Telechargé par lakhdari ayoub

Applications en biologie médicale

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Applications de l’Enzymologieen
BiologieMédicale
Realiséspar :
Dr. LAKHDARIAyoub : CHU de Blida.
Dr.BELKADIRedouane :CHU de Tizi-ouzou
Dr. BOUAKIZ Sarah :CHU de Tizi-Ouzou
Encadrépar: Pr.ARAB
Année : 2020
Plan :
Introduction
I. Les Applications Analytiques
I.1. Utilisation des Enzymes comme réactifs permettant de doser une substance
I.2. Utilisation des Enzymes comme marqueurs en immuno-analyse
I.3. Utilisations des Enzymes comme outils en biologie moléculaire
II. Les Applications en Diagnostic
II.1. Utilisations des Enzymes comme marqueurs tissulaires
II.2. Diagnostic des Enzymopathies
III. Les Applications Thérapeutiques
III.1.Principe, intérêt et limites de l’enzymothérapie substitutive
III.2. Alternatives à l’enzymothérapie substitutive
III.3. Traitements spécifiques des maladies lysosomales
III.4. Perspectives thérapeutiques
III.5. Tableau récapitulatif
IV. Conclusion
Introduction
Les enzymes sont des protéines qui, en raison de leurs propriétés spécifiques, agissentsur un substrat en le
transformant en un produit tout en restant intact à la fin de la réaction.
Ce sont des catalyseurs, c'est-à-dire qu’en agissant à des concentrations très petites,ellesaugmentent la vitesse
des réactions chimiques, sans en modifier le résultat. Ellespeuvent accélérer certaines réactions chimiques par
des facteurs de cent millions.
La mise au point de techniques efficaces de production, d’extraction et de conservationdesenzymes a permis
une extension considérable de leur utilisation.
Les applications de l’enzymologie dépassent le domaine médical (diagnostic etpronostic) vers le domaine
analytique, thérapeutique, voir génétique ou encore industriel.
I.
Les Applications Analytiques
I.1. Utilisation des enzymes comme réactifs permettant de doser une substance
En biochimie le dosage de la plupart des substrats requiert l’utilisation de certains enzymes qui vont agir sur
ces substrats en les transformant en d’autres molécules plus facilement quantifiables.
L’utilisation des enzymes garantie une spécificité au dosage.
Exemples
Glucose oxydase :dosage du glucose.
Lipase : dosage du TG.
Cholestérol estérase : dosage du cholestérol
Uréase :dosage de l’urée.
Peroxydase : dosage du glucose,acide urique...
I.2. Utilisation des enzymes comme marqueurs en immuno-analyse



Les enzymes sont actuellement les marqueurs les plus utilisés en immuno-analyse.
La phosphatase alcaline (PAL) et la peroxydase sont les 2 enzymes les plus couramment
sélectionnées en immuno-analyse.
Selon la configuration du dosage, l’enzyme est couplée soit à l’antigène soit àl’anticorps.
Avantages du marquage enzymatique
 Très bonne sensibilité du fait de l’activité catalytique de l’enzyme qui permetd’amplifier le signal.

L’activité enzymatique est en général plus stable, donc durées de conservation plus importantes et des
étalonnages moins fréquents.
Inconvénients

Les conditions de génération du signal doivent être parfaitement définies(concentration en substrats,
pH, T°, cofacteurs…) et préservés des interférences possibles par l’échantillon (inhibiteur).
I.3. Utilisation des enzymes comme outils en biologie moléculaire
I.3.1 Les polymérases
 Les polymérases sont des enzymes impliquées dans l’étape d’amplification des acides nucléiques
permettant ainsi d’avoir une quantité considérable de l’acide nucléique àétudier.
 Ces enzymes sont douées d’une activité polymérase 5’-3’ et une activité exonucléase3’-5’ ou 5’-3’ ou les
2 en même temps.
I.3.1.1 DNA polymérases
catalysent la réaction générale suivante :(dNMP)n + dNTP(dNMP)n+1 + PPi
Ces enzymes sont des DNA polymérases DNA dépendantes.
Toutes les DNA polymérases exigent la présence du Mg2+ comme cofacteurs, beaucoup d’entre elles
fonctionnent en milieu alcalin. Leur T° optimale d’action se situe habituellemententre 20 et 40°c (sauf la Taq
et tub polymérases qui résistent à des T° élevées).
I.3.1.2 Les RNA polymérases
L’enzyme de transcription des gènes, elle permet la synthèsed’ARN à partir d’un des 2 brins d’ADN
matrice, la synthèse s’effectue sans amorces et nécessite des NTP et Mg2+.
Applications


Synthèse des ribosondes hautement marquées.
synthèse à partir d’un gène cloné de grandes quantités d’ARN nécessaire pour l’étude de sa structure,
ses régulations et ses interactions.
I.3.1.3 La reverse transcriptase


Enzyme produite par certains virus dits rétrovirus.
Catalyse la synthèse d’un ADN complémentaire à partir d’une matrice ARN.
Applications


Construction de banques d’ADN complémentaire à partir d’ARN messager.
PCR sur ARNm (RT-PCR).
I.3.2 Les enzymes de restriction




Ce sont des endonucléases bactériennes qui hydrolysent les liaisons phosphodiesters entre 2
nucléotides à l’intérieur de la chaine d’ADN.
Leur mode d’action est basé sur la reconnaissance spécifique suivie de coupure de l’ADN double
brin en des sitesspécifiques déterminés par une courte séquence de 4 à 8 nucléotides appelée site
derestriction.
Ces enzymes nécessitent également le Mg2+ comme cofacteur.
Il existe 3classes d’enzymes de restriction, la grande majorité des enzymes utilisées enpratique
appartiennent à la classe II.
Applications




Fragmentation de l’ADN naturel en fragments de taille accessible plus facilementmanipulables.
Etablissement des cartes de restriction
Clonage
Mise en évidence de certaines mutations (PCR-digestion) .
I.3.3 Les enzymes de modification
I.3.3.1 Les nucléases
C’est des enzymes capables de couper l’ADN au niveau des liaisons phosphodiesters. Ondistingue :
 Les exonucléases : qui dégradent la séquence d’ADN en détachant les nucléotides à partir d’une
extrémité.Les plus utilisées :

Exonucléase III
 Formation d’ADN simple brin à partir de ses extrémités.
 Délétions unidirectionnelles.

Nucléase Bal 31
 Raccourcissement progressif d’un ADN double brin aux 2 extrémités.
 Cartographie des sites de restriction.
 Les endonucléases : coupent à l’intérieur de la séquence. Les plus utilisées :




DNase I : élimination de l’ADN contaminant des extraits de protéines ou d’ARN.
Créationde cassure (pour le marquage).
Nucléase S1 : élimination des extrémités simple brin d’ADN double brin.
RNase A : élimination des ARN dans les préparations d’ADN et de protéines.
RNase H : destruction des ARN après transcription reverse en vue de la synthèse du second brin de
l’ADN complémentaire.
I.3.3.2 Les ligases
Enzymes qui assurent la formation de liaisons phosphodiesters entre une extrémité 3’ OHlibre et une extrémité
5’phosphate.Ex : DNA ligase de E. coli, T4 DNA ligase, Taq DNA ligase et RNA ligase. Utilisées dans
leclonage des gènes.
I.3.4 Autres enzymes
 Phosphatase alcaline : élimine les groupements phosphate 5’ sur les ADN, ARN et les nucléotides libres.
 Les kinases : T4 polynucléotide kinase permettent de fixer un groupement phosphate àl’extrémité 5’
d’ADN en présence d’ATP, utilisation pour le marquage en 5’ despolynucléotides.
 Protéinase K : est une sérine protéase qui dégrade les protéines notamment les nucléases lors de
l’extraction d’ADN.
II. Les applications en diagnostic
II.1 Utilisation des enzymes comme marqueurs tissulaires
II.1.1 Marqueurs musculaires
 Créatine-kinase (CK)
 La CK catalyse la phosphorylation réversible de la créatine par l’ATP.
 Présente principalement dans le muscle squelettique, cerveau et le tissu cardiaque.
 Formée de 2 sous unités différentes (M et B) ; ce qui conduit à 3 isoenzymes :
CK-BB (CK1, <1% de la CK sérique totale) : cerveau.
CK-MB (CK2, 5% de la CK sérique totale) : cœur.
CK-MM (CK3, 95% de la CK sérique totale) : muscle squelettique et cœur.
Dosage : méthode cinétique en UV :
Créatine-phosphate + ADP ------------- > créatine + ATP
ATP + glucose ADP + glucose-6-phosphate pH=6,5
Glucose-6-phosphate + NADP+ gluconate-6-phosphate + NADPH,H+
On mesure l’apparition du NADPH,H+à 340nm.
(E= CK)
(E= HK)
(E= G6PD)
Intérêt




Traumatismes musculaires divers, myopathies et rhabdomyolyse, exercice physique intense.
Syndrome malin des neuroleptiques.
AVC et traumatismes crâniens.
Infarctus du myocarde.
 Lactate déshydrogénase (LDH)
 enzyme qui catalyse l’oxydation réversible du lactate en pyruvate en présence du NADH,H+
(dernière étape de la glycolyse anaérobie).
 tétramère formé de 2 types de sous unités (H et M) ; il en résulte 5 isoenzymes différentes séparées par
électrophorèse de l’anode vers la cathode comme suit :
LDH1 (H4) : principalement dans le cœur.
LDH2 (H3M1) : principalement dans le système réticuloendothélial.
LDH3 (H2M2) : principalement dans les poumons.
LDH4 (H1M3) : principalement dans les reins.
LDH5 (M4) : principalement dans le foie et muscles striés.
Dosage : méthode cinétique en UV.
Pyruvate + NADH,H+ lactate + NAD+
pH=9,4
(E=LDH)
On mesure la consommation du NADH,H+ à 340nm..
Intérêt







Infarctus du myocarde (tardif).
Atteintes pulmonaires sévères.
Infarctus rénal.
Cytolyse hépatique.
Nécrose musculaire.
Anémies hémolytiques et mégaloblastiques
Processus néoplasiques
II.1.2 Marqueurs pancréatiques
 Amylase
 Enzyme capable d’hydrolyser les liaisons α(1-4) glycosidique à l’intérieur despolysaccharides
composés d’α-D-glucose (amidon, glycogène) pour libérer : glucose,maltose et dextrines limites.
 On distingue 2 isoformes : -amylase salivaire (60% de l’amylase sérique totale)
-amylase pancréatique (40%).
Dosage : méthode enzymatique colorimétrique.
 Un oligosaccharide bien défini (éthylène 4,6 (G7)-p-nitrophényl(G1)-α, D maltoheptaose) est dégradé
sous l’action catalytique de l’amylase.
 Les fragmentsG2PNP, G3PNP, G4PNP qui en résultent sont complètement hydrolysés par l’α
glucosidase en glucose et paranitrophenol (PNP).
 L’intensité de la coloration du PNP développé est directement proportionnelle à l’activité de l’amylase
et est mesurée par photométrie (λ=405nm).
 Le dosage de l’amylase pancréatique repose sur le même principe mais avec inhibition de l’isoforme
salivaire grâce à l’emploi de 2 anticorps monoclonaux.
 Lipase :
La lipase est une enzyme sécrétée par le pancréas exocrine qui catalyse l’hydrolysedes triglycérides
émulsionnées dans la lumière intestinale en présence de sels biliaireset de colipase.
Dosage : méthode enzymatique colorimétrique.
 Le substrat chromogène de la lipase (l’ester de 1,2-O-dilauryl –rac-glycérol-3-acid eglutarique et de la
méthyl-6-résorufine) est scindé en solution alcaline sous l’action catalytique de la lipase en O-dilauryl1,2- rac-glycérol et en un produit intermédiairein stable (le mono-ester de l’acide glutarique et de
méthyl-6-résorufine ), celui-ci de décompose spontanément en solution alcaline en acide glutarique et
méthyl-6-résorufine dont l’intensité de sa coloration rouge (λ=570nm) est directement
proportionnelle à l’activité de la lipase.
Intérêt
 Pancréatite aigüe.
 Pancréatite chronique.
II.1.3 Marqueurs hépatiques
 Transaminases (ASAT / ALAT)
C’est 2 enzymes ont une large distribution tissulaire,
l’ASAT est présente en particulier dans le cœur, foie, rein, muscle squelettique.
L’ALAT est également retrouvée dans un grand nombre de tissus mais plus abondante au niveau des
hépatocytes.
Dosage : méthode cinétique en UV.
L-aspartate + 2-oxoglutarateoxaloacétate + L- glutamate. (E=ASAT)
Oxaloacétate + NADH,H+ malate + NAD+ (E=MDH)
L-alanine + 2-oxoglutarate  pyruvate + L-glutamate (E=ALAT)
Pyruvate + NADH,H+ lactate + NAD+(E=LDH)
On mesure la consommation du NADH,H+à 340 nm.
Intérêt
 Hépatites aigues et chroniques.
 Atteintes hépatobiliaires (cirrhose, lithiase biliaire, carcinome hépatobiliaire).
 IDM et pathologies musculaires.
 Phosphatase alcaline (PAL)
La PAL catalyse l’hydrolyse des liaisons ester-phosphoriques d’une large variété de substrats.
Localisation celluliare : la membrane cytoplasmique
Localisation tissulaire : retrouvée dans de nombreux tissus, cependant en grande quantité dans l’épithélium
intestinal, tubules rénaux, l’os, foie et placenta.
Dosage : méthode enzymatique colorimétrique.
Paranitrophenyl-phosphate+ amino2-méthylpropanol  Paranitrophenol + AMP-P (E=PAL)
On mesure la coloration développée par le PNP à 405nm.
Intérêt
 Choléstase hépatiques et hépatobiliaires.
 Atteintes osseuses.
 γ- glutamyltransférase (GGT)
La GGT est une enzyme membranaire qui catalyse le transfert d’un groupement γglutamyl vers un accepteur d’AA.
Localisée surtout sur la membrane cellulaire où elle joue un rôle dans le transport des peptides.
Elle intervient en particulier dans le métabolisme du glutathion.
Localisation tissulaire : Retrouvée en grande quantité dans le foie, pancréas, rein et intestin.
C’est une enzyme très inductible.
Dosage : méthode enzymatique colorimétrique.
γ- glutamyl-3-carboxy4 nitoanilide + glycylglycine 5-amino-2-nitrobenzoate +γ- glutamyl-glycylglycine.
(E=GGT).
Intérêt




Cholestases hépatiques et hépatobiliaires.
Cirrhose, carcinome hépatocellulaire, métastases hépatiques.
Alcoolisme chronique et suivi du sevrage alcoolique.
Prise de certains médicaments (les inducteurs enzymatiques).
II.2 Diagnostic des enzymopathies
II.2.1 Enzymopathies en relation avec le métabolismeglucidique
II.2.1.1 Les glycogénoses
Définition
un groupe d’affections faisant partie des maladies de surcharge;causées par des deficits enzymatiques sur les
voies de degradation, de synthèseou de transport du glycogène;provoquant le plus souvent une accumulation
de glycogène de structure normale ou anormale.
la glycogénoses de type II :seulglycogénose lysosomal
P a t h o l o g i e Enzyme déficiente C
l
i
n
i
q
u
e
F o r m e
i n f a n t i l e
- Myopathie rapide progressive
- Cardiomégalie et insuffisance cardiaqu e
Alpha glucosidase - H é p a t o m é g a l i e m o d é r é e
(Anomalie moléculaire du gène - D é t r e s s e r e s p i r a t o i r e
Maladie de pomp e codant pour l’alpha glucosidase - R e t a r d d e l ’ a c q u i s i t i o n e t p o n d é r a l
à transmission autosomique
F o r m e
d e
l ’ a d u l t e
r é c e s s i v e )
- Faiblesse musculaire entre 30-40 ans
-Prédominance aux membres inferieurs,
-Difficulté à monter les escalier s
- Insuffisance respiratoire.
Diagnostic
 Dosage spécifique de la alpha-gucosidase
 Méthode fluorométrique ;
 Sur un culot leucocytaire obtenu a partir de tubes EDTA :
A l’aide d’un substrat artificial 4-methyl umbelliferyl-alpha-D-glucopyranoside a 37°c et de PH=4 après un
temps d’incubation arrêt de la réaction par un tampon a PH alcalin,
une détermination de la fluorescence du4-methylumbelliférone sera faite au fluorimétre à 340 nm d’excitation
et 446 d’émission en comparaison avec étalon de 4MU préparer dans les mêmes conditions.
Résultat :en nmol/h/mg de protéines (35-140 nmol/h/mg de protéines)
II.2.1.2 Déficit en G6PD
Définition :C’est le déficite nzymatique le plus répondu du GR
L’hémoglobine est transformée en laissant apparaitre des corps de HENZ dans les hématies,la transmission de
cette maladie liée au sexe, touche essentiellement les personnes habitants sur le partour méditerranée.
P a t h o l o g i e E n z y m e
Anémie hémolytique
d é f i c i e n t e C
l
i
n
i
q
u
e
Glucose 6 phosphate déshydrogénaseH2 Hémolyse importance suiteà l’ingestion de certains médicaments ou substances oxydantes.
Dosage
 MéthodeEnzymatique
Prélèvement sur tube EDTA, on réalise un lavage leucocytaire, après récupération on ajoute une
solution hémolysante.
l’activité enzymatique est déterminée par le mesure de changement de l’absorbance a 340 nm due a
la réduction du NADP+selon la réaction suivante :
G6P +NADP gluconate 6P +NADPH,H+
Résultat interpréter par rapport au nombre du GR ou taux d’Hb
Valeursusuelles :6.97 - 20.5 UI/g Hb
II.2.2 Enzymopathies en relation avec le métabolisme des acidesaminés
II.2.2.1 Phénylcétonurie
Définition
Maladie génétiqueliée a une anomalie du métabolisme de la phénylalanine qui s’accumule dans le sang suit a
son non transformation en tyrosine.
P a t h o l o g i e Enzyme déficiente C
l
i
n
i
q
u
e
-phénylalanine hydroxylase - M a l a d i e a u t o s o m i q u e r é c e s s i v e
P
C
U -coenzyme tetrahydrobiopterine - t r a i t
a u t i s t i q u e
-retard d’acquisition et mental
-teint blanc ne ressemble pas aux parent s
Diagnostic
 Méthode enzymatique colorimétrique
Nature du prélèvement : sang total recueilli sur papier
Principe :laphénylalaninedéshydrogénase catalyse la désamination
phenylpyruvate et enammoniaque avec réduction du NAD en NADH.
de
la
phénylalanineenL-
Le NADH produitestmesuré par colorimétrie 570-690 nm enutilisant un sel de tetrazolium comme
accepteur d’électron .
L-phénylalanine +H2o+NAD –> phenylpyruvate +NH3+NADH,H+
II.2.2.2 L’Homocysteinurie
Définition
désordregénétique
rare
du
métabolisme
de
la
méthionine,caractérisé
par
des
valeurstrèselevéesd’homocysteineplasmatiques et urinaire avec retard du développement et artériosclérose.
Prélèvement sur anticoagulant EDTA ouhéparine, centrifugationrapideou conservation dans la glace et
centrifugation dans les 4h.
Diagnostic
Méthode enzymatique colorimétrique àl’homocysteine methytransferase :
 réduction par le dithioothréitolhomocysteine réduite (libre)
 transfert d’un groupementméthyl de la l-méthioninemethylsulfoniumversl’homocysteinecatalysé par
l’homocysteine methyl transférase.
 oxydation de la D-méthionine par la D-aminoacideoxydase +libération d’H2O2
 oxydation d’un chromophore bleu de méthylènecoloration bleuemesurée a 660nm
 nécessitel’addition de N-ethylmaleimidepour masquer le groupement Du dithithréitol restant et
l’empêcher de réagir avec le chromophore.
II.2.3 Sphingolipidoses
II.2.3.1. Maladie de Fabry:
Définition
Maladie lysosomale, héréditaire de transmission liée a l’X,responsable de l’accumulation de trihexosylcéramide dans la cellule .
Globoside trihexosyl céramide lacosyl-céramide.
P a t h o l o g i e Enzyme déficiente C
l
i
n
i
q
u
e
- D é b u t d e l ’ e n f a n c e
-Atteinte rénale avec 1er signe
Maladie de fabry A l p h a - g a l a c t o s i d a s e A M i c r o a l b i m i n u r i e  p r o t é i n u r i e
A t t e i n t e
c a r d i a q u e
-Atteinte cerébrovasculaire
-Atteinte cochélo-vestibulaire
-Surdité brusque et progressive
Diagnostic
Prélèvement sur tube EDTA
Alpha-gal hydrolyse le substrat 4-methylumbelliferyl-alpha-galactopyranose a 37 °c PH=4.5
après arrêt de la réaction une détermination de la fluorescence du 4-methylmbelliférone libéré sera faite
comparativement a un étalon a 446 nm.
4-methylumbelliferyl-alpha-galactopyranose4 MU +-alpha-galactopyranose.
Valeurs usuelles (25-55) nmol/h/mg de protéines.
II.2.3.2. Maladie de Gaucher
Définition
Maladie lysosomale héréditaire de transmission autosomiquerecessive, due a un deficit en glucocerbrosidase.
GM1GM2GM3LactosylCeramide Glucocerebroside  Céramide + Glucose.
Pathologie
Enzyme déficiente
C
3
l
Maladie de
Gaucher
n
i
p r i n c i p a u x
T
B-glucosidase
o
u
son activateur
saposine C
i
y
p
q
u
e
p h é n o t y p e s
e
1
:
95% des cas non neurologique (dg à 20 ans)
SPM/HPM/HGIE modérée atteinte Osseuse
T
y
p
B i o l o g i e
e
2
Thrombopénie
Ferritinémie élevée
:
1% des cas aigueneurologique (dg de 3à6mois)
C'est la forme la plus sévère
Paralysie oculomotrice/signebulbaire/mvtdystonique/convulsion tardive+HPM
CRP normal
TYPE 3:5%des cas neurologiquesubaig u
CarenceenB12
Diagnostic
 Dosageenzymatique
Prélèevement effectué sur tube EDTA
 B-glucosidase
La B-glucosidase hydrolyse le substrat 4-méthylumbellféryl 6-D-Glucopyranoside à37'c pH 5,5,
après arret dela reaction une détermination de la fluorescence du 4-Méthylumbeliférone (4MU) libéré sera
faite comparativement à un étalon à 446nm .
4-méthylumbelliféryl 6-D-Glucopyranoside ------------> 4MU+ 6-D-Glucopyranoside
Valeursusuelles: (6-25) nmol/h/mg de protéines
II.2.3.3. La LeucodystrophieMétachromatique
Définition
Maladie lysosomal, héréditaire de transmission autosomiquerécessif, responsable de l'accumulation de
sulfatide (galactosylcéramide-3-0-sulfate), lipide majeur qui constitue la myéline d'où son accumulation dans
les oligodendriocytes et les cellules de chawannes provoquant une dégénérescence du SNC et SNP
Sulfatides ---------->galactocérébroside
P a t h o l o g i e
Enzyme déficiente
C
Leucodystrophie
métachromatique
Arylsulfatase A ou
son activateurla saposine B
- Forme infantile
Stagnation du
H y p o t o n i
T r o u b l e à
l
i
n
i
q
u
e
tardive: 1à2ans
DVP moteur
e
a x i a l e
l a m a r c h e
Diagnostic
Dosage enzymatique par method colorimétrique
L'arylsulfatase A hydrolyse le para-nitrocathéchol-sulfate en présence de pyrophosphate de sodium et
chlorurede sodium (inhibiteur de l'arylsulfataseB à 37"C et à pH5, la quantité de para-nitrocatéchol
libéré,proportionnelle à l’activitéenzymatique,est mesurée par spectrométrie à 515nm.
Valeurs usuelles: 30-130nmol/h/mg de protéines
II.2.3.4. Gangliosidose à GM2
Définition
Maladie à transmission recessive autosomique
GM2 GM3 (hexosaminidaseA)
Globoside--------Trixosyl-céramide (hexosaminidases A et B)
Enzyme déficitaire
C
S a c h s
Hexosaminidase A
D é b u t
v a r i a b l e
- Signes neurologiques: ataxie,épilepsie, régression intellectuelle
- T a b l e a u p s y c h i a t r i q u e
S A N D H O F F
Hexosaminidases A et B
- T ableau i denti que à cel ui de Tay Sach s
P a t h o l o g i e
T a y
l
i
n
i
q
u
e
Diagnostic : dosage enzymatique
Prélèvement sur tube sec
Les hexosaminidases hydrolysent le substrat 4-Méthylumbelliférone-N-acétyle-6-D-glucosaminide à 37C et
àPh 4,
après arrêt de la réactionunedétermination de la fluorescence du 4-Méthylumbelliférone (4MU) Ilibéré sera
faite comparativement à un étalon (exc :365nm -emi 450) .
4-méthylumbelliféryl 6-D-Glucosaminide ------- 4MU + N-acétyle-6-D-Glucopyranoside
L'hexosaminidases A est thermosensible, on incube l'Hexo B à 50'C pour dénaturée la A
L'activité de l’HexoA :Hexo total-Hexo B
II.4. Les Muccopolysacharidoses
Définition
Maladies héréditaires secondaire au déficit d'une des enzymes impliquées dans le catabolisme des
glycosaminoglycanes: dermatane sulfate- héparane sulfate-kératane sulfate-chondroitine sulfate, entraine
l'accumulation intralysosomiale du ou des glycosaminoglycanes non dégradées, ils ‘agit d'affections graves
multisystimique, d'évolution chronique et progressive
Les différents types de glycosaminoglycanes
 Le typel
P
a
t
h
o
l
o
g
i
e
M a l a d i e d ' h u r l e r
(autosomique récessif)
Enzyme déficitaire
α-1-iaudoronidase
C
l
i
n
i
q
u
e
- Début dans les 2 premières années
- Dysmorphie facialecaractéristique
-Hernie ombilicale/diarrhée/HPSM
- Apnée du sommeilpneumopathi e
- Insuffisance mitralo -aortique
- Li mitation des mvm articulaire s
Diagnostic :enzymatique
-Sur tube EDTA
α-l-iaudoronidase hydrolyse le substrat 4-méthylumbelliféryl α-l-idoronide à températureambiante pH
3,5après arrêt de la réaction, une détermination de la fluorescence du 4 Méthylumbelliférone (4MU) libéré
sera faite comparativement a un étalon à 446nm .
4-méthylumbelliféryl α-l-idoronide-------- 4MU+ α-l-idoronide
Valeursusuelles: (01-05) nmol/h/mg de proteins
 Le type3
P a t h o l o g i e
Maladie de Sanphilippo
E n z y m e
-
d é f i c i t a i r e
Type A: héparane sulfamidase
Type B: α glucosaminidase
Type C: α glucosaminid-Nacetyltransferase
Type D: N- acetylglucosamine-6- sulfate
C
-
l
i
n
i
q
u
e
Otite à répétition
Retard psychomoteu r
Macrocéphalie
H P S M m o d é r é
Diarrhée chronique
Ostéochondrite
Diagnosticc (type B) :dosage enzymatique
L'αg lucosaminidase hydrolyse le substrat para-Nitro-Phényl-α-D-Glucosaminide à37, une détermination du
paranitrophénol libéré sera faite photomériquement à 400nm selon la réaction suivante :
Para-Nitro-Phényl-α-D-Glucosaminide ---------- paranitrophénol+ D-Glucosaminide
 Le type 4
P a t h o l o g i e
Maladie de Maroteaux Lamy
(Autosomique récessif)
Enzyme déficitaire
C
A r y l s u l f a t a s e
- Régression psychointelectuell e
- Atteinte os5seuse sévère
- Décès à l'adolescence
B
l
i
n
i
q
u
e
Diagnostic :dosage enzymatique
Prélèvement sur tube EDTA
L'Arylsulfatase B le substrat paranitrocatéchol-sulfate +AgNO, (inhibiteur de l'Arylsulfatase A) à37°C PH 5,8
Après précipitation des protéines la réactionestrévélée par addition de NAOH et une détermination de
paranitrocatéchol libéré sera faite photométriquement à 546nm selon la réactionsuivante :
Paranitrocatéchol-sulfate -------- paranitrocatéchol+ H2SO4
Valeursusuelles: 85-410 nmol/h/mg de proteins
III. Les Applications Thérapeutiques
III.1. Principe, intérêt et limites de l’enzymothérapie substitutive
 Le principe de l’enzymothérapie substitutive est d’apporter l’enzyme déficiente aux cellules du malade
afin de restaurer l’activité enzymatique.
 L’administration de l’enzyme se fait par perfusions intraveineuses, effectuées régulièrement (toutes les
semaines ou tous les 15 jours). Le traitement doit se poursuivre à vie.
 Intérêt : diminution de la surcharge et, le plus souvent, limiter la progression de l’atteinte viscérale et de
ses conséquences cliniques.
 L’efficacité de l’enzymothérapie substitutive est variable selon le type et le stade de la maladie mais aussi
selon l’organe atteint. Elle est inefficace sur les symptômes neurologiques car ces enzymes ne franchissent
pas la barrière hémato-méningée.
III.2. Alternatives à l’enzymothérapie substitutive
 Le traitement par réduction de substrat :
Empêche partiellement la production du substrat
Peut être utilisé dans le cas de maladies lysosomales qui touchent le système nerveux central ou en
complément d’autres traitements. Cependant, son efficacité est modérée.
 La greffe de moelle osseuse ou de cellules souches hématopoïétiques :
Le but est d’apporter au patient atteinte d’une maladie lysosomale des cellules souches capables de
produire l’enzyme déficiente.
 La thérapie génique :
Repose sur l’introduction dans les cellules des personnes atteintes la copie normale du gène.
se fait le plus souvent par l’intermédiaire d’un vecteur viral. actuellement en phase d’essai clinique.
 Les molécules chaperonnes :
De nombreuses mutations engendrent des protéines dont la conformation est altérée, provoquant ainsi une
perte de fonction.
Le traitement de protéines de configuration incorrecte par des molécules chaperonnes (contrôlent le
repliement tridimensionnel correct )dites "pharmacologiques" permettrait de corriger le repliement de ces
protéines afin qu’elles puissent exercer leur activité.
III.3. Traitementsspécifiques des maladies lysosomales
III.3.1. Sphingolipidoses :
III.3.1.1. Maladie de Gaucher
La première maladie lysosomale ayantbénéficié d'un traitementspécifique par enzyme substitutive :
Glucocérébrosidase recombinante : Imiglucérase (CEREZYME ®).
Malheureusement le traitement est inefficace sur les troubles neurologiques et n'est donc pas indiqué dans la
maladie de Gaucher de type 2.
III.3.1.2.Maladie de Fabry
le traitement de substitution, maintenu à vie, consiste en une perfusion toutes les deux semaines de
Fabrazyme® (agalsidase bêta)) ou de Replagal® (agalsidase alfa) ).
III.3.2. Glycogénose de type II (Maladie de Pompe)
Actuellementc’est la seuleglycogénose qui est accessible au traitement par enzymothérapie substitutive.
L'alpha-glucosidase humaine recombinante :Alglucosidase alfa (MYOZYME®) .
III.3.3. Mucopolysaccharidoses
III.3.3.1. MPS de type I (Maladie de Hurler)
La mucopolysaccharidose de type I (MPS I) est une maladie de surcharge lysosomale due à un déficit en α-Liduronidase.
Le pronostic de cette maladie a été amélioré par l’enzymothérapie substitutive (ETS) par α-L-iduronidase
recombinante humaine : Iaronidase (ALDURAZYME ®).
Le diagnostic précoce de cette maladie est nécessaire, car les résultats de l’ETS sont d’autant plus
encourageants que le traitement est débuté tôt dans l’évolution.
Le traitement précoce permet, en quelques mois, une amélioration significative de la fonction respiratoire et
des capacités physiques, ainsi qu’une réduction de l'hépatomégalie et l'accumulation de glycosaminoglycanes.
Une autre alternative est la transplantation de cellules souches hématopoïétiques mais qui possède
actuellement peu d’indications compte tenu des risques inhérents à la procédure.
D’autresstratégiesthérapeutiquesinnovantessontactuellementexplorées, telle que la thérapie par réduction de
substratbasée sur l’utilisationd’inhibiteurs de la biosynthèse des MPS comme la génistéine (Inhibition de la
synthèse des protéoglycanes) qui permettrait de réduire l’accumulation des composéspathologiques et
leursconséquences au niveau des tissus.
D’autres thérapies moléculaires pouvant avoir un effet chaperon ou permettant la translecture de codon stop
sont également à l’étude.
Enfin,
la
thérapiegéniquepourraitêtreuneméthodeenvisageable
essaiscliniquessontencours.
dans
le
futur,
les
premiers
III.3.3.2. MPS de type II (Maladie de Hunter)
La muccopolysaccharidose de type II est causée par le déficit de l’iduronate-2-sulfatase. Elle se transmet selon
un mode lié à l’X et donc théoriquement n’atteint que les garçons, mais une dizaine de cas de MPS de type II
a été rencontré chez des filles en raison du phénomène d’inactivation de l’X.
Depuis 2006, le traitement enzymatique substitutif par l’idursulfase (ELAPRASE ®) est disponible.
L’enzyme doit être administrée au malade de préférence chaque semaine par perfusion, et ce à vie.
Les essais cliniques ont montré des améliorations significatives, comme une réduction rapide de
l’hépatosplénomégalie, et une amélioration des capacités motrices, cardiaques et respiratoires.
Cependant, l’enzyme ne parvient pas jusqu’au cerveau, et donc ne permet pas de réparer les lésions
neurologiques déjà existantes. La régression psychomotrice est néanmoins plus lente et plus tardive grâce au
traitement.
La greffe de moelle osseuse n’est plus recommandée qu’exceptionnellement, pour des malades dont le cas est
soigneusement sélectionné.
La thérapiegéniqueesttoujours au stadeexpérimental.
III.3.3.3. MPS de type VI (Maladie de Maroteaux-Lamy)
Cette maladie est due à une déficience en Arylsufatase B. Elle est caractérisée par un nanisme, une surdité et
des déformations progressives du squelette, une hépatosplénomégalie est souvent retrouvée.
Actuellement un traitement de substitution enzymatiqueest disponible, ils’agit de la galsulfase
(Naglazyme®). L’efficacité du traitementdépend de l’âge de début de la maladie, la vitesse de progression de
la maladie et l’âge de début de l’enzymothérapie.
III.3.3.4. MPS de type IV A (Maladie de Morquio type A)
La mucopolysaccharidose de type IV oumaladie de Morquio existe sous deux formesdifférentes dues à un
déficitendifférentes enzymes. Les deux types entraînentunedégradationinsuffisante de sulfate de kératane et de
sulfate de chondroïtine dans les lysosomes. La forme la plus fréquenteest la MPS IV A.La MPS IV B est plus
rare.
La MPS IV A est due à une déficience en N-acétylglucosamine-6-sulfate sulfatase.
Depuis 2014 une N-acetylgalactosamine-6-sulfatase humaine recombinante rhGALNS ouElosulfase alfa
(Vimizim®) est disponible sur le marché.
 Autres traitements :
- Les quelques essais de greffe de moelle osseuse réalisés à ce jour n’ont pas permis d’améliorer ni les signes
biologiques, ni les manifestations cliniques ni la qualité de vie des patients.
- Thérapiegénique :Plusieursstratégiessontactuellement à l’essai sur des modèlesanimaux et des protocoles
pour une application cliniquesont à l’étude.
III.4. Perspectives thérapeutiques
Des traitements de substitution enzymatiquesontencoursd’étude pour de nombreusesautres maladies
lysosomales (Leucodystrophiemétachromatique, maladie de Niemann-Pick, MPS de type IV A et de type III)
ainsi que d’autres types d’enzymopathiestelle que l’hypophosphatasie.
III.4.1. Leucodystrophiemétachromatique
La maladie de Scholz ou leucodystrophie métachromatique (LDM) est une maladie de surcharge lysosomale
due à un déficit en arylsulfatase A. Cette enzyme est responsable de la dégradation des sulfatides comme le
cérébroside-3-sulfate en galactocérébroside et sulfate, en présence d’un cofacteur la saposine B.
L'accumulation pathologique des sulfatides dans le système nerveux (myéline, neurones et cellules gliales)
entraîne le plus souvent une atteinte neurologique, un retard mental, des troubles nerveux et une cécité.
 Traitement actuel :
Plusieurs malades atteints de forme infantile et juvénile de la LDM ont reçu une greffe de moelle osseuse
(GMO) mais aucune régression des signes n'a été rapportée. Par contre, la GMO chez les patients atteints de la
forme adulte de LDM était très bénéfique. Une amélioration des symptômes neurologiques associée à une
normalisation de leurs activités ARSA et leurs taux de sulfatides a été notée.
 En perspective :
- L'enzymothérapie de substitution :Depuis 2008, au Danemark, un essaid'enzymothérapie substitutive à la
Metazym
estproposé
à
des
enfants
présentant
la
forme
infantile
tardive.
Les
essaiscliniquessonttoujoursencours.
- Thérapie par réduction de substratpar la warfarine : Les premières études sur la warfarine, anticoagulant et
antagoniste de la vitamine K, ontmontré que cecomposéempêche la synthèse des sphingolipidesréduisant de ce
fait les concentrations des sulfatides chez les souris. Ainsi la warfarinepourraitêtre un moyen de diminuer la
charge métaboliquerésultant du défaut de l'ARSA.
- Thérapiegénique : À ce jour, plusieursapprochessont à l'essai sur des modèlesanimaux.
III.4.2. Maladie de Niemann-Pick de type A et B
La maladie de Niemann-Pick est une maladie lysosomale due au déficit de l’activité de la sphingomyélinase
acide, l’enzyme qui hydrolyse la sphingomyéline en céramide. Ce défaut est responsable de la surcharge des
cellules en sphingomyéline.
Les formes de type A sont plus précoces (première année) et sont associées à une altération de l’état général,
une hépatosplénomégalie majeure, et une atteinte neurologique sévère (arrêt du développement psychomoteur,
hypotonie…). La dégradation neurologique et les infections pulmonaires conduisent rapidement au décès.
Dans les formes de type B, l’âge de début esttrès variable (jusqu’àl’âgeadulte) et le signe le plus constant
estl’hépatosplénomégalieparfoisassociée à des signespulmonaires.
Maladie de Niemann-Pick type A
Maladie de Niemann-Pick type B
A c t i vi t é e n zy ma t i q u e r é si d u el l e < 1 %
Activité enzymatique résiduelle 5 – 10 %
C l i n i q u e
:
- Signes digestifs (Vomissements, diarrhée),
- Atteinte neurodégénérative progressive,
- Retard de développement psychomoteur,
- Hépatosplénomégalie,
P n e u m o p a t h i e .
Décès généralement avant l'âge de 3 ans.
C
l
i
n
i
q
u
e
:
- Absence de signes neurologiques,
- H é p a t o s p l é n o m é g a l i e
T h r o m b o p é n i e
- Pneumopathie interstitielle
C i r r h o s e
( r a r e m e n t ) .
Décès à l’adolescence ou l’âge adulte .
La thérapie enzymatique utilisant la sphingomyélinase acide humaine recombinante rhASM ou Olipudase
alfa est toujours en phase d’essais cliniques sur les formes de type B (Non neurologique).
EnFévrier 2015, les premiers résultats de l’étude de tolérance et de toxicité (phase I) ontétéprésentés et
semblentprometteurs.
Les
effetsindésirables
à
court
termesontmodérés,
maisplusieursannéesd’étudeserontnécessairesavant la mise sur le marché de l’enzymeen question.
III.4.3. MPS de type III A (San Filippo type A)
La maladie de San Filippo est divisée en quatre sous-types qui présentent tous des symptômes similaires. Elle
se traduit par une dégénérescence nerveuse très importante aboutissant à un état grabataire vers l'âge de 20 ans
et un décès entre 20 et 30 ans. En revanche sur le plan biochimique ils sont différents, chaque sous-type est
déterminé en fonction de l’enzyme qui est absente ou déficitaire :
- l’héparane-N-sulfatase ou héparane sulfamidase est déficitaire dans la MPS III A
- l’alpha-N-acétylglucosaminidase est déficitaire dans la MPS III B
- l’acétyl-CoA-alpha-glucosaminide-N-acétyltransférase est déficitaire dans la MPS III C
- la N-acétylglucosamine-6-sulfatase est déficitaire dans la MPS III D
Lorsqu’une de ces quatre enzymes est absente, cela provoque une accumulation d’héparane sulfate dans les
lysosomes.
Plusieurs traitements spécifiques sont actuellement à l’étude comme :

La thérapie de réduction du substrat de l’enzyme déficiente par utilisation de Génistéine.

La transplantation de cellules souches hématopoïétiques

La thérapeutique enzymatique substitutive par voie intrathécale: Elle correspond à l’injection de
l’enzyme héparane N-Sulfatase humaine recombinante HGT-1410 au niveau de la colonne vertébrale
dans le liquide céphalo-rachidien. Des essais cliniques pour la MPS III A sont actuellement en cours pour
vérifier l’innocuité de ce type de traitement. La thérapeutique enzymatique substitutive par voie
intraveineuse n’est pas disponible car l’enzyme déficiente ne peut pas traverser la barrière hématoméningée.

La thérapie génique : Des essais cliniques pour la MPS III A et la MPS III B sont actuellement menés. Ils
consistent à injecter dans le cerveau, par neurochirurgie, une certaine concentration d’un vecteur
contenant le gène correct de l’enzyme impliquée dans le sous-type en question. L’objectif premier est
d’évaluer la tolérance et l’innocuité de ce traitement.
Pour êtretotalementefficaces, cestraitementsdoiventêtrecommencésavantqu’il y ait des dommagesirréversibles
du systèmenerveux central.
III.4.4. Hypophosphatasie
L’hypophosphatasie (HPP) est due à des mutations récessives dans le gène ALP, qui code pour la phosphatase
alcaline non tissu-spécifique. Le spectre phénotypique est large, allant de formes létales de fœtus « dépourvus
d’os» à des formes légères avec retard de croissance et douleurs osseuses, voire même limitées à une perte
prématurée des dents. L’HPP est une maladie primairement osseuse, avec des conséquences systémiques
inconstantes.
Le traitement enzymatique substitutif de l’HPP : ENB-0040 a été conçu pour fournir la phosphatase alcaline
dans l’os. C’est une molécule de fusion entre l’enzyme et la portion Fc des IgG humaines liée à un peptide
dérivé de l’ostéopontine et de la sialoprotéine osseuse, deux protéines naturellement ciblées pour entrer dans
le tissu osseux.
Une étude cliniqueestencours, avec des résultatspréliminairestrèsencourageantsentermesd’efficacité et de
sécurité.
III.5. Tableau récapitulatif
P a t h o l o g i e s
T hé r a pi e
Maladie de Gaucher
e n zy m a t i q ue
M a l a d i e
d e
F a b r y
M a l a d i e
d e
P o m p e
Imiglucérase Cerezyme®(Genzyme)
V é l a gl u c é r a s e V - P R I V ® ( S h i r e )
Agalsidase betaFabrazyme®(Genzyme)
Agalsidase alfa Replagal® (Shire)
Alglucosidase alfa Myozyme® (Genzyme)
I ( H u r l e r )
I I ( H u n t e r )
Iaronidase Aldurazyme® (BioMarin Pharmaceutical)
Idursulfase Elaprase® (Shire)
MPS VI (Maroteaux-Lamy)
MPS IV A (Morquio A)
Galsulfase Naglazyme® (BioMarin Pharmaceutical)
Elosulfase alfa Vimizim® (BioMarin Pharmaceutical)
Leucodystrophie métachromatique
M e t a z y m
Maladie de Niemann-Pick type A-B
MPS III A (San filippo A)
Olipudase alfa (Genzyme)
H G T 1 4 1 0 ( S h i r e )
M P S
M P S
s ubs t i t ut i v e
Traitements disponibles
( S h i r e )
Traitements expérimentaux
IV. Conclusion
Les enzymes sont des protéines qui agissent comme catalyseurs dans tous les organismes vivants
Depuis le XXe siècle, l’amélioration de la connaissance des enzymes a permit leur utilisation dans différents
domaines dont les plus importants sont le diagnostic médical, la chimie analytique, la biologie moléculaire et
la thérapie enzymatique.
Depuis les années 90, la thérapie par enzyme substitutive a connu un essor considérable. Cependant plusieurs
défis persistent, en particulier le traitement du système nerveux central.
Des stratégies alternatives, telles que la réduction de substrat ou l'emploi de petites molécules chaperons pour
restaurer des enzymes mutées, mal repliées ou instables, mais qui ont gardé une fonction résiduelle, sont en
cours d'évaluation.
Malgré ses nombreux avantages la thérapie enzymatique doit être obligatoirement poursuivie à vie et peut
engendrer dans certains cas des phénomènes d’hypersensibilité. Ce type de traitement ne permettra jamais une
guérison totale et définitive de la maladie. Actuellement des essais de thérapie génique sont en cours. Elle
permettrait d’apporter aux cellules des malades le gène fonctionnel et ainsi de synthétiser l’enzyme in vivo.
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