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LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2012, Volume 7, N°29
Article original
DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE LA BRUCELLOSE HUMAINE:
COMPARAISON DE DEUX TECHNIQUES DE SEROAGGLUTINATION
LABORATORY DIAGNOSIS OF HUMAN BRUCELLOSIS: COMPARISON OF TWO TECHNIQUES
OF SERUM AGGLUTINATION
K. Bellamine*, M. Riyad***, B.Takourt**, B. Farouqi**, H. Fellah*
*Laboratoire d’Immunologie, Faculté de Médecine de Casablanca
**Laboratoire d’Immunologie, CHU Ibn Rochd de Casablanca
***Laboratoire de Parasitologie, Faculté de Médecine de Casablanca
Résumé :
Objectif : Evaluer les caractéristiques de deux
techniques de séroagglutination
pour la
détection des anticorps sériques anti-Brucella.
Matériel et méthodes : La recherche des
anticorps anti Brucella a été effectuée sur 100
échantillons de sérums, provenant de patients
chez qui la brucellose a été suspectée sur des
critères cliniques et épidémiologiques. La
moyenne d’âge est de 31 ans avec un écart type
de 1,5 et un sex-ratio (H/F) de 2. Les deux
méthodes
de
séroagglutination
utilisées
(manuelles) sont :
1- BRUCELLACAPT® (Vircell,Espagne)
2- ROSE BENGALE® (Bio Rad, France).
Résultats : Les résultats ont montré une
concordance entre les deux techniques de 92%
(80% négatifs et 12% positifs), et une
disconcordance de 8%.
Conclusion :
Les
résultats
discordants
démontrent la nécessité d’intégrer à la démarche
diagnostic,
les
données
cliniques,
épidémiologiques, l’évolution de la maladie,
ainsi que les données biologiques et de prendre
en considération la valeur seuil de détection des
marqueurs sérologiques de la technique utilisée.
Mots clés : séro-agglutination, Brucellose,
anticorps, sensibilité, spécificité
Abstract:
objective: Evaluate the technical characteristics
of two agglutination techniques used for the
detection of serum antibodies of Brucella.
Material and methods: The search for Brucella
antibodies was performed in 100 serum samples.
They come from patients with brucellosis was
suspected on clinical and epidemiological
criteria. The average age was 31 years with a
standard deviation of 1.5 and a sex ratio (M / W)
is equal to 2. The two methods used are
(manual):
1- BRUCELLACAPT® (Vircell,Spain)
2- ROSE BENGAL ® (Bio-Rad, France).
Results: The results showed a concordance
between the two techniques of 92% (80%
negative results and 12% positive), and
discrepancy of 8%.
Conclusion: Discordant results demonstrate the
need to always integrate the approach diagnostic
of a clinical and epidemiological data associated
with biological data, and secondly, to take into
account the threshold value of detection of
serological markers of the technique used.
Keywords:
agglutination,
brucellosis,
antibodies, sensitivity, specificity
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LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2012, Volume 7, N°29
l’antigène tamponné (EAT) (dont le test au Rose
Bengale), l’inhibition d’agglutination, la réaction
de fixation du complément (RFCp), la technique
d’immunofluorescence indirecte (IFA), les tests
immunoenzymatiques « Elisa », la cytométrie en
flux et les techniques d’amplification génique
[6]. Peu d’études ont évalué le rendement de ces
méthodes dans les différents stades de la
Brucellose humaine qui reste souvent une
maladie sous diagnostiquée [6].
L’objectif de ce travail est d’évaluer deux
techniques
commercialisées
de
séroagglutination manuelle pour la détection des
anticorps sériques anti-Brucella, ce sont : le test
BRUCELLACAPT® (Vircell ,Espagne) et le test
ROSE BENGALE® (Bio Rad, France).
MATERIEL ET METHODES :
Il s’agit d’une étude prospective réalisée au
laboratoire d’immunosérologie de l’hôpital
universitaire de Casablanca pendant une période
de 6 mois.
Nous avons recueillis 100 échantillons de
sérums provenant de patients hospitalisés dans
les différents services pour lesquels la brucellose
a été suspectée sur la base des critères cliniques
et épidémiologiques. La moyenne d’âge était de
31 ans avec un écart type de 1,5 et un sex-ratio
(H/F) de 2.
Les deux trousses utilisées sont: Le test
BRUCELLACAPT® (Vircell, Espagne) et le test
ROSE BENGALE® (Bio Rad, France).
A- Le test BRUCELLACAPT® (Vircell,
Espagne) :
C'est un test d’agglutination pour la détection et
la quantification des anticorps totaux antiBrucella dans le sérum humain. Il est utile au
dépistage et surtout au diagnostic de la
Brucellose dans sa phase chronique.
Un titre supérieur à 1/320 est révélateur d’une
brucellose. Cette méthode est basée sur la
technique d’immunocapture. Après addition et
dilution des sérums directement dans la
microplaque (fonds en U sensibilisés avec des
anti- immunoglobulines humaines), l’antigène
Brucella abortus est ajouté. La micro-plaque est
Introduction :
La brucellose humaine est l’anthropozoonose la
plus répandue dans le monde. Elle demeure
endémique dans certains pays du bassin
méditerranéen, au Moyen Orient,
et dans
plusieurs régions d’Afrique où elle pose encore
un véritable problème de santé publique et
représente un surcoût économique important
[1,2]. Pendant les 10 dernières années, une
augmentation du nombre de cas a été notée ce
qui a relancé récemment l’intérêt médical pour
cette maladie [1].
Les espèces de Brucella fréquemment
responsables d’infections humaines sont B.
melitensis, B. aborus et B. suis et sont transmis
principalement par voie digestive ou cutanéomuqueuse [3]. La Brucellose survient à tous les
âges avec une prédominance chez l’adulte jeune
de sexe masculin. Après une période
d’incubation variable, la brucellose se manifeste
dans sa phase aiguë par un tableau pseudo
grippal. L’évolution spontanée se caractérise
surtout par la possibilité de survenue de
localisations secondaires, qui font la gravité de la
maladie [4] : neuroméningées, cardiaques,
hépatospléniques, ostéoarticulaires...Concernant
les formes chroniques, elles se définissent par
une évolution prolongée au delà d’un an [4]. La
diversité clinique et les complications
engendrées par la brucellose rendent son
diagnostic clinique difficile et sa confirmation
reste souvent biologique, reposant sur des
critères bactériologiques et sérologiques [5]. En
outre, le diagnostic de certitude qui repose sur
l’isolement de Brucella en culture, est caractérisé
par une sensibilité variable en fonction du stade
clinique de la maladie. Dans ce contexte, les
méthodes sérologiques (diagnostic indirect)
peuvent apporter leur contribution au diagnostic
de cette pathologie [4].
De nombreuses méthodes ont été développées,
notamment la technique d’agglutination en tube
ou séro-agglutination de Wright (SAW) qui est
la technique de référence internationale, la
technique d’agglutination sur lame ou épreuve de
100
LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2012, Volume 7, N°29
ensuite incubée pendant 24 heures à température
ambiante. Les sérums positifs en anticorps antiBrucella produisent une agglutination sur la
majeure partie du puits. Pour les sérums négatifs
il n’y a pas d’agglutination. Ce test permet de
détecter des anticorps agglutinants ainsi que les
anticorps incomplets jusqu’alors uniquement
détectables par le test de Coombs.
B- Le test de BRUCELLA ROSE
BENGALE® (BIO-RAD, France):
La réaction de l’antigène au Rose Bengale
permet le diagnostic sérologique des brucelloses
dues à Brucella melitensis, Brucella abortus,
Brucella bovis ou Brucella suis, par détection
des anticorps type IgG. Ce test qualitatif, qui se
positive peu après le sérodiagnostic de Wright,
est utile au dépistage, ainsi qu’à la surveillance
de la brucellose (enquêtes épidémiologiques).
Ce test à l’antigène tamponné, est une réaction
d’agglutination
rapide
utilisant
comme
suspension bactérienne, Brucella abortus,
colorée au Rose Bengale en milieu acide
tamponné.
Après mélange à part égales d’antigène au Rose
Bengale et de sérum, on observe l’apparition
d’agglutinats colorés en cas de brucellose et une
absence d’agglutination en cas de réaction
négative. La limite de sensibilité est de 25UI/ml.
Les principales caractéristiques des deux
techniques sont résumées dans le tableau 1.
Tableau 1 : Les principales caractéristiques des deux techniques testées.
Caractéristiques
Technique
Principe
Méthodes
Composition de la plaque
Antigéne
Echantillon
Volume
Procedure de validation
Lecture des résultats
Durée de l’analyse
Seuil de détection
Brucellacapt Vircell®
Manuelle
Agglutination par Immuncapture
Brucella Rose Bengale Bio Rad ®
Manuelle
Agglutination
par
l’Antigéne
tamponné
Qualitative
Qualitative
Quantitative
Microplaque sensibilisée par des anti- Support d’agglutination
immunoglobulines humaines
Antigène Brucella Abortus
Antigène Brucella Abortus coloré
au Rose Bengale
Sérum humain
Sérum humain
5μl (microlitres)
30μl (microlitres)
Contrôle positif (présence d’agglutination) Contrôle
positif
(présence
et négatif (absence d’agglutination)
d’agglutination)
et négatif
(absence d’agglutination)
Présence d’agglutination sur l’ensemble Présence d’agglutinats colorés en
du puit (résultat positif)
cas de brucellose
Absence d’agglutination sur l’ensemble de (résultat positif)
puit (résultat négatif)
Absence d’agglutinats colorés
(résultat négatif)
Nombre de tests
Résultat après 24 heures
Résultat après 4 minutes
A partir d’un titre ≥ 1/320 est révélateur A partir d’un taux ≥ 25 UI/ml
d’une Brucellose
96 Tests/Kit
30 Tests/Kit
Sensibilité
95%
65%
Spécificité
99%
99%
101
LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2012, Volume 7, N°29
RESULTATS:
supérieur au seuil (1/320), alors qu’ils sont
sortis négatifs par le test ROSE BENGALE®.
Par ailleurs 3 sérums se sont
révélés négatifs par le BRUCELLACAPT®
avec des titres d’anticorps strictement éloignés
du seuil de détection de ce test (Inférieur à
1/ 320), mais positifs par le test de ROSE
BENGALE®. L’ensemble des résultats sera
analysé et interprété en fonction des données
cliniques et épidémiologiques disponibles, et
celles de la littérature.
Les résultats sérologiques (recherche des
anticorps anti Brucella) obtenus par les deux
techniques sont représentés dans le tableau 2.
Ainsi 80 sérums se sont révélés négatifs et 12
sérums positifs en anticorps anti-brucella par les
deux techniques testées (Brucellacapt® et
ROSE BENGALE®). Ce qui donne une
corrélation de 92% (92/100) entre les deux
techniques.
Dans les résultats discordants 8% (8/100), cinq
sérums se sont révélés positifs par le
Brucellacapt® avec un titre d’anticorps
Tableau 2 : Résultats obtenus par les deux techniques utilisées
TEST BRUCELLACAPT®
(Vircell, Espagne).
-
+
TEST ROSE BENGALE®
(BioRad,France)
Total
+
12
3
15
-
5
80
85
17
83
100
Total
Discussion :
Sur le plan biologique, la Brucellose
s’accompagne d’une leuco neutropénie ou d’une
leucocytose
normale,
parfois
d’une
thrombopénie, d’un syndrome inflammatoire
modéré ou franc (élévation de la vitesse de
sédimentation ou de la protéine C réactive
sérique) et d’une cytolyse modérée [7]. Le
diagnostic de Brucellose est confirmé par
l’isolement de Brucella ou par la sérologie.
L’isolement de Brucella en culture demeure la
technique de référence pour établir un diagnostic
de certitude mais elle doit être réalisée dans un
laboratoire de sécurité biologique de niveau 3.
Les hémocultures sont réalisées en cas de fièvre
ou de foyers secondaires, l’utilisation de
systèmes automatisés pour les hémocultures
permet de raccourcir le délai de croissance à
moins de 5 jours [3]. Les hémocultures sont
positives dans 70 à 80% des cas au cours de la
phase septicémique et 20 à 45% des cas dans les
formes focalisées [3]. La recherche des anticorps
repose sur différentes techniques sérologiques
dont le sérodiagnostic de Wright (SW) qui se
positive précocement, 7 à 15 jours après le début
des signes cliniques et devient assez rapidement
négative en cas de guérison [9], la réaction de
fixation du complément peu sensible est
actuellement abandonnée au profit de réactions
plus
récentes
et
plus
utiles
[10],
l’immunofluorescence indirecte (IFI) et la
réaction immuno-enzymatique par la technique
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
sont très sensibles et très spécifiques, elles
restent longtemps positives et permettent la
102
LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2012, Volume 7, N°29
détection des différentes classes d’anticorps (Ig
G, Ig M et IgA) [9]. L’immunofluorescence
directe (IFD) peut être effectuée sur une coupe
histologique d’un Prélèvement biopsique ou
suite à un geste chirurgical peut reconnaître la
présence du germe [2].
Les techniques d’amplification génique ne sont
pas encore de pratique courante et restent
réservées à certains laboratoires. La technique la
plus couramment utilisée est la PCR. Cette
technique, sensible et spécifique, permet un
diagnostic plus rapide (en 24 heures) que les
hémocultures, au cours de la phase aiguë
septicémique [10].D’autres méthodes peuvent
être utilisées notamment, la recherche d’une
hypersensibilité retardée au cours de la
brucellose chronique mais elle n’est plus
pratiquée [2]. Il en est de même pour le test de
transformation lymphoblastique qui a une
signification superposable à l’intradermoréaction [2]. L’étude de la production spontanée
d’anticorps spécifiques par les lymphocytes
spécifiques ou IVAP (in vitro antibodies
production) est exceptionnellement pratiquée.
Elle permet quand elle est positive d’affirmer
une infection évolutive, même focalisée [8]. Les
études comparant les performances de
différentes méthodes pour la détection des
anticorps anti Brucella démontrent qu’aucune
méthode n’est parfaite, et la multiplication des
techniques ne permet pas toujours d’établir le
sérodiagnostic avec certitude [9,10]. La limite
essentielle du diagnostic sérologique de la
brucellose est représentée par la fréquence des
réactions croisées entre Brucella spp et d’autres
espèces bactériennes, principalement, Yersinia
enterocolitica, Vibrio cholerae et Salmonella
[11]. Les résultats des tests sérologiques doivent
être interpréter en fonction
du risque
d'exposition au germe, de l’évaluation des
éléments cliniques, de l’histoire précise de la
maladie, de l’état actuel du patient, et d’une
compréhension de l’utilité et des pièges des tests
diagnostic utilisés. Il est également important de
comprendre l’évolution de la réponse
immunitaire suite à l'infection et après
traitement, puisque chez un bon nombre de
patients, les IgG spécifiques anti- Brucella, et
dans certains cas les IgM, peuvent persister
pendant des années, malgré le traitement et la
guérison [12, 13].
Dans notre étude une corrélation entre les deux
techniques utilisées est observée dans 92% des
cas, cette corrélation peut être expliquée par
l’utilisation du même principe d’analyse par les
deux tests à savoir la technique d’agglutination.
Ces deux tests sont caractérisées aussi par une
bonne spécificité, puisque 80% des sérums testés
sont sortis négatifs.
En comparant les résultats sérologiques avec les
données cliniques, il s’est avéré que les sujets
ayant des résultats sérologiques négatifs ne
présentaient pas des signes cliniques de
Brucellose ni au moment de la demande
d’analyse ni dans les semaines qui ont suivi.
Alors que les patients qui ont eu des sérologies
positives, ont bien évolué sous traitement anti
Brucellique.
Parmi les causes de discordances (8%) évoquées
dans notre étude : La date de l’infection
Brucellique qui était difficile à déterminer chez
les patients étudiés, afin de préciser le moment
de négativation du Rose Bengale au cours de
l'évolution. Ce test bien qu’il est simple et rapide
dans le cas d’une Brucellose aigue mais il peut
donner de faux négatifs dans les cas chroniques
et compliqués [14,15]. Pour une ancienne
Brucellose, seul le Brucellacapt ® permet de
détecter des anticorps résiduels [10], car une
forte corrélation a été démontré entre les
différents tests sérologiques classiques (Test de
Coombs anti-Brucella, sérodiagnostic de Wright,
fixation du complément et les tests ELISA
IgM ;IgG anti Brucella) et le Brucellacapt ®
(98%) avec une sensibilité et une spécificité
élevée [10] .
Les cinq patients avec une sérologie positive
seulement avec le test de Brucellacapt ®, ont été
mis sous traitement spécifique, vu la présence
d’exposition à la maladie et les signes cliniques
en faveur de Brucellose. On a noté également
chez ces sujets une bonne évolution post
103
LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2012, Volume 7, N°29
thérapeutique. Cependant chez les trois patients
avec des réactions positives isolées au Rose
Bengale®, ils ont été mis sous surveillance
clinique et biologique. L’hypothèse de fausses
réactions positives peut être avancée, celle ci a
été rapportée par d’autres études où le test Rose
Bengale ® a été positif chez des patients dont le
contexte épidémiologique et clinique n’était pas
en faveur de Brucellose [16,17]. Une autre
hypothèse peut être évoquée c’est le dépistage
très précoce avant l’apparition des anticorps antiBrucella, éventualité jamais observée [18].
Dans notre contexte, il serait souhaitable de
réaliser une autre étude plus large avec un
nombre de patients plus élevé et d’effectuer
éventuellement des comparaisons avec ces
résultats préliminaires.
Conclusion :
Devant le manque de spécificité des signes
cliniques et les performances très variables de la
culture, la recherche des anticorps spécifiques du
genre Brucella pourrait constituer un argument
d’intérêt qu’il faut cependant corréler aux
données cliniques et épidémiologiques dans le
respect des règles des examens sérologiques. Et
enfin et pour améliorer les performances des
examens biologiques dans le cadre du diagnostic
précoce de la Brucellose, toute suspicion
épidémio-clinique de cette pathologie doit être
systématiquement signalée au laboratoire.
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