microscopie optique

La microscopie optique
Nicolas Sandeau
Maître de Conférences
A quoi ça sert?
Observer un objet, un phénomène…
avec une bonne résolution spatiale (voire temporelle)
sans trop de perturbations (innocuité).
L’instrument doit être sensible
et la mesure (l’image) contrastée.
Le plan
• Les contrastes
• Les microscopies de fluorescence
• La microscopie confocale
• Augmenter la résolution
• Les microscopies non linéaires
Les 1er microscopes
Vers 1880, des détails aussi
petits que 0.2 µm sont déjà
accessibles.
Microscope Carl Zeiss 1891
Principe du microscope
Imageur
Vers caméra
Vers l’oeil
Source en
Epi-illumination
Source en
transmission
Détection en forward
Principe du microscope
Oculaire
Image intermédiaire
Oculaire
Plan image
160 mm
Lentille de Telan
Objectif
Objectif
Spécimen
Spécimen
Les contrastes en
microscopie
Contraste en microscopie
D’où vient le contraste?
Absorption, diffusion,
réfraction, réflexion.
⇒
Variations d’intensité,
de couleurs, de netteté
Contraste en microscopie
Condenseur
Caméra
Lampe
(incohérent)
Filtre occultant
Filtre déphasant
⇒ Fond noir
⇒ Contraste de phase
Contraste en microscopie
Condenseur
Caméra
Lampe
(incohérent)
Filtre occultant
Filtre déphasant
⇒ Fond noir
⇒ Contraste de phase
Contraste en microscopie
Condenseur
Caméra
Lampe
(incohérent)
Filtre occultant
Filtre déphasant
⇒ Fond noir
⇒ Contraste de phase
ei'
Microscopie sur fond noir
Objectif
Rayons diffractés
Rayons non-diffractés
Spécimen
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/darkfieldgallery
Condenseur
Filtre annulaire
Lumière
blanche
http://prn1.univ-lemans.fr/prn1/siteheberge/PublisCoursOPI/OPI_fr_M03_C04/co/Contenu_K22.html
Contraste de phase
(Zernike prix Nobel 1953)
Diaphragme annulaire
Lame de Phase
Source
Ouverture du
condenseur
Plan focal arrière
de l’objectif
Plan Image
Contraste de phase
(Zernike prix Nobel 1953)
Image de la phase
http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/phasemicroscopy.html
Microscope polarisant
Mesure de la biréfringence
P
A
0
1
cos µ
E0@ sin µ A
0
I0
0
1
cos µ
E0@ sin µei' A
0
I0
0
1
¡ sin µ
E0 sin (2µ) (ei' ¡ 1)@
cos µ A
2
0
I0 sin2 (2µ) sin2 ('=2)
Microscope polarisant
Mesure du pléochroïsme
P
0
1
cos µ
E0@ sin µ A
0
I0
0
1
cos µ
E0@ sin µe¡® A
0
¡ 2
¢
2
¡2®
I0 cos µ + sin µe
http://les.mineraux.free.fr/dossier-mineralo/lamemince/fiches/biotite.htm
Contraste par interférométrie
Image du relief
http://prn1.univ-lemans.fr/prn1/siteheberge/PublisCours-OPI/OPI_fr_M03_C04/co/Contenu42.html
Microscope DIC
“Differential Interference Contrast”
Image du gradient de la phase
± < r¶esolution
I / 1 + cos(¢' + '0 )
gradient de phase
DIC ou Contraste de phase?
Objets
Images DIC
Images de la phase
Contraste de phase insensible aux pbs de polarisation ⇒ boite de Petri
DIC utilisable avec des objectifs à forte NA ⇒ meilleur résolution
http://www.microscopyu.com/galleries/dicphasecontrast/index.html
Contraste de fluorescence
Décalage de Stokes
Excitation
Émission
Diagramme énergétique de
Jablonski
Intérêts de ce contraste
•
•
•
•
https://www.omegafilters.com/curvo2/index.php?dyes=16&xmin=400
Possibilité de filtrer simplement le faisceau d’excitation et ne détecter que l’émission
Découplage de l’excitation et de l’émission
Rendement de fluorescence
Marquage spécifique
Défauts
Particularités
• Photobleaching
• Toxicité
• Temps de désexcitation
• Transfert d’énergie
Les luminophores
• Fluorophores exogènes intercalables, greffables (spécifique)…
• Protéines chimériques (GFP…);
• Billes fluorescentes (plus lumineux mais plus gros);
• Fluorophores endogènes (moins lumineux);
• Nanocristaux de semi-conducteur (plus lumineux, moins de
photobleaching mais blinking! et pb de greffache et de phototoxicité.
• Nano-diamants (plus stables, plus lumineux…)
Contraste de fluorescence (spectral)
2 (fausses)couleurs
Dichroïque
Filtre DAPI
Filtre rouge
détection
Cellules de foie www.zeiss.de
Excitation à 360nm
Excitation
filtres
Noyau (DAPI)
détection
Miroir
dichroïque
Émission
Cytosquelette
Contraste de fluorescence (temps de vie)
FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)
Deux méthodes (Cf F. Sureau):
• Time domain
• Frequency domain
Permet de différencier 2 fluorophores qui ont même spectre d’émission
Images Sandrine Lévêque-Fort - Lab.de Photophysique Moléculaire
Contraste en microscopies cohérentes
~! : E
~!
• Génération de Second Harmonique (SHG) P~ 2! = Â(2) E
⇒ uniquement sur des matériaux non-centrosymétriques!
2ω
SHG
ω
Artère de rein fibrotique
Rouge:2PEF
Vert: SHG=>collagène
http://www.lob.polytechnique.fr
ωf
2PF
• Génération de Troisième Harmonique (THG)
⇒ efficace sur les interfaces!
~! : E
~! : E
~!
P~ 3! = Â(3) E
Intensity (counts)
ω
30000
THG
SHG
20000
TPF
800
600
400
200
0
350
400
450
550
600
wavelength (nm)
ω
3ω
THG
Image d’embryon de drosophile
W. Supatto et al., PNAS (2005)
650
Les microscopies de
fluorescence
Microscopies de fluorescence
Échantillons spatialement incohérents!
Deux modes d’imagerie :
Condenseur
Caméra
Imagerie en
champ large
Lampe
(incohérent)
Faisceau pompe
(cohérent)
x
Imagerie en
mode confocal
Trou
confocal
Photodiode
z
y
Miroir
dichroïque
Microscopies de fluorescence
Échantillons spatialement incohérents!
Deux modes d’imagerie :
La profondeur de champ
n¸
dz =
NA2
Microscopies de fluorescence
Résolution vs Localisation
La localisation latérale est limitée par le bruit
⇒ de l’ordre du nm avec 1 émetteur!
⇒ Single Particule Tracking (SPT)
New directions in single-molecule imaging and analysis, W. E. Moerner, PNAS 104, 12596–12602, 2007
La résolution latérale est limitée par la diffraction
⇒ de l’ordre de ¸=2 .
µ
J1 (k N A M r)
k NA M r
¶2
Microscopies de fluorescence
Résolution vs Grandissement
Image à faible
grandissement
Image grandie 4 fois
Le grandissement
La résolution
ft
M=
fo
1:22¸
2N A
Image grandie 4 fois
et 2 fois plus résolue
Le grandissement est important
mais l’ouverture numérique de
l’objectif l’est beaucoup plus!
Microscopies de fluorescence
Résolution vs Grandissement
résolution de l’objectif
Attention à la taille du pixel!
1; 22¸
M
2N A
Il faut adapter le grandissement
à la taille du détecteur!
Microscopies de fluorescence
Mesure de l’orientation 3D
x
excitation
z
camera
emission
excitation
camera
emission
Conservation de l’information
sur l’orientation de l’émetteur à travers le microscope
λ=525 nm
NA=1,3 n=1.518 m=40
Imagerie défocalisée
x
excitation
40
emission
dipole
20
60
0
40
-20
20
-40
Conservation de l’information
sur l’orientation de l’émetteur à travers le microscope
x
-20
0
20
X ( µm)
40
Image du dipole
excitation
40
emission
20
30
0
20
-20
10
0
-40
focal plane
Mais information difficile à lire!
-40
-20
0
20
X ( µm)
40
Image du dipole
(U.A.)
camera
Y ( µm)
z
dipole
0
-40
focal plane
(A.U.)
camera
Y ( µm)
z
Imagerie défocalisée
150
excitation
100
Y ( µm)
camera
0
-50
-100
emission
(A.U.)
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
50
-150
-100
0
X ( µm)
100
150
x
excitation
10 mm
100
camera
emission focal plane
0.8
50
0.6
0
0.4
-50
0.2
-100
0.0
-150
-100
L’imagerie défocalisée pour lire cette information!
M. Böhmer & J. Enderlein, JOSA B 20 (2003)
0
X (µm)
100
« image défocalisée» du
dipole
(A.U.)
Y (µm)
z
Imagerie défocalisée
A
A
D. Patra, I. Gregor, J. Enderlein, J. Phys. Chem. A 108 (33) p. 6836-6841 (2004)
B
E. Toprak et al., PNAS 103 (17) p. 6495-6499 (2006)
Les microscopies de
fluorescence à balayage
Microscopie confocale de fluorescence
Laser
beam
fobj
fl
NA
φ
n
Photodetector
Dichroic
mirror
Main parameters
• of the microscope : NA and the ratio φ/M…
• of the excitation : mode, wavelength, polarization, shape of the beam…
• of the emission : wavelength…
3D-Resolution is defined by a volumetric function depending on
the excitation, emission and collection parameters.
Volumes d’excitation (EEF)
Excitation Efficiency Function (EEF)
E. Guiot, PhD Orsay Univ. (2001)
NA=1,4 n=1,518
λ1=400nm
EEF = Carte 3D de l’intensité focalisée (1PF)
= Carte 3D de I2 (2PF)
meilleure confocalité
LASER
beam
Volumes de collection (CEF)
Collection Efficiency Function (CEF)
600
100
400
80
z (nm)
200
60
0
-200
40
-400
20
-600
-400
-200
0
r (nm)
200
400
objective Tube lens
pinhole
CEF = Image 3D du trou confocal
Carte 3D de l’intensité détectée en
= fonction de la position 3D de l’émetteur
individuel uniformément éclairé
Fluorescence
Volumes de collection (CEF)
Collection Efficiency Function (CEF)
600
100
400
80
z (nm)
200
60
0
-200
40
-400
20
-600
-400
-200
0
r (nm)
200
400
objective Tube lens
pinhole
CEF = Image 3D du trou confocal
Carte 3D de l’intensité détectée en
= fonction de la position 3D de l’émetteur
individuel uniformément éclairé
Fluorescence
Volumes de collection (CEF)
Collection Efficiency Function (CEF)
600
100
400
80
z (nm)
200
60
0
-200
40
-400
20
-600
-400
-200
0
r (nm)
200
400
objective Tube lens
pinhole
CEF = Image 3D du trou confocal
Carte 3D de l’intensité détectée en
= fonction de la position 3D de l’émetteur
individuel uniformément éclairé
Fluorescence
Volumes de collection (CEF)
Collection Efficiency Function (CEF)
600
100
400
80
z (nm)
200
60
0
-200
40
-400
20
-600
-400
-200
0
r (nm)
200
400
objective Tube lens
pinhole
CEF = Image 3D du trou confocal
Carte 3D de l’intensité détectée en
= fonction de la position 3D de l’émetteur
individuel uniformément éclairé
Fluorescence
Volumes de détection (DEF)
Detection Efficiency Function (DEF)
600
100
Focusing
400
Emission
80
z (nm)
200
60
0
Excitation
-200
40
-400
20
Collection
Detection
-600
-400
-200
0
r (nm)
200
EEF
400
Resolution
DEF=EEF X CEF
Focused beam
Image of the
pinhole
CEF
LASER
beam
Fluorescent
sample
Fluorescence
Augmenter la résolution?
100
100
EEF
CEF
DEF
80
60
60
40
40
20
20
0
0
-2
-1
0
1
Axe X ( µm)
NA=0,6 φ/M=1µ
µm
λp=488nm λf=525nm
Le trou confocal
doit être adapter à
la fonction d’Airy
1; 22¸
R=M
2NA
EEF
CEF
DEF
80
2
-2
-1
0
1
Axe X ( µm)
NA=0,6 φ/M=0,3µ
µm
λp=488nm λf=525nm
2
Augmenter la résolution?
100
100
EEF
CEF
DEF
80
60
60
40
40
20
20
0
0
-2
-1
0
1
Axe X ( µm)
NA=0,6 φ/M=1µ
µm
λp=488nm λf=525nm
Le trou confocal
doit être adapter à
la fonction d’Airy
1; 22¸
R=M
2NA
EEF
CEF
DEF
80
2
-2
-1
0
1
Axe X ( µm)
NA=0,6 φ/M=0,3µ
µm
λp=488nm λf=525nm
2
Augmenter la résolution des
microscopes confocaux
Résolution axiale
TIRF microscopy
(Total Internal Reflection Fluorescence)
I(z) = I0 e¡z=d
¸
d= p
4¼ n1 2 sin2 µ ¡ n2 2
d ↘ quand λ↘ ou θ ↗
Résolution axiale
TIRF microscopy
(Total Internal Reflection Fluorescence)
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/tirf/tirfconfiguration.html
Résolution axiale
Le θ-microscope
EEF
DEF
CEF
=
X
z
z
z
Résolution axiale: le θ-microscope
DEF
EEF
CEF
Laser
beam
Photodetector
Pb d’encombrement et de support d’échantillons!
Résolution axiale: 4π
π-microscopie
Fluorescence
Photodetecteur
LASER
LASER
L
Sténopé
Filtre Notch
L Sténopé
Fluorescence
M
Lame semiréfléchissante
L
M
M
Objectifs
(a)
(a) S. W. Hell, EP0491289 (24-06-1992)
(b) C. J. R. Sheppard et al. Optik 87(3) (1991)
Objectifs
Miroir
dichroïque
(b)
Résolution axiale: 4π
π-microscopie
Fluorescence
Photodetecteur
LASER
LASER
L
Sténopé
Filtre Notch
L Sténopé
Fluorescence
M
Lame semiréfléchissante
L
M
M
Objectifs
(a)
(a) S. W. Hell, EP0491289 (24-06-1992)
(b) C. J. R. Sheppard et al. Optik 87(3) (1991)
Objectifs
Miroir
dichroïque
(b)
Résolution axiale : 4π
π-microscopie
L
Photodetecteur
Sténopé
Filtre Notch
Fluorescence
Lame semiréfléchissante
M
M
Objectifs
(a)
(a) S. W. Hell, EP0491289 (24-06-1992)
(b) C. J. R. Sheppard et al. Optik 87(3) (1991)
(c) A. Egner et al. Trends in Cell Biology 15(4) 2005
(c) Fibres d’actines
CEF d’un 4π
π-microscope
Fluorophore
dipolaire
Axe optique (z)
Foyers
λ=525 nm
NA=1,3 n=1.518 m=40
φ=20 µm
CEF d’un 4π
π-microscope
Dipôle fictif
cohérent
Fluorophore
dipolaire
Axe optique (z)
Foyers
λ=525 nm
NA=1,3 n=1.518 m=40
φ=20 µm
Résolution axiale: le 4π
π-microscope
Lobes secondaires
trop intenses
Pas de gain sur la
résolution latérale
Images of a pair of actin fibers
A. Egner et al. Trends in Cell Biology 15(4) 2005
4π
π-microscopie et excitation 2PE
EEF= Carte 3D du carré de l’intensité
du faisceau pompe focalisé
Excitation
Émission
Régime d’absorption à 2 photons
λpompe1=488 nm
λpompe2=2x488 nm
λfluo=525 nm
β=0.1
Polarisation selon X
NA=1,3 n=1.518
Φ=20 µm m=40
4π
π-microscopie et excitation 2PE
EEF= Carte 3D du carré de l’intensité
du faisceau pompe focalisé
Excitation
Émission
Régime d’absorption à 2 photons
λpompe1=488 nm
λpompe2=2x488 nm
λfluo=525 nm
β=0.1
Polarisation selon X
NA=1,3 n=1.518
Φ=20 µm m=40
4π
π-microscopie et excitation 2PE
Excitation
Lobes
secondaires
moins intenses
Émission
Régime d’absorption à 2 photons
λpompe1=488 nm
λpompe2=2x488 nm
λfluo=525 nm
β=0.1
Polarisation selon X
NA=1,3 n=1.518
Φ=20 µm m=40
Perte sur la
résolution latérale
Résolution latérale: le 4π
π’
Fluorophore
optical axis
(z)
Focus
λ=525 nm φ=20 µm
NA=1,3 n=1.518 m=40
S. Hell, “Double-confocal scanning microscope,”
European Patent EP0491289 (1992, filed dec. 18 1990).
Résolution latérale: le 4π
π’
Coherent dipole
Fluorophore
optical axis
(z)
Focus
λ=525 nm φ=20 µm
NA=1,3 n=1.518 m=40
S. Hell, “Double-confocal scanning microscope,”
European Patent EP0491289 (1992, filed dec. 18 1990).
Résolution latérale: le 4π
π’
Fluorophore
optical axis
(z)
Focus
Coherent dipole
λ=525 nm φ=20 µm
NA=1,3 n=1.518 m=40
N. Sandeau, H. Giovannini, J. Opt. Soc. Am. A 23, 1089-1095 (2006).
Résolution 3D: le STED
Stimulation
Excitation
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15): 8206-8210 (2000).
Principe des microscopies
non linéaires et/ou
cohérentes
Signaux non linéaires
Fluorescence
ω2
ωf
ω1
Signaux cohérents
ω3
ωf
ω2
Intensité (U.A.)
Fluorescence
excitée à 3 ph.
3PF
ω
2ω
ω
Génération 2nd
Harmonique.
SHG
Uniquement sur les
objets non centrosymétriques (Collagène)
THG
SHG
20000
ω
ω
ω3
Fluorescence Fluorescence
excitée à 1 ph. excitée à 2 ph.
1PF
2PF
30000
ωf
ω3
3ω
ω
Génération 3ème
Harmonique.
THG
Fluo
Efficace sur les interfaces
(membranes)
800
600
400
200
0
350
400
450
550
Longueur d’onde(nm)
600
650
Signaux non linéaires
ωf
ω1
ω2
ωf
ω2
1PF
Avantages:
• confocalité
• pénétration dans les tissus (- de
diffusion)
• + grand écart entre excitation et
émission
2PF
400nm
continu
800nm
impulsionnel
Inconvénients:
• sources à impulsions courtes
(Prix, spectre…)
W. R. Zipfel
et al. Nature Biotech.
21 (2003)
1 photon
2 photons
Signaux non linéaires
ωf
ω1
ω2
ωf
ω2
1PF
2PF
Avantages:
• confocalité
• pénétration dans les tissus (- de
diffusion)
• + grand écart entre excitation et
émission
Inconvénients:
• sources à impulsions courtes
(Prix, spectre…)
Rein de singe profondeur 60 µm
exc 750nm, NA 1.2
V. E. Centonze et al. Biophys. J. 75 (1998)
Signaux non linéaires
ωf
ω1
ω2
ωf
ω2
1PF
Avantages:
• confocalité
• pénétration dans les tissus (- de
diffusion)
• + grand écart entre excitation et
émission
2PF
2PE
1PE
95 nm
305 nm
Inconvénients:
• sources à impulsions courtes
(Prix, spectre…)
Spectre 2PE sur tissu pulmonaire non marqué
Excitation à 800 nm
Signaux non linéaires
ωf
ω1
ω2
ωf
ω2
1PF
Avantages:
• confocalité
• pénétration dans les tissus (- de
diffusion)
• + grand écart entre excitation et
émission
Inconvénients:
• sources à impulsions courtes
(Prix, spectre…)
2PF
Signaux Cohérents
Sur objet non centro-symétrique
(signal cohérent)
ω
Sensible à l’ordre et à l’orientation
des molécules
2ω
ω
SHG
SHG image of fibroblast cell labeled by Di8
Spectre 2PE sur tissu pulmonaire non marqué
Excitation à 830 nm
LPQM Collaboration with The Ben-Gurion
University (L. Amire, R. Marx)
Microscopies cohérentes : ex la SHG
Local excitation field
Coherent induced dipoles
Eω (x, y, z )
P2NL
ω ( x, y , z )
NL
( 2)
P2ω (x, y, z ) = χ 2ω : Eω ( x, y, z ) : Eω ( x, y, z )
Microscopies cohérentes : ex la SHG
NL
( 2)
P2ω (x, y, z ) = χ 2ω : Eω ( x, y, z ) : Eω ( x, y, z )
χ15( 2) ≈ 1.9 pm / V
χ 24( 2) ≈ 3.6 pm / V
χ 31( 2) ≈ 2.5 pm / V
Potassium Titanyl Phosphase KTiOPO4
χ 32( 2) ≈ 4.4 pm / V
χ 33( 2) ≈ 16.9 pm / V
2
x
χ(2) of massive KTP
Y
ψ1
z
We define the KTP
orientation by the Euler
angles (θ, ϕ, ψ)
3
Z
θ
ϕ
X
y
Le signal de SHG dépend du champ
d’excitation et de l’objet (orientation,
taille…)!
Microscopies cohérentes : ex la SHG
200
-200
0
x nm
-200
0 20 40
z nm
200
-200
-40 -20
y nm
0
-100
-200
-200
0 20 40
z nm
0
z nm
200
1.0
KTP along X axis
Intensity (A.U.)
θ=90°°, ϕ=0°,
ψ=0°
ϕ
Forward
Epi x 100
Epi/Forward
0.6
0.4
0.2
0.0
100
200
300
sides length (nm)
0
-100
-200
0
z nm
200
100 nm long side
0.8
Euler angles:
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-200
70 nm long side
10 nm long side
100
400
6
-40
100
3
-20
200
x10
0
0
z nm
200
600
500
400
300
200
100
0
x10
250
200
150
100
50
0
20
0
-200
200
40
y nm
0
z nm
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-100
y nm
x nm
-40 -20
-100
200
100
6
-40
0
400
3
-20
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x10
0
100
x10
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200
150
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0
20
200
x nm
40