LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2012, Volume 7, N°29 Article original DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE LA BRUCELLOSE HUMAINE: COMPARAISON DE DEUX TECHNIQUES DE SEROAGGLUTINATION LABORATORY DIAGNOSIS OF HUMAN BRUCELLOSIS: COMPARISON OF TWO TECHNIQUES OF SERUM AGGLUTINATION K. Bellamine*, M. Riyad***, B.Takourt**, B. Farouqi**, H. Fellah* *Laboratoire d’Immunologie, Faculté de Médecine de Casablanca **Laboratoire d’Immunologie, CHU Ibn Rochd de Casablanca ***Laboratoire de Parasitologie, Faculté de Médecine de Casablanca Résumé : Objectif : Evaluer les caractéristiques de deux techniques de séroagglutination pour la détection des anticorps sériques anti-Brucella. Matériel et méthodes : La recherche des anticorps anti Brucella a été effectuée sur 100 échantillons de sérums, provenant de patients chez qui la brucellose a été suspectée sur des critères cliniques et épidémiologiques. La moyenne d’âge est de 31 ans avec un écart type de 1,5 et un sex-ratio (H/F) de 2. Les deux méthodes de séroagglutination utilisées (manuelles) sont : 1- BRUCELLACAPT® (Vircell,Espagne) 2- ROSE BENGALE® (Bio Rad, France). Résultats : Les résultats ont montré une concordance entre les deux techniques de 92% (80% négatifs et 12% positifs), et une disconcordance de 8%. Conclusion : Les résultats discordants démontrent la nécessité d’intégrer à la démarche diagnostic, les données cliniques, épidémiologiques, l’évolution de la maladie, ainsi que les données biologiques et de prendre en considération la valeur seuil de détection des marqueurs sérologiques de la technique utilisée. Mots clés : séro-agglutination, Brucellose, anticorps, sensibilité, spécificité Abstract: objective: Evaluate the technical characteristics of two agglutination techniques used for the detection of serum antibodies of Brucella. Material and methods: The search for Brucella antibodies was performed in 100 serum samples. They come from patients with brucellosis was suspected on clinical and epidemiological criteria. The average age was 31 years with a standard deviation of 1.5 and a sex ratio (M / W) is equal to 2. The two methods used are (manual): 1- BRUCELLACAPT® (Vircell,Spain) 2- ROSE BENGAL ® (Bio-Rad, France). Results: The results showed a concordance between the two techniques of 92% (80% negative results and 12% positive), and discrepancy of 8%. Conclusion: Discordant results demonstrate the need to always integrate the approach diagnostic of a clinical and epidemiological data associated with biological data, and secondly, to take into account the threshold value of detection of serological markers of the technique used. Keywords: agglutination, brucellosis, antibodies, sensitivity, specificity 99 LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2012, Volume 7, N°29 l’antigène tamponné (EAT) (dont le test au Rose Bengale), l’inhibition d’agglutination, la réaction de fixation du complément (RFCp), la technique d’immunofluorescence indirecte (IFA), les tests immunoenzymatiques « Elisa », la cytométrie en flux et les techniques d’amplification génique [6]. Peu d’études ont évalué le rendement de ces méthodes dans les différents stades de la Brucellose humaine qui reste souvent une maladie sous diagnostiquée [6]. L’objectif de ce travail est d’évaluer deux techniques commercialisées de séroagglutination manuelle pour la détection des anticorps sériques anti-Brucella, ce sont : le test BRUCELLACAPT® (Vircell ,Espagne) et le test ROSE BENGALE® (Bio Rad, France). MATERIEL ET METHODES : Il s’agit d’une étude prospective réalisée au laboratoire d’immunosérologie de l’hôpital universitaire de Casablanca pendant une période de 6 mois. Nous avons recueillis 100 échantillons de sérums provenant de patients hospitalisés dans les différents services pour lesquels la brucellose a été suspectée sur la base des critères cliniques et épidémiologiques. La moyenne d’âge était de 31 ans avec un écart type de 1,5 et un sex-ratio (H/F) de 2. Les deux trousses utilisées sont: Le test BRUCELLACAPT® (Vircell, Espagne) et le test ROSE BENGALE® (Bio Rad, France). A- Le test BRUCELLACAPT® (Vircell, Espagne) : C'est un test d’agglutination pour la détection et la quantification des anticorps totaux antiBrucella dans le sérum humain. Il est utile au dépistage et surtout au diagnostic de la Brucellose dans sa phase chronique. Un titre supérieur à 1/320 est révélateur d’une brucellose. Cette méthode est basée sur la technique d’immunocapture. Après addition et dilution des sérums directement dans la microplaque (fonds en U sensibilisés avec des anti- immunoglobulines humaines), l’antigène Brucella abortus est ajouté. La micro-plaque est Introduction : La brucellose humaine est l’anthropozoonose la plus répandue dans le monde. Elle demeure endémique dans certains pays du bassin méditerranéen, au Moyen Orient, et dans plusieurs régions d’Afrique où elle pose encore un véritable problème de santé publique et représente un surcoût économique important [1,2]. Pendant les 10 dernières années, une augmentation du nombre de cas a été notée ce qui a relancé récemment l’intérêt médical pour cette maladie [1]. Les espèces de Brucella fréquemment responsables d’infections humaines sont B. melitensis, B. aborus et B. suis et sont transmis principalement par voie digestive ou cutanéomuqueuse [3]. La Brucellose survient à tous les âges avec une prédominance chez l’adulte jeune de sexe masculin. Après une période d’incubation variable, la brucellose se manifeste dans sa phase aiguë par un tableau pseudo grippal. L’évolution spontanée se caractérise surtout par la possibilité de survenue de localisations secondaires, qui font la gravité de la maladie [4] : neuroméningées, cardiaques, hépatospléniques, ostéoarticulaires...Concernant les formes chroniques, elles se définissent par une évolution prolongée au delà d’un an [4]. La diversité clinique et les complications engendrées par la brucellose rendent son diagnostic clinique difficile et sa confirmation reste souvent biologique, reposant sur des critères bactériologiques et sérologiques [5]. En outre, le diagnostic de certitude qui repose sur l’isolement de Brucella en culture, est caractérisé par une sensibilité variable en fonction du stade clinique de la maladie. Dans ce contexte, les méthodes sérologiques (diagnostic indirect) peuvent apporter leur contribution au diagnostic de cette pathologie [4]. De nombreuses méthodes ont été développées, notamment la technique d’agglutination en tube ou séro-agglutination de Wright (SAW) qui est la technique de référence internationale, la technique d’agglutination sur lame ou épreuve de 100 LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2012, Volume 7, N°29 ensuite incubée pendant 24 heures à température ambiante. Les sérums positifs en anticorps antiBrucella produisent une agglutination sur la majeure partie du puits. Pour les sérums négatifs il n’y a pas d’agglutination. Ce test permet de détecter des anticorps agglutinants ainsi que les anticorps incomplets jusqu’alors uniquement détectables par le test de Coombs. B- Le test de BRUCELLA ROSE BENGALE® (BIO-RAD, France): La réaction de l’antigène au Rose Bengale permet le diagnostic sérologique des brucelloses dues à Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella bovis ou Brucella suis, par détection des anticorps type IgG. Ce test qualitatif, qui se positive peu après le sérodiagnostic de Wright, est utile au dépistage, ainsi qu’à la surveillance de la brucellose (enquêtes épidémiologiques). Ce test à l’antigène tamponné, est une réaction d’agglutination rapide utilisant comme suspension bactérienne, Brucella abortus, colorée au Rose Bengale en milieu acide tamponné. Après mélange à part égales d’antigène au Rose Bengale et de sérum, on observe l’apparition d’agglutinats colorés en cas de brucellose et une absence d’agglutination en cas de réaction négative. La limite de sensibilité est de 25UI/ml. Les principales caractéristiques des deux techniques sont résumées dans le tableau 1. Tableau 1 : Les principales caractéristiques des deux techniques testées. Caractéristiques Technique Principe Méthodes Composition de la plaque Antigéne Echantillon Volume Procedure de validation Lecture des résultats Durée de l’analyse Seuil de détection Brucellacapt Vircell® Manuelle Agglutination par Immuncapture Brucella Rose Bengale Bio Rad ® Manuelle Agglutination par l’Antigéne tamponné Qualitative Qualitative Quantitative Microplaque sensibilisée par des anti- Support d’agglutination immunoglobulines humaines Antigène Brucella Abortus Antigène Brucella Abortus coloré au Rose Bengale Sérum humain Sérum humain 5μl (microlitres) 30μl (microlitres) Contrôle positif (présence d’agglutination) Contrôle positif (présence et négatif (absence d’agglutination) d’agglutination) et négatif (absence d’agglutination) Présence d’agglutination sur l’ensemble Présence d’agglutinats colorés en du puit (résultat positif) cas de brucellose Absence d’agglutination sur l’ensemble de (résultat positif) puit (résultat négatif) Absence d’agglutinats colorés (résultat négatif) Nombre de tests Résultat après 24 heures Résultat après 4 minutes A partir d’un titre ≥ 1/320 est révélateur A partir d’un taux ≥ 25 UI/ml d’une Brucellose 96 Tests/Kit 30 Tests/Kit Sensibilité 95% 65% Spécificité 99% 99% 101 LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2012, Volume 7, N°29 RESULTATS: supérieur au seuil (1/320), alors qu’ils sont sortis négatifs par le test ROSE BENGALE®. Par ailleurs 3 sérums se sont révélés négatifs par le BRUCELLACAPT® avec des titres d’anticorps strictement éloignés du seuil de détection de ce test (Inférieur à 1/ 320), mais positifs par le test de ROSE BENGALE®. L’ensemble des résultats sera analysé et interprété en fonction des données cliniques et épidémiologiques disponibles, et celles de la littérature. Les résultats sérologiques (recherche des anticorps anti Brucella) obtenus par les deux techniques sont représentés dans le tableau 2. Ainsi 80 sérums se sont révélés négatifs et 12 sérums positifs en anticorps anti-brucella par les deux techniques testées (Brucellacapt® et ROSE BENGALE®). Ce qui donne une corrélation de 92% (92/100) entre les deux techniques. Dans les résultats discordants 8% (8/100), cinq sérums se sont révélés positifs par le Brucellacapt® avec un titre d’anticorps Tableau 2 : Résultats obtenus par les deux techniques utilisées TEST BRUCELLACAPT® (Vircell, Espagne). - + TEST ROSE BENGALE® (BioRad,France) Total + 12 3 15 - 5 80 85 17 83 100 Total Discussion : Sur le plan biologique, la Brucellose s’accompagne d’une leuco neutropénie ou d’une leucocytose normale, parfois d’une thrombopénie, d’un syndrome inflammatoire modéré ou franc (élévation de la vitesse de sédimentation ou de la protéine C réactive sérique) et d’une cytolyse modérée [7]. Le diagnostic de Brucellose est confirmé par l’isolement de Brucella ou par la sérologie. L’isolement de Brucella en culture demeure la technique de référence pour établir un diagnostic de certitude mais elle doit être réalisée dans un laboratoire de sécurité biologique de niveau 3. Les hémocultures sont réalisées en cas de fièvre ou de foyers secondaires, l’utilisation de systèmes automatisés pour les hémocultures permet de raccourcir le délai de croissance à moins de 5 jours [3]. Les hémocultures sont positives dans 70 à 80% des cas au cours de la phase septicémique et 20 à 45% des cas dans les formes focalisées [3]. La recherche des anticorps repose sur différentes techniques sérologiques dont le sérodiagnostic de Wright (SW) qui se positive précocement, 7 à 15 jours après le début des signes cliniques et devient assez rapidement négative en cas de guérison [9], la réaction de fixation du complément peu sensible est actuellement abandonnée au profit de réactions plus récentes et plus utiles [10], l’immunofluorescence indirecte (IFI) et la réaction immuno-enzymatique par la technique ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) sont très sensibles et très spécifiques, elles restent longtemps positives et permettent la 102 LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2012, Volume 7, N°29 détection des différentes classes d’anticorps (Ig G, Ig M et IgA) [9]. L’immunofluorescence directe (IFD) peut être effectuée sur une coupe histologique d’un Prélèvement biopsique ou suite à un geste chirurgical peut reconnaître la présence du germe [2]. Les techniques d’amplification génique ne sont pas encore de pratique courante et restent réservées à certains laboratoires. La technique la plus couramment utilisée est la PCR. Cette technique, sensible et spécifique, permet un diagnostic plus rapide (en 24 heures) que les hémocultures, au cours de la phase aiguë septicémique [10].D’autres méthodes peuvent être utilisées notamment, la recherche d’une hypersensibilité retardée au cours de la brucellose chronique mais elle n’est plus pratiquée [2]. Il en est de même pour le test de transformation lymphoblastique qui a une signification superposable à l’intradermoréaction [2]. L’étude de la production spontanée d’anticorps spécifiques par les lymphocytes spécifiques ou IVAP (in vitro antibodies production) est exceptionnellement pratiquée. Elle permet quand elle est positive d’affirmer une infection évolutive, même focalisée [8]. Les études comparant les performances de différentes méthodes pour la détection des anticorps anti Brucella démontrent qu’aucune méthode n’est parfaite, et la multiplication des techniques ne permet pas toujours d’établir le sérodiagnostic avec certitude [9,10]. La limite essentielle du diagnostic sérologique de la brucellose est représentée par la fréquence des réactions croisées entre Brucella spp et d’autres espèces bactériennes, principalement, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae et Salmonella [11]. Les résultats des tests sérologiques doivent être interpréter en fonction du risque d'exposition au germe, de l’évaluation des éléments cliniques, de l’histoire précise de la maladie, de l’état actuel du patient, et d’une compréhension de l’utilité et des pièges des tests diagnostic utilisés. Il est également important de comprendre l’évolution de la réponse immunitaire suite à l'infection et après traitement, puisque chez un bon nombre de patients, les IgG spécifiques anti- Brucella, et dans certains cas les IgM, peuvent persister pendant des années, malgré le traitement et la guérison [12, 13]. Dans notre étude une corrélation entre les deux techniques utilisées est observée dans 92% des cas, cette corrélation peut être expliquée par l’utilisation du même principe d’analyse par les deux tests à savoir la technique d’agglutination. Ces deux tests sont caractérisées aussi par une bonne spécificité, puisque 80% des sérums testés sont sortis négatifs. En comparant les résultats sérologiques avec les données cliniques, il s’est avéré que les sujets ayant des résultats sérologiques négatifs ne présentaient pas des signes cliniques de Brucellose ni au moment de la demande d’analyse ni dans les semaines qui ont suivi. Alors que les patients qui ont eu des sérologies positives, ont bien évolué sous traitement anti Brucellique. Parmi les causes de discordances (8%) évoquées dans notre étude : La date de l’infection Brucellique qui était difficile à déterminer chez les patients étudiés, afin de préciser le moment de négativation du Rose Bengale au cours de l'évolution. Ce test bien qu’il est simple et rapide dans le cas d’une Brucellose aigue mais il peut donner de faux négatifs dans les cas chroniques et compliqués [14,15]. Pour une ancienne Brucellose, seul le Brucellacapt ® permet de détecter des anticorps résiduels [10], car une forte corrélation a été démontré entre les différents tests sérologiques classiques (Test de Coombs anti-Brucella, sérodiagnostic de Wright, fixation du complément et les tests ELISA IgM ;IgG anti Brucella) et le Brucellacapt ® (98%) avec une sensibilité et une spécificité élevée [10] . Les cinq patients avec une sérologie positive seulement avec le test de Brucellacapt ®, ont été mis sous traitement spécifique, vu la présence d’exposition à la maladie et les signes cliniques en faveur de Brucellose. On a noté également chez ces sujets une bonne évolution post 103 LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2012, Volume 7, N°29 thérapeutique. Cependant chez les trois patients avec des réactions positives isolées au Rose Bengale®, ils ont été mis sous surveillance clinique et biologique. L’hypothèse de fausses réactions positives peut être avancée, celle ci a été rapportée par d’autres études où le test Rose Bengale ® a été positif chez des patients dont le contexte épidémiologique et clinique n’était pas en faveur de Brucellose [16,17]. Une autre hypothèse peut être évoquée c’est le dépistage très précoce avant l’apparition des anticorps antiBrucella, éventualité jamais observée [18]. Dans notre contexte, il serait souhaitable de réaliser une autre étude plus large avec un nombre de patients plus élevé et d’effectuer éventuellement des comparaisons avec ces résultats préliminaires. Conclusion : Devant le manque de spécificité des signes cliniques et les performances très variables de la culture, la recherche des anticorps spécifiques du genre Brucella pourrait constituer un argument d’intérêt qu’il faut cependant corréler aux données cliniques et épidémiologiques dans le respect des règles des examens sérologiques. Et enfin et pour améliorer les performances des examens biologiques dans le cadre du diagnostic précoce de la Brucellose, toute suspicion épidémio-clinique de cette pathologie doit être systématiquement signalée au laboratoire. REFERENCES [1] Sohn AH, Probert WS, Glaser CA, Gupta N, Bollen AW, Wong JD. Human neurobrucellosis with intracerebral granuloma caused by a marine mammal Brucella spp. Emerg Infect Dis 2003; 9:485–8. [2] - Janbon F. 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