LECONTE JUSTINE 36003545 L3SV TP2a PARTIE 1 : DESCRIPTION DU TP SUR UN JOUR Le début du TP commencera théoriquement à 8h et finira a 18h, pour la pause déjeuner on considéra que les étudiants d’un même sous groupe se relaieront pour aller manger. Le tp se fera donc sur une journée unique et durera 10h. Le but du tp est de mettre en évidence la production de phéromones par les bactéries misent en culture, mais aussi de montrer la spécificité de ces phéromones envers leurs récepteurs. La bactérie que nous allons étudier s’appelle : Bacillus subtilis, c’est une bactérie Gram+ présente dans les sols. Il y aura 4 différentes souches qui seront utilisées lors de ce TP : 2 souches dites productrices et 2 souches dites testrices. Dans la première partie du TP, nous mesurerons l’expression de la fusion de lacZ pour chacune des 4 souches. À la fin, grâce au surnageant nous pourrons observer les phéromones excrétées pas les bactéries pendant la culture. Pour le début de ce TP, il nous faut d’abord un milieu de compétence qui servira pour la culture des bactéries. Chaque souche sera mise dans 25mL de milieu de compétence. Celui-ci, sera préparé à l’avance par le technicien de laboratoire et les 4 différentes souches auront été lancés. La première étape sera de mesurer la DO à 600nm. On pipette 1mL de culture que l’on met dans une cuve à spectrophotométrie et que l’on met dans le spectrophotomètre. On relève le résultat et on le reporte sur une feuille semi-log. Puis on pipette à nouveau 1mL que l’on insère cette fois dans un tube eppendorff, que l’on va centrifuger pendant 5 minutes à 13 000 RPM. On jette le surnageant par inversion et on congèle le culot obtenu au congélateur. On répète ainsi ces actions toutes les heures. On arrête ensuite les cultures. On les centrifuge 10 minutes grâce à des tubes falcons de contenance 50mL. On récupère ensuite chaque surnageant pour préparer 2 séries de 4 tubes falcons ( toujours de 50mL) qui contiendront chacun une souche des cultures. Les surnageant seront stérilisés grâce à des filtrations que l’on mettra dans de nouveaux falcons propres. On isole ensuite les souches sur des boites LB (celles-ci pourront servir pour les prochains groupes). La deuxième grande étape est celle ou nous allons maintenant préparer 4 Mixs. Afin de gagner du temps chaque sous groupe se chargera de réaliser un Mix différent (sous groupe 1 = MixA , sous groupe 2 = MixB, etc.). Pour chaque Mix il faudra prendre 20mL de milieu de compétence frais auquel on ajoutera 20mL du surnageant. Chaque mix sera réalisé pour un surnageant différent. On remet en suspension des colonies de cultures fraîches. On les remet en suspension dans 1,5mL de milieu de compétence. Ces dernières serviront pour les groupes d’après et les suspensions que nous utiliserons dans la suite du TP proviendront soit des groupes de la veille, soit du technicien de laboratoire si nous sommes le premier groupe. Nos 4 sous-groupes vont préparer chacun 4 tubes qui contiendront 10mL de chaque Mix ajouter a 50µL de suspension bactérienne. Chaque groupe devra également préparer un tube de contrôle. Voici les tubes que chaque sous groupe devra préparer, ainsi qu’un tube de contrôle (encadré rouge) correspondant pour chaque groupe : Quart de groupe 1 Tube1a : BD2876+ MixA Tube2a : BD2876+ MixB Tube3a : BD2876+ MixC Tube4a : BD2876+ MixD Quart de groupe 2 Tube1b : BD2867+ MixA Tube2b : BD2876+ MixB Tube3b : BD2876+ MixC Tube4b : BD2876+ MixD 1 tube avec 6ml de milieu de compétence+ inoculez BD1890 Quart de groupe 3 Tube5a : BD2877+ MixA Tube6a : BD2877+ MixB Tube7a : BD2877+ MixC Tube8a : BD2877+ MixD Quart de groupe 4 Tube5b : BD2876+ MixA Tube6b : BD2876+ MixB Tube7b : BD2876+ MixC Tube8b : BD2876+ MixD 1 tube avec 6ml de milieu de compétence+ inoculez BD2915 Quand un léger trouble va être visible, on prélève 1 mL de suspension et on mesure une fois de plus, sa DO à 600 nm. On centrifuge et ensuite, on congèle. On refait ceci toutes les heures jusque T0+2. Pour la dernière grande étape, on commence par préparer une solution de Na 2CO3 1M . Un tampon Z aura été préalablement préparé par le technicien, toujours afin de gagner du temps. Sous une hotte, on ajoute 0,5 mL de ce tampon Z à chaque culot. On re-suspend ensuite le culot avec un pipetman (mouvement d’aspiration/rejet) auquel on ajoute une goutte de toluène. On vortexe le tout pendant 30 secondes et on ajoute un disque d’ONPG. On met ensuite les tubes à 28 °C. On mesure la durée jusqu’à l’apparition d’une coloration jaune. À ce moment précis, on ajoute 0,5 mL de la solution Na 2CO3 que l’on a préparé plus tôt et on centrifuge 5 minutes à 13 000RPM. On récupère 1mL de chaque tube et on mesure le DO à 420 nm et 550 nm. On reporte sur un papier semi-log la DO à 600 nm et on calcule l’activité galactosidase en fonction du temps. On pourra conclure en discutant des résultats en termes de spécificité des phéromones vis-à-vis de leurs récepteurs et en terme de cinétique d’induction de la fusion reporter. PARTIE 2 : ANALYSE D’UNE FIGURE J’ai choisi d’interpréter la figure 4 du document A qui a pour titre « Spécificité de la réponse QS ». QS signifie « quorum sensing », ou détection du quorum. C’est une particularité d’un microorganisme à détecter et à réagir à des signaux moléculaires de son environnement qui nous permet de connaître la densité de sa population. Ici, la figure se compose de 4 graphiques différents, sur lesquels se trouvent plusieurs courbes. Ces courbes représentent le taux de β-galactosidase en fonction du temps (allant de 0 à 3 heures) et selon la présence ou non des différents produits. Sur la première courbe, on voit les données recueillies pour BD2877, que l’on a vu lors de ce TP. Ici, on voit que cette bactérie réagit beaucoup plus en présence de BD2833 que en présence de ROH-1. On peut voir qu’au bout de 3 heures le taux de β-galactosidase atteint plus de 700 U/mg protéine pour cette première courbe. Pour la courbe B, on voit un phénomène plus ou moins semblable. En effet, ici, la bactérie étudiée, la BD2962 dérivée de la B.mojavensis est plus réactive vis-à-vis de , B. natto NAF4 (BD2915) alors pour les courbes des autres stagnent dès la 2e heure. Mais comparé au graphique A ici, le maximum atteint en 3h est de 200 U/mg protéine. Pour le graphique C, on ne voit plus une protéine dominante. Il y en a qui dominent plus et augmente de façon presque linéaire , comme BD2913 et RS-B-1 (BD2914) qui augmentent réciproquement jusqu’à 500 U/mg protéine et environ 350 U/mg protéine. Le RO-B-2 (BD2936) augmente aussi mais de façon moins importante que les deux protéines précédentes. Quant aux autres leurs taux reste bien inférieur à 100. Pour le graphique D, les courbes représentants les souches 168(BD2833) et ROC-2(BD2937) ont une augmentation beaucoup plus importante. Le premier monte jusque 450 U/mg protéine et le second est au alentour de 350U/mg protéine. On voit que pour les 2 autres, le taux de βgalactosidase est proche de 0. On voit donc que selon les souches concernées, le taux de β-galactosidase varie selon les interactions qui sont présentes avec les protéines du milieu. Cela varie en fonction de la ressemblance ou différence entre les espèces présentes. On voit aussi que le taux de β-galactosidase est plus ou moins important selon la souche concernée. On peut donc conclure qu’il y a une spécificité entre l’interaction d’une phéromone, sa protéine de récepteur et sa protéine de transformation.
