Dynamique et régulation cellulaire : La culture cellulaire in vitro permet de créer, à partir d'un petit bout de plante, un grand nombre de plantes du même type. Par exemple, sur une pomme de terre qui bourgeonne à l'obscurité, on peut récupérer les pousses, le fragmenter, le mettre en culture et récupérer un milliers d'individu provenant d'une même pousse. Les méthodes de culture cellulaire sont multiples et dépendent des espèces. On peut utiliser un embryon de plantes, un organe, un cal (cellule indifférencié) ou une cellule par exemple. Cultures cellulaires végétales : Historique et impact : 1. Totipotence des cellules végétales : L'idée que le noyau d'une cellule était le site pouvant régénérer tout un organisme à été émis par Haberlandt en 1902 : « Toute cellule végétale est capable de régénérer un nouvel organisme identique à celui dont elle est issue.» (pas vraiment possible sur toutes les cellules) De nombreuses cellules végétales sont totipotentes tandis que seul le zygote est totipotent chez les métazoaires. En 1965, Vasil et Hildebrandt on pu prouver que l'idée de Haberlandt était juste en régénérant un plant de tabac. 2. Historique de la culture in vitro : En 1934, White réussit à créer une culture de tomates en milieu in vitro via une racine de tomate. (Le milieu était composés d'eau, de sels minéraux, d'extrait de levure, du sucre et de l'auxine, seul hormone végétale connue à l'époque.) En 1939, Gautheret a permis le développement indéfini (On cultive aujourd'hui encore des cellules du premier cal de Gautheret) d'un cal de cellules dédifférenciées à partir d'un fragment de racine de carotte. Il s'agit de la première vrai culture in vitro (Dans du verre). Les cellules ayant poussé à partir de la racine différencié sont des cellules indifférenciés. En 1962, Murashige et Skoog mettent au point le premier milieu de base pour la culture in vitro : - Sels minéraux (macro et micro-éléments en g/L et μg/L) - Sucres (saccharose) - Vitamines (B) - Hormones (Auxine et cytokinines) - pH acide à 5,5 La culture est faite à température, lumière et hygrométrie contrôlée. Via cette technique, on a pu faire de la prolifération de méristème de tige, ce qui n'avait jamais été fait auparavant, le méristème ayant toujours été réfractaire à la multiplication végétative in vitro. Des substances organiques sont ajoutés parfois pour tenter de booster la croissance de plante, les espèces végétales ne répondant pas tous de la même façon à la culture in vitro (acides aminés, extrait de banane, pomme de terre, etc. ) 3. Activation de processus cellulaire programmés : Le fragment sectionné, blessé, doit cicatrisé pour ensuite régénérer spécifiquement le morceau endommagé. • • • 1ère étape : Dédifférenciation cellulaire : Une fois un fragment coupé et retiré de l'organisme mère, il perd les signaux de position, nutrition, dominance apical de l'auxine, etc. qu'il avait auparavant. Il redevient une cellule dédifférencié de cals. 2ème étape : Multiplication cellulaire 3ème étape : Redifférenciation cellulaires Certains résultats sont meilleurs : ➢ Quand les tissus d'origine du tissus de départ sont des tissus jeunes (embryons zygotiques immatures, hypocotyles (tissus en dessous du cotylédon) et cotylédons (pseudo-feuille poussant au début du développement de la plante) de germinations, méristèmes de plantes adultes). ➢ Quand les cellules sont diploïdes plutôt que polyploïdes. ➢ Chez certaines familles de plantes (Solanacées, Brassicacées (4 pétales formant une fleur (A. Thaliana, Choux, Carotte))) et certains génotypes au sein d'une famille (Tournesol) 4. Développement d'explants pluricellulaire : • 1ère voie : L’organogenèse : Passer d'un cal (cellules indifférenciés) à une plantule. En partant d'embryons immatures, on peut générer des pousses de tiges ou des racines selon le milieu de culture dans lesquelles on les placent. • 2ème voie : Embryogenèse somatique : On part d'un explant immatures pour donner un 'organe' ayant une morphologie d'embryons végétales, appelés embryons somatiques. Ces embryons permettent ensuite de donner des individus. C'est le développement initial d'un tissu indifférencié de type embryonnaire qui se développe en un individu complet. 5. Conditions de régénération de plantules : Le milieu de culture se doit d'être : 1. Aseptisation du milieu ET de l'explant. 2. Milieu de culture solide (agarose) • • AVANTAGES : Manipulation facile, action physique du maillage favorise les divisions et l'ancrage. LIMITES : Diffusion des nutriments Milieu de culture liquide • • AVANTAGES : Absorption aisée des nutriments LIMITES : Manque d'oxygénation (besoin d'agitation), sécrétion de produits toxiques dans le milieu Les repiquages réguliers sont indispensables. Les risques sont la perte de stérilité et la contamination par des bactéries ou levure. Rôle des hormones dans la croissance : L'auxine, de son vrai nom Acide indole-3-acétique (AIA) est synthétisé dans l'apex, le méristème apical des pousses. Ces effets sont les suivants : - élongation de la tige - différenciation et croissance des racines (en grande quantité) - maturation du fruit - inhibition de croissance des bougeons latéraux - phototropisme des feuilles et géotropisme des racines La cytokinines, a d'abord été appelé zéatine puis fut synthétisé en laboratoire. Elle est synthétisé dans les racines et les tissus à croissance rapide. Ses effets sont les suivants : - retard de la sénescence - ramification et perte de domination apical (antagoniste de l'auxine) - dépendant du taux d'auxine associé Choix de la balance hormonale : Quand on a une majorité d'auxine, la croissance des racines est privilégié. Quand on a une majorité de cytokinines, on a un développement des bourgeons végétatifs. Enfin, si on a une quantité faible d'auxine et de cytokinines, on obtient une floraison. 6. Applications de la culture in vitro : Les applications de la culture in vitro sont nombreuses, on peut faire du 'sauvetage d'embryons', de l'haplodiploïdisation, l'obtention de protoplastes, la multiplication conforme ou la culture de méristème. Culture de méristèmes : En 1952, Morel et Martin développe une technique pour protéger et sauver les plantes malades, touchés par des virus. On cultive le méristème car c'est la seule zone qui n'est jamais contaminé par un virus. Il pousse plus vite que le virus n'infecte les cellules. Sauvetage d'embryons : Certains croisement interspécifiques ne permettent pas le développement de graines ! Un embryon crée en forçant un croisement entre deux plantes donne un hybride que l'on n'aurait pas obtenu en croisant pollen et anthère. La culture des embryons immatures permet l'obtention de plantes. Les avantages sont que l'ont peut s'affranchir de l'étape de dormance des semences, le développement des embryons est homogène et l'accélération du cycle végétatif. Haplodiploïdisation : Mise en culture des organes reproducteurs afin de développer des individus à partir des cellules reproductrices et gamètes. Ces cellules contiennent une seule copie de l'information génétique. Au cours de la régénération, on peut réussir à doubler à l'identique cette copie. Les individus obtenus sont des lignées pures car ils ont la même information sur les deux chromosomes, ils sont homozygotes. Utilisation de protoplastes : Explants unicellulaires : Digestion enzymatique de la paroi de parenchyme de jeunes feuilles pour isoler une suspension de protoplastes (tissu obtenu quand la paroi d'un tissu végétale est digérer). Ces cellules peuvent grandir mais sans paroi, elles ne se développent pas. Au bout de 24h, en environ 10 minutes, une nouvelle paroi apparaît (si le milieu contient les éléments nécessaire). On peut alors modifier les protoplastes, par hybridation somatique par exemple. Pour le noyau, plusieurs schéma peuvent apparaître : - Soit un des deux noyaux est gardé complètement - Soit une proportion variable de chaque ADN est conservé - Soit on se retrouve une cellule poli-nuclée. Lorsque deux noyaux reste présent dans le cytoplasme, on parle d'hétérocaryons. Lorsqu'un seul noyaux reste, sans mixte avec l'autre, on parle de cybrides. Lorsque qu'une proportion de chaque noyau est présent, on parle d'hybrides somatiques. Il faut ensuite sélectionnés dans cette population les éléments intéressantes via des marqueurs morphologiques (pigments) ou des marques de résistance. Seul les hybrides ayant acquis une résistance à un pathogène seront sélectionnés. On peut ensuite caractérisés génétiquement ces individus. L'avantage est notamment de pouvoir créer de nouvelles variétés de plantes. ➢ Pourquoi créer de nouvelles espèces par hybridation somatique plutôt que par croisement ovule X pollen ? On peut passer outre la volonté de Dieu et créer de nouvelles espèces ! (Et accessoirement, on peut aussi créer des croisements qui n'aurait pas été naturellement possible) Des problèmes peuvent survenir suite à l'incompatibilité des génomes. De plus, les mitochondries expriment également du matériel génétique et porte eux-mêmes parfois les résistances. Il faut apprendre à les faire passer entre les espèces également. Cela permet de créer des plantes cultivés qui acquiert des capacités intéressantes. Un problème agricole à résoudre était de produire de l'huile de colza à un meilleur rendement. Via des populations très homogène qui se fécondaient tout le temps entre eux, on obtient des génomes homozygotes. Ces plantes sont moins aptes à grandir et à pousser que des populations hétérozygotes. On a alors hybrider des plants via l'hybridation somatique ! Pourquoi pas zygotique comme c'était la même espèce ? Parce que les colzas ont tendance à s'auto-féconder. On n'obtenait pas d'hétérozygote via cette hybridation. Les hétérozygotes avaient des patrimoines génétiques qui se complétaient et fournit une meilleur huile. Une alternative est de rendre le colza mâle stérile et ainsi forcer une fécondation d'un autre individu. Comment du colza mâle stérile a-t-il été obtenu ? Hybridation zygotique : Pollen Colza x Ovules radis mâle stérile => Colza stérile MAIS Les graines ne sont pas du tout utilisable par les agriculteurs (Photosynthèse peu efficace). On s'est rendu compte que lors de la fécondation, le pollen contient uniquement le noyau de la souche mâle alors que l'ovule contient le noyau et les mitochondries ! Hors c'était les mitochondries qui portaient le gène de la stérilité mâle. Hybridation somatique : Colza X Radis blancs => L'hybridation somatique fonctionne et permet de sélectionner du colza mâle stérile dont les cellules possèdent le noyau et les chloroplastes du colza et les mitochondries du radis ! L’intérêt de la mise en culture de protoplastes : Il faut s'intéresser à la culture de cellules pour réaliser des hybridations. On doit d'abord mettre en culture des cellules qui doivent régénérer un cals puis des pousses ou racines. Une cellule végétale sans paroi est incapable de se diviser à nouveau. Avant de se diviser, une plante recrée une paroi pecto-cellulosique. Dans beaucoup d'espèce, il faut environ 24h pour former d'un coup une paroi. En 24h moins une dizaine de minutes, on ne voit encore rien ! En utilisant du Calcofluor White, on peut marquer cette paroi et la voir apparaître. Ces premières divisions cellulaires n'augmentent pas le volume cytoplasmique immédiatement. Après quelques heures, le cals obtenu va grossir et augmenter le volume de chaque cellule. C'est enfin la variation des hormones du milieu qui génère pousses ou racines. 7. Variation somaclonale : Constat : Toutes les plantes régénérées à partir de cultures cellulaires d'une seul cellule de base sont pas toutes identiques à la plante-mère ! :O Ces plantes ont été modifiés quelque part. Causes : - Caractère polyploïde (division cellulaire se passant mal) - Altération du nombre de chromosomes - Réarrangements chromosomiques (translocations, délétions, … ) - Modification des génomes mitochondriaux et plastidiaux (chloroses, … ) - Activation de transposons - Mutations ponctuelles Limites : - Vitrification : Plante plus verte, plus brillante, elle ne présente pas de signes de dysfonctionnement mais elle est muté dans un grand nombre de gènes. - Albinisme : Impossibilité de produire des chloroplastes fonctionnels et entraîne la mort de la plante. 8. Cultures de souches cellulaires en suspension : On doit passer par une culture in vitro quand on veut passer d'une cellule unique à un cals puis un individu entier. Cette culture passe par trois phases de croissance : - Une phase de croissance exponentielle - Une phase de croissance linéaire - Une phase stationnaire Ces 3 phases sont précédés d'une phase de latence. On doit régulièrement réalisés des repiquages, en général juste avant la phase linéaire, pour apporter aux cellules les éléments nécessaire à la croissance qui s'appauvrissent dans le milieu. Il est inutile de repiquer avant la phase linéaire puisque le milieu 1 possèdent encore suffisamment de nutriments pour pousser. La génération de la courbe de croissance permet de déterminer le moment parfait pour repiquer une plante sans gâcher de ressources. Chez les cellules de tabac BY-2, qui poussent en fil sur le milieu de culture, permettent d'y appliquer des drogues pour synchronisée leurs cycles cellulaires. 9. Transgenèse : Comment transformer un gène et l'incorporer dans un génome. L'idée est de transférer un ou plusieurs gènes d'une espèce à une autre sans aucune barrière. Applications : • • Étude fonctionnelle de gènes d'intérêt (RECHERCHE FONDAMENTALE) Amélioration des rendements agricoles (risque potentiel) (RÉSISTANCE AUX RAVAGEURS, TOLÉRANCE AUX HERBICIDES) • Amélioration des qualités nutritionnelles de produits agroalimentaires (RIZ DORE, TOMATES, MELONS, … ) • Amélioration des plantes à l'origine de produits industriels PÂTE A PAPIER) (BOIS PEU LIGNIFIE POUR • Utilisation des plantes comme bioréacteurs (PRODUCTION DE MÉDICAMENTS , VACCINS ORAUX, PLANTICORPS, … ) Risques : • • Le site d'intégration du transgène est rarement ciblable. Cela peut conduire à des effets physiologiques non contrôlés. Les transformants expriment souvent des marqueurs de sélection (résistance à un antibiotique, un herbicide, … ), qui peut être transférable à d'autres organismes. Méthodes de transfert : - Électroporation - Canon à particules - Micro-injection - Via Agrobacterium tumefaciens L'éléctroporation : Le champ électrique provoque la déstabilisation de la membrane et induit la formation de pores à travers lesquels l’ADN peut transiter. Ce phénomène est réversible si le choc électrique n’est pas trop violent et la membrane peut reprendre son état initial. Efficacité 100 à 1000 fois meilleure que micro-injection cytoplasmique du vecteur 1985, Fromm sur des protoplastes. 1990, Dekeyser, sur cellules intactes de plantes Bombardement à partir d'un canon à particules : Basé sur la biolistique, il s'agit de projeter des microbilles de tungstène ou d'or de 1 μm de diamètre, enrobées avec le plasmide possédant le gène d'intérêt. Ces microparticules acquièrent l'énergie cinétique nécessaire pour traverser la paroi cellulaire, la membrane plasmique et l'enveloppe nucléaire. Le gène s'intègre rarement, on a une expression transitoire. Via Agrobacterium tumefaciens : Agrobacterium tumefaciens est une bactérie qui, dans la nature, provoque des tumeurs au niveau des blessures des plantes. Les tumeurs sont provoqués par le transfert, de la bactérie vers la plante, du plasmide Ti (Tumor-inducing) dont un fragment (ADN-T, T pour transfert) s'insère dans le génome de la plante et s'exprime. En 'désarmant' le plasmide de Agrobacterium tumefaciens (en retirant les sites codant l'auxine, les cytokinines et les opines responsable de la tumeur) et en les remplaçant par les gènes d'intérêt, on peut incorporer un gène à une plante par cette voie. Les applications de ces techniques sont nombreuses. On peut notamment lutter contre la pyrale du maïs en faisant synthétiser au maïs une toxine létale pour l'insecte. On peut également diminuer le pourcentage de lignine dans les plantes et ainsi diminuer les traitements nécessaires à la formation de pâte à papier. BILAN : Cours 2 : Carine Meignin : L'apoptose a longtemps été considéré comme une conséquence de caractéristiques de l'environnement qui affectait les cellules. Cependant, si ce mécanisme ne pouvait pas être forcés et volontaires, les organismes aurait un déséquilibre dans leur balance division cellulaire/mort cellulaire. Les facteurs de croissance et récepteurs : Un facteur de croissance est un peptide. Dans un premier temps, un signal extracellulaire de nombreux types (facteurs de croissance, de différenciation, des hormones, l'environnement proche … ). Les cellules possèdent sur leurs membranes des récepteurs transmembranaires permettant la signalisation et un transport de l'information. On parle de transduction du signal. La réponse engendré peut être de plusieurs nature : - Prolifération cellulaire (dans le cas d'un facteur de croissance) - Différenciation (dans le cas d'un facteur de différenciation) - Migration - Apoptose Perception du signal : Les signaux peuvent être perçus par les cellules de différente façon : • La cellule émettrice peut être la cellule receveuse, on parle de boucle autocrine. La molécule doit sortir de la cellule pour agir sur ces propres récepteurs. (Ex : IL2) La cellule émettrice produit un facteur qui est exporté dans le milieu extracellulaire, qui se fixe sur une cellule réceptrice différente. On parle de stimulation paracrine. (Ex : PDGF, VEGF, etc … ) • • Une cellule émet le signal dans le sang et permet le transport du signal dans l'intégralité de l'organisme pour être délivrés au niveau des cellules réceptrices. On parle de stimulation endocrine. (Ex : Facteurs de croissance des chondrocytes) • Enfin, on peut avoir une cellule émettrice qui produit par exemple un facteur de croissance qui reste ancrée dans la membrane, permettant de stimuler uniquement les cellules proches. On parle de stimulation juxtacrine. On a également l'intervention de certaines enzymes appelés Sheddases, ancré dans la membrane, clivant le facteur de croissance dans la membrane pouvant le libérer. Dans cette famille des Sheddases, on trouve les protéines ADAM, qui possède un domaine enzymatique métalo-protéases. On en trouve sur la membrane plasmique et suite à stimulus, elle peut cliver un facteur de croissance proche ancrée dans la membrane. Découverte des premiers facteurs de croissance NGF et EGF : L'embryologiste Rita Levi-Montalchini et le biochimiste Stanley Cohen ont réalisés des tests sur la régulation de la croissance des fibres nerveuses. Ils ont observés qu'en amputant le bourgeon d'un membre de poulet, les cellules nerveuses du membres vont mourir, ils ne sont plus irrigués par quelque chose dont ils ont besoin. A l'inverse, en greffant ce bourgeon sur une partie de l'animal, on voit la progression de cellule nerveuse. On peut en déduire que le bourgeon est nécessaire et suffisant pour créer des nerfs. Un signal devait en partir pour favoriser la croissance de fibres nerveuses. Cohen a utilisé des phosphodiestérase produit à partir de venin de serpent pour détruire des acides aminés sur les bourgeons de membres … et les nerfs continuent de pousser ! En purifiant cette molécule, on récupère aussi toutes les molécules des glandes salivaires ! En utilisant les glandes salivaires d'autres espèces, ils sont arrivés au même résultat. Le facteur de croissance qui faisait pousser les nerfs se trouvait dans les glandes salivaires. Ils l'ont appelés le NGF. En testant in vivo ce NGF de ces glandes salivaires, on produit bien une croissance des nerfs mais également une sur-croissance des yeux et des dents. C'était l'EGF. Ils ont le prix Nobel en 1986 pour la découverte des facteurs de croissances. Découverte du PDGF (Platelet Derived Growth Factor) : En centrifugeant du sang et en plaçant du plasma ou du sang sur des fibroblastes, on ne voit aucune pousse. Cependant, en prenant uniquement le sérum, on provoque une pousse des fibroblastes ! Qu'y a t-il dans le sérum qui n'est pas présente dans le sang ? En fait, quand on fait coaguler le sang pour créer du sérum, les cellules sanguines vont lyser et libérer leurs contenus. C'est la lyse de ces plaquettes sanguines qui libère le PDGF et induit la pousse de fibroblaste. Méthode d'étude des facteurs de croissance : • On peut simplement placer le facteur de croissance sur des cellules pendant un certains temps pour compter les cellules avant et après et mesurer la prolifération cellulaire. • On peut placer à t=0 le facteur de croissance avec différent produit (MTT, XTT, Alamar Blue) puis on réalise un test colorimétrique pour mesurer l'activité déshydrogénase mitochondriales. On peut ainsi voir si les cellules peuvent réaliser correctement le cycle de Krebs. Cela permet de mesure la viabilité cellulaire. Cette technique est : - Rapide - Reproductible - Automatisable - Sans radioactivité - Permettant de compter le nombre de cellule vivante. • On peut placer de la thymidine tritiée dans le milieu avec le facteur de croissance. Elle va s'incorporer dans l'ADN uniquement au moment de la réplication pour former de l'ADN et permet de mesurer la réplication cellulaire. • On peut marquer la cellule au CFSE, permettant, via un suivi de la fluorescence, de suivre étape par étape les divisions cellulaire en fonction de la quantité de fluorescence dans chaque cellule-fille. Chaque pic sur le profil de FACS définit le nombre de division cellulaire qui se sont réalisés. On peut ainsi suivre les divisions cellulaires. Exemple de facteurs de croissance/différenciation : Le NT1 correspond à une neurotrophine et agit sur la survie neuronale. L'EPO est un précurseur des globules rouges. Il est notamment émit suite à un temps passé à de hautes altitude, pour permettre au corps de s'accommoder au manque d'oxygène. Le TNF (Tumor Necrosis Factor) induit l'apoptose et la mort cellulaire. Les facteurs trophiques permettent la survie cellulaire. Les facteurs chimiotactiques induisent la migration cellulaire. Il attire des cellules. Notamment lors des infections virales, ces facteurs attirent les cellules immunitaires sur le lieu d'infection. Orchestration de la réponse immunitaire par les cytokines : Les réponses cellulaire et humorale sont des réactions du corps pour lutter contre une infection bactérienne ou virale. Dans la réponse cellulaire, des lymphocytes TCD8+ (killer) tuent les bactéries et les macrophages 'nettoient' le déchets cellulaires. Les lymphocytes B produisent des anticorps lors de la réponse humorale. Ces cellules ont les mêmes précurseurs ! Il s'agit de lymphocyte TH0 (CD4) qui via de l'IL-12 ou des INFg vont les transformer en TH1 qui, ensuite, via de l'IL-2 ou des IFNy donneront les cellules de la réponse cellulaire. Dans la même idée, en partant d'un TH0, avec un autre cocktail de cytokine, on peut produire les cellule de la réponse humorale. Contrôle de l'angiogenèse par le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) : 1. Il induit la formation de capillaire sanguin. Les cellules endothéliales composant les vaisseaux sanguins peuvent former un pseudopode en présence d'IL-8. 2. Le VEGF active la division cellulaire préalablement initié par la formation du pseudopode. 3. On a ensuite formation de 2 vacuoles contiguës dans les cellules filles. 4. Ces vésicules fusionnent et on a le départ d'un nouveau capillaire sanguin. VEGF stimule spécifiquement la prolifération des cellules endothéliales : En utilisant une concentration croissante de VEGF sur des cellules endothéliales, on peut mesurer la valeur nécessaire de VEGF pour induire la division efficace de l'endothélium. Sur des cellules endothéliales, on note une valeur efficace vers 10 3 pg. Sur les fibroblastes, on ne peut induire de croissance via le VEGF. En fait, il n'y a pas de récepteurs au VEGF sur les fibroblastes. L'expression de VEGF est induite en réponse a une hypoxie : Le Southern Blot permet de mesurer l'ADN. Le Northern Blot permet de mesurer l'ARN. Le Western Blot permet de mesurer les protéines. Sur le Northern Blot ci-dessous, on note une absence de VEGF en condition normale. Le gène n'est pas exprimé. Dans des conditions hypoxique, on note la présence d'ARN * Les protéines Nodal ont un rôle dans la symétrie-gauche. On mesure la présence de Nodal via une hybridation in situ (qui marque l'ARN et l'ADN via une sonde) Cours 2 : Activation des récepteurs et initiation de la transduction du signal : Les facteurs de croissance sont des molécules protéiques assez grosses ne passant pas à travers la membrane. Elles ont besoin de récepteur. Les premiers facteurs découvert sont les hormones, de toutes petites molécules transmettant un signal. (Pierre CHAMBON, directeur de l'IBMC, découvre les ARN I, II et III, il travaille sur la chromatine et met en évidence le nucléosome. Enfin, il découvre le mécanisme d'épissage chez les eucaryotes et les récepteurs de l'acide rétinoïque. ) Il existe un grand nombre d'hormones jouant le rôle de ligand, activant des récepteurs nucléaires et diffusant à travers la membrane. Un récepteur nucléaire possède un domaine permettant l'interaction avec le ligand, un pour interagir avec l'ADN (permettant d'activer les gènes cibles en modifiant sa structure) et un domaine ligand-dépendant. Ils sont monomériques puis deviennent dimériques après changement de conformation. Le récepteur est présent dans le cytoplasme de façon inactif. Une protéine inhibitrice lui est associé pour être sur de bloquer le message . Quand le ligand se forme, le récepteur va dans le noyau. Le ligand va rejeter l'interaction avec la protéine inhibitrice et permet la libération du domaine d'action du récepteur. D'autres protéines, co-activatrices, peuvent venir assurer le message pour garantir un effet. Pour un facteur de croissance, c'est différent. Il ne diffuse pas. On a besoin de récepteurs transmembranaires qui captent le message extracellulaire et le transmet. La majorité des récepteurs sont sous forme monomériques. Un facteur de croissance, en général dimériques, va reconnaître une branche du récepteur et rapprocher la deuxième pour dimériser le récepteur. Un dimère crée un dimère. Ces modifications du récepteurs vont permettre la transmission du signal. Le récepteur à l'EGF et son récepteur est l'EGFr. L'EGF est toujours sous forme monomérique. Quand il agit avec son récepteur, il change la conformation du récepteur et recrute un autre EGF pour dimériser un récepteur. 2 monomères fabrique un dimère. Les facteurs FGF se fixent sur leurs récepteurs sous forme oligomérisée (à plusieurs). Le FGF récepteurs est intégré dans la membrane plasmique. Au niveau de la MB, des protéoglycanes agissent avec des molécules GAG (polymères de sucre linéaires). Ce polymère de sucres va permettent de rassembler les FGF et de les rapprocher de la membrane plasmique, les récepteurs vont bouger sur la membrane fluide jusqu'au FGF rassemblés et permettent le passage du signal. Expérience : (L'anti-pY sert à montrer qu'on a une activité phosphorylation) Dans le cas de la FGF, mettre du FGF contre son récepteur n'est pas suffisant pour induire un signal. Il faut une interaction FGF + une molécule de type GAG pour activer le récepteur. C'est les GAG qui forment des dimères de FGF. Mise en évidence de récepteurs multimériques : L'IL-3 va agir avec l'IL-3 alpha et beta. On forme un hétérodimère. Pour mettre en évidence ces interactions, on utilise un ligand radioactif et on le met en présence d'une molécule appelé DSS, permettant de former des liaisons covalentes (crosslinking). On va forcer des liaisons covalents pour relier le ligand radioactif avec une branche de son récepteur. Puis on réalise une autoradiographie sur SDS-PAGE et on observe 3 bandes. L'IL-3 non fixée sera situé au bas de la fraction. L'IL-3 avec le beta et l'IL-3 avec le alpha se trouve plus en hauteur de la fraction. Les deux bandes définissent deux protéines de tailles différentes. Structure et fonction de l'IL-2 : Formation d'un tétramère formant le récepteur via alpha, beta et gamma, trois monomères, qui agiront avec l'IL-2. L'IL-2 est une petite molécules se repliant sur elle-même. On sait que la tyrosine en position 59 (Y59) agit avec alpha, le D34 agit avec l'IL-2RB et le Q141 agit avec une molécule inconnu. En connaissant les acides aminés responsables des liaisons, on peut les muter et observer la réponse cellulaire. • Sans muter quoi que ce soit, on obtient un graphique de type courbe noire. • De l'IL-2 muté donnera la courbe jaune. On observe une réponse cellulaire, même si on empêche l'interaction avec le récepteur alpha ! Elle met plus de temps à se mettre en place mais elle est présente. Le récepteur alpha n'intervient pas pour la transduction du signal. • La courbe violette définit la mutation sur D34. Même conclusion pour le récepteur beta. • Enfin si on mute le Q141 on obtient la courbe verte. On ne voit pas de réponse cellulaire ! La partie gamma permet la transduction du signal ! CQFD. Les récepteurs tyrosines-kinases : (RTK) On s'intéressera ici qu'au récepteur de type 1. Ils jouent un rôle essentiel dans les mécanismes de migration, apoptose, différenciation, etc … Ils peuvent se phosphoryler eux-mêmes sur leurs récepteurs. La phosphorylation des tyrosines apparaît quelques secondes après l'activation d'un récepteur et permet la transduction du signal (Présente chez tout les eucaryotes sauf les plantes). Ils permettent le transfert d'un gamma-ATP et de changer la conformation ou l'interaction protéines-protéines qui auront un effet. Les RTK 1 sont transmembranaires. Ils ont un domaine transmembranaire hydrophobe, plusieurs domaines comme des cystéine-riche, des fibronectines de type III et des domaines immunoglobulines. Ensuite, dans le cytoplasme, on a deux grandes catégories avec des domaines tyrosine-kinase. On en a soit 1 seul (cas de l'EGFr) soit 2 domaines séparés tyrosine-kinase. Parfois, on trouve des domaines SAM en bout de partie cytoplasmique permettant des interactions protéines-protéines. La forme active du récepteur VEGF n'est présent que lorsque l'on place du VEGF avec du VEGFr. On met cela en évidence via un immunomarquage VEGFr Tyrosine-Kinase. La molécule VEGFr est toujours présente mais pas toujours sous forme active. Dimérisation du récepteur EGF par son ligand : On forme comme vu auparavant un homodimère. La protéine sauvage de l'EGFr possède deux domaines cystéine-riche et un domaine TK. En retirant le domaine cytoplasmique, on obtient une protéine tronqué qui s'ancrera dans la membrane mais on n'aura pas de transduction du signal sans domaine TK. (On utilise un marquage à la Met-S 35 radioactive car 99% des nouvelles protéines commence par une méthionine (AEG=Met). On utilise du DSS pour lier le ligand et le récepteur et de l'EGF pour servir de ligand.) Dans le premier cas, sans facteur et sans cross-linking, on ne voit rien, c'est de même si on mais juste l'EGF. Juste le cross-linker est un contrôle négatif et enfin, si on met le DSS et le EGF, on voit une bande à 340 kDa montrant l'homodimère actif ! En utilisant la protéines tronqué, on observe une bande à 115 plus légère définissant le récepteur muté sans ligand. Les trois dernières bandes définissent un dimère avec deux monomères sauvage, un dimère avec deux mutés et entre les deux, un dimère avec un sauvage et un muté. Dans le cas d'un dimère sauvage, on aura une auto-phosphorylation des deux domaines. Sur l'hétérodimère, on aura aussi auto-phosphorylation mais d'un seul monomère. La trans-phosphorylation définit le fait qu'un domaine TK ne peut phosphoryler que son voisin. On n'observera un phosphorylation uniquement dans le cas où on trouve deux monomères sauvage avec des domaines TK fonctionnel. Phosphorylation des tyrosines du domaine intracytoplasmique du récepteur PDGF : Le PDGF va former un dimère fonctionnelle pour son récepteur et va transmettre un signal. Les domaines PK seront phosphorylé lors de l'activation. On aura ensuite une activation des PK intracellulaires et enfin, une cascade de phosphorylation intracellulaire. • La phosphorylation au niveau des domaines TK contrôle l'activité de son récepteur. • La phosphorylation au niveau des domaines TK intermédiaires, qui sont noncatalytiques (domaines KID), permet le recrutement de nouvelles protéines qui auront des affinités pour les protéines phosphoryler et contiennent des domaines SH2 ou PTB, présents au sein de nombreuses protéines. Protéines agissant avec les domaines KID : Il s'agit là d'un recrutement de messagers secondaires. Le récepteur va rester dans la membrane mais va recruter des protéines pour permettre le message. Les domaines SH2 : Composés essentiellement d'arginine, elles agissent avec des tyrosines phosphorylés. La sérine ou la thréonine peuvent également être phosphorylés mais n'agissent pas avec les groupement SH2. Il faut également un cycle aromatique pour cela, cycle présent chez la tyrosine. Les adaptateurs phospho-sensibles : Il s'agit de protéines ayant une affinité pour des domaines phosphorylés, comme notamment SH2 et PTB mais il en existe d'autres. Association avec les messagers secondaires : 3 exemples : 1. La PhosphoLipase C-gamma est recruté dans les domaines KID via la tyrosine phosphorylés. Agir avec la PLC-gamma va la rapprocher de la membrane plasmique (elle-même composés de lipides pas forcément identique en terme de composés). PIP2 (phosphatidyl-inositol bisphosphate) va agir avec la PLC-gamma proche de PIP2 et PIP2 sera clivée. On va former d'une part du DAG et de l'autre par de l'IP3. C'est mécanique et dû uniquement au fait du rapprochement de PLC et PIP2 DAG va permettre l'activation de PKC à la membrane plasmique. L'IP3 va permettre de relarguer du calcium au niveau du réticulum endoplasmique. Si on traite des lymphocytes T avec uniquement la première molécule ou la seconde, on aura aucun effet. Si on met les deux, on observe une prolifération ! Elle est induite uniquement si 2 effets sont présents : Augmentation du calcium intracellulaire et activation des PKC. Augmenter la concentration en calcium va induire le recrutement de calmoduline, qui vont changer de conformation dû au calcium et vont rapprocher leurs domaines Cterminal de son N-terminal. En attachant de la BFP et de la YFP dans les domaines C et N, on peut observer ce changement. En fait, quand la protéine n'est pas activé, les domaines C et N sont trop éloignés pour réagir entre elles. Mais quand on l'active et que sa conformation change, un des BFP/GFP • P3 Kinase possède deux sous-unités : P185 avec la SH2 et P110 avec une activité phosphorylase. En la rapprochant des lipides, on va avoir une phosphorylation d'un PI, qui sera transformé en PI-3 phosphate [Pi(3)P]. Si on la rapproche d'un PI-4, on aura alors un PI 3,5 bisphosphate. Elle rajoute en fait un phosphate au lipides. On modifie juste la membrane. Elle phosphoryle un lipide en position 3 du cycle. Quand elle agit sur PIP2, elle va le transformer en PIP3, cela va induire le recrutement de différente protéines, dont des protéines à domaine PH qui recruteront à leurs tours des protéines (PDK1 / PKB Akt) qui seront phosphorylé, perdront leurs affinité pour les PH et tomberont dans le cytoplasme, ce qui agira sur la phosphorylation d'une facteur BAD. Non-phosphorylé, cela conduit à l'apoptose mais si BAD est phosphorylé, cela induit la survie. Cours du 14/10 : Meignin : Le tableau suivant présentes les lipides pouvant intervenir dans la signalisation et ceux pouvant être modifiés pour agir. (tableau 1) Les protéines pouvant interagir avec des lipides modifiés sont présentes en très grand nombres. Nous avons parler des protéines à domaine PH (PDK1 par exemple) Ces phospholipides peuvent être modifiés dans les deux sens, le mécanisme est réversible. On peut toujours passer d'un état modifiés à un autre via de nombreuses enzymes. La PI3K va ajouter un phosphate en position 3 d'un lipide mais on peut également le retirer. Messagers secondaires : On reste dans le domaine des récepteurs PDGF. Un récepteur est activé par un ligand, il se dimèrise. Il est ensuite modifié et peut recruter des protéines qui agiront ensuite dans la signalisation. Le schéma suivant résume ce qui se passe avec PDGFr qui recrute PI3K. Amener l'AKT à la membrane va permettre de recruter mTOR, qui est un facteur de croissance. Sans facteur de croissance, des protéines sont actives et inhibe Rheb. Avec un facteur de croissance, par cascade, on active AKT et ont inactive une protéine et Rheb est active. Cela entraîne la voie mTOR qui fait grandir la cellule. Les noms ne sont pas à connaître, juste le principe d'une cascade de signalisation. Schéma récapitulatif de l'activation des PDGFr par le PDGF : Il y a au moins 3 conséquences à cette activation. On a un récepteur, inactif, qui ne recrute rien. Dès qu'il est fixé avec le ligand, on a dimérisation, recrutement de protéines et cascade de signalisation. Un récepteur est généralement monomérique. Activé, il devient au moins dimérique. Une phosphorylation du récepteur permet le recrutement de protéines. On a vu deux exemples : PI3K et PLC-gamma. 3ème exemple : La protéine GAP : Toutes les tyrosines phosphorylés ne fixent pas les messagers secondaires. Une tyrosine précise recrutera un messager précis. Une série de tyrosine recrute notamment les protéines Ras, très importante dans la signalisation et font partis de la super-famille des protéines Ras, des interupteurs moléculaires. Toujours présent dans le cytoplasme, ils sont sous forme active ou pas. Quand elles fixent du GTP, la protéine devient actif. Pour passer d'un état actif à un état inactif, on a l'intervention d'enzyme GEF. Pour passer d'un état inactif à actif, on a l'intervention d'enzyme GAP, transformant le GTP de la protéine active en GDP. Pour observer la fonction, on peut jouer sur des mutants où la protéine sera en permanence active (dominant négatif, on mute les AA responsable de l'action de GEF, soit la Thréonine ou la Sérine qu'on mute en Aspartate) ou en permanence inactive (Constitutivement active, même principe, voir schéma) Le recrutement de GERB2 : Grb2 va recruter Ras-GEF (Sos), permettant de transformer un Ras dans la membrane. Dans la protéine Sos, des régions riche en proline permettent la fusion avec des domaines SH2 et SH3 et permettent de migrer dans la membrane pour agir sur des protéines Ras ancrés dans la membrane. Mesure de l'activité par FRET : Placer une molécule fluorescente à coté d'une autre molécule pouvant être fluorescente. Cela activera l'autre protéine. On illumine Ras qui fera briller une protéine YFP attacher à Ras. On apporte du GTP coloré en rouge. Si on rapproche Sos de la protéine Ras-GDP, on va avoir réaction, la YFP va émettre de la fluorescence et excitera le GTP proche qui brillera également en rouge ! On peut mesurer ensuite la longueur d'onde d'excitation (ici 480 pour faire briller le YFP) et la longueur d'onde d'émission. La courbe bleu montre l'émission de lumière de la YFP. Si on rajoute du GTP coloré, à différente concentration, on voit de l'émission dans le rouge également, on a la preuve que la protéine Ras-GDP est devenu Ras-GTP. On peut mettre en compétition du GTP marqué et non-marqué pour prouver que la fixation de Ras-GTP est transitoire et ne reste pas dans cette état. On peut les répartir en plusieurs catégories de la super-famille des Ras : - Ras, intervenant dans la transduction du signal de domaine TK - Ral, dans le transport des vésicules et la polarité cellulaire - Ran, une seule dans le cytoplasme, pas d'isoforme, transport nucléocytoplasmique. - Arf et Rab, transport vésiculaires et échanges de membranes. - Rho, régulant le cytosquelette d'actine. La cascade des MAP (Mitogen activated protein) kinases : Un motif de type TxY permettra l'adressage à la membrane plasmique. Cette protéine p21ras.GTP recrutera la protéine Raf (MAPKKK) et agira sur la MEK (MAPKK) en la phosphorylant et cette dernière phosphorylera ERK (MAPK). Une fois phosphoryler, ERK migrera dans le noyau et activera des facteurs de transcription agissant sur l'ADN. (Schéma) Si on reprend cette cascade, un module de 3 MAP kinases surviennent après un stimulus et provoquent une réponse biologique. On a, pour chacune de ces étapes et comme le montre le schéma suivant plusieurs types de stimulus, de MAP kinases et de réponses. Résumé : RTK : A savoir Dans la partie PLC-gamma, l'IP3 entraîne la libération de calcium cytoplasmique activant des calmodulines et entraînant l'activation de calmoduline kinases (CaM kinase) Tout ça agit sur des protéines cibles pouvant être de différents types (facteurs de transcription, cyclines, régulateurs, … ) Les récepteurs associés à des tyrosine kinases : On y trouve : ➢ La famille des Src, avec un domaine SH2, SH3 et tyrosine-kinase. Souvent associés au récepteurs de l'antigène des lymphocytes, elles activent la même voie que les RTK. ➢ La famille des protéines JAK, associés aux récepteurs de l'interleukine et des interférons. Elles activent directement des protéines STAT. Les Src : A gauche de la protéine, on trouve différente modification (palmytisation et mérystisation, qui correspond à une ancre lipidique dans la membrane plasmique.) Régulation de l'activité des Src par phosphorylation sur tyrosine : On a deux tyrosine importantes dans l'activation-inhibition. Une complètement en C-terminal, importante dans l'inhibition et une au début du domaine TK pour l'activation. A gauche du schéma, on a la forme active, à droite la forme inactive : La tyrosine phosphorylé en forme inactive va activé son propre récepteur tyrosine kinase. Il n'est donc plus disponible et reste sous forme inactive. Sinon, un CD45 va libérer ce domaine en forme active et laissera le domaine libre. Seule la tyrosine en C-terminal peut activer son récepteur. Il faut déphosphoryler la protéine pour libérer le site. Lorsque le ligand arrive, on a un changement conformationnelle permettant de déphosphoryler la tyrosine bloquant le site. Étude de mutants : Chez un mutant CSK, qui permet à l'inverse de CD45 de passer de former active à inactive, on voit un problème dans la formation du tube neural. Le graphe ci-dessous montre un test de protéine Src en fonction de leurs états phosphoryler ou non. On regarde l’interaction avec l'énolase, qui à une affinité avec les protéine phosphorylé, et on pourra alors marquer les protéine phosphorylés. Les mutants nuls ont une grande quantité de Src phosphorylés. On en a encore plus chez les mutants CSK ! C'est la preuve que CSK permet de déphosphoryler la partie inactive et de phosphoryler la partie active. Ces enzymes CSK agissent sur toutes la famille Src. Les protéines JAK : Elles agissent dans la voie de signalisation des intégrines et généralement, les intégrines n'ont rien pour induire une information. La voie de signalisation JAK-STAT : Un récepteur de cytokine va interagir avec une kinase JAK. On va alors avoir dimérisation du récepteur, trans-phosphorylation, cela activera la kinase qui phosphorylera un phosphate sur le récepteur qui recrutera STAT (puis un autre STAT dans un second temps). Ces deux STAT vont fusionner et induire une cascade de signalisation dans le noyau. On peut mettre en évidence des tyrosines phosphorylés sur des gel 2D via un Western Blot. Le pervanadate activera toutes les tyrosine-kinase. On peut comparer sur l'image : Environ une centaine chez l'homme, on en trouve associés à des récepteurs ou cytosoliques. Elle enlève un phosphate. Un exemple de récepteur sérine/thréonine kinase : Le récepteur TGF Beta : Ce récepteur est composés d'un hétéro-dimères, un TGFBrII qui possède un domaine S/T kinase, agissant avec du TGFB, ce qui permet le recrutement de TGFBrI. On a activation et le premier domaine S/T kinase va phosphoryler une sérine ou thréonine sur l'autre monomère. Cette phosphorylation permettra le recrutement de messagers secondaires. Ici il s'agit de Smad2, qui agira avec Smad4 pour former un hétérodimère qui sera translocer dans le noyau. Résumé : Récepteurs sans activité kinase : La voie Wnt : La voie Wnt B-caténine va permettre d'éviter la dégradation de la B-caténine. Dans un état actif, Wnt va agir avec LRP et Fzl (Frizzled), cela permettra de recruter Dvl, qui inhibera un complexe permettant la stabilisation de la B-caténine. Dans un état inactif, LRP et Frizzled n'agissent pas avec Wnt, Dlv est inactive et on aura inhibition de la protéolyse de la B-caténine. La voie Hedgehog est identique en terme de fonctionnement. La voie Notch : On a un récepteur Notch ancré dans la membrane. Son ligand Delta est un ligand ancré dans la membrane, très important dans les interactions cellules-cellules. On aura clivage de la partie intracellulaire du récepteur Notch une fois active. Cette partie intracellulaire est un facteur de transcription qui agira dans le noyau activé des gènes cibles. On aura ensuite recyclage du récepteur. Le ligand ancré à la membrane permet l'inhibition latérale. Une cellule centrale active toutes les cellules autour d'elle. Cette voie Notch permet également la survie des cellules souches. Une sur-expression de Notch augmente le nombre de cellules souches. La cellule se différencie, exprime Delta et active une cellule-souche proche. Elle permet la différenciation et l'arrêt du cycle cellulaire. Clivage protéolytique : Le domaine extracellulaire agit avec le ligand. Une fois qu'il y a activation, des protéines ADAM vont permettre la libération du domaine extracellulaire. Une gamma-secretase va permettre de libérer le domaine intracellulaire de Notch. Ce domaine ira directement dans le noyau et activera des gènes cibles. Pas d'activité kinase. Pas même de phosphorylation. Au bout de la partie intracellulaire de Notch, on a un domaine NLS (Nuclear Localisation Signal) qui entraîne Notch dans le noyau. Résumé : On a ensuite besoin d'énergie dans les différents changement de conformation, soit par la phosphorylation, en hydrolysant de l'ATP, soit en fixant du GTP, chez les protéines Ras par exemple. Cours Meignin : DRC : 21/10/2016 : L'apoptose : « Life and death are one thread, the same line viewed from different sides » Lao Tzu La mort cellulaire peut être programmé, on l'appelle apoptose, et la non-programmé, qu'on appelle nécrose. Il en existe d'autres types mais ils sont moins bien caractérisé (pyroptose, nécroptose) 1. Définitions : Vers 1842, Carl Vogt détermine le concept d'apoptose. Il n'utilise pas encore le terme mais décrit des cellules qui se résorbent, dans le système nerveux en développement. Le mot apparaît vers la moitié du 18ème. Cette mort cellulaire n'est pas par défaut, on parle de mort cellulaire programmée, concept porté par Flemming vers la fin du 19ème. Vers 1965, Kerr différencie l'apoptose et la nécrose. Enfin en 2002, Brenner, Horvitz et Sulston obtiennent le prix Nobel pour leurs travaux sur le contrôle génétique de la régulation des organes et la mort programmée. Étapes de l'apoptose : (a) Normal (b) Rétrécissement de la cellule et augmentation de la densité cytoplasmique. (c) Compactions de la chromatine (d) Ségrégation et compartimentation autour de l'enveloppe nucléaire (e-f) Formation des saillies en forme de cloques (g) Formation de corps apoptotiques. On a pu observer ces phénomènes en microscopie à balayage. Ces types caractéristiques de l'apoptose sont conserver au cours de l'évolution. Des inhibiteurs d'apoptose (P35 par exemple) fonctionnent comme inhibiteur d'apoptose (pas terrible d'inhiber l'apoptose … ). Les macrophages viennent ingérer les débris cellulaires résultant de l'apoptose d'une cellule. Les deux types de mort cellulaire : Nécrose VS Apoptose : La nécrose entraîne un gonflement (au lieu de rétrécir), des organites endommagés et la chromatine altérée. L'apoptose entraîne une réduction du volume, des organites saines et de la chromatine compactée. La cellule nécrosé va lysée, les organites détruits et le contenu cellulaire est dispersé dans la matrice. La cellule en apoptose va former des corps apoptotiques, entouré d'une bicouche lipidique. La nécrose entraînera alors une phagocytose et une inflammation. (Interféron, NFkB etc ….) L'apoptose entraîne une phagocytose uniquement. Les organites présent dans les corps apoptotiques peuvent être réutilisés. Clivage internucléosomal de l'ADN dans les cellules en apoptose : L'ADN y est fragmenté. On peut observer l'ADN via un gel d'agarose classique en faisant migrer l'ADN. La piste 4 définit un ADN normal, en haut. La piste 2 et 3 définit des cellules apoptotiques et une série de bandes tout le long du gel. L'ADN est fragmenté. Le clivage de 2 et 3 est identique ! L'ADN est dégradé de façon programmé pour avoir toujours le même profil de dégradation. On peut également visualiser la dégradation au cours du temps en traitant une cellule avec des anticorps anti-Fas, si les récepteurs à Fas ne sont pas activés, on a apoptose. Cela fait intervenir une endonucléase, CAD, qui n'est pas fonctionnel naturellement, puisqu'elle est couplé à un inhibiteur iCAD. En induisant l'apoptose, on fait agir des caspases (elles clivent des trucs) et elles cliveront iCAD, libérant CAD et permettant à l'endonucléase d'aller couper l'ADN. Cependant, l'ADN étant associés au histone en nucléosomes. CAD ne peut pas couper sur un nucléosomes ! Elle coupe donc entre les nucléosomes ! Détection des cellules apoptotiques par cytométrie de flux : En faisant entrer des cellules par une Facs ou une cytométrie de flux, on peut rentrer divers caractéristiques. En FSC, on marque la taille des cellules. En SSC, la granulométrie. En comparant les cellules normales et les cellules en apoptose, on obtient des profils de Facs différents. Des cellules changent de granulosité et de taille. On voit, à gauche, les cellules petites et granuleuse vu que les organelles s'associent, qui représente les cellules apoptotiques. Détection des cellules apoptotiques par agent fixant l'ADN (Hoescht 33342) : Comme on sait que l'ADN est clivé, on prend un marquer se fixant sur les extrémité de l'ADN. Chez les cellules normales, on a peu d'extrémité, parce qu'on a peu de brins. Chez les cellules apoptotiques, on voit la présence de plus de brins d'ADN, donc plus d'extrémité marqué donc un profil différent.On utilise des agents intercallents (Iodure de propidium, etc … ) Détection des cellules apoptotiques par marquage des extrémités 3' OH : On récupère une molécule d'ADN avec ces extrémités 3' OH. Si on induit un clivage, on induit un très grand nombre de formation de 3' OH. Si on marque via la terminal deoxynucleotidyl transferase les extrémités 3'OH avec du dUTP marqué, on peut ensuite visualisé nos cellules apoptotiques. On appelle ça la technique de TUNEL. ➢ Sur une population normale, on couple le dUTP avec du FITC, qui émet dans le vert comme la GFP. Si on utilise une population apoptotique, on amplifie le décalage à droite, dans la mesure où on a plus de 3'OH donc plus de marquage et une courbe plus prononcé. On peut utiliser d'autres types de marqueur. En effet, le TUNEL nécessite que l'ADN soit déjà clivé. Si on réalise un marquage à la FITC-Annexin5, on voit des résultats similaires à ceux obtenus précédemment. ➢ L'annexinV va agir avec des phospholipides chargés. Une des conséquences de l'apoptose est que, sur les phospholipides chargés situés sur la membranes internes (PIP2, PIP3, etc ...), on aura un basculement sur la membrane externe. Et ça c'est pas normal. Pas de phospholipide chargé sur la membrane externe. Sinon la cellule à déjà débuté l'apoptose. Fonctions : Un peu de blabla sur C.elegans. Lignage cellulaire invariants, 1090 formés et 131 qui meurent par apoptose. Première division asymétrique, blabla … Effet de l'actinomycine D sur l'apoptose au cours de la métamorphose des insectes : La métamorphose chez les insectes induit énormément d'apoptose. En comparant la masse musculaire à son temps de développement, on voit une diminution de la masse au fil du temps. C'est l'effet de l'apoptose. La même expérience via l'actinomycine D (ActD) va rendre l'individu plus gros, il perdra moins de poids. Il n'y aura pas eu d'apoptose. L'ActD inhibe la transcription. La cyclohéximide inhibe la traduction. On retrouve ces composés en général dans les bactéries, dont le but est généralement de tuer la cellule dans laquelle elle rentre. Si on inhibe la transcription, on a pas d'apoptose. On a donc des signaux précis qui active cette dernière. En jouant sur la température, on peut également influer sur l'apoptose. Des thymocytes à 40°C vont faire de la nécrose au bout d'un certain temps. Si on les mets un certain à 40°C et qu'on les ramènent à 37°C, certaines vont résister mais certaines, trop endommagés pour survivre, vont rentrer en apoptose. Elles choisissent bravement de mourir. Le Valhala pour ces cellules. Élimination par apoptose des cellules sans fonction : On élimine les cellules en trop. Genre entre les doigts à la naissance. Dans le développement on préfère faire pleins de cellules et éliminer le trop plein plutôt que de tenter d'en produire exactement le nombre voulu. (a) On en trouve beaucoup lors de la morphogenèse, dans la formation des mains et des pieds par exemple. On le voit notamment via l'utilisation d'acridine orange, marquant les cellules en apoptose. On sait qu 1. e des mutants n'induisent pas cette réponse et développent des mains et des pieds palmé. L'apoptose a un rôle sculpteur. (b) On en voit également dans la formation des acini mammaires. Au début on a beaucoup de cellules puis, petit à petit on va perdre les cellules centrales et former un canal. Chez C.elegans, de l'axe antérieur à postérieur, on aura des cellules P qui vont se diviser successivement pour former soit des épithéliums et d'autres qui vont donner des neurones moteurs, puis 6 clusters vont mourir pour permettre la formation des autres tissus. (c) Les canaux de Müller sont éliminés par apoptose chez les mâles lors du développement. Élimination des cellules formés en excès : On peut le voir chez l'embryon de poulet, dont certaines cellules neuronales rentrent en apoptose. Le pool initial est énorme puis un grand nombre disparaît par apoptose pour obtenir le nombre de cellules voulus. On a toujours une valence entre l'apoptose et la division cellulaire dans le développement. Élimination des cellules anormales : Les thymocytes immatures vont interagir avec les complexes peptides-CMH dans l'épithélium thymique lors de la sélection positive. Suite à cela, il vont agir avec les complexe antigène du soi, si il réagissent au anticorps du soi, ils sont éliminés, c'est la sélection négative. Les cellules n'étant pas sélectionnés meurent par apoptose. Délétion des LT exprimant un TCR transgénique V6 autoréactif : On peut forcer une souris à exprimer des cellules autoréactive qui détectent le soi. ➢ A 4°, le mécanisme de sélection ne fonctionne pas. ➢ A 37°, température idéale, on note une élimination des cellules V6 autoréactive mais pas des autres. On a une sélection positive. ➢ Si on réalise la même chose à 37° avec de la CHX (cyclohéximide) ou de ActD, on ne voit pas de sélection et de mort des V6 ! On a bien à faire à un phénomène programmé. Effet de l'inactivation de Fas sur l'apoptose dans les organes lymphoïdes : Sur un mutant Fas, on a une augmentation des tissus du ganglion lymphatique et la rate. Fas élimine donc des cellules en induisant l'apoptose. Quand il est inactif, les cellules prolifèrent. On teste sur cette expérience des hétérozygotes pour voir si on a des cas de dominant négatif, où la mutation serait dominante. Les glucocorticoïdes sont des messagers cellulaires induisant la mort cellulaire par apoptose. Quand Fas est activé par un ligand Fas présent sur un lymphocyte killer, on a activation via une cascade, notamment au niveau des domaines de mort, induisant l'activation de la caspase 8 entraînant comme vu précédemment l'apoptose. Système rétinien chez le rat adulte ou nouveau-né : Chez le rat nouveau né, on injecte un marqueur permettant de savoir où les neurones projettent. On a une projection sur le lobe opposé en général mais certains neurones ne vont pas dans le bon lobe, c'est ceux qui ne sont pas marqués. Chez le nouveau né, la population B qui n'est pas bien localisé est beaucoup plus importante que la population B mal localisé chez les adultes. Ils sont éliminés par apoptose au cours du temps. Élimination par apoptose des cellules ayant rempli leur(s) fonction(s) : C'est un peu comme une mafia cruelle, une fois que tu sers plus, on t'élimine … C'est le cas par exemple chez les batraciens, dont la larve à une queue et l'adulte non. Délétion des cellules dangereuses par apoptose : • Une cellule infecté par un virus rentre de temps en temps en apoptose spontanément. On a longtemps travaillé avec le virus Sindbis, qui a permis de mettre en évidence la mort de cellule infecté (Sauf les neurones post-mitotiques, qui expriment Bcl-2, un inhibiteur d'apoptose) Un bon virus ne doit pas être trop virulent, ils doivent inhiber l'apoptose et se faire discret. Chikungunya et Sindbis sont tout deux des alphavirus. Une cellule cancéreuse peut rentrer en apoptose, de temps en temps, notamment grâce à p53, un suppresseur de tumeur. En surexprimant p53 dans l’œil d'une drosophile, tout l’œil meurt par apoptose. • Le privilège immunitaire, correspond à l'élimination des cellules immunitaires de tissus sensibles (yeux, cerveau, etc …). Ces cellules meurt par apoptose. • Régulation de l'apoptose : Les premières études du contrôle de l'apoptose ont été réalisés chez C. elegans et on y voit certaines cellules qui rentre en apoptose, au niveau du pharynx. Chez le ver, on a plusieurs vagues d'apoptose, une pendant le développement (113 cellules en stade embryonnaire puis 12 au stade larvaire). Dès qu'une cellule rentre en apoptose, on peut voir les corps apoptotiques environ 40 minutes. Ces cellules chez le ver prennent alors des buttons-like forms. Au niveau génétique : La cellule va choisir l'apoptose, c'est la décision. On a la réalisation de l'apoptose, c'est l’exécution. On a une digestion par la cellule voisine, la phagocytose. La cellule qui a phagocyté va réaliser une dégradation de la phagocyté. Chez C.elegans, on a trouvé 3 mutants affectant l'apoptose : ced-9, ced-4 et ced-3 Il interagissent ensemble. Ced-3 est une caspase protéolytique et régule positivement l'apoptose. Ced-4 est aussi un régulateur positif et est l'analogue de Apaf-1 chez les Mammifères. Ced-9 est un régulateur négatif et est analogue de Bcl-2 chez les Mammifères. Ced-4 est en amont de Ced-3, sans Ced-4, on a pas d'expression de Ced-3 et Ced-9 est en amont de Ced-4 et Ced-3. Si Ced-9 n'est pas là, on a une apoptose massive car on inhibe pas les régulateurs positif. En mutant Ced-9 et Ced-4, on retourne à une situation normale (?). On appelle le phénomène de classer les gènes dans un certain ordre un test épistatique. Les stimuli environnementaux ou la queue développementale influent sur egl-1, un inhibiteur de ced-9. En aval de ces réactions, on une série de Ced (1 ; 6 ; 12 ; etc …) ainsi que des protéines comme Nuc-1 ou Cps-6. Ced-3 est une caspase protéolytique, régulateur positif de l'apoptose. On parle de caspases pour cysteine-dependant aspartate-specific proteases. L'aspartate et la cystéine sont donc très importantes dans ces protéines. Les précurseurs des caspases sont formés de deux domaines catalytiques. Dans le plus grand, une cystéine est présente, responsable de l'activité catalytique. De nombreux acide aspartique dans le précurseur marque les zones de clivage pour former un domaine catalytique. Une fois que le clivage est effectué, on obtient deux sous-domaines, une large P20 et une petite P10. Pour être catalytiquement actif, il faut former un dimère ! Une fois qu'elles sont actives, elles peuvent agir sur d'autres caspases, des protéines du cytosquelette, des lamines, etc … Cela induira des manifestations morphologiques et biochimiques de l'apoptose. Les régulateurs de l'apoptose comme Ced-3 comprennent généralement une proenzyme composé de deux sous-unités (P20-P10) nécessaire deux fois pour obtenir une holo-enzyme. Ils agiront alors sur des sites actif, comme des acides aminés précis. Elles peuvent aussi clivés d'autres caspases et seront appelés caspases initiatrices. Chez les Mammifères, la caspase 3, 7 et 6 sont les caspases initiatrices, toujours construite identiquement. Les pro-enzymes réaliseront des clivages, généralement d'abord celui de la partie Nterminal puis un second enlevant la partie au milieu du domaine catalytique, cela induisant la formation de l'holo-enzyme fonctionnelle. Activation des caspases par des signaux extrinsèques : La famille du récepteur TNF : Le TNFr de type 1 et de type 2 sont composés de domaines cystéines riches (entre 4 et 6), puis un ligand activant le récepteur, le TNF. Le TNF peut être produit par les macrophages, les monocytes, les lymphocytes (T et B) et les fibroblastes. C'est une petite protéine (26 kDa) transmembranaire, associés à des sheddases qui permettront de libérer la protéine mature (17 kDa). Il existe d'autres types de récepteurs TNF dont les ligands ont des modes de fonctionnement identiques. On peut tester l'effet de ces récepteurs. Seul les récepteurs Fas et TNFr1 induisent l'apoptose. Sur ces récepteurs on trouve des Death domain (DD) qui sont nécessaire et suffisant pour induire de l'apoptose. Le DD permet l'activation des caspases et le début de l'apoptose. Récepteur Fas et apoptose : Après fixation sur le récepteur Fas par un ligand, on a la formation d'un complexe DISC, précurseur de l'activation des caspases et de l'apoptose. Les DD interagissent entre eux, les Dead-Dead agissent également entre eux, etc … comme des dominos. Les DD font environ 70 AA permettant des interactions homophile protéinesprotéines permettant ensuite le recrutement d'autre DD. TNFr de type 1 : Lorsqu'on active ce récepteur, on recrute la protéine TRADD, possédant aussi un DD, qui recrute une protéine FADD, possédant un DED (Death effector domain) Ce DED permet de recruter une caspase 8, sous forme de pro-enzyme, possédant aussi un DED. C'est une caspase initiatrices qui clivera d'autres caspases et qui s'auto-active. C'est aussi une caspase apical. Cette caspases 8 activera des caspase 3, 6 et 7 entraînant l'apoptose. On parle de caspases effectrices. Elles agiront sur la fragmentation de l'ADN, la condensation de la chromatine ou des modifications de surface. La super-famille des DD : On en trouve 4 grands types : - Les Death Domain - Les Death Effector domain - Les CARD (Caspases recruitment domain) - Les PYD (pyrin domain) Il y a une centaines de protéines avec des DD, une dizaine avec les DED et une faible quantité avec PYD et CARD chez l'Homme. Parallèle avec les récepteurs tyrosines kinase : Les RTK ont des domaines Y permettant de recruter des protéines à domaines SH2, lié à des SH3 recrutant des protéines comme Grb2 permettant l'activation de la GEF, la stimulation de Ras et la prolifération cellulaire. On peut faire une analogie avec le mode de fonctionnement des récepteurs Fas. Que se passe-t-il si on lie un domaine SH2 avec un domaine DED ? On crée des protéines chimériques. Une avec juste SH2, une avec SH2-DED et une SH2-DED, muté au niveau du récepteur de la tyrosine, se liant à la tyrosine du RTK. Si on met juste le SH2 ou le SH2 muté et DED, on a une survie normale de la cellule. Mais si on lie SH2-DED, on a une induction de l'apoptose ! Le domaine DED par lui-même ne suffit pas à activer l'apoptose, il doit être recrutés au niveau de la membrane pour activer les caspases apicales ! Initiateurs de l'apoptose : Les caspases 8, 9, 2 ou 10 (ou la C-FLIP (large ou small) possédant une tyrosine plutôt qu'une cystéine) sont les caspases initiatrices, possèdent aussi deux domaines catalytiques mais aussi soit des domaines DED ou CARD. Cela permet les interactions protéines-protéines au niveau apical. La C-FLIP est également recruté au pôle apical mais ce n'est pas une caspase, elle n'a pas de cystéine permettant l'activité protéolytique ! :O Sans aspartate entre les DED et la grande sous-unité, on a également pas de clivage pour la rendre fonctionnelle ! Elle va rentrer en compétition avec les Cas-8 ! Comme nous l'avons dit, il faut un dimère de Cas-8 pour qu'il y est une activité fonctionnelle. Avec que de la caspase 8, on a aucun problème à créer des dimères et réaliser de l'apoptose. Si on a peu de C-FLIP, on a la formation de quelques dimères actif, ce qui rend l'apoptose possible. Si on a beaucoup de C-FLIP, voir des C-FLIP small, on a une quantité très faible de dimères fonctionnelles donc pas d'apoptose ! La formation des ces longs filaments (nucléation) de caspase entraînant l'apoptose est donc inhibé par la concentration variable de C-FLIP (large ou small). Inhibiteurs de l'apoptose : La famille Bcl-2 : C'est une protéine de la famille des anti-apoptotic B-cell lymphoma, dont le but est de bloquer l'apoptose. Bcl-2 augmente la survie cellulaire, à l'inverse des loncogène classique dont le rôle est de promouvoir la prolifération cellulaire. Certaines protéines de la famille Bcl-2 sont pro-apoptotiques. Cette famille est impliqué dans l'apoptose via des signaux intrinsèques. On peut séparer les protéines de cette famille Bcl-2 en trois domaines : - BH1 – 4, possédant le domaine BH4, étant anti-apoptotiques. - BH1-3, ne possédant plus le domaine BH4 mais seulement le BH3, 2 et 1, dont les homologues mammifères sont Bax et Bak. Comme BH1-4 avant lui, cette famille possède un domaine transmembranaire. - BH-3 only, des pro-apoptotiques possédant seulement BH3. Ils ont des domaines transmembranaire comme Bim et Bik, ou pas, comme Bid, Bad, Puma et Noxa. Si on réprime Bad, on augmente la survie cellulaire, vu qu'ils sont pro-apoptotiques. Cette dernière catégorie est associé à la membrane mitochondriale. On a une balance entre ceux qui promouvoit l'apoptose et ceux qui l'inhibent. • La lésion de l'ADN induit la formation de p53 qui induisent la formation (transcriptionnel) de NOXA et PUMA. • Si on a un facteur de croissance ou de survie, on exprime une PI3K, qui réprime BAD. • L'activation de TNF ou Fas entraîne la formation de Casp-8 et l'activation de BID. Ces trois exemples activent Bax et Bak, qui entraînent l'apoptose. Interaction de BIM avec BAX : Avant fixation de BIM sur BAX, on a une queue N-terminal flottante. Quand elles sont fixés, cette queue activent la protéines et n'est plus flottante. Bax et Bak sont localisés sur la mitochondrie, dont l'activation active Apaf-1, Caspase-9 ou Apaf-3, ces trois là agissant sur des caspases effectrices comme la caspase-3. Cette activation libère aussi le cytochrome C dans le cytoplasme. Si il part dans le cytoplasme, il jouera le rôle d'activateur de l'apoptose ! Bax, localisés dans les mitochondries, est associés à une protéines Bh3-only qui la rend plutôt inactive. Un activateur Bh3 va changer la configuration de cette protéine et on aura formation d'oligomères de Bax. Pleins de Bax vont se regrouper ensemble. Et c'est ça qui entrainera la libération du cytochrome C dans le cytoplasme car ces oligomères forment les canaux permettant le passage du cytochrome C. Rôle critique des mitochondries dans l'activation de l'apoptose : Dans le cytoplasme, on trouve Apaf-1 et la pro Caspase-9 qui sont inactives. Ils ont des death domain de type CARD pouvant normalement interagir entres elles MAIS Apaf-1 cache son domaine CARD via des répétitions WD. Quand le cytochrome C arrive, il change la configuration de Apaf-1, libérant son site CARD, qui dimèrise, activant la pro caspase-9 et permettant un auto-clivage formant une holo-enzyme fonctionnelle ! CQFD ! On a alors formation d'une structure appelés apoptosome. 60 millions de cellules qui rentrent en apoptose chaque jour. Les IAP (inhibitor of apoptosis proteins) sont des inhibiteurs de l'apoptose et il y a toujours une valence entre inhibition et activation d'apoptose. Contrôle génétique de l'apoptose chez C.elegans : On utilise 3 caspases majoritairement en résumé : - ced-3, une caspase protéolytique, régulateur positif de l'apoptose. - ced-4, homologue de l'Apaf-1 chez les mammifère. - ced-9, régulateur négatif de l'apoptose. L'apoptose est très importante au cours du développement, elle permet de compenser la prolifération cellulaire et offre une certaine homéostasie cellulaire. Phagocytose des cellules apoptotiques : Des macrophages vont venir nettoyer des débris cellulaires. Ces cellules en apoptose libèrent des signaux « Find-me », qui serviront à recruter des phagocytes. On trouve notamment de la LPC, de la Sphingosine-1-phosphate ou encore des ATP ou UTP. On a ensuite une phase d'ingestion « Eat-me », où les phagocytes dégraderont les corps apoptotiques. LE signal le plus important est le phosphatidylsérine, censé se retrouver sur la face interne mais libérer lors de l'apoptose, permettant le signalement et l'ingestion par les phagocytes. Voie extrinsèque et voie intrinsèque de l'apoptose : La partie majeure, qui est centrale du mécanisme de l'apoptose est conservé au niveau de l'évolution. Apoptose et maladie humaine : Trop d'apoptose conduit à une atrophie tissulaire, on le retrouve dans les maladie neurodégénérative ou le SIDA. Peu d'apoptose conduit à une hyperplasie, un gonflement des tissus, on le retrouve dans certains cancers. III. Bases moléculaires du cancer : 1. Les oncogènes : Ils sont aussi appelés carcinogènes et sont souvent mutagènes. On en trouve des chimiques, induisant des mutations génétiques ou encore des radiations ionisantes (rayons X) et enfin des virus. Mise en évidence de la transformation cancéreuse : En général, parmi une culture de cellules, on peut voir des cellules qui formeront des amas cellulaire et formeront des tumeurs. Suite à l'ajout d'un agent carcinogène, certaines cellules de la culture perdent leurs contacts avec leurs supports, on une perte de l'inhibition de contact. On peut étudier ce phénomène via un test de formation de foyers. On peut aussi voir des pertes de la dépendance à l'ancrage, que l'on met en évidence via un test de formation de colonies en agar. Au début du 20ème siècle, Rous observe des tumeurs chez des poules qu'il explique avec le Rous Sarcoma Virus. On regarde si les cellules infectées par le RSV forment des foyers cellulaires. C'est effectivement ce qui a été observés, on pouvait en déduire que c'était un carcinogène. Le RSV est un rétrovirus. Il pénètre dans un cytoplasme d'un hôte et après libération de la capside, il libère son matériel génétique, de l'ARN. Cette ARN est composé de deux extrémités R et U ainsi que des 3 protéines gag, pol et env pour coder la capside, les protéines nécessaires à la réplication et l'enveloppe. Le virus vient avec une reverse-transcriptase, non présente dans la cellule, permettant de remonter à l'ADN. Le double-brin ADN formé ira s'intégrer dans le génome de l'hôte pour être transcrit. En fonction de où se situera l'infection (somatique ou germinale) on pourra avoir une transmission à la descendance. Le RSV contient un oncogène v-onc : Chez le RSV possède un gène en plus que les gag, pol et env, le v-src. On a créer en laboratoire un virus sans le v-src et on n'observe pas de formation de cancer. On voit que le gène est nécessaire pour former des cancers. En réalisant l'expérience inverse et en mettant uniquement le gène sans le reste des gènes, on prouve qu'il est suffisant car on observe une formation de cancer. On a donc caractériser v-src comme un oncogène. En observant la structure de ce gène, on observe que c'est une protéine de type tyrosine-kinase. Il activera la prolifération cellulaire pour répandre plus vite sa descendance. Si on regarde ce gène en détail via un Southern Blot avec d'une part des fibroblastes de poulet + RSV et d'une autre part des fibroblastes de poulet non-infectés, on observe une bande commune entre les infectés et non-infectés, le c-src. On a deux gènes, un du virus, le v-src et un du fibroblastes, le c-src, très proche du v-src. C'est un proto-oncogène, si elle est sur-exprimé ou sous-exprimé, elle entrainera un effet oncogène. Test de mutagénicité : Si on veut évaluer la capacité d'un oncogène à créer des mutations, on réalise un test de Ames, utilisant des salmonelles mutantes dont le gène de l'histidine est muté. On va chercher des révertants, une mutation qui ramènera la production d'histidine. Une mutation ponctuelle transforme le proto-oncogène en oncogène. Si on prend le gène ras impliqué dans des carcinomes de la vessie, on se rend compte qu'il est muté dans un acide aminé précis. Activation constitutive des voies de signalisation par les oncogènes : Dans une cellule normale, la voie RTK – AP1 n'est pas activé, sauf quand un facteur de croissance active le RTK. Chez ces cellules mutés en Ras, on a une activation de la cascade induisant la prolifération cellulaire sans avoir à activer les RTK ! Transformation cancéreuse par amplification de proto-oncogènes cellulaires : Si on exprime plus de proto-oncogène, on a plus d'expression d'oncogène et donc plus de chance d'avoir des cancers. Dans le génome, on a une augmentation de la proportion du gène ! Exemples de proto-oncogènes : Type Type Type Type Type 1 : Facteurs de croissances 2 : Tyrosines kinases (récepteurs ou protéines associés) 3 : Régulateurs cytoplasmiques 4 : sérine/thréonine kinases cytoplasmiques 5 : facteurs de transcription Des gènes suppresseurs de tumeurs sont présents pour réguler les tumeurs. Si on fusionne une cellule tumorale et une cellule non-tumorale, on obtient une cellule normale, et cela grâce à des gènes suppresseurs de tumeurs comme p53. Le gène du rétinoblastome (Rb) code pour un suppresseur de tumeur. La progression tumorale : On peut regarder les mutations sur Ras et p53, on peut regarder leurs méthylations, qui joue sur leurs expressions (si on est hypométhylés, on sera exprimé) La probabilité de développer un cancer dépend de l'âge, de la biomasse (le nombre de cellule dans le corps), etc … Il y a 40 copies de p53 chez les éléphants, qui ne développent pas plus de cancer que l'Homme alors qu'ils vivent plus longtemps et on plus de biomasse !
