Applications en biologie médicale

Applications de l’Enzymologieen
BiologieMédicale
Realiséspar :
Dr. LAKHDARIAyoub : CHU de Blida.
Dr.BELKADIRedouane :CHU de Tizi-ouzou
Dr. BOUAKIZ Sarah :CHU de Tizi-Ouzou
Encadrépar: Pr.ARAB
Année : 2020

Plan :
Introduction
I. Les Applications Analytiques
I.1. Utilisation des Enzymes comme réactifs permettant de doser une substance
I.2. Utilisation des Enzymes comme marqueurs en immuno-analyse
I.3. Utilisations des Enzymes comme outils en biologie moléculaire
II. Les Applications en Diagnostic
II.1. Utilisations des Enzymes comme marqueurs tissulaires
II.2. Diagnostic des Enzymopathies
III. Les Applications Thérapeutiques
III.1.Principe, intérêt et limites de l’enzymothérapie substitutive
III.2. Alternatives à l’enzymothérapie substitutive
III.3. Traitements spécifiques des maladies lysosomales
III.4. Perspectives thérapeutiques
III.5. Tableau récapitulatif
IV. Conclusion

Introduction
Les enzymes sont des protéines qui, en raison de leurs propriétés spécifiques, agissentsur un substrat en le
transformant en un produit tout en restant intact à la fin de la réaction.
Ce sont des catalyseurs, c'est-à-dire qu’en agissant à des concentrations très petites,ellesaugmentent la vitesse
des réactions chimiques, sans en modifier le résultat. Ellespeuvent accélérer certaines réactions chimiques par
des facteurs de cent millions.
La mise au point de techniques efficaces de production, d’extraction et de conservationdesenzymes a permis
une extension considérable de leur utilisation.
Les applications de l’enzymologie dépassent le domaine médical (diagnostic etpronostic) vers le domaine
analytique, thérapeutique, voir génétique ou encore industriel.
I. Les Applications Analytiques
I.1. Utilisation des enzymes comme réactifs permettant de doser une substance
En biochimie le dosage de la plupart des substrats requiert l’utilisation de certains enzymes qui vont agir sur
ces substrats en les transformant en d’autres molécules plus facilement quantifiables.
L’utilisation des enzymes garantie une spécificité au dosage.
Exemples
Glucose oxydase :dosage du glucose.
Lipase : dosage du TG.
Cholestérol estérase : dosage du cholestérol
Uréase :dosage de l’urée.
Peroxydase : dosage du glucose,acide urique...
I.2. Utilisation des enzymes comme marqueurs en immuno-analyse
 Les enzymes sont actuellement les marqueurs les plus utilisés en immuno-analyse.
 La phosphatase alcaline (PAL) et la peroxydase sont les 2 enzymes les plus couramment
sélectionnées en immuno-analyse.
 Selon la configuration du dosage, l’enzyme est couplée soit à l’antigène soit àl’anticorps.
Avantages du marquage enzymatique
 Très bonne sensibilité du fait de l’activité catalytique de l’enzyme qui permetd’amplifier le signal.
 L’activité enzymatique est en général plus stable, donc durées de conservation plus importantes et des
étalonnages moins fréquents.
Inconvénients
 Les conditions de génération du signal doivent être parfaitement définies(concentration en substrats,
pH, T°, cofacteurs…) et préservés des interférences possibles par l’échantillon (inhibiteur).
I.3. Utilisation des enzymes comme outils en biologie moléculaire
I.3.1 Les polymérases
 Les polymérases sont des enzymes impliquées dans l’étape d’amplification des acides nucléiques
permettant ainsi d’avoir une quantité considérable de l’acide nucléique àétudier.
 Ces enzymes sont douées d’une activité polymérase 5’-3’ et une activité exonucléase3’-5’ ou 5’-3’ ou les
2 en même temps.

I.3.1.1 DNA polymérases
catalysent la réaction générale suivante :(dNMP)n + dNTP(dNMP)n+1 + PPi
Ces enzymes sont des DNA polymérases DNA dépendantes.
Toutes les DNA polymérases exigent la présence du Mg2+ comme cofacteurs, beaucoup d’entre elles
fonctionnent en milieu alcalin. Leur T° optimale d’action se situe habituellemententre 20 et 40°c (sauf la Taq
et tub polymérases qui résistent à des T° élevées).
I.3.1.2 Les RNA polymérases
L’enzyme de transcription des gènes, elle permet la synthèsed’ARN à partir d’un des 2 brins d’ADN
matrice, la synthèse s’effectue sans amorces et nécessite des NTP et Mg2+.
Applications
 Synthèse des ribosondes hautement marquées.
 synthèse à partir d’un gène cloné de grandes quantités d’ARN nécessaire pour l’étude de sa structure,
ses régulations et ses interactions.
I.3.1.3 La reverse transcriptase
 Enzyme produite par certains virus dits rétrovirus.
 Catalyse la synthèse d’un ADN complémentaire à partir d’une matrice ARN.
Applications
 Construction de banques d’ADN complémentaire à partir d’ARN messager.
 PCR sur ARNm (RT-PCR).
I.3.2 Les enzymes de restriction
 Ce sont des endonucléases bactériennes qui hydrolysent les liaisons phosphodiesters entre 2
nucléotides à l’intérieur de la chaine d’ADN.
 Leur mode d’action est basé sur la reconnaissance spécifique suivie de coupure de l’ADN double
brin en des sitesspécifiques déterminés par une courte séquence de 4 à 8 nucléotides appelée site
derestriction.
 Ces enzymes nécessitent également le Mg2+ comme cofacteur.
 Il existe 3classes d’enzymes de restriction, la grande majorité des enzymes utilisées enpratique
appartiennent à la classe II.
Applications
 Fragmentation de l’ADN naturel en fragments de taille accessible plus facilementmanipulables.
 Etablissement des cartes de restriction
 Clonage
 Mise en évidence de certaines mutations (PCR-digestion) .
I.3.3 Les enzymes de modification
I.3.3.1 Les nucléases
C’est des enzymes capables de couper l’ADN au niveau des liaisons phosphodiesters. Ondistingue :
 Les exonucléases : qui dégradent la séquence d’ADN en détachant les nucléotides à partir d’une
extrémité.Les plus utilisées :

 Exonucléase III
 Formation d’ADN simple brin à partir de ses extrémités.
 Délétions unidirectionnelles.
 Nucléase Bal 31
 Raccourcissement progressif d’un ADN double brin aux 2 extrémités.
 Cartographie des sites de restriction.
 Les endonucléases : coupent à l’intérieur de la séquence. Les plus utilisées :
 DNase I : élimination de l’ADN contaminant des extraits de protéines ou d’ARN.
Créationde cassure (pour le marquage).
 Nucléase S1 : élimination des extrémités simple brin d’ADN double brin.
 RNase A : élimination des ARN dans les préparations d’ADN et de protéines.
 RNase H : destruction des ARN après transcription reverse en vue de la synthèse du second brin de
l’ADN complémentaire.
I.3.3.2 Les ligases
Enzymes qui assurent la formation de liaisons phosphodiesters entre une extrémité 3’ OHlibre et une extrémité
5’phosphate.Ex : DNA ligase de E. coli, T4 DNA ligase, Taq DNA ligase et RNA ligase. Utilisées dans
leclonage des gènes.
I.3.4 Autres enzymes
 Phosphatase alcaline : élimine les groupements phosphate 5’ sur les ADN, ARN et les nucléotides libres.
 Les kinases : T4 polynucléotide kinase permettent de fixer un groupement phosphate àl’extrémité 5’
d’ADN en présence d’ATP, utilisation pour le marquage en 5’ despolynucléotides.
 Protéinase K : est une sérine protéase qui dégrade les protéines notamment les nucléases lors de
l’extraction d’ADN.
II. Les applications en diagnostic
II.1 Utilisation des enzymes comme marqueurs tissulaires
II.1.1 Marqueurs musculaires
 Créatine-kinase (CK)
 La CK catalyse la phosphorylation réversible de la créatine par l’ATP.
 Présente principalement dans le muscle squelettique, cerveau et le tissu cardiaque.
 Formée de 2 sous unités différentes (M et B) ; ce qui conduit à 3 isoenzymes :
CK-BB (CK1, <1% de la CK sérique totale) : cerveau.
CK-MB (CK2, 5% de la CK sérique totale) : cœur.
CK-MM (CK3, 95% de la CK sérique totale) : muscle squelettique et cœur.
Dosage : méthode cinétique en UV :
Créatine-phosphate + ADP ------------- > créatine + ATP (E= CK)
ATP + glucose ADP + glucose-6-phosphate pH=6,5 (E= HK)
Glucose-6-phosphate + NADP+ gluconate-6-phosphate + NADPH,H+ (E= G6PD)
On mesure l’apparition du NADPH,H+à 340nm.