Compte rendu du stage de Tp de Microbiologie Année 2002-2003 1 Préparation des milieux et du matériel L’étude des bactéries a connu son plein développement à partir du moment où furent mises au point des méthodes permettant de les cultiver, les isoler, et de les identifier. Ces différentes opérations nécessitent l’emploi de milieux de culture. Principales caractéristiques d’un milieu de culture Les microorganismes doivent trouver dans le milieu de culture et son atmosphère tous les éléments chimiques les constituant, sous une forme appropriée. Un bon milieu doit : Etre stérile Etre nutritif : doit contenir quantitativement et qualitativement les aliments exigés pour la croissance et l’entretien des microorganismes. Contenir une quantité d’eau suffisante pour permettre le métabolisme bactérien. Avoir un pH convenable. Rq : Un milieu contenant uniquement ce qui est nécessaire aux microorganismes est dit milieu minimum. Classification des milieux de culture Les milieux de culture sont classés en fonction de leur composition ou de leur utilisation. a) Classification selon la composition. 1. Milieux naturels ou empiriques Milieux complexes de composition mal définie. Leur origine est soit animale (extraits de viande, peptone), soit végétale (pomme de terre, levure). 2. Milieux synthétiques Milieux composés de substances chimiques exactement définies 3. Milieux semi synthétiques Milieux synthétiques additionnés d’un produit naturel b) Classification selon l’utilisation 1. Milieu usuels = milieu de base Milieu d’un emploi aussi général que possible. Il n’existe cependant pas de milieu de culture universel 2. Milieu d’isolement Les milieux d’isolement peuvent être : Des milieux de base Des milieux enrichis de produits biologiques Des milieux électifs : Ce sont des milieux de culture permettant un développement particulièrement abondant de certains germes. Des milieux sélectifs (ou d’enrichissement) : Ce sont des milieux dans lesquels on incorpore un inhibiteur chimique. Celui-ci, judicieusement choisi, entrave le développement de la plupart des bactéries excepté celui de l’espèce recherchée. Ces milieux permettent donc d’isoler une espèce bactérienne au milieu d’un mélange de germes. 3. Milieu d’identification Ces milieux permettent la mise en évidence des caractères biochimiques et donc de résoudre les problèmes d’identification différentielle qui se posent entre des espèces ou des genres voisins. 2 c) Classification selon leur présentation 1. Milieux liquides Ce sont soit des bouillons nutritifs contenant des produits carnés ou protéiques, soit des solutions riches en produits synthétiques. Dans les deux cas la gélose est totalement absente. La croissance microbienne est réalisée dans des tubes, des ballons ou des erlenmeyers. Elle est suivie par turbidimétrie : un milieu limpide au départ devient de plus en plus trouble lorsqu’un microorganisme se développe. 2. Milieux solides Les milieux nutritifs solides peuvent être identiques aux précédents mais ils contiennent de la gélose. Si il y a plus de 1% d’agar on parle de milieu solide, si il y a moins de 1% d’agar on parle de milieu semi solide. Ces milieux peuvent être répartis en boîtes de pétri, dans des tubes à gélose molle prise en culot, etc. La croissance microbienne se déroule en surface ou en profondeur et est suivie par observation de l’augmentation de la taille des colonies respectivement aérobies et anaérobies. Une cellule initiale se multiplie et donne une descendance de plusieurs millions d’individus tous identiques, formant une colonie. Préparation des milieux de culture Sachant que de la préparation des milieux de culture dépend les résultats de l’analyse microbiologique, un défaut de fabrication, une stérilisation mal conduite, risquent de perturber le travail. Il faudra donc apporter un grand soin à leur fabrication. Les milieux de culture existent aujourd’hui sous trois formes, soit, du plus coûteux au plus économique : - Le prêt à l’emploi - Le prêt à couler - En poudre Durant ce Tp nous avons essentiellement utiliser des milieux en poudre du fait de leur moindre coût, ce sont soit un mélange des constituants de base, soit un des éléments de base, dont le fabricant indique la dose à peser pour un volume final de milieu. Les différentes étapes de la préparation de ces milieux consistaient en : - La pesée - La dissolution des ingrédients - La mesure du pH - La répartition - La stérilisation des milieux (autoclave 121°C pendant 20 min) Rq : L’agar étant un composé insoluble à froid, il sera incorporé après la dissolution des ingrédients et la mesure du pH. 3 Les milieux utilisés durant ce Tp, leur rôle et leur préparation Durant ce Tp nous avons utilisé : Un milieu empirique sous forme solide: Gélose nutritive (GN) Un milieu empirique sous forme liquide : Bouillon nutritif (BN) Deux milieux sélectifs : Milieu à l’éosine et bleu de méthylène (EMB), Milieu Malt agar (MA) De l’eau physiologique Gélose nutritive (GN): Relativement simplifiée, sa formulation apporte les éléments nutritifs nécessaires à la croissance d’une grande variété de germes non exigeants. Elle est utilisée pour la culture et la numération des microorganismes ne présentant pas d’exigences particulières. Elle est constituée : - extrait de levure - bouillon nutritif (nutrient broth) - glucose - agar Nous avons pesé 20g de BN, 3g d’extrait de levures, 5g de glucose, que nous avons placés dans un erlen de 2L et auxquels nous avons ajouté 1L d’eau déminéralisée et placé sous agitation avec un barreau aimanté afin de dissoudre les différents constituants. Nous avons alors vérifié que le pH se situait bien dans une gamme comprise entre 7 et 7.5. C’est donc après la dissolution des différents éléments du milieu et ajustage du pH que nous avons incorporé les 15g d’agar. Nous avons alors bouché l’encolure de l’erlen avec du coton cardé et placé une feuille d’aluminium autour avant de stériliser le milieu à l’autoclave à 121°c pendant 20 min. Bouillon nutritif (BN) : Le bouillon nutritif contient exactement les mêmes constituants que la gélose nutritive, excepté le fait qu’on n’ajoute pas d’agar puisque c’est un milieu liquide. Il est donc constitué de : - extrait de levure - bouillon nutritif (nutrient broth) - glucose Sa préparation est identique à celle de la gélose nutritive. Gélose EMB (éosine methylen bleu) : La gélose EMB est constituée d’éosine Y et de bleu de méthylène qui sont des agents faiblement sélectifs. Ils n’inhibent que partiellement le développement des microorganismes gram positifs tels que les Streptocoques fécaux. De plus ces colorants assurent la différenciation entre les germes lactose positifs et les germes lactose négatifs, lorsque le milieu est lactosé. Nous avons pesé 18.75g afin de préparer 500 mL de ce milieu, auxquels nous avons ajouté 500 mL d’eau déminéralisée. On a alors ajusté le pH à 6.8-7 à l’aide de KOH concentré et stérilisé à 121°c pendant 20 min suivant le même protocole que précédemment. 4 Gélose Malt agar : Elle est constituée : - extrait de malt - extrait de levure - glucose - agar Nous avions à notre disposition sous forme de poudre la base du milieu malt agar qui contenait tous les constituants sauf l’extrait de levure et le glucose. Le fabricant indiquait qu’il fallait peser 45g pour préparer un litre. Nous voulions préparer 500 mL, nous pesions par conséquent 22.5g sur une feuille d’aluminium. Nous avons également pesé 1.25g d’extrait de levure et 5g de glucose. Après avoir pesé tous les constituants nous les avons transférés dans un erlen d’un litre et ajouté 500 mL d’eau déminéralisée. Nous avons ensuite rajouté 0.25g de Cloramphénicol avant de stériliser à 121°C pendant 20 min. La sélection des levures se réalise par l’emploi du chloramphénicol L’eau physiologique : Elle est obtenue par dissolution de 9g de Chlorure de sodium (NaCl) par litre d’eau distillée. Elle constitue un milieu isotonique qui permettra la dissolution des microorganismes tout en maintenant la différence de pression osmotique de part et d’autre de la membrane plasmique évitant ainsi la lyse. Après stérilisation nous avons procédé à l’étape de répartition des milieux. Nous avons coulé les géloses de façon stérile à proximité de la flamme du bec Bunzen. 5 Familiarisation avec le monde microbien Les Techniques de préparations microscopiques L’observation microscopique des microorganismes peut se faire sans coloration ou après coloration. Dans le premier cas, on examine des individus vivants : on apprécie ainsi la mobilité, la taille, la forme des germes ; dans un second cas, on précise la forme et on détaille les structures invisibles, par coloration, après fixation et desséchage des préparations, opérations tuant les germes. Observation sans coloration : Etat frais L’observation de l’état frais se réalise à l’objectif x40, le conden seur descendu, et le diaphragme légèrement fermé. On observe ainsi sur un fond grisâtre des bactéries brillantes. On met à profit la propriété de réfringence des microorganismes pour les observer vivants. 1) Technique opératoire La technique opératoire consiste à préparer une lame propre dégraissée et sèche. Homogénéiser la suspension à observer : prélever aseptiquement à la Pipette Pasteur une goutte de culture : déposer cette goutte au centre de la lame. Rq : Si on part d’un produit solide comme une colonie sur une boite de pétri par exemple, on déposera d’abord une goutte d’eau au centre de la lame et on y suspendra une faible quantité de la colonie à l’aide de l’ose. On recouvrira ensuite la goutte d’une lamelle tout en évitant les bulles d’air et les débordements de liquide au-delà de la zone délimitée par la lamelle. On observera sur fond clair avec l’objectif 40. 6 2) Interprétation Cette préparation permet d’apprécier : Le nombre de bactéries contenues dans le prélèvement ; notion semi quantitative permettant de dire s’il y a beaucoup ou peu de germes (renseignement utile ultérieurement pour choisir la quantité d’inoculum convenable pour l’observation d’un bon isolement et d’une bonne culture). La forme des bactéries Coques ou cocci : éléments arrondis, sphériques. Bacilles : bâtonnets : éléments allongés de taille variable. Bacilles de taille moyenne Bacilles grêles Gros bacilles trapus Bacilles courts et arrondis : coccobacilles Le mode d’assemblage de bactéries Coques Isolés Groupés par deux : diplocoques En grappe ( Staphylocoques) En chaînettes ( Streptocoques) En longue chaînes Bacilles Isolés En courtes chaînettes En chaînes En palissades 7 La mobilité Les cellules peuvent être mobiles : la présence de cils ( non visibles à l’état frais) favorise le déplacement qui ne doit pas être confondu avec le mouvement général du liquide ou avec le mouvement brownien si la température du liquide est trop élevée (du fait de l’éclairage continu). Un corps microbien est mobile lorsqu’un individu observé traverse le champ du microscope ou lorsque deux individus se croisent. Il ne faut pas oublier que dans un échantillon, il y a le plus souvent plusieurs types de bactéries, l’état frais permet de savoir combien de types différents sont présents. Dans d’autres cas, cette observation permet de vérifier la pureté d’une culture. Il ne faut jamais oublier que les bactéries sont vivantes. L’observation de l’état frais est une étape indispensable et très importante, qui apporte de nombreux renseignements et oriente déjà le diagnostic et permet de passer à l’étape suivante : l’observation de préparations colorées. 8 Observation après coloration Les observations après coloration se font à l’objectif 100 à l’immersion, le condenseur relevé à fond, et le diaphragme ouvert entièrement. Avant tout examen d’un frottis coloré, il faut dans un premier temps réaliser le frottis. 1) Préparation d’un frottis On dépose une goutte de culture microbienne ou on suspend une colonie dans une goutte d’eau au centre d’une lame. On étale la préparation avec l’oese de façon à obtenir une couche mince On sèche la lame. On fixe la préparation en écrasant la flamme du bec 2 à 3 fois avec la lame. 2) Colorations Les colorants simples que l’on emploie sont des colorants acides qui colorent uniformément les cellules, et des colorants basiques à affinité pour le cytoplasme (fushine, violet de gentiane) Durant ce Tp nous avons réalisé : Un examen après coloration différentielle d’un frottis, c’est la coloration de Gram. 2.1) Coloration de Gram C’est la coloration la plus utilisée en microbiologie car elle permet de distinguer deux grands groupes de microbes : les Gram + et les Gram -. La distinction est basée sur la différence de structure des parois mise en évidence par la double coloration. La lecture se fait avec l’objectif à immersion. La coloration de Gram permet de classer les bactéries en deux grandes catégories : - Les bactéries à Gram positif qui gardent la coloration violette après action de l’alcool - Les bactéries à Gram négatif qui sont décolorées par l’alcool et teintées en rose plus ou moins vif par la fushine. Cette distinction, base de toute la taxonomie bactérienne repose sur une variation dans la structure de la paroi des bactéries. En effet, la richesse en lipides de la paroi des bactéries à Gram négatif permet à l’alcool de traverser cette paroi et de dissoudre le composé coloré, fixé dans le cytoplasme, résultat de l’action co njointe du violet de gentiane et du lugol. Par contre, la paroi des Gram positifs, riche en peptidoglycane et pauvre en lipides est imperméable à l’alcool et par conséquent garde le complexe coloré violet. 9 2.2) La coloration des spores La coloration de spore permet de mettre en évidence les spores ou endospores, qui constituent les formes de résistances de deux classes de bactérie : - Les Bacillus (aérobie) - Les Clostridie (anaérobie) La spore est résistante à la chaleur, à la dessiccation, et aux radiations. Afin de la mettre en évidence il faut réaliser une coloration à chaud faisant intervenir du vert de Malachite, rincer à l’alcool, et faire une contre coloration à la safranine. Endospore Les spores seront colorées en vert et le cytoplasme des bactéries en rose. 2.3) Coloration à la nigrosine : La nigrosine est un colorant qui peut permettre la mise en évidence des cicatrices des bourgeonnements des levures. Sinon on l’utilise lors d’état frais pour augmenter le contraste de la préparation. 2.4) Coloration à l’encre de chine : L’encre de chine est obtenue à partir d’une suspension de particules de charbon. Du fait de la taille élevée des particules, celles -ci ne pénètrent pas dans la cellule. On observe donc des cellules non colorées sur un fond noir. Cette technique est une coloration négative, puisqu’on ne colore pas les cellules, ainsi on peut mettre en évidence la présence de capsules qui apparaissent blanchâtre autour de la cellule qui elle est réfringente. La technique consiste à placer sur une lamelle une goutte de la préparation et une goutte de colorant côte à côte. Et de déposer dessus une lamelle. Les deux gouttes se mélangeront, et on observera au grossissement x40. 10 Observation d’un mou de raisins Le mou de raisin est un mélange en solution aqueuse de raisins écrasés. Afin d’observer les différentes catégories de germes présents, nous avons réaliser des techniques microscopiques d’observation. Technique s d’observation Observations Etat Frais (G x40) Nigrosine (G x 40) On observe des bactéries en forme de bâtonnet qui ne possèdent pas de mobilité. On observe également des levures Coloration de spore (G x100) Coloration à l’encre de chine (G x 40) On observe des bactéries roses en forme de bâtonnet ne présentant pas de spores, et des levures roses. On observe des bactéries et des levures. Les bactéries ne possèdent pas d’halo blanc caractérisant la présence de capsule. On peut donc constater que le raisin possède plusieurs flores microbiennes : une d’origine bactérienne et l’autre de type levure. Ces deux flores sont nécessaires à la fabrication du vin. 11 Observation d’un jus de radis Technique s d’observation Etat Frais (G x40) Observations On observe des protozoaires. On observe des arthrospores. On observe également du pseudomycélium. Nigrosine (G x 40) Coloration de spore (G x100) Coloration à l’encre de chine (G x 40) On observe quelques capsules. Sélection des bactéries formants des endospores dans la suspension de radis Les spores sont des formes de résistances, afin de les mettre en évidence nous allons mettre dans des conditions de stress un aliquote de notre solution de jus de radis à 90°C pendant 20 min. Cette étape à pour but de tuer toutes les formes végétatives, et de sélectionner uniquement les formes sporulantes. Par étalement sur un milieu GN de notre aliquote chauffé et après incubation, on a obtenu des colonies correspondantes aux bactéries sporulées. Nous avons ainsi confirmé la présence de spores et isolé les bactéries sporulantes. 12 Etude de 6 souches de collection Gram Coloration de spores Coloratio n à l’encre de chine oxydase catalase Mobilité Bâtonnet à bouts carrés 1.5µ*4µ Mobilité + ou – par ciliature péritriche isolé Bacille violet gram + Exospores verte et spores déformantes subterminales - - + +/- Petit coque, immobile Petit coque, immobile Coque gram + violet, isolé, par 2, en amas, ou en tétrade - - + - Bacille 1µ*5µ Isolé Courte chaînette Bacille 1µ*5µ Isolé Courte chaînette Bacille a gram variable - - - - Bâtonnet ovoïde, groupé par 2 ou isolé Taille : 1-3µ Bâtonnet ovoïde, groupé par 2 ou isolé Taille : 1-3µ Bacille rose Gram – Isolé ou par 2 - - +++ Petit bâtonnet ovoïde de forme coccobacille Isolé, par 2 Taille : 1µ Petit bâtonnet ovoïde de forme coccobacille Isolé, par 2 Taille : 1µ Coccobacille rose gramIsolé, par 2 - - - Petit bâtonnet Isolé, par 2 Taille : 5µ Petit bâtonnet Isolé, par 2 Taille : 5µ Bacille rose Gram – Isolé, par 2 - + ++ Nom de la souche Aspect macroscopique Coloration à la nigrosine Etat frais Bacillu s megaterium Colonie blanche à bord crénelé de 0.5 cm de diamètre Bâtonnet à bouts carrés 1.5µ*4µ Mobilité + ou – par ciliature péritriche isolé Micrococcus flavus Colonie blanche-jaune, ronde, lisse, brillante, diamètre 1mm Waksmania sp Serratia marcescens Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Petite colonie ronde, bombée pigmentée en rose Colonie lisse, 1.5 mm de diamètre, rondes, bombées, bord réguliers, luisantes, jaunâtres Grande colonie plates de 2 à 3 mm de diamètre, transparente, bords frangés, aspect irisé, nacré 13 + Réalisation d’une courbe de croissance La croissance est définie comme l’accroissement ordonné de tous les composants d’un organisme. Chez les micro-organismes unicellulaires comme les bactéries ou les levures, elle aboutit à une augmentation du nombre d’individus résultant d’une division cellulaire. Cet accroissement est donc synonyme de multiplication, puisque au bout d’un temps correspondant au temps de génération, une bactérie peut donner naissance à deux nouvelles bactéries. Parallèlement, cette croissance se traduit par un appauvrissement en divers métabolites, et par l’accumulation de déchets entraînant la mort des cellules. Afin d’étudier la croissance, nous avons évalué le nombre de cellules en mesurant le trouble. C’est le procédé le plus simple et le plus rapide. C’est une méthode optique générale, appelée turbidimétrie, fondée sur la propriété que présente toutes les solutions d’absorber une partie de l’intensité d’un faisceau de lumière qui la traverse. Cette propriété est basée sur la loi de Beer Lambert ou log (I0/I) = .l.c. Il en découle que l’absorbance est proportionnelle à la concentration. Cependant cette loi n’est plus valable aux fortes concentrations, c’est pour cela que nous avons dilué nos échantillons lorsque la DO dépassait les 0.8. L’inconvénient de cette technique c’est qu’elle est incapable de différencier les cellules mortes des cellules vivantes et de mesurer des 6 concentrations microbiennes inférieurs à 10 bactéries/mL. C’est pour cela que nous avons réalisé une préculture en milieu BN 24h auparavant. Celle-ci avait pour but d’obtenir une culture jeune avec un fort inoculum, et aussi d’habituer la souche au milieu de culture, permettant ainsi de diminuer la phase de latence qui correspond au temps d’adaptation de la bactérie. Nous avons réalisé des courbes de croissance sur deux souches différentes : Un coque gram + : Micrococcus flavus Un bacille gram - : Escherichia coli Les courbes ont été obtenues en traçant l’évolution de la densité optique en fonction du temps, toutes les 30 minutes environ. La croissance est constituée de différentes phases, dont la phase exponentielle de croissance. Durant cette phase l’absorbance, donc le nombre de cellules, augmente de façon exponentielle et ln (nb cellules) est proportionnel au temps. Cette phase permet de déterminer deux paramètres : - Le temps de génération - Le taux de croissance népérien C’est ces paramètres que nous allons calculer ; ce sont des caractères propres à chaque espèce. Nous allons utiliser du papier semi-log ce qui permettra de reporter directement les valeurs de DO, tout en linéarisant la phase exponentielle de croissance. 14 Explication des différentes phases de la croissance On a remarqué que si on représente la fonction ln N = f (t), on obtient une zone linéaire pendant la phase où N augmente (phase exponentielle de croissance). Phase Phase de latence Description Elle est facultative. Quand elle existe, elle correspond à une phase d'adaptation des bactéries au milieu. Les bactéries ne se divisent pas (ou trop peu pour mesurer la variation). Elle est absente quand l'inoculum est jeune et que le milieu est le même que le précédent. Cette phase correspond au temps nécessaire aux bactéries pour synthétiser les enzymes nécessaires pour dégrader le milieu et pour ajuster certains paramètres comme le pH. Phase Les bactéries se multiplient de plus en plus activement d'accélération Les bactéries se multiplient à leur rythme le plus élevé. Le ln de N est Phase directement proportionnel eu temps. C'est la phase physiologique (production exponentielle d'antibiotiques et de toxines. La représentation est une droite d'équation : de croissance Phase de Lorsque les nutriments se raréfient, la croissance ralentit, le phénomène ralentissement s'accentue plus les nutrime nts se raréfient. La biomasse est stable. Deux explications sont envisageables : - Les bactéries ne se divisent plus ; Phase - Il y a autant de bactéries qui se divisent que de bactéries qui meurent. stationnaire Elle peut être due à la disparition d'un ou plusieurs nutriments, à l'acidification du milieu et, ou surtout à l'accumulation de déchets toxiques. Phase de Les bactéries ne se divisent plus, certaines meurent et sont lysées. Leur nombre déclin N diminue. 15 Valeur de µ x (vitesse spécifique de croissance) en h-1 µx = 0 (ln N = ln N o) µx ↑ (G↓) µx = µmax µx ↓et tend vers 0 µx = 0 µx < 0 Temps de génération : Le temps de génération (en min) est le temps de doublement de la population bactérienne, c'est l'intervalle de temps compris entre 2 divisions bactériennes en phase exponentielle.. Taux de croissance : 1) Escherichia coli : 1.1) Préculture : Un jour avant de réaliser notre courbe de croissance, nous avons ensemencé 2 mL de bouillon BN à l’aide d’un clone de la bactérie. Nous avons mis le tube à incuber sous agitation au bain marie pendant la nuit à 30°C. 1.2) Expérience : Dans un premier temps nous avons étalonné le spectrophotomètre. Nous avons donc transféré dans une cuve 1mL du milieu BN restant contenu dans notre flacon, et nous avons étalonné le spectrophotomètre. Ensemencement Préalablement nous avons mesurer la Do à 600 nm afin d’avoir une estimation de la concentration de l’inoculum. On veut obtenir une absorbance inférieure à 0.1 dans notre Bouillon nutritif de 100 mL au temps t=0 initial. Préalablement j’ai dilué la culture au 1/20ème (50 L dans un volume final de 1000µL), ce qui a donné une DO de 0.395 pour 1mL soit une DO de 7.9 pour l’échantillon non dilué. 1 ml de la culture dans les 100 mL de bouillon nutritif donnerait donc une Do de 0.08. On a donc inoculé les 100 ml de milieu BN à l’aide de 1mL de la préculture. On a laissé la pipette cotonnée qui nous a servi à l’inoculation dans l’erlen en la callant avec le coton cardé. On agite la solution pour l’homogénéiser et on prélève 1 mL pour réaliser la mesure de l’absorbance au temps t=0. On replace alors l’erlen sous agitation au bain marie à 30°C, c’est le temps zéro de l’expérience. Mesure de la croissance : Toutes les 30 minutes, on prélève 1 mL de la culture en cours afin de suivre l’évolution de l’absorbance et tracer la courbe de croissance. Rq : On a toujours utilisé la même cuve pour faire les mesures qu’on a rincé entre temps à l’eau. 16 Résultats : Temps Dilution DO avec Dilution DO 0 30 Aucune Aucune 0,122 0,125 0,122 0,125 60 90 120 Aucune Aucune Aucune 0,163 0,213 0,28 0,163 0,213 0,28 150 180 Aucune Aucune 0,364 0,516 0,364 0,516 210 240 Aucune ½ 0,798 0.5 0,798 1 270 300 ½ ½ 0.595 0.715 1,19 1,43 On a dilué à partir du temps t=240 min, car le spectrophotomètre ne donne plus de réponse linéaire au-delà d’une absorbance de 0.8, ainsi que la loi de Beer Lambert qui n’est plus valable. 2) Calcul des différents paramètres de la croissance Nom de la souche Temps de génération (min) Taux de croissance (min-1) Escherichia coli 75 0.009min-1 0.54 h-1 On a pu constater sur le graphique une augmentation de l’absorbance au temps t= 3h et ensuite une diminution au temps t= 3h30. Ce changement correspond à une élévation de température et un retour à la température initiale, on est passé de 28°C à 30°C puis on est retourné à 28°C. De ce fait on a pu voir que le temps de génération n’est une constante pour un germe donné que dans des conditions données. Le temps de génération est différent pour chaque microorganisme. On peut s’en servir pour obtenir un nombre de cellules à un temps donné. 17 Etude microbiologique de produits L’étude microbiologique d’un produit à pour but de mettre en évidence et de dénombrer les microorganismes présents, comme les bactéries, les levures, ou les moisissures par l’utilisation de milieux sélectifs adéquats. Par la suite, l’étude des caractères biochimiques permettra éventuellement de caractériser ces microorganismes. Les microorganismes contenus à l’intérieur du produit à analyser doivent être extraits puis ensemencés en milieu solide ou liquide. Le choix des milieux et des conditions de culture (température) est important et l’utilisation de plusieurs milieux sélectifs permettra d’isoler l’ensemble de la flore microbienne. On utilisera donc pour la recherche des bactéries, le milieu GN. La recherche des entérobactéries se fera sur milieu sélectif au pH neutre : EMB La recherche des levures et moisissures se fera sur milieu complexe sélectif au pH acide : Ma+chloramphénicol. L’extraction des microorganismes du produit à analyser devra être adaptée au type de produit à analyser. Pour un produit solide comme la terre, un broyat en présence d’un solvant facilitant la dispersion des cellules (eau physiologique) a été réalisé. Pour le lait, milieu liquide, aucun traitement particulier n’a été nécessaire. 18 1 Analyse microbiologique et dénombrement d’un échantillon de sol Extraction et analyse microbiologique d’un échantillon de sol 1) Prélèvement Afin de déterminer la flore présente dans le sol, nous allons prélever de façon le plus stérilement possible, un échantillon de terre afin de limiter l’apport d’autres contaminants. On veillera à prélever une masse supérieure à 10g. Puisque par la suite nous aurons besoin de deux fois 5g de terre, une pour déterminer le poids sec, l’autre pour déterminer la flore présente. 2) Extraction A partir de cet échantillon, nous allons peser deux fois 5g de terre. Le contenu de la première pesée sera placé dans un bêcher et placé au four pasteur pendant 6h à 180°C afin de déterminer le poids sec. Le contenu de la deuxième pesée est placé dans un mortier en présence de 30 mL de solution d’extraction (eau physiologique). L’eau physiologique constitue un milieu isotonique qui empêche la lyse des cellules, en maintenant une pression constante de part et d’autre de la cellule. On broie alors à l’aide d’un pilon le produit, puis on transvase dans un tube gradué de 50mL. L’ensemble de l’étape d’extraction se réalise dans des conditions stériles autour du bec bunsen avec du matériel stérile. Le pilon et le mortier sont rincés avec la solution d’extraction afin de récupérer toute la terre présente. Puis le tube est complété à 50 mL avec la solution d’extraction. Nous étant trompé notre volume final était de 53 mL .L’échantillon est homogénéisé au vortex puis on laisse reposer pendant 15 min. 3) Calcul du poids sec Après avoir mis dans un bêcher un poids connu et précis de terre. On place celui ci au four pasteur pendant un temps minimum de 6h. Ainsi on s’affranchira du taux d’hydratation de la terre qui varie en fonction des conditions atmosphériques et du lieu de prélèvement. Ceci est nécessaire pour comparer des échantillons prélevés à des lieux différents, puisqu’on ne prend plus en compte que la masse de la terre sèche. Masse du bêcher 46.73g Masse terre humide = 4.97g Masse du bêcher + terre humide 51.70g Masse bêcher + terre sèche 47.99 Masse terre sèche = 51.7-47.99=3.71g On dispose donc de 3.71g de terre sèche. Il y avait donc ((4.97-3.71)/4.97)x100=25% d’humidité dans la terre. Pour la suite des calculs on considèrera que la masse de terre humide était de 5g. 4) Dilutions -1 -9 Les microorganismes en suspension sont dilués en cascade de 10 à 10 . Le transfert de 1mL de la er suspension préparée précédemment dans le 1 tube contenant 9 mL de solution de dilution -1 constitue la dilution 10 . On homogénéisera à l’aide d’un vortex et on procédera de la même -1 manière, en prélevant 1 mL dans le tube 10 pour le transférer dans le tube 2, on homogénéise, et ainsi de suite. 19 5) Ensemencement A partir des dilutions, les microorganismes dilués sont étalés sur boîtes de milieu nutritifs et inoculés en milieu nutritif liquide. 6) Dénombrement Afin de déterminer le nombre de microorganismes contenus dans notre échantillon de terre, nous allons utiliser deux techniques de dénombrement : Une technique de comptage sur boite Une technique statistique : le test de Mac Grady faisant intervenir un paramètre : le MPN (most popular number) ou NPP (nombre le plus probable) 6.1) Comptage sur boite Afin de dénombrer des microorganismes sur milieu solide, il faut considérer que chaque colonie ou clone visible correspond à un microorganisme déposé sur la boîte lors de l’étalement. Vue que certains microorganismes peuvent être pluricellulaire, on ne peut considérer que chaque clone provient d’une seule cellule originelle. On utilise donc le terme d’UFC (unité formant colonie) pour rapporter le résultat obtenu On réalisera donc des étalements en surface de 0.1mL des différentes dilutions précédemment préparées, en inoculant 3 boîtes par dilution. Un nombre trop faible ou trop important de colonies sur une boîte n’étant pas statistiquement fiable, seules les boîtes contenant entre 30 et 300 colonies seront prises en comptes. Le milieu MA va servir à la multiplication des champignons Le milieu GN va servir à une multiplication non sélective des bactéries Le milieu EMB va servir à la présélection de notre souche isolée d’entérobactérie Milieu MA Dilution 10-3 10-4 10-5 Boîte 1 Boîte 2 0 1 0 0 0 0 Boîte 3 Moyenne 3 1.33 0 0 Afin d’avoir un nombre statistiquement correct, on considère un nombre comptable entre 30 et 300 colonies. On prendra donc pour le calcul la dilution 10 -3 qui donne un nombre de 1.33 colonies. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent : N = 1.33 x 10 3 x 10 = 1.33 x 104 UFC/mL dans le sol. Ces germes correspondraient aux levures. Milieu GN Dilution 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 Boîte 1 Boîte 2 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Boîte 3 Moyenne 0 0.75 0 0 0 0 -5 La dilution 10 donne un nombre de 0.75 UFC. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent : N = 0.75 x 10 5 x 10 = 7.5 x 105 bactéries/mL dans le sol. Il y aurait donc 7.5 x 105 bactéries, toutes flores confondues, dans un mL de suspension de terre. 20 Milieu EMB Dilution Boîte 1 10-2 84 10-3 6 10-4 0 Boîte 2 Boîte 3 Moyenne 111 105 100 13 10 10 0 1 Afin d’avoir un nombre statistiquement correct, on considère un nombre comptable entre 30 et -2 300 colonies. La dilution 10 donne un nombre de 100 UFC. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent : 2 5 N = 100 x 10 x 10 = 1 x 10 bactéries/mL dans le sol. Ces germes correspondraient aux Entérobactéries. 6.2) Test de Mac Grady (NPP: technique du nombre le plus probable) Une utilisation de l’analyse statistique peut être faite pour obtenir des résultats plus précis en milieu liquide. Cette technique utilise trois essais par dilution. C’est la méthode du nombre le plus probable (NPP), dérivée des études de Mac Grady, qui consiste à interpréter les résultats en comparant les trois essais et leurs résultats. Il s’agit d’une interprétation probabiliste. Après incubation des tubes, on notera pour chaque essai si le résultat est positif ou négatif. Et, à chaque dilution, on affectera un chiffre égal au nombre de tubes positifs. On groupe ensuite en nombre de 3 chiffres la suite de chiffres obtenue, en commençant par le chiffre obtenu pour la plus faible dilution. Dilution 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 Tube 1 Tube 2 + + + + + - - - - Tube 3 Nb de tube + + 3 2 1 0 0 0 Ici nous obtenons les nombres : 321 210 100 On choisi le nombre le plus grand possible et si possible inférieur à 330 (car cela correspond à une meilleure répartition dans les dilutions). Pour l’échantillon de sol le nombre significatif est 321 pour la dilution 10 -4. On lit la valeur correspondante n dans la table, on obtient un NPP de 15 La concentration de bactérie dans notre échantillon de sol est: -4 5 4 Nb bactérie = (n/10 )= 1.5 x 10 bactéries/mL de la dilution 10On départ on avait 53 mL dans lesquels on à prélevé 0.5 mL, ce qui correspond à : 5 7 (1.5 x 10 x 53)/0.5 = 1.59 10 bactéries/ml Dans nos 53ml de départ, il y avait 5g de terre humide soit 3.71g de terre sèche. Le nombre de bactérie par gramme de terre sèche est : 7 6 1.59 10 / 3.71 = 4.28 10 bactéries / gramme de terre sèche. 6 Notre échantillon de sol à une concentration en bactérie de 4.28 10 bactéries/ gramme de terre sèche. 21 2 Analyse microbiologique et dénombrement d’un échantillon de lait cru 1) Dilutions Nous avons préparé une gamme de dilution en NaCl 0.9% de 10 -1 à 10-4. Pour cela nous avons placé au préalable 4.5 mL de NaCl dans chaque tube. Nous avons homogénéiser l’échantillon de lait cru, prélever 0.5 mL et dilué dans le tube 1 (10 -1). Nous avons bien homogénéisé entre chaque prélèvement, et transvaser 0.5 mL du tube 1 vers le tube 2. Nous avons répété cette opération jusqu’au tube 4 (10-4) en réalisant une dilution en cascade de 10 en 10. 2) Enrichissement/sélection -2 -4 A partir des dilutions 10 à 10 , nous allons procéder à l’étape d’enrichissement sélection grâce à l’utilisation de milieux sélectifs. Pour cela nous allons inoculer 0.1 mL sur les milieux GN MA EMB, en utilisant trois boîtes par dilution. 3) Comptage sur boite Afin de dénombrer des microorganismes sur milieu solide, il faut considérer que chaque colonie ou clone visible correspond à un microorganisme déposé sur la boîte lors de l’étalement. Vue que certains microorganismes peuvent être pluricellulaire, on ne peut considérer que chaque clone provient d’une seule cellule originelle. On utilise donc le terme d’UFC (unité formant colonie) pour rapporter le résultat obtenu Un nombre trop faible ou trop important de colonies sur une boîte n’étant pas statistiquement fiable, seules les boîtes contenant entre 30 et 300 colonies seront prises en comptes 4) Résultats Milieu MA (Sélection des champignons) Dilution 10-2 10-3 10-4 Boîte 1 Boîte 2 Boîte 3 164 180 198 20 8 11 0 0 12 Moyenne 181 13 4 Afin d’avoir un nombre statistiquement correct, on considère un nombre comptable entre 30 et 300 colonies. On prendra donc pour le calcul la dilution 10 -2 qui donne un nombre de 181 colonies. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent : 2 4 N = 181 x 10 x 10 = 1.81 x 10 UFC/mL dans le lait cru. Ces germes correspondraient aux levures. 22 Milieu GN (développement non sélectif de la totalité de la flore) Dilution Boîte 1 10-2 inc 10-3 inc 10-4 276 Boîte 2 Boîte 3 Moyenne inc inc inc inc inc inc 262 300 280 -4 La dilution 10 donne un nombre de 280 UFC. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent : 4 7 N = 280 x 10 x 10 = 2.8 x 10 bactéries/mL dans le lait cru. 7 Il y aurait donc 2.8 x 10 bactéries, toutes flores confondues, dans un mL de ce lait cru. Milieu EMB (développement sélectif du genre Entérobactérie) Dilution Boîte 1 10-2 inc 10-3 444 10-4 Pb Boîte 2 Boîte 3 inc inc Pb Pb Pb Pb Moyenne inc 444 Pb -3 La dilution 10 donne un nombre de 444 UFC. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent : 3 6 N = 444 x 10 x 10 = 4.44 x 10 bactéries/mL dans le lait cru. Ces germes correspondraient aux Entérobactéries. 23 Identification d’un bacille gram – oxydase – Réf : lait 2 Origine : lait Isolement à partir de EMB Vérification du genre Enterobacteriacea a) Négrosine La coloration à la nigrosine a pu mettre en évidence la forme bacillaire de la bactérie. b) Coloration de Gram On a observé des bacilles roses gram -. c) Encre de Chine La coloration à l’encre de chine n’a pas révélé la présence de capsule. d) Oxydase La bactérie ne possède pas l’oxydase. Tous ces tests confirment bien la présence d’une Entérobactérie Vérification du type fermentaire : Hugh et Leifson Les entérobactéries dégradent les oses, en particulier le glucose, par voie fermentaire en produisant des acides organiques. Pour mettre en évidence la fermentation d’un sucre, il suffit donc de rechercher la variation de pH du milieu grâce à un indicateur coloré. Grâce au milieu Hugh Leifson, nous allons étudier la voie d’attaque du glucose. Ce milieu, faiblement peptoné, contient du glucose à la concentration de 1% et du bleu de bromothymol comme indicateur de pH. Il est présenté en culot, du fait de sa consistance molle. Après régénération (élimination de l’O2 dissous par passage au bain marie) et refroidissement, on a ensemencé par piqûre centrale 2 tubes en parallèle : - un tube est recouvert d’huile minérale, il est dit fermé :F - l’autre est laissé au contact de l’air : il est dit ouvert :O Les résultats obtenus permettent de distinguer plusieurs catégories de bactéries. Bactéries acidifiant le milieu : - acidification dans les deux tubes : bactéries fermentatives. - acidification en surface dans le tube ouvert : bactéries oxydatives. Bactéries ne modifiant pas le pH du milieu : bactéries inactives. «F» «O » Culture et virage au jaune en « O » et « F » «F» «O» Culture et virage au jaune en surface dans « O » seul 24 «F» «O» Peu ou pas de culture en « F », culture en « O » mais pas de virage Détermination de la sensibilité de la bactérie aux antibiotiques 1) Définition Antibiotique : C’est une substance chimique produite par un microorganisme qui est capable d’inhiber la croissance (bactériostase) ou de tuer (bactéricide) certaines bactéries. De nombreux antibiotiques sont susceptibles d’être obtenus par synthèse, de ce fait, la discrimination entre antiseptique et antibiotique repose essentiellement sur leur mode d’action : Un antibiotique est électif, dirigé uniquement contre les bactéries, agit rapidement et à faible dose. Alors qu’un antiseptique est global, détruisant à la fois les germes et les cellules vivantes. 2) Antibiotiques utilisés et leurs cibles Les agents antimicrobiens peuvent être classés en familles d’après leur origine, leur spectre d’action, leur mode d’action. 25 Durant ce Tp nous avons testé trois antibiotiques : - Tétracycline - Ampicilline - Pénicilline Ces trois antibiotiques ont des cibles différentes : Antibiotiques inhibiteurs de la synthèse protéique : Différentes classes d'antibiotiques agissent en interférant avec la synthèse protéique bactérienne, et ce, au niveau de l'une des trois étapes principales de la traduction : - l'initiation - l'élongation - la terminaison Les ribosomes procaryotes présentent un coefficient de sédimentation de 70S (50S pour la sous-unité lourde et 30S pour la sous-unité légère). La sous-unité 50S comporte les ARN ribosomaux (ARNr) 5S et 23S alors que la sous-unité 30S intègre l'ARNr 16S (impliqué dans la reconnaissance de la séquence de Shine-Delgarno de l'ARN messager, aboutissant à l'initiation de la traduction). Les tétracyclines sont des antibiotiques isolés de souches de Streptomyces , et aujourd'hui obtenus par hémisynthèse. Les tétracyclines inhibent la synthèse protéique en empêchant la liaison de l'aminoacyl-ARNt à la sous unité 30 S du ribosome bactérien. Ce sont des composés bactériostatiques à très large spectre. Néanmoins, leur usage est aujourd'hui limité par l'émergence de résistances. Les tétracyclines doivent leur nom à leur structure tétracyclique commune (noyau naphtacène-carboxamide), sur laquelle viennent se greffer des substituants au niveau des positions indiquées par un astérisque dans la figure cidessous. Tétracycline hydrochlorure (masse moléculaire : 480,9) 26 Les -Lactamines : Les -lactamines sont des inhibiteurs de la synthèse de la paroi bactérienne. Ces composés n'agissent donc que sur des bactéries se multipliant activement. Durant ce Tp, nous avons utilisé deux lactamines : - La pénicilline - L’ampicilline La pénicilline appartient à la famille des lactamines. Lorsque les bactéries gram+ ou gramsont en croissance et traitées par des pénicillines, la synthèse de leur paroi est stoppée. On peut observer que les cellules s’accroissent mais que la paroi diminue progressivement. La pression osmotique augmente à l’intérieur de la cellule, qui finit par éclater. Au niveau du peptidoglycane les pénicillines empêchent l’incorporation des peptides dans les chaînes polysaccharidiques de la paroi. Il se forme alors un complexe non fonctionnel [peptidasepénicilline]. La pénicilline empêche la construction de la paroi en bloquant deux enzymes : Transpeptidases qui a pour rôle de faire rentrer les tétrapeptides Carboxypeptidase, qui décroche la 2ème D-Ala. L’ampicilline est aussi appelée aminopénicilline. Elle appartient également à la famille des lactamines comme la pénicilline, et possède le même mode d’action. Elle arrête le processus de transpeptidation qui lie les peptidoglycannes de la paroi bactérienne. Les bêta lactamines se lient et inactivent des cibles enzymatiques situées sur la paroi interne de la membrane bactérienne: les protéines de liaison des pénicillines : transpeptidases, carboxypeptidases, endopeptidases. Les bêta lactamines inactivent également des inhibiteurs endogènes des autolysines bactériennes. 27 3) Antibiogramme par la méthode des disques L’antibiogramme est l’examen de pratique courante qui permet d’étudier commodément sur une souche bactérienne l’activité bactériostatique d’antibiotique choisi en fonction de leur spectre d’activité et d’apprécier les résistances acquises. Principe : La culture bactérienne est réalisée à la surface d’une gélose GN. Des disques préimprégnés d’une dose connue d’antibiotique sont déposés à la surface de la gélose. L’antibiotique diffuse horizontalement et verticalement à partir du disque en créant un gradient de concentration minima inhibitrice. Les caractères de sensibilité ou de résistance de la souche bactérienne en seront déduits. La mesure du diamètre de la zone d’inhibition de la bactérie peut être reliée à la concentration de l’antibiotique à ce niveau : cette concentration est la concentration minima inhibitrice ou CMI de la souche pour cet antibiotique. Technique de l’antibiogramme : Les différentes étapes de la réalisation de l’antibiogramme sont standardisées ; Il y a l’ensemencement : on verse 0.2 mL à la surface du milieu qu’on réparti a l’aide d’un râteau ou de billes de verre. On laisse sécher les boîtes Ensuite nous appliquons les disques : Les disques ne doivent pas être trop près les uns des autres, et ils ne doivent pas être déplacés une fois posés. On veillera à ne pas les chauffer avec la pince flambée. Il faut en dernier lieu qu’il y ait prédiffusion avant d’incuber la boîte : on laisse les boîtes à température ambiante, puis on les incubent 18h à l’étuve à 37°C. Lectures et interprétation : Aux diamètres mesurés autour du disque, permettant l’estimation de la CMI, on peut associer les diamètres critiques eux-mêmes correspondant à deux concentrations critiques, concentration critique supérieure et concentration critique inférieure. La comparaison de la CMI aux deux concentrations critiques permet de déterminer le caractère sensible (S), intermédiaire (I) ou résistant R de la souche. La comparaison des diamètres permettra la même opération : - diamètre d’inhibition (correspondant à la CMI) > diamètre de la concentration critique inférieure souche sensible S - diamètre d’inhibition < diamètre de la concentration critique supérieure : souche résistante - diamètre d’inhibition compris entre les deux diamètres des concentrations critiques : souche intermédiaire. mm CMI mg/L Concentration critique inférieure S Concentration critique supérieure 28 I R Résultats : Sigle de l’ATB Nom de l’antibiotique TE AM Tétracycline Ampicilline Diamètre d’inhibition (mm) 20 Pas de halo P Pénicilline Pas de halo Schéma explicatif pour la tétracycline : 19 17 mm S I R CMI mg/L 4 8 29 Interprétation Par rapport au diamètre > 19 Interprétation CMI CMI < 4mg/L Résultat S R R 4) Détermination de la CMI, méthode en tubes 4.1) Définition de la CMI La CMI est la concentration minimale inhibitrice. C’est, pour un temps donné d’application de l’antibiotique, la concentration la plus faible en antibiotique pour laquelle on n’observe aucune croissance (µ x= 0). 4.2) Principe de la détermination de la CMI Il consiste à placer dans un même inoculum de la souche à étudier (présentée en tubes), des concentrations croissantes d’antibiotiques selon une progression d’ordre 2 et en présence d’un témoin sans antibiotique. Les tubes sont incubés à 37 °C pendant 24 H la concentration du premier tube ne présentant pas de culture correspond à la CMI. 4.3) Schéma montrant la préparation de la galerie de dilution et l’ensemencement de dilution et l’ensemencement de la gamme Afin de déterminer la CMI (concentration minima inhibitrice), nous allons réaliser une gamme de dilution de l’antibiotique. On va donc préparer 10 tubes - tube 2 à 9 contenant 5 mL de milieu BN Tube 1 contenant 10 mL de milieu BN Rien dans le tube 10 Dans le tube 1, nous allons rajouter de la tétracycline afin d’avoir une concentration finale de 150 µg/mL. Pour cela, on dispose d’une solution initiale à 10 mg/ml. CiVi = CfVf Vi = (CfVf)/Vi Ci : concentration initiale en ATB : 10 mg/mL Cf : concentration finale en ATB 150 µg/mL Vf : volume du tube : 10 mL Vi : volume de solution mère à prélever -6 -3 Vi = (150.10 x 10) / (10.10 )= 0.15 mL soit 150 µL Il faudra donc introduire 150 µL de la solution mère d’antibiotique dans le tube 1 afin d’obtenir une concentration de150 µg/mL. Ensuite, il sera réalisé une dilution géométrique de raison 2 de l’antibiotique. Nous prélèverons après homogénéisation 5 mL du tube 1 que nous transvaserons dans le tube 2. Cette étape sera répétée jusqu’au tube 10. 30 Ce n’est qu’après dilution de l’antibiotique que nous allons incorporer la bactérie. Tube [ATB] µg/mL Résultat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 150 75 37.5 18.75 9.375 4.6875 2.34375 1.171875 0.5859375 0.5859375 - - - - + + + + + + Absence de culture : Présence d’une culture : + La présence ou l’absence de culture se traduit par la présence ou non d’un trouble due à un développement bactérien. -1 4.4) Lecture de la galerie (représentation, détermination de la CMI en µg.mL ) Témoin - - - - + + + + + + Le tube contenant 18.75 µg/mL est le premier ne présentant pas de culture, pour notre souche la concentration minimale inhibitrice est de 18.75 µg/mL. 31 5) DETERMINATION DE LA CMB 5.1) Définition de la CMB La CMB est la concentration minimale bactéricide. C’est pour un temps donné la plus faible concentration pour laquelle le nombre de bactéries survivante est inférieur à 1/10 000 (ou 0,01%). 5.2) Schéma de la technique de détermination de la CMB Afin de déterminer la CMB : concentration minima bactéricide, nous allons étaler une goutte de nos tubes 1 à 6 qui ont servi à réaliser le test de la CMI. Afin de vérifier que lorsque il n’y a plus de trouble, cela signifie qu’il n’y a plus de culture et donc qu’on à atteint la CMB. Incubation : 37 °C, 24 h. 5.3) Lecture : schéma de l’observation de la gélose 6 5 4 3 2 1 On observe une décroissance du nombre de bactérie d’un demi de 6 à 1, correspondant aux dilutions de l’antibiotique, mais en aucun cas il y a inhibition de la croissance traduisant un effet bactéricide de la part de l’antibiotique. 32 5.4) Résultat de la CMB La concentration minimale CMB est supérieure à 150 UI.mL -1. 6) Conclusion des deux résultats CMI et CMB trouvés La CMI est très inférieure à la CMB (CMI << CMB), on peut en conclure que l’antibiotique, vis à vis de cette souche est bactériostatique (c’est à dire qu’il inhibe la souche mais ne la tue pas). Les concentrations dites bactériostatiques permettent à la population bactérienne de se développer mais en ralentissant la croissance ; alors que les concentrations dites bactéricides permettent de réduire le nombre initial de bactéries. 33 Réalisation de la galerie API20E : La galerie API est un ensemble miniaturisé d’une vingtaine de tests biochimiques. Ces systèmes sont variés et chacun cible l’identification d’un groupe particulier de bactéries. Nous allons utiliser dans ce Tp une galerie API20E qui cible l’identification du groupe des Entérobactéries. Préparation de l’inoculum : On a prélevé à l’aide de l’oese quelques colonies fraîchement isolées sur le milieu GN ensemencé la veille avec la souche à identifier. On introduit ces bactéries dans un tube contenant 5 mL d’eau physiologique et on homogénéise bien à l’aide d’un vortex. Inoculation de la galerie : Cupule Tube Il faut remplir tubes et cupules des tests CIT VP GEL, et remplir uniquement les tubes des autres tests. Il faudra créer une anaérobiose dans les tests ADH LDC ODC H2S URE en rajoutant de l’huile de paraffine dans leur cupule. Afin d’éviter la déshydratation de la galerie celle-ci sera placée dans une boîte d’incubation contenant des alvéoles qu’on remplira d’eau afin de créer une atmosphère humide. Puis incubée 24h minimum à 37°C. Lecture : La lecture de certains tests ne se fait pas directement : Dans la cupule TDA, il faudra rajouter une goutte du réactif TDA ; une couleur marron indique une réaction positive Une goutte du réactif IND sera ajoutée dans la cupule IND. Un anneau rouge traduira une réaction positive. Une goutte de réactif VP1 et VP2 sera ajouté à la cupule VP. Une couleur rose apparaissant au bout de 10 min indique une réponse positive. Rq : si la cupule GLU est positive, on pourra réaliser le test de la nitrate réductase en rajoutant Nit1 et Nit2, puis du zinc si la réaction est négative afin de mettre en évidence la présence éventuelle d’une nitrate réductase ainsi que son stade d’oxydation (NO 2 ou N2). 34 Résultats : En comptabilisant les résultats positifs et négatifs on obtient un profil numérique : 12055735 qui correspond à Rahnella aquatilis Quelques informations sur la bactérie trouvée Rahnella aquatilis était précédemment connu comme Enterobacter cloacae-like class H2. C’est dans les années 80 qu’elle est venue rejoindre la famille des Enterobacteriaceae . C’est une bactérie qui se rencontre qu’exceptionnellement dans les fèces et qui peut se multiplier dans des eaux de boisson de qualité relativement bonne. 35 Correspondance DO600 et nombre de cellules/ml Afin de déterminer la correspondance entre la DO et le nombre de cellules par mL Nous allons suspendre un peu de notre bactérie dans un tube contenant de l’eau physiologique. Après avoir dilué l’échantillon au 1/20ème ; on mesure la DO. On obtient : 0.08 d’unité d’absorbance. Ce qui correspondrait à une DO de 1.6 si l’échantillon n’était pas dilué. En se basant sur le fait que : 8 1 Do 10 cellules/mL au maximum On peut estimer le nombre de cellules : 8 1.6 DO 1.6 x 10 cellules/mL Sur un milieu, on considère un nombre comptable entre 30 et 300 UFC. Je choisi donc de calculer la dilution adéq uate afin d’obtenir 160 colonies. 8 6 La dilution de référence correspondante est : 1.6 x 10 / 160 = 10 Fautes de boîtes de milieu de culture nous n’avons pu encadrer cette dilution, nous avons réaliser les dilutions 10 -6 et 10 -7 en ensemencent en surface 2 boîtes par dilution avec 0.1 mL de la dilution. Nous avons obtenu les résultats suivants : Boîte 1 Boîte 2 10-6 Inc Inc 10-7 1600 1600 Moyenne Inc 1600 Ce qui correspond à un nombre de : 1600 x 10 7 x 1/0.1 = 1.6 x 1011 cellules/mL Une Do de 1.6 correspond à 1.6 x 10 11 Cellules/mL 11 Donc 1 x 10 cellules/mL correspondent à une DO de 1 11 Pour Rahnella aquatilis une DO de 1 correspond à une population de 1 x 10 cellules/mL 36 Actinomycètes LES MICRO-ORGANISMES DU SOL: SOURCE PRINCIPALE DES ANTIBIOTIQUES Les producteurs d'antibiotiques les plus féconds sont les Actinomycètales, un ordre de bactéries filamenteuses qui sont présentes dans le sol. Elles produisent plus de la moitié des antibiotiques.Les actinomycètes sont des bactéries filamenteuses, ramifiées, communément rencontrées dans la nature (sol, eau). Les Actinomycètes sont des Bactéries dont la croissance donne lieu à des colonies constituées d’hyphes, c’est -à-dire de filaments qui irradient, par croissance centrifuge, tout autour du germe qui leur a donné naissance. Cela explique leur dénomination : le mot « Actinomycètes » provient de deux substantifs grecs et signifie « Champignons à rayons » ou « Champignons rayonnants ». Les formes les plus évoluées des Actinomycètes rivalis ent en complexité morphologique avec les moisissures (Champignons imparfaits) mais en diffèrent radicalement puisque, comme toutes les autres Bactéries, ce sont des Procaryotes (cellules sans enveloppes autour du matériel génétique). Un corollaire de leur structure cytologique est le diamètre de leurs hyphes qui est de l’ordre de 0,5 mm, soit approximativement un dixième de celui de la plupart des hyphes fongiques. Les Actinomycètes sont les plus prolifiques de tous les micro -organismes en tant que producteurs d’antibiotiques. Parmi les espèces appartenant aux différents genres d’Actinomycètes, les Streptomyces sont les plus importants producteurs d’antibiotiques et autres métabolites secondaires. On peut estimer que 75% des antibiotiques isolés des Actinomycètes sont produits par des Streptomycètes - Les aminoglycosides (streptomycine, néomycine, kanamycine, gentamicine). - Les macrolides (érythromycine) ; - Les ansamycines (rifamycine) ; - Les bêta-lactames (thiénamycine) ; - Les peptides (viomycine, thiostrepton, actinomycine, pristinamycine) ; - Les anthracyclines (adriamycine) ; - Les tétracyclines (chlortétracycline, oxytétracycline) ; - Les nucléosides (puromycine) ; - Les polyènes (nystatine, candicidine, amphotéricine B) ; - Les polyéthers (monensine). Afin de mettre en évidence la présence de la sécrétion d’un antibiotique, nous allons dans un premier temps vérifier une des caractéristiques de l’espèce : la présence d’une structure filamenteuse caractéristique. Pour cela nous disposons sur une gélose GN, de 8 souches qui ont été isolées à partir de nos différents échantillons de sol. 37 Après observation microscopique, on constate que les souches 1 et 5 ne sont pas filamenteuses. En parallèle nous avons observé au gram une colonie sur milieu au char bon. C’est un milieu sélectif des actinomycètes. Les actinomycètes ont un aspect macroscopique caractéristique : Ceci nous a permis d’observer leur structure filamenteuse en spirale et ainsi caractériser l’appartenance ou non des souches 1 à 8 à l’espèce. Afin de voir la présence d’antibiotiques produit par les actinomycètes, on coule une surcouche BN + agar 0.5% + microorganisme testeur (9mL de BN + agar et 1 mL de culture) Nous avons réalisé cela sur 5 souches différentes : Escherichia coli Bacillus megaterium Serratia Marcescens Micrococcus flavus Pseudomonas aeruginosa 1 2 3 4 Escherichia coli 5 6 7 20 mm Bacillus megaterium 16 mm Serratia Marcescens Micrococcus flavus 23 mm 8 mm Pseudomonas aeruginosa On peut constater que la souche 7 sécrète un ou plusieurs antibiotiques auxquels Escherichia coli et Micrococcus flavus sont sensibles. On peut constater que la souche 4 sécrète également un ou plusieurs antibiotiques auxquels Bacillus megaterium et Micrococcus flavus sont sensibles. 38 8 Les Champignons microscopiques Les champignons microscopiques (mycètes) se divisent en deux groupes : - Les champignons unicellulaires ou « levures » - Les champignons filamenteux ou « moisissures » Levures 1) Les levures On appelle levures les champignons microscopiques de type unicellulaire ou présentant dans leur cycle biologique une phase cellulaire prépondérante. Il en existe deux classes : - ascomycètes : Les spores sont contenues dans un sac (ascospore) - basidiomycètes : Les spores se retrouvent dans des structures externes (basides). Possédant un polymorphisme fréquent au niveau de la taille ou de l’organisation : formes mycéliennes ou pseudo mycéliennes ; et pouvant parfois être polynucléé chez les levures faisant des mycéliums . C’est donc sur ces critères morphologiques et physiologiques que nous allons nous baser pour identifier les levures. La forme, la taille, le mode de reproduction (sexué ou asexué), sont donc une partie des caractères d’identification des levures. 2) Le dénombrement direct La méthode directe s’effectue à l’aide d’une cellule de comptage, on dénombre tous les germes aérobies ou anaérobies, vivants ou morts. Les germes sont dénombrés à l’aide d’une lame spéciale appelée « cellule de comptage ». Elle comporte un quadrillage calibré ou réseau. Sur la lame, on compte les cellules dans plusieurs champs microscopiques. Le résultat du dénombrement s’exprime en nombre de cellules par mL. 39 2.1) La cellule de Thoma Le quadrillage de la cellule de Thoma est constituée d’un grand carré de 1mm de côté (rstu) divisé en 400 petits carrés de 0.05 mm de côté. Certains petits carrés sont regroupés par 16 en carrés moyens de 0.2 mm de côté, séparés les uns des autres par une rangée de petits carrés striés (rstu). 40 Lorsque la lamelle plane est déposée sur la plate-forme centrale, la profondeur de la chambre est de 0.1 mm. La chambre correspondant au grand carré a un volume de : V = 1 * 1 * 0.10 = 0.1 mm 3 Le parallélépipède correspondant au carré moyen a un volume de : V = 0.20 * 0.20 * 0.10 = 0.004 mm3 Ici, nous appliquons la technique de comptage directe aux levures. 3) Comptage des levures à la cellule de Thoma Résultats : En comptant dans un carré moyens nous trouvons : 14 33 34 33 20 20 20 17 9 17 27 20 19 19 16 15 Observation de levures en cellule de Thoma 3 Ce qui fait un total de 323 levures dans un volume de 0.004 mm soit dans 4.10 Le nombre de levures par mL est donné par la formule : N= 323/4.10 -6 Il y a donc 8.1 x 107 levures/mL 41 -6 mL 4) Observation de levures de collection Nom Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces lactis Pichia scolyti Klockera apiculata Saccharomyces oviformis Debaromyces sp Trichosporon sp Taille (µm) Forme Mode de division Formation de Pseudomycélium 10 Sphérique Bourgeonnement Pseudomycélium 5 Ovoïde Bourgeonnement Tubes germinatif s 5 Sphérique (unicellulaire) Bourgeonnement 5 Apiculée Bourgeonnement 7 Ovoïde Bourgeonnement 5 Sphérique Bourgeonnement 9 6 Sphérique cylindrique Pseudomycélium Mycélium Tubes germinatifs Arthrospores Schizosaccharomyces octosporus C’est une levure qui se divise par fission. Il contient des asques avec 8 spores Sporobolomyces salmonicolor C’est une levure ovoïde, qui se divise par bourgeonnement. La spore se situe au bout d’un pédicelle, et est remplie de liquide. Lorsque la pression est trop forte, la spore est éjectée. C’est ce qui se traduisait par les petites gouttelettes sous le couvercle de la boîte. Schéma : 42 5) Observation de nos levures A partir de nos isolements réalisé sur milieux Malt agar +Cloramphénicol, nous avons pu isoler 3 levures différentes provenant du lait. Souche 1 Taille (µm) 3 Forme Ovoïde 2 3 Ovoïde 3 3 Ovoïde 43 Mode de division Bourgeonnement polaire Bourgeonnement polaire Mycélium Bourgeonnement polaire Moisissures 1) Généralités On désigne sous le nom vaguement scientifique de moisissures toute une série de champignons appartenant en réalité à des groupes taxonomiques très divers. Tout aussi prolifiques que les bactéries, les moisissures sont capables de se dévelop per et de s'adapter à des conditions les plus extrêmes. Il en existe plusieurs dizaines de milliers d'espèces. Ces champignons microscopiques sont pluricellulaires, composés de filaments ou hyphes constituant un ensemble appelé mycélium. Ce mycélium peut porter des structures de reproduction avec des spores souvent nombreuses, dont la dimension peut varier de 1 à plusieurs dizaines de microns, suivant les espèces et le type. Il existe deux modes de reproduction: sexué et asexué(s). Dans le cas de la reproduction asexuée, le champignon émet une multitude de spores minuscules. L'identification se fait, entre autres, en fonction des caractéristiques du "porteur de spores " ou conidiophore (asexué). En l'absence de conidiophore, on parle de mycélium stérile, car l'identification n'est pas réalisable. Les moisissures sont connues pour les substances anti-bactériennes qu’elles sécrètent : les antibiotiques ; elles synthétisent également des toxines, ou mycotoxines, et des substances volatiles pouvant être hautement nuisibles pour la santé. L'identification des espèces repose sur des critères morpho-ontogéniques qui accordent une grande importance à l'aspect macroscopique du champignon (aspect, couleur et odeur des colonies), à la morphologie des spores et à l'ontogénie de ces spores, c'est-à-dire la conidiogenèse (aspect, couleur et structure des conidiophores). 2) La méthode d’observation Le plus souvent, l'observation microscopique des moisissures ne requiert aucune coloration. Cependant, en mettant un colorant, on peut mettre en relief certaines structures. Les deux colorants les plus utilisés sont le "bleu coton" et le "lactofuschine". 2.1) Le colorant utilisé Bleu coton lactique C’est une solution à 0,1% de bleu coton dans de l’acide lactique pur ou dilué de moitié. Il colore le contenu cellulaire et certaines ornementations sporiques et permet la mise en évidence de la "cyanophilie" (coloration bleue des spores ou des hyphes par le colorant). 44 2.2) La préparation La méthode consiste à découper au ¾ du champign on, à l’aide d’un scalpel un petit morceau rectangulaire. De le déposer sur une lame sur la tranche et d’enlever au maximum la gélose en surplus.Après il suffit de mettre dessus une petite goutte de colorant, et de déposer une lamelle. A l’aide d’une allumette on tapotera dessus afin d’écraser la préparation. On pourra s’aider de la veilleuse du bec bunsen pour réchauffer la gélose, en faisant attention à ne pas trop chauffer. La préparation s’observe comme un état frais, au grossissement x40. 3) Observation de nos souches 3.1) Souche n°1 Colonie : thalle bleu vert, d’aspect poudreux, colonie rase, marge blanche. Revers orangé. Hyphes : cloison nombreuses septomycètes Conidies : Elles sont de forme sphérique, de 2µ de large, ne possèdent pas de cloisons, à paroi lisse et vert clair. 3.2) Souche 2 Colonie : aérienne, avec des spores noires, poilue, grise, filamenteuse, possédant un revers jaunâtre peu coloré, très envahissante Hyphes : Ils sont assez gros, de taille homogène 10-20 µm, peu cloisonnés siphomycètes Conidies : Elles sont de forme ovale 4µx7-10µ, ne possèdent pas de cloison, de couleur jaune-gris. L’ornementation est fine et légèrement rugueuse L’arrangement peu être différent : Columelle 45 4) Observation de souches de collection Geotrichum (Septomycètes) Colonie : thalle blanc à croissance rapide, blanc lisse, souvent d'aspect membraneux ou velouté, à odeur douçâtre. Revers clair. Hyphes : septés rampants, à embranchements dichotomiques de 8-10 µm d'épaisseur. Conidies : rectangulaires de taille 5-10×3-6 µm à 20×10 µm, formées par désarticulation des hyphes fertiles, les chaînes sont le plus souvent aériennes, érigées. Mycélium Arthrospore ou arthroconidie 46 Aspergillus Colonie : marron -noire avec marge blanche, rase, plissée dessous, revers jaune. Hyphes : Deux types 1-5 µm et 10-15µm d'épaisseur. Conidies : Têtes conidiennes bisériées (quelquefois unisériées) radiées, de couleur vert jaune à vert-olive, rondes de taille 3-4 µm, lisse, en chaînette, et ne possédant pas de connectif visible, unicellulaire. Conidiophore : Conidiophores pouvant atteindre 1mm, à parois rugueuses renflée en vésicules sphériques à légèrement allongées, de 25-45 µm de diamètre. Spores : exogènes Phialides : verdâtres, de 6-10×4-6 µm, groupées sur les trois quarts supérieurs de la surface de la vésicule. Phialide Conidie Métule Spore ou conidie Conidiophore 47
