, la lipoprotéine lipase (LPL).
L’hydrolyse des TG des chylomicrons libère, entre autres, des acides gras libres (AGL), qui
reprit au niveau du tissu adipeux, serviront à l’édification des réserves d’énergie suite à leur
ré-estérification en TG. Au niveau du muscle, les AGL peuvent également servir de source
d’énergie. Les chylomicrons diminuent de taille au fur et à mesure que leurs TG sont
hydrolysés. Ils deviennent alors, d’une part, des chylomicrons remnants enrichis en
cholestérol et d’autre part des HDL naissantes. Ceux-ci entrent à nouveau dans la circulation
en se dissociant de l’endothélium des capillaires et ils sont captés ensuite par le foie. Les
chylomicrons interviennent donc dans la voie exogène du métabolisme des lipoprotéines en
assurant le transport des TG alimentaires au muscle et au tissu adipeux et du cholestérol
alimentaire au foie (figure 2, p.10) (Redgrave, 2004).
I.1.2.b. Les VLDL et leurs résidus :
Les VLDL sont synthétisées et sécrétées par le foie. Elles interviennent au niveau de
la voie endogène en transportant des lipides depuis le foie vers les tissus périphériques (figure 2,
p.10). Elles contiennent une forte proportion de TG et peuvent véhiculer des apo des classes C
et E. L’apoB100 est la constituante majoritaire des apo (Berneis and Krauss, 2002). Les
VLDL libérées dans la circulation sont soumises à l’activité lipolytique des lipases, et plus
particulièrement à l’action de la LPL. Les acides gras libérés par l’hydrolyse des VLDL servent
les mêmes besoins que ceux assurés par les chylomicrons. L’hydrolyse continue des TG des
VLDL réduit leur contenu lipidique ce qui a pour effet de réduire leur diamètre et d’augmenter
leur densité. Lorsque les VLDL atteignent une certaine taille (environ 300 Å), elles sont alors
considérées
comme
-9-
Chapitre I : Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
Figure 2. Métabolisme des lipoprotéines (effectuée à partir de Britton, 1995).
A Cycle exogène : 1.chylomicrons (contenant ApoAI et ApoB48), 2.hydrolyse des chylomicrons par la lipoprotéine lipase, 3.échange d’apo entre HDL et chylomicrons,
4. chylomicrons remnant appauvrie en lipide et contenant ApoB48 et E, 5.perte des acides gras (AG) libérées à partir des chylomicrons sous forme d’énergie (muscle et
cœur), 6.mise en réserve dans le tissu adipeux, 7.récupération d’une partie des lipides exogène par le foie après endocytose de chylomicrons remnants à travers le
récepteur ApoB/E. B Cycle endogène : 8.Les VLDL (ApoB100 et ApoC) sont synthétisées au niveau du foie en cas d’abondance énergétique à partir de triglycérides
(TG) endogène et ApoB-100, 9.catabolisme de la lipoprotéine lipase pour donner IDL (ApoB100) et de l’énergie pour muscle et cœur et stockage au niveau du tissu
adipeux, 10. Catabolisme de lipase hépatique pour donner LDL (ApoB-100), 11.transport du cholestérol aux tissus périphériques par les LDL (11a) grâce au récepteur
ApoB présent essentiellement au niveau des tissus stéroîdogènes et foie et qui répond au rétro contrôle (11b) et par voie indépendante du récepteur (pinocytose,
phagocytose et endocytose) par le système de rétro contrôle ou au niveau des macrophages ne possèdent pas de système de rétro contrôle (avec risque de formation de
cellules spumeuses).
- 10 -
Chapitre I: Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
des lipoprotéines de densité intermédiaire ou IDL (intermediate density lipoproteins), aussi
connues sous l’appellation de résidus de VLDL (Berneis and Krauss, 2002). Le core lipidique
des IDL est constitué de pratiquement autant de TG que d’ester de cholestérol. L’hydrolyse
subséquente des IDL, par l’action conjointe de la LPL et de la lipase hépatique (LH), mène à la
formation de lipoprotéines de taille encore plus réduite appelées LDL (diamètre inférieur à 270
Å). Notons finalement qu’une proportion des VLDL sécrétées par le foie sont captées par
celui-ci via, soit le R-LDL, soit le récepteur LRP (LDL receptor related peptide) (Herz et al.,
1988) ou même encore le récepteur LSP (lipolysis stimulated receptor) (Mann et al., 1997)
avant même que leur contenu en TG ne soit suffisamment hydrolysé pour atteindre la taille
et la densité des LDL.
I.1.2.c. Les LDL :
Les LDL se caractérisent par un contenu relativement élevé en cholestérol
comparativement à leur teneur en TG. Elles sont constituées principalement d’une seule
molécule d’apoB qui prend une conformation en extension recouvrant au moins la moitié
de la surface de la particule. De ce fait, la classe lipoprotéique des LDL est celle qui
véhicule la majeure partie du cholestérol se trouvant dans la circulation sanguine. Il est
depuis longtemps reconnu que le cholestérol des LDL joue un rôle important dans le
développement de l’athérosclérose, d’où son surnom de «mauvais cholestérol» dans la
littérature populaire (Berneis and Krauss, 2002). Deux options se présentent aux
lipoprotéines issues de l’hydrolyse séquentielle des VLDL au terme de leur périple
intravasculaire. D’abord, le cholestérol sert de précurseur à la synthèse de nombreuses
hormones. De ce fait, une partie des LDL est captée par les cellules stéroïdogènes
(Croston et al., 1997). Une autre portion des LDL est prise en charge par les cellules de
divers tissus incapables de synthétiser leur propre cholestérol. Enfin, la majorité des LDL
en circulation sont prises en charge par les hépatocytes. Toutes les cellules captent les LDL
via divers récepteurs tels que le R-LDL qui capte la majeure partie des LDL en
interagissant avec l’apoB100 (Berneis and Krauss, 2002). Ces récepteurs s’agglomèrent
dans des puits tapissés de clathrine destinés à l’endocytose. Après invagination, les puits
vont former des vésicules qui vont fusionner avec des lysosomes. Les LDL vont être ainsi
dégradées en acides aminés, cholestérol et acides gras disponibles pour la cellule (Brown
and Goldstein, 1992).
Les LDL sont hétérogènes dans la distribution de leur taille, de leur densité et de
certaines de leurs propriétés. Même si toutes les LDL sont athérogènes, les LDL petites et
- 11 -
Chapitre I: Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
denses (sdLDL) sont considérées comme étant la sous-population la plus athérogène. (Rizzo
and Berneis, 2006; Williams et al., 2003). Les sous populations de LDL peuvent être classées
soit en phénotype A (décalage vers les grosses LDL : diamètre ≥ 25.8 nm) ou en phénotype B
(décalage vers les petites LDL: diamètre < 25.8 nm). Une autre classification permet de
classer les sous-populations selon leur taille, de LDL1 à LDL7 : LDL-I (27.2 à 28.5 nm),
LDL-IIa (26.5 à 27.2 nm), LDL-IIb (25.6 à 26.5 nm), LDL-IIIa (24.7 à 25.6 nm), LDL-IIIb
(24.2 à 24.7 nm), LDL-IVa (23.3 à 24.2 nm), et LDL-IVb (22.0 à 23.3 nm) (Rizzo and
Berneis, 2006; Williams et al., 2003; Krauss and Burke, 1982)
I.1.2.d. Les HDL:
Les HDL sont principalement constituées d’esters de cholestérol. La densité élevée de
ces lipoprotéines est attribuable à leur contenu relativement élevé en protéines (figure 3, p.12).
La partie protéique représente environ 50% de la masse des HDL, dont 70% pour l’apoAI et
20% pour l’apoAII, les autres protéines comme l’apoAIV, l’apoCIII, l’apoE, l’apoJ, la
paraoxonase (PON), l’haptoglobine, l’α-macroglobuline, et la lécithine cholestérol
acyltransférase (LCAT) représentant les 10% restant (Forti and Diament, 2006).
Figure 3. Structure de HDL sphérique
(Forti and Diament, 2006).
HDL sphérique contient un cœur de lipide neutre (des esters de cholestérol et des TG) entouré par une
monocouche de phospholipides, apolipoprotéines et une petite quantité de cholestérol non estérifié
Les HDL sont hétérogènes en termes de densité, de taille, de composition et de charge
superficielle. Elles peuvent être séparées par ultracentrifugation en deux sous-fractions
principales : HDL2 et HDL3. Les HDL2 sont plus grandes et moins denses que les HDL3
(figure 4a, p.14). Les HDL peuvent aussi être résolues sur la base de la taille par
- 12 -
Chapitre I: Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
l'électrophorèse en gradient de gel non dénaturant en 5 sous-populations de particules
distinctes : HDL2b, HDL2a, HDL3a, HDL3b et HDL3c avec les diamètres moyens respectifs de
10.6, 9.2, 8.4, 8.0 et 7.6 nm, (figure 4b, p.14) (Blanche et al., 1981). Elles ont aussi été
classifiées sur la base de leur composition en apo en deux populations de particules: celles
qui contiennent apoAI, mais pas apoAII, (A-I) HDL et celles qui contiennent apoAI et
apoAII, (A-I/A-II) HDL (figure 4c, p.14) (Cheung and Albers, 1984). Dans le plasma humain
normal, l’apoAI est distribuée approximativement également entre (A-I) HDL et (A-I/A-II)
HDL, tandis qu'apoAII est surtout associée à (A-I/A-II) HDL. Selon leurs positions de
migration électrophorétique sur gel d’agarose, les HDL migrent à la position γ-, α - ou préß(figure 4d, p.14). Les (A-I) HDL et (A-I/A-II) HDL sphériques montrent une α -migration,
tandis que les HDL discoïdales et l’apoAI sans lipide ont une migration pré-ß. Une petite
population de HDL larges et sphériques qui contient apoE, apo secondaire des HDL, migre à
la γ -position (Huang et al., 1994). La majorité du cholestérol véhiculée par les HDL (HDLC) est présente dans la fraction α-HDL, composée de HDL relativement gros, de forme
globulaire et riche en lipides. C’est cette sous-fraction de HDL qui peut être séparée en
HDL2 et en HDL3. Les préβ-HDL, quant à elles, peuvent être considérées comme des HDL
immatures. Elles sont de forme discoïde, relativement plus petites que les α-HDL et
pratiquement dépourvues de lipides, étant seulement composées d’une ou deux molécules
d’apoAI et de quelques molécules de phospholipides. Cinq à 15% de l’apoAI totale est
contenue au niveau des préβ-HDL, qu’on retrouve principalement dans l’espace extra
vasculaire (Assmann and Nofer, 2003). Les préβ-HDL peuvent être séparées en trois sousclasses: préβ1-HDL, préβ2-HDL et préβ3-HDL (Francone et al., 1989). Le poids moléculaire
évalué de préβ1-HDL est 60-70 kDa. Parmi les nombreuses sous-classes de HDL, le
cholestérol cellulaire est en premier transféré de préférence à préβ1-HDL et ensuite à préβ2HDL (Castro and Fielding, 1988). Enfin, le cholestérol cellulaire est déplacé à préβ3-HDL, la
plus grande des préβ-HDL, où la LCAT est localisée (Francone et al., 1989). La LCAT
convertit le cholestérol libre en esters de cholestérol, un composé hydrophobe qui entre dans
le cœur des particules HDL. Finalement, la préβ-HDL est convertie en des particules HDL
grandes, riches en esters de cholestérol, sphériques; ce processus est mentionné comme la
maturation de préβ1-HDL. Ces particules, appelées aussi HDL naissantes, sont l’accepteur
primaire du cholestérol efflué par les cellules périphériques dans la voie du transport inverse
du cholestérol (TIC), c'est-à-dire qu’elles retirent le cholestérol des tissus et le renvoie vers le
foie (Eren et al., 2012).
- 13 -
Chapitre I: Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
Moins dense
Plus dense
Figure 4. Hétérogénéité des HDL sphériques
(Rye and Barter, 2010).
Les HDL sphériques peuvent être résolues sur la base de la densité (a), la taille de particule (b), la
composition en apolipoprotéines (c) et la charge superficielle (d)
I.2. Métabolisme des lipoprotéines
Le métabolisme des lipoprotéines est complexe et fait intervenir de nombreux
récepteurs et enzymes. Il peut être divisé en trois parties : la voie exogène (à partir de
l’intestin vers les autres tissus), la voie endogène (du foie aux autres tissus) et le TIC (des
tissus au foie) (figure 2, p.10).
I.2.1. Voie exogène :
La fonction de la voie exogène du métabolisme des lipoprotéines est d’amener les
lipides alimentaires exogènes aux tissus pour la production d’énergie, le stockage ou la
synthèse de molécules. Ces lipides sont transportés vers le foie et le tissu adipeux par les
chylomicrons formés dans l’entérocyte pendant la période postprandiale. Dans la lumière
intestinale, les lipides exogènes sont hydrolysés par les enzymes pancréatiques. Les produits
- 14 -
Chapitre I: Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
de l’hydrolyse (cholestérol libre, acides gras, monoglycérides et diglycérides) forment, en
présence des sels biliaires, des micelles solubles nécessaires à leur absorption intestinale.
Dans les entérocytes, les lipides sont ré-estérifiés et seront assemblés à l’aide de l’apoB48
pour former des chylomicrons qui gagnent le compartiment plasmatique par le canal
thoracique. Au niveau des muscles et du tissu adipeux, les TG contenus dans les chylomicrons
sont hydrolysés en AGL par la LPL pour stockage ou production d’énergie. Les chylomicrons
appauvris en TG sont transformés, d’une part en chylomicrons remnants « chylomicrons
résiduels » qui sont rapidement épurés par le foie, via le récepteur LRP et l’apoE et d’autre
part en HDL naissantes qui ont pour rôle le TIC ; ils récupèrent le cholestérol à partir des
tissus périphériques et de la circulation sanguine, pour le ramener vers le foie (Redgrave,
1999, Packard and Shepherd, 1999).
Le LRP est un récepteur cellulaire exprimé au niveau de l’hépatocyte qui reconnaît l’apoE
mais pas l’apoB100. Les résidus de lipolyse des chylomicrons et des VLDL (« remnants »)
sont très rapidement captés par le foie. L’apoE et le LRP contribuent à cette épuration rapide.
I.2.2. Voie endogène :
Quelques heures après un repas, lorsque la quantité de chylomicrons en circulation est
faible, les besoins en TG des tissus périphériques sont assurés par les lipides synthétisés par le
foie ou transitant par celui-ci, qui sont alors acheminés par les VLDL. La synthèse de VLDL,
dans l’hépatocyte est catalysée par la MTP (Microsomial Triglyceride Transfert Protein) qui
est une protéine intracellulaire. Dans les cellules hépatiques et intestinales, la MTP catalyse la
formation des VLDL et des chylomicrons à partir de l’apoB, des TG endogènes et des esters
de cholestérol. De la même manière que les chylomicrons, les VLDL seront hydrolysées par
la LPL dans les capillaires. Les résidus des VLDL, les IDL, subiront l’hydrolyse de leurs TG
par l’action de la LH, menant ainsi à la particule LDL fortement enrichie en cholestérol
estérifié. La LH peut aussi hydrolyser les TG restant dans la particule LDL. Les LDL
transportent le cholestérol à partir du foie vers les tissus périphériques : c’est la voie endogène
du métabolisme lipidique (Redgrave, 1999; Packard and Shepherd, 1999).
I.2.3. Métabolisme des LDL :
Le métabolisme cellulaire des LDL se déroule essentiellement dans le foie mais aussi
dans les tissus périphériques. Deux voies ont été individualisées:
 La première voie: elle implique une reconnaissance de haute affinité de l’apoB100
des LDL par des récepteurs spécifiques (apoB100/E) présents dans différents tissus et dont la
- 15 -
Chapitre I: Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
structure est connue. L’affinité de l’apoB100 pour les récepteurs est due à la présence de
lysine et d’arginine dans la molécule. Le niveau de fixation des particules est fonction du
nombre de récepteurs disponibles. Il se produit un regroupement des récepteurs dans des
structures qui sont des puits recouverts de clathrine qui formeront des vacuoles mobiles
dans la cellule après l'endocytose. Ces puits contenant l'ensemble LDL-R-LDL sont
internalisés. Les vacuoles se déchargent des LDL dans les lysosomes. Les constituants des
LDL sont catabolisés par les enzymes lysosomales alors que les récepteurs libérés rejoignent
la membrane cellulaire pour un nouveau cycle de captation (Brown and Goldstein, 1979 ;
1986). Les apo sont hydrolysées en acides aminés, les esters de cholestérol en acides gras
et cholestérol libre. Le cholestérol libre intracellulaire déclenche un triple effet régulateur,
inhibition de la HMG-Co- A réductase (ou 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase) donc
de la synthèse du cholestérol, stimulation de l'ACAT ( acyl cholestérol acyl transférase) qui
estérifie le cholestérol libre intracellulaire, augmentant ainsi le stockage, et inhibition de la
synthèse des récepteurs des LDL et de leur incorporation membranaire, d’où leur nombre
diminue, ce qui protège la cellule d'une surcharge en cholestérol.(Brown et al., 1981) (figure
5, p.16).
ApoB/E
Figure 5. Métabolisme cellulaire des LDL
(Effectuée à partir de Brown and Goldstein, 1979)
Voie des récepteurs apoB/E. Les LDL sont fixés par des récepteurs B/E. le complexe récepteurs
LDL formé est internalisé et dégradé dans les lysosomes sous forme d’AG, d’acides aminés, de
l’apo-B et du cholestérol libre. L’augmentation du cholestérol intra- cellulaire freine la
synthèse de l’HMG-CoA réductase et des récepteurs apoB/E et augmente sa propre
estérificarion par l’ACAT.
 La seconde voie: indépendante des récepteurs et moins bien connue, ne semble pas
être soumise à un rétrocontrôle par l’excès de cholestérol. Plusieurs processus de faible
- 16 -
Chapitre I: Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
affinité, mais de grande capacité pourraient être impliqués: pinocytose, phagocytose,
endocytose par le système réticulo-endothélial. L’existence au niveau des macrophages de
récepteurs spécifiques des LDL acétylés a été rapportée (Steinberg, 1997; de Winther, 2000).
La voie indépendante des récepteurs représenterait normalement entre la moitié et les trois
quarts du catabolisme des particules lipoprotéiques contenant l’apoB, l’autre partie étant
assurée par les récepteurs de haute affinité. N’étant pas régulée par un système de rétro
contrôle, cette voie entraîne un engorgement des cellules (macrophages) par le cholestérol et
leur transformation en cellules spumeuses, point de départ de l’athérosclérose (Brown and
Goldstein, 1979; 1986).
I.2.4. La voie du TIC :
Elle sera présentée en plus de détails dans la section rapportant les propriétés
athéroprotectrices des HDL (figure 6, p.18). Les apo, composant la partie protéique du HDL,
sont synthétisées par le foie et l’intestin et proviennent également de l’hydrolyse des
chylomicrons et des VLDL par les lipases, qui relâchent alors des constituants en circulation.
Les phospholipides composants les HDL proviennent principalement des autres lipoprotéines
lors de leur hydrolyse. La particule HDL reçoit du cholestérol libre et des esters de cholestérol
des autres lipoprotéines lors de leur hydrolyse, mais aussi via le récepteur SR-BI (récepteur
scavenger de classe B, type I, présent dans les macrophages, le foie et les tissus
stéroïdogéniques) et via le système ABCA1 (transporteur Adénosine triphosphate Binding
Cassette A1, présent dans les macrophages, le foie, les reins, l’intestin et les glandes
surrénales). Le cholestérol libre est alors estérifié par la LCAT. Au fur et à mesure que la
HDL reçoit du cholestérol, sa taille augmente, passant de la classe HDL 3 à la classe HDL2.
Les esters de cholestérol peuvent par la suite être échangés contre des TG entre les HDL et les
lipoprotéines contenant l’apoB100 par l’action de la protéine de transfert des esters de
cholestérol (CETP). Les esters de cholestérol ainsi transférés aux LDL et aux VLDL
retourneront alors au foie via le R-LDL. La HDL sera captée par un récepteur SR-BI du foie
ou d’un tissu stéroïdogéne auquel il donnera son cholestérol. Il est important de noter que la
HDL n’est pas internalisée par SR-BI; après avoir livré ses esters de cholestérol, la HDL se
retrouve à nouveau en circulation et redevient disponible pour recevoir des esters de
cholestérol. La LH est capable d’hydrolyser les TG contenus dans la HDL. Dans le foie, le
cholestérol sera transformé en sels biliaires ou sera directement excrété dans la bile, alors que
dans les tissus stéroïdogénes, le cholestérol sera transformé en hormones stéroïdes (Eisenberg,
1999; Tall et al., 2002).
- 17 -
Chapitre I: Lipoprotéines et métabolisme des lipoprotéines
Figure 6. Transport inverse du cholestérol
(Dominic, 2005).
L’apoAI interagit avec le transporteur ABCA1 présents dans les macrophages de la plaque
athéromateuse et induisent l’efflux de cholestérol entraînant ainsi la formation de HDL. Sous l’action
de la LCAT, le cholestérol libre sera estérifié en esters de cholestérol permettant la maturation des
HDL. Les esters de cholestérol peuvent être transférés des HDL matures vers les VLDL et LDL sous
l’action de la CETP favorisant l’élimination du cholestérol par la voie du récepteur LDL-R hépatique.
Le cholestérol des HDL matures quant à lui sera éliminé par le foie dans la bile après captation par la
voie du SR-BI.
- 18 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
II.1. Maladies cardiovasculaires
II.1.1. Importance des maladies cardiovasculaires :
Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la première cause de mortalité dans le
monde. Plus de 80% des décès par MCV dans le monde surviennent dans des pays à revenu
faible ou intermédiaire. (OMS, 2011). Ces maladies constituent un ensemble de troubles
affectant le cœur et les vaisseaux sanguins et ont en commun une physiopathologie liée à
l’athérosclérose et responsable de mort prématurée. Il peut s’agir:

Des cardiopathies coronariennes (touchant les vaisseaux sanguins qui alimentent le
muscle cardiaque)

Des maladies cérébro-vasculaires (touchant les vaisseaux sanguins qui alimentent le
cerveau)

Des artériopathies périphériques (touchant les vaisseaux sanguins qui alimentent les
bras et les jambes)

Des cardiopathies rhumatismales, résultant d’un rhumatisme articulaire aigu, causé par
une bactérie streptocoque et affectant le muscle et les valves cardiaques

Des malformations cardiaques congénitales (malformations de la structure du cœur
déjà présentes à la naissance)

Des thromboses veineuses profondes et les embolies pulmonaires (obstruction des
veines des jambes par un caillot sanguin, susceptible de se libérer et de migrer vers le
cœur ou les poumons).
Les infarctus et les accidents vasculaires cérébraux sont généralement des événements aigus
et sont principalement dus au blocage d’une artère empêchant le sang de parvenir au cœur ou
au cerveau. Leur cause la plus courante est la constitution d’un dépôt gras sur les parois
internes des vaisseaux sanguins alimentant ces organes. Les accidents vasculaires cérébraux
peuvent aussi résulter du saignement d’un vaisseau sanguin cérébral ou de caillots. (OMS,
2011).
Les MCV sont à l’origine du plus fort pourcentage de décès par maladies non transmissibles
(48%), suivies par les cancers (21%) et les maladies respiratoires chroniques (12%). Les
diabètes sont directement responsables de 3.5% des décès par maladies non transmissibles.
On estime que certains facteurs de risque (FR) comportementaux, dont le tabagisme,
l’inactivité physique, la mauvaise alimentation et l’usage nocif de l’alcool, sont responsables
d’environ 80% des cardiopathies coronariennes et des MCV (OMS, 2009).
- 19 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
II.1.2. Impact des MCV sur la santé dans le monde :
L’Organisation mondiale de la Santé (OMS) estime à 17.3 millions le nombre de
personnes qui sont mortes de MCV en 2008, soit 30% de l’ensemble des décès mondiaux.
Selon les estimations, 7.3 millions étaient dus à des cardiopathies coronariennes et 6.2
millions à un accident vasculaire cérébral (AVC). Environ 80% de ces décès sont survenus
dans les pays en voie de développement, concernant presque à égalité les hommes et les
femmes. Si les tendances actuelles sont confirmées, en 2030, on estime à 23.6 millions le
nombre de personnes qui vont mourir de MCV, principalement de cardiopathies et d’AVC.
Selon les projections, ces affections resteront la première des causes de mortalité (OMS,
2012a).
L’étude des MCV et des FR associés en Tunisie est intéressante à plus d’un titre.
D’abord, très peu de données épidémiologiques sont disponibles pour quantifier le problème
en Tunisie, à part quelques études en milieu semi-urbain (Ghannem et al., 1992) et urbain
(Ben Rhomdane, 2001) et touchant un nombre réduit de sujets ou s’intéressant à un seul FR
(Papoz et al., 1988) comme le diabète ou l’hypertension artérielle. Ensuite, des données de ce
type confirment le phénomène de transition épidémiologique, ce qui devrait permettre au pays
de mieux organiser son système de santé pour faire face à cette nouvelle pathologie chronique
et coûteuse et d’entreprendre des actions de prévention efficaces à l’échelle du pays entier,
comme cela a été le cas pour les pays à forte mortalité cardiovasculaire (Lihioui et al., 2007).
D’après une étude tunisienne, il a été rapporté que le niveau des MCV a augmenté de façon
spectaculaire, en particulier chez les hommes. En 1992, 39.2% des hommes et 11.8% des
femmes ont été hospitalisés pour une MCV. En 2002, ces taux ont augmenté à 58.8% chez les
hommes et 38.2% chez les femmes (Ben Romdhane et al., 2005).
II.2. L’athérosclérose
II.2.1. Généralités et origine :
L’athérosclérose n’est pas une pathologie des temps modernes. En effet, des plaques
d’athérome authentiques sur le plan histologique ont été identifiées sur des corps momifiés
égyptiens par Sir Marc Armand RUFFER qui publia ses observations en 1911 (Ruffer, 1911).
Sur le plan anatomopathologique, ce n’est qu’en 1740 que le médecin allemand Johann
Friedrich Crell observe des concrétions calciques au niveau de la paroi vasculaire qu’il
appelle « plaque osseuse » (cité par Cowdry and Blumenthal, 1967). Une dizaine d’années
- 20 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
plus tard, le terme « athérome » est proposé pour la première fois par Albrecht Von Haller
(Von Haller, 1755). Il vient du grec athara qui signifie « bouillie de farine ou de gruau » qui
caractérise un kyste blanchâtre graisseux (Schwartz and Mitchell, 1962).
Puis en 1833, c’est à Strasbourg que le Docteur Lobstein a défini « l’artériosclérose» comme
des altérations artérielles considérant qu’elles ne sont pas d’origine inflammatoire et
conduisent à un durcissement et à un épaississement de la paroi des artères (Lobstein, 1833).
Aujourd’hui, l’artériosclérose est principalement causée par un vieillissement vasculaire.
C’est finalement, en 1904, que le Docteur Felix Marchand invente le terme « d’athérosclérose
» qui reflète la dualité lésionnelle, athéromateuse et scléreuse, de la maladie (Marchand,
1904).
Aujourd’hui, l’athérosclérose est l’une des causes majeures de mortalité et d’invalidité
humaines dans les pays industrialisés, représentant de ce fait un enjeu important de santé
publique. La prise en charge globale des patients atteints s’est améliorée. Cependant, les
récidives telles que les re-sténoses restent imprévisibles et nombreuses, soulignant l’échec de
la prévention médicale et l’insuffisance des connaissances des mécanismes sous-jacents
(Woldt, 2009).
II.2.2. Définition :
L’OMS définit l’athérosclérose comme « une association variable de remaniements de
l’intima des artères de gros et moyens calibres consistant en une accumulation focale de
lipides, de glucides complexes, de sang et de produits sanguins, de tissus fibreux et de dépôts
calcaires. Le tout s’accompagne d’une modification de la média » (OMS, 1958).
L’athérosclérose est une maladie multifactorielle, correspondant à une pathologie
inflammatoire chronique. Cette pathologie est liée à l’interaction entre les lipoprotéines
modifiées, les cellules inflammatoires, les macrophages dérivés des monocytes circulants et
des lymphocytes T et les éléments cellulaires de la paroi artérielle, impliquant les cellules
musculaires lisses (CML) et la production de matrice extracellulaires. Ceci aboutit à la
formation de lésions complexes et à une réduction du calibre artériel (Bonnet, 2005).
II.2.3. Physiopathologie de l’athérosclérose :
II.2.3.1. Structure de la paroi artérielle :
La paroi artérielle comprend trois tuniques : l’intima, la media et l'adventice (figure 7,
p.22). L’intima est la tunique la plus interne. C'est à son niveau que se développera la plaque
- 21 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
d'athérosclérose. Elle est composée d’une monocouche continue de cellules endothéliales
aplaties, jointives grâce à des jonctions serrées, ainsi que d'une couche sous-jacente de tissu
conjonctif (appelé espace sous-endothélial) assez épaisse et constituée de collagène, de
microfibrilles élastiques et de protéoglycanes (Glorian and Limon, 2007).
La media est la tunique moyenne. C'est la plus épaisse. Elle est composée d’un seul type
cellulaire, la CML, qui s’organise de façon extrêmement ordonnée. Elle est délimitée des
deux autres tuniques par des lames d'élastine : la limitante élastique interne et la limitante
élastique externe (Glorian and Limon, 2007).
L’adventice est la tunique externe correspond à un tissu conjonctif peu organisé. Elle sert de
support à l’innervation et aux micro-vaisseaux appelés « vasa vasorum », également à un
réseau de nerfs, qui peuvent pénétrer la partie externe de la média (Glorian and Limon, 2007).
Figure 7. Structure de la paroi artérielle (Glorian and Limon, 2007).
La paroi artérielle comprend trois tuniques : l’intima, la media et l'adventice. L’intima est la tunique la plus
interne (en regard de la lumière du vaisseau). C'est à son niveau que se développera la plaque d'athérosclérose.
Elle est composée d'une couche continue de cellules endothéliales formant une barrière étanche, ainsi que d'une
couche sous-jacente de tissu conjonctif appelé espace sous-endothélial. La media est la tunique moyenne. C'est la
plus épaisse. Elle est composée de cellules musculaires lisses (CML); Elle est délimitée des deux autres tuniques
par des lames d'élastine : la limitante élastique interne (LEI) et la limitante élastique externe (LEE). L’adventice
ou tunique extrême correspond à un tissu conjonctif peu organisé. Elle est irriguée par des vasa-vasorum qui se
projettent également dans la partie externe de la media. L’adventice renferme également un réseau de nerfs
rejoignant la media.
II.2.3.2. Mécanismes de formation de la plaque d’athérome : (figure 8, p.24)
Les LDL font partie des lipoprotéines athérogènes. Une hyperLDLémie favorise leur
infiltration dans l’espace sous-endothélial, c’est la première étape de l'athérogènèse.
L’accumulation de LDL athérogènes contenant l’apoB au niveau intimal reflète un
déséquilibre entre leurs flux d’entrée et de sortie.
- 22 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
Le flux d’entrée s’accroit par des concentrations plasmatiques élevées de ces lipoprotéines,
ainsi que par l’augmentation de la perméabilité endothéliale. Le flux de sortie peut être
diminué du fait de la présence de protéoglycanes et de collagène qui fixent les LDL dans le
sous-endothélium (Paul and Baudin, 2009). Cette liaison résulte de l’interaction
électrostatique entre les groupements sulfates chargés négativement portés par les
protéoglycanes et les régions basiques de l’apoB100. Ainsi piégées dans l’intima, les
lipoprotéines vont subir un processus d’oxydation, et se transforment en LDL oxydées
(LDLox) dont la présence dans l’intima altère les fonctions endothéliales et provoque
l’initiation d’une réaction inflammatoire, en stimulant la sécrétion de facteurs de croissance
comme le M-CSF (monocyte-colony stimulating factor), et de facteurs chimioattractants tels
que le MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1 ), ainsi que l’expression de molécules
d'adhésion ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-I), VCAM-1 (vascular cell adhesion
molecule-I) par les cellules endothéliales qui ont la capacité de se lier à des ligands de la
famille des intégrines présents à la surface des leucocytes circulants comme les monocytes et
les lymphocytes T. Ceci permet l’adhérence ferme de ces cellules à la surface de
l’endothélium vasculaire puis leur pénétration dans l’intima artérielle (Duriez, 2004; Glorian
and Limon, 2007; Packard and Libby, 2008).
Après adhésion, les monocytes pénètrent dans l’espace sous endothélial où ils seront
transformés en macrophage, sous l’influence des MCP-1, qui sont nécessaires au passage des
monocytes entre les cellules endothéliales, et des M-CSF nécessaires à la différenciation des
monocytes en macrophages et à leur prolifération (Packard and Libby, 2008).
Ces macrophages produisent de nombreuses cytokines pro-inflammatoires qui augmentent
l’activation endothéliale, favorisent l’adhésion de nouveaux monocytes ainsi que leurs
passage dans l’intima. Les cytokines induisent également un changement phénotypique des
CML qui aboutit à la perte de leur contractilité qui leur permettent de migrer et de proliférer
dans l'intima (Packard and Libby, 2008).
Les LDL ainsi modifiées ne peuvent plus se lier au récepteur cellulaire des LDL natives mais,
en revanche, elles sont capables de se lier aux récepteurs éboueurs ou « scavenger » exprimés
à la surface des macrophages et des CML ayant migrés de la media vers l'intima. A l’inverse
du récepteur aux LDL natives, les récepteurs scavangers ne sont plus contrôlés négativement
par le contenu intracellulaire en cholestérol ainsi les macrophages sous-endothéliaux et les
CML captent des quantités importantes de cholestérol en incorporant les LDLox par
l’intermédiaire des scavengers, se surchargent de cholestérol et se transforment en cellules
- 23 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
spumeuses (foam cells) qui caractérisent les lésions de type I (Paul and Baudin, 2009) (figure
8, p.24).
Figure 8. Genèse de la plaque d’athérosclérose (Glorian and Limon, 2007).
Les LDL infiltrées dans l’espace sous endothélial s’oxydent et déclenchent une réaction inflammatoire de
l’endothélium permettant le recrutement des monocytes au sein de la paroi artérielle, notamment via l’expression
de molécules d’adhésion telles que VCAM1.L’activation des monocytes en macrophages permet à ces cellules
de phagocyter les LDLox, de les accumuler et de devenir des cellules spumeuses. Les macrophages synthétisent
également des médiateurs proinflammatoires et des facteurs de croissances qui induisent notamment le
changement phénotypique des CML. Ces cellules migrent alors vers la média et secrètent à leur tour des
cytokines et des facteurs de croissances. Certaines d’entre elles se chargent de cholestérol et contribuent à la
formation du cœur lipidique de la plaque .D’autres prolifèrent et secrètent des protéines de la matrice
extracellulaire autour des cellules spumeuses pour élaborer la chape fibreuse de la plaque
II.2.3.3. Classification des lésions athéroscléreuses :
La plaque d'athérosclérose apparait comme une lente métamorphose de l’intima
artérielle qui semble se dérouler en plusieurs étapes (figure 9, p. 27). Selon la classification de
« l’American Heart Association » (AHA), les plaques d’athérome peuvent présenter six
phases successives d’évolution, identifiées d’un point de vue histopathologique par six types
de plaques (Stary et al., 1995).
II.2.3.3.a. Lésions de types I et II : Formation de cellules spumeuses et de stries
lipidiques :
La formation des cellules spumeuses caractérisent les lésions de type I.
L’accumulation de ces cellules spumeuses dans le sous-endothélium favorise l’évolution vers
- 24 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
le stade II, formant des lésions visibles macroscopiquement dites stries lipidiques. Les lésions
de type II se caractérisent plutôt par l’absence de lipides extracellulaires. Les deux premiers
stades peuvent apparaître entre les âges de zéro à 10 ans et sont asymptomatiques (Stary et al.,
1995; Duriez, 2004).
II.2.3.3.b. Lésions de type III : Lésions pré-athéromateuses :
Les lésions de type III ou pré-athérome, correspondent à une accumulation de lipides
extracellulaires en faible quantité due à la mort des cellules spumeuses par apoptose, sans
formation de véritable centre lipidique. Histologiquement, elles sont caractérisées par des
gouttelettes lipidiques extracellulaires, visibles au microscope. Ces lésions surviennent entre
10 et 20 ans sans provoquer d’événements cliniques (Stary et al., 1995; Bonnet, 2005).
II.2.3.3.c. Lésions de type IV : Lésions athéromateuses :
Les lésions de type IV ou athérome se caractérisent par l’accumulation focale des
lipides extra et intracellulaires en un amas appelé cœur lipidique constituant l’athérome. Ces
lésions sont présentes chez l’homme de 20 à 30 ans, et peuvent être le siège d’événements
thrombotiques éventuellement symptomatiques (Stary et al., 1995; Duriez, 2004).
II.2.3.3.d. Lésions de type V : Lésions fibro-athéromateuses :
Les lésions de type V correspondent à la plaque d’athérosclérose mature qui
correspond à la définition de l’OMS. Ces lésions apparaissent après 40 ans, et peuvent
engendrer des manifestations cliniques. Cette plaque comprend un centre lipidique entouré
d’une chape fibreuse. Le centre lipidique est constitué de cellules spumeuses, essentiellement
des macrophages, des CML, et de lipides extracellulaires. La chape fibreuse qui entoure le
centre est constituée d’une matrice qui contient des fibres de collagène de type I et III, des
glycoprotéines, dont la fibronectine et les glycosaminoglycanes synthétisés par les CML
(Stary et al., 1995; Duriez, 2004).
Les cellules contenues dans la chape fibreuse sont essentiellement des CML qui proviennent
de cellules ayant migré à partir de la média et proliféré dans l’intima sous l’effet des facteurs
chimiotactiques libérés par les cellules endothéliales, les macrophages et les CML. Enfin les
cellules endothéliales entourent la lésion en formant un revêtement continu thromborésistant,
dont la persistance et l’intégralité fonctionnelle assurent l’absence de complication de la
plaque.
Il existe selon la classification de l’AHA trois sous-types V : (Stary et al., 1995).
•
Type Va, plaque fibrolipidique
- 25 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
•
Type Vb, présence de calcifications
•
Type Vc, plaque fibreuse caractérisée par l’absence de centre lipidique.
II.2.3.3.e. Lésions de type VI : La plaque d’athérosclérose compliquée :
Les lésions de type VI sont dites compliquées, elles surviennent habituellement après
40 ans et présentent des phénomènes hémorragiques ou thrombotiques intra-plaques. La
cicatrisation qui survient après l’hémorragie et la formation du thrombus intra-plaque
contribuent à augmenter la sténose par augmentation du volume de la plaque. Ces
hémorragies et thromboses peuvent rendre une plaque brutalement symptomatique et
déclencher les accidents vasculaires aigus (angor instable, infarctus du myocarde (IDM),
AVC) (Stary et al., 1995; Duriez, 2004).
La classification de l’AHA reconnaît trois sous-types des lésions de type VI : (Stary et al.,
1995).

Type VIa (ulcération): rupture de la plaque caractérisée par l’apparition de fissures à la
surface de la lésion, due à la présence de cellules inflammatoires, secrétant les
cytokines pro-inflammatoires qui stimulent l’activité des enzymes qui digèrent la
matrice extracellulaire et favorisent la rupture de la plaque, telles que les
métalloprotéinases (MMP).

Type VIb (hémorragie ou hématome intraplaque): caractérisée par l’apparition d’une
hémorragie ou d’un hématome intraplaque. La survenue de ces hémorragies se produit
essentiellement à partir de la rupture de néovaisseaux sous l’effet des contraintes
hémodynamiques.

Type VIc (thrombose): Les lésions de type VIc se caractérisent par l’apparition d’une
thrombose. Le contact du sang circulant avec le sous-endothélium et le contenu du
centre nécrotique permet l’initiation du processus thrombotique avec l’adhésion et
l’agrégation des plaquettes sanguines et la formation d’un thrombus pariétal.
- 26 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
A : Artère normale
D : Plaque athérosclérotique stable
Formation de la chape fibreuse
Migration et prolifération
des CML
Intima :
Endothélium
)))))))))))))))))
LEI
)))))))))))))))))
Media:
)))))))))))))))))
CML
)))))))))))))))))
Matrice
)))))))))))))))))
LEE
)))))))))))))))))
)))))))))))))))))
))))))))))))
Accumulation
de macrophages
Apoptose des cellules
spumeuses : Formation
du core nécrotique
Activation des cellules T
E : Plaque athérosclérotique instable
B : Dysfonction endothéliale
Infiltration des lipides (LDL)
Molécules d’adhésion
endothéliale (VCAM-1, ICAM-1)
Migration de leucocytes
à la paroi artérielle
Amincissement
de la chape
fibreuse
Rupture de la
chape fibreuse
Formation des ERO
Augmentation de la
perméabilité endothéliale
Hémorragie
intra plaquettaire
Formation
du thrombus
Adhésion des leucocytes
F : Rupture de la plaque athérosclérotique
C : formation de stries lipidiques
Infiltration des lipides
(LDL)
Adhésion et agrégation
plaquettaire
Migration et
prolifération des CML
Thrombus intraluminal
Rupture
de la chape fibreuse
Formation
des cellules spumeuses
Activation des cellules T
Thrombus
intraplaquettaire
Adhérence et entrée
de plusieurs leucocytes
Figure 9. Formation de la plaque athérosclérotique (George and Lyon, 2010).
A : La paroi d'artère normal est composé de l'intima - une couche de cellules endothéliales assises sur la limitante élastique
interne (LEI) - et la média, où des cellules de muscle lisses (CMLs) vasculaires sont incorporées dans la matrice
extracellulaire et entourées par la limitante élastique externe (LEE). B: Dysfonctionnement endothélial. Les dégâts de
l'endothélium dus à l'exposition à des facteurs de risque mènent à la présence des espèces réactives d'oxygène (ERO),
augmentation de la régulation de molécules d'adhésion et de la perméabilité. Par conséquent, les leucocytes adhèrent à la
paroi artérielle et l’envahissent. De plus, les lipoprotéines de faible densité (LDL) sont infiltrées dans la paroi artérielle. C:
Formation de stries lipidiques. Les plaquettes adhèrent à la couche endothéliale endommagée. Une fois dans la paroi
artérielle, les LDL sont modifiées et sont ensuite prises par les macrophages qui se développent en cellules spumeuses. La
libération de chimiokines et des facteurs de croissance mène au recrutement des cellules inflammatoires, activation de
cellules T et migration et prolifération des CMLs vasculaires. D : formation de la plaque athérosclérotique stable. La
migration et la prolifération des CMLs mènent à la formation de la chape fibreuse. L’apoptose des cellules spumeuses cause
la formation d'un core nécrotique. L’accumulation de cellules T activées et des macrophages s’installe. E: Formation de la
plaque athérosclérotique instable. Amincissement de la chape fibreuse du à l’apoptose des CMLs et à la dégradation
matricielle. L’hémorragie intraplaquettaire s’installe. Ces facteurs rendent la plaque très instable et peuvent provoquer sa
rupture. F : Rupture de la plaque athérosclérotique. Rupture de la chape fibreuse ou érosion de la surface liminale
précipite la formation du thrombus, qui peut être occlusif.
- 27 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
II.3. Facteur de risque cardiovasculaire
Un facteur de risque cardiovasculaire (FRCV) se définit comme un facteur pour lequel
l'exposition du patient augmente le risque de survenue de la MCV alors que sa suppression ou
son amélioration diminue le risque. Plusieurs FR ont été associés au développement des
MCV. Certains FR, appelés facteurs classiques, sont connus depuis longtemps, alors que les
FR, dits émergents, sont en cours de validation et ne sont connus que depuis quelques années
et font encore l’objet de plusieurs études (Baudin et al., 2009)
II.3.1. Facteurs de risque classiques :
Ces différents FR méritent d’être distingués en facteurs non modifiables et
modifiables.
II.3.1.1. Facteurs de risque non modifiables :
II.3.1.1.a. L’âge et le sexe :
Le plus déterminant est représenté par l’âge du sujet, sur lequel il n’est
malheureusement pas possible d’intervenir. Les lésions d’athérosclérose apparaissent
toutefois très tôt dès l’âge de 20 ans chez les sujets exposés, au niveau de l’aorte abdominale
puis des coronaires. La présence d’un FR doit être retenue si l’âge du sujet dépasse 45 ans
pour un homme et 55 ans pour une femme ou si celle-ci est ménopausée. La population
masculine est particulièrement exposée au risque vasculaire. Ainsi, les femmes sont
concernées par la maladie coronaire avec 10 à 15 ans de retard. La survenue d’une ménopause
précoce spontanée ou chirurgicale constitue un FR indiscutable. Le rôle protecteur exercé par
le traitement hormonal substitutif est aujourd’hui remis en cause à la lumière des grandes
études nord-américaines (Bauduceau et al., 2004). En combinant âge et sexe, le risque d’avoir
un accident cardiovasculaire augmente à partir de 55 ans (Baudin et al., 2009).
II.3.1.1.b. Antécédents familiaux :
Les antécédents familiaux d’accident cardiovasculaire sont importants à considérer,
surtout lorsqu’ils sont survenus précocement. C’est ainsi que doivent être prises en compte les
notions d’IDM ou de mort subite avant 55 ans chez le père ou un parent du premier degré de
sexe masculin, ou chez la mère ou un parent du premier degré de sexe féminin âgés de moins
de 65 ans. Le mécanisme de ces facteurs héréditaires n’est sans doute pas univoque et
regroupe des affections bien connues comme les dyslipoprotéinémies familiales, le mode de
vie et de probables facteurs génétiques de prédisposition ou de protection sur lesquels
d’importants travaux de recherche sont en cours (Bauduceau et al., 2004).
- 28 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
II.3.1.2. Facteurs de risque modifiables:
Ce sont des FR qui ont fait l’objet de plus de travaux en raison des conséquences
thérapeutiques qu’ils offrent. La plupart de ces FR peut être efficacement pris en charge par
une modification des habitudes de vie, du moins au début de leur installation.
II.3.1.2. a. Le diabète:
Le diabète constitue un autre FR important des MCV, il augmente l'incidence de
l’IDM et de l’AVC chez les femmes plus que chez les hommes (Beckman et al., 2002).
L’hyperglycémie et la résistance à l’insuline associées à cette pathologie altèrent la fonction
de plusieurs cellules telles que les CML et les cellules endothéliales, ce qui conduit à
l’augmentation du processus inflammatoire et favorise la thrombose (Beckman et al., 2002).
Les études tunisiennes situent la prévalence nationale du diabète aux alentours de 6%.
Toutefois, il existe une disparité régionale (Ben Alaya et al., 2002). En effet, la prévalence du
diabète diffère significativement entre les régions, allant de 10.7% dans la région du grand
Tunis à 3.6% dans le Sud Ouest. Les données concernant l'Ariana situent la prévalence du
diabète aux alentours de 10% (INNTA, 2000; Ben Romdhane, 2001). La fréquence du diabète
chez des coronariens de la région du Sahel (Mahdia, Monastir, Sousse) est de 42.5% chez les
hommes et de 56.6% chez les femmes (Lihioui et al., 2007). La prévalence du diabète
augmente avec l'âge; elle est plus élevée en milieu urbain qu'en milieu rural. En ce qui
concerne le niveau d’instruction, il y a une interaction avec le sexe : à âge constant, la
prévalence du diabète pour les femmes est la plus élevée chez les analphabètes, et pour les
hommes chez les plus instruits (Ben Romdhane, 2001; Ben Alaya et al., 2002).
II.3.1.2.b. L’hypertension artérielle :
L’hypertension artérielle (HTA) est définie comme une augmentation de la pression
artérielle systolique (PAS) 140 mmHg et la pression artérielle diastolique (PAD) 90 mmHg
(OMS, 2012b). La localisation préférentielle des plaques d'athérosclérose dans des régions de
l’arbre artériel soumises à des perturbations du flux sanguin suggère l’importance des
contraintes mécaniques dans la genèse de la plaque. Ainsi, il n'est pas étonnant que l’HTA
soit un FR majeur des MCV (Glorian and Limon, 2007). Elle est impliquée dans
l'hypertrophie ventriculaire gauche, ainsi que dans l’augmentation de l’incidence d’AVC
ischémique ou hémorragique (Messerli et al., 2007). En effet, l’HTA, à laquelle 13 % des
décès dans le monde sont attribués, présente un des principaux FR à l’échelle mondiale. On
estime que l’HTA est à l’origine de 51% des décès par AVC et de 45% de ceux dus à une
cardiopathie coronarienne (OMS, 2009; 2012b).
- 29 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
La fréquence de l’HTA chez des coronariens de la région du Sahel (Mahdia, Monastir,
Sousse) est de 28.5% chez les hommes et de 59.6% chez les femmes (Lihioui et al., 2007).
Une autre étude Tunisienne, portant sur 2483 individus, a rapporté que la prévalence de
l’HTA était de 31% (25% chez les hommes et 36% chez les femmes) (Elasmi et al., 2009).
II.3.1.2.c. Le tabac :
Le tabagisme est un FR indépendant des MCV. Il induit l’augmentation de la
concentration du fibrinogène, ainsi qu’une diminution de la concentration du HDL-C et
stimule l’agrégation plaquettaire. Les radicaux libres générés par le tabac sont impliqués dans
le processus athérogéne et favorisent l’oxydation des LDL (Zieske et al., 1999). L’étude de
Framingham a clairement montré que le tabagisme représentait un FRCV puissant et
particulier car il favorise à la fois le développement de l’athérosclérose et la survenue de ses
complications aigues dont l’IDM (Dujardin and Cambou, 2005).
Dans le rapport sur la santé dans le monde en 2002 (OMS, 2002), l’OMS identifie le
tabagisme comme un FR majeur pour la santé, c’est-à-dire comme ayant une part attribuable
élevée dans la mortalité prématurée; la mortalité attribuée au tabagisme chez les hommes était
26.3% et celle chez les femmes était 9.3%.
En Tunisie, selon Lihioui et al. (2007) la fréquence du tabagisme chez des coronariens
de la région du Sahel (Mahdia, Monastir, Sousse) est de 77.4% chez les hommes et de 2.9%
chez les femmes. Une autre étude Tunisienne, portant sur 2483 individus (958 hommes et
1525 femmes) résidant dans la région du Grand Tunis, a rapporté que plus de la moitié des
hommes et 8% des femmes étaient fumeurs (Elasmi et al., 2009).
II.3.1.2.d. L’obésité :
Le surpoids et l’obésité se définissent comme une accumulation anormale ou
excessive de graisse corporelle qui peut nuire à la santé. L’indice de masse corporelle (IMC)
est une mesure simple du poids par rapport à la taille couramment utilisée pour estimer le
surpoids et l’obésité chez l’adulte. Il correspond au poids divisé par le carré de la taille,
exprimé en kg/m2 (IMC=poids/taille2). L’OMS définit le surpoids comme un IMC égal ou
supérieur à 25; l’obésité comme un IMC égal ou supérieur à 30. L’IMC est la mesure la plus
utile du surpoids et de l’obésité dans une population car, chez l’adulte, l’échelle est la même
quels que soient le sexe ou l’âge du sujet. Il donne toutefois une indication approximative car
il ne correspond pas forcément au même degré d’adiposité d’un individu à l’autre (OMS,
2012c).
L’obésité est une maladie cliniquement et biologiquement très hétérogène. Son
développement est classiquement associé à un déséquilibre de la balance énergétique dû à
- 30 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
l’interaction d’une susceptibilité biologique (en partie génétique) avec les modes de vie
favorisant l’augmentation des apports énergétiques et la sédentarité (Lubrano-Berthelier and
Clément, 2005).
À l’échelle mondiale, 2.8 millions de personnes meurent chaque année comme conséquence
de leur surpoids ou de leur obésité (OMS, 2009). Ces excès pondéraux peuvent entraîner des
effets métaboliques préjudiciables sur la pression artérielle et sur les taux de cholestérol ou de
TG et peuvent conduire à un diabète. Ils augmentent donc le risque de cardiopathie
coronarienne, d’AVC ischémique, de diabète de type 2 et de certains cancers courants. Entre
1980 et 2008, la prévalence mondiale de l’obésité (IMC 30 kg/m2) a presque doublé. En
2008, 10% des hommes et 14 % des femmes dans le monde étaient obèses, contre 5% des
hommes et 8% des femmes en 1980. On estime en conséquence que le nombre d’hommes et
de femmes de plus de 20 ans obèses atteignait un demi-milliard en 2008. Dans toutes les
régions de l’OMS, les femmes ont une plus grande probabilité que les hommes de souffrir
d’obésité (OMS, 2012b).
Selon les estimations de l’OMS (2008), l’obésité est estimée à 22.3% en Tunisie, et est plus
élevée chez les femmes que chez les hommes (31.7% versuss 12.8%). Dans l‘étude de
Ghannem et Hadj Fredj (1997) sur 957 adultes issus d'une zone urbaine secondaire (Sousse),
la prévalence d’obésité est de 28% dans la population (34% pour les femmes; 12% pour les
hommes). La fréquence de l’obésité chez des coronariens de la région du Sahel (Mahdia,
Monastir, Sousse) est de 25.1% chez les hommes et de 31.9% chez les femmes (Lihioui et al.,
2007). Une autre étude Tunisienne qui a porté sur 2964 femmes et 2379 hommes, a rapporté
que l’obésité est estimée à 25.4% dans la population générale. Elle est plus élevée chez les
femmes que chez les hommes (37% versus13.3%) (El Ati et al., 2012).
II.3.1.2.e. La dyslipidémie :
La dyslipidémie correspond à une ou plusieurs anomalies lipidiques associées au
risque coronaire telles que l’hypercholestérolémie, l’augmentation des TG, du LDLcholestérol (LDL-C) et des ratios (CT/HDL-C), (apoB/apoAI), ou la diminution du HDL-C
(Biswas et al., 2008).
Selon les recommandations de l’American National Cholesterol Education Program (NCEP)
III, la dyslipidémie est définie par la présence d’au moins un des caractères suivants :
cholestérol total ≥ 6.5 mmol/L, LDL-C ≥3.35 mmol/L, TG ≥ 1.7 mmol/L, HDL-C<1.03
mmol/L chez les hommes et <1.29 chez les femmes (NCEP, 2001). La fréquence de la
dyslipidémie chez des coronariens de la région du Sahel (Mahdia, Monastir, Sousse) est de
39.4 % chez les hommes et de 43.7% chez les femmes (Lihioui et al., 2007).
- 31 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
Selon l’Enquête sur la prévalence des FR des cardiopathies ischémiques dans le gouvernorat
de l’Ariana de 1997, en Tunisie, la prévalence de l'hypercholestérolémie est aux alentours de
14.3%. Les femmes sont plus touchées que les hommes (15.9% versus 12.4%) (Ben
Romdhane, 2001, Ben Alaya et al., 2002). Une autre étude a porté sur 2483 individus, âgés de
35 à 70 ans et résidant dans la région du Grand Tunis, recrutés entre mars 2004 et juin 2005.
Elle a rapporté que la dyslipidémie est observée chez 21% des sujets, sans différence en
fonction du sexe (Elasmi et al., 2009).
L’hypertriglycéridémie est associée à une augmentation du risque coronarien mais elle dépend
fortement de l’effet d’autres FR tels que l’obésité, le diabète, l’HTA mais aussi la diminution
des HDL et la présence de LDL modifiées qui sont alors plus sensibles à l’oxydation
(Bauduceau et al., 2004).
II.3.2. Facteurs de risque émergents :
II.3.2.1. L’augmentation de la Lipoprotéine a :
La lipoprotéine a (Lp(a)) est une macromolécule composée d’une apo(a), ayant de
fortes homologies de séquences avec le plasminogène, reliée à l’apoB100 par un pont
disulfure. L’analogie de structure de l’apo(a) avec le plasminogène a pour conséquence un
défaut de fixation du plasminogène et de génération de plasmine. Ainsi cette lipoprotéine
contribue à la fois au processus thrombogène et athérogène. L’augmentation de sa
concentration est considérée comme un FR de l’athérosclérose et des MCV (Kamstrup, 2010).
II.3.2.2. L’augmentation de la protéine C réactive (CRP) ultrasensible :
L’intérêt du dosage de cette protéine de l’inflammation renvoie à la physiopathologie
de l’athérosclérose qui est en fait un processus inflammatoire chronique. L’augmentation de la
CRP ultrasensible représente l'un des marqueurs de l'inflammation de l'athérosclérose
(Nordestgaard and Zacho, 2009).
II.3.2.3. L’augmentation de la Microalbuminurie :
Tout particulièrement chez les diabétiques de type 2, la découverte d’une
microalbuminurie dépassant 30 mg par 24 heures constitue un marqueur de risque
indiscutable (Bauduceau et al., 2004). Une étude a montré que la présence d’une
microalbuminurie était associée à la sévérité des MCV indépendamment des autres FRCV
(Ozyol, 2012).
II.3.2.4. L’hyperhomocystéinémie :
L’hyperhomocystéinémie représente aussi un FRCV (Guilland et al., 2003; Ciaccio
and Bellia, 2010). Chalghoum et al. ont rapporté que l’élévation de l’ homocystéine (hcy)
- 32 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
constitue un facteur non classique de risque cardiovasculaire chez des coronariens tunisiens
(Chalghoum et al., 2010). L’hcy est issue de la déméthylation de la méthionine qui est un
acide aminé soufré, principal donneur de groupement méthyle de l’organisme.
L’hyperhomocystéinémie modérée (entre 15 et 30 mol/L) est actuellement considérée
comme un FRCV et une augmentation de l’hcy totale de 10 mol/L augmente le risque
cardiovasculaire de 80%. Les propriétés pro-atérogènes de l’hcy s’expliquent par le fait
qu’une hyperhomocystéinémie est responsable de l’altération endothéliale, des lésions de la
paroi artérielle, de la prolifération des CML, de l’inactivation de la protéine C et surtout de
l’oxydation des LDL-C. Tous ces effets s’associent et s’accumulent pour la formation de la
plaque athéromateuse et contribuent aux complications thrombotiques et ischémiques
ultérieures (Obeid and Herrmann, 2009; Chalghoum et al., 2010).
II.3.2.5. Le Syndrome métabolique :
II.3.2.5.a. Historique et définitions:
Dès 1923, Kylin observa une association entre hyperglycémie, hypertension et la
goutte; maladie chronique liée au métabolisme de l’acide urique (Kylin, 1923). En 1956,
Vague fit le lien entre ce syndrome, l’obésité androïde et l’athérosclérose (Vague, 1956). La
relation entre le syndrome métabolique (SM) et l’hyperinsulinémie a été ensuite mise en
évidence par Modan (Modan et al., 1985), mais c’est Reaven, en 1988, qui mit
l’insulinorésistance au cœur du SM et qui lui donna le nom de syndrome X (Reaven, 1988).
Enfin, Kaplan désigna « deadly quartet » l’association entre obésité abdominale, intolérance
au glucose, hypertriglycéridémie et HTA (Kaplan, 1989). Ce bref historique permet d’illustrer
l’évolution du concept de SM, où sont mises en avant, suivant les époques et les auteurs,
tantôt l’obésité abdominale, tantôt l’insulinorésistance.
Dans les années 1990, le concept de SM, en tant que regroupement des principaux FRCV,
connut un intérêt croissant notamment en santé publique. Afin de faciliter son diagnostic,
plusieurs groupes d’études ont établi des critères pour le définir (tableau III, p.34). La
prévalence du SM est en augmentation dans les sociétés occidentales. Cependant, la
comparaison entre les études de prévalence est difficile aux vues des différents critères du SM
retenus pour chacune. Elle varie en fonction de l’âge, du sexe, des populations et de l’ethnie
(Harzallah et al., 2006; Santos and Barros, 2007; Kelliny et al., 2008; Allal-Elasmi et al.,
2010). De nombreuses études ont montré que le SM est associé à un risque accru de MCV
ainsi que de décès par MCV (Ninomiya et al., 2004; Gami et al., 2007).
- 33 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
Tableau III. Principales définitions du syndrome métabolique
(Colas, 2010).
Groupe d’étude
Organisation Mondiale
de la Santé (OMS)
(Alberti and Zimmet, 1998)
« National Cholesterol
Education Program’s Adult
Treatment Panel (ATP) III »
(NCEP, 2001)*
« American Heart
Association » (AHA)
(Grundy et al., 2004)
Fédération Internationale
du Diabète (IDF)
(Alberti et al., 2005)
Définition unifiée
(Alberti et al., 2009)
Définition
- Diabète de type-2 ou tolérance au glucose diminuée ou glycémie
circulante modifiée ou résistance à l’insuline
+
2 ou plus des 4 anomalies suivantes :
- Obésité : IMC > 30 ou ratio taille/hanche > 0.9 (H) / 0.85 (F)
- Dyslipidémie : TG ≥ 1.7 mM ou HDL-C < 0.9 mM (H) / 1.0 mM (F)
- Hypertension : PA ≥ 160/90 mm Hg
- Microalbuminérie : taux excrétion d’albumine > 20 mcg/min
3 ou plus des 5 anomalies suivantes :
- Obésité abdominale : tour de taille ≥ 102 cm (H) / 88 cm (F)
- Hypertriglycéridémie : TG ≥ 1.7 mM
- Faible HDL-C : HDL-C < 1 mM (H) / 1.3 mM (F)
- Hypertension : PA ≥ 130/85 mm Hg
- Glycémie à jeun : ≥ 6.1 mM
3 ou plus des 5 anomalies suivantes :
- Obésité abdominale : tour de taille ≥ 102 cm (H) / 88 cm (F)
- Hypertriglycéridémie : TG ≥ 1.7 mM ou traitement
- Faible HDL-C : HDL-C < 1 mM (H) / 1.3 mM (F) ou traitement
- Hypertension : PA ≥ 130/85 mm Hg ou traitement
- Glycémie à jeun : ≥ 5.6 mM ou traitement
Obésité abdominale : tour de taille ≥ 94 cm (H) / 80 cm (F)
(avec spécificités ethniques)
+
2 ou plus des 4 anomalies suivantes :
- Hypertriglycéridémie : TG ≥ 1.7 mM ou traitement
- Faible HDL-C : HDL-C < 1 mM (H) / 1.3 mM (F) ou traitement
- Hypertension : PA ≥ 130/85 mm Hg ou traitement
- Glycémie à jeun : ≥ 5.6 mM ou diabète de type-2
3 ou plus des 5 anomalies suivantes :
- Obésité abdominale : dépendante des populations et des pays
- Hypertriglycéridémie : TG ≥ 1.7 mM ou traitement
- Faible HDL-C : HDL-C < 1 mM (H) / 1.3 mM (F) ou traitement
- Hypertension : PA ≥ 130/85 mm Hg ou traitement
- Glycémie à jeun : ≥ 5.5 mM ou traitement
*Etude réalisée par un comité d’experts. F, femme H, homme; PA, pression artérielle.
- 34 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
II.3.2.5.b. Physiopathologie du SM:

Obésité abdominale et conséquences inflammatoires :
Des données indiquent que le SM est précédé par un excès de tissu adipeux viscéral
(Cameron et al., 2008). C’est un paramètre clinique très intimement lié au SM (NCEP, 2002;
Carr et al., 2004), lui-même associé à un état pro-inflammatoire (Sutherland et al., 2004). Le
tissu adipeux étant un organe endocrine, son expansion induit une sécrétion accrue de
médiateurs pro-inflammatoires et pro-athérogéniques comme la leptine, la résistine, le facteur
de nécrose tumoral alpha (TNFα), l’interleukine (IL)-6, la CRP et l’inhibiteur de l’activateur
du plasminogène -I (PAI-I) ainsi qu’une sécrétion diminuée d’adiponectine (Trayhurn and
Wood, 2004; Wassink et al., 2007). De plus, des anormalités fonctionnelles des adipocytes
apparaissent, notamment un stress du réticulum endoplasmique et des mitochondries,
conduisant au développement d’une insulino-résistance (de Ferranti and Mozaffarian, 2008).
L’inflammation contribue aussi à ce phénomène puisque des niveaux élevés de cytokines proinflammatoires conduisent à la résistance à l’insuline (Saltiel and Kahn, 2001). L’IL-6 est
associée à une inhibition de la signalisation de l’insuline dans des myotubes humains
(Rieusset et al., 2004; Colas, 2010).
 Résistance à
l’insuline :
L’insuline est une hormone hypoglycémiante produite sous forme d’un précurseur, la
pro-insuline, par les cellules β des ilôts de Langerhans du pancréas. L’insuline mature est
composée de deux chaînes polypeptidiques (la chaîne A de 21 acides aminés et la chaîne B de
30 acides aminés) reliées par deux ponts disulfures. Sa sécrétion est principalement contrôlée
par la concentration en glucose plasmatique. Elle joue un rôle dans un ensemble de
mécanismes métaboliques. Sa fonction principale est le contrôle de la capture et de
l’utilisation du glucose dans les tissus périphériques par l’intermédiaire de transporteurs
passifs de glucose (GLUT) (Zhao and Keating, 2007). Cet effet hypoglycémiant est facilité
par sa capacité à inhiber la néoglucogenèse et la glycogénolyse tout en stimulant la
glycogenèse hépatique. Ces effets sont neutralisés par des hormones hyperglycémiantes
s’opposant à l’insuline comme le glucagon (produit par les cellules α des ilôts de Langerhans
du pancréas). Elle possède également un effet anti-lipolytique au niveau des adipocytes
(Manganiello et al., 1991). Lorsqu’un défaut d’action de l’insuline apparaît, il en résulte une
hyperinsulinémie à jeun pour maintenir l’euglycémie.
La résistance à l’insuline est en partie due à des facteurs innés génétiques (Bogardus et
- 35 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
al., 1989) et à des facteurs acquis avec le style de vie occidental comme par exemple le
manque d’activité physique et la sédentarité. En effet, il est connu que l’activité physique
augmente la sensibilité à l’insuline (Perseghin et al., 1996). L’obésité favorise la résistance à
l’insuline. Les AGL sont libérés en abondance dans la circulation sanguine du tissu adipeux
élargi et insulino-résistant et leur clairance est diminuée (Bjorntorp et al., 1969), contribuant à
augmenter les taux d’AGL circulants chez les obèses. Ces derniers contribuent à la résistance
à l’insuline des muscles squelettiques (Boden et al., 1994) tandis que leur diminution
l’améliore (Santomauro et al.,1999). Les AGL favorisent la résistance à l’insuline du foie en
inhibant l’action anti-glycogénolytique de l’insuline, contribuant à augmenter la production
hépatique de glucose (Boden et al., 2002). Ils contribuent à l’accumulation intracellulaire de
lipides, associée à la résistance à l’insuline des muscles squelettiques et au dysfonctionnement
des cellules β (Schaffer, 2003). En effet, les AGL pénètrent facilement dans la cellule et leur
accumulation contribue à une augmentation de leur ré-estérification en TG mais aussi à une
augmentation des diacylglycérols (DAG) produits. Ces derniers activent la protéine kinase C
(PKC) qui diminue la phosphorylation des « Insulin Receptor Substrate » (IRS-1/2),
diminuant ainsi la capture de glucose (Boden, 2008) (figure 10, p.37). Enfin, les AGL
diminuent la transcription des gènes codant pour GLUT4 et diminuent la stabilité de leur
acide ribonucléique messager (ARNm) (Long and Pekala, 1996; Armoni et al., 2005).
Cependant, il est important de souligner que l’augmentation des AGL induit
paradoxalement une sécrétion compensatoire d’insuline ainsi qu’une diminution de sa
clairance afin de maintenir l’euglycémie. Seuls les individus dont la compensation est
insuffisante deviennent hyperglycémiques, expliquant ainsi pourquoi seulement 50% des
obèses insulino-résistants développent un diabète de type 2 (Boden, 2005; Colas, 2010).
- 36 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
Figure10. Rôle des AGL circulants dans les différentes composantes du syndrome
métabolique (modifié à partir de Boden, 2008; Colas, 2010). L’obésité favorise la résistance à
l’insuline contribuant à augmenter les taux des acides gras libres (AGL) circulants. Les AGL pénètrent
facilement dans la cellule et leur accumulation contribue d’une part à une augmentation de la synthèse des
triglycérides (TG) d’où une augmentation de la production des lipoprotéines de très basse densité (VLDL) et
une diminution des lipoprotéines de haute densité (HDL) et d’autre part à une augmentation des diacylglycérols
(DAG). Ces derniers activent la protéine kinase C (PKC) qui diminue la phosphorylation des « Insulin Receptor
Substrate » (IRS-1/2), diminuant ainsi la capture de glucose. Les AGL contribuent alors à l’accumulation
intracellulaire de lipides, associée à la résistance à l’insuline des muscles squelettiques. Les AGL peuvent aussi
induire une relative vasoconstriction. En effet, au niveau des cellules endothéliales, la perfusion d’insuline
augmente la production de monoxyde d’azote (NO) mais l’élévation d’AGL empêche cette augmentation en
activant la PKC et la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate oxydase (NADPH oxydase) et en inhibant
IRS-1/2. eNOS, « Endothéliale Nitric oxide Synthase »; ERO, espèces réactives oxygénées; GLUT4, « Glucose
Transporter type-4 »; PI3 Kinase, phosphatidyl inositol 3 kinase.
 Intolérance au
glucose :
Les défauts d’action de l’insuline dans le métabolisme du glucose entraînent des
déficiences de la capacité de l’hormone d’une part à supprimer la production hépatique et
rénale de glucose, et d’autre part à induire la capture et l’utilisation du glucose dans les tissus
insulino-sensibles. La relation entre insulino-résistance et intolérance au glucose est bien
connue. Afin de compenser ses défauts d’action, l’organisme est capable de modifier la
sécrétion et/ou la clairance de l’insuline (Byrne et al., 1995) pour maintenir une glycémie
normale. Lorsque la sécrétion d’insuline commence à diminuer et devient insuffisante pour
maintenir l’euglycémie, l’organisme devient intolérant au glucose et des phases
d’hyperglycémie apparaissent, notamment en périodes post-prandiales (Colas, 2010).
- 37 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
 Dyslipidémie :
Dans des conditions de résistance à l’insuline, le flux d’AGL allant du tissu adipeux
vers le foie augmente et favorise la synthèse hépatique de TG (figure 10, p.37). Il en résulte
des modifications du métabolisme des lipoprotéines. On constate alors une augmentation de la
production des VLDL larges, riches en TG et promptes à former des sdLDL appauvries en
esters de cholestérol et enrichies en TG, ainsi qu’une diminution des HDL. Le catabolisme
des lipoprotéines à apoB est diminué alors que celui des HDL à apoAI est augmenté (Chan et
al., 2004). Dans le SM, la faible concentration des HDL est liée à un catabolisme accéléré :
l’augmentation des AGL et de l’activité de la CETP induit une perte de cholestérol estérifié et
un enrichissement en TG des HDL par échange avec les lipoprotéines riches en TG (Barter,
2004), les HDL ainsi transformées sont alors plus sensibles à l’action de la LH et deviendront
des particules HDL plus petites et moins stables qui seront rapidement catabolisées. La
présence de LDL de petite taille est liée à l’activation de la LH qui va diminuer la teneur en
lipides des particules de LDL et HDL (Brunzell and Hokanson, 1999) (figure 11, p.39). Les
sdLDL sont plus sensibles à l’oxydation, moins bien reconnues et donc moins épurées par les
R-LDL s’accumulant ainsi plus facilement au niveau de la paroi artérielle. La figure 12 (p.40)
résume le rôle de l’obésité centrale dans la genèse des dyslipidémies.
- 38 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
Figure 11. L’effet athérogène de la dyslipidémie en présence du syndrome métabolique
(Modifiée à partir de Berneis and Krauss, 2002).
(A) une hypotriglycéridémie permet la sécrétion de lipoprotéines de très basse densité (VLDLs)
pauvres en triglycérides (TG), qui seront transformées en des lipoprotéines de basse densité (LDL),
sous l’action de la lipoprotéine lipase (LPL). Ces LDL ont une grande affinité pour le récepteur LDL
(R-LDL). (B) une hypertriglycéridémie est associée à la sécrétion de particules VLDL plus grandes
qui sont hydrolysées moins efficacement par la LPL, donnant naissance à des particules remnantes.
Ces remnants sont à leur tour hydrolysés par l'action combinée de la LPL et de la lipase hépatique
(LH) pour se transformés en LDL plus petites qui ont une moindre affinité pour le R-LDL. Ces
remnants subissent aussi l'échange de TG contre le cholestérol à partir des LDL et des HDL sous
l’action de la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP). Les particules LDL et HDL riches
en TG sont ensuite dégradées par la LH, donnant naissance à des LDL plus petites et des HDL plus
petites et moins stables qui seront rapidement catabolisées. Chol, cholestérol; IDL, lipoprotéine de
densité intermédiaire
- 39 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
Cellules
adipeuses
AGL
Foie
CE
VLDL
HDL
HDL-c
TG
CE
TG
LDL
LD L
petites
et denses
Figure 12. L’adiposité abdominale : point de départ de la dyslipidémie athérogène
(Effectuée à partir de Bastard et al., 2001).
L’excès des cellules adipeuses semble à l’origine de la dyslipidémie associée à l’obésité abdominale
en induisant une augmentation du flux d’acides gras libres (AGL) vers le foie et en participant à
l’insulinorésistance. Il en résulte des modifications du métabolisme des lipoprotéines qui se caractérise
par une triade métabolique athérogène incluant une augmentation de la production des particules
VLDL larges, riches en triglycérides (TG), une baisse du HDL-C et un excès de la fraction des LDL
petites et denses. Toutes ces anomalies lipidiques contribuent à l’augmentation du risque
cardiométabolique engendré par un excès de tissu adipeux viscéral.
La présence des sdLDL augmente le risque d’évènements cardiovasculaires (St. Pierre et al.,
2001; Holvoet et al., 2004). Le rôle délétère des sdLDL est résumé dans la figure 13 (p.41).
Ces particules sont plus athérogènes que les particules de LDL plus grandes, mais elles
portent moins de cholestérol. Donc, la concentration de LDL-C n'est pas toujours l'équivalent
du nombre des particules LDL. Par contre, chaque particule LDL contient une molécule
d'apoB; donc, l’apoB plasmatique est équivalente au nombre total des particules athérogènes,
> 90% de celui des particules LDL (Sniderman and Cianflone, 1993). En effet, Boumaiza et
al. (2010) ont rapporté que chez des patients ayant un SM et une hypertriglycéridémie, les
concentrations d’apoB et du Non-HDL-C (mais pas du LDL-C) sont significativement élevées
et semblent être associées à une augmentation de la sténose coronaire. Donc, la mesure
d'apoB et du Non-HDL-C semble être plus utile dans l'évaluation de risque de la sténose
coronaire dans la population ayant un SM que les LDL-C et peut être une meilleure cible
thérapeutique.
- 40 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
TG
Figure 13. Les LDL petites et denses sont particulièrement athérogènes
(Effectuée à partir de Fruchart, 2002).
Une dyslipidémie s'accompagne de la prédominance des LDL petites et denses. Ces lipoprotéines sont
hautement athérogénes, du fait d'une diminution de leur affinité de liaison pour le récepteur des LDL,
s’accumulant ainsi plus facilement au niveau de la paroi artérielle, et de la diminution de leur
résistance au stress oxydatif. Ces LDL petites et denses seront captées par les macrophages au niveau
de l'espace sous-endothélial avec formation de cellules spumeuses, point de départ de l’athérosclérose.
 Hypertension
:
L’hypertension peut être induite par l’état de résistance à l’insuline (Ferrannini et al.,
1987) durant lequel l’effet vasodilatateur de l’insuline est perdu (Tooke and Hannemann,
2000). Par contre, les effets de l’insuline sur la réabsorption du sodium (Kuroda et al., 1999)
et l’activité du système nerveux sympathique sont maintenus (Egan, 2003). Les AGL peuvent
également induire une relative vasoconstriction (Tripathy et al., 2003). En effet, au niveau des
cellules endothéliales, la perfusion d’insuline augmente la production de monoxyde d’azote
(vasodilatateur) mais l’élévation d’AGL empêche cette augmentation (Baron, 2002) en
activant la PKC et la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase et en
inhibant IRS-1/2 (Boden, 2008; Colas, 2010) (figure 10, p.37).

NAFLD : composante hépatique du SM :
La stéatose est une lésion histologique fréquemment observée et définie par l’accumulation
d’acides gras sous forme de TG dans le cytoplasme des hépatocytes, se traduisant le plus
souvent par de larges vacuoles refoulant le noyau en périphérie. La stéatose non alcoolique,
ou nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), représente un large spectre d’entités
- 41 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
histopathologiques allant de la stéatose pure au carcinome hépatocellulaire. Le plus souvent
observée chez des malades ayant un SM, elle est désormais considérée comme la
manifestation hépatique de ce syndrome. La forme la moins avancée est la stéatose hépatique
qui correspond à une accumulation de TG dans le foie. Cette stéatose peut évoluer en
stéatohépatite ou (non alcoholic steatohepatitis) qui correspond à une stéatose associée à une
inflammation et à des lésions hépatiques. La NASH peut elle-même progresser en cirrhose
puis, dans les formes les plus sévères, en carcinome hépatocellulaire (Lemoine and Serfaty,
2012). La relation entre la stéatose non alcoolique et le SM est désormais bien admise (Ying
et al., 2012 ; Page, 2012; Hurjui et al., 2012). Approximativement 90% des patients avec une
NAFLD présentent au moins une des caractéristiques du SM et environ 33% présentent le
diagnostic complet (Marchesini et al., 2003 ; 2005a). La présence d'un SM augmente le risque
de développer une NAFLD que ce soit chez l'homme ou chez la femme (Hamaguchi et al.,
2005). De nombreuses études ont démontré que les caractéristiques du SM (obésité,
insulinorésistance, diabète de type 2, dyslipidémie et hypertension) sont fortement associées à
la présence d'une NAFLD (Bugianesi et al., 2005; Oh et al., 2006; Kwon et al., 2012). De
même, les NAFLD sont fortement associées à la composante majeure du SM, l'insulinorésistance (Ying et al., 2012). Ces différents éléments laissent à penser que les NAFLD
représenteraient la composante hépatique du SM (Marchesini et al., 2001; Yki-Järvinen, 2005;
Page, 2012). La résistance à l’insuline est considérée comme une étape clé dans
l’accumulation des lipides au niveau hépatique et donc dans l’initiation de la NAFLD. Dans
des conditions d’insulino-résistance, le tissu adipeux et le muscle oxydent de préférence les
lipides, ce qui a pour conséquence d’augmenter la quantité d’AGL dans la circulation
sanguine (Leclercq and Sempoux, 2006; Lewis and Mohanty, 2010) (figure 14, p.43). Le
tissu adipeux joue un rôle important dans l’homéostasie systémique des lipides et du
glucose. Dès que sa capacité à estérifier les acides gras provenant de la circulation sanguine et
à les stocker au sein des adipocytes est dépassée (ce qui se produit en cas d’excès alimentaire
riche en graisses et sucres et en cas d’insulino-résistance), les AGL sont délivrés au foie,
provoquant une stéatose (Lewis et al., 2002). Cette composante hépatique du SM semble jouer
un rôle dans le développement de l’athérosclérose. Certaines études ont rapporté que NAFLD
est un FR indépendant des MCV (Gaudio et al., 2012; Del Ben et al., 2012; Huang et al.,
2012a; Bhatia et al., 2012).
- 42 -
Chapitre II: Maladies cardiovasculaires et athérosclérose
Figure 14. Vue d'ensemble des mécanismes de l’insulinorésistance et enzymes
hépatiques: mécanismes de l’augmentation de l'assimilation des acides gras libres (AGL) par le foie,
l’augmentation de la lipogenèse de novo, la détérioration de la β-oxydation causée par le
dysfonctionnement mitochondrial et la sécrétion des lipoprotéines de très basse densité (VLDL), qui
sont impliqués dans le développement de la stéatose non alcoolique (NAFLD) qui contribue à son tour
au risque cardiovasculaire. ALAT : alanine aminotransferase; GGT : Gamma glutamyl transférase ;
TG : triglycérides. (modifiée à partir de Schindhelm et al., 2007a)
II.4. HDLémie :
Plusieurs études épidémiologiques ont démontré que les basses concentrations de
HDL-C représentent un FR indépendant de développer la maladie coronarienne (Wilson et al.,
1988; Gordon and Rifkind, 1989; Assmann, et al., 1996; Gotto, 2001). Il a été démontré que
chaque réduction de 0.026 mmol/L (réduction de l’ordre de 1%) du HDL-C correspondait à
une augmentation du risque de développer la MCV de 2% chez l’homme et de 3% chez la
femme. Les études démontrent que cette relation significative persiste au sein des populations
étudiées jusqu’à l’âge de 80 ans et qu’elle demeure tout aussi significative chez des sujets
ayant des concentrations normales de cholestérol total (Genest and Cohn, 1998).
Les raisons physiologiques pour lesquelles les niveaux de HDL cholestérol sont
inversement associés à la prévalence de la MCV sont longtemps demeurées obscures. Plus
récemment, des expériences effectuées in vitro et à l’aide de modèles animaux modifiés
génétiquement ont entre autres permis de cibler des mécanismes pouvant potentiellement
expliquer l’effet athéroprotecteur des HDL. Le chapitre suivant dresse la liste des différents
mécanismes.
- 43 -
Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
III.1. Propriétés athéroprotectrices des HDL
L’athéroprotection induite par les HDL a été classiquement attribuée à leur rôle central
dans le TIC, le processus physiologique par lequel le cholestérol excédentaire présent dans les
cellules périphériques est capté et transporté dans le plasma pour son élimination finale
essentiellement par le foie. La mise en évidence des effets directs des HDL sur l’endothélium
a ouvert un nouveau domaine de recherche. Ces effets peuvent être groupés en 4 catégories :
la protection de la biodisponibilité de l’oxyde nitrique (NO), le contrôle de l’inflammation, le
contrôle de la thrombose, et la régulation de l’apoptose, de la prolifération et de la migration
cellulaires. Les HDL possèdent aussi des propriétés antioxydantes. Tous ces effets seront
décrits brièvement ci-dessous.
III.1.2. Transport inverse du cholestérol :
III.1.2.1. Historique :
Le concept du TIC était d’abord présenté en 1968 par Glomset pour décrire le
processus par lequel le cholestérol extra-hépatique (périphérique) retourne au foie pour
excrétion dans la bile et enfin dans les fèces (Glomset, 1968). Les cellules non hépatiques
acquièrent du cholestérol par l’assimilation de lipoprotéines et font sa synthèse de novo.
L’excès du cholestérol non estérifié est toxique pour les cellules et en conséquence, les
cellules ont développé plusieurs voies pour s’en protéger. La seule voie clé est l’efflux du
cholestérol vers les cellules extracellulaires (accepteurs). Le retour de ce cholestérol
« périphérique » au foie est nécessaire pour équilibrer la consommation en cholestérol et la
synthèse de novo et ainsi maintenir un métabolisme de cholestérol stationnaire.
La relation entre le TIC et l’athérosclérose est tout d’abord suggéré par Ross et Glomsel
(1973) qui ont rapporté l’hypothèse que les lésions athérosclérotiques se développent quand
un déséquilibre s’installe entre la déposition et le déplacement du cholestérol artériel après
une blessure endothéliale. Ce concept est aussi développé par Miller et Miller (1975), qui ont
suggéré que, sur la base de la relation inverse entre le HDL-C et les MCV, l’accent devrait
être placé sur l’augmentation de HDL comme une voie pour augmenter la clairance du
cholestérol de l’artère pour prévenir les MCV. Malgré trois décennies de travail, la relation
entre le TIC et l’athérosclérose demeure plus une hypothèse qu’un fait établi (Cuchel and
Rader, 2006).
III.1.2.2. Etapes du transport inverse du cholestérol :
Toutes les cellules du corps humain synthétisent du cholestérol en plus elles en
importent à partir des lipoprotéines en circulation et des membranes des cellules
- 44 -
Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
sénescentes. La synthèse de cholestérol intracellulaire parallèle à son importation produit
un débalancement entre l’utilisation et la disponibilité de celui-ci, l’offre étant plus grande
que la demande (Assmann, and Nofer, 2003). Afin d’éviter son accumulation dans
l’organisme, les 9 mg de cholestérol synthétisés par jour par kilogramme de masse
corporelle doivent être pris en charge pour être éventuellement éliminés (Assmann, and
Nofer, 2003). Ceci est rendu possible par la présence d’une voie métabolique appelée
«TIC», qui réfère au mouvement du cholestérol des tissus périphérique vers le foie, pour
son élimination (figure 15, p.46). Chaque sous-classe de HDL, de concert avec plusieurs
enzymes, joue un rôle de premier plan dans cette voie métabolique que les connaissances
actuelles permettent de décrire comme suit (Von Eckardstein et al., 2001).
III.1.2.2.a. Étape I : Synthèse de l’apoAI et formation des pré-β-HDL :
Les pré-β-HDL correspondent aux HDL naissantes ou immatures à cause de leur très
faible contenu en lipides. Elles sont constituées d’apo, principalement l’apoAI, associées avec
quelques molécules de phospholipides. Ces particules ont une forme discoïdale (en raison de
l’absence de composés lipidiques neutres au cœur), une densité élevée (comprise entre 1.21 et
1.25 g/mL) et une mobilité électrophorétique de type pré β (Fielding and Fielding, 2001). Les
molécules d’apoAI et les pré-β-HDL sont synthétisés de novo au niveau du foie et de la
muqueuse intestinale. Elles peuvent aussi être générées à partir de constituants provenant de
l’hydrolyse des lipoprotéines riches en TG (chylomicrons et VLDL) suite à l’action de la
LPL, ou encore provenir de l’hydrolyse des particules HDL elles-mêmes suite à leur
catabolisme (Lagrost et al., 2003) (figure 16, p.47). La protéine de transfert de phospholipides
(PLTP: Phospholipid Transfer Protein) est activement impliquée dans la formation des pré-βHDL, en catalysant l’incorporation de molécules de phospholipides, tels que la
sphyngomyéline et la phosphatydilcholine, à la surface de l’apoAI délipidée. Il est à noter que
l’événement précoce qu’est l’incorporation des phospholipides sur les molécules d’apoAI est
d’une importance primordiale dans la maturation ultérieure de la HDL. Suite à leur
production, l’apoAI et les pré-β-HDL initient le TIC, en interagissant avec les membranes des
cellules induisant un efflux de phospholipides et de cholestérol. L’interaction des molécules
d’apoAI et des pré-β-HDL avec les membranes cellulaires peut se faire de façon spécifique
ou non spécifique. Le cholestérol libre en circulation peut également s’associer à l’apoAI. Le
cycle du TIC est donc amorcé par la collecte du cholestérol excédentaire par les molécules
d’apoAI et les pré-β-HDL (Mauger, 2004).
- 45 -
Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
Figure 15. Vue schématique du transport inverse du cholestérol et du métabolisme des
lipoprotéines de haute densité (Singh et al., 2007).
ABCA1 : adenosine triphosphate–binding cassette transporter A1; ABCG1 : adenosine
triphosphate–binding cassette transporter G1; apo : apolipoprotéine ; HDL : lipoprotéine de
haute densité ; LDL : lipoprotéine de basse densité ; LDL-R, Récepteur du LDL ; LPL :
lipoprotéine lipase ; SR-BI scavenger receptor type BI ; VLDL lipoprotéine de très basse
densité
- 46 -
Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
Figure 16. Origine des particules préβHDL
(Lagrost et al., 2003)
Les pré-β-HDL, encore nommées HDL naissantes ou HDL discoïdales, peuvent avoir
plusieurs origines métaboliques distinctes, essentiellement de trois types : 1) la synthèse
directe par le foie ou l’intestin ; 2) l’hydrolyse des lipoprotéines riches en triglycérides
(notamment chylomicrons) en période postprandiale. Cette origine semble requérir les actions
combinées de la lipoprotéine lipase (LPL) et de la protéine de transfert des phospholipides
(PLTP) ; et 3) le remodelage des particules HDL au cours de leur transit intravasculaire et
sous l’action de diverses protéines (enzymes lipolytiques, protéines de transfert des lipides,
récepteurs cellulaires).
III.1.2.2.b. Efflux du cholestérol :
L’efflux du cholestérol cellulaire, étape au cours de laquelle le cholestérol est
transféré des cellules périphériques vers des accepteurs pré-β-HDL extracellulaires,
constitue un élément clé du TIC, étant l’étape initiatrice de celui-ci (figure 17, p.49). Deux
formes d’efflux de cholestérol on été répertoriées. La première consiste en des mouvements
de cholestérol qui peuvent résulter d’une simple diffusion passive à travers la phase
aqueuse, suivie d’une incorporation dans des particules acceptrices présentes dans le milieu
extracellulaire (Rothblat et al., 1986). Ces échanges dépendent directement du gradient de
concentration en cholestérol entre la membrane plasmique et la surface des lipoprotéines
acceptrices. Il s’agit d’une diffusion physique simple et non spécifique au niveau des
micro-domaines membranaires spécialisés : les cavéoles (Alam et al., 2001). A ce niveau et
en présence d’un gradient de cholestérol favorable, le récepteur SR-BI pourrait également
faciliter l’interaction des pré-β-HDL avec la membrane plasmique (Groen et al., 2004). Ce
processus est bidirectionnel, ayant lieu suivant le gradient de cholestérol. Ce type d’efflux
- 47 -
Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
n’a que peu d’impact sur la balance du cholestérol intracellulaire et ne participe que
discrètement au TIC (Groen et al., 2004).
Un autre efflux de cholestérol, rapide, unidirectionnel et spécifique cette fois, est
observé en présence d’apoAI, A-II, A-IV, C et E (Fielding and Fielding, 2001). Il a aussi été
observé qu’un échange de phospholipides avait lieu simultanément et que la présence de
phospholipides, en particulier la lysophosphatidyl choline, semble requise pour que la réaction
d’échange ait lieu (Hara et al., 1997). Autre différence notoire entre les deux types d’efflux :
l’efflux non spécifique n’implique que le cholestérol au niveau des membranes cellulaires
alors que l’efflux spécifique met en jeu le cholestérol estérifié présent sous forme de vésicules
à l’intérieur des cellules (Zha et al., 2003). L’efflux spécifique a pour effet de lipider les apo
des classes AI, A-II, A-IV, C et E pour former des particules semblables à des HDL migrant
en position pré-β sur gel d’agarose (Asztalos et al., 1997). Ce type d’efflux nécessite
vraisemblablement une interaction spécifique avec des protéines de la membrane cellulaire,
car il est aboli suite à la modification covalente des apo ou suite à un traitement protéolytique
des membranes cellulaires (Assmann and Nofer, 2003). La nature des interactions impliquées
lors de l’efflux de cholestérol spécifique est encore mal connue, mais il est accepté que
l’interaction des apo avec les membranes cellulaires amorce une signalisation intracellulaire.
Cette signalisation induirait la translocation du cholestérol à partir d’organelles
intracellulaires telles que le réticulum endoplasmique, le réseau trans du Golgi et les
endosomes, vers la membrane plasmique. Diverses évidences laissent croire que le transport
du cholestérol à l’intérieur de la cellule se ferait sous forme de vésicules, car les conditions
reconnues comme inhibant le transport vésiculaire (absence d’ATP : adénosine triphosphate),
basses températures, présence de composant interférant avec la fonction normale du Golgi
inhibent l’efflux spécifique de cholestérol (Assmann and Nofer, 2003).
Les récepteurs membranaires impliqués dans le TIC font eux aussi l’objet de
recherches intensives. La maladie de Tangier est une maladie génétique autosomale récessive
très rare où les individus homozygotes pour l’allèle défectif montrent un déficit presque
complet en HDL et une accumulation d’esters de cholestérol à l’intérieur des cellules de
divers tissus. L’étude de cette maladie a mené à la découverte des présumés principaux
récepteurs impliqués dans le TIC (Stein and Stein., 1999). Il a été démontré que l’apoAI
synthétisée chez les homozygotes de Tangier présente une structure et un taux de synthèse
normale comparativement à des individus sains. Cependant elle n’engendre aucun efflux de
cholestérol cellulaire spécifique (Francis et al., 1995). Il a été proposé qu’un transporteur
membranaire de type ABC (ATP-binding cassette), nommé ABCA1, serait défectif chez les
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Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
individus affectés par ce type de désordre. Depuis, des études ont démontré l’importance
d’ABCA1 dans l’efflux de cholestérol impliquant l’apoAI et les particules HDL (BrooksWilson et al., 1999). Ainsi, il a été observé que l’inactivation du gène d’ABCA1 chez des
animaux hyperlipidémiques provoque une accumulation de lipides au niveau de divers tissu et
probablement au niveau des macrophages, ce qui pourrait favoriser la formation de cellules
spumeuses (Aiello et al., 2002). Des études ont toutefois démontré que l’inactivation
d’ABCA1 ne mène pas systématiquement à un développement précoce de l’athérosclérose, ce
qui témoignerait de l’existence possible de mécanismes compensatoires. Ces mécanismes, une
fois suractivés, pourraient remplacer partiellement l’efflux de cholestérol compromis chez les
individus atteints de la maladie de Tangier (Mauger, 2004).
Figure 17. Mécanismes moléculaires de l’efflux du cholestérol cellulaire
(Lagrost et al., 2003) .
Le transporteur ABCA1 facilite la translocation du cholestérol des pools intracellulaires vers
la membrane plasmique et il pourrait également permettre le transfert de phospholipides vers
les particules pré--HDL primitives, les rendant ainsi compétentes pour acquérir du
cholestérol non-estérifié. L’efflux de cholestérol se ferait par diffusion au niveau de
microdomaines membranaires spécialisés : les cavéoles. Le récepteur SR-BI pourrait
également intervenir à ce niveau en facilitant l’interaction de la particule pré--HDL avec la
membrane plasmique. CL : cholestérol libre ; PL : phospholipides.
III.1.2.2.c. Étape II : Maturation des HDL :
Le cholestérol intracellulaire en excès associé aux pré-β-HDL, via l’efflux de
cholestérol, est ensuite estérifié par l’action de l’enzyme LCAT (Ng, 2004). Cette enzyme
est synthétisée principalement par le foie et s’associe de manière réversible aux particules
HDL circulantes. L’apoAI représente son cofacteur (Lagrost et al., 2003). Le cholestérol,
auparavant hydrophile et à la périphérie de la pré-β-HDL, est maintenant estérifié et
hydrophobe. Cette perte du caractère hydrophile du cholestérol induit une migration des
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Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
molécules de cholestérol vers le centre hydrophobe de la particule. La place laissée
vacante en périphérie de la particule HDL permet l’acceptation d’autres molécules de
cholestérol non estérifié libre ou en provenance des cellules endothéliales et des
macrophages. L’enrichissement en cholestérol et en phospholipides des particules pré-βHDL petites et discoïdales donne naissance à des particules HDL matures de type α, plus
grandes et relativement sphérique (Assmann and Nofer, 2003). Au fur et à mesure que la
HDL reçoit du cholestérol, sa taille augmente, passant de la classe HDL3 à la classe HDL2
(Mauger, 2004).
III.1.2.2.d. Étape III : échange de lipides entre HDL et autres lipoprotéines :
Les HDL2 représentent la sous-classe de particules HDL contenant la majorité du
HDL-C. Sous l’action de l’enzyme CETP, les HDL2 lèguent des molécules d’esters de
cholestérol en échange de TG aux lipoprotéines riches en TG (IDL et VLDL), qui seront
ultérieurement prises en charge par les hépatocytes (Lagrost, 1997). Résultats de cet échange:
une fraction des esters de cholestérol en excès collectée par les HDL retourne au foie pour
être excrétée, après modifications enzymatiques, sous forme de sels biliaires dans l’intestin.
Parallèlement, les particules HDL subissent un enrichissement progressif en TG, devenant
ainsi un substrat plus spécifique de la LH et de façon moindre de la lipase endothéliale (LE)
(Mauger, 2004).
III.1.2.2.e. Étape IV : action de la LH et de la LE et clairance des HDL :
Les TG transférés aux HDL sous l’action de la CETP sont maintenant hydrolysés par
la LH. L’action concertée de la LH et d’une autre lipase, la LE, qui hydrolyse
préférentiellement les phospholipides des HDL, mène à une réduction de la taille et à une
augmentation conséquente de la densité des HDL. Ces particules plus petites et plus denses
forment la classe des HDL3, l’autre sous-classe majeure des HDL. Ces HDL de petites tailles
ont une affinité élevée pour SR-BI, le récepteur majeur des HDL au niveau des hépatocytes et
des cellules productrices d’hormones stéroïdiennes (Mauger, 2004). Les HDL3 interagissent
donc avec SR-BI, ce qui induit une prise en charge sélective des esters de cholestérol par les
hépatocytes et les cellules stéroïdogènes sans qu’il y ait internalisation (endocytose) des
particules HDL (Williams et al., 1999). Le processus de captation sélective des esters requiert
la liaison directe des HDL au récepteur SR-BI, par l’intermédiaire d’interactions de type
protéine-protéine, impliquant des hélices amphipathiques d’apo. Cette première étape serait
suivie de la formation d’un canal hydrophobe le long duquel les molécules d’esters de
cholestérol diffuseraient des HDL vers la membrane plasmique le long d’un gradient de
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Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
concentration (Williams et al., 1999; Lagrost et al., 2003). Ces phénomènes interviendraient
au niveau de régions spécialisées de la membrane plasmique : les cavéoles. Les molécules
d’apoAI, se retrouvant à nouveau sous forme de molécules relativement délipidées, viennent
régénérer le pool d’apoAI/pré-β-HDL. Elles peuvent ainsi à nouveau s’infiltrer dans l’espace
extra vasculaire pour induire l’efflux de cholestérol et réinitier le cycle du TIC.
Bien que le foie constitue l’organe principal permettant de diminuer de la circulation les esters
de cholestérol des HDL, le rein contribue aussi au catabolisme de ces particules: le
mécanisme mis en jeu est une endocytose récepteur-dépendante de la particule HDL toute
entière. Le récepteur de haute affinité est la cubiline, par ailleurs impliquée dans l’endocytose
de la vitamine B12. La cubiline et la mégaline sont co-exprimées, et leurs expressions
corégulées, suggérant que ces deux protéines coopèrent dans la reconnaissance et la captation
cellulaire des HDL (Moestrup et al., 2000; Lagrost et al., 2003).
L’importance du bon fonctionnement du TIC dans le retardement du développement de
l’athérosclérose a été démontrée par le biais d’études réalisées à l’aide d’animaux
transgéniques. Il a été observé que l’athérosclérose se développe de façon prématurée
lorsqu’une ou plusieurs étapes du cycle du TIC sont compromises (Mauger, 2004). À
l’inverse, il a également été démontré que la surexpression de protéines impliquées dans le
TIC engendrait une protection contre l’athérosclérose (Kalopissis and Chambaz, 2000).
III.1.2.3. HDL et TIC: modulation physiologique :
III.1.2.3.a. Influence de l’âge sur la voie du TIC :
L’incidence des MCV, due à l’athérosclérose, augmente avec l’âge (Grundy, 1995). Le
vieillissement est caractérisé par l’existence de plusieurs modifications biochimiques et
physiques qui peuvent affecter les fonctions et la structure de HDL (Berrougui et al., 2007;
Walter, 2009). Chez les sujets âgés, les niveaux de vitamine E endogène dans les particules
natives de HDL sont réduits, comparés à ceux dans les HDL isolées à partir de sujets jeunes et
d’âge moyen. Cette réduction des vitamines E contenues dans les HDL peut être responsable
de l’augmentation de la susceptibilité de ces particules à l’oxydation. L’activité anti-oxydante
des HDL diminue avec l’âge, ce qui a comme conséquence la diminution de l’effet protecteur
de la PON1 contre la péroxydation des LDL (Seres et al., 2004; Jaouad et al., 2006).
III.1.2.3.b. Influence de l’activité physique sur la voie du TIC :
L’activité physique influence favorablement un certain nombre de FRCV comme
l’obésité, l’insulino-résistance et la pression artérielle. Elle a aussi un effet bénéfique sur le
- 51 -
Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
profil lipidique. L’effet majeur de l’exercice physique est sur le nombre et leur contenu.
L’exercice, qui induit des changements des concentrations de HDL-C, est le résultat de
l’interaction entre l’intensité, la fréquence, la durée et la longueur de l’exercice et peut être
aussi dépendant du sexe. Les athlètes ont une augmentation de la concentration de HDL-C et
d’apoAI, une augmentation de l’activité de la LCAT et des niveaux de pré-HDL, comparés
aux contrôles sédentaires (Olchawa et al., 2004). En outre, l’efflux de cholestérol des
macrophages vers le plasma est augmenté chez les athlètes résultant de l’augmentation du
nombre de particules de HDL (Catalano and Guerin, 2010).
III.1.2.3.c. Influence du régime alimentaire sur la voie du TIC :
Le rôle protecteur de la consommation des acides gras moninsaturés ou des acides gras
polyinsaturés (PUFA) contre l’athérosclérose a été connu depuis plusieurs années (Psota et
al., 2006). En effet, des études épidémiologiques ont montrées que le régime méditerranéen,
dans lequel l’huile d’olive (riche en acide oléique) prédomine, est associé à une réduction des
pathologies cardiovasculaires. Le n-6 PUFA (acide arachidonique et linoléique) diminue la
concentration de LDL-C alors que l’acide gras saturé l’augmente. En plus, le n-3 PUFA
(acide linoléique α) réduit la triglycéridémie et a des propriétés anti-thrombotique et antiathérogène. En 2006, une étude faite sur des sujets sains a montré que la consommation de
PUFA favorise les propriétés anti-inflammatoires des particules de HDL, alors que la
consommation de l’acide gras saturé réduit leur activité anti-inflammatoire et dégrade la
fonction endothéliale (Nicholls et al., 2006). Ces études suggèrent que la fonctionnalité des
particules HDL, chez les patients présentant un risque cardiovasculaire élevé, peut être
modulée par la consommation des acides gras.
III.1.2.3.d. Influence du tabac sur la voie du TIC :
Le tabac est associé à des changements des taux plasmatiques des lipoprotéines avec
une relation réponse dose entre le nombre de cigarettes fumées par jour et l’extension des
anomalies lipidiques. Cependant, très peu d’études ont été faites concernant les mécanismes
moléculaires à travers lesquels le tabac peut accélérer l’athérosclérose. Le tabac peut accélérer
l’athérosclérose en favorisant les modifications des lipoprotéines et ainsi influencer la
fonctionnalité des HDL. Les fumeurs de cigarette présentent une réduction de la concentration
plasmatique de HDL-C et de l’activité de la LCAT, comparés aux non fumeurs. L’exposition
à la fumée de cigarette provoque une mauvaise inhibition de l’activité de la LCAT, des
changements de la taille des particules de HDL et la dissociation de la CETP des particules
(Bielicki et al., 1995). Les HDL qui sont exposées à tous les extraits de la fumée de cigarette
- 52 -
Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
ont montré une augmentation remarquable des taux de diènes conjugués comme dans les HDL
oxydées qui sont inversement corrélées avec la capacité de l’efflux de cholestérol. Les extraits
de la fumée de cigarette contiennent des variétés de radicaux libres et d’oxygène actif qui
peuvent être impliquées dans la péroxydation des acides gras des HDL (Ueyama et al., 1998).
L’acroléine est un composant majeur de la fumée de cigarette et un des aldéhydes qui peut
modifier la charge et la structure des HDL. Il a été démontré que cet aldéhyde toxique est
capable de modifier l’apoAI par une modification du site spécifique de lys-226 au niveau de
HDL et capable de diminuer l’efflux de cholestérol médié par ABCA1 (Shao et al., 2005b).
III.1.3. HDL et préservation de la fonction endothéliale :
L’endothélium vasculaire est une structure simple, mais hautement fonctionnelle,
constituée d’une monocouche de cellules qui se retrouve à l’interface de la circulation
sanguine et de la paroi vasculaire. L’endothélium est impliqué dans plusieurs processus
biologiques régulés tels que l’inflammation, la pression sanguine, l’angiogénèse, l’adhésion
des cellules de l’inflammation, l’apoptose et la prolifération cellulaire ainsi que le
métabolisme des lipoprotéines. La détérioration de l’endothélium joue un rôle prédominant
à chacune des étapes du développement de l’athérosclérose (O'Connell and Genest, 2001).
Initialement, la dysfonction endothéliale survient lorsqu’une ou plusieurs fonctions de
l’endothélium sont altérées. Elle est principalement caractérisée par une diminution de la
biodisponibilité du NO et une affinité accrue pour les leucocytes (Drexler, 1997). À un stade
plus avancé de l’athérosclérose, l’apoptose des cellules de l’endothélium mène à une
dénudation de la paroi vasculaire ce qui, en plus de former des sites privilégiés pour la
formation de thrombose, libère des radicaux et des cytokines venant aggraver le processus
inflammatoire en cours, au niveau de la paroi artérielle. De nombreuses études ont démontré
l’effet bénéfique des HDL sur l’endothélium vasculaire (O'Connell and Genest, 2001).
III .1.3.1. Effets sur la biodisponibilite de NO :
Concernant la biodisponibilité du NO, les HDL ont des effets bénéfiques à différents
niveaux (Radojkovic Navarro, 2010). Le NO est un puissant vasodilatateur synthétisé par
l’oxyde nitrique synthase (NOS) (eNOS pour l’isoforme endothélial) dont la demi-vie est
courte (moins de 6 secondes) (Gryglewski et al., 1988). Les LDLox induisent une
délocalisation de l’eNOS vers des compartiments intracellulaires via le récepteur scavenger
CD36 et la déplétion en cholestérol des cavéoles. Les HDL, en apportant du cholestérol aux
cavéoles et non pas en empêchant leur efflux vers les LDLox, préviennent la délocalisation de
- 53 -
Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
l’eNOS et restituent la fonction endothéliale (Uittenbogaard et al., 2000; Yuhanna et al.,
2001). De plus, grâce à son haut contenu en antioxydants, les HDL inhibent la formation des
espèces réactives de l’oxygène (ERO) associés aux LDLox et au stress oxydatif (SO) (Lee et
al., 2005), augmentant la demi-vie du NO. En outre, les HDL augmentent l’activité (Mineo et
al., 2003; Drew et al., 2004) et la demi-vie de l’eNOS (Ramet et al., 2003) à travers
l’activation de la protéine kinase B (Akt) et des protéines kinases activées par des mitogènes
(Mitogen-Activated Protein Kinase : MAPK) en aval de SR-BI (Mineo et al., 2003). De façon
complémentaire, les lipides contenus dans les HDL, principalement la sphingosylphosphorylcholine (SPC), la sphingosine-1-phosphate (S1P) et le lysosulfatide (LSF),
augmentent l’activité de l’eNOS par la phosphorylation d’Akt via le récepteur S1P3 (Kwon et
al., 2001; Nofer et al., 2004). Ainsi, les HDL augmentent la biodisponibilité du NO par des
effets sur l’eNOS (localisation sur la membrane cellulaire, prolongement de sa demi-vie,
stimulation de son activité) et sur le NO libéré (inhibition des ERO).
III.1.3.2. Effets sur le contrôle de la thrombose :
Les HDL inhibent la coagulation et la formation du thrombus par des voies distinctes
(Radojkovic Navarro, 2010). Concernant l’adhésion et l’activation plaquettaires, les HDL
préservent l’intégrité de l’endothélium et ainsi le confinement de la matrice extracellulaire et
du facteur tissulaire (TF) dans l’espace sous-endothélial. Ceci est possible grâce à la synthèse
de NO (Gryglewski et al., 1988) et de la prostacycline (PGI2) (Toborek and Kaiser, 1999;
Fetalvero et al., 2007) induite par les HDL. Comme il a été décrit ci-dessus, les HDL
augmentent la biodisponibilité du NO par différents mécanismes concernant tant l’eNOS que
le NO. Pour la PGI2, les HDL induisent sa synthèse par au moins deux mécanismes:
l’activation de la phospholipase A2 (PLA2) sensible au calcium et l’expression de l’enzyme
cyclooxygénase 2 (COX-2) (O'Connell and Genest, 2001).
Le TF est un déterminant clé de l’adhésion plaquettaire et est exprimé par les cellules
endothéliales suite à la stimulation par la thrombine. Les HDL inhibent l’expression du TF à
travers le blocage de Rho A (ras homolog gene family, member A) en aval de l’activation de
la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), par un mécanisme indépendant de la voie Akt / NO
(Viswambharan et al., 2004). De plus, en réponse à la thrombine, différents types cellulaires
synthétisent le facteur activateur des plaquettes (PAF) dans les étapes précoces de
l’inflammation. Les HDL inhibent la synthèse endothéliale de PAF à travers l’inhibition de
l’activité
de
l’acétyl-CoA:lyso-PAF
acétyltransférase
majoritairement de leurs apo (Sugatani et al., 1996).
- 54 -
par
une
voie
dépendante
Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
Les cascades de coagulation aboutissant à la formation du thrombus sont aussi régulées par
les HDL à travers l’induction de la synthèse de la thrombomoduline, une protéine à activité
anti-coagulante très puissante. En outre, les HDL fournissent les cellules en glucosylcéramide
et en glycosphingolipides, des cofacteurs pour l’activité des protéines C et S qui participent
aux processus anti-coagulant et fibrinolytique (Mineo et al., 2006). Parmi les lipides associés
aux HDL, la sphingosine s’associe au facteur Xa de la cascade de coagulation, inhibant la
formation de la thombinase par la rupture de l’association entre les facteurs Va et Xa et en
bloquant l’activation du facteur X par le TF (Deguchi et al., 2004). Ainsi, les HDL inhibent
l’activation de la cascade de coagulation par l’inhibition directe du facteur Xa et par la
diminution de la formation de la thrombine.
Concernant la fibrinolyse, les HDL bloquent la surexpression de PAI-I et l’inhibition de
l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), induites par les LDLox (Ren and Shen, 2000),
favorisant la dissolution du thrombus.
III .1.3.3. Effets sur le contrôle de l’inflammation :
Les HDL inhibent l’expression endothéliale d’E-sélectine, des molécules d’adhésion
ICAM-1 et VCAM-1 par l’inhibition de la translocation du facteur de transcription NF-κB
(facteur nucléaire κB) en aval de la voie PI3K/Akt/NO (Kimura et al., 2006; Schmidt et al.,
2006). Les récepteurs de surface activés par les HDL et responsables de cet effet sont les
S1P1, S1P3 et SR-BI, mettant en évidence la participation des composants lipidiques et
protéiques (apoAI) des HDL dans leurs effets anti-inflammatoires (Kimura et al., 2006). En
conséquence, les HDL inhibent l’adhésion leucocytaire à l’endothélium et leur extravasation,
diminuant la réponse inflammatoire chronique.
Un effet indirect des HDL dans le contrôle de l’inflammation est la synthèse de TGF-β2
(transforming growth factor beta). Ce facteur de croissance libéré par les cellules
endothéliales induit des effets anti-inflammatoires par la modulation de l’expression de
molécules telles que l’IL-6, la MCP-1 et le facteur stimulateur de colonies de granulocytes
(G-CSF) (Norata et al., 2005).
III.1.3.4. Effets sur l’apoptose, la prolifération et la migration cellulaires :
L’apoptose est le mécanisme physiologique de mort cellulaire génétiquement
programmée. Ce processus est nécessaire pour la survie des organismes multicellulaires et est
en équilibre constant avec la prolifération. A la différence de la nécrose, l’apoptose ne
provoque pas d’inflammation grâce à la conservation de l’intégrité de la membrane cellulaire
- 55 -
Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
et aux signaux déclenchés pour l’élimination des cellules apoptotiques par phagocytose.
L’apoptose participe à différents processus normaux, comme la morphogenèse embryonnaire
et le développement tissulaire, la maturation du système immunitaire, le contrôle de la
réponse immune et l’élimination de cellules non-viables (infectées, stressées ou modifiées).
L’apoptose peut être déclenchée par deux voies indépendantes et complémentaires: la voie
extrinsèque impliquant des récepteurs appartenant à la superfamille des récepteurs au TNF, et
la voie intrinsèque mettant en jeu la mitochondrie et la libération du cytochrome c dans le
cytoplasme (Radojkovic Navarro, 2010). Ces deux voies aboutissent à l’activation de
protéases à cystéine (Cys) appelées caspases (Green, 1998), lesquelles sont responsables des
phénomènes morphologiques et biochimiques observés lors de l’apoptose.
Les cellules et les corps apoptotiques sont éliminés par les phagocytes adjacents, soit
professionnels, notamment les macrophages, soit non professionnels ou facultatifs, comme les
cellules endothéliales. Lors de l’apoptose, la phosphatidylsérine (PS) est transloquée du
feuillet interne vers l’externe de la membrane plasmique, ce qui constitue un signal de
reconnaissance et d’élimination pour les phagocytes. La translocation de PS est un marqueur
apoptotique précoce qui suit la libération du cytochrome c dans le cytoplasme et précède les
changements morphologiques caractéristiques des cellules apoptotiques (Martin et al., 1995).
En parallèle, les cellules apoptotiques produisent des ERO qui peroxydent les lipides de la
membrane cellulaire, présentant des motifs analogues à ceux des LDLox, qui servent
également comme ligands aux récepteurs scavenger (CD36, SR-BI…) des phagocytes (Chang
et al., 1999).
Différents signaux peuvent stresser les cellules endothéliales et conduire à leur apoptose.
Parmi eux, les plus importants sont les médiateurs inflammatoires (TNF-α et INF-γ), les
LDLox (production des ERO et élévation des concentrations intracellulaires de calcium),
l’absence de signaux anti-apoptotiques dérivés des interactions cellule-cellule et cellulematrice cellulaire, les dommages subis par l’acide désoxyribonucléique (ADN) (UV, rayons
X), certaines hormones (glucocorticoïdes), le stress du réticulum endoplasmique, et la
dégradation des télomères au cours du processus de vieillissement (Mallat and Tedgui, 2000;
Zhang et al., 2009).
La dérégulation de l’équilibre apoptose/prolifération peut induire des conditions
pathologiques, telles que le cancer, certaines maladies neuro-dégénératives, l’hypotrophie
tissulaire, et la MCV. En effet, l’équilibre apoptose/prolifération des cellules endothéliales
joue un rôle central dans l’initiation et le développement de la dysfonction endothéliale,
participant à toutes les étapes de la lésion athéromateuse. L’apoptose des CML vasculaires est
- 56 -
Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
un facteur clé dans les états avancés de la lésion, induisant la formation du noyau nécrotique
et les complications dérivées de la rupture de la chape fibreuse.
Les HDL protègent les cellules endothéliales de l’apoptose. Plusieurs facteurs proathérogéniques sont également des inducteurs de l’apoptose (LDLox, TNF-α, homocystéine et
angiotensine II) (Mineo et al., 2006; Zhang et al., 2009). Les HDL et l’apoAI inhibent
l’apoptose induite par les LDLox en augmentant la synthèse protéique et en inhibant
l’augmentation soutenue de calcium intracellulaire (Suc et al., 1997). Aussi, l’apoptose
déclenchée par le TNF-α est inhibée par les HDL et des liposomes contenant de l’apoAI par
un mécanisme dépendant de l’inactivation de la caspase-3 (Sugano et al., 2000). D’autres
études ont mis en évidence la participation des composants lipidiques des HDL dans leurs
effets anti-apoptotiques. Par exemple, Nofer et al. ont observé que la protéine Akt, un
médiateur antiapoptotique, est activée par la présence des HDL (Nofer, et al., 2001). Il a été
aussi démontré que la SPC et la LSF inhibent l’apoptose des cellules endothéliales induite par
la déplétion en facteurs de croissance (Nofer, et al., 2001). Conjointement, la S1P protège les
cellules endothéliales de l’apoptose par l’activation de MAPK (Kimura et al., 2001) et
l’augmentation de l’activité de l’eNOS via le récepteur S1P1 (Kwon et al., 2001).
Les HDL induisent la prolifération et la migration des cellules endothéliales (Tauber et al.,
1980 ; Darbon et al., 1986). La prolifération cellulaire est dépendante des composants
protéiques des HDL par l’activation de la PKC et la phosphorylation de molécules de
signalisation intracellulaire (Darbon et al., 1986). Les HDL par l’interaction apoAI/SR-BI
induisent la migration cellulaire et la re-endothélisation (Seetharam et al., 2006). De plus, les
HDL augmentent la quantité des précurseurs de cellules endothéliales (EPCs) et leur
différenciation en cellules endothéliales matures (Pu and Liu, 2008). L’ensemble des effets
induits par les HDL (inhibition de l’apoptose, induction de la prolifération, de la migration et
de la survie des EPCs) favorise la re-endothélisation vasculaire et l’intégrité de l’endothélium.
En conclusion, les HDL empêchent la mort cellulaire et favorisent les mécanismes de
réparation conduisant à l’intégrité de l’endothélium et de la paroi vasculaire.
III.1.4. Propriétés antioxydantes des HDL :
L’oxydation des LDL est un événement majeur dans l’initiation du développement de
la plaque athéromateuse. Les LDL s’oxydent principalement par interaction de leurs
constituants lipidiques (phospholipides et cholestérol estérifié) avec les radicaux réactifs
d’oxygènes (O2- et OH-) présents en petite quantité dans la circulation sanguine. Une fois
attaqués
par
ces
radicaux,
les
hydroperoxydes
- 57 -
lipidiques
formés
(acide
Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
hydroperoxyoctadecadiénoïque et hydroperoxyeicosatetraènoïque) catalysent la formation
non enzymatique d’autres phospholipides oxydés dont le 1-palmytoyl-2-glutaroyl-sn-glycéro3-phosphorycholine aux pouvoirs pro-athérogéniques supérieurs à ceux ayant induit leur
formation (Navab et al., 2001). À noter que les hydroperoxydes lipidiques précurseurs
peuvent également être générés par l’action de l’enzyme 12/15-lipoxygénase (Zhu et al.,
2003). Une fois le LDL suffisamment oxydé, celui-ci devient toxique pour les cellules
endothéliales en plus d’être un chémoattractant pour les monocytes et d’induire la sécrétion de
différentes cytokines (Navab et al., 2000a; b). Il a été démontré que certaines composantes des
HDL de même que des enzymes qui leur sont reliées ont un fort pouvoir antioxydant pouvant
prévenir chacune des étapes de la formation des LDLox. Par exemple, les molécules
lipophiles anti-oxydantes du HDL telles que le α-tocophérol et les deux résidus méthionine
sulfoxides de l’apoAI peuvent séquestrer les radicaux d’oxygène réactifs avant que ceux-ci
n’interagissent avec les phospholipides des particules LDL et prévenir ainsi leur oxydation
(Navab et al., 2000a; b). L’apoAI et l’apoJ (clusterine) semblent aussi être en mesure de
prendre en charge les phospholipides « catalyseurs » oxydés des LDL et de les dégrader par
un processus enzymatique impliquant potentiellement l’acétylhydrolase du PAF, la
peroxidase du glutathion, mais surtout par la PON (Assmann and Nofer, 2003). Cette dernière
serait l’enzyme responsable de la plus grande partie du pouvoir antioxydant des HDL
(Durrington et al., 2001) et c’est pour cette raison qu’elle a fait objet d’étude dans ce présent
travail de thèse. Des études réalisées sur des modèles de souris susceptibles de développer
l’athérosclérose ont à cet effet démontré que l’activité de la PON des HDL diminue en phase
aiguë de l’athérosclérose. Il a également été observé que les HDL résultants montrent des
propriétés pro-inflammatoires et une activité anti-oxydante diminuée (Navab et al., 1997). Les
HDL pourraient donc être perçues comme des particules caméléons dotées d’un potentiel
athéro-protecteur en phase basale, mais pouvant devenir potentiellement pro-athérogènes en
phase aiguë de l’athérosclérose (Navab et al., 1996; Mauger, 2004).
La liste des mécanismes et propriétés athéroprotectrices associés aux HDL est en
constante évolution, certains de ces mécanismes ayant été démontrés in vitro, d’autres in vivo.
On peut, cependant, affirmer que la présente liste des mécanismes athéroprotecteurs des HDL
rassemble plusieurs arguments appuyant la forte relation inverse entre le développement de la
MCV et les concentrations plasmatiques de HDL.
- 58 -
Chapitre III: Propriétés athéroprotectrices des HDL
Plusieurs études ont étudié la régulation génétique des HDL (Zannis et al., 2006;
Krimbou et al., 2008; Boes et al., 2009). Malgré les nombreux gènes candidats qui contribuent
aux basses concentrations du HDL-C, leurs impact sur les MCV est hétérogène, reflétant de
diverses interactions gène-gène et relations gène-environnement. Le chapitre suivant dresse
les gènes candidats, associés au métabolisme des HDL, aux quels nous nous sommes
intéressés dans notre manuscrit afin de les mettre en évidence dans la partie pratique de ce
travail pour étudier leurs associations avec l’athérosclérose.
- 59 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ABCA1
IV.1. Transporteur Adénosine triphosphate Binding Cassette A1
(ABCA1)
IV.1.1. Historique :
Le transporteur ABCA1, encore appelé protéine régulatrice de l’efflux de cholestérol,
joue un rôle clé dans le métabolisme des HDL (Cavelier et al., 2006). C’est un transporteur
membranaire appartenant à la famille des protéines ABC. Chez l’homme, 48 membres de la
famille des transporteurs ABC ont été identifiés et classés en sept sous familles, désignées
d’ABC-A à ABC-G (Dean et al., 2001; Voloshyna and Reiss, 2011).
L'ABCAl a été identifié par clonage moléculaire en 1994 par le groupe de Chimini (Luciani et
al., 1994). Toutefois, ce n'est que cinq ans plus tard que son rôle fût démontré (Brooks-Wilson
et al., 1999; Bodzioch et al., 1999). La présence de mutations dans le gène d’ABCA1 humain
serait à l'origine de la maladie de Tangier qui se caractérise par un déficit en HDL et par une
incapacité à excréter le cholestérol hors des cellules (Bodzioch et al., 1999; Kaminski, et al.,
2006). Par conséquent, la découverte et l'étude de la maladie de Tangier ont permis
d'identifier le rôle physiologique exercé par la protéine ABCAl au sein de l'organisme.
ABCA1 joue un rôle clé dans l’homéostasie du cholestérol cellulaire.
IV.1.2. Structure génique et protéique d’ABCA1:
Le gène d’ABCA1 est situé sur le chromosome 9q31. Il est de 149 Kb et comprend 50
exons (Santamarina-Fojo et al., 2000). Il code pour un polypeptide de 2261 acides aminés et
de poids moléculaire de 254 kDa (Langmann et al., 1999; Pullinger et al., 2000).
La protéine ABCA1, fortement glycosylée (Tanaka et al., 2001), est composée de 2 parties de
structures similaires (Fitzgerald et al., 2001). Chaque partie comporte un domaine
transmembranaire contenant 6 hélices et un domaine de fixation des nucléotides (Nucleotide
Binding Domain : NBD). Ce dernier est composé de deux motifs (Walker A et Walker B).
Leur rôle est d’assurer la fixation et l’hydrolyse de l’ATP, fournissant ainsi l’énergie
nécessaire au domaine transmembranaire pour le transport du substrat. Les motifs Walker A
et B encadrent une région signature (Walker C), spécifique des transporteurs ABC et dont le
rôle n’est pas encore bien déterminé (Dean et al., 2001) (figure18, p.61).
Le transporteur ABCA1 est une protéine ubiquitaire. Outre sa présence dans les
macrophages, elle est exprimée en grande quantité dans le placenta, le foie, les poumons, les
glandes surrénales ainsi que dans les tissus fœtaux. Les tissus dans lesquels l’expression est la
- 60 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ABCA1
plus faible sont les reins, le pancréas, l’hypophyse et la moelle épinière (Langmann et al.,
1999).
Extracellulaire
Cytoplasmique
Figure 18. Structure de la protéine ABCA1 (Oram and Heinecke, 2005).
ABCA1 est formée de 2 domaines transmembranaires contenant 6 hélices traversant la membrane et
formant le pore par lequel transite le substrat spécifique à la protéine. NBD-1 et NBD-2 sont 2
domaines de fixation des nucléotides qui contiennent 2 domaines conservés Walker A et Walker B une
région signature (Walker C). Y indique approximativement les sites de glycosylation et S-S indique
un pont disulfure.
IV.1.3. Expression et régulation :
Le séquençage du gène, situé sur le chromosome 9q31, a mis à jour de nombreux
éléments spécifiques de régulation sur le promoteur du gène ABCA1. On y retrouve
notamment des sites de régulation tissu spécifiques tels que les facteurs de transcription Sp1
et Sp3, l’upstream stimulatory factor USF1/2 et le facteur nucléaire hépatocytaire HNF1 (Santamarina-Fojo et al., 2000; Langmann et al., 2002). Bien que l’on ne sache pas
vraiment à quel niveau il agit, l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) est un acteur très
présent dans l’activation du gène et de l’efflux de cholestérol vers l’apoAI (Lawn et al., 1999;
Bortnick et al., 2000; Santamarina-Fojo et al., 2000). Plusieurs travaux ont montré que
l’expression et l’activité d’ABCA1 sont sensibles aux variations intracellulaires des stérols
(Lawn et al., 1999; Santamarina-Fojo et al., 2000) par l’intermédiaire des récepteurs
nucléaires liver X receptor (LXR) / retinoid X receptor (RXR) qui trouvent un site DR4, site
de fixation de l’hétérodimer LXR/RXR, sur le promoteur du gène (Schwartz et al., 2000).
Lorsque ces récepteurs sont activés par le LDL (Liao et al., 2002) ou par leurs ligands, tel que
- 61 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ABCA1
le 27 hydroxy-cholestérol (Repa et al., 2000), la transcription du gène est accrue. Dans les
macrophages humains, les agonistes des PPARs (peroxisome proliferator-actived receptors) 
et  augmentent l’expression du gène et l’efflux de cholestérol en passant probablement par
l’intermédiare des LXR (Chinetti et al., 2001). Le PPAR influence également la transcription
du gène et l’efflux du cholestérol dans le même sens et peut-être de manière plus prononcée
que les PPAR et , et ce, sans faire intervenir le LXR. Ce dernier résultat a été observé
uniquement chez des singes rhésus obèses et insulino-résistants (Oliver et al., 2001).
D’autres facteurs jouent un rôle répresseur sur ABCA1. Le promoteur du gène possède
un site de fixation de la protéine « en doigts de zinc » 202 (ZNF202) qui inhibe son
expression (Porsch-Özcürümez et al., 2001). L’interféron , facteur d’inactivation des
macrophages, diminue l’efflux de cholestérol vers le HDL, via l’apoAI, en réprimant
l’expression du gène ABCA1 (Panousis and Zuckerman, 2000). Le même résultat est obtenu
chez des souris rendues diabétiques par la présence d’acides gras polyinsaturés et de corps
cétoniques, particulièrement l’acéto-acétate (Uehara et al., 2002). Les acides gras
polyinsaturés régulent aussi l’ABCA1 au niveau post-transcriptionnel en augmentant le
« turnover » déjà rapide de la protéine dans les macrophages et peuvent ainsi en diminuer
l’expression à la surface cellulaire (Tall et al., 2002).
L’AMPc est un acteur très présent dans l’activation du gène et de l’efflux de cholestérol vers
l’apoAI. Il stimule la transcription de l’ABCA1 dans les macrophages (Bortnick et al., 2000).
En présence d’AMPc, la phosphorylation par la protéine kinase A (PKA) des résidus dans le
domaine régulateur de la protéine ABCA1 régule l’activité du transporteur. C’est au niveau de
deux sérines situées dans les NBD d’ABCA1 que se réalise la phosphorylation par la PKA.
Une séquence riche en proline, acide glutamique, sérine et thréonine (PEST) a été identifiée
dans la structure primaire de la protéine. Cette séquence entraîne la dégradation d’ABCA1 par
une calpaïne protéase, permettant ainsi le contrôle de la quantité et de l’activité du
transporteur. Toutefois, si l’ABCA1 est lié à de l’apoAI, la protéase ne trouve plus son site de
fixation et l’efflux de cholestérol est activé (Wang et al., 2003).
Les métabolites associés à certaines pathologies, tels que l'inflammation et le diabète,
peuvent déstabiliser l’ABCA1 dans les macrophages cultivés. Les AGL, qui sont élevés dans
le diabète et le SM, déstabilisent directement l’ABCA1 par une voie de signalisation
impliquant l'activation de la phospholipase D2 et la phosphorylation des sérines de l’ABCA1
(Wang et al., 2004; Wang and Oram, 2007).
- 62 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ABCA1
IV.1.4. Rôle physiopathologique d’ABCA1:
Ce transporteur intervient dans différents processus. En effet, l’ABCA1 est impliquée
dans la phagocytose des cellules apoptotiques par les macrophages durant le développement
embryonnaire. Cette protéine est aussi capable de transporter des anions (Becq et al., 1997).
Elle est aussi impliquée dans le transport de la phosphatidylsérine du feuillet interne de la
membrane plasmique vers le feuillet externe. Cette fonction pourrait influencer le
microenvironnement lipidique de la surface cellulaire et pourrait alors faciliter la fixation de
l’apoAI (Zha et al., 2001). Le transporteur ABCA1 permet aussi l’efflux du cholestérol et des
phospholipides du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire (Cavelier et al., 2006;
Jessup et al., 2006). Ce rôle, lié à sa présence dans les macrophages, présente un intérêt
particulier dans la protection cardiovasculaire. En effet, élément clé du TIC, la protéine
permet ainsi de limiter la formation de cellules spumeuses et, par conséquent, la formation de
plaques d’athérome.
Beaucoup d’apo servent d’intermédiaire dans le transport du cholestérol et du
phospholipide dirigé par l’ABCA1, mais l’apoAI est la plus impliquée dans ce type de
transport. Les autre apo échangeables (AII, AIV, CI, CII et E) y participent à un degré
moindre (Remaley et al., 2001). Les mécanismes par lesquels ABCA1 favorise l’efflux des
lipides ne sont pas complètement compris. En effet, trois modèles pour décrire l’interaction
entre les apo et ABCA1 ont été proposés (figure 19, p.64) (Yancey et al., 2003). Certains
rapportent que la protéine ABCA1 a un rôle de récepteur à l'apoAI, c'est-à-dire que l'apoAI se
lierait spécifiquement à la protéine ABCA1 à la surface cellulaire (Oram et al., 2000; Wang et
al., 2000) (figure 19A, p.64). D'autres suggèrent que c'est le résultat d'une interaction
lipidique à proximité de la protéine ABCAl, c'est-à-dire que la présence de la protéine
ABCA1 à la surface membranaire génère une modification de l'environnement lipidique
permettant à l'apoAI de soutirer les phospholipides et par la suite de générer l'efflux du
cholestérol (Chambenoit et al., 2001) (figure 19B, p.64). Panagotopulos et al ont rapporté un
modèle hybride dans lequel l’hélice 10 de l’apoAI attache l’apo à un domaine lipidique
spécialisé associé avec l’ABCA1. L’apoAI diffuse ensuite latéralement le long de la bicouche
lipidique et se lie à l’ABCA1, entrainant un efflux de lipides (Panagotopulos et al., 2002)
(figure 19C, p.64) .
- 63 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ABCA1
A : Interaction directe entre
apolipoprotéine et ABCA1
B : Interaction de l’apolipoprotéine
avec le domaine lipidique
C : Interaction de l’apolipoprotéine
avec le domaine lipidique et ABCA1
Phospholipide
Apolipoprotéine
Cholestérol
Figure 19. Les trois modèles d’interaction entre l’ABCA1 et l’apoAI.
(Yancey et al., 2003).
A : l’apoAI se lie directement à l’ABCA1 et acquiert les phospholipides et le cholestérol pour former
les HDL naissantes. B : l’apoAI interagit avec des domaines lipidiques spécialisés associés à
l’ABCA1 et s’enrichit par conséquent en lipides. C : l’hélice 10 de l’apoAI attache l’apolipoprotéine à
un domaine lipidique spécialisé associé avec l’ABCA1. L’apoAI diffuse latéralement le long de la
bicouche lipidique et se lie à l’ABCA1, entrainant une production de HDL naissantes.
Plusieurs modèles de l’efflux de phospholipides et de cholestérol aux apo via ABCA1
ont été proposés, y compris le modèle de l’efflux moléculaire (modèle "en deux étapes"ou"
séquentiel"), dans lequel l’ABCA1 favorise tout d'abord la lipidation des apo avec du
phospholipide, produisant les particules préβ. Ces particules seraient alors capables en second
lieu d'acquérir le cholestérol à partir d'autres domaines de membrane (Yancey et al., 1995;
Fielding et al., 2000) (figure 20A, p.66) et le modèle de solubilisation membranaire (modèle
"en une étape"), (Gillotte et al., 1998; 1999) dans lequel le phospholipide et le cholestérol sont
mobilisés simultanément en tant qu'unités discrètes, petites (microsolubilisation) ou grandes
(macrosolubilisation) (figure 20B, p.66). Ce mécanisme simultané affirme que le
phospholipide et le cholestérol sont libérés ensemble (Gillotte et al., 1999; Rothblat et al.,
- 64 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ABCA1
2002). Ainsi, la solubilisation des unités de membrane est liée à la vésiculation de la
membrane induite par apoAI /ABCA1, ayant pour résultat le dégagement simultané de
phospholipide et du cholestérol. Un autre modèle de l’efflux simultané est la rétroendocytose
qui suggère qu'ABCA1 facilite la lipidation intracellulaire des apo et la resécrétion des
particules de HDL naissantes (Takahashi et al., 1999; Neufeld et al., 2001; Azuma et al.,
2009). Ces modèles demeurent un sujet de plusieurs études.
B : solubilisation membranaire
A : Efflux moléculaire
Extracellulaire
Intracellulaire
Figure 20. Modèles de l’efflux de phospholipides et de cholestérol aux apolipoprotéines
via ABCA1. (Yancey et al., 2003).
A : efflux moléculaire : l’apolipoprotéine acquiert en premier lieu les molécules de phospholipides.
Devenue riche en phospholipides, elle peut par la suite acquérir des molécules de cholestérol.
B : solubilisation membranaire : l’apolipoprotéine acquiert simultanément les molécules de
phospholipides et de cholestérol sous forme de petites (microsolubilisation) ou grandes
(macrosolubilisation) unités de la membrane plasmatique.
IV.1.5. ABCA1 comme une cible thérapeutique :
Il a été rapporté que l’activité élevée d’ABCA1 protège significativement contre
l’athérosclérose. En effet, une activité accrue d’ABCA1 dans les macrophages artériels peut
empêcher la formation des cellules spumeuses et l’élévation de cette activité au niveau
hépatique peut augmenter la concentration des HDL et améliorerait ainsi les diverses
fonctions athéroprotectrices de cette lipoprotéine (Singaraja et al., 2002). L’effet protecteur de
l’activité d’ABCA1 a fait de ce transporteur une nouvelle cible thérapeutique importante pour
- 65 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ABCA1
traiter les MCV et de multiples programmes ont été introduits par l'industrie pharmaceutique
pour développer des agonistes de cette voie (Oram, 2002; Oram and Heinecke, 2005).
Arakawa et al. (2009) ont suggéré que l’inhibition de la dégradation protéolytique d’ABCA1
médiée par la calpaïne peut être un traitement antiathérogène potentiel qui peut augmenter la
concentration des HDL et prévenir l’athérosclérose.
IV.1.6. Mutations et polymorphismes:
Plus de 70 mutations ont été identifiées au niveau du gène d’ABCA1 chez des sujets
avec de basses concentrations de HDL-C. Ces mutations ont tendance à se regrouper dans la
boucle extracellulaire, le domaine NBD et la région C-terminale. En 1999, il a été montré que
des mutations du gène d’ABCA1 étaient impliquées dans la maladie de Tangier (Rust et al.,
1999; Brousseau et al., 2000; Slatter et al., 2006). Cette pathologie connue depuis les années
60, est caractérisée par la taille importante des amygdales et leur coloration orangée due à
l’accumulation de composés lipophiles, tels que la vitamine E et les caroténoïdes. Elle est
également caractérisée par des manifestations neuropathiques, une hépatomégalie, une
splénomégalie et une hypocholestérolémie. Il s’agit d’une maladie autosomique récessive
rare. Les patients homozygotes présentent une absence quasi-totale de HDL et d’apoAI au
niveau plasmatique et une accumulation des esters de cholestérol au niveau des amygdales, du
foie, de la rate, du thymus et de la muqueuse intestinale (Fredrickson et al., 1961 ; Oram,
2000). Plusieurs études ont aussi retrouvé des mutations de ce gène dans les déficiences
familiales en HDL, pathologie caractérisée par des concentrations très basses de HDL et
apoAI (Pisciotta et al., 2004; 2009) .
Environ 20 polymorphismes communs (fréquence allélique >1%) ont été identifiés sur
les régions codantes, promotrice et 5’UTR d’ABCA1 et plusieurs polymorphismes parmi eux
sont associés soit à une basse soit à une forte concentration de HDL (Singaraja et al., 2003;
Cohen et al., 2004; Frikke-Schmidt et al., 2004; Brunham et al., 2006).
Nous nous sommes intéressés, dans cette thèse, à la mise en évidence de quatre
polymorphismes du gène d’ABCA1 et à l’étude de leur association avec le profil lipidique et
la sténose coronaire chez notre population de coronariens. Il s’agit des polymorphismes
suivant :
IV.1.6.1. R219K (G1051A):
C’est un changement de l’arginine (R) en lysine (K) sur l’acide aminé 219 sur l’exon 7
[rs2230806]. L’association du polymorphisme R219K avec les variations de HDL-C et les
MCV est controversée. En effet, certaines études ont rapporté qu’il est associé à une
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ABCA1
augmentation de la concentration de HDL-C (Mantaring et al., 2007; Benton et al., 2007; Ma
et al., 2011), alors que d’autres n’ont trouvé aucune association (Frikke-Schmidt et al., 2004;
2008; Sandhofer et al., 2008). Plusieurs études et méta-analyses ont aussi rapporté que ce
polymorphisme est un facteur protecteur contre les MCV (Sandhofer et al., 2008; Ma et al.,
2011; Jiang et al., 2011; Li et al., 2012), d’autres ont rapporté une diminution (Tregouet et al.,
2004; Woll et al., 2005; Benton et al., 2007) alors que certains n’ont trouvé aucune
association (Harada et al., 2003; Frikke-Schmidt et al., 2008)
IV.1.6.2. V771M (G2706A):
C’est un changement de valine (V) en méthionine (M) sur l’acide aminé 771 sur
l’exon 16 [rs2066718]. L’association de ce polymorphisme avec les variations de HDL-C est
controversée. Certaines études ont rapporté une augmentation de la concentration de HDL-C
(Frikke-Schmidt et al., 2004; 2008) et d’autres n’ont trouvé aucune association (Mantaring et
al., 2007). Ce polymorphisme est aussi associé à une diminution du risque cardiovasculaire
(Clee et al., 2001; Yamakawa-Kobayashi et al., 2004; Andrikovics et al., 2006), alors que
Frikke-Schmidt et al. (2008) ont rapporté qu’il est associé à une diminution de ce risque.
IV.1.6.3.V825I (G2868A):
C’est un changement de valine (V) en isoleucine (I) sur l’acide aminé 825 sur l’exon
17 [rs4149312]. L’association du polymorphisme V825I avec les variations de HDL-C est
controversée. Certaines études ont rapporté qu’il est associé à une augmentation de la
concentration de HDL-C (Frikke-Schmidt et al., 2004; 2008; Kyriakou et al., 2007; Slatter et
al., 2008), d’autres à une diminution (Cao et al., 2011), alors que certains n’ont rapporté
aucune association (Clee et al., 2001; Tan et al., 2003; Mantaring et al., 2007). Ce
polymorphisme est associé à une augmentation de risque des MCV, d’après certaines études
(Clee et al., 2001; Tan et al., 2003; Frikke-Schmidt et al., 2008)
IV.1.6.4. -565C/T (-477C/T):
C’est un changement de cytosine par thymine sur le promoteur de gène [rs2422493].
L’association de ce polymorphisme avec le risque des MCV est controversée. En effet,
certaines études ont rapporté une augmentation de ce risque (Lutucuta et al., 2001; Kyriakou
et al., 2005; Benton et al., 2007), d’autres une diminution (Jensen et al., 2007) et certains
n’ont pas trouvé d’association (Takagi et al., 2002; Woll et al., 2005). Aucune association
avec les variations de HDL-C et ce polymorphisme n’a été rapporté (Kyriakou et al., 2005;
Benton et al., 2007)
- 67 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
SR-BI
IV.2. Récepteur scavenger de classe B, type I (SR-BI)
IV.2.1. Historique :
Le gène de SR-BI (nommé SCARB1) a été cloné simultanément chez l’homme, en
1993,
à
partir
d’ADN
complémentaire
(ADNc)
de
cellules
HEL
(cellules
érythroleucémoiques) et identifié sous le nom de « CD-36 and LlMPll-analogous-1 » CLA-I)
(Calvo et Vega, 1993) et chez le hamster, en 1994, à partir d’un mutant de cellules ovariennes
d’hamster chinois et nommé « SR-BI» (Acton et al., 1994). Il existe 81% d’homologie dans la
séquence en acides aminés entre le hamster et l’homme (Acton et al., 1994). Ainsi, deux
nomenclatures s’appliquent pour ce récepteur et, étant donné que les études sur le
métabolisme du cholestérol ont été effectuées en majorité sur le SR-BI et qu’aucune
terminologie définitive n’existe, nous utiliserons le terme SR-BI, dans la suite de ce
manuscrit. Le récepteur SR-BI a été d'abord rapporté par Acton et al. (1996) pour être un
récepteur de haute affinité pour HDL, qui pourrait médier l'assimilation sélective des lipides
des HDL à partir des cellules.
IV.2.2. Structure génique et protéique de SR-BI :
Le gène de SR-BI est situé sur le chromosome 12q24.2 chez l'homme. Il comprend 75
kb et contient 13 exons et 12 introns (Cao et al., 1997).
Le SR-BI est une glycoprotéine membranaire constituée de 509 acides aminés (Calvo
et Vega, 1993; Acton et al., 1994), et ayant, sous sa forme non glycosylée, un poids
moléculaire apparent de 57 kDa (Acton et al., 1994). La protéine est hautement glycosylée
dans le domaine extracellulaire (Babitt et al., 1997) et possède un poids moléculaire de 82 à
88 kDa (Acton et al., 1996).
Ce récepteur membranaire se présente sous la forme d’un «U» inversé et possède deux
domaines intracellulaires séparés par un large domaine extracellulaire (figure 21, p.69). La
boucle extracellulaire contient six résidus Cys (Calvo et Vega, 1993) impliqués dans les ponts
disulfures, des sites de N-glycosylation et des sites d'acylations (ajout d'acides gras comme le
palmitate et le myristate) (Babitt et al., 1997) en plus d'être impliquée dans le transport
sélectif des lipides (Gu et al., 1998). La partie intracellulaire amino-terminale est très courte,
comparée à la partie intracellulaire carboxy-terminale. Le SR-BI possède des sites de
palmitoylation sur les résidus d'acides aminés Cys462 et Cys470 dans la partie intra
cytoplasmique, permettant un meilleur ancrage à la membrane plasmique (Gu et al., 1998).
- 68 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
SR-BI
De plus, l'analyse de l'ADNc de SR-BI prédit une protéine possédant des sites de
phosphorylation par des protéines kinases sur les résidus Ser4, Ser477 et Ser481, tous dans la
partie intracellulaire du récepteur (Calvo et Vega, 1993). Ces motifs suggèrent que la structure
et la fonction du récepteur peuvent être modulées par phosphorylation de ses queues
cytoplasmiques et par homo- ou hétérodimérisation.
Chaîne de glycane
Cholestérol
Domaine extracellulaire
403 acides aminés
Phospholipides
Extracellulaire
Domaine de liaison
du cholestérol
Intracellulaire
Extrémité N-terminale
8-10 acides aminés
Site de phosphorylation
par une PKC
Site de palmitoylation
Site de palmitoylation
Site de phosphorylation
par une PKC
Site de phosphorylation
par une PKC
Extrémité C-terminale
43 acides aminés
Figure 21. Structure du récepteur scavenger classe B type I (SR-BI), incluant un
large domaine extracellulaire glycolysé, 2 domaines N- et C-terminaux (domaines intracellulaires).
Les parties intracellulaires possèdent 3 sites potentiels de phosphorylation par une protéine Kinase C
(PKC) (Sérine4, Sérine477, Sérine481), ainsi que 2 sites de palmitoylation (Cystéine462, Cystéine 470). La
figure montre aussi des sites potentiels de dimérisation (leucine zipper motif), de liaison de
cholestérol, une séquence de criblage peroxysomale PTS-1 (« peroxysomal targeting sequence ») et un
domaine « PDZ binding protein » (Modifiée à partir de Harder and McPherson, 2007).
- 69 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
SR-BI
Il existe un récepteur très similaire au SR-BI qui fût nommé SR-BII. En fait, ce
récepteur provient d'un épissage alternatif de l'ARNm de SR-BI. Ainsi, la séquence de SR-BII
est en tout point identique à celle de SR-BI, à la seule différence qu'il possède une queue
cytoplasmique plus courte. Cependant, malgré cette grande similarité entre ces deux formes,
le SR-BII ne représente, au niveau du foie, que 12 % de l'ensemble des SR-B générés à partir
du gène de SR-BI. De plus, il a été établi que le SR-BII est 4 fois moins efficace que le SR-BI
à prendre sélectivement les esters de cholestérol à partir des HDL (Webb et al., 1997; 1998).
Ainsi, le rôle du SR-BII demeure encore inconnu.
IV.2.3. Localisation :
Le SR-BI est retrouvé sur la membrane plasmique dans des domaines nommés
radeaux lipidiques qui se caractérisent par une composition riche en sphingolipides et en
cholestérol. Plus précisément, il a été découvert que le SR-BI se retrouve dans des
invaginations de la membrane appelées cavéoles (Lisanti et al., 1994; Babitt et al., 1997;
Matveev et al., 1999). Celles-ci sont des domaines membranaires également riches en
sphingolipides et en cholestérol, mais qui se distinguent des radeaux lipidiques par la présence
de protéines de la famille des cavéolines. Les cavéoles sont donc considérées comme un type
spécial de radeaux lipidiques. Toutefois, il est important de mentionner que la présence des
cavéoles n'est pas un pré-requis pour l'expression de SR-BI, puisque différentes études ont
montré la présence membranaire de ce récepteur dans des cellules dépourvues de cavéolines
et par conséquent de cavéoles (cellules granulaires ovariennes et cellules hépatiques humaines
(HepG2)) (Azhar et al., 1998; Reaven et al., 1999; Rhainds et al., 2004) Ainsi, en absence de
ce domaine cavéolaire, il a été démontré que le SR-BI est retrouvé dans des domaines de la
surface cellulaire ayant une faible densité et correspondant aux radeaux lipidiques.
IV.2.4. Expression et régulation de SR-BI :
Le récepteur SR-BI est exprimée dans plusieurs tissus et types cellulaires à savoir le
cerveau, l’intestin, les macrophages, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses,
les kératinocytes, les adipocytes, les plaquettes et les cellules placentaires (Connelly and
Williams, 2004). De plus, il est exprimé en très grande quantité au niveau des tissus
dépendant du cholestérol provenant des HDLs, soit le foie et les tissus impliqués dans la
stéroïdogenèse, c’est-à-dire, les glandes adrénales, les ovaires et les testicules (Acton et al.,
1996; Connelly and Williams, 2004).
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
SR-BI
L'expression du gène de SR-BI peut être régulée par différents facteurs dététitiques,
hormonaux, métaboliques et pharmacologiques (Trigatti et al., 2000; Rigotti et al., 2003).
Ainsi, il a été constaté que chez les hamsters, une diète riche en acides gras polyinsaturés
stimulait l'expression du gène au niveau hépatique et la prise des esters de cholestérol par les
HDL (Spady et al., 1999). À l'opposé, une diète contenant de l'acide myristique provoque une
baisse des niveaux de SR-BI entrainant une augmentation des HDL plasmatiques (Loison et
al., 2002). Il est donc évident que la diète a un impact sur l'expression du SR-BI et que cet
effet se répercute sur la clairance du cholestérol des HDL. Les hormones en circulation sont
un autre facteur pouvant affecter l'expression de SR-BI au niveau du foie. En effet, des
hamsters diabétiques traités avec de l'insuline ont une baisse de l'expression du SR-BI,
lorsqu'on compare ces hamsters avec d'autres ayant été traités avec une solution saline ou
sérum physiologique ou bien étant des hamsters normaux non diabétiques (Dubrac et al.,
2001). L’expression de SR-BI est inversement régulée par des concentrations cellulaires de αtocophérol dans la lignée cellulaire HepG2 et par l’approvisionnement de la vitamine
diététique E dans le foie de la souris (Witt et al., 2000). Les estrogènes semblent avoir un
impact sur le niveau d'expression du gène. En effet, il a été démontré que l'administration de
cette hormone à des doses pharmacologiques supprime toute expression de SR-BI au niveau
du foie (Landschulz et al., 1996). Les niveaux d'œstrogène en circulation pourraient donc
expliquer les différences dans les niveaux d'expression de SR-BI que l'on retrouve selon le
sexe de l'animal. En effet, il est connu que chez les rats, les femelles ont moins de SR-BI
hépatique que les mâles. Par contre, le retrait des ovaires donne une expression hépatique de
SR-BI qui est équivalente à celle que l'on retrouve chez les mâles (Graf et al., 2001). À
l'opposé des œstrogènes, la testostérone entraîne une augmentation de l'expression de SR-BI
dans les hépatocytes. En effet, il a été démontré que des cellules HepG2 traitées avec de la
testostérone expriment davantage de SR-BI (Langer et al., 2002).
Dans le foie, une protéine de 519 acides aminés et de 63 kDa, contenant un domaine
(C-terminal linking and modulating protein) ou PDZ ( PDZ binding protein), aussi nommée
(CLAMP/ PDZK1), lie la partie C-terminale cytoplasmique de SR-BI (Ikemoto et al., 2000) et
semble jouer un rôle important dans le contrôle du transport intracellulaire, l'expression
polarisée, la stabilité et l'activité de SR-BI (Ikemoto et al., 2000; Silver, 2002). La coexpression de PDZK1/CLAMP avec SR-BI dans des cellules transfectées affecte la stabilité
de SR-BI aussi bien que l'efficacité de la conversion des esters de cholestérol-HDL pris via
SR-BI au cholestérol non estérifié intracellulaire (Ikemoto et al., 2000). Les mutations dans la
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
SR-BI
partie C-terminale de SR-BI qui suppriment la liaison à PDZK1/CLAMP empêchent
l'expression cellule-surface du récepteur dans le foie (Silver, 2002).
Des études in vivo et in vitro ont indiqué l'importance des récepteurs nucléaires dans la
régulation de l'expression hépatique de SR-BI. Par exemple, l'administration d'acide cholique,
un activateur du récepteur farnesoid X (FXR), chez des souris a augmenté significativement
les niveaux de la protéine et de L’ARNm de SR-BI hépatique (Lambert et al., 2003). En Plus,
les récepteurs X du foie (LXR) (Malerod et al., 2002), le récepteur homologue 1 hépatique
(LRH-1: Liver Receptor Homolog-1) (Schoonjans et al., 2002), le PPAR-γ, et le HNF4-α,
semblent tous stimuler l'expression hépatique de gène SR-BI (Malerod et al., 2003).
À cause de l'importance de l'expression hépatique de SR-BI pour l’homéostasie des HDL et
les effets régulateurs multiples du PPAR- α sur le métabolisme des lipides, l'activation de ce
récepteur nucléaire par ses ligands (exemple les fibrates) pourrait avoir des conséquences
importantes sur les niveaux d'expression de SR-BI au niveau du foie. En effet, le traitement
par fibrates supprime l'expression de la protéine SR- BI, mais pas l’ARNm, dans le foie murin
et la réduction de l'activité de SR-BI est apparemment responsable de l’altération du
métabolisme des HDL chez des animaux traités par des médicaments (Mardones et al., 2003).
IV.2.5. Ligands de SR-BI :
Le SR-BI est capable de lier avec haute affinité les LDLox et les LDL-acétylées
(LDLac), ce qui en fait par définition un récepteur "scavenger". À la grande surprise, ce
récepteur, au contraire des récepteurs classés "scavengers", a démontré une haute affinité pour
les LDL et les HDL natives (Acton et al., 1996) ainsi que pour les VLDL (Calvo et al., 1997).
Les HDL et les LDL n’entrent pas en compétition les unes avec les autres vis-à-vis de SR-BI.
Il a été identifié des acides aminés de la boucle extracellulaire de SR-BI qui sont
spécifiquement impliqués dans l’interaction de lipoprotéines avec SR-BI. Le remplacement
des glutamines en position 402 et 418 par des arginines diminue la fixation des HDL, sans
modifier la fixation des LDL. De plus, le remplacement de la méthionine en position 158 par
une arginine inhibe la fixation des HDL et des LDL sans modifier la fixation des LDLac. Ces
mutations inhibent également l’internalisation des esters de cholestérol à partir des HDL et/ou
des LDL. Ces études confirment donc que HDL, LDL et LDLac se fixent au niveau de sites
différents sur SR-BI (Gu et al., 2000; Trigatti et al., 2000).
SR-BI lie également l'albumine bovine sérique maléylée (M-BSA) (Acton et al., 1994), les
phospholipides anioniques tels la phosphatidylsérine, le phosphatidylinositol et l'acide
phosphatidique (Rigotti et al., 1995). Ces derniers se trouvent principalement dans les feuillets
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
SR-BI
internes de la membrane plasmique et sont mis à nu lors du processus d'apoptose. Ainsi, on
peut croire que le SR-BI aurait aussi un rôle dans la reconnaissance des cellules sénescentes
(Rigotti et al., 1995). SR-BI peut également reconnaître différentes apo (apoAI, apoAII,
apoCIII, apoE) (Xu et al., 1997, Thuahnai et al., 2001), libres ou associées à des
phospholipides. Williams et al. (2000) ont montré que l’interaction entre les HDL et SR-BI
pouvait s’expliquer par la reconnaissance des hélices α de l’apoAI. Cette observation permet
d’expliquer l’interaction de SR-BI avec différentes apo par la reconnaissance de structures
secondaires communes à ces apo, les hélices α amphiphiles. Si ces différentes apo se fixent
sur SR-BI, elles n’ont pas toutes le même effet sur l’internalisation des esters de cholestérol
par cette voie. Ainsi, il a été montré un effet antagoniste de l’apoAII car, si l’enrichissement
des HDL en apoAII augmente leur affinité pour SR-BI, il diminue l’internalisation des esters
de cholestérol par la cellule (Pilon et al., 2000).
IV.2.6. Rôle physiologique du SR-BI :
IV.2.6.1. SR-BI et la captation sélective :
Le phénomène de la captation sélective des esters de cholestérol des HDL a tout
d'abord été démontré en 1996 par le groupe de Krieger (Acton et al., 1996) qui, par
l'utilisation de cellules sur-exprimant le SR-BI, a constaté que ce dernier est effectivement
responsable de la captation sélective des esters de cholestérol présents au niveau des HDL
(figure 22, p.74). Par la suite, de nombreuses études in vivo et in vitro ont montré la
participation de ce récepteur dans le mécanisme de captation sélective du cholestérol
provenant des HDL (Babitt et al., 1997; Rigotti et al., 1997; Varban et al., 1998). En fait, trois
études simultanées ont démontré que le SR-BI
était le seul récepteur physiologique
responsable de la captation sélective des esters de cholestérol des HDL (Out et al., 2004;
Brodeur et al., 2005; Brundert et al., 2005). En fait, SR-BI serait responsable de la captation
hépatique de 68% à 85% des esters de cholestérol en provenance des HDLs (Rhainds et al.,
2003).
Le mécanisme détaillé par lequel le SR-BI effectue cette captation sélective des esters de
cholestérol à partir des lipoprotéines demeure passablement obscur. L'hypothèse la plus
répandue suggérait la formation d'un canal hydrophobe permettant le transfert des esters de
cholestérol. SR-BI, qui permet la captation sélective, exige la liaison lipoprotéine-récepteur
qui est suivie par le transfert des lipides dans la cellule (Nieland et al., 2002; Temel et al.,
2002). Bien que les mécanismes de transfert des lipides restent en grande partie inconnu,
certaines études suggèrent que ce transfert se passerait sur la surface cellulaire et n'exigerait
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
SR-BI
pas d'internalisation des particules de lipoprotéines (Liu and Krieger, 2002; Nieland et al.,
2005; Harder et al., 2006). Ainsi, ces études suggèrent que l'endocytose n'est pas nécessaire
pour la captation sélective des esters de cholestérol via la voie du SR-BI et le phénomène se
déroulerait exclusivement au niveau de la membrane plasmique. Cependant, une autre étude
faite par le groupe de Tall (Silver et al., 2001) a plutôt révélé qu'au niveau de cultures
primaires d'hépatocytes de souris, la lipoprotéine est internalisée suite à sa liaison au
récepteur. Une fois internalisée, une partie du cholestérol de la lipoprotéine subit une
transcytose sélective et est ainsi transportée vers la membrane apicale, alors que la
lipoprotéine subit une rétro-endocytose vers la membrane basolatérale pour être re- sécrétée
dans la circulation. D’autres études supportent ce mécanisme au niveau des cellules HepG2
(Silver et al., 2000; Rhainds et al., 2004). Bien que ce phénomène semble être présent au
niveau des cellules hépatiques, aucun résultat clair ne permet d'appliquer ce phénomène de
rétro-endocytose à tous les types cellulaires, ce qui pourrait expliquer la divergence existant
dans la littérature.
Extracellulaire
Cavéoles
Intracellulaire
Figure 22. Processus de captation sélective du cholestérol par le récepteur SR-BI
(Al-Jarallah and Trigatti, 2010).
SR-BI lie HDL, via apoA-I, et permet la captation sélective du cholestérol de HDL.
IV.2.6.2. SR-BI et efflux de cholestérol :
En plus de son rôle dans l’internalisation des esters de cholestérol, SR-BI semble
également impliqué dans l’efflux de cholestérol non estérifié. La transfection de SR-BI dans
des cellules en culture augmente l’efflux de cholestérol vers les HDL, mais pas vers l’apoAI
libre (Ji et al., 1997). SR-BI peut donc entraîner un mouvement bidirectionnel vers l’intérieur
ou l’extérieur de la cellule et, dans certaines conditions, ce récepteur est capable d’entraîner
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
SR-BI
un mouvement global du cholestérol en faveur de l’efflux (Ji et al., 1997). La direction du flux
de cholestérol est probablement déterminée par les concentrations relatives de cholestérol
dans la membrane plasmique et dans les accepteurs de cholestérol, HDL ou LDL.
Le mécanisme par lequel SR-BI est capable de faciliter l’efflux de cholestérol n’est pas
actuellement bien connu. De la Llera-Moya et al. (1999) ont suggéré que la fixation des
lipoprotéines à SR-BI n’était pas indispensable à l’efflux de cholestérol. En effet, CD36, qui
peut fixer les HDL, ne peut induire l’efflux de cholestérol. SR-BI pourrait participer à l’efflux
en induisant un remaniement de l’organisation de la membrane plasmique et de la distribution
du cholestérol, en particulier au niveau des cavéoles. Cependant, il a été démontré, en utilisant
des anticorps bloquant la partie extracellulaire du SR-BI, que la fixation des HDL ou des LDL
sur SR-BI était indispensable à l’efflux du cholestérol vers ces accepteurs (Gu et al., 2000;
Trigatti et al., 2000).
Le SR-BI est exprimé dans les macrophages, en particulier au niveau de la plaque d’athérome.
Son implication dans l’efflux de cholestérol pourrait lui faire jouer un rôle important dans
l’athérosclérose, ce mécanisme étant probablement utilisé pour limiter l’accumulation de
lipides et la formation des cellules spumeuses dans la paroi artérielle. En outre, dans les
macrophages, l’expression de SR-BI est régulée par les activateurs des récepteurs nucléaires
PPARα et PPARγ, récepteurs jouant un rôle important dans le métabolisme lipidique (Chinetti
et al., 2000).
IV.2.7. Rôle pathologique du SR-BI :
IV.2.7.1. SR-BI et athérosclérose :
Comme nous venons de le voir, SR-BI peut être impliqué dans les différentes étapes
du métabolisme des HDL, mais également dans le métabolisme des lipoprotéines de plus
basse densité, contenant de l’apoB, telles que les LDL et les VLDL. Or, il est établi depuis de
nombreuses années que le risque d’athérosclérose augmente de façon proportionnelle à la
concentration plasmatique de LDL-C, alors que ce risque est inversement proportionnel à la
concentration de HDL-C. Ainsi, l’impact de SR-BI sur le métabolisme des différentes classes
de lipoprotéines pourrait se révéler très important dans le développement de l’athérosclérose
(Trigatti et al., 2000; Trigatti and Rigotti, 2000). Les modèles d’animaux transgéniques ont
permis d’étudier, in vivo, le rôle de SR-BI. La surexpression de SR-BI, dans tout l’organisme
ou au niveau hépatique, conduit à la diminution des HDL plasmatiques. Cette diminution est
due à l’augmentation de l’internalisation par le foie des esters de cholestérol des HDL et à
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
SR-BI
l’excrétion du cholestérol dans la bile (Kozarsky et al., 1997). À l’inverse, les souris
déficientes en SR-BI au niveau hépatique voient leurs HDL plasmatiques s’accumuler, tandis
que la capture des esters de cholestérol par le foie et l’excrétion du cholestérol biliaire
diminuent. Les stocks de cholestérol au niveau des tissus stéroïdogènes (glandes surrénales et
ovaires) décroissent fortement, montrant ainsi l’importance des HDL dans l’apport de
cholestérol à ces tissus. Pour étudier le rôle de SR-BI dans le développement de
l’athérosclérose, deux modèles de souris ont été utilisés: des souris déficientes en récepteur
LDL ou des souris déficientes en apoE. Ces deux modèles développent spontanément des
lésions d’athérosclérose. Dans ces deux modèles, la déficience supplémentaire en SR-BI
augmente le nombre et/ou la taille des lésions. À l’inverse, la surexpression de SR-BI protège
ces souris en retardant l’apparition des lésions ou en diminuant leur taille. Dans tous ces
modèles animaux, les concentrations de HDL plasmatiques sont liées au niveau d’expression
de SR-BI. La surexpression hépatique de SR-BI est associée à la diminution des niveaux
plasmatiques de HDL-C, à l’augmentation de la clairance des esters de cholestérol de HDL, et
à l’augmentation du contenu biliaire en cholestérol et du transport de cholestérol du foie dans
la bile. Ces différents résultats montrent que SR-BI a un rôle protecteur vis-à-vis de
l’athérosclérose chez la souris. Cependant les mécanismes impliqués ne sont pas encore très
bien compris et sont probablement très complexes étant donné les différents niveaux
d’intervention de SR-BI dans le métabolisme des lipoprotéines. De plus, il est difficile
d’extrapoler ces résultats à l’homme, à cause des différences importantes existant entre le
métabolisme des lipoprotéines chez l’homme et celui des lipoprotéines chez la souris: chez
l’homme, le cholestérol est principalement véhiculé par les LDL. En outre, à la différence de
la souris, l’homme exprime la CETP, enzyme qui joue un rôle important dans le métabolisme
des lipoprotéines. Ces différences sont de nature à entraîner des mécanismes de
développement de l’athérosclérose différents de ceux rencontrés chez la souris (Pilon et al.,
2001).
SR-BI peut protéger contre l'athérosclérose par un seul mécanisme ou une
combinaison des mécanismes suivants:
(1) il peut permettre l'assimilation hépatique et la sécrétion biliaire de cholestérol des HDL et
peut donc protéger contre l'athérosclérose en stimulant le TIC en général (Ueda et al., 1999; Ji
et al., 1999; Mardones et al., 2001);
(2) son expression dans les cellules spumeuses de macrophage dans les plaques
athérosclérotiques (Hirano et al., 1999; Chinetti et al., 2000) peut affecter le flux de
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
SR-BI
cholestérol entre les cellules et HDL (Gu et al., 2000; Huang and Mazzone, 2002; Covey et
al., 2003);
(3) il peut empêcher l'accumulation des lipoprotéines athérogènes dans le plasma (Wang et
al., 1998 ; Ueda et al., 1999);
(4) il peut contribuer à l’athéro-protection médiée par α-tocophérol plasma (Terasawa et al.,
2000; Thomas et al., 2001);
(5) il peut être impliqué dans l’athéroprotection médiée par l’oxyde nitrique. En effet, l’effet
des HDL sur des cellules endothéliales est obtenu grâce au SR-BI (Yuhanna et al., 2001;
Mineo et al., 2003). La particule HDL promet aussi la croissance et la migration des cellules
endothéliales via SR-BI (Gong et al., 2003; Seetharam et al., 2006);
(6) son expression peut influencer la provision d'oxygène artériel en contrôlant la maturation
des globules rouges et en empêchant l'anémie (Holm et al., 2002).
IV.2.8. Polymorphismes et mutations de SR-BI :
Malgré l'évidence fonctionnelle de l’influence de SR-BI sur le HDL-C, les études
épidémiologiques et génétiques sont relativement faibles (Boes et al., 2009). Des études
génétiques examinant les concentrations de HDL-C et de là, la fonction hépatique de SR-BI,
ont examiné des polymorphismes sur le gène SR-BI pour l’étude des associations avec divers
traits lipidiques et métaboliques. Le gène SR-BI, situé sur le chromosome 12q24, révèle que
ce locus est polymorphe chez une population Européenne blanche (Acton et al., 1999). En
effet, Acton et al. (1999) sont les premiers à avoir identifié le polymorphisme d'un seul
nucléotide (SNPs: single nucleotide polymorphisms) du gène SR-BI et ont associé certaines
de ces variantes communes (exon 8, exon 1, intron 5) avec des variations lipidiques et l'IMC.
Pour cette thèse, nous allons nous intéresser, particulièrement, à mettre en évidence
ces 3 polymorphismes du gène de SR-BI: exon 8, exon1 et intron 5. En deuxième partie nous
étudierons leur effet sur le risque de la sténose coronaire significative chez notre population
d’étude.
IV.2.8.1. Le polymorphisme exon8 :
C’est un changement de la base C en T à la position 1050 de l’ADNc, codant pour
l’acide aminé alanine (A) à la position 350 mais ne résultant pas un changement d’acide
aminé, c’est une mutation synonyme ou silencieuse (rs5888 [A350]) (Acton et al., 1999).
Ce polymorphisme est associé à des concentrations élevées de HDL-C (Richard et al., 2005;
Roberts et al., 2007); cet effet semble être significativement plus prononcé chez les femmes
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
SR-BI
(Roberts et al., 2007). Plusieurs études ont rapporté que le polymorphisme exon8 du gène SRBI peut jouer un rôle dans l’homéostasie du cholestérol et est associé aux MCV (RodriguezEsparragón et al., 2005; Morabia et al., 2004; Ritsch et al., 2007; Tanaka et al., 2007; Roberts
et al., 2007). Ritsch et al., (2007) ont suggéré que SR-BI n’est pas seulement associé au
développement des MCV mais joue aussi un rôle dans le développement des maladies
artérielles périphériques chez les hommes. Ils ont rapporté une augmentation du risque
significatif de ces maladies chez les femmes porteuses de l’allèle sauvage de l’exon8 avec un
OR de 2.623.
Les SNPs silencieux semblent être les seuls marqueurs non identifiés pour être des SNPs
causaux; cependant, l'évidence accumulée suggère maintenant que les SNPs silencieux
puissent directement affecter l'expression et/ou la fonction de la protéine de leurs produits de
gène (Komar, 2007; Nielsen et al., 2007; Sauna et al., 2007). Constantineau et al. (2010) ont
rapporté que le SNP exon 8 affecte la structure secondaire de l’ARN de SR-BI, la traduction
de la protéine et il est significativement associé à une réduction de l’expression et de la
fonction de la protéine de SR-BI in vitro.
IV.2.8.2. Le polymorphisme exon1 :
C’est un changement de la base G en A à la position 4 de l’ADNc qui code pour une
substitution de glycine (G) par sérine (S) à la position 2; c’est une mutation non synonyme
(rs4238001 [G2S]). Ce SNP semble être associé significativement à un HDL-C élevé et LDLC bas chez les hommes seulement (Acton et al., 1999).
IV.2.8.3. Le polymorphisme intron5 :
C’est un changement de base C en T à la position 55 de l’intron 5. Ce polymorphisme
a montré une association avec l’IMC, chez les femmes seulement (Acton et al., 1999). Il a été
rapporté que l’allèle muté de l’intron 5 semble être un FR pour les maladies artérielles
périphériques chez les hommes avec un odds ratio de 2.182 (Ritsch et al., 2007).
Plus récemment, une nouvelle mutation fonctionnelle sur SR-BI (889C/T qui est une
substitution de serine par proline [P297S]) a été d’identifiée par le séquençage de SR-BI dans
une population caucasienne à HDL-C élevée. Les porteurs de la mutation montrent des
concentrations élevées de HDL-C et un efflux de cholestérol réduit à partir de macrophages,
mais aucune augmentation significative de l'athérosclérose (Vergeer et al., 2011). Deux autres
nouvelles mutations, S112F (nucléotide C588T) et T175A (nucléotide A776T), ont été
identifiées par Brunham et al. (2011) et semblent être associées à une concentration élevée de
HDL-C.
- 78 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
CETP
IV.3. La protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP)
IV.3.1. Historique :
Il y a Plus de 40 ans, Nichols and Smith (1965) ont décrit un facteur dans le plasma
humain qui a pu stimuler l'échange réciproque de TG et d’esters de cholestérol entre des sousclasses de lipoprotéines. La première caractérisation biochimique d'une protéine de transfert
de lipide dans le plasma est apparue 13 ans plus tard (Pattnaik et al., 1978). La purification
complète de la CETP (Hesler et al., 1987) et le clonage ultérieur de son ADNc ont été réalisés
en 1987 (Drayna et al., 1987).
IV.3.2. Structure du gène de la CETP:
Le gène humain de la CETP couvre 22 kb d’ADN génomique, avec 16 exons et 15
introns (figure 23, p.79). La taille des exons s’étend de 32 à 250pb. Il est situé sur le bras long
du chromosome 16 (16q21), à proximité du gène de la LCAT et de l'haptoglobine (Drayna
and Lawn, 1987; Agellon et al., 1990). Il code pour un ARNm de 1790pb.
Figure 23. Gène de la CETP
(Source: http://droog.gs.washington.edu/parc/data/cetp/gene_model.htm.)
Le gène humain de la CETP couvre 22 kb d’ADN génomique, avec 16 exons et 15 introns.
Le gène humain de la CETP est d’une similarité marquante avec le gène de la PLTP
dans l’organisation exon-intron (Tu et al., 1995). La PLTP transfère les phospholipides, entre
les lipoprotéines et est à 20% d’homologie avec la CETP (Day et al., 1994; Lagrost et al.,
1998). La CETP est un membre de la famille génique des protéines de transfert des lipides qui
inclue les protéines : bactericidal/permeability-increasing protein (BPI), lipopolysaccharide
binding protein (LBP), et PLTP (Yamashita et al., 2000).
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
CETP
IV.3.3. Structure de la protéine CETP :
L’ARNm du gène de la CETP code pour une pré-protéine de 493 acides aminés, qui
contient un pré-peptide de 17 acides aminés, dont le clivage donne naissance à une protéine
plasmatique mature de la CETP de 476 acides aminés (Drayna et al., 1987; Drayna and Lawn,
1987). La CETP est une glycoprotéine circulante hydrophobe, ayant un poids moléculaire
d'environ 70 -74 kDa (Bruce et al., 1998a; Lagrost, 1994). La CETP présente quatre sites de
N-glycosylation, le troisième site est glycosylé de façon variable ce qui explique l'existence
de deux isoformes circulants de poids moléculaires très voisins.
L’analyse de la séquence primaire de la CETP indique que la protéine mature est
composée de 45% de résidus non polaires, ce qui suggère le fait qu’elle soit très hydrophobe
(Hesler et al., 1987; Drayna et al., 1987; Drayna and Lawn, 1987). Cependant, le fait que la
CETP est facilement soluble dans l’eau implique que de tels résidus hydrophobes sont
principalement inaccessibles à la phase aqueuse. En effet, ils forment une poche hydrophobe
qui permet la liaison des lipides neutres (Hesler et al., 1987). L’étude des relations entre
structure-fonction, dans la CETP, révèle que la région C-terminale joue un rôle crucial dans la
liaison des lipides neutres (Swenson et al., 1989; Wang et al., 1992; Au-Young and Fielding,
1992). Cependant, la liaison des phospholipides semble avoir besoin d’un site distinct
(Swenson et al., 1988; Wang et al., 1992).
La structure cristalline de la CETP a révélé une molécule formée d’un boomerang
allongé avec la courbure de la surface concave s’adaptant probablement à la courbure convexe
de la surface de la lipoprotéine (Qiu et al., 2007) (figure 24, p.81). L’unique tunnel
hydrophobe de longueur 60 Å avec deux ouvertures distinctes traverse le cœur de la protéine.
Ce tunnel peut être rempli de deux molécules d’esters de cholestérol et branché par deux
molécules de phospholipide à chaque extrémité. Il a été proposés que sur la CETP liant la
surface de lipoprotéine, les phospholipides attachés aux extrémités du tunnel se mêlent dans la
monocouche de phospholipides et permettent aux lipides neutres d'entrer et de quitter le
tunnel. Une hélice amphipathique C-terminale (figure 24, la flèche noire, p.81), reconnue par
la neutralisation d'anticorps monoclonal de la CETP (Tall, 1995), est placée à l’extrémité de
l'entrée N-terminale jusqu’au tunnel liant les lipides et peut faciliter l'entrée des lipides
neutres dans la CETP. La structure de la CETP semble confirmer que le rôle de la CETP est
de se lier à des lipides neutres et de faire la navette entre eux et les lipoprotéines plasmatiques
selon un mécanisme de transporteur intermédiaire (Barter and Jones, 1980).
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
CETP
Figure 24. Modèle structurel de la CETP humaine (Qiu et al., 2007)
Les domaines N-terminal sont en vert, les domaines C-terminal sont en jaune et la liaison est en rouge.
Les deux molécules d’esters de cholestérol sont en magenta et en cyan et les phospholipides sont
représentés en des liens noirs. La CETP montre une forme de boomerang allongée avec la courbure de
la surface concave adaptant la courbure convexe de la surface des lipoprotéines. Un tunnel hydrophobe
unique rempli de deux molécules d’esters de cholestérol traverse le cœur de la protéine. Ce tunnel est
branché par deux molécules de phospholipide à chaque fin. Une hélice C-terminale (la flèche noire)
est placée à l’extrémité de l'entrée de N-terminal jusqu’au tunnel hydrophobe.
IV.3.4. Expression de la CETP :
Il existe une très forte variabilité de l'expression du gène de la CETP selon les espèces.
Son expression est nulle chez le rat et la souris, moyenne chez l'homme et forte chez les
primates et les lapins. Chez l'homme, l'expression du gène de la CETP est élevée au niveau du
foie, organe longtemps considéré de façon implicite comme le site exclusif de la biosynthèse
de la CETP, et au niveau du tissu adipeux (Drayna et al., 1987; Drayna and Lawn, 1987; Jiang
et al., 1991). Bien que la CETP est synthétisée à bas niveau dans un grand nombre de tissus
tels que l’intestin grêle, les glandes surrénales, la rate (Drayna et al., 1987; Drayna and Lawn,
1987) et les macrophages (Tollefson et al., 1985), l’analyse de la distribution de la CETP,
dans l’aorte humaine, indique que la CETP est produite par les CML dans la média (Ishikawa
et al., 2001). La CETP est aussi détectée dans les cellules spumeuses, dans les lésions
athérosclérotiques, coronaires et aortiques humaines (Ishikawa et al., 2001; Zhang et al.,
2001). Finalement, la CETP a été détectée dans le liquide folliculaire humain (Ravnik et al.,
1992), les astrocytes (Yamada et al., 1995), et le liquide céphalorachidien, suggérant ainsi que
la CETP peut être synthétisée directement dans le cerveau humain (Albers et al., 1992).
In vitro, les niveaux d'expression cellulaire de la CETP dans des modèles de lignée
cellulaire en culture primaire ou secondaire sont le plus souvent extrêmement faibles ou nuls.
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
CETP
Les macrophages obtenus à partir de monocytes humains circulants constituent le seul type
cellulaire permettant d'étudier, in vitro, l'expression du gène de la CETP, sans manipulation de
transfection (Moulin, 1995).
IV.3.5. Régulation de l’expression de la CETP :
Les éléments régulateurs identifiés dans le gène promoteur de la CETP sont résumés
schématiquement dans la figure 25 (p.82).
Figure 25. Régulation de l’activité du promoteur de la CETP dans le foie
(Le Goff et al., 2004)
L’activité du promoteur de la CETP est régulée constitutivement par des facteurs nucléaires actifs
(facteurs transcriptionnels présents dans les cellules nucléés qui lient des séquences d’ADN
spécifiques dans le promoteur de la CETP, incluant Sp1, Sp3 et C/EBP) et par des facteurs régulateurs
de la transcription qui sont présents dans les cellules, sous forme inactive et qui sont activés par
d’autres signaux intracellulaires et extracellulaires.
La région promotrice 5’ distale de ce gène contient un nombre d’éléments répétitifs
(Williams et al., 1997). Un de ces éléments est la répétition Alu, localisée à la position -2153/2414, elle agit comme élément répressif sur l’activité promotrice de la CETP (Le Goff et al.,
2003a). La région promotrice a été extrêmement étudiée permettant la caractérisation de
nombreux éléments de la région transcriptionnelle. Ainsi, la protéine  CCAAT/enhancer
binding (C/EBP) trans-active le gène promoteur de la CETP dans les cellules HepG2.
La région proximale du gène humain de la CETP contient un motif riche en GC à la
position -37, qui permet la fixation des facteurs transcriptionnels ubiquitaires Sp1 et Sp3
(Gaudet and Ginsburg, 1995; Le Goff et al., 2003b). La liaison de Sp1 et Sp3 à ce site permet
la trans-activation du promoteur de la CETP. Deux autres sites Sp1 ont été décrits dans la
région promotrice (Le Goff et al., 2003b; Dachet et al., 2000). Le premier correspond au
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
CETP
polymorphisme -629C/A ; l’allèle -629A permet la fixation de deux facteurs de transcription
Sp1 et Sp3 et réprime l’activité du promoteur de la CETP, in vitro. Au contraire, l’allèle 629C ne lie ni Sp1 ni Sp3 (Dachet et al., 2000). Le deuxième site Sp1, à la position -690,
réprime l’activité du promoteur de la CETP au même degré que celui exercé par le site 629C/A, les effets répressifs deviennent additifs (Le Goff et al., 2003b).
Bien que de nombreux éléments régulateurs aient été identifiés dans la région proximale, une
étude a montré que la région promotrice distale contribue à l’activité transcriptionnelle de la
CETP (Le Goff et al., 2003a).
Un régime riche en cholestérol induit une élévation du niveau de l’ARNm de la CETP.
De telles inductions de l’expression du gène CETP apparaissent reliées au cholestérol libre
intracellulaire (Quinet et al., 1991). Le promoteur de la CETP contient un élément sterol
responsive-like aux positions -190 à -206, qui représente une grande homologie avec celui
dans le gène R-LDL (Gauthier et al., 1999).
Les concentrations plasmatiques de la CETP sont influencées par les hormones
sexuelles, ce qui suggère un effet sur l’expression du gène de la CETP (Tall, 1995). En effet,
les niveaux de la CETP sont plus élevés (+25%) chez les femmes que chez les hommes
(Iglesias et al., 1994). De plus, les taux plasmatiques de la CETP sont plus bas chez les
femmes post ménopausées (61-81 ans) que chez celles péri ménopausées (41-60 ans) ou celles
pré ménopausées (18-40 ans) (Zhang et al., 2001). Aussi, les taux plasmatiques de la CETP
sont élevés durant la grossesse (Silliman et al., 1993). De plus, il existe une corrélation
positive entre la concentration sérique de la CETP et la concentration en estradiol, chez les
femmes (Zhang et al., 2001). Finalement, les glucocorticoïdes réduisent les taux plasmatiques
de la CETP (Moulin et al., 1992).
IV.3.6. Méthodes de dosage de la CETP :
 La concentration de la CETP est mesurée par immuno-dosage type ELISA, avec 2
anticorps monoclonaux différents (Mezdour et al., 1994).
 L’activité de la CETP est mesurée par la méthode fluorimétrique, en utilisant une
molécule donnatrice contenant des lipides neutres fluorescents qui sont transférés à
une molécule acceptatrice entraînant une augmentation de la fluorescence (Ordovas et
al., 2000).
- 83 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
CETP
IV.3.7. Rôles de la CETP:
IV.3.7.1. Rôles physiologiques de la CETP :
IV.3.7.1.a. Fonction physiologique de la CETP :
Chez les sujets normolipidémiques, la concentration plasmatique de la CETP varie
entre 1 et 3g/mL (Marcel et al., 1990). Cependant, les taux plasmatiques de la CETP sont
typiquement augmentés par 2 à 3 fois, chez les sujets montrant une hypercholestérolomie ou
des formes mixtes d’hyperlipidémie avec des niveaux élevés de TG (McPherson et al., 1991;
Guerin et al., 1996).
La circulation de la CETP est associée avec les particules de VLDL, LDL et HDL
(Morton, 1985 ; Nishida et al., 1993). Seulement 1% de la CETP plasmatique est présente
sous forme libre (Nishida et al., 1993).
Parmi les différentes sous espèces des particules HDL, la CETP est principalement
associée aux particules HDL contenant seulement apoAI (Groener et al., 1984; Marcel et al.,
1990) et aux pré-HDL (Francone et al., 1989). Seulement, une proportion mineure de la
CETP est associée aux particules HDL contenant apoAI et apoAII (Cheung et al., 1986;
Moulin et al., 1994). Pourtant, chez les humains, la distribution de la CETP entre les
lipoprotéines varie en fonction du sexe et de l’état hyperlipidémique. En effet, chez les
femmes, la CETP est principalement associée aux lipoprotéines (AI), alors que chez les
hommes normolipdémiques, la CETP est distribuée en parts égales entre les lipoprotéines (AI)
et celles (AI :AII). Par contraste, la majorité de la CETP plasmatique, chez les hommes
hyperlipidémiques est liée aux particules (AI: AII) (Moulin et al., 1994).
Dans le plasma humain, la CETP assure la totalité du transfert du cholestérol estérifié
et TG mais seulement un tiers du transfert des phospholipides, entre les différentes particules
de lipoprotéines (Hesler et al., 1988). Le transfert des 2/3 restants des phospholipides est
médié par la PLTP (Tall et al., 1983).
Bien que, le transfert des lipides neutres soit initialement observé entre HDL et LDL,
il est maintenant bien établi que le transfert du cholestérol estérifié, se produit vraiment de
HDL vers LDL, dans le plasma humain (Guerin et al., 1994). En plus, les particules LDL de
sous classe de densité et de taille intermédiaires, apparaissent représenter les accepteurs
préférentiels du cholestérol estérifié, parmi les sous classes majeures de LDL (Marzetta et al.,
1993; Guerin et al., 1994).
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
CETP
En conclusion, l’activité plasmatique de la CETP est modulée par quatre facteurs
majeurs: la concentration plasmatique de la CETP, les niveaux plasmatiques et la composition
chimiques (lipides et protéines) des lipoprotéines acceptrices et donnatrices et la présence
dans le plasma d’inhibiteurs spécifiques de la CETP, notamment l’apoCI (Gautier et al.,
2000). En addition, des facteurs environnementaux tels que l’exercices physique, l’alcool et le
tabagisme peuvent aussi affecter l’activité plasmatique de la CETP (Anagnostopoulou et al.,
2009; Marques-Vidal et al., 2010; Ahmad et al., 2011).
IV.3.7.1.b. Rôle de la CETP dans le remodelage intravasculaire des lipoprotéines
La CETP a un impact majeur sur le remodelage intravasculaire des particules HDL
(figure 26, p.86). En effet, plusieurs études in vitro ont montré que la CETP induit des
modifications de la taille des particules HDL, en favorisant la formation des particules de
petites tailles, incluant HDL3b, HDL3c (Lagrost, 1992; Lagrost, et al., 1993; 1996) et préHDL
(Barter et al., 1990 ; Kunitake et al., 1992). En plus, l’action combinée de la CETP avec la
LPL ou la LH, en présence des VLDL, favorise la réduction de la taille des HDL (Newnham
and Barter, 1990; 1992).
Le rôle de la CETP dans le remodelage des particules HDL a été confirmé, chez les patients
ayant une déficience en CETP. De tels sujets sont caractérisés par un ratio élevé de
HDL2/HDL3, reflètant une proportion élevée de particules HDL larges enrichies en
cholestérol estérifié et apoE (Yamashita et al., 1990; 1991). La présence de telles particules
suggère que la CETP est un facteur clé, dans la modulation du recyclage des HDL larges.
Le remodelage intravasculaire des particules HDL, médié par la CETP se produit au moins
par trois mécanismes distincts. Alors que les deux premiers mécanismes suggèrent que la
réduction de la taille des HDL est basée sur la perte partielle du noyau lipidique (Lagrost,
1997), le troisième implique la fusion des particules HDL (Rye et al., 1997).
 Le premier mécanisme nécessite l’action combinée de la CETP et de la LH. En effet,
la CETP permet l’enrichissement des particules HDL en TG qui seront, plus loin,
hydrolysée par LH, induisant ainsi la réduction de la taille du noyau lipidique
(Lagrost, 1997). Comme les particules récemment produites sont fondamentalement
instables, elles donnent naissance à deux particules distinctes de petite taille, une
composée d’un noyau lipidique hydrophobe et des composants de surface et l’autre
une particule pauvre en lipide pré, contenant apoAI, avec un contenu mineur de
cholestérol libre et phospholipides.
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CETP
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
 Dans le deuxième mécanisme, la réduction de la taille du noyau lipidique de la
particule HDL résulte de l’incorporation lente de TG, qui se produit simultanément
avec perte de cholestérol estérifié sous l’action de la CETP mais en absence de LH
(Lagrost, 1997).
 Le troisième mécanisme nécessite la formation d’un complexe ternaire entre une
molécule de la CETP et deux particules de HDL, chacune contenant trois molécules
d’apoAI. La fusion qui s’ensuit de ces deux particules HDL génère une nouvelle
particule HDL passagère composée de six molécules apoAI et qui permet, par la suite
la formation de trois particules HDL de petite taille, chacune contenant deux
molécules apoAI (Rye et al., 1997).
α- HDL
petite taille
HDL mature
AI
CETP
CE
Foie
+
AI
HL
TG
B
VLDL/LDL
AI
Préβ-HDL
Cholestérol
libre
phospholipides
Tissus périphériques
Figure 26. Rôle de la CETP dans le métabolisme des HDL
(effectuée à partir de Lagrost et al., 2003)
Dans une étape initiale, les particules préβ-HDL prennent en charge le cholestérol libre localisé dans
les membranes plasmiques des cellules périphériques. Le cholestérol libre est ensuite rapidement
estérifié dans le compartiment intravasculaire par la LCAT qui permet la transformation des particules
préβ-HDL discoïdales en particules αHDL sphériques, comportant un coeur hydrophobe riche en
cholestérol estérifié (CE). La CETP peut contribuer à la régénération de particules préβ-HDL. Les CE
des HDL sont progressivement remplacés par des TG provenant essentiellement des VLDL.
L'hydrolyse consécutive des TG des HDL par la LH conduit à l'émergence de particules instables,
appauvries en lipides neutres, qui se scindent spontanément en particules préβ-HDL et αHDL, plus
petites, plus stables et appauvries en CE.
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
CETP
IV.3.7.2. Rôle pathologique de la CETP :
La CETP a été extrêmement étudiée à travers des modèles animaux ainsi qu’à travers
les variations génétiques chez l’homme, afin de mieux comprendre son rôle dans la
modulation des niveaux de HDL-C et son impact sur les MCV humaines. En termes de
pathologies cardiovasculaires, il n’existe pas de consensus sur le rôle de la CETP, celle-ci
apparaît anti ou pro-athérogène, selon les études.
Pour certains auteurs, la CETP semble constituer un facteur pro-athérogène qui surcharge les
lipoprotéines athérogènes, notamment VLDL, en cholestérol aux dépens des HDL antiathérogènes. Cette action, véritable court-circuit du TIC, conduit en outre à l'accumulation
dans le plasma de particules αHDL et LDL de petite taille qui constituent les nouveaux
marqueurs du risque cardiovasculaire. Cependant, pour d'autres auteurs, la CETP constituerait
plutôt un facteur anti-athérogène, en régénérant les préβ-HDL, accepteurs initiaux du
cholestérol excédentaire des tissus périphériques, et en offrant une voie alternative au retour
du cholestérol au foie par le biais des lipoprotéines à apoB et de leur récepteurs cellulaires. En
fait, il est probable qu'in vivo la CETP présente ces deux rôles, selon le contexte métabolique:
niveau d'expression de la CETP, cinétique du métabolisme des lipoprotéines, profil normo- ou
dyslipidémique, situation de jeûne ou période postprandiale. (Lagrost et al., 1998; Lagrost,
1999; Guerin et al., 2001).
IV.3.8. Inhibition de la CETP, comme stratégie thérapeutique pour la
réduction du risque cardiovasculaire:
Les données disponibles actuellement suggèrent que la diminution de l’activité de la
CETP est anti-athérogène, particulièrement si elle est associée à des niveaux élevés de HDLC. L’inhibition de la CETP est maintenant considérée comme étant une nouvelle stratégie
pour traiter les MCV. Un vaccin, CETi-1 et deux composés de petites molécules, JTT-705 et
torcétrapib, sont actuellement sous investigation chez les humains (Barter and Kastelein,
2006). Dans l’étude ILLUMINATE, le torcétrapib a effectivement augmenté fortement le
HDL-C, mais sans bénéfice en termes d’événements cardiovasculaires avec même, au
contraire, une augmentation de la mortalité et du risque d’événement cardiovasculaire. Les
causes de cet échec sont encore discutées et pourraient être liées au fait que le torcétrapib
exerce des effets indépendants de son action sur la CETP en stimulant le système rénine
angiotensine, ce qui est associé à une élévation notable de la pression artérielle sous
traitement. Cet effet sur la pression artérielle n’est pas nécessairement un effet de classe, et au
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
CETP
moins un autre inhibiteur de la CETP, l’anacetrapib, semble en être dépourvu (Barter et al.,
2007).
La présence d’inhibiteurs naturels de la CETP dans le plasma humain a été rapportée.
Une telle protéine, initialement référée comme une protéine inhibitrice du transfert des
lipides, a été identifiée comme apoF (Wang et al., 1999). Cette protéine réprime,
préférentiellement, les transferts impliquant les LDL mais a un faible effet sur les transferts
impliquant les HDL. L’inhibition de l’activité de la CETP dans la fraction HDL a été
identifiée comme apoCI (Gautier et al., 2000).
IV.3.9. Mutations et polymorphismes touchant le gène de la CETP :
L’ADNc du gène humain de la CETP est à l’origine séquencé par Drayna et al. en
1987 et plusieurs mutations ont été décrites. Ces mutations sont communes dans la population
Japonaise et elles sont associées à une réduction de l’activité de la CETP, dans le plasma. En
addition, nombreux polymorphismes ont été identifiés dans le gène humain de la CETP,
indiquant que ce locus est très polymorphe (figure 27, p.88). Les polymorphismes dans ce
gène constituent des marqueurs génétiques essentiels de la relation entre le gène de la CETP
et ses impacts métaboliques et cliniques. Quelques polymorphismes de longueurs des
fragments de restriction (RFLP) ont été impliqués dans l’altération de l’activité de la CETP et
les concentrations de HDL-C. Ils ont été étudiés comme prédicteurs des MCV.
Nous nous sommes intéressés, dans cette thèse, à la mise en évidence de quatre
polymorphismes du gène CETP (TaqIB, I405V, R451Q et A373P) dont le rôle dans les MCV
est controversé et à l’étude de l’association de ces polymorphismes avec le profil lipidique et
la sténose coronaire chez notre population d’étude.
Figure 27. Polymorphismes et mutations de la CETP (Thompson et al., 2003)
Nombreux polymorphismes ont été identifiés dans le gène de la CETP, nous nous sommes intéressés à
l’étude de 4 polymorphismes (TaqIB, I405V, R451Q et A373P).
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
CETP
IV.3.9.1. Le polymorphisme A373P (rs5880) :
La mutation GC, sur le codon 373, sur l’exon 12 du gène de la CETP, conduit à une
substitution de l’alanine (A) par la proline(P) (Hill et al., 1997). Elle est associée à une
activité élevée de la CETP et à un niveau bas de HDL-C (Agerholm-Larsen et al., 2000b).
Une étude multi-ethnique sur l’athérosclérose a rapporté que l’allèle P du polymorphisme
A373P est associé au risque coronaire (Tsai et al., 2008).
IV.3.9.2. Le polymorphisme R451Q (rs1800777) :
La mutation GA, sur le codon 451, sur l’exon 15 du gène de la CETP, conduit à une
substitution de l’arginine (R) par glutamine (Q) (Kakko et al., 1998). Elle est associée à une
activité élevée de la CETP et à un niveau bas de HDL-C (Agerholm-Larsen et al., 2000b).
L’étude de Copenhagen City Heart a démontré que les porteurs de l’haplotype rare
373P/451Q présentent une diminution de HDL-C de 0.12 à 0.36 mmol/L (7% à 21%), chez
les femmes et 0.14 à 0.21 mmol/L (10% à 15%), chez les hommes et qu’ils sont associés
paradoxalement à une diminution de 36% du risque des maladies coronaires, chez les femmes
(Agerholm-Larsen et al., 2000b). Tsai et al ont rapporté que l’allèle 451Q est associé à un
renforcement de la plaque de l’artère de la carotide, caractérisé par une activité élevée de la
CETP ce qui peut prédisposer les individus à l'athérosclérose (Tsai et al., 2008).
IV.3.9.3. Le polymorphisme I405V (rs5882) :
Ce polymorphisme, très commun, est du à une transition de AG, sur la position
+20206, sur l’exon 14, qui aboutit à une mutation faux sens avec substitution de l’isoleucine
(I) par la valine (V), dans la position 405 de la protéine (Boekholdt and Thompson, 2003).
Dans la forme homozygote du plus rare allèle (génotype V/V), le polymorphisme I405V est
associé à une réduction de l’activité de la CETP et à des changements dans la concentration
des HDL-C (Boekholdt et al., 2004 ; Brousseau et al., 2004). Quelques études ont rapporté
que l’allèle 405V est associé à un HDL-C élevé, à une CETP basse et à une augmentation du
risque des maladies coronaires (Bruce et al., 1998b; Agerholm-Larsen et al., 2000a; Kakko et
al., 2000). Cependant, d’autres études ont trouvé que l’allèle V est associé à une diminution
du risque coronaire (Kolovou et al., 2006; Borggreve et al., 2006; Isaacs et al., 2007), alors
que deux autres n’ont rapporté aucune association (Ghatreh Samani et al., 2009 ; Padmaja et
al., 2009a).
- 89 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
CETP
IV.3.9.4. Le polymorphisme TaqIB (rs708272) :
C’est le polymorphisme le plus étudié de tous. Il est associé à la population
caucasienne. C’est un changement de GA qui affecte le 277ième nucléotide, sur l’intron 1
du gène, et possède un site de restriction pour l’endonucléase TaqI (Drayna et al., 1987). La
présence du site de restriction de TaqI est désignée par l’allèle B1 et son absence par B2.
L’allèle B2 est considéré comme muté et l’allèle B1 comme l’allèle sauvage.
L’allèle B2 a été associé, chez les sujets normolipidémiques, à des niveaux plus élevés de
HDL-C, à des taux plus bas de CETP et à une activité plus basse de CETP que pour l’allèle
B1 (Hannuksela et al., 1994; Kuivenhoven et al., 1997b).Cette association dépend de la nature
de la population (Mitchell et al., 1994) et elle est très influencée par les facteurs de
l’environnement tels que la consommation d’alcool et le tabagisme (Hannuksela et al., 1994;
Kauma et al., 1996). Le polymorphisme TaqIB du gène CETP influence l’activité de CETP et
les taux de HDL-C. Cependant, ce polymorphisme est peu probable qu’il soit fonctionnel par
lui-même et reflète plutôt l’effet d’un ou de plusieurs variants fonctionnels du gène CETP
(Corbex et al., 2000). En particulier, le polymorphisme TaqIB est en quasi complète
association avec le polymorphisme C-629A localisé sur le promoteur et qui influence
l’expression du gène et l’activité de la CETP (Dachet et al., 2000).
L’implication de ce polymorphisme dans les MCV est controversée. En effet, le
polymorphisme TaqIB est considérablement associé aux taux de HDL et aux MCV, dans
plusieurs études (Borggreve et al., 2006; Padmaja et al., 2009a) telle que l’étude Framingham
(Ordovas et al., 2000), l’étude VA-HIT= Veterans Affairs HDL-Cholesterol Intervention Trial
(Brousseau et al., 2002), alors qu’il n’y a aucune association entre le génotype de TaqIB et les
MCV, dans d’autres études (Kolovou et al., 2006; Tsai et al., 2008; Doğru-Abbasoğlu et al.,
2009).
- 90 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
LCAT
IV.4. La lécithine cholesterol acyl transférase (LCAT)
IV.4.1. Historique:
Des travaux de Glomset (1962) ont démontré qu’une enzyme plasmatique permettait
l’estérification du cholestérol par le transfert d’acide gras de la phosphatidylcholine vers le
cholestérol. Cette enzyme fut nommée Lecithin Cholesterol Acyl Transferase ou LCAT (EC
2.3.1.43). Peu de temps après sa découverte, Glomset a proposé que la LCAT puisse
promouvoir le TIC (Glomset et al., 1966; Glomset, 1986). Bien que le rôle de la LCAT dans
l’efflux du cholestérol à partir des cellules ait en grande partie été justifié, son rôle complet
dans la pathogénèse des MCV n'est toujours pas complètement compris, parce qu'il semble
dépendre d'autres gènes et facteurs exogènes.
IV.4.2. Structure du gène de la LCAT:
Le gène codant pour la LCAT a été cloné par McLean et al. en 1986 (McLean et al.,
1986a; 1986b). En 1987, Azoulay et al. ont localisé ce gène sur le chromosome 16q22.1 par
hybridation in situ. Le gène de la LCAT est composé de 6 exons avec une séquence codante
de 1,5 kb, mesure 4,23 kb et est transcrit en un ARNm de 1550 bases (figure 28, p.91)
(McLean et al., 1986a; 1986b).
Figure 28. Gène de la LCAT
(Source: http://droog.gs.washington.edu/parc/data/lcat/gene_model.html.)
Le gène humain de la LCAT couvre 4.23 kb d’ADN génomique, avec 6 exons et 5 introns.
IV.4.3. Structure de la protéine de la LCAT :
La LCAT est une glycoprotéine de 416 acides aminés ayant un poids moléculaire de
63kD. La protéine LCAT est traduite sous la forme d’un peptide de 440 acides aminés,
incluant un peptide signal de 24 acides aminés (McLean et al., 1986a).
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
LCAT
La séquence de la LCAT contient six résidus Cys, deux d'entre elles sont libres, Cys31
et Cys184. La Cys libre peut être localisée près du site actif, mais ne participe pas directement
au mécanisme catalytique (Francone and Fielding, 1991). Les quatre autres Cys forment deux
ponts disulfures, Cys50-Cys74 et Cys313-Cys356 (Yang et al., 1987). La boucle recouverte
par Cys50-Cys74 est essentielle pour la liaison de LCAT aux surfaces des lipoprotéines
(Adimoolam and Jonas, 1997; Jin et al., 1999).
La protéine LCAT possède quatre sites de N-glycosylation (Asn20, Asn84, Asn272 et
Asn384), deux sites d’O-glycosylation (Thr407 et Ser409) (Schindler et al., 1995) et les
groupes glucidiques représentent environ 25% de la masse totale de la protéine (Chong et al.,
1983). La LCAT est transportée dans le plasma et liée aux lipoprotéines, préférentiellement
aux HDLs mais aussi aux LDLs. La structure primaire de la LCAT est hautement conservée
à travers l’évolution des espèces, suggérant qu’une protéine entière est nécessaire pour
maintenir son activité enzymatique (Jonas, 2000). Les structures secondaire et tertiaire de la
LCAT n'ont pas encore été déterminées, mais la structure prédite par homologie avec la
lipase pancréatique suggère que la LCAT est formée de 7 domaines β parallèles ainsi que de
4 hélices α (figure 29 A, B, p.93) (Peelman et al., 1998). Le site actif de la LCAT a été
identifié par homologie avec d’autres lipases. La LCAT contient trois acides aminés
essentiels à son activité enzymatique, qui forment la triade retrouvée dans toutes les lipases.
Ces acides aminés sont la sérine en position 181 (Ser181), l’acide aspartique 345 (Asp345) et
l’histidine 377 (His377) (figure 29 A, p.93) (Peelman et al., 1999).
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
LCAT
Figure 29. Modèle structural et structure tridimensionnelle prédite de la LCAT
(Peelman et al., 1998).
(A) Modèle structural de la LCAT. Les localisations des résidus de la triade catalytique sont indiquées
par les points et les autres résidus du site actif sont indiqués par les étoiles (B) Structure
tridimensionnelle prédite de la LCAT
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
LCAT
IV.4.4. Expression et régulation du gène de la LCAT :
Chez les humains et les animaux expérimentaux l’ARNm de la LCAT est exprimé
principalement dans le foie, mais aussi, à des quantités moindre dans le cerveau et les
testicules (Warden et al., 1989; Hixson et al., 1993). L'expression de l’ARNm de la LCAT
change pendant le développement embryonnaire et post-natal des humains et des rats, mais
reste relativement constante avec l'âge chez les adultes (Warden et al., 1989). Chez les
poulets, le modèle lié au développement est saisissant. En effet, au début du développement,
les femelles ont des niveaux très élevés d’ARNm de la LCAT dans le foie et des niveaux non
détectables dans le cerveau; cependant, quand elles commencent à mettre des œufs, le modèle
change complètement. L’ARNm de la LCAT dans le cerveau augmente à un niveau 5 fois
plus élevé que dans le foie. Au contraire, chez des coqs adultes, l'expression de la LCAT dans
le cerveau reste plus basse que dans le foie (Hengstschläger-Ottnad et al., 1995).
Le gène LCAT est sous le contrôle d'un promoteur minimal contenant 71 pb qui
incluent une boîte TATA, deux sites de liaison Spl qui sont absolument exigés pour
l'expression et un motif LFAI (Warden et al., 1989). Le gène LCAT est régulé par plusieurs
facteurs de transcription comme Sp1, LF-AI, AP1, AP2, C/EBP et NF-κB (Sakai et al., 1997;
Feister et al., 2002). Il a été rapporté que Sp1 est un activateur de transcription puissant du
gène LCAT (Hoppe and Francone, 1998). Sp1 varie énormément dans différents types
cellulaires et pendant le développement (Saffer et al., 1991; Persengiev et al., 1996). Cela
pourrait, en partie, expliquer le modèle d’expression de l’ARNm de LCAT observé chez le rat
et le poulet aussi bien que dans le foie fœtal humain (Warden et al., 1989; HengstschlägerOttnad et al., 1995). De même Sp1 est exprimé à des niveaux différents dans le
développement gastrique (Saffer et al., 1991) et hématopoïétique (Minie et al., 1992) et
influence l’expression du gène dans ces cellules (Minie et al., 1992; Merchant et al., 1995).
Les effets du régime et des médicaments sur les niveaux de l’ARNm et l'activité de la
LCAT dans le plasma sont controversés. Les régimes riches en cholestérol et en graisse
n'affectent pas l'expression et l'activité de la LCAT dans plusieurs études portant sur des
humains, des lapins et des rats (Warden et al., 1989; Meijer et al., 1993), tandis qu'une étude a
observé une augmentation de 5 fois de l’ARNm de la LCAT chez des lapins alimentés avec
un régime riche en cholestérol (Murata et al., 1996).
Le traitement avec des hormones diverses (éthinylestradiol, L-thyroxine, hydrocortisone) et
des médicaments hypolipiméants (probucol, simvastatine, acide nicotinique) a peu ou pas
d'effet sur l’ARNm de la LCAT dans le foie de rat; seulement les fibrates diminuent
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
LCAT
l’expression hépatique d’ARNm de 50 % (Staels et al., 1992), tandis que les torcetrapib et
atorvastatine peuvent modestement augmenter les taux LCAT (Yvan-Charvet et al., 2007;
Kassai et al., 2007). Le sodium butyrate et le facteur de croissance TGF-β inhibent
l’expression de l’ARNm de la LCAT dans les des cellules hépatiques humaines HepG2 par un
mécanisme post-transcriptionel qui augmente la dégradation du pré ARNm (Skretting et al.,
1997). Un traitement avec l’endotoxine et le TNF réduit l'activité de la LCAT ainsi que
l’expression hépatique de l’ARNm de la LCAT chez des hamsters syriens ou des primates
(Ettinger et al., 1990; Ly et al., 1995).
IV.4.5. Méthode de dosage de la LCAT :
IV.4.5.1. Mesure de l’activité de la LCAT :
Il existe plusieurs approches pour mesurer l’activité de la LCAT. Elle peut être
évaluée in vitro grâce à la mesure du taux d’estérification du cholestérol. Ceci peut être fait en
mesurant le taux de formation d’esters de cholestérol dans des HDL (activité α-LCAT) ou des
LDL (activité β-LCAT) humaines purifiées et incubées avec le plasma du patient (Stokke and
Norum, 1971). Des substrats exogènes peuvent aussi être utilisés. Des protéoliposomes
synthétiques analogues au HDL contenant de l’apoAI sont souvent utilisés pour mesurer le
taux d’estérification du cholestérol (Chen and Albers, 1982a). Cette méthode permet
uniquement la mesure de l’activité α-LCAT.
L’activité in vivo de la LCAT peut être évaluée indirectement par la mesure du ratio
cholestérol libre/cholestérol total. Chez les individus normaux, le cholestérol libre représente
entre 25 et 35 % du cholestérol total. Chez les individus atteints du déficit familial de LCAT
(FLD), le cholestérol non-estérifié s’accumule dans le plasma et peut représenter jusqu'à 99%
du cholestérol total (Santamarina-Fojo et al., 2008; Baass, 2009).
IV.4.5.2. Mesure de la concentration de la LCAT :
Les mesures de la concentration de la LCAT dans le plasma par des méthodes
immunologiques bien établies sont les indicateurs les plus fiables de la masse circulante
sécrétés de la LCAT. Cependant, une méthode immunologique spécifique ne peut pas être
fiable pour LCAT avec une structure altérée ou un modèle de glycosylation distinct de la
préparation LCAT utilisée dans le développement des anticorps (Jonas, 1998). Kobori et al.
(2002) ont développé une ELISA basée sur une méthode sandwich impliquant deux anticorps
monoclonaux contre la LCAT humaine.
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
LCAT
IV.4.6. Rôle de la LCAT :
La LCAT est une enzyme plasmatique qui estérifie le cholestérol libre pour le
transformer en ester de cholestérol. Cette étape est fondamentale dans le processus du TIC.
C'est en effet sous sa forme estérifiée que le cholestérol est capté par le foie pour être excrété
en tant que cholestérol ou sous la forme d'acides biliaires dans la bile (Czarnecka and
Yokoyama, 1996; Calabresi and Franceschini, 2010).
IV.4.6.1. Rôle physiologique de la LCAT :
IV.4.6.1.a. Réaction enzymatique de la LCAT :
Le cholestérol sous sa forme estérifiée représente environ 75% du cholestérol
plasmatique total. L’estérification du cholestérol est une étape cruciale pour permettre le
transport efficace du cholestérol par les lipoprotéines. La LCAT possède deux activités
enzymatiques différentes nécessaires pour l’estérification du cholestérol plasmatique.
Une activité enzymatique d’une phospholipase A2 qui coupe un acide gras de la position
sn-2 de la phosphatidylcholine. Une autre activité acyltransferase (trans estérification) qui
permet le transfert de l’acide gras clivé vers le groupe hydroxyl 3β du cholestérol. Il en
résulte la formation d’esters de cholestérol et de lysophosphatidylcholine (figure 30, p.97)
(Glomset, 1986). Le substrat principal de la LCAT est le cholestérol des HDL car l’apoAI,
principalement retrouvée sur les HDL, est le plus important activateur de la LCAT
(Fielding et al., 1972). Le mécanisme exact par lequel apoAI active la LCAT n'est pas connu,
mais il y a une hypothèse qui présume que apoAI stabilise une conformation active de la
LCAT (Sviridov et al., 2000; Alexander et al., 2005). Il a été démontré que l’apoAII,
l’apoAIV, l’apoCII et l’apoCIII peuvent aussi activer la LCAT, mais avec une efficacité
moindre que l’apoAI (Jonas, 2000). La LCAT va aussi permettre l’estérification du
cholestérol des lipoprotéines contenant l’apoB telles que les LDL et les VLDL (Chen and
Albers, 1982b). L’activité LCAT sur les HDL se nomme activité α-LCAT, tandis que
l’activité LCAT sur les lipoprotéines contenant l’apoB (VLDL et LDL) se nomme activité βLCAT. Ces deux activités représentent 70% et 30% de l’activité LCAT plasmatique totale
respectivement. L'estérification du cholestérol est une étape cruciale dans la maturation des
HDL pré β discoïdaux en HDL α sphériques (Glomset et al., 1966).
- 96 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
LCAT
Figure 30. Activité enzymatique de la LCAT
(modifiée à partir de Rousset et al., 2009).
LCAT catalyse le transfert d’un acide gras ( R 2 ) de la position sn-2 de la phosphatidylcholine vers
le groupe hydroxyl 3β du cholestérol. Il en résulte la formation d’esters de cholestérol et de
lysophosphatidylcholine.
IV.4.6.1.b. Estérification du cholestérol libre par la LCAT :
Le métabolisme du cholestérol, après sa prise en charge par les préβ- HDL et son
transfert dans le compartiment intravasculaire, est lié à l’action d’une enzyme plasmatique : la
LCAT (figure 31, p.98). Cette enzyme est synthétisée principalement par le foie et circule
dans le plasma principalement associée aux particules HDL, dont la principale apo qui est
l’apoAI, est le cofacteur. La LCAT permet l’estérification du cholestérol libre. Le cholestérol
estérifié, devenu plus hydrophobe, pénètre dans le noyau de la particule qui augmente de
volume et accepte sur son enveloppe des phospholipides et des apo (Jonas, 2000). L’activité
de la LCAT participe alors à la constitution d’un noyau lipidique hydrophobe, riche en esters
de cholestérol, transformant les particules préβ-HDL petites et discoïdales en particules
α HDL grandes et sphériques. La réaction de trans-estérification, en consommant des
phospholipides et du cholestérol libre de la surface des HDL, va en outre permettre de
restaurer une certaine avidité des particules pour le cholestérol libre membranaire, entretenant
ainsi le mouvement monodirectionnel de cholestérol des tissus périphériques vers les HDL.
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LCAT
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
LCAT
Foie
HDL
mature
HDL
naissante
Macrophage
Figure 31. Le rôle de la LCAT dans le métabolisme de HDL
(Effectuée à partir de Calabresi and Franceschini, 2010)
La LCAT permet l’estérification du cholestérol libre. L’activité de la LCAT participe à la
transformation des particules préβ-HDL petites et discoïdales en particules α HDL grandes et
sphériques.
Les esters de cholestérol générés par la LCAT et localisés au cœur des particules αHDL
peuvent suivre deux voies métaboliques :

ils demeurent nichés au sein de la particule HDL porteuse jusqu’à leur prise en charge
par les tissus cibles, notamment le foie (car ils ne sont pas échangeables par diffusion
en raison de la phase aqueuse qui environne la particule) ;

ils sont transférés aux lipoprotéines plus légères en échange de TG. Cette réaction,
catalysée par la CETP, conduit en fait à rediriger les esters de cholestérol initialement
générés par la LCAT au sein des HDL vers les lipoprotéines contenant l’apoB
(principalement VLDL).
IV.4.6.2. Rôle pathologique de la LCAT :
La LCAT est une enzyme clé dans le maintien de l’homéostasie du cholestérol et la
régulation de son transport dans le sang, la plupart du cholestérol circulant sous forme d’esters
est générée par elle. Chez l’homme, le FLD et la maladie des yeux de poisson (Fish Eye
Disease ou FED), sont associés à l’accumulation de cholestérol dans les tissus et les
lipoprotéines, conduisant à des perturbations de leurs structures et de leurs compositions
(Kuivenhoven et al., 1997a; Calabresi et al., 2012). Cependant, il est difficile de tirer des
conclusions générales sur l'association entre la déficience en LCAT et le risque des MCV à
cause du faible nombre de sujets affectés, du manque de données cliniques détaillées sur les
- 98 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
LCAT
MCV pour la plupart d'entre eux et du manque de données prospectives sur la relation entre
l'activité plasmatique de la LCAT et les MCV dans la population.
IV.4.6.2.a. Déficit familial en LCAT:
Le déficit familial de LCAT (OMIM 245900) fût caractérisé par Norum et Gjones en
1967 dans une famille Norvégienne. Il s’agit d’une maladie autosomique récessive rare et de
prévalence inconnue. Cette maladie est caractérisée par une absence d’activité α-LCAT et βLCAT. Le cholestérol non- estérifié va s’accumuler dans des cellules spumeuses de plusieurs
tissus tels que la cornée, la rate, les reins, le foie, la moelle osseuse et les artères.
Cliniquement, cette maladie est caractérisée par une basse concentration de HDL-C
accompagnée d’une opacité cornéenne précoce bilatérale, d’une anémie normochrome
normocytaire, d’une protéinurie et d’une insuffisance rénale progressive (Santamarina-Fojo et
al., 2008 ; Baass, 2009). Au niveau biochimique, le diagnostic du déficit familial de LCAT se
fait lorsque l’absence complète d’activité LCAT est démontrée (activité α-LCAT et β-LCAT).
IV.4.6.2.b. Maladie des yeux de poisson:
Carlson et Philipson ont décrit cette maladie en 1979 (OMIM 136120). Cliniquement,
il s’agit d’une maladie qui ressemble par certains points au déficit familial en LCAT. Elle est
caractérisée par un HDL-C très abaissé et des opacités cornéennes précoces. Chez les sujets
atteints, le cholestérol se dépose dans la cornée, lui donnant un aspect inhabituel d'où le nom
de cette affection. Toutefois, cette maladie diffère du FLD par l’absence d’anémie ou
d’atteinte rénale et probablement par une augmentation du risque de MCV précoce, bien que
ceci demeure controversé (Rousset et al., 2009). Cette maladie est encore plus rare que la
FLD. La prévalence réelle est inconnue. L’activité LCAT chez les patients atteints de FED
est globalement normale et la concentration de cholestérol estérifié plasmatique est également
normale à cause de la perte sélective de l’activité α-LCAT, alors que l’activité β-LCAT est
maintenue (Carlson and Holmquist, 1985; Baass, 2009).
IV.4.6.2.c. LCAT et athérosclérose:
Le rôle de la LCAT dans l'athérosclérose humaine est controversé et n'a pas été
définitivement établi (Rousset et al., 2011; Kunnen and Van Eck, 2012; Ng, 2012). En effet,
certaines études ont annoncé soit une augmentation (Wells et al., 1986; Dullaart et al., 2008)
soit une diminution (Solajic-Bozicevic et al., 1991; 1994) soit aucun effet (Ruhling et al.,
1999) de l’activité LCAT chez des patients ayant des maladies coronaires. Ces résultats
contradictoires peuvent être potentiellement expliqués par l’interaction d’autres protéines et
- 99 -
LCAT
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
enzymes du TIC avec la LCAT lui changeant son effet sur l’athérosclérose. Par exemple, une
basse activité LCAT lorsqu’elle est liée aussi à des niveaux élevés de préβ-HDL est associée
aux maladies coronaires (Miida et al., 1996). Une autre explication possible pour les résultats
contradictoires est qu'il peut y avoir d'autres marqueurs biochimiques pour le processus
d’estérification du cholestérol qui est meilleur que l'essai d'activité LCAT in-vitro pour
évaluer le processus de maturation HDL (Dobiasova and Frohlich, 1996; Frohlich and
Dobiasova, 2003). Finalement, il est important de noter qu'il est impossible de déterminer à
partir d'études épidémiologiques si la LCAT joue un rôle positif ou négatif dans
l'athérosclérose.
IV.4.7. Développement de médicaments,
thérapeutique pour moduler l’activité de la LCAT :
comme
stratégie
Bien qu'un rôle clair de la LCAT comme un facteur anti-ou pro-athérogène n'ait pas
encore été bien établi, plusieurs efforts de développement de médicaments modulateurs de
l’effet de la LCAT ont récemment été commencés. Une approche de traitement, qui vient
d’être établi, est l'utilisation de la LCAT recombinante comme une thérapie pour FLD, ayant
le but principal d'empêcher ou renverser la maladie rénale (Rousset et al., 2010). Ce serait
analogue aux traitements de substitution d'enzymes qui sont utilisées pour traiter diverses
maladies de stockage lysosomale, comme la maladie de Gaucher et la maladie de Fabry
(Brady, 2006). D’anciennes études qui ont porté sur des patients avec FLD ayant reçu des
transfusions de plasma ont révélé que la LCAT a une remarquable longue demi-vie dans la
circulation, parfois entre 5 et 6 jours (Murayama et al., 1984; Norum and Gjone, 1986). La
capacité de la LCAT pour s'associer avec HDL explique probablement sa longue demi- vie.
Ces premiers rapports ont aussi montré qu'une quantité relativement petite de la LCAT, moins
de 10 % à 20 % que la normal, était suffisante pour ramener le profil lipoprotéinique des
sujets avec FLD à un profil normal. La perfusion de la LCAT dans le plasma de ces patients
augmente les concentrations des HDL-C et d’apoAI, et rétablit le rapport d’esters de
cholestérol/cholestérol total à un niveau presque normal pendant plusieurs jours. Le fait que la
LCAT est petite, une seule sous-unité de protéine à une concentration relativement basse (5
µg/mL) qui agit dans le compartiment plasmatique, peut être un bon candidat pour un
traitement de substitution par une enzyme recombinante (Rousset et al., 2011).
- 100 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
LCAT
IV.4.8. Mutations et polymorphismes touchant le gène de la LCAT :
Plus de 60 mutations ont été décrites sur le gène de la LCAT (Hirashio et al., 2010).
Certaines de ces mutations vont conduire à deux maladies autosomiques récessives rares :
FLD et FED. Les mutations causant le FLD et le FED sont représentées dans les figures 32a
et 32b (p.101) respectivement.
Figure 32a. Mutations de la LCAT causant le déficit familial de LCAT
(Baass, 2009)
Figure 32b. Mutations de la LCAT causant la maladie des yeux de poisson
(Baass, 2009)
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
LCAT
La LCAT n'est pas très polymorphe et seulement quelques études, examinant les
variantes génétiques du gène LCAT dans la population générale, ont été décrites. Il a été
rapporté que le polymorphisme P143L, associé à un bas HDL-C, peut être lié à une
augmentation du risque de la dyslipidémie et aux maladies coronaires chez une population
chinoise (Zhang et al., 2004). Trois autres polymorphismes du gène de la LCAT ont été
étudiés chez une autre population chinoise, le polymorphisme 608T semble être associé à une
élévation de HDL-C chez les patients ayant des maladies coronaires alors que les deux autres
(911T/C et 1188C/T) semblent être très rares chez cette population (Zhang et al., 2003). Il a
aussi été rapporté qu’un hétérozygote pour la mutation G30S semble être associé à
l’athérosclérose (Owen et al., 1996; Rosset et al., 2001). Au contraire, une étude brésilienne
n'a trouvé aucune association entre l’IDM et deux autres variantes de la LCAT, Arg147Trp et
Tyr171Stop (Izar et al., 2009). La mutation P10Q trouvée en Hollande ou la mutation de
T123I en Allemagne semblent être associées à la maladie coronaire prématurée, ayant pour
résultat le manque de maturation normale des HDL du au dysfonctionnement de la LCAT
(Funke et al., 1991; Kuivenhoven et al., 1995; 1996). Le manque d'une association claire entre
les polymorphismes de la LCAT et les maladies coronaires peut être simplement du au
manque de polymorphismes répandu dans la population, à la possibilité que les
polymorphismes n’altèrent pas l'activité LCAT et au fait que la variation totale dans le HDLC expliqué par les polymorphismes du gène de la LCAT semble être relativement petite.
Dans cette thèse, nous allons nous intéresser, particulièrement, à mettre en évidence
deux polymorphismes de la LCAT : le polymorphisme P143L (+511C>T) qui est une
transition de C en T causant ainsi une mutation non synonyme qui crée un nouveau site de
restriction MnlI, située sur l’exon 4 et à la mutation G30S (Gly→Ser) qui est une substitution
de G en A sur l’exon 2 au niveau du nucléotide 1729 chez notre population, afin d’étudier leur
association avec le risque coronaire.
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ApoAI
IV.5. L'Apolipoprotéine AI (ApoAI)
IV.5.1. Historique :
L’apoAI est une des premières apo qui ont été identifiées et caractérisées. La séquence
d'apoAI a été déterminée par Brewer et al. (1978), suivie du clonage et de la caractérisation de
son ADNc (Breslow et al., 1982; Cheung and Chan, 1983; Law et al., 1983) et de son ADN
génomique (Karathanasis et al., 1983; Shoulders et al., 1983).
IV.5.2. Structure du gène de l’apoAI :
Le gène de l’apoAI appartient à la superfamille multigénique des apo, qui comprend
trois gènes organisés en cluster de 17 kb environ, situés au niveau du bras long du
chromosome 11q23-q24 codants pour l’apoAI, l'apoCIII et l’apoAIV (figure 33, p.103)
(Cheung et al., 1984).
Figure 33. Structure du cluster des gènes de l’apoAI, l’apoCIII et l’apoAIV
(Li et al., 2008)
Le cluster des gènes de l’apoAI, l’apoCIII et l’apoAIV est de 17 Kb, situés au niveau du bras long du
chromosome 11q23-q24
Il a été suggéré que ces gènes ont une relation évolutive et proviennent de la même
séquence ancestrale (Groenendijk et al., 2001; Li et al., 2008). Le gène codant pour l’apoAI
est de 2Kb et comprend 4 exons et 3 introns (figure 34, p.104). L’exon 3 du gène de l’apoAI
code pour la région N-terminale d'apoAI mature (résidus 1-43) et les régions restantes sont
codées par l’exon 4 (Li et al., 1988).
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ApoAI
Figure 34. Représentation génomique de l’apoliporotéine AI
(Source : http://droog.gs.washington.edu/parc/data/apoa1/gene_model.html)
Le gène codant pour l’apoAI est de 2Kb et comprend 4 exons et 3 introns
IV.5.3. Structure de la protéine de l’apoAI :
L’apoAI est l’apo majoritaire des HDL et elle est aussi associée aux chylomicrons.
Chez les humains, la concentration plasmatique de l’apoAI est ~1 mg/mL, où 90-95 % sont
associés aux HDL (Rye et Barter, 2010). Elle est exprimée dans le foie et l'intestin grêle sous
forme de pré-pro-protéine de 267 acides aminés et secrétée dans le réticulum endoplasmique.
Après un clivage intracellulaire d'un peptide signal de 18 acides aminés, une pro-apoAI de
249 acides aminés est sécrétée dans le plasma, où une protéase plasmatique enlève un propeptide de six acides aminés. L’apoAI mature est donc une protéine de 243 acides aminés non
glycosylée avec une masse moléculaire de 28 kDa (Brewer et al., 1978).
La protéine ne présente pas des résidus Cys et isoleucine, cependant, elle contient 37 résidus
leucine, représentant 15% de son contenu d'acides aminés. L’apoAI contient 46 acides aminés
négativement chargés (glutamate et aspartate) et 37 acides aminés positivement chargés
(arginine et lysine), donnant naissance à un point isoélectrique théorique de 5.27 (Oda and
Ryan, 2007).
Les acides aminés de la position 44 à la position 243, correspondant approximativement à 80
% de la protéine, sont composés d'une série de dix hélices α amphipathiques répétées en
tandem (figure 35, p.105). Toutes les hélices contiennent 22 acides aminés, à l’exception des
hélices 3 et 9 qui sont composées de 11 acides aminés (Chan, 1989).
Une caractéristique de la séquence d'acide aminé de l’apoAI est la présence de 10 résidus
proline. À l'exception des trois résidus proline qui se trouvent au sein des premiers sept acides
aminés de l’apoAI mature, les autres prolines, situées aux positions 66, 99, 121, 143, 165, 209
et 220, sont espacées régulièrement pour délimiter des segments d'hélice α amphipathique
individuel (Oda and Ryan, 2007).
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ApoAI
Figure 35. Structure des hélices amphiphatiques de l’apoAI
(Brouillette et al., 2001)
Les acides aminés de la position 44 à la position 243, correspondant approximativement à 80 % de la
protéine de l’apoAI, sont composés d'une série de dix hélices α amphipathiques répétées en tandem.
IV.5.4. Expression et régulation du gène de l’apoAI :
L’expression hépatique du gène de l’apoAI est dirigée par le promoteur proximal de
cette apo, mais ce n’est pas le cas de l’expression intestinale qui nécessite la présence
d’éléments, situés dans la région intergénique apoCIII/apoAIV, nécessaires et suffisants pour
diriger l’expression du gène de l’apoAI dans l’intestin (Ribeiro et al., 2000; Li et al., 2008).
Plusieurs éléments régulent l’expression du gène négativement ou positivement en
réponse à des changements hormonaux ou métaboliques (Mooradian et al., 2004). Il a été
montré que plusieurs hormones stimulent la transcription du gène de l’apoAI. A titre
d’exemple, les hormones thyroïdiennes, les rétinoïdes, les œstrogènes et les glucocorticoïdes
induisent l’activité du promoteur et l’expression du gène de l’apoAI (Hargrove et al., 1999).
Les hormones thyroïdiennes ainsi que les rétinoïdes agissent directement sur le promoteur de
l’apoAI par le biais de leurs récepteurs nucléaires. Les glucocorticoïdes quant à eux stimulent
la liaison des activateurs de la transcription au promoteur, tel que le HNF, conduisant à une
augmentation de la transcription. De même l’œstradiol stimule l’interaction entre HNF3-β et
le HNF4 avec le promoteur de l’apoAI (Harnish et al., 1998). En outre, il existe plusieurs
répresseurs transcriptionels dont le rôle est de diminuer la transcription du gène de l’apoAI
tels que l’ARP-1 (ApoAI repressor protein-1) et HNF4 (Taylor et al., 1996).
Il existe un motif qui intervient dans la régulation de la transcription du gène de
l’apoAI appelé IRCE (Insulin Response Core Element). Cet élément se lie au facteur
ubiquitaire de transcription (SP1); il est responsable de l’induction du gène de l’apoAI par
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ApoAI
l’insuline. Ainsi, l’expression de ce gène est soumise à une régulation faisant intervenir
plusieurs hormones et voies de signalisations métaboliques (Murao et al., 1998).
IV.5.5. Rôle de l’apoAI :
IV.5.5.1. Rôle physiologique de l’apoAI :
L’apoAI joue un rôle important dans le TIC. D’une part, elle est le premier activateur
décrit de la LCAT, et d’autre part, elle interagit avec le transporteur ABCA1 et le récepteur
SR-BI induisant l’efflux de cholestérol vers le foie. (Gelissen et al., 2006). Les domaines de
l’apoAI qui affectent ces diverses fonctions biologiques sont en couleurs dans la figure 36
(p.106).
Figure 36. Structure secondaire et propriétés de l’apoAI
(Modifiée à partir de Zannis et al., 2007).
Les cylindres représentent les 10 hélices-α amphipathiques. Les hélices-α amphipathiques prévues
sont en blanc et les régions α-hélicoïdales supplémentaires qui ont été observées par cristallographie
aux rayons X sont en noir. Les couleurs violet et bleus indiquent respectivement les régions
d’interactions de l’apoAI avec l’ABCA1 et la LCAT. Le rouge indique la région associée avec
l’inhibition de l’activité de PLTP et la dyslipidémie. Le vert ainsi que les astérisques en vert indiquent
les régions et les acides aminés associés à l’hypertriglycéridémie. Les astérisques gris indiquent les
acides aminés impliqués dans l’interaction de l’apoAI avec SR-BI. (Nolte and Atkinson, 1992;
Borhani et al., 1997; 1999)
- 106 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ApoAI
IV.5.5.1.a. ApoAI et activation de la LCAT :
L’apoAI est le cofacteur enzymatique le plus puissant et nécessaire à l’activation de la
LCAT qui catalyse l’estérification du cholestérol associé aux HDL (Fielding et al., 1972).
Cette activation dépend fortement de l’état de conformation de l’apoAI. Le domaine Nterminal (résidus 1-43) de l’apoAI est important pour la stabilité de la protéine et module
indirectement l’interaction avec la LCAT (Frank and Marcel, 2000). Les domaines C-terminal
et central de l’apoAI semblent aussi intervenir dans l’activation de la LCAT. En effet,
plusieurs études ont rapporté que le domaine central de l’apoAI est essentiel pour la liaison et
l'activation de la LCAT (Sorci-Thomas et al., 1993; 2000; McManus et al., 2000; SorciThomas and Thomas, 2002). L'analyse de la conservation d'acides aminés parmi les espèces
dans les hélices 5, 6 et 7 de l’apoAI (ou des résidus aux positions 121-142, 143-164 et 165186, respectivement) a identifié plusieurs acides aminés fortement conservés, dans cette
région. Il a été suggéré que ces résidus fonctionnent soit par la formation d'interactions
électrostatiques directement avec la LCAT soit par la formation d’un pont de sel intrahélicoïdal dans le domaine central de l’apoAI qui interagit avec la LCAT (Roosbeek et al.,
2001; Alexander et al., 2005).
Maiorano et al. ont aussi rapporté que les hélices 5, 6 et 7 de l’apoAI (les acides aminés en
positions 130-174) sont importantes pour l'activation de la LCAT puisqu’elles sont plus
exposées aux solvants comparées à d'autres hélices dans l’apoAI liée aux lipides (Maiorano et
al., 2004). Sorci-Thomas et al. ont démontré que l’enlèvement de l'hélice 6 ou 7 (acides
aminés en position 143-164) (Sorci-Thomas et al., 1993; 2000; Sorci-Thomas and Thomas,
2002), ou le remplacement de l'hélice 6 par l'hélice 10 (acides aminés en position 220-241),
ou l’inversement de la face hydrophobe de l'hélice 6 (Sorci-Thomas et al., 1998), peut causer
une réduction de la liaison de la LCAT à la particule HDL recombinante (HDLr), aussi bien
que la réduction de la vitesse maximale apparente de la réaction. Sviridov et al. ont aussi
étudié le rôle de l’hélice 6 de l’apoAI, spécifiquement les acides aminés en position 140-150,
sur la capacité du HDLr à activer la LCAT. Leurs résultats ont suggéré que ces acides aminés
sont essentiels pour l'activation de la LCAT (Sviridov et al., 2000).
L'activation de la LCAT a été aussi sévèrement affectée par des mutations touchant l'hélice 6
de l’apoAI (ApoAI [Arg160Val/His162Ala]) comme définies dans la figure 36 (p.106)
(Chroni et al., 2005). Ces mutations semblent abolir la capacité de l’apoAI à activer la LCAT
in vitro. Il a aussi été rapporté que le domaine C-terminal de l’apoAI est impliqué dans
l’activation de la LCAT ((Reardon et al., 2001; Laccotripe et al., 1997). Une étude sur des
souris déficientes en apoAI a été rapporté, afin d’identifier le rôle du domaine C-terminal de
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ApoAI
l’apoAI de 32 acides aminés (hélices 9-10) dans la biogenèse des HDL (Reardon et al., 2001).
Cette étude a montré que les mutants ayant une substitution de résidus hydrophobes dans la
région 211 à 229 du domaine C-terminal de l’apoAI, sont associés à des concentrations basses
de HDL et à une diminution de la formation de particules discoïdales de HDL, indiquant
qu’ils ont un défaut dans leur conversion en HDL sphériques et matures. Ces résultats ont
donc montré que les résidus hydrophobes du domaine C-terminal de l’apoAI (hélices 9-10)
peuvent jouer un rôle important dans l'activation in vivo de la LCAT et par la suite dans la
maturation des HDL (Reardon et al., 2001).
IV.5.5.1.b. Interaction entre ApoAI et ABCA1 :
L’ABCA1 permet l’efflux de phospholipides et de cholestérol cellulaires vers l’apoAI
sans lipide et à d'autre apo et peptides amphipathiques, mais pas aux particules HDL
sphériques (Wang et al., 2000; Remaley et al., 2001). Quand les cellules sont épuisées en
cholestérol, ABCA1 favorise l’efflux de phospholipides à l’apoAI, permettant la formation de
particules apoAI riches en phospholipides, qui peuvent à leur tour permettre l’efflux du
cholestérol par ABCA1 à partir des cellules (Fielding et al., 2000; Wang et al., 2001).
D’après plusieurs études, il a été proposé trois modèles pour décrire les interactions
entre apoAI et ABCA1 dans l’efflux de lipides. Le premier modèle suppose qu'il n'y a aucune
association directe entre ABCA1 et apoAI. C’est une interaction indirecte selon laquelle
l’ABCA1 génère un domaine instable de la membrane riche en phospholipides
(particulièrement la phosphatidylsérine), au niveau du feuillet externe de la membrane
cellulaire. Ce domaine riche en phosphatidylsérine pourrait permettre la fixation de l’apoAI et
la lipidation ultérieure des hélices amphipathiques de l’apoAI (Chambenoit et al., 2001; Rigot
et al., 2002). Ce modèle de lipidation de l’apoAI, après sa fixation, implique l'extraction des
phospholipides et du cholestérol de la membrane par la micro-solubilisation (Vaughan and
Oram, 2003). Le deuxième modèle, désigné le modèle hybride, est une modification du
premier. Dans ce modèle, la fixation initiale de l’apoAI aux membranes se fait par le domaine
C-terminal de l’apoAI et par la suite la membrane attachée à l’apoAI s'associe avec ABCA1
qui transfère alors directement les lipides à l'apo (Panagotopulos et al., 2002). Le troisième
modèle d'association directe implique une interaction physique directe initiale entre apoAI et
ABCA1 (Fitzgerald et al., 2002; Wang et al., 2000) qui est suivi par le transfert de lipides
médié par ABCA1. Pour explorer le mécanisme de l’efflux des lipides cellulaire médié par
ABCA1 vers l’apoAI, des études ont exprimé, in vitro, le type sauvage de l’apoAI et de
nombreuses variantes portant des mutations ou des délétions. De nombreuses mutations
naturelles dans les boucles extracellulaires d'ABCA1 diminuent l’efflux de cholestérol (Rust
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ApoAI
et al., 1999; Brooks-Wilson et al., 1999) et il est probable que certains acides aminés mutés
peuvent représenter les sites d'interaction entre apoAI et ABCA1. Cependant, la nature de ces
interactions reste inconnue.
IV.5.5.1.c. Interaction entre SR-BI et ApoAI :
L’apoAI active l’efflux cellulaire du cholestérol par interaction avec différents
récepteurs tel que SR-BI (Liu et al., 2002). Elle joue un rôle de ligand du récepteur SR-BI,
ainsi ce dernier reconnait spécifiquement l’apoAI et libère dans la circulation des HDL moins
riches en esters de cholestérol (Lestavel et al., 2007).
Afin de comprendre comment l'interaction entre SR-BI et apoAI influence le transport de
lipides, Liu et al. ont montré que les mutations sur les hélices 4 ou 6 de l’apoAI réduisent
respectivement l’efflux de 79 et 51 %, sans altérer considérablement la liaison au récepteur.
SR-BI portant la mutation M158R se lie moins aux HDL reconstituées ayant une mutation sur
l’hélice 4 de l’apoAI; la mutation sur l'hélice 6 rétablit une forte liaison à SR-BI (M158R)
(Liu et al., 2002). Quelques mutations sur l’apoAI et/ou SR-BI peuvent aboutir à des liaisons
de haute affinité, mais non productives, qui ne permettent pas un efflux de cholestérol
efficace. Donc, un efflux de cholestérol efficace médié par SR-BI vers les lipoprotéines peut
exiger non seulement la liaison directe des lipoprotéines au récepteur (Gu et al., 2000), mais
aussi la formation d'un "complexe productif" (Liu et al., 2002).
IV.5.5.2. ApoAI et pathologies :
Plusieurs études épidémiologiques ont confirmé la corrélation négative entre la
concentration plasmatique de l’apoAI et les MCV (Kawashiri et al., 2000). Certes, la
surexpression de l’apoAI chez les souris transgéniques protège contre le développement de
lésions vasculaires. À l’inverse, l’inactivation du gène de l’apoAI chez la souris
s’accompagne d’une diminution de l’efflux du cholestérol des tissus périphériques vers le foie
(Schultz and Rubin, 1994). Cette corrélation négative entre les concentrations de l’apoAI et
l'incidence de MCV est généralement considérée comme étant due principalement à son rôle
dans le TIC, bien que d'autres activités potentiellement anti-athérogènes de l’apoAI et des
HDL ont été rapportées telle que l’activité anti-oxydante. En effet, l’apoAI inhibe l’oxydation
des LDL en les rendant résistantes à l’oxydation par les cellules de la paroi artérielle
humaines (Navab et al., 2000a, b). Il a été observé que lorsque l'apoAI était incubée avec les
cellules et ensuite enlevée avant l'addition des LDL, les cellules de la paroi artérielle étaient
alors incapables d'oxyder les LDL ajoutées. Ceci suggère que l’apoAI pourrait enlever des
cellules non seulement du cholestérol et phospholipides, mais peut être aussi des lipides
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ApoAI
oxydés (Hama et al., 1997). Garner et al. ont démontré que apoAI et apoAII peuvent réduire
les esters de cholestérol hydroperoxides via un mécanisme qui implique l'oxydation des
résidus méthionine spécifiques (Garner et al., 1998 a,b).
L’apoAI inhibe aussi l'accumulation et la neurotoxicité du peptide amyloid-β,
neurotoxine principale dans la maladie d'Alzheimer (Paula-Lima et al., 2009). Bien que
l'association entre les apo et la neurodégénération soit peu claire, il a été rapporté que
l’augmentation des concentrations de l’apoAI est corrélée avec une diminution du risque de la
démence (Saczynski et al., 2007), augmentant la possibilité d'un nouveau rôle de l’apoAI dans
les mécanismes physiologiques de la protection contre des troubles neurologiques
dégénératifs.
Les changements de la structure de l’apoAI induite par l'oxydation semblent altérer
son interaction avec les protéines clées impliquées dans le TIC (tels que LCAT et ABCA1) et
sa capacité à intervenir dans l’élimination du cholestérol de la lumière artérielle (Shao et al.,
2008). En effet, il a été rapporté que l’oxydation de Met 148 par la myéloperoxidase (MPO)
détériore la capacité de l’apoAI à activer la LCAT (Shao et al., 2008), en perturbant la boucle
centrale et la conformation de l’hélice 6 de l’apoAI qui sont essentielles pour l’activation de la
LCAT (Sorci-Thomas and Thomas, 2002). De plus, la nitrosylation spécifique et la chloration
de Tyr-192 de l’apoAI ont été aussi observés dans les HDL isolées des lésions
athérosclérotiques (Shao et al, 2005a). Il est suggéré que la nitrosylation survient à partir des
nitroperoxides dérivés du monoxyde d'azote et la chloration par l'action de la MPO. La
chloration de Tyr-192 de l’apoAI réduit la capacité d’ABCA1 à promouvoir l’efflux du
cholestérol (Shao et al., 2005a, 2006).
IV.5.6. Mutations et polymorphismes touchant le gène de l’apoAI :
Plusieurs mutations et polymorphismes qui touchent le gène de l’apoAI ont été décrits
(figure 37, p.111). Parmi les 46 mutations naturelles rapportées sur le gène de l’apoAI, 25
sont associées à des basses concentrations de HDL-C (Sorci-Thomas and Thomas, 2002;
Zannis et al., 1993). 17 de ces mutations réduisent la capacité de l’apoAI à activer la LCAT.
Ces mutations recouvrent les régions 107 à 235, mais sont groupées principalement sur les
alentours de l'hélice 6. Sept mutations entre les résidus 26 et 107 et une sur le résidu 173 sont
associées à de basses concentrations de HDL-C et à l’amylose familiale (Benson, 2005). De
telles mutations sont rares et habituellement associées au dépôt systémique de l'amyloïde dans
les tissus, responsable du dysfonctionnement rénal, hépatique, et cardiaque. En plus des
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ApoAI
mutations structurales de l’apoAI, l’apoAI plasmatique est sujet à des modifications posttraductionnelles qui altèrent ses fonctions (Zannis et al., 2006).
Figure 37. Les mutations de l’apoAI qui produisent des phénotypes pathologiques
(Modifiée à partir de Zannis et al., 2006).
Dans cette thèse, nous allons nous intéresser, particulièrement, à mettre en évidence
deux polymorphismes du gène de l’apoAI: les polymorphismes -75pb (G/A) (rs670) et +83pb
(C/T) (rs5069), en utilisant une seule paire d’amorce et la même enzyme de restriction (MspI).
En deuxième partie, nous étudierons l’association de ces deux polymorphismes avec le risque
de la sténose coronaire significative chez une population de coronariens.
IV.5.6.1. Les polymorphismes -75pb (G/A) et +83pb (C/T) :
Ces deux polymorphismes sont présents dans la région 5’ du gène de l’apoAI. Le
premier polymorphisme a lieu au niveau du promoteur, plus précisément à la 75 éme base en
amont du site + 1 d’initiation de la transcription entre la séquence CCACAT et la boite
TAAATA (Papazafiri et al., 1991), conduisant à une substitution d’une guanine (G) par une
adénine (A). Ce changement aboutit à l’abolition du site de l’enzyme de restriction MspI
(figure 38, p.112) (Ce site polymorphique est variable, il est indiqué à la position -75 pb, -76
pb ou -78 pb d’après d’autres études (Kamboh et al., 1996; Danek et al., 1998). Un deuxième
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
ApoAI
site polymorphique qui ressemble beaucoup au premier et qui a été identifié au niveau du
premier intron du gène de l’apoAI, et plus précisément au niveau de la 83 ème base, se traduit
par une substitution d’une cytosine (C) par une thymine (T), entrainant l’abolition du site de
restriction de l’enzyme de restriction MspI (figure 38, p.112) (Wang et al., 1994).
Figure 38. Les sites de restrictions de l’enzyme MspI
(Sigurdsson et al, 1992)
L’influence de ces polymorphismes sur les concentrations sériques de l’apoAI et du
HDL-C est controversée. Certaines études rapportent une augmentation significative (Jeenah
et al., 1990; Minnich et al., 1995), d’autres une diminution (Chhabra et al., 2005), alors que
certains auteurs n’ont retrouvé aucune association significative (Smith et al., 1992; Barre et
al., 1994; Padmaja et al. 2009b). De même l’implication de ces deux polymorphismes dans les
MCV est controversée. En effet, certaines études ont rapporté que ces deux polymorphismes
sont associés à une augmentation du risque des MCV (Wang et al., 1996b; Shioji et al., 2004;
Chhabra et al., 2005; Rai et al., 2008; Poduri et al., 2009), alors que Zou et al. (2003) ont
rapporté une diminution de ce risque chez une population chinoise. Cependant, d’autres
études n’ont pas rapporté d’association entre le polymorphisme -75G/A et les MCV (Petrovic
et al., 2000; Xiao et al., 2008).
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON
IV.6. Les paraoxonases (PON)
La famille des gènes des PON consiste en trois différents membres : PON1, PON2 et
PON3, alignés l'un à côté de l'autre sur le bras long du chromosome 7q21.3-22.1, chez les
humains (Primo-Parma et al., 1996). Ces trois gènes partagent considérablement une
similitude structurale et semblent avoir surgi par la duplication du gène d'un précurseur
évolutionnaire commun. Ils partagent une similitude approximative de 65% au niveau des
acides aminés et une similitude approximative de 70% au niveau des nucléotides (PrimoParma et al., 1996). D'un point de vue évolutionnaire, PON2 semble être le membre le plus
vieux, suivi par PON3 et ensuite PON1 (Draganov and La Du, 2004). Chez l’homme, la
PON1 est synthétisée dans le foie et sécrétée dans le sang, où elle est associée exclusivement
aux HDLs (Durrington et al., 2001). La protéine sécrétée conserve sa séquence ‘leader’
hydrophobe, qui est une condition structurale pour l’association de PON1 aux HDL (Hassett
et al., 1991; Sorenson et al., 1999). Comme PON1, PON3 est surtout exprimée dans le foie et
à un niveau bas dans le rein (Reddy et al., 2001). Chez les lapins et les humains, PON3 est
retrouvée dans le sérum associée aux HDL (Draganov et al., 2000; Reddy et al., 2001). PON2
n'est pas détectable dans le sérum, bien qu'elle soit exprimée dans plusieurs tissus, y compris
le cœur, le cerveau, le foie, le rein et les testicules (Ng et al., 2001) et elle peut avoir de
multiples formes d’ARNm (Mochizuki et al., 1998).
Des intérêts récents ont été dirigés vers une meilleure compréhension des fonctions de
PON2 et PON3, mais PON1 reste de loin la plus étudiée des trois enzymes.
Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés, particulièrement à la PON1 et à la
PON2. Nous avons étudié deux polymorphismes de la PON1 (L55M et Q192R) et deux autres
de la PON2 (S311C et A148G) et nous avons étudié leur association avec le risque coronarien
chez notre population d’étude.
- 113 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON1
IV.6.1. Paraoxonase1 (PON1)
IV.6.1.1. Historique :
En 1946, Abraham Mazur a été le premier à rapporter la présence d’une enzyme
capable d’hydrolyser les composés organophosphorés, dans les tissus des animaux. Ceci a
conduit à l’identification initiale de l’enzyme PON1 sérique humaine au début des années
1950 (Aldridge, 1953a; b). PON1 a été nommée après son habilité à hydrolyser le substrat
organophosphoré « paraoxon» ou diéthyl-4-nitophénol-phosphate (activité de la PON, EC
3.1.8.1), qui est un métabolite toxique de l’insecticide parathion (Van Himbergen et al.,
2006). PON1 pourrait aussi hydrolyser des esters aromatiques, comme le phenylacétate
(activité de l’arylesterase, EC 3.1.1.2). La PON1 appartient donc à la famille des estérases du
groupe A qui a la capacité d’hydrolyser les substrats organophosphorés (contrairement aux
estérases du groupe B, ceux qui sont inhibées par les organophosphorés (B-estérases), telles
que les cholinestérases ou les carboxylestérases) (Aldridge, 1953a; b). Ceci a mené, pendant
les années suivantes, à de grandes discussions sur le fait si une ou deux enzymes étaient
responsables de l’activité de la PON et de l’arylestérase (La Du, 2002), mais finalement, il a
été conclu que l'activité de la PON ainsi que celle de l’arylestérase étaient les propriétés de la
PON1 (Sorenson et al., 1995). Quand Mackness et al., (1991) ont démontré que la PON1
pourrait empêcher l'accumulation de lipoperoxydes dans les LDL, d’où l’association de la
PON1 avec les MCV, l'intérêt scientifique sur l’étude de la PON1 a augmenté.
IV.6.1.2. Structure du gène de la PON1 :
Le gène codant pour la PON1 appartient au chromosome 7 chez l’homme et au
chromosome 6 chez la souris (Primo-Parma et al., 1996; Li et al., 1997). Il est situé à
proximité de deux gènes codant pour des protéines homologues PON2 et PON3. Le gène
PON1 a une taille d’environ 26 kb et comprend neuf exons et huit introns (figure 39, p.115)
(Clendenning et al., 1996). Les gènes PON1 et PON3 seraient apparus par duplication du gène
PON2. Des segments de séquences de lactonohydrolases sont similaires à ceux des PON1, 2
et 3 (Kobayashi et al., 1998), or il a été établi que les PON1 et 3 ont une activité
lactonohydrolase (Jakubowski, 2000; Billecke et al., 2000; Biggadike et al., 2000). La famille
de gènes des PON pourrait donc avoir évoluée à partir de gènes ancestraux codant pour des
enzymes capables d’hydrolyser les lactones.
- 114 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON1
Figure 39. Le gène de la paraoxonase 1
(Source: http://pga.gs.washington.edu/data/pon1/)
Le gène PON1 a une taille d’environ 26 kb et comprend neuf exons et huit introns
IV.6.1.3. Structure de la protéine PON1 :
La PON1 est une estérase calcium-dépendante qui est présente dans le sérum et les
tissus humains à la surface des HDL (Marsillach et al., 2008; La Du, 1996). C’est une
glycoprotéine de 354 acides aminés avec un poids moléculaire de 43 kDa (Humbert et al.,
1993). Sa concentration dans le plasma est d’environ 60 mg/L et varie entre les individus. Elle
est fortement conservée chez les mammifères, mais absente chez les poissons, les oiseaux et
les invertébrées, comme les arthropodes. Il y a trois résidus nucléotidiques supplémentaires
dans l’exon 4 codant pour l’acide aminé 105 comparé à PON2 et PON3. L’ADNc de PON1
code pour une protéine de 355 acides aminés de laquelle, seulement le résidu méthionine est
enlevé pendant la sécrétion et la maturation. La conservation de la séquence leader est exigée
pour l'association de PON1 avec les particules HDL et chez l’homme, la PON1 sérique est
entièrement associée aux HDL (Vekic et al., 2007).
La structure cristalline montre que PON1 est un β-propulseur à six lames, chaque lame
comporte quatre β-feuilles (Harel et al., 2004). Deux Cys (Cys42 et Cys353) sont situées à
chacune des extrémités de la protéine et sont liées par un pont disulfure qui stabilise la
structure. La troisième Cys est située en position 283, au centre de la molécule et pourrait
représenter le site actif biologique de l’enzyme (Sorenson et al., 1995) (figure 40, p.116).
La PON1 est une métalloenzyme renfermant deux atomes de calcium qui se trouvent dans le
tunnel central de l'enzyme, un au sommet (Ca1 : calcium1) et un dans la partie centrale (Ca2 :
calcium2). Ca2 est un élément essentiel à la stabilité structurale, dont la dissociation mène à
une dénaturation irréversible et est considéré comme le ‘calcium structural’. Ca1 participe
directement à la catalyse et est assigné comme ‘le calcium catalytique’ (Kuo and La Du,
1998).
PON1 exprimée dans les cellules animales est glycosylée (Draganov and La Du,
2004). La glycosylation n'est pas l'élément essentiel pour les activités hydrolytiques des PONs
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Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON1
(Aharoni et al., 2004; Josse et al., 1999), mais elle peut être importante dans l'augmentation de
leur solubilité et stabilité, ou dans la prévention des liaisons non spécifiques aux membranes
cellulaires. Il y a quatre sites N-glycosylation potentiels sur PON1 (des sites NX (S/T)). Deux
(Asn227 et Asn270) sont dans le tunnel central et sont en grande partie inaccessible au
solvant. Les deux autres (Asn253 et Asn324) sont localisés sur la surface des boucles et sont
le plus probablement des sites de glycosylation de PON1 (Josse et al., 1999). Le site Asn253,
un des deux sites de glycosylation de PON1 est absent dans PON2 et PON3 par suite d'un
changement de la troisième position de la séquence consensus NX (S/T) de thréonine à
asparagine ou aspartate. D'autres résidus ou groupes de résidus semblent être spécifiques pour
chaque sous famille (comme dans la région des positions 20-50). Ceux-ci peuvent être liés
aux rôles non hydrolytiques de PONs et à leur localisation (par exemple, PON1 et PON3 sont
exclusivement localisées dans le foie et dans les HDL, tandis que PON2 se trouve dans
plusieurs tissus (Harel et al., 2004).
Figure 40. Structure générale de PON1 (Harel et al., 2004).
(a) Vue d'en haut des six lames. Le sommet est, selon la convention, la face portant les boucles
connectant la ß-feuille extérieure de chaque lame (D) avec la feuille intérieure (A) de la lame suivante
(Scharff et al., 2001). Les terminaisons N et C sont montrées, ainsi que les deux atomes de calcium
dans le tunnel central (Ca1, vert; Ca2, rouge). (b) Une vue de côté, y compris trois hélices au sommet
(H1-H3). Les résidus N-terminal 1-15 et la surface de la boucle connectant des lames 1B et 1C (des
résidus 72-79) ne sont pas visibles dans la structure.
- 116 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON1
IV.6.1.4. Expression et Régulation de PON1:
L’expression du gène de la PON1 est à l’origine de sa synthèse mise en évidence dans
plusieurs tissus tels que le poumon, le cerveau, le pancréas et le placenta (Hegele, 1999), mais
elle est principalement synthétisée dans le foie. Il a été démontré que les concentrations
sériques ou les activités enzymatiques de PON1 peuvent changer dans des conditions
pathologiques diverses. Cependant, le mécanisme régulateur de l’expression de PON1 dans le
foie reste peu clair.
La séquence en amont (upstream) de PON1 ne contient pas la boîte TATA, mais
contient un site consensus Sp1 (-103/-112) qui semble être important pour le début de
transcription. L'interaction entre Sp1 et la PKC peut être un mécanisme clé pour la régulation
de Sp1 dans la transcription PON1 (Osaki et al., 2004). L’IL-1ß et le TNF-A répriment, mais
l’IL-6 augmente la transcription du gène de la PON1 dans les cellules HepG2. Cette
différence dans la régulation du gène de la PON1 dans des cellules HepG2 en réponse aux
diverses cytokines peut contribuer au changement de la concentration sérique de la PON1
selon la cytokine exprimée dans chaque maladie (Kumon et al., 2003).
IV.6.1.5. Modulation de l’activité PON1:
Plusieurs études ont été effectuées afin d'identifier les habitudes alimentaires et de
style de vie comme modulateurs de l'enzyme. Des facteurs d’athérosclérose connus pour être
protecteurs ou de risque ont été évalués pour leurs effets sur PON1 :
IV.6.1.5.a. Âge:
Un certain nombre d'études ont montré que l'activité PON1 diminue avec l'âge (Seres
et al., 2004; Marchegiani et al., 2006; 2008). Il a été rapporté que les personnes âgées ont une
réduction de la capacité anti-oxydante de PON1 (Seres et al., 2004). Le polymorphisme
PON1-Q192R semble jouer un rôle dans cette perte d'activité due au vieillissement. Les
homozygotes QQ se trouvent associés à une perte plus importante de l'activité enzymatique
(Senti et al., 2001).
IV.6.1.5.b. Facteurs diététiques :
L'activité PON1 a été négativement corrélée avec la consommation de légumes
(Rantala et al., 2002), des fibres hydrosolubles et β-carotènes, sachant que ces habitudes
alimentaires sont bien identifiées pour leurs effets bénéfiques pour la santé (Kleemola et al.,
- 117 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON1
2002). La variabilité génétique de la PON1 semble avoir un impact sur la réponse à un régime
riche en végétaux (Rantala et al., 2002). Cependant, la quercétine, un flavonol fréquemment
retrouvé dans les fruits et les légumes, pourrait augmenter l'expression du gène et de la
protéine PON1 dans le foie de la souris, mais aucun effet n'a été trouvé sur l'activité PON1
chez l'homme (Boesch-Saadatmandi et al., 2010).
L'acide oléique, acide gras mono insaturé présent essentiellement dans huile d'olive, est
associé à une activité élevée de PON1. Selon une étude effectuée sur un groupe de femmes
saines, il a été montré que des repas riches en graisse avec une quantité plus élevée en lipides
oxydés causent une baisse significative de l'activité PON1 (Rantala et al., 2002), ce qui est en
accord avec des études in vitro où PON1 s'est avérée être inactivée par les lipides oxydés et
les LDLox (Van Himbergen et al., 2005).
IL a été montré que PON1 est inactivée par le stress oxydant. Les vitamines antioxydantes C et E sont associées à une activité PON1 élevée (Jarvik et al., 2002). Ces
observations peuvent être expliquées par une meilleure défense anti-oxydante, ayant pour
résultat la protection de PON1. La vitamine A montre aussi un potentiel anti-oxydant et
pourrait avoir, donc, un impact bénéfique sur le statut PON1 (Ahlemeyer et al., 2001). Quand
des rats ont été soumis à un régime déficient en vitamine A (pro-oxydatif), une réduction de
HDL-C et de l’activité PON1 ont été observées. La supplémentation en vitamine A a
normalisée les valeurs du HDL-C et de l'activité PON1 (Gatica et al., 2006).
IV.6.1.5.c. Agents pharmacologiques :
Il a été montré dans des études, in vitro et in vivo, que l’expression du gène de la
PON1 peut être affectée par le fénofibrate et les statines (Suehiro et al., 2000).
La consommation des régimes riches en polyphénols (resvératrol) est associée à des effets
cardiovasculaires bénéfiques en raison des propriétés anti-oxydantes des polyphénols. En plus
de leurs propriétés anti-oxydantes, les polyphénols (resvératrol) semblent aussi moduler
l'expression du gène de la PON1. Biologiquement, le resvératrol montre des propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires en empêchant la peroxydation des lipides, ainsi qu’une
diminution des TG et des LDL in vivo (Miura et al., 2003).
IV.6.1.5.d. Tabagisme :
Le tabagisme s'est avéré nuisible à l'activité PON1. Plusieurs études ont confirmé que
le tabagisme est associé à une basse activité PON1 (James et al., 2000; Ferré et al., 2003;
Senti et al., 2003a). En effet, l'extrait de fumée de cigarette semble inhiber l'activité PON1
- 118 -
PON1
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
plasmatique chez l’homme (Nishio and Watanabe, 1997). Les composés responsables de cette
inhibition sont les divers composants aldéhydes (acétaldéhyde, formaldéhyde et α, βaldéhydes insaturés, tels que l'acroléine et le crotonaldéhyde), ainsi que les hydrocarbures
aromatiques (Nishio and Watanabe, 1997). Les anciens fumeurs ont une activité et des
concentrations PON1 comparables à ceux des non-fumeurs, suggérant la réversibilité de l'effet
de la fumée de cigarette sur son activité (James et al., 2000). Senti et al., (2003a) ont rapporté
que les fumeurs qui font des exercices régulièrement ont une activité PON1 semblable à celles
des non-fumeurs, suggérant que l’activité physique atténuerait l'effet du tabagisme sur
l'activité PON1.
IV.6.1.5.e. Alcool :
Le mécanisme par lequel l'alcool peut abaisser le risque de développer les MCV est
mal compris. Van der Gaag et al. (1999) ont montré que le fait de boire 40 g/jour (4 verres)
d'alcool augmente l'activité et la concentration de la PON1. Il n'y a aucune différence entre le
vin rouge, la bière ou les spirits suggérant que ce ne sont pas seuls les polyphénols du vin
rouge qui causent l'effet. Des résultats similaires, rapportés par une étude qui a examiné l'effet
de boire de la bière alcoolisée comparé à la bière sans alcool, ont montré que seulement la
bière alcoolisée a un effet positif sur l'activité PON1 (Sierksma et al., 2002). Le fait de boire
modérément augmente de manière significative les concentrations de HDL-C et d'apoAI, ce
qui peut expliquer l'augmentation observée de la concentration de la PON1. L'augmentation
de l’activité PON1 peut être un des facteurs qui peuvent contribuer à la réduction du risque de
MCV chez les buveurs modérés.
Cependant, la consommation abusive d'alcool est associée à des niveaux élevés de lipides
hydro-peroxydés et de diverses enzymes hépatiques telles que l’alanine aminotransférase
(ALAT), l’aspartate aminotransférase (ASAT) et la gamma glutamyle transférase (GGT),
indiquant des dommages de foie. Simultanément, l'activité PON1 a été nettement diminuée
chez les buveurs abusifs d'alcool, ceci serait en partie lié à la capacité réduite des hépatocytes
à produire PON1 (Prakash et al., 2007).
IV.6.1.5.f. Produits chimiques environnementaux :
L'activité
PON1
dépend
complètement
du
calcium,
et
l'EDTA
supprime
irréversiblement son activité. Cependant, il a été montré que d'autres cations ont un effet
inhibiteur sur l'activité PON1. Le baryum, le lanthane, le cuivre, le zinc et le mercure
semblent inhiber l'activité PON1 dans le foie du rat ou de l’homme (Gonzalvo et al., 1997).
- 119 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON1
Des résultats semblables ont été obtenus dans une étude portant sur des individus porteurs de
PON1Q192, où un effet inhibiteur du manganèse, cobalt, cadmium et nickel a été aussi
identifié (Debord et al., 2003). Dans le cas de mercuriales et de cuivre, encore d'autres études
ont suggéré qu'un groupe de thiol libre sur le résidu Cys285 puisse être la cible moléculaire
(Gonzalvo et al., 1997; Debord et al., 2003).
IV.6.1.5.g. Le diabète :
Diverses études ont constaté que l'activité PON1 est réduite chez les patients
diabétiques de type 1 et de type 2 (Boemi et al., 2001). Le mécanisme de cette réduction est
mal compris, mais pourrait être un résultat de concentration accrue en glucose dans le sang.
La glycation peut inactiver PON1 et augmenter la peroxydation des lipides des HDL (Ferretti
et al., 2001). Une activité basse de PON1 a été observée chez les patients diabétiques de type
2 ayant une neuropathie et une rétinopathie. Il a été postulé que l'activité diminuée de PON1
liée au diabète peut jouer un rôle dans le développement des MCV.
IV.6.1.5.h. Autres maladies :
La basse activité de PON1 a aussi été observée dans un certain nombre de troubles
comme la stéatose alcoolique (Marsillach et al., 2007), l’hépatite-C (Ferré et al., 2005), les
troubles neurologiques comme le Syndrome de Guerre de Golfe, les états d’anxiétés (Hotopf
et al., 2003; Sklan et al., 2004) et la maladie d'Alzheimer (Paragh et al., 2002).
IV.6.1.6. Méthode de dosage de l’activité de PON1 :
L’activité enzymatique de la PON1 a été étudiée en fonction du type de substrat. En
effet, l’activité est dite paraoxonase lorsque l’enzyme utilise le paraoxon comme substrat alors
qu’elle est dite arylestérase quand elle utilise le phénylacétate ou encore lactonase quand il
s’agit de lactone : c’est la spécificité vis-à-vis du substrat (La Du, 1992).
La détermination de l’activité de la PON1 peut être réalisée sur sérum ou plasma héparinée
(Gugliucci et al., 2007; Toy et al., 2009). Les sérums et les plasmas sont récupérés après
centrifugation, aliquotés puis stockés à -80°C ou à -20°C. Les méthodes de détermination de
l’activité enzymatiques les plus utilisées sont des méthodes spectrophotométriques. Ces
méthodes ont permis de déterminer l’activité de la PON3, extraite à partir des microsomes du
foie. Elles utilisent du Tris/HCl 100mM comme tampon (pH=7.4) et du CaCl2 mM. La
réaction est étudiée pendant 2 min à 37°C par contrôle de l’apparition de p-nitrophénol à 405
nm (Rodrigo et al., 2003). La longueur d’onde est choisie en fonction du type du substrat
- 120 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON1
utilisé. En effet, le suivi de l’hydrolyse du paraoxon est réalisé à 405 nm alors que l’hydrolyse
du phénylacétate est suivie à 270 nm (Freynet et al., 2005).
IV.6.1.7. La sécrétion et l’association de la PON1 avec HDL et les
membranes cellulaires :
PON1 est synthétisée dans le foie et sécrétée dans le sérum. Deakin et al. (2002) ont
utilisé l'ovaire d’un hamster chinois comme modèle de culture cellulaire pour étudier les
mécanismes de sécrétion de la PON1. En absence de lipoprotéines, peu de PON1 a été
sécrétée. L’addition de micelles de phospholipides ou de HDL a stimulé la sécrétion, tandis
que les LDL et les lipides sans apoAI n’avaient aucun effet. Cela suggère que PON1 exige un
accepteur approprié pour sa sortie dans le sérum. HDL semble être l'accepteur physiologique
prédominant (Deakin et al., 2002). Il a été démontré que PON1 se lie aux HDL via sa
séquence signal N-terminale hydrophobe (Sorenson et al., 1999 ; Harel et al., 2004). PON1
peut être compétitivement enlevée des HDL par les phospholipides, ainsi elle peut se déplacer
entre HDL et autres secteurs riches en phospholipides, comme les membranes cellulaires
(Sorenson et al., 1999).
PON1 attachée à la membrane est active sur l’acétate de phényle. En présence de HDL, cette
activité est annulée, suggérant que les HDL puissent activement enlever PON1 de la
membrane cellulaire. La sécrétion de PON1 induite par les HDL est concentration dépendante
et saturable indiquant l’implication d’un récepteur (Deakin et al., 2002). Ce récepteur est le
SR-BI qui facilite l'association passagère de HDL avec la surface cellulaire. Il a un ligand
libre spécifique et il peut lier les apoAI et apoAII des HDL aussi bien que les micelles de
phospholipides (Krieger, 1999). La figure 41 (p.122) montre un modèle hypothétique de la
sécrétion de PON1, son association avec HDL et le transfert aux sites avec des dégâts
lipidiques.
- 121 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON1
Figure 41. Modèle proposé pour la sécrétion de PON1, son association avec HDL et son
transfert aux sites avec des dégâts lipidiques (Deakin and James, 2004).
(1) HDL es transitoirement attachée à la surface cellulaire via un récepteur. (2) PON1 ancré dans la
membrane cellulaire via son N-terminus hydrophobe est transféré à HDL dans des conditions nonéquilibrées où elle est stabilisée par apoAI. (3) PON1 entre dans l'espace intravasculaire avec HDL.
(4) Dans des conditions plus statiques favorisant la diffusion, PON1 pourrait transférer des
phospholipides dans des membranes cellulaires, probablement pendant le recrutement de cholestérol à
partir des cellules endothéliales ou des cellules de muscle lisse, obtenu par l’intermédiaire d’un
récepteur (5) PON1 peut donc avoir l'accès à l'interstitiel et aux secteurs d'accumulation de LDL et de
dégâts oxydatifs où elle pourrait protéger contre les effets indésirables de l’oxydation. Le peptide
signal N-terminal hydrophobe conservé est représenté par une ligne noire épaisse.
CE, Cellules endothéliales; SMC, Cellules musculaires lisses; MØ, macrophage; ECM, matrice
extracellulaire; Ox-LDL, LDL oxydées.
IV.6.1.8. Substrats de la PON1 :
Plusieurs études menées sur le substrat physiologique de PON1 sont nécessaires afin
de définir avec précision les fonctions de l'enzyme. Nombreux substrats possibles pour la
PON1 ont été étudiés. PON1 a une activité organophosphatase, qui explique sa capacité pour
hydrolyser les insecticides organophosphorés. PON1 a aussi une activité arylestérase,
l’acétate de phényle étant l'un de ses meilleurs substrats. En outre, PON1 a montré une bonne
activité de lactonase, hydrolysant beaucoup de lactones. Basé sur la spécificité de substrat
trouvé dans diverses expériences, il a été proposé que PON1 pourrait être principalement une
enzyme de lactonase et jouer spécifiquement un rôle dans les réponses anti-inflammatoires et
anti-oxydantes, puisqu'il y a beaucoup de métabolites oxydés des acides gras polyinsaturés
qui sont structurellement semblables aux lactones (Draganov et al., 2005).
- 122 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON1
Un autre substrat important pour PON1 peut être l’homocystéine thiolactone, formé
par la réaction de préparation de certain aminoacyl-ARNt Synthétases. L’homocystéinylation
de protéines peut mener à l’inactivation de protéine et à des dégâts cellulaires. L’activité
hydrolase de l’homocystéine thiolactone a été trouvée sur une protéine associée aux HDL qui
a été plus tard identifiée comme PON1 (Jakubowski, 2000). L’activité thiolactonase de PON1
est négativement corrélée avec N-homocystéinylation de protéines, suggérant une autre action
bénéfique de PON1 dans la prévention de l’athérosclérose (Perla-Kajan and Jakubowski,
2010).
IV.6.1.9. Rôle physiopathologie de la PON1 :
D’abord connue pour sa capacité à hydrolyser les composés organophosphorés (Costa
et al., 2003), sa localisation à la surface des HDL et ses propriétés anti-oxydantes sur les
LDLs ainsi que sa capacité à réduire la formation de cellules spumeuses (Aviram and
Rosenblat, 2004; Mackness et al., 1991), ont fait suspecter un rôle majeur de l’enzyme PON1
dans la physiopathologie de l’athérosclérose (Ng et al., 2008).
La fonction principale de la PON1 est d’inhiber l’oxydation des LDLs en détruisant
des phospholipides biologiquement actifs dans les LDLs modifiées par oxydation (Jaouad et
al., 2003). PON1 réduit significativement le rôle pro-inflammatoire des LDLox et leur
capacité à déclencher des interactions entre les monocytes et les cellules endothéliales (Navab
et al., 2001). Elle hydrolyse les composés associés aux LDLox, qui stimulent la production de
cytokines, IL-8 et des facteurs stimulants des colonies de monocyte et qui incitent l'adhésion
de monocytes à la surface endothéliale (Florentin et al., 2008). Cela implique le maintien de
l'activité antiathérogène des HDL par la PON1 et la réduction ultérieure des lipides oxydés
qui sont responsables de l'initiation de l’athérosclérose (Watson et al., 1995).
PON1 est principalement associée à une sous-fraction de HDL (HDL3, HDL2).
L'activité enzymatique de PON1 est aussi stabilisée et, augmentée par l'apoAI, le peptide
structurel de HDL (Deakin and James, 2004). Au cours de l'athérosclérose et la formation de
l’athérome, HDL est, à son tour, oxydée et subit plusieurs modifications (Deakin et al., 2007):
i) capacité réduite pour stimuler la sortie de PON1 de la cellule;
ii) capacité réduite pour activer l'activité d'enzyme PON1;
iii) perte de fonction principalement causée in vivo par la myeloperoxidase.
- 123 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON1
IV.6.1.10. Polymorphismes de la PON1 :
Le séquençage du gène entier PON1 humain a révélé plus de 200 SNPs (Draganov and
La Du, 2004). Nous nous sommes intéressés, dans cette thèse, à deux polymorphismes situés
dans la région codante de PON1, qui sont Q192R et L55M (figure 42, p.124).
Figure 42. Localisation des polymorphismes du gène PON1 dans la région codante et
dans le promoteur (chromosome 7q21.3) (Marchegiani et al., 2008).
IV.6.1.10.1. Le polymorphisme Q192R :
C’est une substitution en position 192 (glutamine/arginine) sur l’exon 6 (Q192R)
(rs662) (Adkins et al., 1993). Ce polymorphisme a été largement étudié, parce que les deux
alloenzymes ont des affinités et activités catalytiques différentes envers un certain nombre de
substrats. Le paraoxon est hydrolysé six fois plus rapidement par PON1-192R que par PON1192Q, tandis que l’allèle Q est plus actif pour le sarin, soman et diazoxon. Pour quelques
substrats, il n'y a aucune différence des activités hydrolytiques, comme l’acétate de phényle et
la dihydrocoumarine (Davies et al., 1996; Billecke et al., 2000; Li et al., 2000). L’altération
dramatique de l'activité enzymatique causée par le changement de ce seul acide aminé est
expliquée par la structure de l'enzyme. L'acide aminé R192 est un résidu important du site
actif (Harel et al., 2004). Le polymorphisme Q192R peut aussi altérer la capacité de l'enzyme
à protéger les LDL de l'oxydation in vitro, sachant que l’allèle Q semble être le plus
protecteur (Mackness et al., 1998; Aviram et al., 1998).
Plusieurs études ont rapporté que le polymorphisme PON1-192 semble être un FRCV (Gluba
et al., 2010; Wang et al., 2011; Mendonça et al., 2010; Mohamed et al., 2010; Kallel et al.,
2010); alors que d’autres ne rapportent aucune association (Ikeda et al., 2009; Mukamal et al.,
2009; Kaman et al., 2009). D’autres études ont montré que l’allèle R a un effet protecteur
(Kuremoto et al., 2003; Bhattacharyya et al., 2008).
- 124 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON1
IV.6.1.10.2. Le polymorphisme L55M :
C’est une substitution en position 55 (leucine/méthionine) sur l’exon 3 (L55M)
(rs854560) (Humbert et al., 1993). Ce polymorphisme n'affecte pas l'interaction de PON1
avec ses substrats, mais il est associé à une activité catalytique et une concentration basse de
l'enzyme (Blatter-Garin et al., 1997). Leviev et al. (1997) ont trouvé un taux bas d’ARNm de
PON1 chez les individus portant l’allèle M. Une analyse ultérieure a montré un déséquilibre
de liaison significatif avec le polymorphisme C(-108)T situé au niveau du promoteur du gène.
Leviev et James (2000) ont constaté que cette liaison n'a pas complètement expliqué l'effet de
L55M, qui est resté significatif quand le site -108 a été gardé constant, suggérant une
contribution de L55M qui est indépendante de C(-108)T. Brophy et al. (2001b) ont rapporté
une tendance vers une PON1 sérique plus élevée pour le génotype LL comparé à celui de MM
quand le site (-108) était homozygote CC. Leviev et al. (2001) ont montré précédemment que
l’allèle L55 est plus stable et résistant à la protéolyse, qui peut expliquer une partie de son
association avec une PON1 sérique élevée.
Concernant le polymorphisme PON1-M55L, plusieurs études ont rapporté que le génotype
MM est associé à une diminution du risque cardiovasculaire (Demirdogen et al., 2009; Kaman
et al., 2009; Rios et al., 2007; Oliveira et al., 2004); alors que d’autres n’ont pas rapporté
d’association (Wheeler et al., 2004; Troughton et al., 2008; Mukamal et al., 2009).
Le séquençage du promoteur du gène PON1 a mené à la découverte d'au moins 5
polymorphismes avec des degrés différents de leur influence sur l’expression de gène. Ces
polymorphismes sont localisés aux positions -909/907 (C ou G), -832/824 (A ou G),-162 (A
ou G),-126 (C ou G) et -108/-107 (C ou T) (figure 42, p.124) (Suehiro et al., 2000; Leviev and
James, 2000; Brophy et al., 2001a). Les différences dans la nomenclature sont dues aux
petites variations dans les séquences étudiées. Pour la simplicité nous leur font référence
comme ceci -909, -832 et -108.
Il ya un déséquilibre de liaison significatif entre tous les polymorphismes du
promoteur. L’analyse haplotypique de deux populations a montré que le polymorphisme C(108)T était le principal contributeur dans les variations sériques de PON1, représentant 23-24
% de la variation totale (Brophy et al., 2001b; Deakin et al., 2003a). Brophy et al. (2001b) ont
aussi rapporté une contribution légère (1.1% la variation totale) du site A(-162)G. Les sites
aux positions -909 et -832 ont fait peu ou pas de différence pour les taux sériques de PON1
(Brophy et al., 2001b; Deakin et al., 2003a).
Les essais faits sur le gène en utilisant des régions du promoteur de longueurs variables ont
- 125 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON1
montré qu'approximativement 200 pb de la région couvrant les polymorphismes -108 et-162
est suffisante pour la transcription du gène PON1 (Brophy et al., 2001b; Gouédard et al.,
2003 ; Deakin et al., 2003b). La délétion de cette région supprime complètement l'activité du
promoteur, indiquant que c'est une région régulatrice essentielle du promoteur PON1 (Deakin
et al., 2003b).
Comme le site -108 semble être le contributeur le plus significatif dans la variation de PON1,
il a été sujet de nouvelles études. Le polymorphisme est localisé dans le centre d'un site de
liaison consensus pour les facteurs de transcription omniprésents Sp1 et Sp3. Ce site
consensus est supprimé par la présence de la variante -108T (Brophy et al., 2001a; Leviev and
James, 2000). La liaison de Sp1 au site -108 est plus faible en présence de l’allèle T qu’en
présence de l’allèle C, suggérant un effet du polymorphisme sur la liaison de Sp1 (Deakin et
al., 2003a). Il y a des sites Sp1 multiples dans cette région du promoteur PON1, donc l'effet
du polymorphisme serait positionnel. La Co-transfection du promoteur PON1 avec un
plasmide exprimant Sp1 a abouti à une forte régulation de l’activité du promoteur, supportant
l'hypothèse que Sp1 est important dans l'expression de PON1 (Kumon et al., 2003).
Le polymorphisme -162 se trouve sur un site de liaison potentiel NF-1, avec une activité
élevée du variant A et une activité basse du variant G (Brophy et al., 2001a). Cela peut
expliquer l'effet du polymorphisme -162 sur l'expression de gène.
Il y a un déséquilibre de liaison significatif entre les polymorphismes du promoteur et
ceux de la région codante au niveau de L55M. Brophy et al. (2001b) a détecté un déséquilibre
de liaison entre -108C et le polymorphisme R192 de la région codante, qui est associé à une
faible protection contre les MCV.
- 126 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON2
IV.4.6.2. Paraoxonase2 (PON2)
IV.4.6.2.1. Structure du gène de la PON2:
Le gène humain de la PON2 est situé sur le bras long du chromosome 7q21.3, à côté
des membres PON1 et PON3 (Primo-Parmo et al., 1996) de la famille de gènes de PON. Basé
sur une analyse phylogénétique, il a été conclu que la PON2 est le membre le plus âgé de cette
famille de gènes (Hassett et al., 1991; Draganov and La Du, 2004). Approximativement 70%
et 65% des séquences nucléotidiques et de l'acide aminés de PON2 sont respectivement
semblables à ceux de PON1 et de PON3 (Primo-Parmo et al., 1996).
Le gène humain de la PON2 couvre 30 kb d’ADN génomique. Il se compose de neuf exons et
huit introns (figure 43, p.127) (Primo-Parmo et al., 1996).
Figure 43. Le gène de la paraoxonase 2
(Source: http://pga.gs.washington.edu/data/pon2/)
Le gène de la PON2 couvre 30 kb d’ADN génomique. Il se compose de neuf exons et huit introns
IV.4.6.2.2. Structure de la protéine PON2 :
PON2 est une protéine intracellulaire largement exprimée, de 355 acides aminées et
d’une masse moléculaire d'approximativement 43 kDa (Primo-Parmo et al., 1996 ; Ng et al.,
2001). Le gène PON2 contient de nombreux sites de début de transcription et peut être
alternativement épissé, ayant pour résultat plusieurs formes d’ARNm de PON2 (Mochizuki et
al., 1998); cependant, les données concernant les types de cellules qui expriment ces divers
isoformes de PON2 manquent. Jusqu'à maintenant, il a été généralement observé seulement
deux isoformes de la protéine PON2 de taille 40 et 43 kDa par l'intermédiaire
d'immunoblotting avec un anticorps anti-PON2 spécifique. Il a été considéré que ces deux
isoformes sont respectivement non-glycosylé et glycosylé, bien que les différentes fonctions
de ces isoformes n'aient pas été rapportées (Horke et al., 2007).
- 127 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON2
IV.4.6.2.3. Expression de la PON2 :
PON2 est largement exprimée dans plusieurs tissus, et il a été détecté la première fois
dans le cerveau, le foie, le rein, et le testicule (Mochizuki et al, 1998). Ng et al. ont détecté des
taux élevés des transcrits de PON2 dans le cœur, le poumon, le foie, le placenta, et le testicule
par rapport à d'autres tissus examinés. L'expression de PON2 a été également observée dans
les cellules endothéliales humaines immortalisées et primaires et dans les cellules spumeuses
artérielles humaines (Ng et al., 2001); cependant, la localisation sous-cellulaire de PON2
demeure ambiguë. Bien que les anciennes études aient réclamé que PON2 est une protéine
intracellulaire, l'évidence obtenue par l'intermédiaire de la microscopie confocale, du
fractionnement biochimique de cellules, et de la digestion des protéines externes de
membrane a indiqué que PON2 est situé dans l'enveloppe nucléaire et dans le réticulum
endoplasmique des cellules endothéliales vasculaires humaines EA.hy 926 (Horke et al.,
2007). Cependant, l’ARNm et la protéine PON2 ont été récemment détectés dans l'appareil
gastro-intestinal humain (Levy et al, 2007).
Donc, par contraste avec PON1 et PON3, qui sont exclusivement trouvées dans le foie et qui
sont associées aux HDL dans la circulation sanguine après leur sécrétion (Mackness et al.,
1996), PON2 est une protéine intracellulaire qui est largement exprimée dans plusieurs tissus,
y compris le foie, le rein, le poumon, le cœur, le placenta, les testicules, l'estomac, la rate, le
pancréas, l'intestin grêle, le muscle squelettique et les macrophages et qui ne se trouve pas
dans le plasma (Ng et al., 2001, Levy et al., 2007).
IV.4.6.2.4. Régulation de la PON2:
La plupart des études concernant l'induction de l’expression de PON2 par des stimuli
divers se sont concentrées sur le SO parce que PON2 joue un rôle d’antioxydant
intracellulaire. À la différence de PON1, les études in vitro ainsi qu’in vivo ont démontré que
l'expression et l'activité enzymatique de PON2 augmentent pendant le SO. En réponse au SO,
la régulation de PON2 est plus prononcée dans différents types cellulaires (cellules HepG2 et
macrophages), dans des modèles animaux (souris alimentés avec des régimes très gras et des
souris knock-out (KO) pour l’apoE et chez des patients hyper-cholestérolémiques (Shih et al.,
1996, 1998; Forte et al., 2002; Rosenblat et al., 2003, 2004). Les macrophages péritonéaux de
la souris qui ont été traités avec des agents divers qui induisent le SO, ont démontré une
augmentation de l'expression de PON2 et de l'activité lactonase (Rosenblat et al., 2003).
Shiner et al. ont rapporté une augmentation d’environ 7 fois de l'expression de PON2 pendant
- 128 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON2
la différenciation monocyte/macrophage qui dépend de la présence de la NADPH et ce
phénomène se trouve corrélé avec une augmentation du SO cellulaire (Shiner et al., 2004).
PON2 semble être aussi inactivée lorsque les niveaux du SO sont bas. Donc, les niveaux
élevés du SO peuvent inciter un mécanisme compensatoire cellulaire qui sur-régule
l'expression de la PON2 dans les macrophages (Shiner et al., 2006).
L’expression de PON2 a aussi été examinée dans des conditions pathologiques
communes, comme les troubles métaboliques qui sont caractérisés par une augmentation du
SO due aux taux élevés de cholestérol et de glucose. Une hypercholestérolémie chronique
semble causer une augmentation de l’expression de l’ARNm de PON2 hépatique chez la
souris (Forte et al., 2002). Dans une autre étude in vivo, des monocytes humains dérivés des
macrophages (MHDM) de patients hyper-cholestérolémiques, qui ont été soumis au SO, ont
montré des niveaux d'expression de la PON2 plus bas que ceux qui ont été détectés dans les
MHDM isolés de témoins (Rosenblat et al., 2004).
Un résultat semblable a été obtenu chez des souris diabétiques, qui ont démontré que la surrégulation cellulaire de PON2 dans les macrophages a été associée à une augmentation du SO
(Hayek et al., 2007). De plus, l’augmentation de l’expression de PON2 est aussi observée en
réponse à certains médicaments, comme la statine «atorvastatine» et l’antidiabétique
« rosiglitazone » (Rosenblat et al., 2004; Shiner et al., 2007b). Au contraire, les agents proinflammatoires, comme le lipopolysaccharide, semblent diminuer l'expression de PON2 dans
les cellules Caco-2/15 et dans l'intestin humain (Precourt et et al., 2009). L’acide
arachidonique, généralement considéré comme un acide gras pro-inflammatoire, augmente
l'activité et l’expression de l’ARNm de la PON2 dans les macrophages et diminue la
biosynthèse du cholestérol via les facteurs de transcription AP1 et PPAR-γ. Au contraire,
l’ARNm et l'activité de la PON2 sont diminuées dans les macrophages chez la souris Delta6désaturase KO (6-DS KO), qui ne peuvent pas convertir le précurseur acide linoléique en
acide arachidonique (Rosenblat et al., 2010).
L'athérosclérose est aussi une maladie inflammatoire et causée par le SO dans laquelle le
statut PON2 a été évalué. Dans des plaques athérosclérotiques et dans le tissu adjacent à ces
plaques, l'expression du gène de la PON2 a été diminué (Fortunato et al., 2008).
Le traitement des macrophages J774A.1 avec des antioxydants, comme le
butylhydroxytoluène, vitamine E et le punicalagin (ingrédient antioxydant majeur dans le jus
de grenade), augmente aussi l’activité PON2, mais sans aucun effet sur les niveaux de la
protéine. Les facteurs de transcription PPAR-γ et l'AP1 semblent être en partie responsable de
ces modifications, puisque l'incubation des macrophages avec les inhibiteurs de l'AP1 ou de
- 129 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON2
PPAR-γ empêche l'effet sur PON2 (Shiner et al., 2007a). Ces résultats ont montré que PON2
est fortement régulée par l'état oxydatif dans les macrophages, qui peut constituer un
mécanisme compensatoire pour aider à contrôler les ERO au niveau cellulaire.
Une étude fonctionnelle du promoteur de PON2 a révélé un facteur de transcription
obligatoire : sterol regulatory binding protein-2 (SREBP-2) DNA element qui est localisé
entre -593 pb et-575 pb du promoteur PON2 qui peut jouer un rôle majeur dans la régulation
de PON2 (Fuhrman et al., 2009; Lim et Kim, 2009).
IV.4.6.2.5. Dosage de l’activité de la PON2 :
PON2 est une enzyme intracellulaire qui n'est pas présente dans le sérum, au moins
dans les circonstances physiologiques normales. L'activité hydrolytique contre le
dihydrocoumarine dans des extraits tissulaires et dans des cellules cultivées est considérée
comme une évaluation indirecte acceptable de l'activité PON2 (Rosenblat et al., 2003; Shamir
et al., 2005). Cependant, PON1 hydrolyse aussi le dihydrocoumarine (Teiber et al., 2003) et,
pour cette raison, l'équivalence entre l'activité coumarinase (lactonase) et PON2 ne sera
considérée que si PON1 n’est pas localisée à l'intérieur des cellules. Néanmoins, une étude
(Marsillach et al., 2008) a démontré que, au moins dans le modèle de souris, l'expression de la
protéine PON1 est largement exprimé dans la plupart des tissus. Ce résultat met en doute
l'application de l'essai de coumarinase comme un indice fiable pour la mesure de PON2. Cette
question est encore au débat à l'heure actuelle (Camps et al., 2009a).
IV.4.6.2.6. Rôle physiopathologique de la PON2 :
La grande similitude structurelle de PON2 avec les autres membres de la famille PON
a montré qu'elle pourrait posséder une activité analogue à ceux de PON1 et PON3. En effet,
PON2 métabolise efficacement 1,5-lactone de l'acide 5-hydroxyéicosatétraénoïque et 4 hydroxy acide docosahexaénoïque, qui sont des produits d'oxydation respectifs de l’acide
arachidonique et de l'acide docosahexaènoïque et peuvent aussi être des substrats endogènes
pour PON2 (Draganov et al., 2005). Cependant, à la différence de PON1, PON2 est incapable
d’hydrolyser les organophosphorés, comme le paraoxon, bien qu'elle possède une activité
lactonase plus grande en comparaison à celles de PON1 et PON3 quand le dihydrocoumarin
et certains arylesters sont utilisés comme des substrats (Rosenblat et al., 2003; Draganov et
al., 2005).
- 130 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON2
Bien que PON2 ait une capacité anti-oxydatante plus basse que PON1 (Draganov et
al., 2005), plusieurs études de cette protéine ont été conduites en raison de son taux
d'expression élevée et de sa localisation ubiquitaire. Les études utilisant PON2 purifiée ou des
cellules sur-exprimant PON2 ont fourni des résultats semblables. La première démonstration
rapportée au sujet du potentiel anti-oxydatif de PON2 a été obtenue dans des cellules HeLa.
En effet, l'exposition de ces cellules, sur-exprimant PON2 au peroxyde d'hydrogène ou aux
phospholipides oxydés, semble diminuer le SO intracellulaire en réduisant les taux des ERO,
empêchant la peroxydation lipidique des LDL, renversant l'oxydation des LDL moyennement
oxydées (MM-LDL) et inhibant le chimiotactisme des monocyte induit par les LDLox (Ng et
al., 2001).
Les propriétés antiathérogènes de PON2 ont été évaluées chez des souris modifiées
génétiquement (Ng et al., 2006a; Ng et al., 2007). La surexpression de PON2 chez des souris
déficientes en apoE, qui ont plus de sensibilité au développement de lésions
athérosclérotiques, a montré une augmentation de la capacité anti-oxydante, démontrée par
des niveaux réduits de lipides hydroperoxides. Les LDL de ces souris semblent être moins
susceptibles aux modifications oxydatives et les HDL semblent être dotées d'une capacité
anti-oxydante élevée et montrent des capacités augmentées pour l’efflux du cholestérol à
partir des macrophages (Ng et al., 2006b). La preuve supplémentaire pour le rôle protecteur
important de PON2 contre le SO et le développement d'athérosclérose a été montrée en
utilisant des modèles de souris déficients en PON2 (Ng et al., 2006a). Ces souris montrent un
nombre élevé de cellules spumeuses et développent significativement plusieurs lésions
athérosclérotiques en comparaison avec des contrôles, quand ils sont soumis à un régime trèsgras pendant 15 mois. De plus, les LDL isolées de ces animaux semblent être plus
susceptibles à l'oxydation et incitent plus au chimiotactisme des monocytes.
PON2 peut aussi exercer une protection significative contre la biosynthèse et
l’accumulation de TG dans les macrophages, dans des concentrations élevées de glucose.
Cette étude suggère que l'effet protecteur de PON2 puisse contribuer à la diminution de
l’athérogénicité dans les macrophages et de la formation des cellules spumeuses, atténuant
ainsi le développement de complications vasculaires dans le diabète de type 2 (Rosenblat et
al., 2009; Meilin et al., 2010).
En outre, la capacité anti-apoptotique de PON2 semble jouer un rôle dans la protection
contre l’athérosclérose (Horke et al., 2007). La surexpression de PON2 dans les cellules
endothéliales humaines EA.HY 926 semblent protéger contre l’apoptose induite par le SO en
- 131 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON2
empêchant spécifiquement la génération de radicaux superoxydes au niveau de la membrane
mitochondriale intérieure (Horke et al., 2008; Altenhöfer et al., 2010).
IV.4.6.2.7. Polymorphismes de la PON2 :
Plusieurs polymorphismes sur le gène de la PON2 ont été rapportés jusqu'à présent;
cependant, seulement deux polymorphismes communs, de la région codante de la PON2
jouent un rôle majeur dans les conditions pathophysiologiques (figure 44, p.132). Nous nous
sommes intéressées dans ce manuscrit à ces deux polymorphismes qui sont :
IV.4.6.2.7.1. Les polymorphismes A148G et S311C :
Le polymorphisme A148G est une substitution d'une alanine en glycine (G) au codon
148 sur l’exon 5 (rs12026) et celui de S311C est une substitution d’une serine (S) en Cys (C)
au codon 311, sur l’exon 9 : (rs6954345) (Mochizuki et al., 1998).
Figure 44. Localisations de 19 polymorphismes de PON2 (Dasgupta et al., 2011).
Les exons sont en barre noire (les régions UTRs sont en gris) et les introns et les régions flanquées
sont en barre blanche.
Plusieurs études ont rapporté des variations dans les fréquences des polymorphismes
de gène de PON2 selon des groupes ethniques différents comme indiqué dans le tableau IV
(p.133). Basé sur les études actuelles, la plupart des populations portent l’allèle A du
polymorphisme A148G et l’allèle S du polymorphisme S311C.
- 132 -
PON2
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
Tableau IV. Distribution des polymorphismes A148G et S311C de la PON2
Populations (n)
Fréquence allélique
Fréquence allélique
au codon 148
au codon 311
Allèle A
Allèle G
Allèle C
Références
Allèle S
Basilienne (376)
0.6
0.4
0.29
0.71
Oliveira et al., 2004
Canadienne (324)
0.76
0.24
-
-
McKeown-Eyssen et
al., 2004
Chinoise (475)
0.826
0.174
0.173
0.827
Wang et al., 2003
Royaume-Uni (405)
0.73
0.27
0.26
0.74
Pasdar et al., 2006
Italienne (273)
-
-
0.198
0.802
Martinelli et al., 2004
Japonaise (2.210)
-
-
0.198
0.802
Yamada et al., 2003
0.7825
0.2175
0.2175
0.7825
Shin, 2009
0.51
0.49
0.612
0.388
Saeed et al., 2007
-
-
0.24
0.76
Slowik et al., 2007
0.766
0.234
-
-
Ranade et al., 2005
Coréenne (988)
Pakistanaise (370)
Polonaise (437)
Etats Unis (2.553)
À cause du potentiel anti-oxydatif et anti-athérosclérotique de PON2, plusieurs études
se sont intéressées à l'association de PON2 avec les MCV et d'autres troubles pathologiques,
comme le diabète de type 2, la maladie d'Alzheimer et la sclérose latérale amyotrophique
sporadique. Cependant, la plupart des études ont examiné les associations des
polymorphismes PON2 avec ces maladies plutôt que la relation entre l'activité PON2 et la
maladie. Ceci peut être du au fait que le vrai substrat biologique de PON2 reste inconnu.
Actuellement, l'activité de PON2 est déterminée à partir de l'hydrolyse du dihydrocoumarine
et la convenance de ce substrat est toujours soumise à des débats. La plupart des études ont
souligné alors l'association des polymorphismes PON2 avec des pathologies diverses dans des
groupes ethniques différents. Les résultats ont été controversés à cause des variations dans les
conditions expérimentales différentes, des appartenances ethniques et des emplacements
géographiques. De là, de nouvelles enquêtes sont souhaitables.
Le polymorphisme S311C semble être associé à plusieurs complications cardiovasculaires
(Sanghera et al., 1998; Pan et al., 2002; Martinelli et al., 2004; Su et al., 2005; Qin et al.,
2006; Marchegiani et al., 2009), tandis que le polymorphisme A148G semble être associé au
profil lipoprotéique dans certaines études (Oliveira et al., 2004; Shin, 2009). Cependant,
- 133 -
Chapitre IV: Les acteurs associés au métabolisme des HDL/
PON2
d’autres études ne rapportent aucune association de ces deux polymorphismes avec le risque
cardiovasculaire (Pan et al., 2002; Ranade et al., 2005; Chi et al., 2006; Xu et al., 2008).
Il a été récemment rapporté que le polymorphisme S311C dans la PON2 recombinante semble
causer une modification de la glycosylation et une détérioration de l'activité lactonase (Stoltz
et al., 2009).
- 134 -
Chapitre V: Matériels et Méthodes
Partie pratique
Matériels et Méthodes
V.I. Matériels :
V.I.1. Matériels, Réactifs et solutions utilisés:
Les matériels, réactifs et les solutions utilisés, dans la partie pratique, ont été présentés dans
l’annexe 1. (Voir annexe 1)
V.II. Méthodes :
V.II.1. Recrutement des sujets :
Nous avons recruté 316 patients ayant tous eu un événement coronaire (IDM, angor,
douleurs thoraciques) et qui ont été admis au service de cardiologie de l’Hôpital Universitaire
Sahloul, Sousse. Tous les patients ont bénéficié d’une coronarographie qui a permis de les
diviser en deux groupes :
 Groupe ayant une sténose coronaire significative positive (SCS+) : concerne ceux qui
ont un rétrécissement de la lumière artérielle ≥50% sur au moins une des coronaires
principales.
 Groupe ayant une sténose coronaire significative négative (SCS-) : concerne ceux qui
ont une sténose <50% sur toutes les artères coronaires.
Pour chaque patient une fiche de renseignement, a été remplie (voir annexe 2) et les
paramètres qui ont été recueillis à partir des dossiers cliniques ont été sauvegardés dans une
base de données. Nous avons exclu de l’étude toute personne ayant un traitement
hypolipémiant. L’autorisation du comité d’éthique de l’hôpital Universitaire Sahloul (Sousse)
et les consentements des malades ont été obtenus.
Pour chaque patient la pression artérielle a été prise après un repos de 10 minutes et le tour de
taille a été mesuré grâce à un ruban métrique placé sur la crête iliaque parallèle au sol, sans
compression de la peau, et le poids a été mesuré en Kg.
V.II.2. Coronarographie :
C’est une angiographie des artères coronaires réalisée par un cathétérisme rétrograde
de l’aorte. Il s’agit d’un examen non dénué de risque nécessitant des conditions de réalisation
bien particulières :
- 135 -
Chapitre V: Matériels et Méthodes

Partie pratique
Organisation logistique :
La coronarographie se déroule dans un centre hospitalier où il existe une unité de soins
intensifs de cardiologie. Le plateau technique comprend une salle spécialisée équipée par une
table de cathétérisme et un amplificateur de brillance connecté à une console informatisée
permettant un traitement numérisé des images angiographiques. La coronarographie, faite par
un cardiologue senior, se déroule en présence d’un infirmier et d’un technicien de radiologie.

Préparation et installation du patient :
La veille de l’examen, le patient assure un bon rasage bilatéral de l’ombilic au genou.
Le lendemain, le patient est installé, sur la table de cathétérisme. Après un badigeonnage
antiseptique large et une couverture du patient par des champs stériles, un introducteur artériel
est mis en place. Une sonde de cathétérisme coronaire à usage unique est alors introduite à
travers celui-ci. Une fois les ostia coronaires sont intubés, le produit de contraste est injecté et
l’opacification du réseau coronaire est alors affichée sur les différents écrans de la salle.
L’opacification des coronaires est répétée plusieurs fois sur différentes incidences
radiologiques. A la fin de l’examen, l’introducteur artériel est retiré et une compression
pendant 20mn du point de ponction artériel permet l’arrêt du saignement. Le patient est remis,
par la suite, à son lit, avec une surveillance du pouls artériel du membre ponctionné ; une
immobilisation du membre, pendant six heures, est nécessaire.
V.II.3. Classification de la sévérité de la SCS selon le score de Gensini:
Chez les patients, la sévérité de la sténose coronaire a été estimée par le score de
Gensini (Gensini, 1983).
En fait, le score de Gensini, est une méthode qui assigne un score de sévérité selon le degré du
rétrécissement luminal et l’importance « géographique » de son emplacement serait désirable.
Le score de Gensini attribue un score de rétrécissement de la lumière de l’artère coronaire
comme suit : - Un score de 1 pour un rétrécissement de 1-25%.
- Un score de 2 pour un rétrécissement de 26-50%.
- Un score de 4 pour un rétrécissement de 51-75%.
- Un score de 8 pour un rétrécissement de 76-90%.
- Un score de 16 pour un rétrécissement de 91-99%
- Un score de 32 pour une occlusion totale.
Le score est, par la suite, multiplié par un facteur qui tient en compte l’importance de la
position de la lésion au niveau des ramifications des artères coronaires.
- 136 -
Chapitre V: Matériels et Méthodes
Partie pratique
A titre d’exemple, 5 pour le Tronc Commun Gauche (TCG), 2.5 pour l’Inter-Ventricule
Antérieur Proximal (IVA Prox) ou le Circonflexe Proximal (CX Prox) et 1 pour l’IVA Moyen
(IVA Moy) et l’IVA Distal (IVA Dist) ou le Circonflexe Distal (Cx Dist) (tableau V, p.137)
Tableau V. Coefficients respectifs aux ramifications des artères coronaires selon
l’importance de la lésion
TCG
TCG
Coefficient
5
IVA
IVA
IVA
IVA
PROX
MOY
DIST
2.5
1
1
CX
DG
1
DG
0.25
CX
CX
PROX
DIST
2.5
1
CD
Mg
1
POST
CD
CD
CD
LAT
PROX
MOY
DIST
0.5
1
1
1
CD : coronaire droite ; CX : circonflexe ; DG : diagonale ; DIST : distale ; IVA : interventricule antérieur ; IVP : inter-ventricule postérieur ; MOY : moyenne ; PROX : proximal ;
POST LAT : post latérale ; TCG : tronc commun gauche
Le calcul du score se fait en appliquant la formule suivante :
Score de Gensini = la somme (Score de Sévérité × Coefficient)
V.II.4. Prélèvements:
Le prélèvement sanguin a été réalisé à partir de la veine du pli du coude, le matin,
après un jeûne de 12 heures respecté, avant la coronarographie et ceci à l’aide d’une seringue
de 10 mL. Le sang est immédiatement réparti dans les 3 tubes :
-
Un tube EDTA contenant 4 mL, qui sert à l’extraction de l’ADN.
-
Un tube contenant du fluorure de sodium et de l’oxalate de potassium, contenant 3 mL
et qui sert au dosage de la glycémie.
-
Le reste de la quantité soit environ 3 mL est placé dans un tube sans anticoagulant qui
est centrifugé et le sérum frais sert au dosage des différents paramètres lipidiques,
apolipoprotéiques et de la créatinine et de l’insulinémie.
V.II.5. Les dosages sériques:
-
Le cholestérol total et le TG ont été dosés par méthodes enzymatiques colorimétriques
sur CX 7 SYNCHRON Clinical System (Beckman, Fullerton, Calif., USA), utilisant
respectivement le cholestérol oxydase et la lipase/glycérol oxydase. Les valeurs sont
exprimées en mmol/L.
- 137 -
IVP
1
Chapitre V: Matériels et Méthodes
-
Partie pratique
HDL-C : a été dosé par une méthode directe sur CX 7 SYNCHRON Clinical System
(Beckman, Fullerton, Calif., USA), utilisant le réactif Beckman.
-
LDL-C a été calculé par la formule de Friedwald (Friedewald et al., 1972) lorsque les
TG sont inférieures à 4mmol/L :
LDL-C (mmol/L) = Cholesterol total – (HDL-C +TG /2.2)
Sinon on utilise une méthode directe par le réactif Beckman (Beckman, Fullerton, CA, USA).
-
ApoAI et apoB ont été dosées par une méthode immunonéphélémétrique cinétique sur
l’automate IMMAGE Immunochemistry System (Beckman coulter) (Beckman,
Fullerton, CA, USA).
-
Les rapports d’athérogéneité (apoB/apoAI) et (cholestérol total/HDL-C) ont été
calculés.
-
La glycémie a été dosée par une méthode colorimétrique enzymatique utilisant le
glucose oxydase sur un automate CX7-Beckmann Coulter. Les valeurs sont exprimées
en mmol/L.
-
L’insulinémie a été dosée par une méthode basée sur la technologie du dosage
immunologique microparticulaire (MEIA), utilisant AxSym® Abbott (Abbott
laboratories, Abbott Parck, IL 60064 USA). Les valeurs sont exprimées en µU/mL.
- HOMA-IR (homeostatic model assessment of insulin resistance) a été déterminé par la
formule suivante : [Insulinémie (µU/mL) x Glycémie (mmol /L)] / 22.5, comme marqueur
de l’insulino résistance (Matthews et al., 1985).
- Les activités de l’ASAT, l’ALAT, la GGT et de la PAL (phosphatase alcaline) ont été
déterminées par méthodes cinétiques enzymatiques CX 7 SYNCHRON Clinical System
(Beckman, Fullerton, Calif., USA). Les valeurs sont exprimées en UI/L.
V.II.6. Définition des facteurs de risque considérés:
- L’HTA : Un sujet est considéré hypertendue si la PAS > 140 mmHg et la PAD > 90
mmHg ou s’il prend un traitement antihypertenseur (Chobanian et al., 2003).
- Le diabète : Un sujet est considéré diabétique s’il présente une glycémie > 7 mmol/L ou
s’il prend des médicaments antidiabétiques (Alberti and Zimmet, 1998).
- Le tabac: Un individu est considéré comme fumeur lorsqu’il fume couramment ou s’il a
arrêté de fumer depuis une période < 3 mois.
- 138 -
Chapitre V: Matériels et Méthodes
Partie pratique
- La dyslipidémie :
Nous avons définit la dyslipidémie selon la NCEP III (2001), par la présence d’au moins
un des caractères suivants:
 L’hyperLDLémie : LDL-C ≥ 4.1 mmol/L
 L’ hypertriglycéridémie: Une triglycéridémie ≥ 1.71 mmol/L
 L’hypoHDLémie : HDL-C ≤ 1 mmol/L
- Le SM :
Le diagnostic selon la définition de l’IDF (2005) requiert comme critère obligatoire l’obésité
viscérale plus au moins deux autres critères : (Alberti et al., 2005).
● Obésité centrale : tour de taille supérieur ou égal à 94 cm (hommes) ou supérieur ou égal à
80 cm (femmes).
Autres critères :
● Hypertriglycéridémie : TG supérieurs ou égaux à 1.7 mmol/L (1.50 g/L) ou bien traitement
spécifique de cette anomalie ;
● HDL-C bas : inférieure à 1.03 mmol/L (0.40 g/L) [hommes] ou inférieure à 1.29 mmol/L
(0.50 g/L) [femmes], ou bien traitement spécifique de cette anomalie ;
● Élévation de la pression artérielle : la PAS supérieure ou égale à 130 ou la PAD supérieure
ou égale à 85 mmHg ou HTA traitée ;
● Glycémie à jeun supérieure ou égale à 5.6 mmol/L (1.0 g/L) ou diabète de type 2 connu.
Il est à noter que dans la définition de l’IDF le critère d’obésité centrale proposé est celui pour
les populations blanches d’origine européenne, et qu’il est modulé selon l’origine ethnique de
la population. Pour la population sud-asiatique et chinoise, il est proposé supérieur ou égal à
90 cm chez les hommes et supérieur ou égal à 80 cm chez les femmes. Pour les japonais :
supérieur ou égal à 85 cm chez les hommes et supérieur ou égal à 90 cm chez les femmes.
Pour l’Afrique subsaharienne et pays méditerranéens : normes européennes.
II.7. Protocole de l’extraction de l’ADN :
Pour l’extraction de l’ADN nous avons choisi la technique Salting out en utilisant le
chlorure de guanidium (Miller et al., 1988). Cette technique est réalisée en 5 étapes :
1. Lyse des globules rouges :
-
Le sang décongelé ou fraichement recueilli (4 mL de sang prélevé sur tube EDTA), est
vigoureusement mélangé à une solution hypotonique de lyse des globules rouges dans un
falcon (remplir à 16 mL) à froid pendant 15mn.
- 139 -
Chapitre V: Matériels et Méthodes
Partie pratique
-
Centrifuger 10 mn à 4000t/mn
-
Rejeter le surnageant, ajouter environ 6 mL de solution de lyse des globules rouges et
vortexer.
-
Compléter à 16 mL avec la solution de lyse des globules rouges
-
Laisser au contact de la glace pendant 10 mn (agitation lente).
-
Centrifuger 10mn à 4000t/mn.
-
Refaire l’étape précédente (1 ou 2 fois jusqu’à obtenir un culot leucocytaire clair).
-
Une fois le culot leucocytaire est obtenu, il peut être congelé ou être utilisé de suite.
2. Lyse des globules blancs
Ajouter au culot leucocytaire :
-
800 µL solution de lyse des globules blancs, resuspendre le culot puis le «casser»
-
4 mL de chlorure de guanidium 6M.
-
200 µL d’acétate d’ammonium 7.5 M.
Agiter pendant une heure.
3. Lyse de la fraction nucléaire :
-
Ajouter 600 µL sarcosyl 5% ou 300 µL de sarcosyl à 10% et 120 µL protéinase K à 10
mg/mL pour détruire les protéines. En effet, le sarcosyl dénature les protéines
membranaires et celles qui entourent l’ADN, la protéinase K les digèrent, le NaCl
présent dans la solution de lyse des globules blancs les précipitent, l’EDTA et le Tris
inhibent les DNAses.
-Laisser incuber 2 heures à 60°C ou toute une nuit à 37°C.
4. Formation de la pelote d’ADN:
-
Ajouter l’alcool absolu (glacé) doucement jusqu’à 20 mL.
-
Mélanger doucement : la pelote d’ADN apparaît.
-
Récupérer l’ADN, le mettre dans un eppendorf.
-
Laver 2 fois avec l’alcool 70% (400µL).
-
Bien mélanger la pelote d’ADN en agitant.
-
Centrifuger 5mn à 3000t/mn.
-
Eliminer l’alcool, ajouter 400µL d’alcool 70%
-
Centrifuger 5mn à 4000t/mn.
-
Eliminer l’alcool.
- 140 -
Chapitre V: Matériels et Méthodes
Partie pratique
5. Solubilisation de la pelote d’ADN :
Resuspendre dans l’eau bidistillée, (suivant la grosseur de la méduse ajouter entre 300µL
à 500µL).
V.II.8. Contrôle et quantification de l’ADN génomique :
• Dosage de l’ADN :
Nous avons réalisé un dosage spectrophotométrique de l’ADN génomique, en UV à 260 nm.
L’ADN mère a été dilué au 1/70ème dans l’eau bidistillée. La mesure de l’absorbance
s’effectue dans une cuve en quartz par spectrophotométrie. La quantification de l’ADN se
base sur la détermination de la concentration de l’ADN double brin en se basant sur la loi de
Beer-Lambert : 1 unité DO = 50 µg/mL d’ADN double brin.
La concentration en ADN génomique en µg/mL est égale à : A260×50×dilution
• Vérification de la pureté de l’ADN :
La vérification de la pureté de l’ADN extrait peut être évaluée par la réalisation d’une lecture
spectrophotométrique en UV. Les acides nucléiques absorbent à 260 nm et les protéines à 280
nm. Ceci permet d’estimer la contamination par les protéines lors de la purification de l’acide
nucléique. L’appréciation de cette contamination est réalisée par le rapport R :
R=DO260/DO280
Le critère de pureté de l’extrait d’ADN est : 1.8<R<2
Si R<1.8 : contamination protéique
• Vérification de la qualité de l’ADN :
Une électrophorèse sur gel d’agarose 2% de 5 µL d’ADN et 5µL de tampon de charge permet
de vérifier la qualité de l’ADN extrait. Un ADN de bonne qualité donne une bande unique et
non un « smear ».
II.9. Etude génétique des polymorphismes :
II.9.1. Principe de la PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment
length polymorphism analysis)
En présence d’un couple d’amorces, une séquence d’ADN double brin subit une
amplification, par la méthode de polymérisation en chaine ou PCR dont le principe est le
suivant:
- 141 -
Chapitre V: Matériels et Méthodes
Partie pratique
La PCR est une technique de synthèse in vitro d’une séquence cible d’ADN. Le principe de
base est d’essayer d’extraire une séquence d’ADN spécifique présente une seule fois dans un
mélange complexe de séquences nucléotidiques en multipliant son nombre de copies. Il s’agit
d’une amplification effectuée par extension itérative de deux amorces, située de part et d’autre
de la région considérée, grâce à une ADN polymérase. La PCR permet dans la majorité des
cas un diagnostic de certitude non invasif et rapide.
La PCR consiste en une succession cyclique de trois étapes :
- Dénaturation thermique: les deux brins d’ADN sont séparés par élévation de la température
supérieure à la température de dénaturation de l’ADN.
- Hybridation des amorces: une amorce sens et une amorce antisens vont s’hybrider sur les
brins d’ADN et délimitent ainsi la séquence à amplifier. La température réactionnelle doit être
légèrement inférieure au Tm des amorces pour permettre leur hybridation.
- Elongation: La Taq polymérase (ADN polymérase ADN dépendante résistante à une
température
élevée)
allonge
les
amorces
en
incorporant
des
désoxynucléotides
complémentaires de la séquence de la matrice à laquelle elle est hybridée. Cette réaction a lieu
dans le sens 5’3’ à une température intermédiaire entre celle nécessaire à la dénaturation et
celle de l’hybridation des amorces.
Une pré-dénaturation de l’ADN est effectuée avant le premier cycle et une étape
supplémentaire d’extension est ajoutée après le dernier cycle.
Le fragment amplifié est analysé après digestion par l’enzyme de restriction appropriée qui est
une protéine active de type endonucléase qui peut couper les liaisons phosphodiester d’un
fragment d’ADN au niveau d’une séquence de nucléotides précises et palindromiques
correspondant au site de restriction spécifique à l’enzyme: c’est la PCR-RFLP.
V.II.9.2. La PCR multiplex :
La PCR multiplex est une variante de la PCR. C’est une amplification simultanée de
plusieurs séquences cibles (deux au moins) dans un même tube d’amplification. Chaque
amplification, dans le même tube, doit être indépendante des autres, pour chaque amorce.Le
résultat devant être identique à celui obtenu par PCR monoplex (un seul couple d’amorces).
Chaque produit d’amplification doit avoir une taille peu différente de celle des autres pour
obtenir à peu près la même efficacité de PCR mais la différence doit être suffisante pour
qu’on puisse les distinguer (par exemple sur un gel d’agarose).
- 142 -
Chapitre V: Matériels et Méthodes
Partie pratique
Les amorces et les enzymes de restriction utilisées en PCR-RFLP et en PCR multiplex,
dans la partie pratique de ce travail, pour le génotypage des différents polymorphismes
étudiés, sont décrites dans le tableau suivant :
Tableau VI. Les amorces et les enzymes de restriction (ER) utilisées pour les
différents polymorphismes étudiés
Polymorphismes
R219K
ABCA1
V771M
V825I
-565C/T
SCARB1
CETP
Exon8
(C/T)
Exon1
(G/A)
Intron5
(C/T)
TaqIB
R451Q
A373P
I405V
LCAT
P143L
G30S
ApoAI
PON1
-75pb
(G/A)
+83pb
(C/T)
Q192R
L55M
PON2
S311C
A148G
Amorces sens (5’→3)
Amorces anti-sens (5’→3’)
CTCCAAAAGACTTCAAGGACCC
GGCCCAAAAGTCTGAAAGAACAC
CAAGTGAGTGCTTGGGATTG
TGCTTTTATTCAGGGACTCCA
CCCATGCACTGCAGAGATTC
GCAAATTCAAATTTCTCCAGG
CTCGGGTCCTCTGAGGGACCT
CCGCAGACTCTCTAGTCCAC
TTGTATGATGTCCCCTCCCT
TTCCCACCACCCCAGCCCAC
CCGGCGATGGGGCATAAAACCACT
CGCCCAGCACAGCGCACAGTAGC
GCCCAGAATGTTCAGACCAG
GCACCCTCTTCACGACAAAG
CACTAGCCCAGAGAGAGGAGTGCC
CTGAGCCCAGCCGCACACTAAC
TCGCCCAGGGCTCGAGGTAGTGTTT
ACCCAACTTCCACCACGCTG
GTTTCTCTCCCCAGGATATCGTGAC
GTCAAGTTGGAAACAGTCTTTGGTG
AATGCTTGTCCAGGCCGTGCAGCAT
CAGTTTCCCCTCCAGCCCACACTTA
ATCCAGAGTCCAGAGTGAGG
CCGCAGAGACACTCACC
AATCCAGAGTCCAGAGTGA
GGCTAGGGTGGAGCACAT
AGG GAC AGA GCT GAT CCT TGA ACT CTT AAG
TTA GGG GAC ACC TAC CCG TCA GGA AGA GCA
TTGAATGATATTGTTGCTGTGGGACCTGAG
CGACCACGCTAAACCCAAATACATCTCCCAGaA
GAGTGATGTATAGCCCCAGTTTC
AGTCCATTAGGCAGTATCTCCg
GGTTCTCCGCATCCAGAACATTgaA
TGTTAAGaTATCGCACTaTCATGCC
ACATGCATGTACGGTGGTCT
GCACTT TCATGCCAAAAGTAC
- 143 -
ER
StyI
BsaAI
BsaI
AciI
HaeIII
AluI
ApaI
TaqI
XhoI
StuI
FokI
MnlI
PvuII
MspI
HinfI
Fnu4HI
Chapitre V: Matériels et Méthodes
Partie pratique
V.II.10. Etude statistique :
L’étude statistique a été réalisée sur le logiciel SPSS (Statistical Package for the Social
Sciences) version 16. Les variables quantitatives sont présentés sous forme de moyennes ±
écart type et comparées par le test d’analyse de variance (one-way ANOVA) puis par le test
de Student si la distribution est gaussienne, sinon elles sont présentées sous forme de médiane
(min-max) et comparées par le test non paramétrique U de Mann-Whitney. Les variables
qualitatives sont présentées sous forme de pourcentages et comparées par te test de χ2. L’étude
de la corrélation entre les paramètres quantitatifs a été estimée par le test de Pearson. Le seuil
de significativité a été fixé à 0.05.
La loi de Hardy-Weinberg a été vérifiée pour les fréquences génotypiques. En effet,
pour chaque polymorphisme testé, il est nécessaire de vérifier que celui-ci respecte l’équilibre
d’Hardy-Weinberg dans la population étudiée. La loi d’Hardy-Weinberg stipule que, au sein
d’une très grande population dans laquelle les mariages entre individus se font au hasard
(panmixie), et qui ne connaît ni migration, ni sélection naturelle, les fréquences alléliques et
génotypiques restent stables au fil des générations. Dans cette hypothèse, la loi d’HardyWeinberg permet de calculer les fréquences alléliques à partir de la mesure des fréquences
génotypiques et inversement. Selon cette loi, si A1 et A2 sont les allèles d’un locus
autosomique bi-allélique, de fréquence respective p et q (avec q=1-p), les fréquences des trois
génotypes possibles A1A1, A1A2 et A2A2, sont respectivement p2, 2pq et q2. Une
population dans laquelle la distribution génotypique observée est statistiquement compatible
avec cette distribution théorique est dite en équilibre d’Hardy-Weinberg pour le locus
considéré. Pour vérifier qu’un polymorphisme respecte l’équilibre d’Hardy-Weinberg dans
une population donnée, un test du 2 à 1 degré de liberté (ddl) a été utilisé pour permettre de
calculer l’écart entre les fréquences observées et les fréquences théoriques respectives des
différents génotypes. Si cet écart est significatif, la distribution du polymorphisme dans la
population ne respecte pas l’équilibre d’Hardy-Weinberg.
Les études d’association ont été fondées sur le principe de déséquilibre de liaison. Le
déséquilibre de liaison réfère à l’association non aléatoire entre les allèles de deux ou
plusieurs loci. Plus deux loci sont situés proches l’un de l’autre, moins leurs allèles ont de
chances d’être transmis de façon indépendante. On dit alors qu’ils sont en déséquilibre de
liaison. Des loci très près l’un de l’autre seront en plus fort déséquilibre de liaison que des loci
plus éloignés. Ce concept est très utile pour la recherche en génétique. En effet, une
- 144 -
Chapitre V: Matériels et Méthodes
Partie pratique
association entre un marqueur et une maladie suggère la présence d’un déséquilibre de liaison
entre les deux. On présume alors que le marqueur est à proximité du locus de la maladie, ce
qui peut faciliter l’identification du gène.
Le déséquilibre de liaison (exprimé par D’) entre les polymorphismes et l’analyse
haplotypique ont été estimé par le programme SNP analyser 2 (Yoo et al., 2005).
La force de l’association de l’allèle d’un polymorphisme étudié et la maladie a été
estimée par le calcul de l'odds ratio (OR) défini comme le rapport de la cote d’exposition chez
les cas sur la cote d’exposition chez les témoins. Un calcul des OR et des intervalles de
confiance (IC) à 95% a été alors effectué. Les ajustements aux variables confondantes
potentielles ont été effectués par régression logistique binaire.
La lecture de l’OR et de son intervalle de confiance à 95% :
-
OR=1 et l’intervalle de confiance à 95% inclus 1 : il n’y a pas d’association entre
l’exposition étudiée et la maladie donc une absence de risque.
-
OR est significativement supérieur à 1, la borne inférieure de l’intervalle de confiance
est > à 1 : le facteur étudié est un facteur de risque, si le sujet est exposé à ce facteur,
le risque d’avoir la maladie est multiplié par la valeur de l’OR.
-
OR est significativement inférieur à 1, la borne supérieure de l’intervalle est < à 0 : ce
facteur est considéré comme un facteur protecteur.
- 145 -
Chapitre VI: Résultats et Discussion
Partie pratique
I. ETUDE DE LA POPULATION
I.1. Caractéristique de la population d’étude :
Notre population d’étude comprend 316 patients (205 hommes et 111 femmes),
documentés par angiographie coronaire à cause d’un IDM (n= 113), angine (n= 169), douleur
thoracique (n= 18) ou insuffisance cardiaque (n= 16). Les causes des douleurs thoraciques
sont la valvulopathie (n= 3), la cardiomyopathie hypertensive (n=2), la maladie aortique
sévère et l’insuffisance mitrale (n= 2), la cardiomyopathie dilatée (n=2) et les problèmes
psychiatriques comme l’anxiété ou la dépression (n=9). Les causes de l’insuffisance cardiaque
sont la cardiopathie ischémique (n= 6), l’œdème pulmonaire aigu (n= 3), la maladie du cœur
pulmonaire chronique ou la maladie pulmonaire obstructive (n= 3) et la crise hypertensive (n=
4). Les caractéristiques anthropométriques, cliniques, et biologiques de la population d’étude
sont représentées dans le tableau VII (p.147)
La prévalence de la SCS+ est significativement plus grande chez les hommes que chez les
femmes (p= 0.010). Comparé au groupe de SCS-, dans le groupe de SCS+ il y a
significativement plus de fumeurs (p= 0.013), de patients diabétiques (p= 0.001), de patients
présentant une dyslipidémie (p= 0.027) et d’antécédent d’IDM (p<0.001).
Les TG et le rapport apoB/apoAI sont significativement plus élevés alors que les
concentrations du HDL-C (p= 0.040) et de l'apoAI (p= 0.009) sont significativement plus
faibles, chez le groupe de SCS+ comparé à celui de SCS-.
Toutes les variables avec une valeur p < 0.25 entre les 2 groupes d’étude sont considérées
comme un facteur confondant pour les ajustements des ORs prévus dans les résultats
prochains.
- 146 -
Chapitre VI: Résultats et Discussion
Partie pratique
Tableau VII. Caractéristiques de la population d’étude
Caractéristiques
SCS– (n=104)
SCS+ (n=212)
p
Sexe-ratio (H/F)
1.26
1.97
0.010
59.4 ±11.9
60.6 ± 10.6
0.380
Tabac n (%)
47 (45.2)
120 (56.6)
0.013
Diabète n (%)
23 (22.1)
73 (34.4)
0.001
Hypertension n (%)
46 (44.2)
97 (45.7)
0.353
Antécédent d’IDM n (%)
13 (12.5)
91 (42.9)
<0.001
9 (8.6)
33 (15.6)
0.027
5.025±1.087
5.029± 1.192
0.970
Triglycérides (mmol/L)
1.340 ± 0.647
1.614 ± 1.117
0.022
HDL-C (mmol/L)
1.030± 0.276
0.961 ± 0.283
0.040
LDL-C (mmol/L)
3.330± 1.039
3.440± 1.167
0.370
ApoAI (g/L)
1.290± 0.437
1.160± 0.379
0.009
ApoB (g/L)
1.110± 0.413
1.153± 0.376
0.460
ApoB/ApoAI
0.920 ± 0.290
1.057 ± 0.493
0.036
Cholestérol Total /HDL-C
5.410± 1.890
5.630 ± 2.040
0.430
Age (ans)
Dyslipidémie n (%)
Cholestérol Total
(mmol/L)
ApoAI : Apolipoprotéine AI ; ApoB : Apolipoprotéine B ; F : Femme ; H : Homme ; IDM :
Infarctus Du Myocarde ; HDL-C : Lipoprotéine de Haute Densité-Cholestérol ; LDL-C :
Lipoprotéine de Basse Densité-Cholestérol.
p : comparaison entre SCS+ et SCS-
- 147 -
Chapitre VI: Résultats et Discussion
Partie pratique
II. Etude du gène d’ABCA1
Voir publication 1 (annexe3):
Rejeb J, Omezzine A, Rebhi L, Boumaiza I, Kaouthar K, Belkahla R, Ben Rejeb N, Nabli N,
Ben Abdelaziz A, Boughzala E, Bouslama A. Associations between common polymorphisms
of Adenosine Triphosphate-Binding Cassette Transporter A1 and coronary artery disease
in a Tunisian population. Arch Cardiovasc Dis. 2010; 103: 530-537.
II.1. Introduction :
Comme il a été exposé dans la partie théorique, plusieurs études épidémiologiques ont
démontré que les basses concentrations de HDL-C représentent un FR indépendant de
développer la maladie coronarienne, qui représente dans le monde un enjeu majeur de santé
publique (Navab et al., 2011). Le transporteur ABCA1 joue un rôle primordial dans le
métabolisme du HDL. Il permet la sortie du cholestérol cellulaire en excès ce qui constitue la
première étape du TIC (Attie et al., 2001). À notre connaissance, il n’y a pas de publication
concernant le génotypage du gène de l’ABCA1 ou son association avec le risque coronaire
dans la population Tunisienne. C’est pourquoi, nous nous sommes intéressés, dans cette thèse,
à la mise en évidence de quatre polymorphismes du gène de l’ABCA1 (G1051A [rs2230806],
G2706A [rs2066718], G2868A [rs4149312], -565C/T [rs2422493]), dont l’association avec
les variations de HDL-C et les MCV est controversée.
II.2. Présentation du travail :
Suite à cette controverse, nous avons étudié l’association de ces polymorphismes au niveau du
gène de l’ABCA1 avec le profil lipidique et la SCS, dans notre population d’étude.
Par ailleurs, nous avons recherché des interactions entre ces polymorphismes et un certain
nombre de FRCV (tabac, diabète, sexe …) dans la prédisposition à la SCS. Notre attention a
aussi porté sur les combinaisons génotypiques de ces quatre polymorphismes et leurs
associations avec la SCS.
II.3. Méthodes :
II.3.1. Génotypages des polymorphismes d’ABCA1 :
Les génotypes de chaque polymorphisme d’ABCA1 (R219K (G1051A), V771M (G2706A),
V825I (G2868A) and - 565C/T (-477C/T) ont été déterminés par la méthode PCR-RFLP, en
- 148 -
Chapitre VI: Résultats et Discussion
Partie pratique
utilisant les amorces et les enzymes de restriction décrites dans le tableau VII (p.149). Nous
nous sommes basés sur un protocole de PCR publié par Woll et al. (2005) pour l’étude des
polymorphismes G1051A et -565C/T, et sur celui de Clee et al. (2001) pour les
polymorphismes G2706A et G2868A. Après optimisation à nos conditions de travail, la
composition du mélange réactionnel est: pour un volume de 30 µL : 0.266 μM de chaque
amorce, 100 ng d’ADN, 100 μM de dNTPs et 1U de GoTaq Polymérase. Le programme de la
PCR est le suivant: 5 min à 95°C, (45 s à 95°C, 45 s à une Tm affichée dans le tableau selon
les amorces, 45 s à 72°C) 35 cycles, 7 min à 72°C.
La détection des polymorphismes est réalisée par électrophorèse sur gel d’agarose 2% et une
révélation par le bromure d’éthidium (BET) sous rayon UV du produit d’amplification en
présence d’un marqueur de poids moléculaire.
Tableau VIII. Méthodes de génotypage (PCR-RFLP) des polymorphismes d’ABCA1
Amorces sens (5’→3)
Amorces anti-sens (5’→3’)
Tm
(°C)
Enzymes
R219K
CTCCAAAAGACTTCAAGGACCC
GGCCCAAAAGTCTGAAAGAACAC
60
V771M
CAAGTGAGTGCTTGGGATTG
TGCTTTTATTCAGGGACTCCA
57
V825I
CCCATGCACTGCAGAGATTC
GCAAATTCAAATTTCTCCAGG
57
-565C/T CTCGGGTCCTCTGAGGGACCT
CCGCAGACTCTCTAGTCCAC
56
StyI
(2U)
37°C/nuit
BsaAI
(2U)
37°C/nuit
BsaI
(3U)
37°C/nuit
AciI
(2U)
37°C/nuit
- 149 -
Fragment amplifié (pb)
Homozygote normal
Homozygote muté
433
189, 131, 113
320, 113
350
252, 98
350
386
237, 149
386
351
148, 130, 73
278, 73
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
II.4. Résultats et discussion :
II.4.1. Fréquences des polymorphismes d’ABCA1 :
Tableau IX. Fréquences génotypiques et alléliques des polymorphismes d’ABCA1 selon
la présence ou non de la SCS chez notre population Tunisienne.
SCS+
SCS+ (n=212)
SCS- (n=104)
G1051A
GG
GA
AA
GG
GA
AA
%
40
47.7
12.3
35.6
50.9
13.5
G2706A
GG
GA
AA
GG
GA
AA
%
91
8.5
0.5
80
20
0
G2868A
GG
GA
AA
GG
GA
AA
%
76.9
22.6
0.5
79.8
19.2
1
-565C\T
CC
CT
TT
CC
CT
TT
%
24.5
52.9
22.6
27.9
54.8
17.3
SCS-
p
Fréquences alléliques
0.678
A
0.64
0.953
0.61
A
0.009
0.05
0.770
0.893
0.1
A
0.12
0.599
0.982
0.11
T
0.49
p
0.954
0.45
Le tableau IX montre les fréquences génotypiques et alléliques de chaque polymorphisme
d’ABCA1. Chaque polymorphisme obéit à la loi de Hardy-Weinberg. Nous avons rapporté
que les fréquences génotypiques du polymorphisme G2706A sont (GG : 91%, GA : 8.5%,
AA : 0.5% chez SCS+ ; GG : 80%, GA : 20%, AA : 0% chez SCS- ; p= 0.009). La fréquence
du génotype GG est significativement plus élevée, chez le groupe SCS+. Aucun homozygote
muté AA n’a été trouvé chez le groupe SCS-. La fréquence de l’allèle A de ce polymorphisme
est de 0.05, chez le groupe SCS+. Elle est semblable à celle trouvée chez des Danois (0.03)
(Frikke-Schmidt et al., 2008) et des Hollandais (0.029) (Clee et al., 2001). Les fréquences des
allèles 1051A, 2868A et -565T sont respectivement (0.64, 0.12 et 0.49 chez SCS+ ; 0.61, 0.11
et 0.45 chez SCS-). Nous n’avons pas observé de différence significative des fréquences
génotypiques entre les 2 groupes pour ces 3 polymorphismes.
La distribution des fréquences de chaque polymorphisme varie selon l’ethnicité. En effet, la
fréquence de l’allèle A du polymorphisme G1051A (0.64), chez le groupe SCS+, est
comparable à celle trouvée chez une population Américaine Africaine (0.64) (Benton et al.,
2007). Elle est plus élevée que les fréquences trouvées chez les populations Danoise (0.26),
Chinoise (0.40) et Hispanique (0.38) (Frikke-Schmidt et al., 2008; Benton et al., 2007).
Concernant le polymorphisme -565C/T, la fréquence de l’allèle -565T est de 0.49 et semble
- 150 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
être comparable à celle trouvée chez une population Américaine Africaine (0.48), Chinoise
(0.51) et Hispanique (0.50) (Benton et al., 2007).
La fréquence de l’allèle 2868A (0.12) est moins élevée que celle estimée chez une population
Danoise (0.06) (Frikke-Schmidt et al., 2008) et Indienne (0.084) (Tan et al., 2003) et plus
élevée que chez des Chinois (0.0445) et des Malais (0.318) (Tan et al., 2003).
II.4.2. Associations entre les polymorphismes d’ABCA1 et le profil apolipoprotéique :
Dans notre présente étude, nous avons observé que seuls les individus avec un génotype
1051AA et porteurs de l’allèle A (génotypes GA+AA) ont une concentration de HDL-C
significativement plus élevée que les individus avec un génotype 1051GG (respectivement
1.08 ± 0.35, p= 0.042 et 1.11 ± 0.34, p= 0.032, versus 0.93 ± 0.37). Aucune différence
significative pour les autres concentrations lipidiques n’a été observée pour chaque
polymorphisme. En plus, nous avons observé que seuls les porteurs de l’allèle A (génotype
GA+AA) du polymorphisme G2706A semblent avoir un risque bas d’hypoHDLémie avec un
OR= 0.39, IC 95% 0.19-0.81, p= 0.012. Le risque d’élévation des rapports d’athérogénicité,
d’hypoHDLémie et d’hypoApoAI associé aux polymorphismes étudiés n’est pas significatif.
L’association des polymorphismes étudiés d’ABCA1 avec les concentrations de HDL-C est
controversée. En effet, certaines études ont montré une association entre les génotypes de ces
polymorphismes et des concentrations élevées de HDL-C (Benton et al., 2007; FrikkeSchmidt et al., 2008; Ma et al., 2011), alors que d’autres n’ont trouvé aucun effet (Kyriakou et
al., 2005; Jensen et al., 2007; Saleheen et al., 2007).
II.4.3. Associations des polymorphismes d’ABCA1 avec la présence de la sténose
coronaire :
Le rôle des polymorphismes d’ABCA1 dans le risque cardiovasculaire reste controversé
(Tregouet et al., 2004; Kyriakou et al., 2005; Frikke-Schmidt et al., 2008; Ma et al., 2011;
Jiang et al., 2011). Dans notre étude, nous avons rapporté qu’après ajustement des variables
confondants, seuls les porteurs de l’allèle A muté du polymorphisme G2706A semblent être
associés à une diminution du risque de la SCS (OR= 0.66, IC 95% 0.22-0.92, p= 0.029), sans
effet prononcé sur le profil lipidique (tableau X, p.153). Plusieurs études sont en accord avec
notre résultat (Clee et al., 2001; Yamakawa-Kobayashi et al., 2004; Andrikovics et al., 2006),
alors que Frikke-Schmidt et al. (2008) ont rapporté une augmentation du risque des
cardiopathies ischémiques.
- 151 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
Les preuves qu’apportent les études suggèrent que des polymorphismes du gène d’ABCA1
puissent exercer des effets phénotypiques sur l’athérosclérose, indépendamment des
changements en concentrations lipidiques (Clee et al., 2001; Zwarts et al., 2002; Cenarro et
al., 2003). L'association du polymorphisme G2706A avec la diminution de la SCS sans
changement majeur sur la concentration de HDL-C suggère que ce polymorphisme exerce
probablement ses effets principalement par la stimulation du TIC qui peut augmenter l’efflux
de cholestérol vers le foie. Cette augmentation de l’activité du TIC peut directement réduire le
développement de l’athérosclérose sans nécessairement changer le profil des lipides (Clee et
al., 2001). En effet, il a été rapporté que dans la lumière artérielle, les macrophages en se
chargeant de cholestérol ont le potentiel de se transformer en cellules spumeuses, ce qui
caractérise l’étape initiale de l’athérosclérose (Cuchel et Rader, 2006). L’absence d’ABCA1
est liée à des changements significatifs dans la morphologie, les propriétés et les activités
fonctionnelles des macrophages, ce qui en résulte une augmentation du dépôt de cholestérol et
de la réponse aux facteurs chimiotactiques (Francone et al., 2005). L’inactivation sélective
d’ABCA1 dans les macrophages chez des souris hyperlipidémiques est liée à une
augmentation marquée de l’athérosclérose et à une accumulation de cellules spumeuses,
démontrant
ainsi
les
propriétés
anti-athérogènes
d’ABCA1,
indépendamment
des
concentrations de HDL-C (Aiello et al., 2002).
L’interaction de ces polymorphismes avec d’autres FR a été étudiée. Nous avons noté une
interaction significative avec le tabac et le diabète (tableaux XI et XII, p.154). En effet, dans
le modèle de régression logistique binaire, nous avons trouvé un Exp(B)= 1. 22, IC 1.02-1.73
(p = 0.044) pour le tabac et un Exp(B)= 1. 62, IC 1.058-2.485 (p= 0.026) pour le diabète.
Nous avons donc apparié notre population en fonction du statut tabagique et diabétique.
L’effet protecteur du polymorphisme G2706A semble être plus significatif chez les fumeurs
(OR=0.48, IC 95% 0.10-0.83, p= 0.021) comparés aux non fumeurs (OR=0.75, IC 95% 0.181.07, p= 0.055) (tableau XI, p.154).
Il a été rapporté que le tabac augmente le taux d’oxydation des particules de lipoprotéines et il
pourrait être possible que ce SO puisse être réduit en partie à travers la voie d’ABCA1. En
effet, ABCA1 peut médier la sécrétion cellulaire de α-tocophérol (la forme active de la
vitamine E qui a des propriétés antioxydantes) (Andrikovics et al., 2006). Ainsi, il pourrait
être possible que les patients portant l’allèle 2706A soient plus protégés contre l'oxydation des
lipoprotéines et le risque ultérieur d’athérosclérose. De nouvelles études seront nécessaires
pour confirmer cette hypothèse.
- 152 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
Tableau X. Odds ratios de la SCS selon le génotype des polymorphismes de l’ABCA1
Polymorphismes
G1051A
G2706A
G2868A
-565C/T
a
ORs ajustésa
ORs
ORs
IC 95%
pb
ORs
IC 95%
pb
GG
1
-
-
1
-
-
GA+AA
0.810
0.50-1.30
0.227
0.743
0.44-1.25
0.251
GG
1
-
-
1
-
-
GA+AA
0.585
0.19-0.75
0.004
0.658
0.22-0.92
0.029
GG
1
-
-
1
-
-
GA+AA
1.170
0.66-2.07
0.343
1.190
0.64-2.18
0.573
CC
1
-
-
1
-
-
CT+TT
1.160
0.68-1.98
0.333
1.280
0.72-2.28
0.391
Ajustés à l’âge, sexe, diabètes, tabac, hypertension, dyslipidémie.
Toutes les valeurs de p sont calculées par comparaison avec le génotype sauvage.
b
Nous avons aussi observé cet effet protecteur chez les diabétiques (OR=0.53, IC 95% 0.030.86, p = 0.007) comparés aux non diabétiques (OR=0.75, IC 95% 0.26-1.59, p = 0.35). Ce
résultat peut être expliqué par le fait que l’altération d’ABCA1 peut jouer un rôle dans les
MCV qui est la cause majeure de morbidité et de mortalité chez le diabète de type 1 et de type
2 (Haghpassand et al., 2001; Nathan et al., 2003). En effet, les deux caractéristiques de
diabète sont l’élévation du glucose et des acides gras (Reaven et al., 1988; Seigneur et al.,
1994). Il a été rapporté que les carbonyles réactifs glyoxal et glycoaldéhyde, induits par une
hyperglycémie prolongée (Thornalley et al., 1999; Baynes et Thorpe, 2000), détériorent
sévèrement la voie d’ABCA1 dans les macrophages en culture, vraisemblablement en
endommageant directement la protéine ABCA1. De plus, les acides gras déstabilisent la
protéine ABCA1 en activant la voie de signalisation qui phosphoryle l’ABCA1 et augmente
sa dégradation (Wang et al., 2004; Wang and Oram, 2007). Nous n’avons pas observé
d’association significative avec le risque de la SCS pour les 3 autres polymorphismes (565C/T, G1051A, G2868A), ni dans la population d’étude ni en stratifiant selon le statut
tabagique ou diabétique.
- 153 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
Tableau XI. Odds ratios de la SCS selon le statut tabagique
Polymorphismes
G1051A
G2706A
G2868A
-565C/T
a
Fumeurs
Non fumeurs
ORsa
IC 95%
pb
ORsa
IC 95%
pb
GG
1
-
-
1
-
-
GA+AA
0.974
0.44-2.13
0.555
0.687
0.37-1.27
0.150
GG
1
-
-
1
-
-
GA+AA
0.481
0.09-0.83
0.021
0.749
0.18-1.07
0.055
GG
1
-
-
1
-
-
GA+AA
1.720
0.62-4.72
0.208
0.940
0.46-1.91
0.503
CC
1
-
-
1
-
-
CT+TT
1.210
0.50-2.91
0.410
1.131
0.56-2.25
0.430
Ajustés à l’age, sexe, diabetes, hypertension, dyslipidémie
Toutes les valeurs de p sont calculées par comparaison avec le génotype sauvage.
b
Tableau XII. Odds ratios de la SCS selon le statut diabétiques
Polymorphismes
G1051A
G2706A
G2868A
-565C/T
a
Diabétiques
Non diabétiques
ORsa
IC 95%
pb
ORsa
IC 95%
pb
GG
1
-
-
1
-
-
GA+AA
0.825
0.34-1.98
0.666
0.932
0.46-1.87
0.844
GG
1
-
-
1
-
-
GA+AA
0.528
0.03-0.86
0.007
0.751
0.26-1.59
0.347
GG
1
-
-
1
-
-
GA+AA
1.153
0.44-3.00
0.770
1.330
0.62-2.84
0.456
CC
1
-
-
1
-
-
CT+TT
0.782
0.28-2.13
0.631
1.420
0.64-3.16
0.384
Ajustés à l’âge, sexe, tabac, hypertension, dyslipidémie.
Toutes les valeurs de p sont calculées par comparaison avec le génotype sauvage.
b
II.4.4. Déséquilibre de liaison et analyse haplotypique :
Le polymorphisme G1051A est en déséquilibre de liaison avec les polymorphismes G2706A
(D’=0.27, p= 0.0074) et G2868A (D’= -0.28, p= 0.039). Lorsque les 4 polymorphismes
d’ABCA1 ont été combinés (G1051A, G2706A, G2868A et -565C/T), le modèle
haplotypique (AAGC) semble être le plus protecteur. En effet, il est plus fréquent chez le
- 154 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
groupe SCS- comparé au groupe SCS+ (0.079 versus 0.030). Par contre, l’haplotype (GGAT)
est plus fréquent chez le groupe SCS+ (0.044 versus 0.016).
Par analyse haplotypique, après ajustement aux facteurs confondants, l’haplotype (AAGC)
semble être associé à une diminution du risque de la SCS comparé à l’haplotype sauvage
(possédant tous les allèles communs: GGGC) (OR= 0.5, IC 95% 0.29-0.96, p= 0.048).
L’haplotype (GGAT) semble augmenter le risque de la SCS (OR= 1.26, IC 95% 1.03-1.56, p=
0.025) comparé à l’haplotype sauvage.
L’haplotype (AAGC) semble aussi diminuer le risque d’avoir une hypoHDLémie et une
hypoApoAI avec des ORs respectifs : OR= 0.69, IC 95% 0.48-0.95 (p= 0.025) et OR= 0.65,
IC 95% 0.46-0.92 (p= 0.037). Par contre, les risques d’hypoHDLémie et d’hypoApoAI
associés à l’ haplotype (GGAT) sont, respectivement, OR= 1.26, IC 95% 0.76-2.10 (p= 0.36)
et OR= 0.7, IC 95% 0.48-1.02 (p= 0.06). Concernant les autres combinaisons haplotypiques,
nous n’avons observé de changements significatifs ni sur les concentrations de HDL-C ou
d’apoAI, ni sur l’élévation des rapports d’athérogénicité, ni sur le risque de SCS.
En conclusion, nous avons rapporté que, dans notre population d’étude, seuls les porteurs de
l’allèle A du polymorphisme G2706A semble être associé à une réduction du risque de la
SCS, sans d’importantes modifications des concentrations de HDL-C. cet effet semble être
plus protecteur chez les fumeurs et les diabétiques. Nous avons aussi rapporté que l’haplotype
(AAGC) semble être le protecteur alors que (GGAT) est associé à un effet athérogène.
- 155 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
III. Etude du gène de SR-BI
Voir publication 2 (annexe3):
Rejeb J, Omezzine A, Boumaiza I, Rebhi L, Kacem S, Rejeb NB, Nabli N, Abdelaziz AB,
Boughzala E, Bouslama A. Association of three polymorphisms of scavenger receptor class
BI gene (exon8, exon1, intron5) with coronary stenosis in a coronary Tunisian population.
Gene. 2012 Oct 3. pii: S0378-1119(12)01179-1.
III.1. Introduction :
Le récepteur SR-BI joue un rôle majeur dans la régulation du métabolisme des lipoprotéines
et l'athérosclérose. Il lie la particule HDL avec une haute affinité et permet le transfert d'esters
de cholestérol à partir des particules HDL vers les cellules par captation sélective (Valacchi et
al., 2011). Bien que le rôle de SR-BI dans la protection contre l'athérosclérose ait été bien
établi sur des modèles de souris (Trigatti et al., 2003), son rôle chez les humains n'a pas été
largement étudié. Nous nous sommes intéressés, dans cette thèse, à l’étude de trois
polymorphismes de SCARB1 (exon8 (C/T) (rs5888), exon1 (G/A) (rs4238001), intron5
(C/T)). A notre connaissance, il n’y a pas de publication publiée concernant le génotypage de
SCARB1 ou son association avec le risque coronaire dans la population Tunisienne.
III.2. Présentation du travail :
L’objectif de ce travail est d’étudier l’association de ces polymorphismes au niveau de
SCARB1 avec le profil lipidique et la SCS, dans notre population. Nous avons recherché des
interactions entre ces polymorphismes et un certain nombre de FRCV (tabac, diabète, sexe
…) dans la prédisposition à la SCS. Notre attention a aussi porté sur les combinaisons
génotypiques de ces trois polymorphismes et leurs associations avec la SCS.
III.3. Méthodes :
III.3.1. Génotypages des polymorphismes de SCARB1 :
Les génotypes de chaque polymorphisme de SCARB1 (exon8 (C/T), exon1 (G/A), intron5
(C/T)) ont été déterminés par la méthode PCR-RFLP, en utilisant les amorces et les enzymes
de restriction décrites dans le tableau XIII (p.157). Nous nous sommes basés sur un protocole
de PCR décrit par Acton et al., avec quelques modifications (Acton et al., 1999). Après
optimisation à nos conditions de travail, la composition du mélange réactionnel, pour
l’intron5 est: pour un volume de 20µL : 0.4 μM de chaque amorce, 100 ng d’ADN, 200 μM
- 156 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
de dNTPs, 1.5 mM de MgCl2 et 1U de GoTaq Polymérase. Concernant les polymorphismes
exon1 et exon8, la composition du mélange réactionnel est pour un volume de 20µL : 0.3 μM
de chaque amorce, 100 ng d’ADN, 150 μM de dNTPs, 1.5 mM de MgCl2 et 2U de GoTaq
Polymérase. Le programme de la PCR est le suivant: 2 min à 94°C, (40 s à 94°C, 30 s à 60°C,
1 min à 72°C) 35 cycles, 5 min à 72°C.
La détection des polymorphismes est réalisée par électrophorèse sur gel d’agarose 2% et une
révélation par le BET sous rayon UV du produit d’amplification en présence d’un marqueur
de poids moléculaire.
Tableau XIII. Méthodes de génotypage (PCR-RFLP) des polymorphismes de SCARB1
Amorces sens (5’→3)
Amorces anti-sens (5’→3’)
Exon8
(C/T)
TTGTATGATGTCCCCTCCCT
TTCCCACCACCCCAGCCCAC
Exon1
(G/A)
CCGGCGATGGGGCATAAAACCACT
CGCCCAGCACAGCGCACAGTAGC
Intron5 GCCCAGAATGTTCAGACCAG
(C/T) GCACCCTCTTCACGACAAAG
- 157 -
Enzymes
HaeIII (3U)
37°C/2h
AluI (3U)
37°C/2h
ApaI (12U)
37°C/nuit
Fragment amplifié (pb)
Homozygote normal
Homozygote muté
261
158, 103
261
263
263
192,71
291
194,67,30
194,97
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
III.4. Résultats et discussion :
III.4.1. Fréquences des polymorphismes de SCARB1 :
Tableau XIV. Comparaison des fréquences génotypiques des polymorphismes de
SCARB1 selon la présence ou non de la SCS chez notre population d’étude.
Génotypes
Intron 5(C/T)
CC
CT
TT
Exon 1 (G/A)
GG
GA
AA
Exon 8 (C/T)
CC
CT
TT
Fréquences % (nombre)
SCS+ (n=212)
SCS- (n=104)
p
62.3 (132)
31.1 (66)
6.6 (14)
65.4 (68)
31.7 (33)
2.9 (3)
0.380
40.1 (85)
50.94 (108)
8.96 (19)
39.4 (41)
52.9 (55)
7.7 (8)
0.909
49.5 (105)
45.3 (96)
5.2 (11)
32.7 (34)
55.8 (58)
11.5 (12)
0.007
Le tableau XIV présente les fréquences génotypiques des trois polymorphismes de SCARB1.
Chaque polymorphisme obéit à la loi de Hardy-Weinberg. Nous avons rapporté que les
patients portant l’allèle muté de l’exon8 sont significativement plus fréquents dans le groupe
SCS- (p=0.007). Notre résultat concorde avec certaines études (Zhong et al., 1996; Hong et
al., 2002). Les fréquences de l’allèle muté de chaque polymorphisme dans les groupes SCS+
et SCS- sont, respectivement : 0.278 et 0.394 pour l’exon8, 0.344 et 0.341 pour l’exon1,
0.221 et 0.187 pour l’intron5. Aucune différence des fréquences alléliques n’a été observée
entre les 2 groupes pour chaque polymorphisme.
III.4.2. Association des polymorphismes de SCARB1 et du profil apolipoprotéique :
Dans notre population d’étude, nous avons rapporté que seul le polymorphisme exon8 (C/T)
est associé au profil apolipoprotéique. En effet, les individus portant le génotype TT sont
associés à une augmentation significative de la concentration d’apoAI (1.24±0.28 g/L pour
CC, 1.31±0.44 g/L pour CT et 1.48±0.67 g/L pour TT; p=0.022) et semblent tendre vers une
augmentation de HDL-C (0.987±0.3 mmol/L pour CC, 1.057±0.41 mmol/L pour CT et
1.136±0.29 mmol/L pour TT; p=0.097). Nos résultats concordent avec d’autres études
(Richard et al., 2005; Roberts et al., 2007). Dans notre étude, nous n’avons pas rapporté
d’associations significatives entre les polymorphismes exon1 et intron5 et le profil
apolipoprotéique. Plusieurs études précédentes ont étudié cette association, mais leurs
- 158 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
résultats ont été controversés (Rodriguez-Esparragon et al., 2005; Tanaka et al., 2007; Roberts
et al., 2007; Liu et al., 2008).
Le rôle du récepteur SR-BI dans le métabolisme des HDL a été bien mis en évidence sur des
souris transgéniques. Il a été rapporté que la surexpression de SR-BI chez des souris abouti à
des réductions dramatiques des concentrations de HDL-C (Kozarsky et al., 1997; Wang et al.,
1998). Par contre, les diminutions de l'expression de SR-BI a été associée à une augmentation
marquée de HDL-C, caractérisée par de larges particules HDL riches en cholestérol et une
clairance réduite de HDL-C (Ueda et al., 2000). Chez les humains, l'influence de SR-BI sur
HDL-C et d'autres lipoapoprotéines n'est pas bien connue, en raison de la difficulté de
déterminer la fonction et l'activité de SR-BI chez eux et du manque d'études
épidémiologiques.
Dans notre étude, nous avons rapporté que la concentration de HDL-C semble être élevée
chez les patients portant l’exon8, ce qui peut suggérer une association de ce SNP synonyme
avec une basse expression de SR-BI. En effet, jusqu’à récemment, les SNPs synonymes ou
silencieux ont été considérés comme être seulement des marqueurs pour des SNPs causal non
identifié ; cependant, plusieurs études suggèrent que les SNPs silencieux puissent directement
affecter l'expression et/ou la fonction de la protéine (Komar, 2007; Nielsen et al., 2007; Sauna
et al., 2007). Constantineau et al. (2010) ont rapporté que, in vitro, le polymorphisme exon8
affecte la structure secondaire de l’ARN de SR-BI, ce qui diminue sa traduction menant à une
diminution significative de l'expression de la protéine SR-BI. Le mécanisme par lequel les
SNPs synonymes changent la structure secondaire n’est pas encore clair. De plus, la fonction
SR-BI est significativement plus basse dans les macrophages exprimant le polymorphisme
exon8. Néanmoins, plusieurs études sont nécessaires pour comprendre entièrement la
fonctionnalité de l’exon8 et son association avec les MCV.
III.4.3. Associations des polymorphismes de SCARB1 avec la SCS :
Le tableau XV (p.160) montre les ORs de la SCS associés aux polymorphismes de SCARB1.
Nous avons rapporté qu’après ajustement aux facteurs confondants, les ORs de la SCS
associés aux génotypes TT et CT du polymorphisme exon8 sont, respectivement : 0.586, IC
95% 0.362-0.948; p=0.029 et 0.556, IC 95% 0.326-0.949; p=0.031. Ceci suggère que ces
génotypes sont approximativement associés à une diminution de 41% du risque de la SCS.
Plusieurs études ont rapporté que le polymorphisme exon8 est associé aux MCV (Ritsch et al.,
2007; Rodriguez-Esparragon et al., 2005).
- 159 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
Tableau XV. Odds ratios (ORs) associés à la sténose coronaire significative selon les
polymorphismes de SCARB1.
Polymorphismes
Intron 5 (C/T)
CC
CT
TT
Exon 1 (G/A)
GG
GA
AA
Exon 8 (C/T)
CC
CT
TT
OR
ORs
IC 95%
p
OR
ORs ajustés
IC 95%
1
1.013
3.54
0.614-1.671
0.998-12.56
1
0.047
1
1.129
2.035
0.644-1.981
1.035-4.003
0.672
0.039
1
1.229
1.345
0.755-2.001
0.552-3.277
0.455
0.658
1
1.409
1.148
0.817-2.431
0.695-1.895
0.218
0.591
1
0.541
0.319
0.330-0.884
0.129-0.789
0.014
0.016
1
0.556
0.586
0.326-0.949
0.362-0.948
0.031
0.029
p
Cet effet protecteur semble être particulièrement plus significatif chez les femmes (tableau
XVI, p.160), les non diabétiques (tableau XVII, p.161) et les non fumeurs (tableau XVIII,
p.162). L’explication probable que cet effet n’est pas significativement prononcé chez les
fumeurs et les diabétiques est que ces désordres métaboliques sont des FRCV, caractérisés par
de basses concentrations de HDL-C (Kannel and McGee, 1979; Ambrose and Barua, 2004).
Tableau XVI. Odds ratios (ORs) associés à la sténose coronaire significative des
polymorphismes de SCARB1 selon le sexe.
Polymorphismes
a
OR
Intron 5 (C/T)
CC
CT
TT
Exon 1 (G/A)
GG
GA
AA
Exon 8 (C/T)
CC
CT
TT
a
Femmes
CI 95%
p
OR
Hommes
IC 95%
a
p
1
2.17
1.501
0.47-4.54
0.652-3.45
0.37
0.34
1
1.707
2.679
0.829-3.514
0.946-7.59
0.147
0.064
1
0.988
0.961
0.483-2.022
0.5-1.849
0.974
0.906
1
1.57
1.463
0.862-2.806
0.768-2.78
0.140
0.248
1
0.291
0.468
0.137-0.621
0.239-0.917
0.001
0.027
1
0.830
0.676
0.449-1.533
0.336-1.36
0.551
0.272
Ajusté à l’âge, tabac, diabètes, hypertension, hypoHDLémie, syndrome métabolique
- 160 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
La diminution du risque de la SCS a été observée chez les femmes, mais pas chez les
hommes. Cet effet peut être expliqué par l'influence d'hormones sexuelles. Cette association
peut être une interaction possible entre le génotype de SCARB1 et la régulation œstrogène
dépendante de l'expression de SR-BI. En effet, il a été montré que le traitement par des doses
élevées d'œstrogène chez des rats réduit l'expression de SR-BI dans le foie (Landschulz et al.,
1996; Fluiter et al., 1998). De plus, plusieurs études ont observé des diminution des MCV
chez des femmes qui prennent de l'œstrogène post-ménopause que chez celles ne recevant pas
cette thérapie (Grady et al., 1992; Sidney et al., 1997).
Tableau XVII. Odds ratios (ORs) associés à la sténose coronaire significative des
polymorphismes de SCARB1 selon le statut diabétique.
Polymorphismes
ORa
Diabétiques
IC 95%
p
ORa
Non diabétiques
IC 95%
Intron 5 (C/T)
CC
1
1
CT
1.39
0.638-3.03
0.406
0.951
0.492-1.839
TT
2.76
0.964-7.95
0.059
1.44
0.622-3.37
Exon 1 (G/A)
GG
1
1
GA
1.625
0.749-3.526
0.219
0.971
0.537-1.75
AA
2.75
1.342-5.63
0.725
0.399-1.317
0.006
Exon 8 (C/T)
CC
1
1
CT
0.803
0.406-1.588
0.528
0.382
0.211-0.692
TT
0.756
0.351-1.627
0.474
0.505
0.282-0.906
a
Ajusté à l’âge, tabac, sexe, hypertension, hypoHDLémie, syndrome métabolique
- 161 -
p
0.881
0.390
0.922
0.291
0.002
0.022
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
Tableau XVIII. Odds ratios (ORs) associés à la sténose coronaire significative des
polymorphismes de SCARB1 selon le statut tabagique.
Polymorphismes
a
Fumeurs
IC 95%
a
Non fumeurs
IC 95%
OR
p
OR
Intron 5 (C/T)
CC
1
1
CT
2.105
0.882-5.025
0.094
1.17
0.558-2.469
TT
1.85
1.38-1.76
1.86
0.931-3.75
0.047
Exon 1 (G/A)
GG
1
1
GA
1.16
0.517-2.6
0.719
1.107
0.618-1.98
AA
1.32
0.542-3.207
0.541
1.126
0.648-1.95
Exon 8 (C/T)
CC
1
1
CT
0.783
0.360-1.703
0.537
0.495
0.266-0.924
TT
0.743
0.389-1.420
0.369
0.446
0.230-0.864
a
Ajusté à l’âge, sexe, diabètes, hypertension, hypoHDLémie, syndrome métabolique
p
0.678
0.078
0.732
0.674
0.027
0.017
Dans notre étude, nous avons aussi rapporté que le génotype TT du polymorphisme intron5
est associé à une augmentation du risque de la SCS (OR=2.035, IC 95% 1.035-4.003,
p=0.039), particulièrement chez les fumeurs (risque élevé de 85%; OR=1.85, IC 95% 1.381.76; p=0.047) (tableau XVIII, p.162). Le rôle causatif des polymorphismes intron5 et exon8
est toujours peu clair. L'intron5 est situé sur un intron, sans effet connu sur la régulation du
gène. L'exon8 est silencieux, n'aboutissant à aucun changement de la séquence d'acide aminé
du produit de la protéine. Il est donc possible que les associations observées puissent être une
conséquence de DL entre ces polymorphismes et une mutation fonctionnelle sur SCARB1, ou
alternativement avec une autre mutation fonctionnelle à un locus voisin, où plusieurs autres
gènes qui sont impliqués dans le métabolisme lipidique et prédisposent à l'athérosclérose, ont
été localisés (Rodriguez-Esparragon et al., 2005; Ritsch et al., 2007).
Concernant le polymorphisme exon1, le génotype AA est associé à une augmentation du
risque de la SCS chez les diabétiques (OR=2.75, IC 95% 1.342-5.63, p=0.006) et les patients
ayant un SM (OR=2.25, IC 95% 1.081-4.7, p=0.03). Nous n’avons pas observé d’association
significative avec le risque de la SCS pour les polymorphismes exon8 et intron5, selon la
présence ou non du SM.
Plusieurs études ont rapporté que le gène SR-BI est localisé sur le chromosome 12q24, région
en liaison avec le diabète de type 2 et l'obésité abdominale (Florez et al., 2003; Wilson et al.,
- 162 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
2006; McCarthy et al., 2009). Nos résultats concernant le polymorphisme exon1 sont en
accord avec ceux rapportés par Osgood et al. (2003) qui ont trouvé des interactions
significatives entre les génotypes de l’exon1 et le diabète de type 2. L’association des
polymorphismes de SCARB1 avec des traits de diabète a été mis en évidence par une seule
étude qui a rapporté que la sensibilité d'insuline à un régime diététique gras est associée au
polymorphisme exon1 (Pérez-Martínez et al., 2005). Le polymorphisme exon1 code pour une
substitution de glycine par serine à la deuxième position d'acide aminé, qui modifie un des
sites potentiel d’acylation dans la molécule SR-BI, ajoutant un support à sa fonctionnalité
(Osgood et al., 2003).
III.4.4. Déséquilibre de liaison et analyse haplotypique :
Dans notre population d’étude, nous avons observé un déséquilibre de liaison significatif entre
les polymorphismes exon8 et exon1 (D’=0.087, p=0.04). Lorsque les 3 polymorphismes de
SCARB1 sont combinés (exon8 (C/T), exon1 (G/A), intron5 (C/T)), l’haplotype (CAT)
semble être le plus athérogène. En effet, dans l’analyse haplotypique, après ajustement aux
facteurs confondants, cet haplotype semble augmenter le risque de la SCS comparé à
l’haplotype sauvage (possédant tous les allèles communs: CGC) (OR=1.30, IC 95% 1.0291.66, p=0.028). En plus, le risque de la SCS augmente d’approximativement 4 fois, chez les
individus portant l’haplotype (CAT) (OR=3.64, IC 95% 1.21-10.89, p=0.018), comparé à
l’haplotype (TGC), celui qui semble être le plus protecteur contre la SCS. Nous n’avons pas
observé d’associations entre le profil lipidique et les combinaisons haplotypiques.
En conclusion, dans notre population d’étude, les individus portant l’allèle muté du
polymorphisme exon8 semblent augmenter les concentrations d’apoAI et de HDL-C et
réduire le risque de la SCS. Cependant, les polymorphismes intron5, exon1 et l’haplotype
(CAT) semblent avoir un effet athérogène. La relation entre SR-BI et HDL-C est complexe.
Des études supplémentaires sont nécessaires pour bien comprendre et définir le phénotype
clinique associé à ces variantes génétiques. De nouvelles études portant sur l'association des
polymorphismes de SCARB1 avec le développement des MCV chez d'autres groupes raciaux
ou ethniques sont aussi nécessaires.
- 163 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
IV. Etude du gène de la CETP
Voir publication 3 (annexe3):
Rejeb J, Omezzine A, Rebhi L, Naffeti I, Kchok K, Belkahla R, Bel Hadjmbarek I, Ben
Rejeb N, Nabli N, Boujelbene A, Ben Abdelaziz A, Boughzala E, Bouslama A. Association
of the cholesteryl ester transfer protein Taq1 B2B2 genotype with higher high-density
lipoprotein cholesterol concentrations and lower risk of coronary artery disease in a
Tunisian population. Arch Cardiovasc Dis. 2008; 101(10):629-36.
Voir publication 4 (annexe3):
Rejeb J, Omezzine A, Boumaiza I, Rebhi L, Rejeb NB, Nabli N, Abdelaziz AB, Boughzala
E, Bouslama A. Four polymorphisms of cholesteryl ester transfer protein gene and
coronary stenosis in a Tunisian population. J Cardiovasc Med (Hagerstown). 2012 Sep;
13(9):546-53.
IV.1. Introduction :
Comme nous l’avons vu dans la partie théorique, la CETP joue un rôle majeur dans le TIC.
Elle permet le transport des esters du cholestérol en échange de TG, à partir des particules
HDL vers les lipoprotéines contenant apoB. Elle peut avoir un rôle important dans
l’athérogénèse, à travers ses effets sur le métabolisme des HDL. Il existe donc un intérêt
majeur à développer des agents pharmacologiques modifiant favorablement ces mécanismes,
pour sur-réguler le TIC, et réduire potentiellement l’athérosclérose par l’intermédiaire de cette
voie (Tall, 2010; Joy, 2012). Parmi les polymorphismes décrits sur le gène de la CETP, il y a
ceux qui sont impliqués dans les MCV. Les études ayant recherché un lien entre ces
polymorphismes et les MCV ont abouti à des résultats contradictoires (Oliveira and de Faria,
2011). Nous nous sommes alors intéressés, dans cette thèse, à la mise en évidence de quatre
polymorphismes du gène de la CETP (Taq1B [rs708272], I405V [rs5882], R451Q
[rs1800777] et A373P [rs5880]). En plus, à notre connaissance, il n’y a pas de publications
concernant ces polymorphismes ou leur association avec le risque coronaire dans la
population Tunisienne.
IV.2. Présentation du travail :
Nous avons étudié l’association de ces polymorphismes au niveau du gène de la CETP avec le
profil lipidique et la SCS. Nous avons recherché des interactions entre ces polymorphismes et
- 164 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
un certain nombre de FRCV (tabac, diabète, sexe …) dans la prédisposition à la SCS. Notre
attention a aussi porté sur les combinaisons génotypiques de ces quatre polymorphismes et
leurs associations avec la SCS.
IV.3. Méthodes :
IV.3.1. Génotypages des polymorphismes de la CETP :
Les génotypes de chaque polymorphisme de la CETP (TaqIB, R451Q, A373P et I405V) ont
été déterminés par la méthode PCR-RFLP, en utilisant les amorces et les enzymes de
restriction décrites dans le tableau XIX (p.165). Nous nous sommes basés sur un protocole de
PCR publié par Agerholm-Larsen et al. (2000a) pour l’étude les polymorphismes R451Q et
A373P, et sur celui de Fumeron et al. (1995) pour le polymorphisme TaqIB. Pour détecter le
polymorphisme I405V, nous avons suivi la méthode d’Agerholm-Larsen et al. (2000b). Après
optimisation à nos conditions de travail, la composition du mélange réactionnel est: pour un
volume de 30 µL : 0.266 μM de chaque amorce, 100 ng d’ADN, 100 μM de dNTPs et 1U de
GoTaq Polymérase. Le programme PCR est : 3 min à 95°C, (30 s à 95°C, 30 s à 60°C, 45 s à
72°C) 30 cycles, 5 min à 72°C. La détection des polymorphismes est réalisée par
électrophorèse sur gel d’agarose 2% et une révélation par le BET sous rayon UV du produit
d’amplification en présence d’un marqueur de poids moléculaire.
Tableau XIX. Méthodes de génotypage (PCR-RFLP) des polymorphismes de la CETP
Amorces sens (5’→3)
Amorces anti-sens (5’→3’)
Enzymes
TaqIB
CACTAGCCCAGAGAGAGGAGTGCC
CTGAGCCCAGCCGCACACTAAC
TaqI (2U)
65°C/2h
R451Q
TCGCCCAGGGCTCGAGGTAGTGTTT
ACCCAACTTCCACCACGCTG
XhoI (3U)
37°C/nuit
A373P
GTTTCTCTCCCCAGGATATCGTGAC
GTCAAGTTGGAAACAGTCTTTGGTG
StuI (2U)
37°C/nuit
I405V
AATGCTTGTCCAGGCCGTGCAGCAT
CAGTTTCCCCTCCAGCCCACACTTA
FokI (2.5U)
37°C/nuit
- 165 -
Fragment amplifié (pb)
Homozygote normal
Homozygote muté
535
361, 174
535
448
361,76,11
448
523
281,206,36
317,206
184
125,59
184
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
IV. 4. Résultats et discussions :
IV.4.1. Fréquences des polymorphismes de la CETP :
Tableau XX. Fréquences génotypiques et alléliques des polymorphismes du gène CETP
selon la présence ou non de la SCS chez notre population d’étude
Génotypes
TaqIB
B1B1
B1B2
B2B2
Fréquence de l’allèle B2
I405V
II
IV
VV
Fréquence de l’allèle V
R451Q
RR
RQ
QQ
Fréquence de l’allèle Q
A373P
AA
AP
PP
Fréquence de l’allèle P
Fréquences % (nombre)
SCS + (n=212)
SCS- (n=104)
49 (104)
44 (93)
7 (15)
0.29
42.9 (45)
45.4 (47)
11.7 (12)
0.34
37.7 (80)
48.1 (102)
14.2 (30)
0.38
42.3 (44)
43.3 (45)
14.4 (15)
0.36
36.8 (77)
52.4 (112)
10.8 (23)
0.37
39.4 (50)
51.9 (47)
8.7 (7)
0.35
95.7 (203)
4.3 (9)
0
0.02
96.1 (100)
3.9 (4)
0
0.02
p
0.637
0.939
0.790
0.976
0.109
0.976
0.932
1
Nous n’avons pas trouvé de différences significatives entre les fréquences génotypiques et
alléliques des 4 polymorphismes étudiés du gène de la CETP (tableau XX, p.166). Chaque
polymorphisme obéit à la loi de Hardy-Weinberg. Concernant le polymorphisme A373P, nous
n’avons observé aucun génotype muté dans les deux groupes, donnant une fréquence de
l’allèle P égale à 2%. D'autre part, les fréquences des allèles TaqIB B2, 405V et 451Q sont
respectivement (0.29, 0.38 et 0.37 chez le groupe SCS+ ; 0.34, 0.36 et 0.35 chez le groupe
SCS-).
La distribution des fréquences de chaque polymorphisme varie selon l’ethnicité. En effet, la
fréquence de l’allèle B2 du polymorphisme TaqIB (0.29), chez le groupe SCS+, est
comparable à celle trouvée chez une population Américaine Africaine (0.26) (Cuchel et al.,
2002). Elle est moins élevée que les fréquences trouvées chez les populations Américaine
(0.44), Israélienne (0.43) et Taïwanaise (0.42) (Ordovas et al., 2000; Kark et al., 2000; Hsu et
al., 2002). Concernant le polymorphisme I405V, la fréquence de l’allèle 405V est de 0.38 et
- 166 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
semble être comparable à celle trouvée chez une population Taïwanaise (0.39) (Wu et al.,
2001) et Iranienne (0.36) (Ghatreh Samani et al., 2009). Elle est plus élevée que celle observée
chez des Caucasiens (0.32) (Kolovou et al., 2006) et moins élevée que celle estimée chez la
population Tamoule (0.47) (Padmaja et al., 2009a). Les fréquences de l’allèle mineur des
polymorphismes R451Q et A373P sont plutôt rares, selon certaines études (Corbex et al.,
2000; Agerholm-Larsen et al., 2000a; Tsai et al., 2008).
IV. 4.2. Association des polymorphismes de la CETP et du profil apolipoprotéique :
Dans notre population d’étude, nous n’avons pas observés d’associations significatives entre
les polymorphismes A373P et I405V du gène de la CETP et le profil apolipoprotéique. Par
contre, nous avons rapporté que les porteurs de l’allèle B2, comparés au génotype B1B1, sont
associés à une augmentation des concentrations de HDL-C (1.041±0.294 mmol/L versus
0.995±0.277 mmol/L; p= 0.039) et d’apoAI (1.27±0.472 g/L versus 1.182±0.334 g/L; p=
0.020). Le rapport apoB/apoAI est significativement plus bas chez les porteurs de l’allèle B2
que chez le génotype B1B1 (0.858±0.596 versus 0.964±0.322; p= 0.017). Nous n’avons pas
trouvé d’autres associations entre le polymorphisme TaqIB et les lipoapolipoprotéines.
Nous avons examiné l'effet de ce polymorphisme sur le profil apolipoprotéique selon le sexe.
Nous avons rapporté que les hommes porteurs de l’allèle B2, comparés aux hommes ayant un
génotype B1B1, sont associés à une augmentation des concentrations de HDL-C
(respectivement, 1.009±0.27 mmol/L versus 0.894±0.20 mmol/L; p< 0.001) et d’apoAI
(respectivement, 1.186±0.30 g/L versus 1.081±0.31 g/L; p= 0.005). Les hommes porteurs de
l’allèle B2 sont aussi associés à un rapport apoB/apoAI bas comparés aux hommes ayant un
génotype B1B1 (0.883±0.30 versus 1.056±0.31; p= 0.030). Par contre, aucune différence
significative pour les lipides et les apo n’a été observée, chez les femmes.
Nous avons aussi rapporté que les porteurs de l’allèle B2 du polymorphisme TaqIB semble
être associés à une diminution du risque d’avoir une hypoHDLémie (OR=0.615, IC 95%
0.377–1.002, p=0.035).
Plusieurs études ont montré que le génotype B2B2 est associé à des concentrations élevées de
HDL-C (Kuivenhoven et al., 1998; Freeman et al., 2003). Le mécanisme par lequel le
polymorphisme TaqIB peut affecter les concentrations de HDL-C n’est pas connu. Le
polymorphisme TaqIB ne peut pas être responsable tout seul des changements des
concentrations de HDL-C puisque c’est une mutation silencieuse, localisé sur l’intron 1 et ne
peut pas influencer directement la régulation transcriptionnelle de la CETP. Cette
augmentation de HDL-C peut être due à une liaison avec d’autres polymorphismes
- 167 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
fonctionnels dans la région promotrice du gène de la CETP qui peut causer la diminution de
l’activité de la CETP responsable de l’augmentation de HDL-C (Klerkx et al., 2003).
L’influence du polymorphisme TaqIB sur les concentrations plasmatiques de HDL-C dépend
de la nature de la population et est influencée par les facteurs de l’environnement tels que la
consommation de l’alcool et le tabagisme.
Dans notre étude, l’interaction du tabagisme avec le polymorphisme TaqIB n’est étudiée que
chez les hommes, car dans notre population d’étude, toutes les femmes ne fument pas. Les
porteurs de l’allèle B2 ont significativement des concentrations de HDL-C plus élevées
comparé au génotype B1B1, chez les hommes fumeurs (0.969±0.27 mmol/L versus
0.883±0.21 mmol/L) et non fumeurs (1.125±0.24 mmol/L versus 0.909±0.17 mmol/L).
Cependant, l’augmentation de la concentration de HDL-C, chez les porteurs de l’allèle B2
comparée aux génotypes B1B1, est plus significative chez les non fumeurs (p< 0.001) par
rapport aux fumeurs (p= 0.006).
Nos résultats concordent avec plusieurs études qui ont montré que l’effet de l’allèle B2 à
augmenter les niveaux de HDL-C était plus fort chez les non fumeurs (Hannuksela et al.,
1994 ; Freeman et al., 1994). En controverse, plusieurs études n’ont pas rapporté d’interaction
évidente entre le polymorphisme TaqIB et le tabac (Fumeron et al., 1995; Chen et al., 2002;
Tsujita et al., 2007). En effet, Fumeron et al. (1995) n’ont pas trouvé d’interaction avec le
tabagisme, mais ils ont trouvé une importante association avec la consommation de l’alcool
dans l’Etude Cas Témoins de l’Infractus du Myocarde (ECTIM). Nous n’avons pas étudié
l’effet de l’alcool, puisque la quasi-totalité de notre population d’étude s’est déclarée non
consommatrice d’alcool.
Concernant le polymorphisme R451Q, les patients porteurs de l’allèle Q (génotypes RQ+QQ)
sont associés à une augmentation des concentrations du cholestérol total (5.34±1.4 mmol/L
versus 4.98±1.41 mmol/L; p=0.029) et d’apoB (1.24±0.51 g/L versus 1.11±0.39 g/L;
p=0.021) et à une diminution du HDL-C (1.01±0.33 mmol/L versus 1.07±0.39 mmol/L;
p=0.013), comparés aux patients avec un génotype RR-451. Cette diminution en HDL-C a été
rapportée dans deux autres études (Agerholm-Larsen et al., 2000a; Tsai et al., 2008) alors que
kakko et al. n’ont pas trouvé d’association (Kakko et al., 1998).
L’explication biologique plausible de cette association est peut être que la mutation à la
position 451 induit une activité élevée de la CETP permettant un plus grand transfert des
esters de cholestérol hors des particules HDL, chez les porteurs que chez les non porteurs
(Agerholm-Larsen et al., 2000a). Nous n’avons pas pu tester cette hypothèse dans notre étude,
faute de budget. Cependant, certaines études ont rapporté que les porteurs de la mutation
- 168 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
R451Q sont associés à une activité élevée de la CETP (Kakko et al., 1998; Tsai et al., 2008).
Ceci réduirait la quantité des esters de cholestérol dans chaque particule HDL et peut-être
stimulerait aussi la régulation négative ou "down regulation" du nombre total des particules
HDL. Cette hypothèse implique aussi que moins de particules HDL seraient disponibles pour
le TIC, un effet potentiellement délétère (Agerholm-Larsen et al., 2000a).
Le codon 451 dans l’exon 15 est localisé dans le domaine putatif de la liaison des lipides du
gène de la CETP (Drayna et al., 1987). Une telle substitution d'acide aminé (aboutissant à la
perte de charge positive à cette position) pourrait donc influencer la liaison de la CETP aux
esters de cholestérol de HDL et affecter ainsi indirectement l'efficacité de la protéine à
transférer les esters de cholestérol hors des particules HDL. Donc, il semble plausible que
cette substitution peut affecter l'activité de la CETP et par cet effet, diminuer les
concentrations de HDL-C (Agerholm-Larsen et al., 2000a).
Concernant les polymorphismes A373P et I405V, nous n’avons pas observé d’associations
significatives avec le profil apolipoprotéique, dans notre population d’étude.
Les études sur l’impact de ces polymorphismes sur le profil lipidique ont rapporté des
résultats controversés. Certaines études ont montré que les porteurs de l’allèle 405V sont
associé à une augmentation de HDL-C (Borggreve et al., 2006; Doğru-Abbasoğlu et al.,
2009); alors que d’autres n’ont observé aucun changement (Kolovou et al., 2006; Padmaja et
al., 2009a; Ghatreh Samani et al., 2009). Le manque d'association dans cette étude pourrait
être attribué au fait que le polymorphisme I405V est une modification conservative de la
CETP au résidu 405 d'une isoleucine à une valine et ceci ne pourrait pas être une cause directe
pour une altération de l'activité CETP et des valeurs de HDL-C (Padmaja et al., 2009a).
Cependant, ce polymorphisme, semble être fonctionnellement silencieux et les associations
détectées peuvent donc probablement être dues à un DL avec des mutations fonctionnelles
inconnues du gène CETP ou dans d'autres gènes très proche du locus CETP. D’autres études
ont rapporté que les porteurs de l’allèle 373P sont associés à une diminution de HDL-C (Tsai
et al., 2009; Do et al., 2009). Dans notre population d’étude, nous n’avons observé aucun
génotype muté du polymorphisme A373P, ce qui peut expliquer qu’il ne présente aucun effet
sur le profil lipidique.
IV.4.3. Associations des polymorphismes de la CETP avec la présence de la SCS :
Dans notre étude, nous avons observé que les porteurs de l’allèle B2 du polymorphisme
TaqIB réduisent le risque de la SCS de 18%, chez la population coronarienne (OR= 0.82, IC
95%: 0.6-0.97; p= 0.039), après ajustement des FR (âge, sexe, tabac, diabète, hypertension et
- 169 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
dyslipidémie). Cet effet protecteur semble être plus prononcé chez les hommes. En effet, l’OR
de la SCS associé à l’allèle B2 chez les hommes est de 0.77 (IC 95%: 0.57-0.91; p= 0.037).
Les hommes non fumeurs porteurs de l’allèle B2 semblent aussi être associé à une diminution
de 38% du risque de la SCS avec un OR=0.62 (IC 95%: 0.29-0.92; p= 0.029). Aucune
association significative avec la SCS n’a été rapporté chez les femmes (OR= 0.90, IC 95%:
0.08-1.19; p= 0.067). Ces résultats confirment le concept que l’augmentation de la
concentration de HDL-C semble être associée à un risque réduit de la SCS. Nos résultats
concordent avec plusieurs études (Boekholdt et al., 2005; Thompson et al., 2008) telles que
l’étude de Framingham (Ordovas et al., 2000), WOSCOP (Freeman et al., 2003), VA-HIT
(Brousseau et al., 2002), alors que d’autres ne rapportent aucune association (Whiting et al.,
2005; Corella et al., 2010). En controverse, Borggreve et al. (2006) ont rapporté une
augmentation du risque.
Nous avons aussi rapporté qu’après ajustement des facteurs confondants, seuls les porteurs de
l’allèle Q du polymorphisme R451Q ont été associés à une augmentation du risque de la SCS
(OR=1.74, 95 % CI 1.16-2.61, p=0.007). Notre résultat concorde avec celui de Tsai et al.,
(2008). Cet effet athérogène peut être expliqué par le fait que l’allèle 451Q soit associé à une
diminution de HDL-C et une augmentation d’apoB et de l’activité de la CETP. En effet,
plusieurs études ont rapporté que la diminution de l’activité de la CETP peut être liée à une
augmentation des HDL-C, une diminution des LDL-C et un faible risque de MCV (Thompson
et al., 2008). Cependant, l'augmentation de l’activité de la CETP diminue la concentration de
HDL-C et augmente celle de LDL-C ainsi que l'athérosclérose (Tsai et al., 2008).
Aucune association significative n’a été observée entre les polymorphismes A373P et I405V
et la SCS. Plusieurs études ont retrouvé le même résultat en rapportant que le polymorphisme
I405V n’est pas associé au risque cardiovasculaire (Ghatreh Samani et al., 2009; Padmaja et
al., 2009a) ; alors que d’autres ont montré une diminution de ce risque (Kolovou et al., 2006;
Borggreve et al., 2006; Isaacs et al., 2007). Par contre, l’étude Copenhagen City Heart Study a
rapporté une augmentation du risque (Agerholm-Larsen et al., 2000a). Selon les études de
Tsai et al., le polymorphisme A373P semble être proathérogène (Tsai et al., 2008; 2009).
Puisque ce polymrphisme est rare, nous n’avons pas pu étudier son effet sur le risque de la
SCS dans notre population.
IV.4.4. Déséquilibre de liaison et analyse des haplotypes :
Le polymorphisme TaqIB est en déséquilibre de liaison significatif avec V405I (D’ =0.16, p
<0.000) et A373P (D’= –1, p= 0.031). Lorsque les 4 polymorphismes de la CETP ont été
combinés (R451Q, A373P, I405V, Taq1B), en considérant 1 comme génotype sauvage et
- 170 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
2 comme porteurs de l’allèle muté, nous avons rapporté que l’haplotype (1112) semble être le
plus protecteur contre la SCS. En effet, il est plus fréquent chez les patients ne présentant pas
de SCS que chez ceux avec SCS (9.1% versus 5.9%). Par analyse haplotypique, nous avons
aussi montré qu’après ajustement aux facteurs confondants, cet haplotype est associé à une
diminution du risque de la SCS comparé à l’haplotype sauvage (ayant tout les allèles
normaux: 1111), avec un OR=0.71 (IC 95% 0.188-0.983, p=0.014). Il semble aussi être
associé à une diminution de 74% du risque d’avoir une hypoHDLémie (OR=0.26, IC 95%
0.068-0.993; p=0.043)
Par contre, nous avons rapporté que l’haplotype (2111), qui est plus fréquent chez les patients
avec SCS que ceux sans (11.1% versus 3.8%), semble augmenter de 2 fois le risque de SCS
comparé à l’haplotype sauvage (OR=2.17, IC 95% 1.06-5.88, p=0.039). Cet haplotype est
aussi associé à une augmentation du risque d’avoir une hypoHDLémie (OR=1.33, IC 95%
0.909-1.786 ; p=0.039). Aucune autre combinaison haplotypique n'a été associée à un
changement significatif des concentrations de HDL-C ou d’apoAI, à l'élévation des rapports
d’athérogénicité ou du risque de SCS.
En conclusion, nous avons rapporté que, dans notre population d’étude, le polymorphisme
TaqIB est associé à une augmentation de HDL-C et une diminution du risque de la SCS. Cet
effet protecteur semble être plus significatif chez les hommes non fumeurs. Par contre, le
polymorphisme R451Q est associé à une diminution de HDL-C, augmentation d’apoB et du
risque de la SCS. Aucune association n’a été trouvée pour les polymorphismes I405V et
A373P avec le profil lipidique ou avec l’athérogénécité. L’analyse des haplotypes a montré
que l’haplotype (1112) semble être le plus protecteur contre la SCS alors que (2111) semble
avoir un effet athérogène.
Les variants de la CETP aident à expliquer en partie le risque d’athérosclérose, mais, sans
aucun doute, beaucoup plus de gènes sont impliqués et des interactions génétiques avec
d’autres gènes et d’autres facteurs environnementaux spécifiques devront également être
étudiées plus en détail pour comprendre les contributions du métabolisme du HDL au risque
de maladie athéroscléreuse (Ordovas and Tai, 2008). La CETP est susceptible d’être une cible
potentielle pour le développement de nouveaux agents pharmacologiques qui peuvent
augmenter les concentrations de HDL-C. Il sera donc intéressant d'examiner la relation entre
les réponses à de tels médicaments et les génotypes du gène CETP (Farnier, 2012)
- 171 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
V. Etude du gène de la LCAT
V.1. Introduction :
La LCAT joue un rôle important dans le TIC. C’est une enzyme plasmatique qui estérifie le
cholestérol libre pour le transformer en ester de cholestérol qui sera par la suite capté par le
foie (Rousset et al., 2009). Son rôle complet dans la pathogénèse des MCV est controversé et
n'est toujours pas complètement compris, parce qu'il semble dépendre d'autres gènes et de
facteurs exogènes (Rousset et al., 2011; Kunnen and Van Eck, 2012). Nous nous sommes
alors intéressés, dans cette thèse, à la mise en évidence de 2 polymorphismes du gène de la
LCAT (P143L (C/T) et G30S (G/A)). A notre connaissance, il n’y a pas de publications
concernant ces polymorphismes ou leur association avec le risque coronaire dans la
population Tunisienne.
V.2. Présentation du travail :
Nous avons donc étudié l'association de ces deux polymorphismes du gène de la LCAT avec
le profil lipidique, la SCS et la sévérité de la sténose dans notre population coronarienne.
V.3. Méthodes :
V.3.1. Génotypages des polymorphismes de la LCAT :
Les génotypes de chaque polymorphisme de la LCAT (P143L (+511C>T) et G30S) ont été
déterminés par la méthode PCR-RFLP. Nous nous sommes basés sur un protocole de PCR
publié par Zhang et al. (2004) pour l’étude du polymorphisme P143L, et sur celui de Rosset et
al. (2001) pour le polymorphisme G30S. Les amorces sens et anti-sens sont, respectivement:
5’ATCCAGAGTCCAGAGTGAGG3’
polymorphisme
P143L;
et
5’CCGCAGAGACACTCACC3’,
5’AATCCAGAGTCCAGAGTGA3’
pour
le
et
5’GGCTAGGGTGGAGCACAT3’, pour le polymorphisme G30S. Après optimisation à nos
conditions de travail, la composition du mélange réactionnel est: pour un volume de 20 µL :
0.4 μM de chaque amorce, 100 ng d’ADN, 200 μM de dNTPs, 1.5 mM de MgCl2 et 2U de
GoTaq Polymérase. Le programme PCR est : 2 min à 94°C, (40 s à 94°C, 30 s à 60°C, 1 min
à 72°C) 35 cycles, 5 min à 72°C.
La détection des polymorphismes est réalisée par électrophorèse sur gel d’agarose 4% et une
révélation par le BET sous rayon UV du produit d’amplification en présence d’un marqueur
de poids moléculaire. Les produits de la PCR des polymorphismes P143L (592pb) et G30S
- 172 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
(218pb) ont été digérés, respectivement, par les enzymes MnlI (2U) et PvuII (5U), à 37°C
pendant 2 heures. Les produits digérés sont (CC: 282, 202, 98 et 10 pb ; CT: 282, 202, 171,
98, 31, 10 pb; TT: 282, 171, 98, 31, 10 pb) pour le polymorphisme P143L (+511C>T) et
(GG : 218 pb ; GA : 218, 176, 42 pb ; AA : 176, 42 pb) pour le polymorphisme G30S (G/A).
V.4. Résultats et discussion :
V.4.1. Fréquences des polymorphismes de la LCAT :
Tableau XXI. Fréquences génotypiques et alléliques des polymorphismes du gène lcat
selon la présence ou non de la SCS chez notre population d’étude
Génotypes
P143L (C/T)
CC
CT
TT
Fréquence de l’allèle T
G30S (G/A)
GG
GA
AA
Fréquence de l’allèle A
Fréquences % (nombre)
SCS+ (n=212)
SCS- (n=104)
94.8 (201)
5.2 (11)
0
0.026
95.2 (99)
4.8 (5)
0
0.024
69.3 (147)
25.5 (54)
5.2 (11)
0.18
81.7 (85)
15.4 (16)
2.9 (3)
0.10
p
0.88
0.99
0.06
0.87
Le tableau XXI présente les fréquences génotypiques et alléliques des 2 polymorphismes du
gène de la LCAT. Les génotypes GA et AA sont plus fréquents chez le groupe SCS+ comparé
au groupe SCS- (p=0.06). Nous n’avons pas trouvé de génotype muté, pour le polymorphisme
P143L, dans les 2 groupes. Ce résultat concorde avec 2 autres études qui ont trouvé que ce
polymorphisme semble être rare (Zhang et al., 2004; Agirbasli et al., 2011). Agirbasli et al.,
(2011) n’ont trouvé ni d’individus hétérozygotes ni homozygotes mutés du polymorphisme
P143L, chez une population Turque. Zhang et al. (2004) ont rapporté 11 hétérozygotes et 0
homozygote dans leur population Chinoise.
V. 4.2. Association des polymorphismes de la LCAT et du profil apolipoprotéique :
Dans notre population d’étude, aucune association n’a été rapportée sur le profil lipidique,
pour les 2 polymorphismes. Cependant, il a été rapporté que le polymorphisme P143L,
semble être associé à un bas HDL-C (Zhang et al., 2004). Rares sont les études qui portent sur
les SNPs touchant le gène de la LCAT, particulièrement en liaison avec leurs effets sur le
métabolisme des HDL (Zhang et al., 2003; Zhang et al., 2004; Holleboom et al., 2011). Il a
- 173 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
été aussi rapporté qu’il y a relativement peu d’association entre les variations de HDL-C et les
SNPs de ce gène (Spirin et al., 2007).
V.4.3. Associations des polymorphismes de la LCAT avec la présence de la SCS :
Tableau XXII. Odds ratios (ORs) associés à la sténose coronaire significative selon les
polymorphismes de la LCAT.
Polymorphismes
P143L (C/T)
CC
CT+TT
G30S (G/A)
GG
GA+AA
OR
ORs
IC 95%
p
OR
ORs ajustés
IC 95%
1
1.107
0.361-3.391
0.859
1
0.886
0.275-2.853
0.839
1
2.048
1.152-3.642
0.014
1
1.945
1.059-3.575
0.032
p
Après ajustement aux paramètres confondants, nous avons rapporté que les porteurs de l’allèle
muté de la mutation G30S semble augmenter le risque de la SCS avec un OR=1.945; IC 95%
1.059-3.575; p=0.032. Notre résultat concorde avec celui de Rosset et al. (2001) qui ont
rapporté qu’un hétérozygote pour la mutation G30S semble être associé à l’athérosclérose.
Cette mutation a été déjà décrite chez les Japonais et les Indiens (Owen et al., 1996; Yang et
al., 1997). Cet effet athérogène peut être expliqué par le fait que cette mutation est associée à
une diminution de l’activité de la LCAT (Owen et al., 1996; Yang et al., 1997), qui selon
certaines études, semble être associée à une augmentation du risque coronaire (SolajicBozicevic et al., 1991;1994).
Concernant le polymorphisme P143L, aucun effet n’a été observé (tableau XXII, p.174). En
étudiant l’association des polymorphismes de la LCAT avec la sévérité de la sténose, nous
avons rapporté que le génotype muté de la mutation G30S semble influencer
significativement la sévérité de la sténose. En effet, le score de Gensini est maximal chez les
mutés (71.3±80.7 pour AA versus 28.22±37.43 pour GA et 30.17±42.27 pour GG; p=0.004).
Concernant le polymorphisme P143L, aucun effet n’a été rapporté sur le score de Gensini
(31.58±44.78 pour CC versus 36.45±45.61 pour CT; p=0.713).
La LCAT est une protéine qui n’est pas très polymorphe et il n’existe que quelques études
examinant les polymorphismes de son gène dans la population générale. Il a été rapporté que
le polymorphisme P143L, associé à un bas HDL-C, peut être lié à une augmentation du risque
de la dyslipidémie et aux maladies coronaires chez une population Chinoise (Zhang et al.,
2004). L’association des SNPs du gène de la LCAT avec les MCV est peu claire. Ceci peut
- 174 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
être dû à la faible fréquence des SNPs communs dans les populations, la possibilité que les
SNPs ne changent pas l'activité de la LCAT et parce que peu d’associations entre les
concentrations de HDL-C et les SNPs de la LCAT ont été rapporté (Spirin et al., 2007).
Le rôle de la LCAT dans l’athérosclérose est controversé et n'a pas été définitivement établi
(Rousset et al., 2011; Kunnen and Van Eck, 2012; Ng, 2012). En effet, certaines études ont
rapporté soit une augmentation (Wells et al., 1986; Dullaart et al., 2008) soit une diminution
(Solajic-Bozicevic et al., 1991;1994) soit aucun effet (Ruhling et al., 1999) de l’activité
LCAT chez des patients ayant des maladies coronaires. Ces résultats contradictoires peuvent
être potentiellement expliqués par l’interaction d’autres protéines et enzymes du TIC avec la
LCAT lui changeant son effet sur l’athérosclérose. Par exemple, une basse activité LCAT
lorsqu’elle est aussi liée à des niveaux élevés de pré-β HDL est associée aux maladies
coronaires (Miida et al., 1996). Les quelques publications ayant étudié cet effet ne se sont pas
intéressé à ces interactions potentielles. Une autre explication possible pour les résultats
contradictoires est qu'il peut y avoir d'autres marqueurs biochimiques pour le processus
d’estérification du cholestérol qui est meilleur que l'essai d'activité LCAT in-vitro pour
évaluer le processus de maturation HDL (Dobiasova and Frohlich, 1996; Frohlich and
Dobiasova, 2003).
En conclusion, nous avons rapporté, dans notre population d’étude, que les porteurs de
l’allèle Q de la mutation G30S sont associés à un risque élevé de la SCS, sans effet significatif
sur le profil lipidique. Cette mutation semble aussi influencer significativement la sévérité de
la sténose. Concernant le polymorphisme P143L, aucun effet n’a été rapporté sur le profil
lipidique, le risque de la sténose et le score de Gensini.
- 175 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
VI. Etude du gène de l’apoAI
VI.1. Introduction :
L’apoAI est la principale protéine de structure des HDL. Elle joue un rôle important dans le
TIC. D’une part, elle est le premier activateur décrit de la LCAT, et d’autre part, elle interagit
avec le transporteur ABCA1 et le récepteur SR-BI induisant l’efflux de cholestérol vers le
foie. (Gelissen et al., 2006). Nous nous sommes intéressés, dans cette thèse, à la mise en
évidence de 2 polymorphismes du gène de l’apoAI qui sont -75 pb (G/A) et +83 pb (C/T)
dont les résultats de leurs associations avec le profil lipidique et le risque cardiovasculaire
sont controversés.
VI.2. Présentation du travail :
Suite à cette controverse, nous avons étudié l’association de ces polymorphismes au niveau du
gène apoAI avec le profil lipidique et la SCS, dans notre population d’étude. Notre attention
s’est aussi portée sur les combinaisons génotypiques de ces deux polymorphismes et leurs
associations avec la SCS.
VI.3. Méthodes :
VI.3.1. Génotypages des polymorphismes de l’apoAI :
Pour l’étude des polymorphismes -75 pb et + 83pb du gène de l’apoAI, nous nous sommes
basées sur un protocole de PCR-RFLP publié par Larson et al. (2002). Les amorces sens et
anti-sens sont, respectivement: 5’ AGG GAC AGA GCT GAT CCT TGA ACT CTT AAG 3’
et 5’ TTA GGG GAC ACC TAC CCG TCA GGA AGA GCA 3’. Après optimisation à nos
conditions de travail, la composition du mélange réactionnel est: pour un volume de 25µ L :
0.12μM de chaque amorce, 60 ng d’ADN, 2.5 mM de MgCl2, 10% de DMSO, 200 μM de
dNTPs et 1.5U de Taq Polymérase. Le programme de la PCR est le suivant: 3 min à 95°C, (30
s à 94°C, 45 s à 60°C, 1 min à 72°C) 30 cycles, 5 min à 72°C. Le produit de la PCR a été
digéré par l’enzyme MspI (2U), à 37°C pendant toute une nuit. La détection des
polymorphismes est réalisée par électrophorèse sur gel d’agarose 4% et une révélation par le
BET sous rayon UV du produit en présence d’un marqueur de poids moléculaire.
L’application de la PCR-RFLP mise au point permet, en une seule réaction, le génotypage
simultané des deux polymorphismes -75pb (G/A) et +83pb (C/T). Les produits de la digestion
sont décrits dans le tableau XXIII (p.177).
- 176 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
Tableau XXIII. Produits de la digestion enzymatique des deux polymorphismes -75pb
(G/A) et +83pb (C/T)
Génotypes
Normal
Hétérozygote
Muté
Polymorphisme -75pb (G/A)
113pb, 66pb
113pb, 66pb, 179pb
179pb
Polymorphisme +83pb (C/T)
209pb, 45pb
209pb, 45pb, 254pb
254pb
VI.4. Résultats et discussion :
VI.4.1. Fréquences des polymorphismes de l’apoAI :
Tableau XXIV. Fréquences génotypiques et alléliques des polymorphismes du gène de
l’apoAI selon la présence ou non de la SCS chez notre population d’étude
Génotypes
-75 pb (G/A)
GG
GA
AA
Fréquence de l’allèle A
+83 pb (C/T)
CC
CT
TT
Fréquence de l’allèle T
Fréquences % (nombre)
SCS+ (n=212)
SCS- (n=104)
55.7 (118)
34.9 (74)
9.4 (20)
0.269
62.5 (65)
32.7 (34)
4.8 (5)
0.211
90 (191)
9 (19)
1 (2)
0.054
95.2 (99)
4.8 (5)
0
0.024
p
0.279
0.296
0.181
0.265
Les fréquences génotypiques et allèliques des polymorphismes -75pb (G/A) et +83pb (C/T)
sont représentées dans le tableau XXIV (p.177). La comparaison des fréquences alléliques des
deux polymorphismes a montré que l’allèle muté est plus fréquent chez le groupe SCS+ que
chez SCS-, mais cette différence reste non significative. Nous n’avons pas trouvé de génotype
muté, pour le polymorphisme +83pb (C/T), dans le groupe SCS-. Ces deux polymorphismes
ont été étudiés dans plusieurs populations, et leurs fréquences étaient variables selon l’ethnie.
La fréquence de l’allèle A du polymorphisme -75pb (G/A) (0.269) est comparable à celle
trouvée chez une population Chinoise (0.254) (Huang et al., 2012b). Elle est plus élevée que
la fréquence trouvée chez des populations Indienne (0.21) (Dawar et al., 2010), Finlandaise
(0.2) (Pulkkinen et al., 2000), Chinoise (0.109) (Zou et al., 2003); et moins élevée que celle
trouvée chez deux populations Indiennes (0.52) (Rai et al., 2008), (0.3) (Poduri et al., 2009).
Pour le polymorphisme +83pb (C/T), la fréquence de l’allèle T (0.054) est plus élevée que
celle trouvée chez une population Finlandaise (0.015) (Pulkkinen et al., 2000), Caucasienne
- 177 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
(0.038) (Wang et al., 1996a); et moins élevée que celle trouvée chez des populations Indienne
(0.56) (Dawar et al., 2010) et Chinoise (0.15) (Huang et al., 2012b).
VI. 4.2. Association des polymorphismes de l’apoAI et du profil apolipoprotéique :
Tableau XXV. Variation des paramètres apolipoprotéiques en fonction de la présence ou
non de l’allèle muté des polymorphismes -75pb (G/A) et +83pb (C/T).
Polymorphismes
-75pb (G/A)
+83pb (C/T)
GG
GA+AA
p
CC
CT+TT
p
CT (mmol/L)
5.21±1.32
5.18±1.52
0.439
5.20±1.38
5.20±1.43
0.959
TG (mmol/L)
1.64±1.16
1.62±1.12
0.980
1.64±1.16
1.53±0.74
0.378
HDL-C (mmol/L)
1.02±0.36
1.03±0.35
0.516
1.02±0.36
1.04±0.33
0.993
LDL-C (mmol/L)
3.85±1.23
3.83±1.39
0.672
3.84±1.29
3.84±1.26
0.858
ApoAI (g/L)
1.40±0.57
1.36±0.55
0.394
1.41±0.58
1.21±0.34
0.117
ApoB (g/L)
1.18±0.50
1.20±0.43
0.670
1.20±0.48
1.10±0.32
0.299
ApoB/ApoAI
0.88±0.30
0.92±0.29
0.728
0.90±0.30
0.94±0.28
0.975
CT/HDL-C
5.90±5.12
5.40±2.01
0.202
5.74±4.35
5.19±1.41
0.347
CT : cholestérol total.
Nous avons étudié l’association des deux polymorphismes avec la variation du profil lipidique
dans notre population d’étude (tableau XXV, p.178). La comparaison des moyennes des
paramètres lipidiques, entre les porteurs et les non porteurs de l’allèle A, n’a pas montré
d’effet significatif du polymorphisme -75pb (G/A) sur la variation du profil lipidique, même
après ajustement aux facteurs confondants potentiels, aucun effet significatif n’a été constaté
sur le risque de la diminution de l’apoAI [OR = 1.252 ; IC 95% 0.748-2.097; (p=0.393)] et sur
le risque d’hypoHDLémie [OR= 1.041 ; IC 95% 0.532-2.040 ; (p=0.906)] (tableau XXVI,
p.179). Plusieurs études ont révélé l’absence d'associations de ce polymorphisme avec les
paramètres lipidiques (de Franca et al., 2005; Xiao et al., 2008; Poduri et al., 2009; Chen et
al., 2009), en particulier avec l’apoAI et le HDL-C (Heng et al., 2001; Albahrani et al., 2007).
Cependant, d’autres études ont rapporté des résultats controversés (Chhabra et al., 2005;
Souverein et al., 2005; Rai et al., 2008).
Concernant le polymorphisme +83pb (C/T), nous n’avons pas rapporté d’effet significatif sur
la variation du profil lipidique. Cependant, en étudiant l’association de ce polymorphisme
avec l’hypoApoAI et l’hypoHDLémie, un effet significatif de l’allèle T s’est révélé présent
- 178 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
sur le risque de diminution de l’apoAI dans notre population d’étude. En effet, les porteurs de
l’allèle T ont 2 fois plus de risque d’avoir une faible concentration sérique de l’apoAI avec un
OR=2.16 ; IC 95% 1.052-5.47 ; p=0.042. Ce risque est augmenté d’environ 3 fois après
ajustement aux facteurs confondants potentiels, avec un OR=3.20; IC 95% 1.087-9.43; p=
0.035 (tableau XXVI, p.179). Nos résultats concordent avec plusieurs études (Motohashi et
al., 2004; de Franca et al., 2005; Jia et al., 2005; Chen et al., 2009) et sont controversés avec
d’autres (Pulkkinen et al., 2000; Zou et al., 2003; Cheng et al., 2006).
Tableau XXVI. Association des polymorphismes -75pb (G/A) et +83pb (C/T) avec
l’hypoApoAI et de l’hypoHDLémie
Polymorphismes
-75pb (G/A)
GG
(GA+AA)
p
+83pb (C/T)
CC
(CT+TT)
HypoApoAI
OR
OR ajusté
[IC à 95%]
[IC à 95%]
1
1.14
[0.715-1.84]
0.568
1
1.252
[0.748-2.097]
0.393
HypoHDLémie
OR
OR ajusté
[IC à 95%]
[IC à 95%]
1
1.085
[0.678-1.735]
0.413
1
1.041
[0.532-2.04]
0.906
1
1
1
1
2.16
3.2
1.045
1.714
[1.052-5.47]
[1.087-9.43]
[0.449-2.43]
[0.405-7.24]
0.919
0.464
p
0.042
0.035
OR ajusté par rapport à l’âge, le sexe, le tabac, le diabète, l’HTA, l’hypertriglycéridémie et
l’hypercholestérolémie
hypoApoAI <1.28 g/L (médiane)
hypoHDL<1.29mmol/L chez les femmes et <1.03 mmol/L chez les hommes (NCEP 2001).
Les deux polymorphismes ne semblent pas être associés à la variation lipidique dans notre
population d’étude. Ces résultats ne sont pas surprenant étant donné l'étiologie multifactorielle
de la MCV et de nombreuses influences de l'environnement qui tend à influencer le profil
lipidique dans une population coronarienne (Xiao et al., 2008).
La controverse rapportée par les diverses études concernant l’effet des polymorphismes -75pb
(G/A) et +83pb (C/T) sur le profil lipidique, peut être expliquée par l’interaction des facteurs
environnementaux et ethniques, qui diffèrent entre les populations étudiées (Ordovas et al.,
2002).
La controverse peut être aussi expliquée par l’approche statistique de cette étude, en effet la
plus part procèdent à une comparaison des moyennes de ces paramètres et donc sans
- 179 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
ajustement aux facteurs confondants potentiels. En effet dans notre étude l’effet significatif
sur la diminution de l’apoAI n’est apparu qu’après ajustement.
VI.4.3. Associations des polymorphismes de l’apoAI avec la présence de la SCS :
Tableau XXVII. Odds ratios (ORs) associés à la sténose coronaire significative selon les
polymorphismes de l’apoAI.
Polymorphismes
OR
ORs
IC à 95%
p
OR
ORs ajustés
IC à 95%
-75pb (G/A)
1
1
GG
1.327 0.830 -2.124
0.144
1.251
0.755-2.071
GA+AA
+83pb (C/T)
1
1
CC
2.00
0.774-5.166
0.106
2.20
1.178-5.55
CT+TT
OR ajusté par rapport à l’âge, le sexe, le tabac, le diabète, l’HTA, et la dyslipidémie
p
0.385
0.039
Après ajustement aux facteurs confondant potentiels, aucun effet significatif du
polymorphisme -75pb (G/A) n’a été constaté sur le risque de la SCS+, avec un OR=1.251; IC
95% [0.755-2.071] ; p=0.385 (tableau XXVII, p.180). De nombreuses études ont recherché
l’implication de ce polymorphisme dans l’athérosclérose coronarienne. Certaines d’entre elles
ont rapporté des résultats similaires aux nôtres en confirmant qu’il n’y a pas d’association
entre ce polymorphisme et le risque coronaire (Xiao et al., 2008; Petrovic et al., 2000), ainsi
que l’incidence de l’IDM (Yamada et al., 2002). Ceci peut être expliqué par le fait que la
substitution -75pbG/A de la région promotrice du gène de l’apoAI ne soit pas fonctionnelle
(Wang et al., 1996b). En revanche, plusieurs études ont montré que le polymorphisme -75pb
(G/A) semble augmenter le risque d’atteinte coronaire (Chhabra et al., 2005; Rai et al., 2008;
Poduri et al., 2009).
Concernant le polymorphisme +83pb (C/T), après le calcul des ORs ajustés aux facteurs
confondants potentiels, nous avons remarqué que les porteurs de l’allèle T, ont 2 fois plus de
risque de SCS+ par rapport aux homozygotes (CC), avec un OR=2.20, IC 95% 1.178-5.55;
p=0.039. Plusieurs études ont rapporté l’association du polymorphisme +83pb (C/T) avec le
risque coronaire (Pulkkinen et al., 2000; Shioji et al., 2004 ;Rai et al., 2008). Cependant, ces
résultats ont été controversés par d’autres études (Yamada et al., 2002; Zou et al., 2003). Ces
résultats sont en contradiction, et ceci peut être expliqué par l’influence des différents facteurs
environnementaux et ethniques.
- 180 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
VI.4.4. Etude des haplotypes +83pb (C/T) /-75pb (G/A :)
L’étude des fréquences haplogénotypiques a montré que tous les sujets SCS- présentent
l’haplogénotype constitué par les génotypes normaux des deux polymorphismes (GG)/(CC)
(n=104). L’haplogénotype (GA+AA) /(CT+TT), présentant les deux allèles A et T des deux
génotypes à l’état homozygote (AA et TT) ou hétérozygote (GA et CT), n’est présent que
dans le groupe SCS+ (n=17). La différence est donc significative (p= 0.018).
Nous avons également étudié l’effet additif et synergique des deux polymorphismes sur
l’hypoHDLémie et la diminution de l’apoAI. La comparaison des moyennes des paramètres
lipidiques entre les porteurs et les non porteurs des allèle A et T ensemble, n’a pas montré
d’effet significatif, en revanche le calcul des ORs ajustés aux facteurs confondants a montré
que l’haplogénotype (GA+AA) /(CT+TT) contribue à l’augmentation du risque jusqu'à 3 fois
d’avoir une diminution de l’apoAI avec un OR= 3.13; IC 95% [1.33-7.53]; p=0.009 ainsi
qu’un risque 2 fois plus élevé d’avoir une hypoHDLémie [OR=1.71 IC 95% [1.06-4.76] ;
p=0.048] par rapport à l’haplogénotype (GG/CC). D’après Wang et al. (1996a), cet effet
additif des deux polymorphismes est associé à une augmentation considérable de HDL-C chez
une population Caucasienne. Cependant, l’étude de Padmaja et al. (2009b), a rapporté que
l’effet combiné des deux polymorphismes sur le profil lipidique est non significatif.
Il existe aussi un effet additif des deux polymorphismes qui contribue à l’augmentation du
risque coronaire. En effet, la présence des deux allèles A et T ensemble, augmente de 6 fois le
risque de la SCS+ chez les porteurs des haplogénotypes (GA+AA)/ (CT+TT), par rapport aux
sujets non porteurs de ces deux allèles (haplogénotypes (GG)/(CC)), avec un OR=5.8 (IC
95% [1.152-7.840]; p=0.018). L’effet de ces deux polymorphismes semble donc être
synergique, et la combinaison des deux substitutions ensemble semble augmenter
significativement le risque de SCS. Ce résultat demeure significatif après ajustement aux
facteurs confondants, avec un OR=5.05 (IC 95% [1.450-6.300] ; p= 0.003).
Nos résultats sont similaires à ceux d’une étude réalisée chez une population Australienne
Caucasienne, qui rapporte que l’effet additif des deux polymorphismes augmente le risque
coronaire de 6 fois (Wang et al., 1996b). De même la présence des deux génotypes AA et TT
ensemble augmenterait le risque coronaire jusqu'à 8 fois chez une population Indienne (Rai et
al., 2008).
En conclusion, dans notre population d’étude, seul le polymorphisme +83pb(C/T) semble
être associé au risque de SCS et à la diminution de la concentration sérique de l’apoAI. Le
polymorphisme -75pb (G/A) ne semble pas avoir un effet significatif sur le risque de SCS, et
- 181 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
sur la variation des paramètres lipidiques. La présence simultanée des deux sites
polymorphiques -75pb (G/A) et +83pb(C/T), contribue à un risque additionnel de SCS et de la
diminution de la concentration sérique de l’apoAI et du HDL-C
- 182 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
VII. Etude du gène de la PON1 et PON2
Voir publication 5 (annexe3):
Rejeb J, Omezzine A, Rebhi L, Boumaiza I, Mabrouk H, Rhif H, Rejeb NB, Nabli N, Douki
W, Abdelaziz AB, Boughzala E, Bouslama A. Association of PON1 and PON2
Polymorphisms with PON1 Activity and Significant Coronary Stenosis in a Tunisian
Population. Biochem Genet. 2012 Sep 30.
VII.1. Introduction :
Il a été bien établi que la particule HDL a une relation inverse avec le risque des MCV
(Tsompanidi et al., 2010). L’oxydation des LDL est un événement majeur dans l’initiation du
développement de l’athérosclérose (Aoki et al., 2012). En plus de leur effet sur le TIC, les
HDL ont aussi des propriétés anti oxydantes (Farmer and Liao, 2011), qui peuvent être dues à
son association à des enzymes anti-oxydantes telle que la PON1 et la PON2 (Précourt et al.,
2011). Le risque coronaire est aussi associé avec une diminution de l’activité de la PON1
(Mackness et al., 2003). Nous nous sommes intéressés, dans cette thèse, à la mise en évidence
de quatre polymorphismes du gène PON (L55M (rs854560) et Q192R (rs662) de la PON1;
S311C (rs7493) et A148G (rs12026) de la PON2), dont l’association avec les variations de
HDL-C et les MCV est controversée.
VII.2. Présentation du travail :
Suite à cette controverse, nous avons étudié la distribution des polymorphismes de PON1 et
PON2 et leur association avec l'activité PON1 et la SCS dans une population tunisienne de
coronariens. Nous avons aussi recherché des associations entre ces polymorphismes et un
certain nombre de FR (tabac, diabète, sexe …) avec le risque de la SCS. Notre attention s’est
aussi portée sur les combinaisons génotypiques de ces quatre polymorphismes et leurs
associations avec la SCS.
VII.3. Méthodes :
VII.3.1. Analyse de l’activité PON1 :
L’activité PON1 a été mesurée, au laboratoire de Biochimie-Toxicologie à l’Hôpital Fattouma
Bourguiba, Monastir, avec la collaboration de l’équipe du Pr. Najjar MF et Pr. Douki W.
- 183 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
L’activité de la PON1 a été mesurée selon la méthode de Santanam and Parthasarathy (2007),
avec certaines modifications, en utilisant un automate Konelab 30 (Thermo Electron
Corporation). Le principe de cette méthode est que la PON1 hydrolyse le paraoxon en
produisant le para-nitrophénol et le diéthylphosphate. L’activité a été mesurée en ajoutant à 5
μL de sérum une solution tampon de Tris–base (0.26 mM, pH 8.5) [PromegaTM] fraichement
préparée et contenant 0.5 mM de chlorure de sodium (NaCl) [FlukaTM], 25 mM de chlorure de
calcium (CaCl2) [MerckTM] et 1.2 mM de paraoxon [Sigma Aldrich TM]. Après incubation de
30 secondes, la libération du para-nitrophénol a été suivie à 405 nm pendant 6 min.
La manipulation du paraoxon a été réalisée dans des conditions rigoureuses de protection
incluant le travail sous une hotte (Captair ChemTM), le port de gants et l’élimination des
déchets dans une solution adéquate (70 g de NaOH; 250 mL de méthanol et 750 mL d’eau
distillée). Il est à noter que la préparation de la solution de paraoxon doit être faite
extemporanément.
Les résultats sont exprimés en UI/L, sachant que l’activité PON1 d’une UI correspond à
1μmol de para-nitrophénol formé par minute. Deux essais ont été réalisés pour chaque
échantillon et la moyenne des 2 valeurs a été considérée si la différence entre les 2 valeurs est
<10%, sinon un 3ème essai est réalisé.
VII.3.2. Génotypages des polymorphismes de PON1 et PON2 :
Les génotypes de ces trois polymorphismes (PON1-Q192R, PON1-L55M et PON2-S311C)
ont été déterminés par un protocole de PCR-multiplex publié par Motti et al. (2001), en
utilisant des amorces « mismatch » décrites dans le tableau XXVIII (p.185). Après
optimisation à nos conditions de travail, la composition du mélange réactionnel est: pour un
volume de 30µL : 0.13μM de chaque amorce de PON1-192 et PON1-55, 0.26 μM de chaque
amorce de PON2-311, 100 ng d’ADN, 200 μM de dNTPs, 2 mM de MgCl2 et 2U de EuroTaq
Polymérase (EuroClone, Italy). Le programme de la PCR est le suivant: 5 min à 94°C, (1 min
à 94°C, 45 s à 55°C, 45 s à 72°C) 40 cycles, 5 min à 72°C. Les produits de la PCR-multiplex
ont été digérés par l’enzyme HinfI (2U), à 37°C pendant toute une nuit. La détection des
polymorphismes est réalisée par électrophorèse sur gel d’agarose 4% et une révélation par le
BET sous rayon UV du produit en présence d’un marqueur de poids moléculaire.
Pour détecter le polymorphisme PON2-A148G, nous avons suivi le protocole de PCR-RFLP
publié par Oliveira et al. (2004). Les amorces sens et anti-sens sont, respectivement:
5’ ACATGCATGTACGGTGGTCT 3’ et 5’GCACTT TCATGCCAAAAGTAC 3’. La
composition du mélange réactionnel est: pour un volume de 20 µL : 0.1 μM de chaque
- 184 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
amorce, 100 ng d’ADN, 100 μM de dNTPs, 1.5 mM de MgCl2 et 1U de EuroTaq Polymérase.
Le produit de PCR de 232pb a été digéré par 2U de l’enzyme Fnu4HI, pendant toute une nuit
à 37°C. Les produits digérés ont été détectés par électrophorèse sur gel d’agarose 4% et
révélés par le BET sous rayon UV (AA: 161 et 71 pb; AG: 232,161 et 71 pb; GG: 232 pb).
Tableau XXVIII. Les amorces des polymorphismes de PON1 et PON2
Amorces sens (5’→3)
Amorces anti-sens (5’→3’)
Fragment amplifié (pb)
Homozygote normal
Homozygote muté
111
PON1- TTGAATGATATTGTTGCTGTGGGACCTGAG
111
Q192R CGACCACGCTAAACCCAAATACATCTCCCAGaA
77,34
144
PON1- GAGTGATGTATAGCCCCAGTTTC
AGTCCATTAGGCAGTATCTCCg
122,22
L55M
144
GGTTCTCCGCATCCAGAACATTgaA
196
PON2173,23
S311C TGTTAAGaTATCGCACTaTCATGCC
196
Les lettres italiques minuscules indiquent est les nucléotides « mismatch ».
- 185 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
VII.4. Résultats et discussion :
VII.4.1. Fréquences des polymorphismes de la PON1 et de la PON2 :
Tableau XXIX. Fréquences génotypiques et alléliques des polymorphismes de PON1 et
PON2 selon la présence ou non de la SCS chez notre population d’étude
Polymorphismes
PON1-Q192R
QQ
QR
RR
Fréquence de l’allèle R
PON1-L55M
LL
LM
MM
Fréquence de l’allèle M
PON2-S311C
SS
SC
CC
Fréquence de l’allèle C
PON2-A148G
AA
AG
GG
Fréquence de l’allèle G
Fréquences % (nombre)
SCS + (n=212)
SCS- (n=104)
40.6 (86)
42.9 (91)
16.5 (35)
0.379
47.1 (49)
37.5 (39)
15.4 (16)
0.341
38.7 (82)
42 (89)
19.3 (41)
0.403
28.8 (30)
40.4 (42)
30.8 (32)
0.51
33 (70)
43.4 (92)
23.6 (50)
0.453
50.9 (53)
35.6 (37)
13.5 (14)
0.313
92.4 (196)
7.6 (16)
0
0.038
91.3 (95)
8.7 (9)
0
0.043
p
0.534
0.955
0.05
0.879
0.006
0.838
0.731
0.985
Le tableau XXIX montre les fréquences génotypiques et alléliques des polymorphismes de
PON1 et PON2. Nous avons rapporté que la fréquence des individus porteurs de l’allèle
PON2-311C est significativement plus élevée, chez le groupe SCS+. Les porteurs du
génotype MM du polymorphisme PON1-L55M semblent être plus fréquents, chez le groupe
SCS-. Aucune mutation du polymorphisme PON2-A148G n’a été trouvée chez les 2 groupes.
Les polymorphismes de PON1 et PON2 ont été étudié dans plusieurs populations qui ont
montré des fréquences alléliques variables, selon l’ethnie. La fréquence de l’allèle PON1192R (0.379), chez le groupe SCS+, est comparable aux fréquences trouvées chez les
populations Tunisienne (Kallel et al., 2010) et Turque (Kaman et al.., 2009). Elle est plus
élevée que les fréquences trouvées chez les populations Coréenne (0.27), Brésilienne (0.31) et
Turque (0.35) (Shin et al., 2008, Oliveira et al., 2004, Can Demirdöğen et al., 2008). D'autre
part, nous avons rapporté une fréquence de l’allèle PON1-55M de 0.4, qui est similaire à celle
trouvée chez des populations Turque et Italienne (Arca et al., 2002; Can Demirdöğen et al.,
- 186 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
2008) et plus élevée que celle rapportée chez des Brésiliens (Oliveira et al., 2004) et des
Coréens (Shin et al., 2008) (respectivement, M=0.29 et 0.047).
En ce qui concerne le polymorphisme PON2-311, la fréquence de l’allèle C est 0.45, qui est
différente de celle rapportée chez plusieurs populations (Oliveira et al., 2004; Ranade et al.,
2005; Shin et al., 2008). Finalement, la fréquence de l’allèle PON2-148G est 0.038, qui est
moins élevée que celle rapportée chez des Coréens (Shin et al., 2008) et des Brésiliens
(Oliveira et al., 2004) (respectivement, G=0.177 et 0.38).
VII.4.2. Associations entre les polymorphismes de PON1 et PON2, le profil lipidique et
l’activité de PON1 :
Dans notre population d’étude, nous n’avons pas rapporté de différences significatives entre le
profil lipidique et les polymorphismes de PON1 et PON2. Nos résultats concordent avec
certaines études (Sen-Banerjee et al., 2000; Watzinger et al., 2002) et sont controversés avec
d'autres (Rios et al., 2007; Shin et al., 2008; Gluba et al., 2010). Cette controverse peut être
due aux différences de facteurs environnementaux et/ou ethniques. Il a été montré que
l'activité enzymatique PON1 est diminuée chez des patients coronariens (Mackness et al.,
2003; Azarsiza et al., 2003). Dans notre étude, nous avons rapporté une basse activité PON1
chez les patients SCS+ comparés à ceux SCS-, cependant cette différence n’est pas
statistiquement significative (307.041 ± 206.685 UI/L versus. 353.494 ± 200.392 UI/L, p=
0.571). Notre résultat est similaire à celui rapporté par Azarsiza et al. (2003) et Mackness et
al. (2001). Les mécanismes putatifs liés à la diminution de l'activité PON1 pourraient être
l'inactivation de l’enzyme par une augmentation du SO (Aviram et al., 1999). Cette
diminution pourrait être le résultat des concentrations basses des HDL chez des patients ayant
des MCV. Les peroxydes lipidiques, qui sont des substrats de PON1 (Camps et al., 2009b) et
qui sont élevés chez les patients coronariens, sont des inhibiteurs de PON1. Le rôle du SO
dans la diminution de l'activité PON1 pourrait être confirmé par l'association inverse entre les
peroxydes lipidiques et l’activité PON1 (Mackness et al., 2001).
L’activité PON1 est variable selon les individus. Une partie de cette variabilité peut être
expliquée par 2 polymorphismes du gène PON1. Il a été rapporté que l’allèle R du
polymorphisme PON1-Q192R possède une activité plus élevée pour l'hydrolyse du paraoxon
que l’allèle Q (Humbert et al., 1993). Des études préliminaires ont suggéré que le génotype
R/R est moins efficace pour l’hydrolyse des peroxydes lipidiques que le génotype Q/Q
(Mackness et al., 1997; Regieli et al., 2009). D'autre part, des études ont rapporté que le
polymorphisme PON1-L55M entraine un changement ponctuel d’acide aminé leucine (L) en
- 187 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
méthionine (M) dans la partie N terminale de PON1 (Brophy et al., 2000). D’après Leviev et
al (2001), ceci semble augmenter l’affinité de la liaison de PON1 au HDL. Mackness et al.
(1998) ont rapporté que l’allèle M est associé à une diminution de l’activité de PON1, mais
cette diminution ne semble pas être un effet propre de cette mutation puisque le changement
d’acide aminé n’affecte pas la partie catalytique de l’enzyme (Blatter-Garin et al., 1997;
Brophy et al., 2000). Donc cette association polymorphisme/activité a été expliquée par la
liaison au polymorphisme -108C>T touchant la région régulatrice au niveau du promoteur
(Leviev and James, 2000; Brophy et al., 2001b)
Tableau XXX. Activité de la PON1 chez les différents génotypes
Polymorphismes
PON1-Q192R
QQ (135)
QR (130)
RR (51)
PON1-L55M
LL (112)
LM (131)
MM (73)
PON2-S311C
SS (123)
SC (129)
CC (64)
PON2-A148G
AA (291)
AG (25)
Activité PON1 (IU/L)
p
200.314±133.460
367.984±178.526
554.597±220.449
<0.000
426.348±219.237
291.947±195.197
229.703±138.924
<0.000
368.279±219.914
276.571±130.379
333.069±226.779
0.360
320.442±203.880
370.437±233.928
0.353
Dans notre étude, l’analyse de l’activité PON1 chez les différents génotypes de PON1 et
PON2, dans le tableau XXX (p.188), a montré des différences statistiquement significatives
(P<0.000) de l'activité PON1 pour les polymorphismes de la région codante, PON1-L55M et
PON1-Q192R. Les activités les plus élevées ont été détectées pour les génotypes LL et RR,
des activités intermédiaires pour les génotypes LM et QR et des activités les plus basses pour
les génotypes MM et QQ. Aucune différence n'a été observée entre l'activité PON1 et les deux
polymorphismes S311C et A148G du gène PON2.
VII.4.3. Association des polymorphismes de PON1 et PON2 avec la présence de la SCS :
Le rôle des polymorphismes de PON sur les MCV est controversé. Dans notre étude, le
tableau XXXI (p.189) représente les ORs associés à la SCS selon les génotypes homozygotes
- 188 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
mutés de PON1 et PON2. Nous avons rapporté que, après ajustement des facteurs
confondants, l’OR de la SCS associé au génotype MM du polymorphisme PON1-55 est 0.668
(IC 95 % 0.43-0.93; p= 0.042), suggérant que ce génotype est associé à une diminution de
33% du risque de la SCS. Notre résultat est similaire avec plusieurs études (Oliveira et al.,
2004; Kaman et al., 2009) et controversé avec d’autres (Arca et al., 2002; Can Demirdöğen et
al., 2008). D’après Mackness et al (1998), le génotype MM serait associé à une diminution de
l’activité de la PON1, malgré ceci un effet protecteur contre la SCS a été rapporté par d’autres
études et par nos résultats. Cette protection s’expliquerait par l’affinité plus importante de la
PON1 du génotype MM aux HDL que celle du génotype LL ; ce qui entraînerait une
meilleure protection des LDL contre l’oxydation par les HDL du génotype MM. D’ailleur
Mackness et al. (1998) ont rapporté que l’étude « in vitro » de l’habilité des HDL à prévenir la
peroxydation des LDL, en fonction du génotype de PON a montré qu’après 6 heures, les HDL
associés au génotype MM de PON1 ont montré une capacité de protection contre l’oxydation
des LDL 2 fois supérieure à celle des autres génotypes.
Tableau
XXXI.
Associations
entre
les
génotypes
homozygotes
mutés
des
polymorphismes PON et la SCS
Population d’étude
Syndrome Métabolique
Avec
Sans
Diabètes
diabétiques
Non diabétiques
Tabac
Fumeurs
Non fumeurs
Odds ratio [IC 95%]; p
PON1-192RR
PON1-55MM
PON2-311CC
1.833 [1.02-3.29] ; 0.668 [0.43-0.93] ;
1.76 [1.04-3.10] ;
0.043
0.042
0.035
2.044 [1.05-3.98] ;
0.036
1.31 [0.18-9.5] ;
0.787
0.556 [0.18-0.89] ;
0.035
0.673 [0.38-1.67] ;
0.297
2.37 [1.12-7.47] ;
0.031
1.28 [0.83-8.57] ;
0.203
1.64 [1.098-3.38] ;
0.038
1.18 [0.41-3.08] ;
0.728
0.359 [0.14-0.94] ;
0.034
0.691 [0.36-1.3] ;
0.256
2.34 [1.08-5.06] ;
0.031
1.5 [0.32-7.12] ;
0.609
2.39 [1.09-6.37] ; 0.942 [0.38-2.32] ;
0.897
0.041
1.063 [0.205-3.62] ; 0.648 [0.36-1.15] ;
0.840
0.044
2.88 [1.24-13.1] ;
0.024
1.55 [0.75-3.22] ;
0.237
Nous avons aussi rapporté, dans notre étude, que le génotype RR du polymorphisme PON1192 est associé à une augmentation du risque de la SCS (OR= 1.83, IC 95 % 1.02-3.29, p=
- 189 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
0.043). Certaines études ont rapporté des résultats similaires (Ranade et al., 2005; Gluba et al.,
2010; Wang et al., 2011), cependant d’autres ont trouvé des controverses (Pasdar et al., 2006;
Kaman et al., 2009; Bhattacharyya et al., 2008). L’athérogénicité du génotype PON1-192RR
peut être expliquée par sa faible habilité à protéger les LDL contre les modifications
oxydatives comparé au génotype PON1-192QQ (Aviram et al., 1999).
Concernant les polymorphismes de PON2, comme certaines études (Oliveira et al., 2004;
Ranade et al., 2005; Shin et al., 2008), nous n’avons pas rapporté d’association significative
avec le risque de la SCS pour le polymorphisme PON2-148 ; ce qui est controversé avec Shin
(2009).
Nous avons aussi rapporté que le génotype CC de PON2-311 est associé à une augmentation
de ce risque (OR= 1.76, IC 95 % 1.04–3.10, p= 0.035). Notre résultat est en accord avec
d’autres études (Yang et al., 2006; Jalilian et al., 2008). Cette association peut être expliquée
par le fait que la substitution de serine en Cys au niveau du site actif du gène PON2 peut
détériorer sa fonction antioxydante et changer par conséquent la puissance métabolique de la
cellule (Qu et al., 2008). Cependant, des controverses ont été trouvées dans plusieurs études
(Ranade et al., 2005; Guxens et al., 2008; Gluba et al., 2010). Ces associations controversées
des polymorphismes de la PON avec les MCV peuvent être attribuée aux différences dans
plusieurs facteurs entre des études, y compris des facteurs ethniques, le type de population
étudiée, des habitudes diététiques et des différences environnementales.
Afin d’étudier l’effet des polymorphismes de la PON sur la SCS selon le degré du SO, nous
avons stratifié notre population selon les conditions cliniques où le SO est élevé ou non
(présence ou absence de SM, de diabète sucré, de tabagisme).
Les patients diabétiques et ayant un SM sont exposés à un risque élevé de MCV et de SO
(Mackness et al., 2000; Senti et al., 2003b). Dans notre étude, en présence du SM et de
diabète, les génotypes PON1-192RR et PON2-311CC ont été associés à un risque élevé de la
SCS et le génotype PON1-55MM semble diminuer ce risque (tableau XXXI , p.189). Nos
résultats concordent avec plusieurs études (Aubó et al., 2000; Mackness et al., 2005). La
présence du diabète ou du SM est associée à une augmentation de la formation de peroxyde,
une hypothèse possible expliquant l’effet athérogène de l’allèle R de PON1-192 et C de
PON2-311 est que ces derniers favorisent le SO. Dans ce contexte, il a été suggéré que le
génotype LL de PON1-55, qui est associé à une réduction de l’effet protecteur contre
l’oxydation des LDL, semble moins bien protéger contre le SO que l’allèle M (Mackness et
al., 1997).
- 190 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
Le tabagisme est un FR majeur des MCV. Il joue un rôle important dans le mécanisme du SO.
Il a été rapporté que la peroxydation des lipides contribue à l’augmentation du risque de
l’athérosclérose chez les fumeurs (Zieske et al., 1999). Puisque le tabagisme est associé à une
augmentation de la peroxydation des lipides (Steinberg and Chait, 1998), nous avons étudié
la relation entre les polymorphismes de la PON et la SCS suivant le statut tabagique.
Contrairement aux résultats concernant le SM et le diabète (où l’effet du polymorphisme est
plus prononcé en présence de SO élevé), nous avons constaté que le génotype PON1-55MM
semble être significativement associé à une diminution du risque de la SCS chez les non
fumeurs par rapport aux fumeurs. En effet, l’OR de la SCS associé à ce génotype est de 0.648,
IC 95 % 0.36–0.95; p= 0.044.
Les études qui rapportent l’interaction du tabagisme avec les polymorphismes de PON1 sont
rares. Nos résultats concordent avec ceux de Malin et al. (2001) qui ont rapporté que le
génotype PON L55/L55 représente un FR génétique de l’athérosclérose coronaire chez les
hommes non fumeurs. Par contre, certaines études n’ont pas rapporté d’association entre le
polymorphisme PON1-L55M et le risque coronaire chez les fumeurs et chez les non fumeurs
(Sen-Banerjee et al., 2000; Mukamal et al., 2009). Cette absence d’effet du polymorphisme
PON1-L55M, chez les tabagiques, pourrait s’expliquer par une diminution de l’activité de la
PON1 par le tabac (Nishio and Watanabe, 1997). En effet, les substances apportées par le
tabac entraîneraient un encombrement stérique au niveau de l’enzyme gênant la fixation de
son substrat au niveau du site catalytique et gênant le maintien de l’enzyme en conformation
active. Cette diminution semble estomper la différence de l’activité protectrice entre les
génotypes, donc le tabac annulerait l’effet protecteur de MM contre la SCS (Kuo and La Du,
1995).
D’autre part, nous avons rapporté, dans notre étude, que les génotypes PON1-192RR et
PON2-311CC augmentent le risque de la SCS, particulièrement chez les fumeurs (OR=2.39,
IC 95% 1.09-6.37; p= 0.04; OR=2.88, IC 95% 1.24-13.1; p= 0.024). Nos résultats concordent
avec plusieurs études (Osei-Hyiaman et al., 2001; Martinelli et al., 2004) et sont controversés
avec d’autres (Sen-Banerjee et al., 2000; Rios et al., 2007). Cet effet athérogène est expliqué
par une faible capacité anti-oxydative des génotypes PON1-RR et PON2-CC (Princen et al.,
1992). En plus, le tabac génèrent des radicaux libres qui sont impliqués dans le processus
athérogéne et favorisent l’oxydation des LDL (Church and Pryor, 1985). Les particules
LDLox, chez les fumeurs portant ces génotypes, génèrent plus de produits de peroxydation
lipidique que chez les non fumeurs. En fait, les extraits de cigarette diminuent l'activité PON1
- 191 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
chez les génotypes RR et CC, qui sont initialement moins efficaces pour l’hydrolyse des
peroxydes lipidique que chez les génotypes QQ et SS.
VII.4.4. Déséquilibre de liaison et analyse des haplotypes :
Dans notre population d’étude, nous avons observé un déséquilibre de liaison significatif entre
les polymorphismes PON1-55 et PON1-192 (D’=-0.44, p<0.000). Lorsque les 4
polymorphismes de la PON ont été combinés (PON1-192 (A672G), PON1-55 (T260A),
PON2-311 (C1053G), and PON2-148 (C564G)), nous avons rapporté que l’haplotype
(GTGC) semble être le plus athérogène. En effet, il est plus fréquent chez les patients SCS+
que chez ceux SCS- (16.7 versus. 11 %; p= 0.028). Par analyse haplotypique, nous avons
aussi montré qu’après ajustement aux facteurs confondants, cet haplotype est associé à une
augmentation du risque de la SCS comparé à l’haplotype sauvage (ayant tous les allèles
normaux : ATCC), avec un OR= 1.58, IC 95 % 1.050-4.55; p= 0.039. Certaines études ont
rapporté des résultats similaires (Kallel et al., 2010; Arca et al., 2002).
En conclusion,
nous avons rapporté, chez notre population d’étude, que les génotypes
PON1-192RR et PON2-311CC sont associés à un risque élevé de la SCS et le génotype
PON1-55MM semble être plus protecteur contre la SCS, en présence du SM et du diabète.
Cette association est évidente chez les non fumeurs pour le génotype PON1-55MM et chez les
fumeurs pour les génotypes PON1-192RR et PON2-311CC. L’haplotype (GTGC) est associé
à un risque élevé de la SCS chez cette population tunisienne.
- 192 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
VIII. Etude du syndrome métabolique
Voir publication 6 (annexe3):
Rejeb J, Omezzine A, Boumaiza I, Rebhi L, Kalboussi N, Laouini A, Ben Rejeb N, Nabli N,
Abdelaziz AB, Boughzala E, Bouslama A. Metabolic syndrome is a risk factor for coronary
artery disease in a tunisian population. Metab Syndr Relat Disord. 2010;8(2):105-12.
Voir publication 7 (annexe3):
Rejeb J, Omezzine A, Boumaiza I, Rebhi L, Kaouthar K, Kalboussi N, Ben Rejeb N, Nabli
N, Abdelaziz AB, Boughzala E, Bouslama A. Elevated Liver Enzymes in Metabolic
Syndrome Are Associated With Coronary Stenosis in a Tunisian Population. Metab Syndr
Relat Disord. 2010;8(3):249-54.
VIII. 1. Introduction :
Parmi les FR émergents, nous nous sommes intéressés au SM. En effet, le SM est devenu un
des grands sujets d’intérêt de santé publique. Son importance comme marqueur de risque
cardiovasculaire est devenue un concept fondamental (Galassi et al., 2006). En effet, les
cardiologues prennent de plus en plus conscience du risque émergent majeur que constitue ce
syndrome. Afin d’étudier la place du SM comme FR d’athérosclérose coronarienne, nous
avons effectué tous les dosages et les mesures nécessaires pour le diagnostic de ce syndrome
selon les critères de l’IDF chez 192 patients ayant subi une exploration coronarographique.
Une élévation des activités des enzymes hépatiques a été décrite dans certaines formes de SM
et s’expliquerait entre autres par l’apparition d’une stéatose hépatique (Hanley et al., 2005;
André et al., 2007). Un des objectifs de nos études est de montrer si l’élévation des activités
des enzymes hépatiques représente un sur-risque du syndrome coronarien associé au SM.
VIII.2. Présentation du travail :
Notre travail comporte deux volets. Le premier est l’étude de la prévalence du SM selon la
définition de l’IDF et son association avec la SCS, chez notre population coronarienne
Tunisienne. Le deuxième volet est de déterminer le lien entre les activités des enzymes
hépatiques et le SM et ses composantes. Ensuite, l’étude de l’association entre l’élévation de
ces activités et la sténose coronaire associée au SM.
- 193 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
VIII.3. Résultats et discussion :
VIII.3.1. Prévalence du SM dans la population d’étude :
Cette étude a montré que 54.2% (n= 104) des patients présentent un SM selon la définition de
l’IDF, avec une différence significative selon le sexe. En effet, le SM a été diagnostiqué chez
65.9% des femmes et uniquement chez 45.5% des hommes (p= 0.004). Des résultats
similaires ont été décrits, chez des populations Indiennes et Pakistanaises, en rapportant une
prévalence du SM respective de 59.5% et 53% (Ranjith et al., 2008; Wierzbicki et al., 2008).
Une première étude sur une population Tunisienne (âge>40 ans) a rapporté que la prévalence
du SM selon l’IDF est de 45.5% (55.8% chez les femmes; 30% chez les hommes; p< 0.001)
(Harzallah et al., 2006).
À travers plusieurs études rapportant des résultats similaires aux nôtres, il apparaît qu’il existe
une différence significative selon le sexe en faveur d’une prédominance féminine (Santos and
Barros, 2007; Choi et al., 2007; Kelliny et al., 2008; Malik and Razig, 2008). Cependant, la
prévalence du SM est plus élevée chez les hommes que chez les femmes chez d’autres études
(Ford, 2005; Adams et al., 2005).
Nous avons aussi rapporté qu’il ya une augmentation de la fréquence du SM en fonction de
l’âge aussi bien chez les hommes que chez les femmes. En effet, la fréquence du SM la plus
élevée est représentée chez les individus les plus âgés (>68 ans) (figure 45, p194). Ce résultat
concorde avec celui de plusieurs études, selon la définition utilisée du SM (Santos and Barros,
2007; Kelliny et al., 2008). Ainsi, il apparaît clairement que la variation de la prévalence du
SM dépend largement de la définition choisie pour le SM, l’ethnicité et l’âge de la population
ciblée (Cameron et al., 2004).
■ Hommes
□ Femmes
Prévalence du SM
100%
60%
76%
75%
80%
57%
62%
38%
42%
31-53
53-60
54%
56%
60-68
68-84
40%
20%
0%
30-56
56-63
63-68
68-83
Tranches d'âge
Figure 45. Prévalence du SM selon le sexe et par tranche d’âge
dans la population générale.
La fréquence du SM augmente en fonction de l’âge aussi bien chez les hommes que chez les femmes
- 194 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
Nous avons aussi rapporté que chez les patients avec SM, ceux ayant 4 composantes présents
sont les plus fréquents (n=106; 55.3%) suivis de ceux ayant 3 composantes (n=55; 28.5%) et
enfin ceux ayants 5 composantes (n=31; 16.2%).
Tableau XXXII. Prévalence des différents profils du SM
Profils
Obésité
abdominale
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Les composantes présentes
TG élevés
HDL-C
PA élevée
bas
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Glycémie
élevée
+
+
+
+
+
+
+
-
Prévalence
(%)
16.2
21.4
4.3
11.1
7.4
11.1
12
4.3
4.3
5.4
2.5
L’étude du SM présent chez notre population selon la nature et le nombre des composantes a
permis de distinguer 11 profils (tableau XXXII, p.195). Le profil le plus abondant est celui
qui regroupe, chez le même patient, 4 anomalies du SM: l’obésité abdominale,
l’hyperglycémie, HDL-C bas et une pression artérielle élevée (21.4%), suivi du profil qui
regroupe toutes les anomalies du SM (16.2%). Le profil le moins abondant est celui qui
regroupe
3
anomalies
(obésité
abdominale,
une
pression
artérielle
élevée,
hypertriglycéridémie) (2.5%).
La prévalence des différents profils possibles du SM est variable d’une étude à l’autre et ceci
peut être expliqué par la divergence des critères utilisés pour le diagnostic du SM (Andreadis
et al., 2007 ; Liu et al., 2007). En effet, dans notre étude, nous avons eu recours à la définition
de l’IDF contrairement à plusieurs autres études qui continuent à utiliser la définition du
NCEP ATP III, de même la population de notre étude est constituée par des patients admis à
l’hôpital pour coronarographie et qui sont le plus souvent des patients à haut risque de point
de vue cardiovasculaire, d’où la grande fréquence des sujets qui regroupent plusieurs
composantes du SM.
Dans notre étude qui a utilisé la définition de l’IDF pour le SM, où tous les patients doivent
avoir un tour de taille élevé, l’hyperglycémie à jeun et l'hypoHDLémie représentent les
anomalies métaboliques les plus fréquentes (respectivement, 86.5% et 73.5%), suivi de la
- 195 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
pression artérielle élevée et de l'hypertriglycéridémie qui sont les moins fréquentes
(respectivement, 69% et 49%). Ceci est totalement différent des résultats de l’étude de Boulon
et al. (2006), qui en utilisant la définition du SM du NCEP ATP III, ont trouvé que
l’augmentation du tour de taille et l’hypertriglycéridémie sont les anomalies les plus
fréquentes (respectivement 81.3% et 74%), par contre en utilisant la définition de l’IDF,
l’hyperglycémie à jeun et l’hypertriglycéridémie sont les anomalies les plus fréquentes
(respectivement 82.7% et 70.6%). Dans une autre étude comportant exclusivement des
femmes âgés entre 60 et 84 ans, Cabrera et al. (2007) ont rapporté une prévalence du SM
(selon la définition de l’OMS) de 39.9% et parmi les patientes ayant ce syndrome 90.8% ont
un tour de taille > 88 cm, 84.5% ont une pression artérielle élevée, 72.8% présentent une
hypoHDLémie, 65% présentent une hypertriglycéridémie et 38.3% sont diabétiques où ont
une hyperglycémie à jeun.
Par contre dans l’étude d’Andreadis et al. (2007) qui a porté sur une population hypertensive,
la prévalence de chaque composante du SM (NCEP-ATP III) est comme suit : obésité
abdominale 49.1%, hypoHDLémie 36.9%, hypertriglycéridémie 29.6% et pression artérielle
élevée 23.1%. Ainsi il apparaît clairement que la prévalence des différentes anomalies du SM
est différente selon les études.
VIII.3.2. Caractéristiques de la population :
Notre population d’étude comprend 192 patients (âge moyen=61.23±9.99, sexe ratio=1.25),
documenté par angiographie coronaire à cause d’un IDM (n= 59), angine (n= 89), douleur
thoracique (n= 44). Nous avons subdivisé notre population selon la présence ou non du SM.
Les caractéristiques cliniques et biologiques de ces 2 groupes sont représentées dans le
tableau XXXIII (p.197). Le tabagisme est plus fréquent chez les personnes ne présentant pas
un SM (48.9%) par rapport à ceux présentant un SM (31.7%). En effet, ceci peut être expliqué
par le fait que le SM est plus fréquent chez les femmes que chez les hommes et que les
femmes pour la majorité sont non fumeuses. Les patients ayant un SM représentent
significativement plus de patients diabétiques, hyperglycémiques, ayant un tour de taille élevé
et présentant une HTA, comparé au groupe SM-. L’augmentation de l’IMC en présence du
SM est non significative vu que l’obésité qui caractérise ce syndrome est plutôt abdominale
que globale.
- 196 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
Tableau XXXIII. Caractéristiques de la population selon la présence ou non du SM.
Critères
Population
p
SM+ (n=104)
SM- (n=88)
Age (ans)
62.6 ± 9.3
60.5 ± 10.9
0.484
Sexe ratio
0.92
2.14
0.004
IMC (Kg/m²)
31.9 ± 5.7
26.8 ± 5.2
0.085
Tour de taille (cm)
104.2 ±12.3
95.7±17.3
< 0.001
Tabac (%)
33 (31.7)
43 (48.9)
0.012
Pression atérielle
PAS
138.1±17.9
131.6±18.3
0.066
(mmHg)
PAD
81.2±13.2
77.5±8.5
0.065
HTA n (%)
70 (67.3)
21 (23.9)
< 0.001
Diabète n (%)
55 (52.9)
17 (19.3)
< 0.001
IDM n (%)
35 (33.6)
24 (27.2)
0.296
Angine n (%)
46 (44.2)
43 (48.8)
0.294
Douleur thoracique n (%)
23 (22.1)
21 (23.8)
0.520
Glycémie à jeun (mmol/L)
9.1±4.5
7.02±3.2
0.001
Insulinémie (µU/mL)
14.3±3.3
8.1±12.4
0.049
HOMA-IR
6.1±13.8
2.9±6.5
0.031
Cholestérol total (mmol/L)
5.28±1.49
5.02±1.48
0.783
TG (mmol/L)
2.02±0.49
1.37±0.83
0.01
HDL-C (mmol/L)
0.89±0.3
1.1±0.41
0.049
LDL-C (mmol/L)
3.41±0.93
3.31±1.28
0.644
ApoAI (g/L)
1.25±0.042
1.54±0.39
0.042
ApoB (g/L)
2.27±0.32
1.38±0.11
0.022
ApoB/ApoAI
1.58±0.61
0.97±0.41
0.010
TC/HDL-C
5.8±2.8
5.5±2.4
0.583
ALAT (IU/L)
29.3±5.5
10±4.1
0.056
ASAT (IU/L)
31.3±4.9
16.2±6
0.144
PAL (IU/L)
67.8±27
60.6±26
0.229
GGT (IU/L)
34.3±43.5
31.1±20
0.341
Une augmentation significative de l’insulinémie (p=0.049) et de l’ HOMA-IR (p=0.031) est
également observée chez les sujets présentant un SM preuve d’insulinoresistance. En effet,
- 197 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
suite à la diminution de la sensibilité à l’insuline, due à l’insulino-résistance, il ya une
augmentation compensatrice de la sécrétion de l’insuline ce qui explique l’hyperinsulinisme
observé au cours du SM (Reaven, 2004).
En ce qui concerne le bilan lipidique, nous remarquons une dyslipidémie athérogène avec une
diminution significative des concentrations de HDL-C (p= 0.049) et de l'apoAI (p= 0.042) et
une augmentation des concentrations de TG (p= 0.01), d’apoB (p= 0.022) et du rapport
apoB/apoAI (p= 0.01). Cependant, nous n’avons pas rapporté une augmentation significative
de la concentration de LDL-C et du rapport CT/HDL-C.
La différence significative de la concentration de l’apoB et non du LDL-C peut être expliquée
par la présence des sdLDL dont le nombre est sous estimé par un dosage quantitatif des LDL
et un dosage des apoB semble être plus adapté dans le cas du SM. Plusieurs études ont
rapportée une association entre les sdLDL et le SM (Kathiresan et al., 2006; Nozue et al.,
2007).
La concentration des LDL-C n’est pas le plus souvent élevée chez les individus avec un SM.
Cependant, l’effet athérogène des LDL peut dépendre du nombre et de la taille des particules
des LDL, en plus de son contenu en cholestérol (Kathiresan et al., 2006).
Les particules sdLDL semblent être plus athérogènes. En effet, elles sont moins bien
reconnues et donc moins épurées par les R-LDL (Nigon et al., 1991), s’accumulent plus
facilement au niveau de la paroi artérielle (Bjornheden et al., 1996; Rizzo et al., 2006) et sont
plus sensibles à l’oxydation que les particules larges de LDL (Tribble et al., 1992). Donc, le
risque d’évènements cardiovasculaires associé au SM peut être en partie attribué à la présence
des sdLDL (Berneis and Krauss, 2002; St. Pierre et al., 2005).
Les particules sdLDL sont plus athérogènes que les particules de LDL plus grandes, mais
elles portent moins de cholestérol. Donc, la concentration de LDL-C n'est pas toujours
l'équivalent du nombre des particules LDL. Par contre, chaque particule LDL contient une
molécule d'apoB; donc, l’apoB plasmatique est équivalente au nombre total des particules
athérogènes, > 90% de celui des particules LDL (Sniderman et al., 2001). En effet, Boumaiza
et al. (2010) ont rapporté que chez des patients ayant un SM et une hypertriglycéridémie, les
concentrations d’apoB et du Non-HDL-C (mais pas du LDL-C) sont significativement élevées
et semblent être associées à une augmentation du risque de la sténose coronaire. Donc, la
mesure d'apoB et du Non-HDL-C semble être plus utile dans l'évaluation de risque de la
sténose coronaire dans la population ayant un SM que les LDL-C.
Comment expliquer l’association du SM à l’augmentation des sdLDL ?
- 198 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
Il a été rapporté que l’excès adipocytaire dans des conditions de diabètes ou de résistance à
l’insuline, est lié à une augmentation de la production des AGL par les adipocytes (Sniderman
and Cianflone, 1993). Ces AGL sont pris par le foie et utilisés pour la production de TG.
Comme conséquence de l’augmentation de la synthèse hépatique des TG, on constate une
augmentation de la production et sécrétion des particules VLDL par le foie (Lewis et al.,
1995). Ces VLDL sont associés à une augmentation du nombre des particules sdLDL. A
travers l’action de la CETP, il y a une perte de cholestérol estérifié et un enrichissement en
TG des LDL par échange avec les VLDL riches en TG (Halle et al., 1999). Ces particules
LDL enrichies en TG sont alors plus sensibles à l’action de la LH et deviendront des
particules LDL plus petites (Watson et al., 1994).
VIII.3.3. Association entre la SCS et le SM :
Nous avons rapporté que parmi les 192 patients, 113 (58.8%) ont de la SCS. Le SM est plus
fréquent chez les patients avec SCS comparé aux SCS- (63.7% versus. 40.5%, p= 0.004). La
fréquence de survenue de la SCS augmente significativement chez patients ayant un SM par
rapport aux autres (68.7% versus 47%, p= 0.002). Le risque de développer une SCS, en
présence du SM, est multiplié par environ 3 par rapport à son absence. En effet, après
ajustement aux facteurs confondants, l’OR de la SCS associés au SM est 3.38 (IC 95%, 1.7111.4; p= 0.004) chez notre population d’étude. Nos résultats concordent avec certaines études
(Choi et al., 2007; Wierzbicki et al., 2008). Choi et al. (2007) ont rapporté que l’OR de la
sténose coronaire est de 2.8 (IC 95%, 1.6-5.0), chez les sujets Coréens ayant un SM défini
selon l’IDF. Plusieurs études ont confirmé que le SM est un FRCV même si les définitions de
ce syndrome diffèrent d’une étude à l’autre (Rutter et al., 2006; Kokubo et al., 2008).
Cet effet athérogène, en présence du SM a été aussi observé chez les hommes (OR=3.57, IC
95%,1.45–8.7; p= 0.001) et chez les femmes avec un OR= 2.38 (IC 95%, 1.06-7.4; p= 0.005).
Une étude sur une population Européenne a rapporté des résultats similaires aux nôtres (Qiao
et al., 2006) alors que Wang et al. (2010) ont trouvé que le SM est associé à une augmentation
du risque de MCV seulement chez les femmes.
Nous avons aussi rapporté que plus le nombre de composantes présentes du SM est élevé,
plus le risque de la sténose est important. En effet, lorsque 5 composantes sont présentes,
l’OR est 4.18 (IC 95%, 1.21-12.3; p= 0.001). Si 3 ou 4 composantes seulement sont présentes,
les ORs sont, respectivement, 3.26 (IC 95%, 1.62-8.1; p= 0.0026) et 2.35 (IC 95%, 1.11-12;
p= 0.0031). Le profil le plus athérogène est celui qui regroupe chez le même individu les 5
composantes du SM et ayant un OR = 4.18 (IC 95%, 1.21-12.3; p= 0.001), suivi de celui qui
- 199 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
regroupe toutes les composantes du SM à l’exception de l’hyperglycémie avec un OR= 3.76
(IC 95%, 1.31-8; p= 0.002). Nos résultats concordent avec ceux de Malik et al. (2004).
VIII.3.4. Etude d’autres composantes du SM
Outre les composantes citées dans la définition du SM, des nouveaux marqueurs se sont
avérés souvent co-présents avec le SM. Parmi ces marqueurs, il y a l’insulino-résistance qui
joue un rôle majeur dans la physiopathologie du SM, mais aussi l’élévation des enzymes
hépatiques.
VIII.3.4.1. L’insulino-résistance
Plusieurs études ont rapporté que l’insulino-résistance est un facteur central dans la
pathogénèse du SM (Reaven, 1988; DeFronzo and Ferrannini, 1991) et joue aussi un rôle
important dans la progression de l’athérosclérose (Reaven, 2005; Zachary and Bloomgarden,
2005). Dans notre étude, nous avons rapporté, chez les sujets présentant un SM, une
augmentation significative de l’insulinémie (p=0.049) et de l’HOMA-IR (p=0.031), qui sont
des marqueurs de l’insulino-résistance (tableau XXXIII, p.197). Après ajustement à l’âge,
sexe et tabac, le risque de la SCS associé au SM augmente de 5 fois (OR = 4.96; IC 95%,
1.50–10.8; p= 0.001), chez les patients avec le quartile de HOMA-IR le plus élevé, comparé à
ceux avec le quartile le plus bas (OR= 1.93; IC 95%, 0.78–4.08; p= 0.122) (tableau XXXIV,
p.200).
Tableau XXXIV. Odds ratio (OR) de la SCS associé au SM en fonction des quartiles du
HOMA-IR
HOMA-IR
ORs ajustés
IC 95%
p
Q1<0.92
1.93
0.78-4.08
0.122
Q2: 0.92-2.23
2.6
1.18-6.7
0.032
Q3: 2.23-4.28
3.7
1.48-8.5
0.011
Q4: 4.28-11.5
4.96
1.50-10.8
0.001
Donc, nous remarquons que plus l’insulino-résistance est prononcée (HOMA-IR élevée), plus
le risque de développer une sténose coronaire en présence du SM est élevé. Cette insulinorésistance est aussi responsable de plusieurs désordres métaboliques dont la NAFLD
- 200 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
(Marchesini et al., 2001; Angelico et al., 2005; Targher, 2007). C’est pourquoi nous avons
étudié les variations des enzymes hépatiques en présence du SM.
VIII.3.4.2. Les enzymes hépatiques :
Tableau XXXV. Pourcentage des patients à activités enzymatiques élevées en fonction de
la présence ou non du SM
SM+
SM-
p
ALAT > 29 IU/L
23.1%
10.2%
0.040
ASAT > 32 IU/L
22.1%
9%
0.030
24%
5.6%
0.010
28.8%
3.4%
0.009
PAL> 80 IU/L
GGT> 34.5 IU/L
Dans notre étude, nous n’avons pas rapporté une différence significative concernant les
activités enzymatiques entre les 2 groupes SM+ et SM- (tableau XXXIII, p.197), mais en
considérant les quartiles des activités (tableau XXXV, p.201), nous avons noté que parmi les
sujets ayant un SM, il ya plus de sujets à activité enzymatique élevée (appartenant au 4 ème
quartile). Ceci est très significatif surtout pour la GGT (p=0.009). Certaines études se sont
intéressées à cette relation entre les enzymes hépatiques et le SM (André et al., 2007;
Nakanishi et al., 2004; Banderas et al., 2012). André el al. (2007) ont trouvé une
augmentation du risque de développer un SM en fonction des quartiles de la GGT, chez une
cohorte Française. Une autre étude Japonaise a montré que le risque du SM et du diabète
augmente en corrélation avec l’élévation de l’activité de la GGT et d’autres enzymes
hépatiques telles que l’ASAT, l’ALAT et la PAL (Nakanishi et al., 2004). Notre étude a
rapporté que les enzymes hépatiques sont significativement associées avec le SM.
Nous avons aussi étudié la corrélation entre les enzymes hépatiques et les paramètres du SM
(tableau XXXVI, p.202). Les enzymes hépatiques ALAT et ASAT sont positivement
corrélées avec le tour de taille, PAS, PAD et HDL-C. Cependant, il n’y a pas de corrélations
significatives entre la glycémie et les TG. Concernant la PAL et la GGT, elles sont
positivement corrélées avec la glycémie et les TG et inversement corrélées avec HDL-C.
Cependant, il n’y a pas de corrélation significative avec le tour de taille et la pression
artérielle (tableau XXXVI, p.202). L’association entre les enzymes hépatiques et les FRCV
incluant les paramètres du SM a été rapporté dans certaines études (Nakanishi et al., 2004;
Hanley et al., 2005).
- 201 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
Tableau XXXVI. Corrélation entre les enzymes hépatiques et les composantes du SM
Composantes du SM
Tout de taille
Glycémie
Triglycérides
HDL-C
PAS
PAD
ALAT
r= 0.200
p= 0.020
r= 0.037
p=0.437
r= 0.030
p=0.747
r=-0.194
p=0.038
r= 0.280
p=0.005
r= 0.290
p=0.005
ASAT
r= 0.220
p= 0.010
r= 0.007
p=0.937
r= 0.700
p=0.162
r=-0.215
p=0.022
r= 0.360
p=0.001
r= 0.350
p=0.001
PAL
r= 0.101
p= 0.291
r= 0.290
p=0.001
r=0.190
p=0.010
r= -0.220
p= 0.02
r= 0.040
p=0.705
r= 0.122
p=0.254
GGT
r= 0.135
p=0.155
r= 0.25
p=0.005
r= 0.24
p=0.008
r= -0.21
p=0.03
r= 0.182
p=0.084
r= 0.175
p=0.102
L’association entre l’augmentation des enzymes hépatiques, le SM et la NAFLD peut être
expliquée par le faite que l’insulino-résistance associée au SM va entraîner une augmentation
des AGL dû à l’augmentation de la lipolyse. Ces AGL s’accumulent au niveau hépatique et
entraînent un dysfonctionnement mitochondrial aboutissant à un SO. Ce stress entraine un
dommage hépatocytaire ce qui provoque une augmentation de la libération des enzymes
hépatiques en particulier l’ALAT (Hanley et al., 2004). L’augmentation de la GGT
s’expliquerait entre autre par son rôle dans l’homéostasie du glutathion qui est un antioxydant
cellulaire. En effet, la GGT est responsable du transport extracellulaire du glutathion (GSH)
vers les cellules, donc son augmentation au cours du SO accompagnant le SM serait liée à une
augmentation de la synthèse qui compense l’hyperconsommation.
Plusieurs études ont montré que la GGT est associée à une augmentation des MCV
(Emdin et al., 2001; Bots et al., 2002; Ruttmann et al., 2005; Wannamethee et al., 2005). Une
étude prospective a suggéré que l’ALAT prédit aussi les évènements coronaires (Schindhelm
et al., 2007b). En étudiant la relation de la SCS associée au SM en fonction des quartiles
d’ALAT, d’ASAT, de PAL et de GGT, nous avons constaté que particulièrement avec
l’ALAT et la GGT, le risque de développer une sténose en présence du SM augmente en
fonction des quartiles (tableau XXXVII, p.203). En effet, comparé au premier quartile et après
ajustement aux facteurs confondants, l’OR de la SCS associé au SM augmente de 1.4 (IC
95%, 0.66-2.9, P = 0.238) au quartile1 à 4.2 (IC 95%, 1.3–9.9, P <0.001) au quartile4 pour la
GGT et augmente de 1.52 (IC 95%, 0.29-3.7, P = 0.525) au quartile1 à 5.3 (IC 95%, 1.3918.9, P = 0.002) au quartile4 pour l’ALAT.
- 202 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
Tableau XXXVII. Odds ratio (OR) (IC 95%) de la SCS associé au SM en fonction des
quartiles des enzymes hépatiques
Q1
Q2
Q3
Q4
ALAT (IU/L)
<10
[10-13[
[13-29[
≥29
OR
1.52 (0.29-3.7)
3.30 (0.19-9.6)
4.13 (0.65-17)
5.30 (1.39-18.9)
p
0.525
0.632
0.153
0.002
ASAT (IU/L)
<14
[14-20[
[20-32[
≥32
OR
1.73 (0.44-5.6)
1.08 (0.19-6.9)
2.10 (0.24-3.6)
1.65 (0.28-6.8)
p
0.438
0.633
0.296
0.498
PAL (IU/L)
<45
[45-57[
[57-80[
≥80
OR
2.00 (0.32-14.3)
1.38 (0.4-12.4)
4.40 (0.88-21.2)
5.10 (0.96-21.9)
p
0.383
0.322
0.088
0.059
GGT (IU/L)
<19
[19-29[
[29-34.5[
≥34.5
OR
1.40 (0.66-2.9)
2.10 (0.93-6.2)
3.30 (1.3-7.9)
4.20 (1.3-9.9)
p
0.238
0.046
0.027
<0.001
Il est évident que la GGT est un marqueur biochimique potentiel pour le développement
préclinique de l’athérosclérose associée au SM. La GGT semble jouer un rôle dans la
pathogénèse de l’athérosclérose car elle est détectée au niveau des plaques athéromateuses des
artères coronaires qui provient de l’afflux des lipoprotéines qui la portent avec elles au niveau
des lésions déclenchant (Paolicchi et al., 2004; Emdin et al., 2005). Un des produits de
l’hydrolyse du GSH par GGT est le dipeptide Cys-glycine qui va engendrer à son tour des
radicaux anioniques superoxydés qui vont interagir avec les ions libres qui oxydent les LDL
(Pompella et al., 2004). De cette manière, la GGT joue un rôle de pro-oxydant dans l’espace
extracellulaire (Paolicchi et al., 1999; 2004).
Concernant l’ALAT, trois mécanismes peuvent expliquer son association avec le risque
d’athérosclérose, en présence de SM. D'abord, l'association de l’ALAT élevée avec l’insulinorésistance et les diverses composantes du SM, principalement le diabète type 2 (Hanley et al.,
2005; Marchesini et al., 2005b), qui sont considérés comme FR majeur pour l'athérosclérose,
semble être évidente. Deuxièmement, une étude a rapporté des concentrations élevées de la
CRP chez des sujets avec une activité élevée d'ALAT comparé à ceux avec ALAT normale
(Kerner et al., 2005), ceci indique le rôle de l’état inflammatoire dans le foie et le
développement de l'athérosclérose coronaire. Troisièmement, l’élévation de l’ALAT en
- 203 -
Partie pratique
Chapitre VI : Résultats et discussion
réponse à l'infiltration de graisse dans le foie peut aussi refléter le dépôt excessif de graisse
dans d'autres organes comme les coronaires, le myocarde et le muscle squelettique. Dans ces
tissus non adipeux, il y a une surcharge en TG à très longue chaîne, fournissant des substrats
abondants pour les voies métaboliques non oxydatives. Ceci entraine également la formation
de métabolites toxiques et cause le dysfonctionnement mitochondrial et la production
ultérieure d'ERO, responsables du dysfonctionnement d'organe et d’apoptose cellulaires
(Unger, 2002).
Nous avons conclu que le SM est un FR de l’athérosclérose coronaire, dans notre population
d’étude. Il est significativement associé à une augmentation d’ALAT, ASAT, PAL et GGT
mais seulement l’élévation de la GGT et de l’ALAT semble être associée à un sur- risque de
SCS associé au SM.
- 204 -
Chapitre VII : Conclusions et perspectives
Conclusions et perspectives
La particule HDL est l’élément clé du TIC qui est une voie métabolique qui permet
l’élimination du cholestérol par le foie à partir des cellules ou des tissus non hépatiques.
Depuis qu’il a été établi une corrélation inverse entre la concentration des HDL et le risque
cardiovasculaire, l’intérêt pour les mécanismes régulant la HDLémie n’a cessé d’augmenter.
Par la réduction de l’accumulation du cholestérol dans les artères, le TIC peut prévenir le
développement de l’athérosclérose.
Toute anomalie touchant cette voie, surtout les anomalies génétiques (polymorphismes),
entraînant des dysfonctionnements des acteurs de cette voie va entraîner l’accumulation du
cholestérol. Outre leur rôle dans le TIC des tissus vers le foie, les HDLs diminuent la
peroxydation des LDL in vitro et in vivo. La PON étant l’une des principales enzymes liées
aux HDLs, joue un rôle dans l’athérogénèse.
Dans cette thèse, nous avons étudié l’association de plusieurs polymorphismes des acteurs du
TIC (ABCA1, SR-BI, CETP, LCAT, apoAI) ainsi qu'à ceux des enzymes (PON1, PON2)
avec le profil lipidique et la SCS. Nous avons rapporté que certains de ces polymorphismes
semblent être associés à une augmentation ou à une diminution du risque de la SCS et
d’autres n’ont aucune association. En effet, dans notre population d’étude:
- Nous avons étudié quatre polymorphismes (G1051A, G2706A, G2868A, -565C/T) du gène
ABCA1. Nous avons rapporté que les porteurs de l’allèle A du polymorphisme G2706A sont
associés à une réduction du risque de la SCS, sans d’importantes modifications des
concentrations de HDL-C. Cet effet semble être plus protecteur chez les fumeurs et les
diabétiques. Nous avons aussi rapporté que l’haplotype (AAGC) semble être protecteur alors
que (GGAT) est associé à un effet athérogène.
- Nous nous sommes intéressés à trois polymorphismes du SR-BI (exon8, exon1, intron5).
Nous avons noté que les individus portant l’allèle muté du polymorphisme exon8 de SCARB1
semblent augmenter les concentrations d’apoAI et de HDL-C et réduire le risque de la SCS.
Cependant, les polymorphismes intron5, exon1 et l’haplotype (CAT) semblent avoir un effet
athérogène.
- 205 -
Chapitre VII : Conclusions et perspectives
- Notre étude a aussi porté sur quatre polymorphismes (Taq1B, I405V, R451Q et A373P) du
gène de la CETP. Nous avons rapporté que le polymorphisme TaqIB est associé à une
augmentation de HDL-C et une diminution du risque de la SCS. Cet effet protecteur semble
être plus significatif chez les hommes non fumeurs. Par contre, le polymorphisme R451Q est
associé à une diminution de HDL-C, augmentation d’apoB et du risque de la SCS. Aucune
association n’a été trouvé pour les polymorphismes I405V et A373P avec le profil lipidique
ou avec l’athérogénécité. L’analyse des haplotypes a montré que l’haplotype (1112) semble
être le plus protecteur contre la SCS alors que (2111) semble avoir un effet athérogène
- Nous avons étudié deux polymorphismes du gène de la LCAT (P143L (C/T) et G30S
(G/A)). Nous avons rapporté que les porteurs de l’allèle A de la mutation G30S sont associés
à un risque élevé de la SCS, sans effet significatif sur le profil lipidique. Cette mutation
semble aussi influencer significativement la sévérité de la sténose. Concernant le
polymorphisme P143L, aucun effet n’a été rapporté sur le profil lipidique, le risque de la
sténose et le score de Gensini.
- Nous avons mis en évidence deux polymorphismes de l’apoAI (-75 pb (G/T) et +83 pb
(C/T)). Le polymorphisme +83pb (C/T) est associé au risque de la SCS et à la diminution de
la concentration sérique de l’apoAI. Cependant, le polymorphisme -75pb (G/A) ne semble pas
avoir un effet significatif sur le risque de la SCS, et sur la variation des paramètres lipidiques.
La présence simultanée des deux sites polymorphiques contribue à un risque additionnel de la
SCS et de la diminution de la concentration de l’apoAI et du HDL-C
- Nous avons étudié 4 polymorphismes de la PON1 et la PON2 (PON1-L55M, PON1-Q192R,
PON2-C311S et PON2-G148A). Nous avons rapporté que les génotypes PON1-192RR et
PON2-311CC sont associés à un risque élevé de la SCS et le génotype PON1-55MM semble
être plus protecteur contre la SCS, en présence du SM et du diabète. Cette association est
évidente chez les non fumeurs pour le génotype PON1-55MM et chez les fumeurs pour les
génotypes PON1-192RR et PON2-311CC. L’haplotype (GTGC) est associé à un risque élevé
de la SCS.
Nous nous sommes aussi intéressés au SM, afin d'étudier sa place comme un FR
d'athérosclérose coronarienne. Nous avons rapporté que:
- 206 -
Chapitre VII : Conclusions et perspectives
- Le SM est un FR de SCS. Nous avons aussi rapporté, que plus le nombre de
composantes du SM, est élevé, plus le risque de la sténose est important. Nous avons noté que
plus l’insulino-résistance est prononcée (HOMA-IR élevée), plus le risque de développer une
SCS en présence du SM est élevé. Le SM est significativement associé à une augmentation
d’ALAT, ASAT, PAL et GGT mais seulement l’élévation de la GGT et de l’ALAT semble
être associé à un sur- risque de SCS associé au SM.
En perspectives, cette étude sera continuée, dans le but de :
 Doser l’activité de la CETP et de la LCAT.
 Etudier d’autres polymorphismes touchant d’autres acteurs de la voie reverse sur une
population plus importante avec plus d’information sur la gravité de la sténose.
 Mettre en évidence des mutations Tunisiennes par screening par Denaturing Gradient
Gel electrophoresis (DGGE) suivi de séquençage.
 Etudier ces polymorphismes et d’autres touchant la voie reverse du cholestérol sur une
banque d’ADN et une sérothèque établies par une étude de cohorte type « community
based », intitulée HSHS “Hammam Sousse Sahloul Heart Study”, qui comporte 1000
ménages tirés au sort par la méthode en grappe.
- 207 -
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