Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 Etude de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline Les phosphatases alcalines sont des enzymes localisées dans les membranes des cellules situées dans le foie, les os, l’intestin, le placenta, les reins et les globules blancs circulant dans le sang. 90 % des phosphatases alcalines sont d’origine hépatique et osseuse. Elles sont aussi présentes dans le placenta durant la grossesse. Une augmentation des phosphatases alcalines peut être liée à une maladie osseuse, hépatique ou certains cancers. Leur dosage est prescrit en cas de suspicion de maladie du foie ou des os. En temps normal, le taux de phosphatases alcalines, exprimé en unités internationales (UI) par litre de sang, doit être compris entre 40 et 100 UI/L chez une femme adulte de moins de 50 ans et entre 50 et 130 UI/L chez un homme. Dans ce TP, nous avons réalisé une étude de cinétique de la phosphatase alcaline sur une durée de deux jours soit six heures par jour. Nous avons alors opté pour un travail en deux parties : Une première partie portant sur l’enzyme immobilisé, puis sur l’enzyme soluble. De plus nous avons testé la cinétique de l’enzyme selon plusieurs paramètres physiologiques comme la température. Il nous a fallu alors réaliser les protocoles correspondant aux multiples manipulations, et une liste du matériel nous permettant de les réussir. Quels sont les paramètres optimaux de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline ? Quels facteurs peuvent réduire son activité ? Existe-il des limites à cette activitée ? Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 I- Etude sur l’enzyme soluble : A) Cinétique de l’enzyme soluble : L’objectif de cette manipulation est de déterminer la cinétique de l’enzyme soluble, c’est à dire sans aucun facteur qui inhibe la réaction. La phosphatase alcaline ou PAL catalyse l’hydrolyse des monoesters phosphoriques. Le substrat utilisé pour étudier les paramètres cinétiques de l’enzyme est le para-nitrophényl phosphate disodique. Le paranitrophénol (PNP) formé au cours de la réaction d’hydrolyse est jaune en milieu alcalin et absorbe fortement à 405 nm. Nous avons utilisé deux lots différents de la même enzyme sur les deux jours de manipulation afin de les comparer. Protocole utilisé : Tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9 V PNPP [5mM](en mL) 0,025 0,05 0,125 0,25 0,375 0,5 0,625 0,75 1 V eau (en mL) 1,295 1,27 1,195 1,07 0,945 0,82 0,695 0,57 0,32 V TRIS (en mL) 1,15 Préincuber 5 minutes à 37°C V PAL J2 (en mL) 30µL Homogénéiser et incuber 2 min à 37°C V NaOH (en mL) 1 Lire à 405 nm contre un blanc sans PNPP Résultats : Suite à la lecture à 405 nm de nos 9 tubes dans un spectrophotomètre thermostaté à 37°C, nous avons obtenu une mesure d’absorbance en densité optique pour 2 minutes pour chacun de ces tubes. Nous avons divisé chaques mesures d’absorbance par le temps d’incubation, qui était de 2 minutes, afin d’obtenir une mesure de l’absorbance par minute. Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 Enzyme soluble J1 sans inhibiteur Enzyme soluble J2 sans inhibiteur Tube DO (405 nm)/2min Tube DO (405 nm) / 2min 1 0,229 1 0,174 2 0,313 2 0,329 3 0,5 3 0,461 4 0,636 4 0,722 5 0,7 5 0,824 6 0,774 6 0,836 7 0,79 7 0,961 8 0,835 8 1,041 9 0,862 9 1,028 Afin de pouvoir comparer l’activité enzymatique de chacunes de nos deux enzymes, il a fallu convertir ces absorbances en concentration de produit (PNP) formé par millilitre d’enzyme. Pour cela, nous suivons la loi de Beer Lambert qui établi un lien entre l’absorbance mesurée et la concentration du produit à l’aide du coefficient d'extinction molaire du produit (εPNP= 18180 L.mol-1.cm-1) A = ε.l.C soit C = A/ε.l avec l la largeur des cuves = 1cm En appliquant cette formule, on obtient une concentration de substrat utilisé, équivalente à une concentration de produit formé, exprimée en moles (ou micromoles) par minute et par litres de milieu de lecture. On convertit cette concentration de produit en moles (ou micromoles) par minutes et par millilitres de milieu de lecture utilisé. Ce milieu de lecture comprend le substrat, l’eau, le tampon TRIS, le réactif d'arrêt et un volume de 30 µL d’enzyme. On peut donc dire que la concentration obtenue est exprimée en moles (ou micromoles) par minute et pour le volume d’enzyme utilisé (ici 30µL). On rapporte cette concentration en micromoles par min et pour un millilitre d’enzyme afin de pouvoir exprimer la concentration de produit formé en unité internationale par millilitre de phosphatase alcaline. Prenons l’exemple du tube numéro 1 mesuré lors du premier jour. Après lecture, on obtient une absorbance de 0,229 DO/2min ⇔ 0,1145 DO/min De plus, A = ε.l.C soit C = A/ε.l d’où C= 0,1145/18180.1 = 6,298129813.10-6 mol/min/L de ML = 6,298129813 µmol/min/L de ML On a un volume du milieu de lecture Vtotal = 3,5 mL dont Venzyme = 0,03 mL soit C=6,298129813 µmol/min/L de ML ⇔ C=6,298129813 µmol/min/0,03 mL d’enzyme On ramène cette concentration par millilitre d’enzyme, soit C= (C. Vtotal)/Venzyme ⇔ C= (6,298129813. 0,0035)/0,03 = 0,734 µmol/min/mL d’enzyme Donc C = 0,734 UI/mL d’enzyme Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 Enzyme soluble J1 sans inhibiteur Enzyme soluble J2 sans inhibiteur Produit formé (µmol/min/L de ML) Produit formé (UI/mL d'E) Tube 1 6,298129813 0,73478181 1 4,785478548 0,558305831 2 8,608360836 1,00430876 2 9,04840484 1,055647231 3 13,75137514 1,6043271 3 12,67876788 1,479189586 4 17,49174917 2,04070407 4 19,8569857 2,316648331 5 19,25192519 2,24605794 5 22,66226623 2,64393106 6 21,28712871 2,48349835 6 22,99229923 2,68243491 7 21,72717272 2,53483682 7 26,43014301 3,083516685 8 22,96479648 2,67922626 8 28,63036304 3,340209021 9 23,70737074 2,76585992 9 28,27282728 3,298496516 Tube Produit formé (µmol/min/L de ML) Produit formé (UI/mL d'E) A partir de ces résultats, nous avons pu calculer l’activité enzymatique de chaque lots d’enzyme afin d’en comparer les capacités enzymatiques. Pour cela, il nous a fallu calculer la concentration en substrats après dilution dans chaque tube. Afin de calculer la concentration en substrats de chaque tube, nous avons pris en compte la concentration mère du PNPP qui est de 5mM, le volume final de chaque tube et le volume de substrat placé par tube. Soit [S ]fille= ( [S]mère . Vmère)/Vfille Prenons pour exemple le tube numéro 9. Ce tube a un volume total de 3,5 mL dont 1 mL de PNPP de concentration mère égale à 5 mmol/L. d’où [PNPP]tube 9 = (5 . 1)/3,5 = 10/7 ≈ 1,429 mmol/L Nous obtenons alors le graphique suivant : Cette représentation graphique nous permet de comparer la formation de produit entre la phosphatase alcalin soluble utilisée lors du premier jour de TP et celle utilisée lors du second. Les deux enzymes réagissent de la même façon aux différentes concentrations de substrat puisqu’on observe une augmentation constante de la production de PNP lié à l'augmentation de la concentration en PNPP. Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 Nous pouvons en déduire, et ce quelque soit la concentration en substrat, que l’enzyme utilisée le deuxième jour (J2) à une activité enzymatique plus importante puisqu’elle est capable de former une plus grande quantité de produit. B) Etude de l’enzyme soluble à différentes température : L’objectif de cette manipulation est de déterminer la température pour laquelle la phosphatase alcaline a la plus forte activité enzymatique. Pour cette étude nous allons tester la PAL à 4 températures différentes : 20°C ; 45°C ; 50°C ; 60°C. Protocole utilisé : V PNPP [5mM](en mL) V eau (en mL) V TRIS (en mL) Pré-incuber 5 minutes à la température étudiée V PAL J2 (en mL) Homogénéiser et incuber 5 min à la température étudiée V NaOH (en mL) Lire à 405 nm contre un blanc réactif 1 0,32 1,15 30µL 1 Résultats Température 20°C 45°C 50°C 60°C Absorbance (405 nm) 0,373 0,445 0,448 0,522 Nous avons ensuite pus déterminer l’activité enzymatique de la PAL pour chacune des températures d’incubation Interprétation des résultats Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 Nous observons que la phosphatase alcaline a une plus forte activité enzymatique à 60 °C : 0,497 UI/mL d’enzyme. En effet à 45 et 50°C la PAL a 14% d’activité en moins qu’à 60°C tandis qu’elle perds 29% d’activité lors de son utilisation à 20°C. La température est donc un paramètre important à prendre en compte lors de l’utilisation de la phosphatase alcaline. C) Cinétique de l’enzyme avec inhibiteurs Cette étude porte sur l’action d’inhibiteurs compétitif et non compétitif sur la phosphatase alcaline. L’étude sera réalisée à 37°C sur de la PAL soluble donnée au J2. On réalisera 9 tubes de concentrations différentes en substrats contenant du phosphate et 9 tubes de concentrations différentes en substrats contenant de la phénylalanine. Pour le protocole utilisé, celui-ci est identique à l’étude de la cinétique de l’enzyme soluble mise à part l’ajout de 0,25 mL d'inhibiteur dans chacun des tubes. Suite à la lecture de chaque tube à 405 nm dans un spectrophotomètre thermostaté à 37°C, on obtient les résultats suivants : Inhibiteur compétitif (phosphate) Inhibiteur non compétitif (phénylalanine) Tube DO (405 nm) / 2min Tube DO (405 nm)/ 2min 1 0,001 1 0,141 2 0,014 2 0,167 3 0,029 3 0,227 4 0,083 4 0,275 5 0,113 5 0,276 6 0,144 6 0,303 7 0,17 7 0,344 8 0,194 8 0,354 9 0,251 9 0,38 Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 D’après les résultats obtenus ci-dessus, nous avons pu calculer l’activité enzymatique par minute et par millilitre d’enzyme utilisé. Pour cela, il nous a fallu convertir la formule de l’absorbance A = ε.l.C en C = A/ε.l avec l la largeur de cuve d’1cm. En appliquant cette formule, on obtient une concentration de substrat utilisé, équivalente à une concentration de produit formé, exprimée en moles (ou micromoles) par minute et par litres de milieu de lecture. On obtient ainsi nos valeurs de vitesse initial Vi. Les résultats obtenus nous ont permis de faire un graphique de comparaison de l’activité enzymatique en fonction de la concentration en substrat. L’étude comparative porte donc sur les deux types d’inhibiteurs (compétitif et non compétitif) et l’enzyme soluble sans inhibiteurs. L’objectif étant d’observer l’effet des différents inhibiteurs sur l’activité enzymatique. Sur le graphique ci-dessus, on représente la vitesse initiale de formation du produit en fonction de la concentration en substrat présente dans le tube. A l’aide de ces courbes, on peut donner une approximation de la vitesse maximale de formation du produit (Vmax), de la Vmax/2 et donc du Km. Or ici, nos courbes ne présentent pas de plateaux ce qui ne nous permet pas d’obtenir des valeurs de Vmax et Km fiables. On décide donc de représenter cette cinétique à l’aide de la représentation de Lineweaver et Burk. Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 La représentation ci-dessus nous permet d’établir la Vmax et le Km de chaque lot d’enzyme. De plus, cette dernière permet de linéariser les valeurs de vitesse et de concentrations en substrats. Pour linéariser nos valeurs, il suffit de faire le rapport 1/[S] en abscisse et 1/Vi en ordonnée.On ne retiendra que les trois premières valeurs qui sont les plus justes pour cette méthode. On obtient le graphe ci-dessus avec pour chaque droite, son équation. La méthode de Lineweaver et Burk permet d’établir le lien suivant : =( * )+ On remplace dans nos équations de la forme y=ax+b, d’une part b = ⇔ Vmax = 1/b, et d’autre part a = ⇔ Km = Vmax * a. Prenons l’exemple de l’enzyme sans ajout d’inhibiteur. Après avoir obtenu l’équation de la droite y= 0,0061x+0,0359, on remplace a et b. Soit = 0,0359 ⇔ Vmax = 1/0,0359= 27,8551µmol/min/L de ML = 0,0061 ⇔ Km= Vmax*0,0061=27,8551*0,0061= 0,1699161 On obtient donc les valeurs de Vmax et Km de l’enzyme soluble sans inhibiteur. On applique la même méthode pour l’enzyme en présence d’inhibiteurs et on obtient la représentation graphique cidessous. Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 On constate que la vitesse maximale de formation du produit est la plus élevée (27,86 µmol/min/L de ML) pour l’enzyme soluble sans inhibiteur. Les Vmax des enzymes en présences d'inhibiteurs sont inférieures à la Vmax de l’enzyme sans inhibiteur. Cela signifie que les inhibiteurs diminue la vitesse de formation des complexes enzyme-substrat, entraînant ainsi une diminution de la production de PNP. On remarque que le phosphate diminue plus de dix fois la Vmax de l’enzyme tandis que la phénylalanine diminue d’environ quatre fois cette Vmax. Cela signifie que le phosphate a un pouvoir inhibiteur supérieur au pouvoir inhibiteur de la phénylalanine. On comparera ces pouvoirs d’inhibition à l’aide de rendement d’inhibition. De plus, on sait que le Km est en lien direct avec l’affinité de l’enzyme pour son substrat. Plus le Km est faible, plus l’affinité est élevée. Ici, le Km de l’enzyme soluble sans inhibiteur est d’environ 0,170. Le Km de l’enzyme en présence de phosphate est d’environ 0,417. Ce Km est donc supérieur à celui de l’enzyme seule. Cela signifie que la présence du phosphate a affaibli l’affinité de l’enzyme pour son substrat. Le phosphate est donc un inhibiteur compétitif puisqu’il entre en compétition avec le PNPP. Enfin, le Km de la phénylalanine est d’environ 0,034, ce qui est inférieur au Km de l’enzyme seule. Cela signifie que la phénylalanine n'affaiblit pas l’affinité de l’enzyme pour son substrat et de ce fait, la phénylalanine est un inhibiteur non compétitif. Enfin, nous comparer l’action inhibitrice du phosphate et de la phénylalanine et établit un rendement d'inhibition. Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 Pour réaliser ce diagramme, nous avons fait le rapport de la formation de PNP par l’enzyme en présence d’inhibiteur sur celle par l’enzyme sans inhibiteur, le tout soustrait à 1. On obtient ainsi l’activité inhibitrice du phosphate et de la phénylalanine en fonction de la concentration en substrat. On constate que quelque soit la concentration en PNPP, le phosphate inhibe en moyenne plus de 86% de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline, tandis que la phénylalanine inhibe en moyenne 47% de cette activité. On peut donc en conclure que le phosphate a un très fort pouvoir inhibant sur la phosphatase alcaline puisqu’il entre en compétition avec le substrat. De plus, la phénylalanine est un inhibiteur non compétitif et inhibe l’activité de la phosphatase alcaline en moindre intensité. D) Conservation de l’enzyme soluble Cette étude porte sur la conservation de phosphatase alcaline dans différentes conditions. Elle cherche à montrer quel mode de conservation permet de préserver au mieux l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline. On a choisi de conserver l’enzyme soluble environ 15h à température ambiante (20°C), au réfrigérateur (4°C) ou au congélateur (-18°C). On prépare alors 9 tubes avec l’enzyme conservée à température ambiante, 9 tubes avec celle conservée au réfrigérateur et 9 tubes avec celle conservée au congélateur. Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 Tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,5 0,625 0,75 1 V PNPP [5mM](en mL) 0,025 0,05 0,125 0,25 0,375 V eau (en mL) 1,295 1,27 1,195 1,07 0,945 0,82 0,695 0,57 0,32 V TRIS (en mL) 1,15 Pré-incuber 5 minutes à 37°C 30µL V PAL J1 (en mL) Homogénéiser et incuber 2 min à 37°C V NaOH (en mL) 1 Lire à 405 nm contre un blanc sans PNPP On obtient les résultats d’absorbance ci-dessous : Enzyme soluble conservée au réfrigérateur (4°C) Tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Enzyme soluble conservée à température ambiante (20°C) DO/2min (405 nm) 0,101 0,126 0,211 0,251 0,274 0,279 0,26 0,314 0,322 Tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Enzyme soluble conservée au congélateur (-18°C) DO /2min (405 nm) 0,066 0,108 0,166 0,188 0,219 0,238 0,243 0,272 0,298 Tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9 DO /2min (405 nm) 0,125 0,173 0,272 0,304 0,484 0,426 0,413 0,379 0,506 Pour traiter les mesures d’absorbances obtenues : - Utiliser une densité optique par minute Convertir cette DO en concentration à l’aide de la loi de Beer Lambert (A=ε.l.C) et du coefficient d’extinction molaire du PNPP (ε= 181,8*105 cm2.mol-1 = 18180 L.mol-1.cm-1). On obtient alors la quantité de substrat consommé en micromoles par minute et par litre de milieu de lecture, ce qui équivaut à la quantité de produit (PNP) formé. Le milieu de lecture comporte l’enzyme, mais aussi le substrat et les différents tampons. Ici, notre volume du milieu de lecture est de 3,5 mL dans lequel est compris 30µL de phosphatase alcaline. On obtient donc une quantité de produit formé en micromoles par minutes et pour 30µL d’enzyme. - Convertir pour obtenir une quantité de produit formé par minute et par millilitre d’enzyme, ce qui équivaut à l’unité internationale par millilitre d’enzyme (UI/mL). Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 On effectue une comparaison de la formation de produit, et donc de l’activité enzymatique, entre l’enzyme soluble après sa préparation et après conservation. Pour cela, on effectue le rapport de la quantité de produit formé en UI/mL par l’enzyme après 15h de conservation sur la quantité de produit formé en UI/mL par l’enzyme lors du premier jour. On obtient alors un rendement de conservation en pourcentage de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline. On peut donc en déduire la perte d’activité enzymatique. La représentation ci dessous permet de comparer l’efficacité de la conservation de l’enzyme. On assimile l’activité enzymatique du premier jour comme 100%. On observe, quelque soit la concentration en substrat du tube, une activité enzymatique de la phosphatase alcaline conservée au congélateur supérieur à celles de l’enzyme conservée au réfrigérateur ou à température ambiante. De plus, l’enzyme soluble placée au congélateur conserve presque 55% de son activité enzymatique tandis que l’enzyme conservée à 4°C ne garde qu’environ 39% de son activité et que celle conservée à température voit sa capacité enzymatique chuter à moins de 32%. On peut donc en déduire que la conservation de l’enzyme, et quelques soient les conditions, altère l’activité enzymatique et donc la formation du complexe enzyme-substrat indispensable à la fabrication du produit. Cependant, nous avons remarqué qu’une conservation d’environ 15h dans un congélateur à -18°C n'entraîne qu’une perte d’activité moindre de 45%. Si l’on est amené à conserver la phosphatase alcaline en solution sur une courte durée, notamment afin de réduire le coût de la manipulation, nous pouvons la placer au congélateur. Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 II- Étude sur l’enzyme immobilisé : Pour compenser les problèmes liés à l’instabilité des enzymes au cours d’extraction ou d’utilisation, il est nécessaire de les immobiliser artificiellement. Ainsi immobilisées, sur des supports solubles ou insolubles, ces catalyseurs offrent la possibilité d'une utilisation répétée dans des domaines très variés. Un des buts majeurs de l'immobilisation enzymatique, particulièrement pour des applications analytiques, est un accroissement de la durée de vie de l'enzyme. Cependant l’activité enzymatique d’une enzyme immobilisée a tendance à diminuer après immobilisation du fait de possibles gênes stériques et de limitations dans l’accessibilité au site actif. Création des billes Billes à 2% d’alginate Billes à 1.5% d’alginate 100µL d’enzyme 1mL d’enzyme 1.5mL d’enzyme 2.9mL d’alginate 2mL d’alginate 1.5 mL d’alginate Billes à 3% d’alginate Pour chaque mélange : ● pipeter et laisser tomber le mélange d’une hauteur de 20 cm dans une solution de CaCl ● Laisser reposer les billes 30min dans la solution ● Rincer les billes Billes à 2% d’alginate Billes à 1.5% d’alginate 170 billes 200 billes Billes à 3% d’alginate 122 billes 1) Cinétique de l’enzyme en billes à 1,5%, 2% et 3% d’alginate à 37° L’étude porte sur l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline lorsqu’elle est incluse dans des billes d’alginate. On testera l’enzyme dans trois concentrations de billes : 1,5% ; 2% et 3% d’alginate. On choisira d’effectuer ce test à température physiologique (37°C). Réactifs : - Billes précédemment préparées - PNPP (substrat) - NaOH (réactif d’arrêt) Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 Protocole utilisé : Dans un tube à essai, introduire : Billes 1/15 des billes 1,5% soit 13 billes 1/15 des billes 2% soit 11 billes 1/15 des billes 3% soit 8 billes 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2mL 2mL PNPP préincubé 5 min à 37°C Temps d’incubation exact à 37°C 30ses/1min/2min/3min/5min/7min/10min Réaspirer la totalité de la phase liquide dans le tube NaOH (réactif d’arrêt) 2mL Lire la DO à 405 nm contre un blanc réactif sans PNPP On réalisera 7 tubes par types de billes, ces derniers correspondant chacun à un temps d’incubation défini. Résultats Tube Temps (en min) DO à 405 nm à 1,5% d’alginate DO à 405 nm à 2% d’alginate DO à 405 nm à 3% d’alginate 1 0,5 0,012 0,00 0,005 2 1 0,050 0,00 0,001 3 2 0,114 0,00 0,005 4 3 0,215 0,020 0,015 5 5 0,449 0,391 0,034 6 7 0,702 0,566 0,057 7 10 0,710 0,796 0,170 Graphique des résultats : Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 Concernant les résultats, on peut observer que la cinétique de l’enzyme diffère selon la concentration en alginate des billes qui l’immobilise. On remarque que plus la concentration en alginate est forte, moins la cinétique de l’enzyme est importante. On peut avec ce graphique déduire que les billes d’alginates de forte concentrations empêche la réaction de se produire. Nous allons alors exploiter ses résultats en déterminant l’activité enzymatique pour chaque concentration en alginate. Les densités optiques trouvés au dessus sont exprimés en DO/ temps d’incubation en minute. Nous avons donc ramené ces résultats en DO/minute. Ensuite il nous a fallu divisé par le coefficient d'extinction molaire qui était de 18180 L/mol/cm afin de ramener les résultats à des µmol/min/L de milieu de lecture. Nous les avons converti pour le milieu de lecture total utilisé lors du protocole, ce qui nous a donné des UI/ bille, il fallait ensuite les ramener en U/ toute les billes. Les résultats obtenus sont donc ci-dessous : Activité enzymatique pour chaque concentration en alginate : D’après cette histogramme, on peut remarquer pour les billes d’alginate à 3 % que l’activité enzymatique de celle-ci reste très faible comparé aux deux autres. En effet, pour un temps d’incubation de 10 minutes, nous obtenons une valeur maximal de 5x10-4 U/ bille, soit une Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 équivalence approximative à 15% près, de la valeur minimale obtenue ( au bout de 30 secondes ) pour une bille à 1,5 %. On peut alors dire que les billes à 3 % sont peu approprié pour cette étude du fait de leurs parois trop épaisse. Concernant les billes à 2 %, nous avons obtenu un résultat qu’à partir de trois minutes d’incubation : cela peut avoir plusieurs significations. Soit la paroi de la billes étant trop épaisse, celle-ci n’a cédé qu’à partir de trois minutes d’activation. Nous pouvons également émettre l’hypothèse d’une erreur de manipulation en vue des résultats obtenus avec 3 % de l’alginate avec les mêmes temps d’incubations. En revanche, à partir de cinq minutes d’incubation l’activité enzymatique subi une hausse importante de 1073,3% par rapport à trois minutes d’incubation et atteint un maximum à sept minutes d’incubation de 1,8 x 10-3 UI/bille. On peut également observer un léger déclin d’environ 1,6 % à 10 minutes d’incubation. Concernant les billes à 1,5 % d’alginate, nous pouvons remarquer que l’activité enzymatique est croissante en fonction du temps d’incubation. Si nous comparons l’activité enzymatique pour un temps d’incubation de 30 secondes et celui obtenu à la valeur maximale c’est-à-dire pour un temps d'incubations de sept minutes, cette croissance représente un total de 315,2 % d’augmentation. D’autre part, bien que celle-ci atteint un maximum à sept minutes d’incubation de 1,9.10-3 UI/ bille, elle décline d’environ 42,2% à 10 minutes d’incubation. À partir de cette étude, nous pouvons donc en déduire que les billes les plus appropriés sont celles avec le pourcentage d’alginate le moins important soit 1,5 %, c’est également les billes dont la paroi est la moins épaisse. Concernant le temps d’incubation optimal, nous pouvons remarquer qu’il est de sept minutes, ainsi l’activité enzymatique décline si celui-ci est dépassé. Activité enzymatique pour chaque concentration en alginate pour 5 minutes d’incubation : - Pour 1,5% d’alginate : 0,34 U/ 200 billes d’alginates Soit 0,0017 U/ bille - Pour 2% d’alginate : 0,30 U/ 170 billes d’alginates Soit 0,0017 U/ bille - Pour 3% d’alginate : 0,030 U/122 billes d’alginates Soit 0,00025 U/ bille On a mit 4,5 ml d’enzyme dans chaque lot de bille, cela revient à dire qu’on obtient : Pour 1,5% d’alginate Pour 2% d’alginate Pour 3% d’alginate 0,076 UI/ml d’enzyme 0,076 UI/ml d’enzyme 5.10^-5 UI/ml d’enzyme On peut remarquer avec ces résultats que les billes avec une concentration en alginate de 3% sont peu efficace . En revanche, les billes à 1,5% et à 2% sont très efficaces. Par rapport à l’activité enzymatique des billes à 3% d’alginate, on a une augmentation de 580% pour les billes à 1,5% et 2% d’alginate. On peut alors comparé avec les résultats obtenue sur l’enzyme soluble avec la concentration en alginate la plus approprié : Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 Ainsi, sur l’étude de l’enzyme soluble, pour un volume de substrats de 1 ml , on obtient une activité enzymatique de 2,77 UI/ml d’enzyme. En comparant avec les résultats obtenue sur l’enzyme immobilisé dans des billes à 1,5 et 2% d’alginate soit 0,076 UI/ml d’enzyme, on peut observer une diminution de 3544,7%. On peut donc dire que les billes diminue grandement l’efficacité enzymatique. Autrement dit, l’activité de l’enzyme est environ 3500 fois efficace seul que immobilisé. 2) Etude de l’enzyme en bille à différente températures : L’étude porte sur l’activité de la PAL lorsqu’elle est emprisonnée dans des billes d’alginates et qu’elle est soumise à différentes températures. Nous allons observer à quelle température, l’activité enzymatique est la plus importante avec des billes à 2% et 3% d’alginate. Le protocole utilisé est le même que celui utilisé précédemment en changeant la température d’incubation et le temps d’incubation qu’on a fixé à 5 minutes pour une question de reproductibilité. Pour une concentration d’alginate de 2%, nous avons pris 11 billes par température testée. Pour une concentration d’alginate de 3%, nous ne disposions seulement que d’une bille par température testée. Résultats : Les résultats d’absorbances pour les 2 concentrations de billes sont les suivants : Températures d’incubation Absorbance avec billes à 2% 11 billes par test Absorbance avec billes à 3% 1 bille par test 20°C 0,103 0,008 45°C 0,282 0,019 50°C 0,328 0,028 60°C 0,314 0,030 Nous allons maintenant déterminer à partir de ces résultats l’activité enzymatique ( pour une bille ) afin de voir quelles température est optimale aux différentes concentrations d’alginate dans les billes. Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 Interprétation des résultats Avec cette expérience nous pouvons voir que la phosphatase alcaline immobilisée est peu efficace à 20°C pour chaque concentration. Dans l'expérience précédente, à 37°C , nous avons pu voir que la PAL immobilisée dans les billes à 2% d’alginate ont une activité enzymatique de 1,7x10-3 UI/Bille. La température optimale pour la PAL immobilisée dans les billes à 2% d’alginate est donc 37°C. A 20°C l’enzyme a une activité de 2.67 x10-4 UI/Bille soit une diminution de 85% de son activité en comparaison avec son utilisation à la température optimale. Lors de l’utilisation des billes à 2% d’alginate à 60°C, nous observons une diminution de 52% de son activité. Dans l’expérience précédente nous avons pus voir que la PAL immobilisée dans les billes à 3% d’alginate ont une activité enzymatique de 2,5x10-4 UI/Bille à 37°C. La température optimale pour la PAL immobilisée dans les billes à 3% d’alginate est donc à 45 °C avec une activité enzymatique de 5,43 x10-4 UI/Bille . A 20°C, la PAL immobilisée dans les billes à 3% d’alginate voit son activité diminuée de 80% par rapport à son activité lors de l’utilisation à 45°C. L’activité de la PAL immobilisé dans les billes à 3% d’alginate diminue de 14% lors de l’utilisation à 60°C. La PAL immobilisée dans les billes à 3% d’alginate a une température optimale supérieur que la PAL immobilisée dans les billes à 2% d’alginate. L’alginate présente dans les billes assure de manière purement physique la rétention de l’enzyme tout en permettant la diffusion du substrat jusqu’au site actif de l’enzyme grâce à une perméabilité du gel suffisante. La température nécessaire afin de permettre la perméabilité du gel est supérieur pour les billes ayant une plus forte concentration en alginate. Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 3) Etude des cycle des billes à 3% et 2% L’immobilisation de la phosphatase alcaline permet la réutilisation de l’enzyme. L’objectif de cette manipulation est donc de déterminer les pertes d’activité enzymatique lors d’utilisations répété de l’enzyme immobilisé dans les billes d’alginate. Matériels et Méthodes. Pour chaque concentration de billes placer 1/15ème des billes total et : ● Ajouter 2,5 mL de substrat préchauffé ( PNPP ) ● Incuber pendant 5 minutes à 37°C. ● Transvaser uniquement la phase liquide dans un tube contenant 2mL de NaOH ● Lire au spectromètre à 405 nm contre un blanc réactif. L’absorbance sera celle du 1er cycle Recommencer cette opération jusqu’à obtenir moins 50% de l’activité du 1er cycle. Préparation du blanc réactif: 2 mL de NaOH avec 2,5 mL de substrat. Résultats Résultats cycles billes à 2% d’alginate Par manque de temps nous avons arrêté la manipulation au 20ème cycle avant d'obtenir 50% de l’effet induit lors du 1er cycle. Nous avons ensuite pu à l’aide de ces résultats calculer l’activité enzymatique de la PAL immobilisée dans les billes à 2% d’alginate lors des différents cycles. Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 L’activité de la phosphatase alcaline immobilisée dans les bille à 2% d’alginate lors du premier cycle est de 1,1 X 10-3 UI/bille. Lors du 9ème cycle l’activité enzymatique est à son maximum avec une activité de 5,46 X 10-3 UI/bille soit une augmentation de 496% par rapport au 1er cycle. Lors du 20ème cycle l’activité enzymatique est de 2,98 X 10-3 UI/bille donc toujours 170% d’activité de plus que lors du premier cycle. Résultats cycles billes à 2% d’alginate Nous avons aussi arrêté la manipulation avant d'obtenir 50% de l’effet induit lors du 1er cycle. Nous avons ensuite déterminer l’activité enzymatique par billes lors des différents cycles. Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 L’activité de la phosphatase alcaline immobilisée dans les bille à 3% d’alginate lors du premier cycle est de 5,25 X 10-4 UI/bille. Lors du 12ème cycle l’activité enzymatique est à son maximum avec une activité de 1,33 X 10-3 UI/bille soit une augmentation de 253% par rapport au 1er cycle. Lors du 16ème cycle l’activité enzymatique est de 0,91 X 10-3 donc toujours 73% d’activité de plus que lors du premier cycle. Dans les deux cas d’immobilisation ( billes à 2% d’alginate / billes à 3% d’alginate ) la phosphatase alcaline à son activité au maximum au bout d’une dizaine de cycle ( 9ème lors de l’immobilisation à 2% d’alginate , 12ème lors de l’immobilisation à 3%). Après 15 cycles l’activité de la PAL est encore nettement supérieur que lors du premier cycle. La durée de vie des enzymes immobilisé est donc importante. La réutilisation des enzymes immobilisé est donc possible un grand nombre de fois. Malheureusement par manque de temps nous n’avons pas pus réalisé l'expérience comme souhaité, en arrêtant les cycles uniquement après avoir obtenue moins de 50% de l’activité du 1er cycle. Nous aurions pus déterminer combien de fois les enzymes immobilisé sont réutilisable. 4) Etude de l’activité de l’enzyme immobilisée après conservation L’objectif de cette étude vise à déterminer la température idéale afin de conserver l’enzymes immobilisée en billes d’alginates afin de pouvoir la réutiliser. Afin de déterminer cette température nous allons comparer l’activité de l’enzyme immobilisée en billes à 2% d’alginate, sur plusieurs cycles, puis comparer cette activité avec l’activité de l’enzyme avant conservation. La conservation sera réalisée sur une période d’une nuit à 3 température différente : 20°C, 4°C (Frigo ) et -18°C (Congélateur). Résultats Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 Les enzymes immobilisés dans les billes d’alginate à 2% conservées à -18°C n’avaient plus d’activité enzymatique. Nous avons pu observer que les billes étaient très endommagées. Après conservation à 4°C l’activité enzymatique moyenne (sur 20 cycles ) est de 2,05 x 10-3 UI/bille tandis que l’activité moyenne de l’enzyme immobilisée conservé à température ambiante est de 1,78 x 10-3 UI/ bille. La conservation à 4°C des enzymes immobilisées permet de garder une activité enzymatique légèrement supérieure qu’une conservation à 20°C. Avant conservation l’activité enzymatique moyenne sur 20 cycles était de 4,31x10-3 UI/bille. Après conservation à 4°C l’enzyme a néanmoins perdu 53% de son activité ( Perte de 59 % de son activité après conservation à 20°C) . Alors que l’enzyme soluble placée au congélateur conserve presque 55% de son activité enzymatique l’enzyme immobilisée n’était plus utilisable après conservation au congélateur. L’enzyme soluble conservée à 4°C perd environ 60% de son activité tandis que l’enzyme immobilisée perd que 50% de son activité. L’enzyme immobilisée dans les billes d’alginate résiste donc mieux à une conservation à 4°C. L’enzyme immobilisée conservé à 20°C perd 59% de son activité tandis que l’enzyme soluble conservé à 20°C perds près de 70% de sa capacité enzymatique. L’immobilisation de l’enzyme en billes d’alginate semble donc permettre de garder une meilleur activité enzymatique après conservation à 4°C et 20°C. Cependant la conservation à -18°C a dégrader les billes d’alginate à 2% qui ne permet plus à l’enzyme de catalyser le substrat. Pour conclure l’immobilisation de la phosphatase alcaline dans les billes à 2% d’alginate permet la réutilisation de l’enzyme un grand nombre de fois sans perte d’activité. Cette immobilisation permet de mieux conserver la phosphatase alcaline à 4 et 20°C néanmoins après conservation la perte d’activité sera toujours importante. 5) Cinétique de l’enzyme avec inhibiteurs en billes à 2% et 3% d’alginate à 37° Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 L’étude porte sur l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline lorsqu’elle est incluse dans des billes d’alginate en présence d’inhibiteurs compétitif et non-compétitif. On testera l’enzyme dans deux concentrations de billes : 2% et 3% d’alginate. On choisira d’effectuer ce test à température physiologique (37°C). Protocole utilisé : Billes Billes 2% soit 3 billes par inhibiteurs Billes 3% soit 8 billes par inhibiteurs PNPP pré incubé 5 min à 37°C 2,5 mL 2,5 mL Inhibiteurs (phosphate ou phénylalanine) 0,25 mL 0,25 mL Temps d’incubation exact à 37°C 7 minutes Réaspirer la totalité de la phase liquide dans le tube NaOH (réactif d’arrêt) 2mL 2mL Lire la DO à 405 nm contre un blanc réactif sans PNPP Ainsi, en suivant le protocole ci-dessus, nous avons obtenu les résultats suivant : Sur cet histogramme, nous avons comparé l’activité enzymatique de la PAL immobilisée en présence de différents inhibiteurs (compétitif : le phosphate, et non compétitif : le phénylalanine) avec les résultats obtenus précédemment sur l'étude de l’enzyme immobilisée seule. Pour obtenir une comparaison équivalente, nous avons sélectionné les résultats dont la durée d’incubation est de 7 minutes et dont le pourcentage d’alginate des billes est de 2% et 3 %. Ainsi, pour le lot de billes à 2 % d’alginate, on observe une activité bien plus importante pour l’enzyme sans inhibiteurs comparé à l’enzyme avec inhibiteur : soit une augmentation de 93,6 % pour le phosphate et 127,5 % pour le phénylalanine. On peut donc déjà affirmer que les résultats sont cohérents et que les inhibiteurs ont fonctionnés pour ce lot puisque l’activité obtenue est moins Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 important, elle a été inhibée. Par ailleurs, l’inhibiteur phosphate soit le compétitif, engendre une inhibition 33,9 % moins importante que l’inhibiteur phénylalanine qui est non compétitif. Pour ce lot de billes, l’inhibiteur phénylalanine non compétitif est donc plus efficace. Concernant le lot de billes à 3 % d’alginate, on observe une activité enzymatique bien plus importante pour l’enzyme avec inhibiteur phosphate comparé aux deux autres résultats : soit une augmentation de 489 % comparé à l’inhibiteur phénylalanine et 204 % comparé à l’enzyme sans inhibiteur. D’autres part, l’activité enzymatique avec l’inhibiteur phénylalanine non compétitif est 93,3 % moins important que celle sans inhibiteurs. On peut ainsi affirmer en vue des résultats cohérents sur cet inhibiteur qu’il est fonctionnel. En revanche, pour l'inhibiteur phosphate compétitifs, les résultats sont incohérents puisque l’enzyme immobilisé sans inhibiteur à une activité enzymatique moins importante qu’ avec l’inhibiteur : nous pouvons alors émettre deux hypothèses expliquant ces résultats. Cela peut être dû à une erreur de manipulation lors de la pratique. Mais, si nous comparons ce résultat avec celui obtenu sur ce même inhibiteur pour les billes à 2 % d’alginate, nous observons une approximative cohérence des résultats à 23 % près. Ainsi on peut émettre une troisième hypothèse sur le fait que cette manipulation soit cohérente mais que les erreurs de manipulation se soient produite sur les autres résultats. Concernant l'inhibiteur phénylalanine, les résultats sont cohérents puisque l’activité obtenue est moins important, elle a été inhibée. On peut également dire avec ce lot de billes que l'inhibiteur le plus efficace est celui non compétitif soit le phénylalanine. III- Conclusion : En conclusion, nous avons effectué de multiples manipulations sur la phosphatase alcaline. Par exemple, afin de déterminer les paramètres optimaux et les effets pouvant inhiber l’action de la phosphatase alcaline, nous avons décidé d’étudier l’enzyme en faisant varier la température où en présence d'inhibiteur ( phosphatase et phénylalanine ) . Ainsi, nous avons effectué différentes études portant d’une part sur l’enzyme soluble et d’autre part sur l’enzyme immobilisée en bille d’alginate. Par ailleurs, nous avons comparé les résultats entre eux afin de répondre aux interrogations émises. Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie Nicolas HAMON, Antoine PERROT, Léa PANISSAUD, Louna BILLAUT Groupe E1 A l’aide de nos résultats nous avons pus déterminer que l’enzyme soluble résiste bien à la chaleur et avait même une meilleur activité lors d’utilisation à plus haute température. L’enzyme immobilisée tout comme l’enzyme soluble ont une faible activité lors d’utilisation à basse température et gardent une activité intéressante lors d'utilisation à haute température. Lors de la présence d'un inhibiteur l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline est presque totalement inhiber, tandis que la phénylalanine inhibe que de moitié cette activité. On peut donc en conclure que le phosphate a un plus fort pouvoir inhibant sur la phosphatase alcaline, que le phénylalanine puisqu’il entre en compétition avec le substrat. La phénylalanine est, quand à elle, un inhibiteur non compétitif. A la différence de l’enzyme soluble, les résultats obtenues lors de l’étude des inhibiteurs sur une enzyme immobilisé nous ont montrés que la phénylalanine, quelque soit la concentration en alginate des bille, à un plus fort pouvoir inhibiteurs sur l’enzyme et est ainsi plus efficace. D’autre part, nous avons pu déterminer que la concentration optimal d’alginate est 1,5%, soit celle dont la paroi est la moins épaisse. Nous avons ainsi pu observer que l’impact des billes sur l’activité enzymatique était moins important si on augmentait la durée d’incubation. Il fallait ainsi un certain temps avant que la paroi des billes ne cède et que la réaction puisse se faire. A l’aide de nos expériences nous avons pu observer et déterminer que la phosphatase alcaline immobilisée était réutilisable un grand nombre de fois sans perdre son activité. La conservation à 3 températures différentes nous a permis de conclure que la phosphatase alcaline immobilisée perdait moins d’activité que la phosphatase alcaline soluble lors de conservations à 4°C et 20°C. Mais l’enzyme soluble se conserve bien à -18°C contrairement à l’enzyme immobilisée qui est inutilisable après conservation à -18°C. Afin de mieux étudier la réutilisation de l’enzyme immobilisée nous aurions pu faire un plus grand nombre de cycle mais par manque de temps nous avons dû arrêter ces études avant les résultats souhaités. Afin de voir les limites de l’activité de l'enzymes nous aurions pu la tester à des températures extrêmes ( 10° - 80°C ). Nous aurions pu également étudier en parallèle d’autres enzymes qui permettre d’évaluer la fonction hépatique comme l’alanine aminotransférase, aspartate aminotransférase ou encore la gamma-glutamyl transférase. Ces enzymes sont dosées dans le sang tout comme les phosphatases alcalines afin d’obtenir un bilan hépatique lors de suspicion de maladie du foie. Armelle HOUQUE, Vincent HAMANI Enzymologie
