PAL

Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Groupe E1
Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT
Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI
Enzymologie
Etude de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline
Les phosphatases alcalines sont des enzymes localisées dans les membranes des cellules situées dans
le foie, les os, l’intestin, le placenta, les reins et les globules blancs circulant dans le sang. 90 % des
phosphatases alcalines sont d’origine hépatique et osseuse. Elles sont aussi présentes dans le placenta
durant la grossesse. Une augmentation des phosphatases alcalines peut être liée à une maladie
osseuse, hépatique ou certains cancers. Leur dosage est prescrit en cas de suspicion de maladie du foie
ou des os. En temps normal, le taux de phosphatases alcalines, exprimé en unités internationales (UI)
par litre de sang, doit être compris entre 40 et 100 UI/L chez une femme adulte de moins de 50 ans et
entre 50 et 130 UI/L chez un homme.
Dans ce TP, nous avons réalisé une étude de cinétique de la phosphatase alcaline sur une durée de
deux jours soit six heures par jour. Nous avons alors opté pour un travail en deux parties : Une
première partie portant sur l’enzyme immobilisé, puis sur l’enzyme soluble. De plus nous avons testé
la cinétique de l’enzyme selon plusieurs paramètres physiologiques comme la température.
Il nous a fallu alors réaliser les protocoles correspondant aux multiples manipulations, et une liste du
matériel nous permettant de les réussir.
Quels sont les paramètres optimaux de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline ? Quels
facteurs peuvent réduire son activité ? Existe-il des limites à cette activitée ?

Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Groupe E1
Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT
Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI
Enzymologie
I- Etude sur l’enzyme soluble :
A) Cinétique de l’enzyme soluble :
L’objectif de cette manipulation est de déterminer la cinétique de l’enzyme soluble, c’est à dire sans
aucun facteur qui inhibe la réaction. La phosphatase alcaline ou PAL catalyse l’hydrolyse des
monoesters phosphoriques. Le substrat utilisé pour étudier les paramètres cinétiques de l’enzyme est
le para-nitrophényl phosphate disodique. Le paranitrophénol (PNP) formé au cours de la réaction
d’hydrolyse est jaune en milieu alcalin et absorbe fortement à 405 nm.
Nous avons utilisé deux lots différents de la même enzyme sur les deux jours de manipulation afin de
les comparer.
Protocole utilisé :
Tube
1
2
3
4
5
6
7
8
9
V PNPP [5mM](en mL)
0,025
0,05
0,125
0,25
0,375
0,5
0,625
0,75
1
V eau (en mL)
1,295
1,27
1,195
1,07
0,945
0,82
0,695
0,57
0,32
V TRIS (en mL)
1,15
Préincuber 5 minutes à 37°C
V PAL J2 (en mL)
30µL
Homogénéiser et incuber 2 min à 37°C
V NaOH (en mL)
1
Lire à 405 nm contre un blanc sans
PNPP
Résultats :
Suite à la lecture à 405 nm de nos 9 tubes dans un spectrophotomètre thermostaté à 37°C, nous avons
obtenu une mesure d’absorbance en densité optique pour 2 minutes pour chacun de ces tubes. Nous
avons divisé chaques mesures d’absorbance par le temps d’incubation, qui était de 2 minutes, afin
d’obtenir une mesure de l’absorbance par minute.

Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Groupe E1
Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT
Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI
Enzymologie
Enzyme soluble J1 sans inhibiteur
Enzyme soluble J2 sans inhibiteur
Tube
DO (405 nm)/2min
Tube
DO (405 nm) / 2min
1
0,229
1
0,174
2
0,313
2
0,329
3
0,5
3
0,461
4
0,636
4
0,722
5
0,7
5
0,824
6
0,774
6
0,836
7
0,79
7
0,961
8
0,835
8
1,041
9
0,862
9
1,028
Afin de pouvoir comparer l’activité enzymatique de chacunes de nos deux enzymes, il a fallu
convertir ces absorbances en concentration de produit (PNP) formé par millilitre d’enzyme. Pour cela,
nous suivons la loi de Beer Lambert qui établi un lien entre l’absorbance mesurée et la concentration
du produit à l’aide du coefficient d'extinction molaire du produit (εPNP= 18180 L.mol-1.cm-1)
A = ε.l.C soit C = A/ε.l avec l la largeur des cuves = 1cm
En appliquant cette formule, on obtient une concentration de substrat utilisé, équivalente à une
concentration de produit formé, exprimée en moles (ou micromoles) par minute et par litres de milieu
de lecture. On convertit cette concentration de produit en moles (ou micromoles) par minutes et par
millilitres de milieu de lecture utilisé. Ce milieu de lecture comprend le substrat, l’eau, le tampon
TRIS, le réactif d'arrêt et un volume de 30 µL d’enzyme. On peut donc dire que la concentration
obtenue est exprimée en moles (ou micromoles) par minute et pour le volume d’enzyme utilisé (ici
30µL). On rapporte cette concentration en micromoles par min et pour un millilitre d’enzyme afin de
pouvoir exprimer la concentration de produit formé en unité internationale par millilitre de
phosphatase alcaline.
Prenons l’exemple du tube numéro 1 mesuré lors du premier jour. Après lecture, on obtient
une absorbance de 0,229 DO/2min ⇔ 0,1145 DO/min
De plus, A = ε.l.C soit C = A/ε.l d’où C= 0,1145/18180.1 = 6,298129813.10-6 mol/min/L de ML
= 6,298129813 µmol/min/L de ML
On a un volume du milieu de lecture Vtotal = 3,5 mL dont Venzyme = 0,03 mL
soit C=6,298129813 µmol/min/L de ML ⇔ C=6,298129813 µmol/min/0,03 mL d’enzyme
On ramène cette concentration par millilitre d’enzyme,
soit C= (C. Vtotal)/Venzyme ⇔ C= (6,298129813. 0,0035)/0,03 = 0,734 µmol/min/mL d’enzyme
Donc C = 0,734 UI/mL d’enzyme

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Enzymologie
Enzyme soluble J1
sans inhibiteur
Enzyme soluble J2
sans inhibiteur
Tube
Produit formé
(µmol/min/L de ML)
Produit formé
(UI/mL d'E)
Tube
Produit formé
(µmol/min/L de ML)
Produit formé
(UI/mL d'E)
1
6,298129813
0,73478181
1
4,785478548
0,558305831
2
8,608360836
1,00430876
2
9,04840484
1,055647231
3
13,75137514
1,6043271
3
12,67876788
1,479189586
4
17,49174917
2,04070407
4
19,8569857
2,316648331
5
19,25192519
2,24605794
5
22,66226623
2,64393106
6
21,28712871
2,48349835
6
22,99229923
2,68243491
7
21,72717272
2,53483682
7
26,43014301
3,083516685
8
22,96479648
2,67922626
8
28,63036304
3,340209021
9
23,70737074
2,76585992
9
28,27282728
3,298496516
A partir de ces résultats, nous avons pu calculer l’activité enzymatique de chaque lots d’enzyme afin
d’en comparer les capacités enzymatiques. Pour cela, il nous a fallu calculer la concentration en
substrats après dilution dans chaque tube.
Afin de calculer la concentration en substrats de chaque tube, nous avons pris en compte la
concentration mère du PNPP qui est de 5mM, le volume final de chaque tube et le volume de substrat
placé par tube. Soit [S ]fille= ( [S]mère . Vmère)/Vfille
Prenons pour exemple le tube numéro 9. Ce tube a un volume total de 3,5 mL dont 1 mL de
PNPP de concentration mère égale à 5 mmol/L.
d’où [PNPP]tube 9 = (5 . 1)/3,5 = 10/7 ≈ 1,429 mmol/L
Nous obtenons alors le graphique suivant :
Cette représentation graphique nous permet de comparer la formation de produit entre la phosphatase
alcalin soluble utilisée lors du premier jour de TP et celle utilisée lors du second. Les deux enzymes
réagissent de la même façon aux différentes concentrations de substrat puisqu’on observe une
augmentation constante de la production de PNP lié à l'augmentation de la concentration en PNPP.

Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Groupe E1
Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT
Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI
Enzymologie
Nous pouvons en déduire, et ce quelque soit la concentration en substrat, que l’enzyme utilisée le
deuxième jour (J2) à une activité enzymatique plus importante puisqu’elle est capable de former une
plus grande quantité de produit.
B) Etude de l’enzyme soluble à différentes température :
L’objectif de cette manipulation est de déterminer la température pour laquelle la phosphatase alcaline
a la plus forte activité enzymatique.
Pour cette étude nous allons tester la PAL à 4 températures différentes : 20°C ; 45°C ; 50°C ; 60°C.
Protocole utilisé :
V PNPP [5mM](en mL)
1
V eau (en mL)
0,32
V TRIS (en mL)
1,15
Pré-incuber 5 minutes à la température étudiée
V PAL J2 (en mL)
30µL
Homogénéiser et incuber 5 min à la température étudiée
V NaOH (en mL)
1
Lire à 405 nm contre un blanc réactif
Résultats
Température
Absorbance (405 nm)
20°C
0,373
45°C
0,445
50°C
0,448
60°C
0,522
Nous avons ensuite pus déterminer l’activité enzymatique de la PAL pour chacune des températures
d’incubation
Interprétation des résultats