Telechargé par zahradine67

DRC v2

publicité
Dynamique et régulation cellulaire :
La culture cellulaire in vitro permet de créer, à partir d'un petit bout de plante, un
grand nombre de plantes du même
type.
Par exemple, sur une pomme de
terre qui bourgeonne à l'obscurité,
on peut récupérer les pousses, le
fragmenter, le mettre en culture et
récupérer un milliers d'individu
provenant d'une même pousse.
Les méthodes de culture cellulaire
sont multiples et dépendent des
espèces. On peut utiliser un
embryon de plantes, un organe, un
cal (cellule indifférencié) ou une
cellule par exemple.
Cultures cellulaires végétales : Historique et impact :
1. Totipotence des cellules végétales :
L'idée que le noyau d'une cellule était le site pouvant régénérer tout un organisme à
été émis par Haberlandt en 1902 : « Toute cellule végétale est capable de régénérer
un nouvel organisme identique à celui dont elle est issue.» (pas vraiment possible sur
toutes les cellules)
De nombreuses cellules végétales sont totipotentes tandis que seul le zygote est
totipotent chez les métazoaires.
En 1965, Vasil et Hildebrandt on pu prouver que l'idée de Haberlandt était juste en
régénérant un plant de tabac.
2. Historique de la culture in vitro :
En 1934, White réussit à créer une culture de tomates en milieu in vitro via une racine
de tomate. (Le milieu était composés d'eau, de sels minéraux, d'extrait de levure, du sucre et de
l'auxine, seul hormone végétale connue à l'époque.)
En 1939, Gautheret a permis le développement indéfini (On cultive aujourd'hui encore
des cellules du premier cal de Gautheret) d'un cal de cellules dédifférenciées à partir
d'un fragment de racine de carotte. Il s'agit de la première vrai culture in vitro
(Dans du verre). Les cellules ayant poussé à partir de la racine différencié sont des
cellules indifférenciés.
En 1962, Murashige et Skoog mettent au point le premier milieu de base pour la
culture in vitro :
- Sels minéraux (macro et micro-éléments en g/L et μg/L)
- Sucres (saccharose)
- Vitamines (B)
- Hormones (Auxine et cytokinines)
- pH acide à 5,5
La culture est faite à température, lumière et hygrométrie contrôlée.
Via cette technique, on a pu faire de la prolifération de méristème de tige, ce qui
n'avait jamais été fait auparavant, le méristème ayant toujours été réfractaire à la
multiplication végétative in vitro.
Des substances organiques sont ajoutés parfois pour tenter de booster la croissance de plante, les
espèces végétales ne répondant pas tous de la même façon à la culture in vitro (acides aminés, extrait
de banane, pomme de terre, etc. )
3. Activation de processus cellulaire programmés :
Le fragment sectionné, blessé, doit cicatrisé pour ensuite régénérer spécifiquement
le morceau endommagé.
•
•
•
1ère étape : Dédifférenciation cellulaire : Une fois un fragment coupé et retiré
de l'organisme mère, il perd les signaux de position, nutrition, dominance apical
de l'auxine, etc. qu'il avait auparavant. Il redevient une cellule dédifférencié
de cals.
2ème étape : Multiplication cellulaire
3ème étape : Redifférenciation cellulaires
Certains résultats sont meilleurs :
➢ Quand les tissus d'origine du tissus de départ sont des tissus jeunes
(embryons zygotiques immatures, hypocotyles (tissus en dessous du cotylédon)
et cotylédons (pseudo-feuille poussant au début du développement de la
plante) de germinations, méristèmes de plantes adultes).
➢ Quand les cellules sont diploïdes plutôt que polyploïdes.
➢ Chez certaines familles de plantes (Solanacées, Brassicacées (4 pétales
formant une fleur (A. Thaliana, Choux, Carotte))) et certains génotypes au sein
d'une famille (Tournesol)
4. Développement d'explants pluricellulaire :
•
1ère voie : L’organogenèse : Passer d'un cal (cellules indifférenciés) à une
plantule. En partant d'embryons immatures, on peut générer des pousses de
tiges ou des racines selon le milieu de culture dans lesquelles on les placent.
•
2ème voie : Embryogenèse somatique : On part d'un explant immatures pour
donner un 'organe' ayant une morphologie d'embryons végétales, appelés
embryons somatiques. Ces embryons permettent ensuite de donner des
individus. C'est le développement initial d'un tissu indifférencié de type
embryonnaire qui se développe en un individu complet.
5. Conditions de régénération de plantules :
Le milieu de culture se doit d'être :
1. Aseptisation du milieu ET de l'explant.
2. Milieu de culture solide (agarose)
•
•
AVANTAGES : Manipulation facile, action physique du maillage favorise les divisions et l'ancrage.
LIMITES : Diffusion des nutriments
Milieu de culture liquide
•
•
AVANTAGES : Absorption aisée des nutriments
LIMITES : Manque d'oxygénation (besoin d'agitation), sécrétion de produits toxiques dans le milieu
Les repiquages réguliers sont indispensables.
Les risques sont la perte de stérilité et la contamination par des bactéries ou levure.
Rôle des hormones dans la croissance :
L'auxine, de son vrai nom Acide indole-3-acétique (AIA) est synthétisé dans l'apex, le
méristème apical des pousses. Ces effets sont les suivants :
- élongation de la tige
- différenciation et croissance des racines (en grande quantité)
- maturation du fruit
- inhibition de croissance des bougeons latéraux
- phototropisme des feuilles et géotropisme des racines
La cytokinines, a d'abord été appelé zéatine puis fut synthétisé en laboratoire. Elle
est synthétisé dans les racines et les tissus à croissance rapide. Ses effets sont les
suivants :
- retard de la sénescence
- ramification et perte de domination apical (antagoniste de l'auxine)
- dépendant du taux d'auxine associé
Choix de la balance
hormonale :
Quand on a une
majorité d'auxine, la
croissance des racines
est privilégié. Quand on
a une majorité de
cytokinines, on a un
développement des
bourgeons végétatifs.
Enfin, si on a une
quantité faible d'auxine
et de cytokinines, on
obtient une floraison.
6. Applications de la culture in vitro :
Les applications de la
culture in vitro sont
nombreuses, on peut faire
du 'sauvetage
d'embryons', de
l'haplodiploïdisation,
l'obtention de
protoplastes, la
multiplication conforme ou
la culture de méristème.
Culture de méristèmes :
En 1952, Morel et Martin développe une technique pour protéger et sauver les plantes
malades, touchés par des virus.
On cultive le méristème car c'est la seule zone qui n'est jamais contaminé par un
virus. Il pousse plus vite que le virus n'infecte les cellules.
Sauvetage d'embryons :
Certains croisement interspécifiques ne permettent pas le développement de graines !
Un embryon crée en forçant un croisement entre deux plantes donne un hybride que
l'on n'aurait pas obtenu en croisant pollen et anthère.
La culture des embryons immatures permet l'obtention de plantes.
Les avantages sont que l'ont peut s'affranchir de l'étape de dormance des
semences, le développement des embryons est homogène et l'accélération du cycle
végétatif.
Haplodiploïdisation :
Mise en culture des organes reproducteurs afin de développer des individus à partir
des cellules reproductrices et gamètes. Ces cellules contiennent une seule copie de
l'information génétique.
Au cours de la régénération, on peut réussir à doubler à l'identique cette copie. Les
individus obtenus sont des lignées pures car ils ont la même information sur les deux
chromosomes, ils sont homozygotes.
Utilisation de protoplastes : Explants unicellulaires :
Digestion enzymatique de la paroi de parenchyme de jeunes feuilles pour isoler une
suspension de protoplastes (tissu obtenu quand la paroi d'un tissu végétale est
digérer).
Ces cellules peuvent grandir mais sans paroi, elles ne se développent pas. Au bout de
24h, en environ 10 minutes, une nouvelle paroi apparaît (si le milieu contient les
éléments nécessaire). On peut alors modifier les protoplastes, par hybridation
somatique par exemple.
Pour le noyau, plusieurs schéma peuvent apparaître :
- Soit un des deux noyaux est gardé complètement
- Soit une proportion variable de chaque ADN est conservé
- Soit on se retrouve une cellule poli-nuclée.
Lorsque deux noyaux reste
présent dans le cytoplasme,
on parle d'hétérocaryons.
Lorsqu'un seul noyaux reste,
sans mixte avec l'autre, on
parle de cybrides.
Lorsque qu'une proportion de
chaque noyau est présent, on
parle d'hybrides
somatiques.
Il faut ensuite sélectionnés dans cette population les éléments intéressantes via des
marqueurs morphologiques (pigments) ou des marques de résistance. Seul les
hybrides ayant acquis une résistance à un pathogène seront sélectionnés. On peut
ensuite caractérisés génétiquement ces individus.
L'avantage est notamment de pouvoir créer de nouvelles variétés de plantes.
➢ Pourquoi créer de nouvelles espèces par hybridation somatique plutôt que par
croisement ovule X pollen ?
On peut passer outre la volonté de Dieu et créer de nouvelles espèces ! (Et
accessoirement, on peut aussi créer des croisements qui n'aurait pas été
naturellement possible)
Des problèmes peuvent survenir suite à l'incompatibilité des génomes. De plus, les
mitochondries expriment également du matériel génétique et porte eux-mêmes
parfois les résistances. Il faut apprendre à les faire passer entre les espèces
également.
Cela permet de créer des plantes cultivés qui acquiert des capacités intéressantes.
Un problème agricole à résoudre était de produire de l'huile de colza à un meilleur
rendement.
Via des populations très homogène qui se fécondaient tout le temps entre eux, on
obtient des génomes homozygotes. Ces plantes sont moins aptes à grandir et à
pousser que des populations hétérozygotes.
On a alors hybrider des plants via l'hybridation somatique !
Pourquoi pas zygotique comme c'était la même espèce ? Parce que les colzas ont
tendance à s'auto-féconder. On n'obtenait pas d'hétérozygote via cette hybridation.
Les hétérozygotes avaient des patrimoines génétiques qui se complétaient et fournit
une meilleur huile.
Une alternative est de rendre le colza mâle stérile et ainsi forcer une fécondation
d'un autre individu.
Comment du colza mâle stérile a-t-il été obtenu ?
Hybridation zygotique :
Pollen Colza x Ovules radis mâle stérile
=> Colza stérile MAIS
Les graines ne sont pas du tout utilisable par les agriculteurs (Photosynthèse peu
efficace).
On s'est rendu compte que lors de la fécondation, le pollen contient uniquement le
noyau de la souche mâle alors que l'ovule contient le noyau et les mitochondries !
Hors c'était les mitochondries qui portaient le gène de la stérilité mâle.
Hybridation somatique :
Colza X Radis blancs
=> L'hybridation somatique fonctionne et permet de sélectionner du colza mâle stérile
dont les cellules possèdent le noyau et les chloroplastes du colza et les mitochondries
du radis !
L’intérêt de la mise en culture de protoplastes :
Il faut s'intéresser à la culture de cellules pour réaliser des hybridations.
On doit d'abord mettre en culture des cellules qui doivent régénérer un cals puis des
pousses ou racines. Une cellule végétale sans paroi est incapable de se diviser à
nouveau.
Avant de se diviser, une plante recrée une paroi pecto-cellulosique. Dans beaucoup
d'espèce, il faut environ 24h pour former d'un coup une paroi.
En 24h moins une dizaine de minutes, on ne voit encore rien !
En utilisant du Calcofluor White, on peut marquer cette paroi et la voir apparaître.
Ces premières divisions cellulaires n'augmentent pas le volume cytoplasmique
immédiatement.
Après quelques heures, le cals obtenu va grossir et augmenter le volume de chaque
cellule. C'est enfin la variation des hormones du milieu qui génère pousses ou racines.
7. Variation somaclonale :
Constat : Toutes les plantes régénérées à partir de cultures cellulaires d'une seul
cellule de base sont pas toutes identiques à la plante-mère ! :O
Ces plantes ont été modifiés quelque part.
Causes :
- Caractère polyploïde (division cellulaire se passant mal)
- Altération du nombre de chromosomes
- Réarrangements chromosomiques (translocations, délétions, … )
- Modification des génomes mitochondriaux et plastidiaux (chloroses, … )
- Activation de transposons
- Mutations ponctuelles
Limites :
- Vitrification : Plante plus verte, plus brillante, elle ne présente pas de signes de
dysfonctionnement mais elle est muté dans un grand nombre de gènes.
- Albinisme : Impossibilité de produire des chloroplastes fonctionnels et entraîne la
mort de la plante.
8. Cultures de souches cellulaires en suspension :
On doit passer par une culture
in vitro quand on veut passer
d'une cellule unique à un cals
puis un individu entier.
Cette culture passe par trois
phases de croissance :
- Une phase de croissance
exponentielle
- Une phase de croissance
linéaire
- Une phase stationnaire
Ces 3 phases sont précédés
d'une phase de latence.
On doit régulièrement réalisés des repiquages, en général juste avant la phase
linéaire, pour apporter aux cellules les éléments nécessaire à la croissance qui
s'appauvrissent dans le milieu.
Il est inutile de repiquer avant la phase linéaire puisque le milieu 1 possèdent encore
suffisamment de nutriments pour pousser.
La génération de la courbe de croissance permet de déterminer le moment parfait
pour repiquer une plante sans gâcher de ressources.
Chez les cellules de tabac BY-2, qui poussent en fil sur le milieu de culture,
permettent d'y appliquer des drogues pour synchronisée leurs cycles cellulaires.
9. Transgenèse :
Comment transformer un gène et l'incorporer dans un génome.
L'idée est de transférer un ou plusieurs gènes d'une espèce à une autre sans aucune
barrière.
Applications :
•
•
Étude fonctionnelle de gènes d'intérêt (RECHERCHE FONDAMENTALE)
Amélioration des rendements agricoles (risque potentiel) (RÉSISTANCE AUX
RAVAGEURS, TOLÉRANCE AUX HERBICIDES)
•
Amélioration des qualités nutritionnelles de produits agroalimentaires
(RIZ DORE,
TOMATES, MELONS, … )
•
Amélioration des plantes à l'origine de produits industriels
PÂTE A PAPIER)
(BOIS PEU LIGNIFIE POUR
•
Utilisation des plantes comme bioréacteurs
(PRODUCTION DE MÉDICAMENTS , VACCINS
ORAUX, PLANTICORPS, … )
Risques :
•
•
Le site d'intégration du transgène est rarement ciblable. Cela peut
conduire à des effets physiologiques non contrôlés.
Les transformants expriment souvent des marqueurs de sélection
(résistance à un antibiotique, un herbicide, … ), qui peut être transférable
à d'autres organismes.
Méthodes de transfert :
- Électroporation
- Canon à particules
- Micro-injection
- Via Agrobacterium tumefaciens
L'éléctroporation :
Le champ électrique provoque la déstabilisation de la membrane et
induit la formation de pores à travers lesquels l’ADN peut transiter.
Ce phénomène est réversible si le choc électrique n’est pas trop violent et la
membrane peut reprendre son état initial.
Efficacité 100 à 1000 fois meilleure que micro-injection cytoplasmique du vecteur
1985, Fromm sur des protoplastes.
1990, Dekeyser, sur cellules intactes de plantes
Bombardement à partir d'un canon à particules :
Basé sur la biolistique, il s'agit de projeter des microbilles de tungstène ou d'or de
1 μm de diamètre, enrobées avec le plasmide possédant le gène d'intérêt.
Ces microparticules acquièrent l'énergie cinétique nécessaire pour traverser la paroi
cellulaire, la membrane plasmique et l'enveloppe nucléaire. Le gène s'intègre
rarement, on a une expression transitoire.
Via Agrobacterium tumefaciens :
Agrobacterium tumefaciens est une bactérie qui, dans la nature, provoque des
tumeurs au niveau des blessures des plantes.
Les tumeurs sont provoqués par le transfert, de la bactérie vers la plante, du
plasmide Ti (Tumor-inducing) dont un fragment (ADN-T, T pour transfert) s'insère
dans le génome de la plante et s'exprime.
En 'désarmant' le plasmide de Agrobacterium tumefaciens (en retirant les sites
codant l'auxine, les cytokinines et les opines responsable de la tumeur) et en les
remplaçant par les gènes d'intérêt, on peut incorporer un gène à une plante par cette
voie.
Les applications de ces techniques sont nombreuses. On peut notamment lutter contre
la pyrale du maïs en faisant synthétiser au maïs une toxine létale pour l'insecte.
On peut également diminuer le pourcentage de lignine dans les plantes et ainsi
diminuer les traitements nécessaires à la formation de pâte à papier.
BILAN :
Cours 2 : Carine Meignin :
L'apoptose a longtemps été considéré comme une conséquence de caractéristiques de
l'environnement qui affectait les cellules. Cependant, si ce mécanisme ne pouvait pas
être forcés et volontaires, les organismes aurait un déséquilibre dans leur balance
division cellulaire/mort cellulaire.
Les facteurs de croissance et récepteurs :
Un facteur de croissance est un
peptide. Dans un premier temps,
un signal extracellulaire de
nombreux types (facteurs de
croissance, de différenciation,
des hormones, l'environnement
proche … ).
Les cellules possèdent sur leurs
membranes des récepteurs
transmembranaires permettant
la signalisation et un transport
de l'information. On parle de
transduction du signal.
La réponse engendré peut être de plusieurs nature :
- Prolifération cellulaire (dans le cas d'un facteur de croissance)
- Différenciation (dans le cas d'un facteur de différenciation)
- Migration
- Apoptose
Perception du signal :
Les signaux peuvent être perçus par les cellules de différente façon :
•
La cellule émettrice peut être la cellule receveuse, on parle de boucle
autocrine. La molécule doit sortir de la cellule pour agir sur ces propres
récepteurs. (Ex : IL2)
La cellule émettrice
produit un facteur qui
est exporté dans le
milieu extracellulaire, qui se fixe sur une cellule réceptrice différente. On
parle de stimulation paracrine. (Ex : PDGF, VEGF, etc … )
•
•
Une cellule émet le signal dans le sang et permet le transport du signal dans
l'intégralité de l'organisme pour être délivrés au niveau des cellules
réceptrices. On parle de stimulation endocrine. (Ex : Facteurs de croissance
des chondrocytes)
•
Enfin, on peut avoir une cellule émettrice qui produit par exemple un facteur de
croissance qui reste ancrée dans la membrane, permettant de stimuler
uniquement les cellules proches. On parle de stimulation juxtacrine. On a
également l'intervention de certaines enzymes appelés Sheddases, ancré dans
la membrane, clivant le facteur de croissance dans la membrane pouvant le
libérer.
Dans cette famille des Sheddases, on trouve les protéines ADAM, qui possède un domaine enzymatique
métalo-protéases. On en trouve sur la membrane plasmique et suite à stimulus, elle peut cliver un
facteur de croissance proche ancrée dans la membrane.
Découverte des premiers facteurs de croissance NGF et EGF :
L'embryologiste Rita Levi-Montalchini et le biochimiste Stanley Cohen ont réalisés
des tests sur la régulation de la croissance des fibres nerveuses. Ils ont observés
qu'en amputant le bourgeon d'un membre de poulet, les cellules nerveuses du
membres vont mourir, ils ne sont plus irrigués par quelque chose dont ils ont besoin.
A l'inverse, en greffant ce bourgeon sur une partie de l'animal, on voit la progression
de cellule nerveuse.
On peut en déduire que le bourgeon est nécessaire et suffisant pour créer des nerfs.
Un signal devait en partir pour favoriser la croissance de fibres nerveuses.
Cohen a utilisé des phosphodiestérase produit à partir de venin de serpent pour
détruire des acides aminés sur les bourgeons de membres … et les nerfs continuent
de pousser !
En purifiant cette molécule, on récupère aussi toutes les molécules des glandes
salivaires ! En utilisant les glandes salivaires d'autres espèces, ils sont arrivés au
même résultat. Le facteur de croissance qui faisait pousser les nerfs se trouvait dans
les glandes salivaires. Ils l'ont appelés le NGF.
En testant in vivo ce NGF de ces glandes salivaires, on produit bien une croissance des
nerfs mais également une sur-croissance des yeux et des dents. C'était l'EGF.
Ils ont le prix Nobel en 1986 pour la découverte des facteurs de croissances.
Découverte du PDGF (Platelet Derived Growth Factor) :
En centrifugeant du sang
et en plaçant du plasma ou
du sang sur des
fibroblastes, on ne voit
aucune pousse. Cependant,
en prenant uniquement le
sérum, on provoque une
pousse des fibroblastes !
Qu'y a t-il dans le sérum
qui n'est pas présente
dans le sang ?
En fait, quand on fait coaguler le sang pour créer du sérum, les cellules sanguines vont
lyser et libérer leurs contenus. C'est la lyse de ces plaquettes sanguines qui libère le
PDGF et induit la pousse de fibroblaste.
Méthode d'étude des facteurs de croissance :
•
On peut simplement placer le facteur de croissance sur des cellules pendant un
certains temps pour compter les cellules avant et après et mesurer la
prolifération cellulaire.
•
On peut placer à t=0 le facteur de croissance avec différent produit (MTT,
XTT, Alamar Blue) puis on réalise un test colorimétrique pour mesurer
l'activité déshydrogénase mitochondriales.
On peut ainsi voir si les cellules peuvent réaliser correctement le cycle de
Krebs. Cela permet de mesure la viabilité cellulaire.
Cette technique est :
- Rapide
- Reproductible
- Automatisable
- Sans radioactivité
- Permettant de compter le nombre de cellule vivante.
•
On peut placer de la thymidine tritiée dans le milieu avec le facteur de
croissance. Elle va s'incorporer dans l'ADN uniquement au moment de la
réplication pour former de l'ADN et permet de mesurer la réplication
cellulaire.
•
On peut marquer la cellule au
CFSE, permettant, via un suivi
de la fluorescence, de suivre
étape par étape les divisions
cellulaire en fonction de la
quantité de fluorescence dans
chaque cellule-fille. Chaque pic
sur le profil de FACS définit le
nombre de division cellulaire
qui se sont réalisés. On peut
ainsi suivre les divisions
cellulaires.
Exemple de facteurs de croissance/différenciation :
Le NT1 correspond à une neurotrophine et agit sur la survie neuronale.
L'EPO est un précurseur des globules rouges. Il est notamment émit suite à un temps passé à de
hautes altitude, pour permettre au corps de s'accommoder au manque d'oxygène.
Le TNF (Tumor Necrosis Factor) induit l'apoptose et la mort cellulaire.
Les facteurs trophiques permettent la survie cellulaire.
Les facteurs chimiotactiques induisent la migration cellulaire. Il attire des cellules.
Notamment lors des infections virales, ces facteurs attirent les cellules immunitaires
sur le lieu d'infection.
Orchestration de la réponse immunitaire par les cytokines :
Les réponses cellulaire et humorale sont des réactions du corps pour lutter contre
une infection bactérienne ou virale.
Dans la réponse cellulaire, des lymphocytes TCD8+ (killer) tuent les bactéries et les
macrophages 'nettoient' le déchets cellulaires.
Les lymphocytes B produisent des anticorps lors de la réponse humorale.
Ces cellules ont les mêmes précurseurs !
Il s'agit de lymphocyte TH0 (CD4) qui via de l'IL-12 ou des INFg vont les transformer
en TH1 qui, ensuite, via de l'IL-2 ou des IFNy donneront les cellules de la réponse
cellulaire.
Dans la même idée, en partant d'un TH0, avec un autre cocktail de cytokine, on peut
produire les cellule de la réponse humorale.
Contrôle de l'angiogenèse par le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) :
1. Il induit la formation de capillaire sanguin. Les cellules endothéliales composant
les vaisseaux sanguins peuvent former un pseudopode en présence d'IL-8.
2. Le VEGF active la division cellulaire préalablement initié par la formation du
pseudopode.
3. On a ensuite formation de 2 vacuoles contiguës dans les cellules filles.
4. Ces vésicules fusionnent et on a le départ d'un nouveau capillaire sanguin.
VEGF stimule spécifiquement la prolifération des cellules endothéliales :
En utilisant une concentration croissante de VEGF sur des cellules endothéliales, on
peut mesurer la valeur nécessaire de VEGF pour induire la division efficace de
l'endothélium.
Sur des cellules endothéliales, on note une valeur efficace vers 10 3 pg.
Sur les fibroblastes, on ne peut induire de croissance via le VEGF. En fait, il n'y a pas
de récepteurs au VEGF sur les fibroblastes.
L'expression de VEGF est induite en réponse a une hypoxie :
Le Southern Blot permet de mesurer l'ADN.
Le Northern Blot permet de mesurer l'ARN.
Le Western Blot permet de mesurer les protéines.
Sur le Northern Blot ci-dessous, on note une absence de VEGF en condition normale.
Le gène n'est pas exprimé. Dans des conditions hypoxique, on note la présence d'ARN
* Les protéines Nodal ont un rôle dans la symétrie-gauche. On mesure la présence de
Nodal via une hybridation in situ (qui marque l'ARN et l'ADN via une sonde)
Cours 2 :
Activation des récepteurs et initiation de la transduction du signal :
Les facteurs de croissance sont des molécules protéiques assez grosses ne passant
pas à travers la membrane. Elles ont besoin de récepteur.
Les premiers facteurs découvert sont les hormones, de toutes petites molécules
transmettant un signal.
(Pierre CHAMBON, directeur de l'IBMC, découvre les ARN I, II et III, il travaille
sur la chromatine et met en évidence le nucléosome. Enfin, il découvre le mécanisme
d'épissage chez les eucaryotes et les récepteurs de l'acide rétinoïque. )
Il existe un grand nombre d'hormones jouant le rôle de ligand, activant des
récepteurs nucléaires et diffusant à travers la membrane.
Un récepteur nucléaire possède un domaine permettant l'interaction avec le ligand, un
pour interagir avec l'ADN (permettant d'activer les gènes cibles en modifiant sa
structure) et un domaine ligand-dépendant.
Ils sont monomériques puis deviennent dimériques après changement de conformation.
Le récepteur est présent dans le cytoplasme de façon inactif. Une protéine
inhibitrice lui est associé pour être sur de bloquer le message
. Quand le ligand se forme, le récepteur va dans le noyau.
Le ligand va rejeter l'interaction avec la protéine inhibitrice et permet la libération
du domaine d'action du récepteur.
D'autres protéines, co-activatrices, peuvent venir assurer le message pour garantir
un effet.
Pour un facteur de croissance, c'est différent. Il ne diffuse pas.
On a besoin de récepteurs transmembranaires qui captent le message extracellulaire
et le transmet.
La majorité des récepteurs sont sous forme monomériques. Un facteur de croissance,
en général dimériques, va reconnaître une branche du récepteur et rapprocher la
deuxième pour dimériser le récepteur. Un dimère crée un dimère.
Ces modifications du récepteurs vont permettre la transmission du signal.
Le récepteur à l'EGF et
son récepteur est
l'EGFr. L'EGF est
toujours sous forme
monomérique. Quand il
agit avec son récepteur,
il change la conformation
du récepteur et recrute
un autre EGF pour
dimériser un récepteur.
2 monomères fabrique un
dimère.
Les facteurs FGF se fixent sur leurs récepteurs sous forme oligomérisée (à
plusieurs). Le FGF récepteurs est intégré dans la membrane plasmique.
Au niveau de la MB, des protéoglycanes agissent avec des molécules GAG (polymères
de sucre linéaires). Ce polymère de sucres va permettent de rassembler les FGF et de
les rapprocher de la membrane plasmique, les récepteurs vont bouger sur la
membrane fluide jusqu'au FGF rassemblés et permettent le passage du signal.
Expérience :
(L'anti-pY sert à montrer qu'on a une activité phosphorylation)
Dans le cas de la FGF, mettre du FGF contre son récepteur n'est pas suffisant pour
induire un signal. Il faut une interaction FGF + une molécule de type GAG pour
activer le récepteur. C'est les GAG qui forment des dimères de FGF.
Mise en évidence de récepteurs multimériques :
L'IL-3 va agir avec l'IL-3 alpha et beta. On forme un hétérodimère. Pour mettre en
évidence ces interactions, on utilise un ligand radioactif et on le met en présence
d'une molécule appelé DSS, permettant de former des liaisons covalentes (crosslinking). On va forcer des liaisons covalents pour relier le ligand radioactif avec une
branche de son récepteur.
Puis on réalise une autoradiographie sur SDS-PAGE et on observe 3 bandes. L'IL-3
non fixée sera situé au bas de la fraction. L'IL-3 avec le beta et l'IL-3 avec le alpha
se trouve plus en hauteur de la fraction. Les deux bandes définissent deux protéines
de tailles différentes.
Structure et fonction de l'IL-2 :
Formation d'un tétramère formant le
récepteur via alpha, beta et gamma,
trois monomères, qui agiront avec
l'IL-2.
L'IL-2 est une petite molécules se
repliant sur elle-même. On sait que la
tyrosine en position 59 (Y59) agit
avec alpha, le D34 agit avec l'IL-2RB
et le Q141 agit avec une molécule
inconnu.
En connaissant les acides aminés
responsables des liaisons, on peut les
muter et observer la réponse
cellulaire.
•
Sans muter quoi que ce soit, on obtient un graphique de type courbe noire.
•
De l'IL-2 muté donnera la courbe jaune.
On observe une réponse cellulaire, même si on empêche l'interaction avec le
récepteur alpha ! Elle met plus de temps à se mettre en place mais elle est
présente.
Le récepteur alpha n'intervient pas pour la transduction du signal.
•
La courbe violette définit la mutation sur D34.
Même conclusion pour le récepteur beta.
•
Enfin si on mute le Q141 on obtient la courbe verte.
On ne voit pas de réponse cellulaire ! La partie gamma permet la transduction
du signal ! CQFD.
Les récepteurs tyrosines-kinases : (RTK)
On s'intéressera ici qu'au récepteur de type 1.
Ils jouent un rôle essentiel dans les mécanismes de migration, apoptose,
différenciation, etc …
Ils peuvent se phosphoryler eux-mêmes sur leurs récepteurs.
La phosphorylation des tyrosines apparaît quelques secondes après l'activation d'un
récepteur et permet la transduction du signal (Présente chez tout les eucaryotes
sauf les plantes).
Ils permettent le transfert d'un gamma-ATP et de changer la conformation ou
l'interaction protéines-protéines qui auront un effet.
Les RTK 1 sont transmembranaires. Ils ont un domaine transmembranaire
hydrophobe, plusieurs domaines comme des cystéine-riche, des fibronectines de type
III et des domaines immunoglobulines.
Ensuite, dans le cytoplasme, on a deux grandes catégories avec des domaines
tyrosine-kinase.
On en a soit 1 seul (cas de l'EGFr) soit 2 domaines séparés tyrosine-kinase.
Parfois, on trouve des domaines SAM en bout de partie cytoplasmique permettant des
interactions protéines-protéines.
La forme active du récepteur VEGF n'est présent que lorsque l'on place du VEGF avec du VEGFr. On met cela en
évidence via un immunomarquage VEGFr Tyrosine-Kinase.
La molécule VEGFr est toujours présente mais pas toujours sous forme active.
Dimérisation du récepteur EGF par son ligand :
On forme comme vu auparavant un homodimère. La protéine sauvage de l'EGFr
possède deux domaines cystéine-riche et un domaine TK.
En retirant le domaine cytoplasmique, on obtient une protéine tronqué qui s'ancrera
dans la membrane mais on n'aura pas de transduction du signal sans domaine TK.
(On utilise un marquage à la Met-S 35 radioactive car 99% des nouvelles protéines
commence par une méthionine (AEG=Met). On utilise du DSS pour lier le ligand et le
récepteur et de l'EGF pour servir de ligand.)
Dans le premier cas, sans facteur et sans cross-linking, on ne voit rien, c'est de même
si on mais juste l'EGF. Juste le cross-linker est un contrôle négatif et enfin, si on
met le DSS et le EGF, on voit une bande à 340 kDa montrant l'homodimère actif
!
En utilisant la protéines tronqué, on observe une bande à 115 plus légère définissant
le récepteur muté sans ligand.
Les trois dernières bandes définissent un dimère avec deux monomères sauvage, un
dimère avec deux mutés et entre les deux, un dimère avec un sauvage et un muté.
Dans le cas d'un dimère sauvage, on aura une auto-phosphorylation des deux domaines.
Sur l'hétérodimère, on aura aussi auto-phosphorylation mais d'un seul monomère.
La trans-phosphorylation définit le fait qu'un domaine TK ne peut phosphoryler que
son voisin. On n'observera un phosphorylation uniquement dans le cas où on trouve
deux monomères sauvage avec des domaines TK fonctionnel.
Phosphorylation des tyrosines du domaine intracytoplasmique du récepteur PDGF :
Le PDGF va former un dimère fonctionnelle pour son récepteur et va transmettre un
signal. Les domaines PK seront phosphorylé lors de l'activation. On aura ensuite une
activation des PK intracellulaires et enfin, une cascade de phosphorylation
intracellulaire.
• La phosphorylation au niveau des domaines TK contrôle l'activité de son
récepteur.
•
La phosphorylation au niveau des domaines TK intermédiaires, qui sont noncatalytiques (domaines KID), permet le recrutement de nouvelles protéines qui
auront des affinités pour les protéines phosphoryler et contiennent des
domaines SH2 ou PTB, présents au sein de nombreuses protéines.
Protéines agissant avec les domaines KID :
Il s'agit là d'un recrutement de messagers secondaires. Le récepteur va rester dans
la membrane mais va recruter des protéines pour permettre le message.
Les domaines SH2 :
Composés essentiellement d'arginine, elles agissent avec des tyrosines phosphorylés.
La sérine ou la thréonine peuvent également être phosphorylés mais n'agissent pas
avec les groupement SH2. Il faut également un cycle aromatique pour cela, cycle
présent chez la tyrosine.
Les adaptateurs phospho-sensibles :
Il s'agit de protéines ayant une affinité pour des domaines phosphorylés, comme
notamment SH2 et PTB mais il en existe d'autres.
Association avec les messagers secondaires : 3 exemples :
1. La PhosphoLipase C-gamma est recruté dans les domaines KID via la tyrosine
phosphorylés. Agir avec la PLC-gamma va la rapprocher de la membrane
plasmique (elle-même composés de lipides pas forcément identique en terme de
composés).
PIP2 (phosphatidyl-inositol bisphosphate) va agir avec la PLC-gamma proche de
PIP2 et PIP2 sera clivée. On va former d'une part du DAG et de l'autre par de
l'IP3. C'est mécanique et dû uniquement au fait du rapprochement de PLC et
PIP2
DAG va permettre l'activation de PKC à la membrane plasmique. L'IP3 va
permettre de relarguer du calcium au niveau du réticulum endoplasmique.
Si on traite des lymphocytes T avec uniquement la première molécule ou la seconde,
on aura aucun effet. Si on met les deux, on observe une prolifération ! Elle est
induite uniquement si 2 effets sont présents : Augmentation du calcium
intracellulaire et activation des PKC.
Augmenter la concentration en calcium va induire le recrutement de calmoduline, qui
vont changer de conformation dû au calcium et vont rapprocher leurs domaines Cterminal de son N-terminal. En attachant de la BFP et de la YFP dans les domaines C
et N, on peut observer ce changement. En fait, quand la protéine n'est pas activé, les
domaines C et N sont trop éloignés pour réagir entre elles. Mais quand on l'active et
que sa conformation change, un des BFP/GFP
•
P3 Kinase possède deux sous-unités : P185 avec la SH2 et P110 avec une
activité phosphorylase. En la rapprochant des lipides, on va avoir une
phosphorylation d'un PI, qui sera transformé en PI-3 phosphate [Pi(3)P].
Si on la rapproche d'un PI-4, on aura alors un PI 3,5 bisphosphate.
Elle rajoute en fait un phosphate au lipides. On modifie juste la membrane.
Elle phosphoryle un lipide en position 3 du cycle.
Quand elle agit sur PIP2, elle va le transformer en PIP3, cela va induire le
recrutement de différente protéines, dont des protéines à domaine PH qui
recruteront à leurs tours des protéines (PDK1 / PKB Akt) qui seront phosphorylé,
perdront leurs affinité pour les PH et tomberont dans le cytoplasme, ce qui agira sur
la phosphorylation d'une facteur BAD. Non-phosphorylé, cela conduit à l'apoptose
mais si BAD est phosphorylé, cela induit la survie.
Cours du 14/10 : Meignin :
Le tableau suivant présentes les lipides pouvant intervenir dans la signalisation et
ceux pouvant être modifiés pour agir. (tableau 1)
Les protéines pouvant interagir avec des lipides modifiés sont présentes en très
grand nombres. Nous avons parler des protéines à domaine PH (PDK1 par exemple)
Ces phospholipides peuvent être modifiés dans les deux sens, le mécanisme est
réversible. On peut toujours passer d'un état modifiés à un autre via de nombreuses
enzymes.
La PI3K va ajouter un phosphate en position 3 d'un lipide mais on peut également le
retirer.
Messagers secondaires :
On reste dans le domaine des récepteurs PDGF.
Un récepteur est activé par un ligand, il se dimèrise. Il est ensuite modifié et peut
recruter des protéines qui agiront ensuite dans la signalisation. Le schéma suivant
résume ce qui se passe avec PDGFr qui recrute PI3K.
Amener l'AKT à la membrane va permettre de recruter mTOR, qui est un facteur de
croissance.
Sans facteur de
croissance, des
protéines sont actives
et inhibe Rheb.
Avec un facteur de
croissance, par cascade,
on active AKT et ont
inactive une protéine et
Rheb est active. Cela
entraîne la voie mTOR
qui fait grandir la
cellule.
Les noms ne sont pas à
connaître, juste le
principe d'une cascade
de signalisation.
Schéma récapitulatif de l'activation des PDGFr par le PDGF :
Il y a au moins 3 conséquences à cette activation.
On a un récepteur, inactif, qui ne recrute rien.
Dès qu'il est fixé avec le ligand, on a dimérisation, recrutement de protéines et
cascade de signalisation.
Un récepteur est généralement monomérique.
Activé, il devient au moins dimérique.
Une phosphorylation du récepteur permet le recrutement de protéines.
On a vu deux exemples : PI3K et PLC-gamma.
3ème exemple : La protéine GAP :
Toutes les tyrosines phosphorylés ne fixent pas les messagers secondaires.
Une tyrosine précise recrutera un messager précis.
Une série de tyrosine recrute notamment les protéines Ras, très importante dans la
signalisation et font partis de la super-famille des protéines Ras, des interupteurs
moléculaires.
Toujours présent dans le cytoplasme, ils sont sous forme active ou pas.
Quand elles fixent du GTP, la protéine devient actif.
Pour passer d'un état actif à un état inactif, on a l'intervention d'enzyme GEF.
Pour passer d'un état inactif à actif, on a l'intervention d'enzyme GAP, transformant
le GTP de la protéine active en GDP.
Pour observer la fonction, on peut jouer sur des mutants où la protéine sera en
permanence active (dominant négatif, on mute les AA responsable de l'action de GEF,
soit la Thréonine ou la Sérine qu'on mute en Aspartate) ou en permanence inactive
(Constitutivement active, même principe, voir schéma)
Le recrutement de GERB2 :
Grb2 va recruter Ras-GEF (Sos), permettant de transformer un Ras dans la
membrane.
Dans la protéine Sos, des régions riche en proline permettent la fusion avec des
domaines SH2 et SH3 et permettent de migrer dans la membrane pour agir sur des
protéines Ras ancrés dans la membrane.
Mesure de l'activité par FRET :
Placer une molécule fluorescente à coté d'une autre molécule pouvant être
fluorescente. Cela activera l'autre protéine.
On illumine Ras qui fera briller une protéine YFP attacher à Ras. On apporte du GTP
coloré en rouge. Si on rapproche Sos de la protéine Ras-GDP, on va avoir réaction, la
YFP va émettre de la fluorescence et excitera le GTP proche qui brillera également
en rouge !
On peut mesurer ensuite la longueur d'onde d'excitation (ici 480 pour faire briller le
YFP) et la longueur d'onde d'émission.
La courbe bleu montre l'émission de lumière de la YFP.
Si on rajoute du GTP coloré, à différente concentration, on voit de l'émission dans le
rouge également, on a la preuve que la protéine Ras-GDP est devenu Ras-GTP.
On peut mettre en compétition du GTP marqué et non-marqué pour prouver que la
fixation de Ras-GTP est transitoire et ne reste pas dans cette état.
On peut les répartir en plusieurs catégories de la super-famille des Ras :
- Ras, intervenant dans la transduction du signal de domaine TK
- Ral, dans le transport des vésicules et la polarité cellulaire
- Ran, une seule dans le cytoplasme, pas d'isoforme, transport nucléocytoplasmique.
- Arf et Rab, transport vésiculaires et échanges de membranes.
- Rho, régulant le cytosquelette d'actine.
La cascade des MAP (Mitogen activated protein) kinases :
Un motif de type TxY permettra l'adressage à la membrane plasmique.
Cette protéine p21ras.GTP recrutera la protéine Raf (MAPKKK) et agira sur la MEK
(MAPKK) en la phosphorylant et cette dernière phosphorylera ERK (MAPK). Une fois
phosphoryler, ERK migrera dans le noyau et activera des facteurs de transcription
agissant sur l'ADN.
(Schéma)
Si on reprend cette cascade, un module de 3 MAP kinases surviennent après un
stimulus et provoquent une réponse biologique.
On a, pour chacune de ces étapes et comme le montre le schéma suivant plusieurs
types de stimulus, de MAP kinases et de réponses.
Résumé : RTK : A savoir
Dans la partie PLC-gamma, l'IP3 entraîne la libération de calcium cytoplasmique
activant des calmodulines et entraînant l'activation de calmoduline kinases (CaM
kinase)
Tout ça agit sur des protéines cibles pouvant être de différents types (facteurs de
transcription, cyclines, régulateurs, … )
Les récepteurs associés à des tyrosine kinases :
On y trouve :
➢ La famille des Src, avec un domaine SH2, SH3 et tyrosine-kinase. Souvent
associés au récepteurs de l'antigène des lymphocytes, elles activent la même
voie que les RTK.
➢ La famille des protéines JAK, associés aux récepteurs de l'interleukine et des
interférons. Elles activent directement des protéines STAT.
Les Src :
A gauche de la protéine, on trouve différente modification (palmytisation et
mérystisation, qui correspond à une ancre lipidique dans la membrane plasmique.)
Régulation de l'activité des Src par phosphorylation sur tyrosine :
On a deux tyrosine importantes
dans l'activation-inhibition.
Une complètement en C-terminal,
importante dans l'inhibition et une
au début du domaine TK pour
l'activation.
A gauche du schéma, on a la forme
active, à droite la forme inactive :
La tyrosine phosphorylé en forme inactive va
activé son propre récepteur tyrosine kinase. Il
n'est donc plus disponible et reste sous forme
inactive. Sinon, un CD45 va libérer ce domaine
en forme active et laissera le domaine libre.
Seule la tyrosine en C-terminal peut activer son
récepteur.
Il faut déphosphoryler la protéine pour libérer le site.
Lorsque le ligand arrive, on a un changement conformationnelle permettant de
déphosphoryler la tyrosine bloquant le site.
Étude de mutants :
Chez un mutant CSK, qui permet à l'inverse de CD45 de passer de former active à
inactive, on voit un problème dans la formation du tube neural.
Le graphe ci-dessous montre un test de protéine Src en fonction de leurs états
phosphoryler ou non.
On regarde l’interaction avec l'énolase, qui à une affinité avec les protéine
phosphorylé, et on pourra alors marquer les protéine phosphorylés.
Les mutants nuls ont une grande quantité de Src phosphorylés.
On en a encore plus chez les mutants CSK ! C'est la preuve que CSK permet de
déphosphoryler la partie inactive et de phosphoryler la partie active.
Ces enzymes CSK agissent sur toutes la famille Src.
Les protéines JAK :
Elles agissent dans la voie de signalisation des intégrines et généralement, les
intégrines n'ont rien pour induire une information.
La voie de signalisation JAK-STAT :
Un récepteur de cytokine va interagir avec une kinase JAK. On va alors avoir
dimérisation du récepteur, trans-phosphorylation, cela activera la kinase qui
phosphorylera un phosphate sur le récepteur qui recrutera STAT (puis un autre
STAT dans un second temps).
Ces deux STAT vont fusionner et induire une cascade de signalisation dans le noyau.
On peut mettre en évidence des tyrosines phosphorylés sur des gel 2D via un
Western Blot. Le pervanadate activera toutes les tyrosine-kinase. On peut comparer
sur l'image :
Environ une centaine chez l'homme, on en trouve associés à des récepteurs ou
cytosoliques. Elle enlève un phosphate.
Un exemple de récepteur sérine/thréonine kinase : Le récepteur TGF Beta :
Ce récepteur est composés d'un
hétéro-dimères, un TGFBrII qui
possède un domaine S/T kinase,
agissant avec du TGFB, ce qui
permet le recrutement de
TGFBrI.
On a activation et le premier
domaine S/T kinase va
phosphoryler une sérine ou
thréonine sur l'autre monomère.
Cette phosphorylation permettra
le recrutement de messagers
secondaires.
Ici il s'agit de Smad2, qui agira avec Smad4 pour former un hétérodimère qui sera
translocer dans le noyau.
Résumé :
Récepteurs sans activité kinase : La voie Wnt :
La voie Wnt B-caténine va permettre d'éviter la dégradation de la B-caténine.
Dans un état actif, Wnt va agir avec LRP et Fzl (Frizzled), cela permettra de recruter
Dvl, qui inhibera un complexe permettant la stabilisation de la B-caténine.
Dans un état
inactif, LRP et
Frizzled n'agissent
pas avec Wnt, Dlv
est inactive et on
aura inhibition de
la protéolyse de la
B-caténine.
La voie Hedgehog
est identique en
terme de
fonctionnement.
La voie Notch :
On a un récepteur Notch ancré dans la membrane. Son ligand Delta est un ligand
ancré dans la membrane, très important dans les interactions cellules-cellules.
On aura clivage de la partie intracellulaire du récepteur Notch une fois active. Cette
partie intracellulaire est un facteur de transcription qui agira dans le noyau activé
des gènes cibles. On aura ensuite recyclage du récepteur.
Le ligand ancré à la membrane permet l'inhibition latérale.
Une cellule centrale active toutes les cellules autour d'elle.
Cette voie Notch permet également la survie des cellules souches. Une sur-expression
de Notch augmente le nombre de cellules souches. La cellule se différencie, exprime
Delta et active une cellule-souche proche.
Elle permet la différenciation et l'arrêt du cycle cellulaire.
Clivage protéolytique :
Le domaine extracellulaire agit avec le ligand.
Une fois qu'il y a activation, des protéines ADAM vont permettre la libération du
domaine extracellulaire.
Une gamma-secretase va permettre de libérer le domaine intracellulaire de Notch.
Ce domaine ira directement dans le noyau et activera des gènes cibles.
Pas d'activité kinase. Pas même de phosphorylation.
Au bout de la partie intracellulaire de Notch, on a un domaine NLS (Nuclear
Localisation Signal) qui entraîne Notch dans le noyau.
Résumé :
On a ensuite besoin d'énergie dans les différents changement de conformation, soit
par la phosphorylation, en hydrolysant de l'ATP, soit en fixant du GTP, chez les
protéines Ras par exemple.
Cours Meignin : DRC : 21/10/2016 :
L'apoptose :
« Life and death are one thread, the same line viewed from different sides » Lao Tzu
La mort cellulaire peut être programmé, on l'appelle apoptose, et la non-programmé,
qu'on appelle nécrose. Il en existe d'autres types mais ils sont moins bien caractérisé
(pyroptose, nécroptose)
1. Définitions :
Vers 1842, Carl Vogt détermine le concept d'apoptose. Il n'utilise pas encore le
terme mais décrit des cellules qui se résorbent, dans le système nerveux en
développement.
Le mot apparaît vers la moitié du 18ème.
Cette mort cellulaire n'est pas par défaut, on parle de mort cellulaire programmée,
concept porté par Flemming vers la fin du 19ème.
Vers 1965, Kerr différencie l'apoptose et la nécrose.
Enfin en 2002, Brenner, Horvitz et Sulston obtiennent le prix Nobel pour leurs
travaux sur le contrôle génétique de la régulation des organes et la mort programmée.
Étapes de l'apoptose :
(a) Normal
(b) Rétrécissement de la cellule et augmentation de la densité cytoplasmique.
(c) Compactions de la chromatine
(d) Ségrégation et compartimentation autour de l'enveloppe nucléaire
(e-f) Formation des saillies en forme de cloques
(g) Formation de corps apoptotiques.
On a pu observer ces phénomènes en microscopie à balayage. Ces types
caractéristiques de l'apoptose sont conserver au cours de l'évolution.
Des inhibiteurs d'apoptose (P35 par exemple) fonctionnent comme inhibiteur
d'apoptose (pas terrible d'inhiber l'apoptose … ).
Les macrophages viennent ingérer les débris cellulaires résultant de l'apoptose d'une
cellule.
Les deux types de mort cellulaire :
Nécrose VS Apoptose :
La nécrose entraîne un gonflement (au lieu de rétrécir), des organites endommagés et
la chromatine altérée.
L'apoptose entraîne une réduction du volume, des organites saines et de la chromatine
compactée.
La cellule nécrosé va lysée, les organites détruits et le contenu cellulaire est dispersé
dans la matrice.
La cellule en apoptose va former des corps apoptotiques, entouré d'une bicouche
lipidique.
La nécrose entraînera alors une phagocytose et une inflammation. (Interféron, NFkB etc ….)
L'apoptose entraîne une phagocytose uniquement.
Les organites présent dans les corps apoptotiques peuvent être réutilisés.
Clivage internucléosomal de l'ADN dans les cellules en apoptose :
L'ADN y est fragmenté. On peut observer l'ADN via un gel d'agarose classique en
faisant migrer l'ADN. La piste 4 définit un ADN normal, en haut. La piste 2 et 3
définit des cellules apoptotiques et une série de bandes tout le long du gel. L'ADN est
fragmenté.
Le clivage de 2 et 3 est identique ! L'ADN est dégradé de façon programmé pour avoir
toujours le même profil de dégradation.
On peut également visualiser la dégradation au cours du temps en traitant une cellule
avec des anticorps anti-Fas, si les récepteurs à Fas ne sont pas activés, on a apoptose.
Cela fait intervenir une
endonucléase, CAD, qui n'est pas
fonctionnel naturellement,
puisqu'elle est couplé à un
inhibiteur iCAD.
En induisant l'apoptose, on fait
agir des caspases (elles clivent
des trucs) et elles cliveront iCAD,
libérant CAD et permettant à
l'endonucléase d'aller couper
l'ADN.
Cependant, l'ADN étant associés
au histone en nucléosomes.
CAD ne peut pas couper sur un
nucléosomes ! Elle coupe donc
entre les nucléosomes !
Détection des cellules apoptotiques par cytométrie de flux :
En faisant entrer des cellules par une Facs ou une cytométrie de flux, on peut rentrer
divers caractéristiques.
En FSC, on marque la taille des cellules. En SSC, la granulométrie.
En comparant les cellules normales et les cellules en apoptose, on obtient des profils
de Facs différents.
Des cellules changent de granulosité et de taille.
On voit, à gauche, les cellules petites et granuleuse vu que les organelles s'associent,
qui représente les cellules apoptotiques.
Détection des cellules apoptotiques par agent fixant l'ADN (Hoescht 33342) :
Comme on sait que l'ADN est clivé, on prend un marquer se fixant sur les extrémité
de l'ADN. Chez les cellules normales, on a peu d'extrémité, parce qu'on a peu de
brins.
Chez les cellules apoptotiques, on voit la présence de plus de brins d'ADN, donc plus
d'extrémité marqué donc un profil différent.On utilise des agents intercallents
(Iodure de
propidium,
etc … )
Détection des cellules apoptotiques par marquage des extrémités 3' OH :
On récupère une molécule d'ADN avec ces extrémités 3' OH.
Si on induit un clivage, on induit un très grand nombre de formation de 3' OH.
Si on marque via la terminal deoxynucleotidyl transferase les extrémités 3'OH avec
du dUTP marqué, on peut ensuite visualisé nos cellules apoptotiques.
On appelle ça la technique de TUNEL.
➢ Sur une population normale, on couple le dUTP avec du FITC, qui émet dans le
vert comme la GFP. Si on utilise une population apoptotique, on amplifie le
décalage à droite, dans la mesure où on a plus de 3'OH donc plus de marquage
et une courbe plus prononcé.
On peut utiliser d'autres types de marqueur. En effet, le TUNEL nécessite que l'ADN soit déjà clivé.
Si on réalise un marquage à la FITC-Annexin5, on voit des résultats similaires à ceux obtenus
précédemment.
➢ L'annexinV va agir avec des phospholipides chargés. Une des conséquences de
l'apoptose est que, sur les phospholipides chargés situés sur la membranes
internes (PIP2, PIP3, etc ...), on aura un basculement sur la membrane externe.
Et ça c'est pas normal.
Pas de phospholipide chargé sur la membrane externe. Sinon la cellule à déjà
débuté l'apoptose.
Fonctions :
Un peu de blabla sur C.elegans.
Lignage cellulaire invariants, 1090 formés et 131 qui meurent par apoptose.
Première division asymétrique, blabla …
Effet de l'actinomycine D sur l'apoptose au cours de la métamorphose des insectes :
La métamorphose chez les insectes induit énormément d'apoptose.
En comparant la masse musculaire à son temps de développement, on voit une
diminution de la masse au fil du temps. C'est l'effet de l'apoptose.
La même expérience via l'actinomycine D (ActD) va rendre l'individu plus gros, il
perdra moins de poids. Il n'y aura pas eu d'apoptose.
L'ActD inhibe la transcription. La cyclohéximide inhibe la traduction.
On retrouve ces composés en général dans les bactéries, dont le but est
généralement de tuer la cellule dans laquelle elle rentre.
Si on inhibe la transcription, on a pas d'apoptose.
On a donc des signaux précis qui active cette dernière.
En jouant sur la température, on peut également influer sur l'apoptose.
Des thymocytes à 40°C vont faire de la nécrose au bout d'un certain temps.
Si on les mets un certain à 40°C et qu'on les ramènent à 37°C, certaines vont résister
mais certaines, trop endommagés pour survivre, vont rentrer en apoptose. Elles
choisissent bravement de mourir. Le Valhala pour ces cellules.
Élimination par apoptose des cellules sans fonction :
On élimine les cellules en trop. Genre entre les doigts à la naissance. Dans le
développement on préfère faire pleins de cellules et éliminer le trop plein plutôt que
de tenter d'en produire exactement le nombre voulu.
(a) On en trouve beaucoup lors de la morphogenèse, dans la formation des mains
et des pieds par exemple. On le voit notamment via l'utilisation d'acridine
orange, marquant les cellules en apoptose.
On sait qu
1. e des mutants n'induisent pas cette réponse et développent des mains et des
pieds palmé.
L'apoptose a un rôle sculpteur.
(b) On en voit également dans la formation des acini mammaires. Au début on a
beaucoup de cellules puis, petit à petit on va perdre les cellules centrales et
former un canal.
Chez C.elegans, de l'axe antérieur à postérieur, on aura des cellules P qui vont se
diviser successivement pour former soit des épithéliums et d'autres qui vont donner
des neurones moteurs, puis 6 clusters vont mourir pour permettre la formation des
autres tissus.
(c) Les canaux de Müller sont éliminés par apoptose chez les mâles lors du
développement.
Élimination des cellules formés en excès :
On peut le voir chez l'embryon de poulet, dont certaines cellules neuronales rentrent
en apoptose. Le pool initial est énorme puis un grand nombre disparaît par apoptose
pour obtenir le nombre de cellules voulus.
On a toujours une valence entre l'apoptose et la division cellulaire dans le
développement.
Élimination des cellules anormales :
Les thymocytes immatures vont interagir avec les complexes peptides-CMH dans
l'épithélium thymique lors de la sélection positive.
Suite à cela, il vont agir avec les complexe antigène du soi, si il réagissent au anticorps
du soi, ils sont éliminés, c'est la sélection négative.
Les cellules n'étant pas sélectionnés meurent par apoptose.
Délétion des LT exprimant un TCR transgénique V6 autoréactif :
On peut forcer une souris à exprimer des cellules autoréactive qui détectent le soi.
➢ A 4°, le mécanisme de sélection ne fonctionne pas.
➢ A 37°, température idéale, on note une élimination des cellules V6 autoréactive
mais pas des autres. On a une sélection positive.
➢ Si on réalise la même chose à 37° avec de la CHX (cyclohéximide) ou de ActD,
on ne voit pas de sélection et de mort des V6 ! On a bien à faire à un
phénomène programmé.
Effet de l'inactivation de Fas sur l'apoptose dans les organes lymphoïdes :
Sur un mutant Fas, on a une
augmentation des tissus du ganglion
lymphatique et la rate. Fas élimine
donc des cellules en induisant
l'apoptose. Quand il est inactif, les
cellules prolifèrent.
On teste sur cette expérience des
hétérozygotes pour voir si on a des cas
de dominant négatif, où la mutation
serait dominante.
Les glucocorticoïdes sont des
messagers cellulaires induisant la mort
cellulaire par apoptose.
Quand Fas est activé par un ligand Fas présent sur un lymphocyte killer, on a
activation via une cascade, notamment au niveau des domaines de mort, induisant
l'activation de la caspase 8 entraînant comme vu précédemment l'apoptose.
Système rétinien chez le rat adulte ou nouveau-né :
Chez le rat nouveau né, on injecte un marqueur permettant de savoir où les neurones
projettent. On a une projection sur le lobe opposé en général mais certains neurones
ne vont pas dans le bon lobe, c'est ceux qui ne sont pas marqués.
Chez le nouveau né, la population B qui n'est pas bien localisé est beaucoup plus
importante que la population B mal localisé chez les adultes.
Ils sont éliminés par apoptose au cours du temps.
Élimination par apoptose des cellules ayant rempli leur(s) fonction(s) :
C'est un peu comme une mafia cruelle, une fois que tu sers plus, on t'élimine …
C'est le cas par exemple chez les batraciens, dont la larve à une queue et l'adulte non.
Délétion des cellules dangereuses par apoptose :
•
Une cellule infecté par un virus rentre de temps en temps en apoptose
spontanément.
On a longtemps travaillé avec le virus Sindbis, qui a permis de mettre en
évidence la mort de cellule infecté (Sauf les neurones post-mitotiques, qui
expriment Bcl-2, un inhibiteur d'apoptose)
Un bon virus ne doit pas être trop virulent, ils doivent inhiber l'apoptose et se faire
discret. Chikungunya et Sindbis sont tout deux des alphavirus.
Une cellule cancéreuse peut rentrer en apoptose, de temps en temps,
notamment grâce à p53, un suppresseur de tumeur.
En surexprimant p53 dans l’œil d'une drosophile, tout l’œil meurt par apoptose.
• Le privilège immunitaire, correspond à l'élimination des cellules immunitaires de
tissus sensibles (yeux, cerveau, etc …). Ces cellules meurt par apoptose.
•
Régulation de l'apoptose :
Les premières études du contrôle de l'apoptose ont été réalisés chez C. elegans et on
y voit certaines cellules qui rentre en apoptose, au niveau du pharynx.
Chez le ver, on a plusieurs vagues d'apoptose, une pendant le développement (113
cellules en stade embryonnaire puis 12 au stade larvaire).
Dès qu'une cellule rentre en apoptose, on peut voir les corps apoptotiques environ 40
minutes.
Ces cellules chez le ver prennent alors des buttons-like forms.
Au niveau génétique :
La cellule va choisir l'apoptose, c'est la décision.
On a la réalisation de l'apoptose, c'est l’exécution.
On a une digestion par la cellule voisine, la phagocytose.
La cellule qui a phagocyté va réaliser une dégradation de la phagocyté.
Chez C.elegans, on a trouvé 3 mutants affectant l'apoptose : ced-9, ced-4 et ced-3
Il interagissent ensemble.
Ced-3 est une caspase protéolytique et régule positivement l'apoptose.
Ced-4 est aussi un régulateur positif et est l'analogue de Apaf-1 chez les
Mammifères.
Ced-9 est un régulateur négatif et est analogue de Bcl-2 chez les Mammifères.
Ced-4 est en amont de Ced-3, sans Ced-4, on a pas d'expression de Ced-3 et Ced-9
est en amont de Ced-4 et Ced-3.
Si Ced-9 n'est pas là, on a une apoptose massive car on inhibe pas les régulateurs
positif.
En mutant Ced-9 et Ced-4, on retourne à une situation normale (?).
On appelle le phénomène de classer les gènes dans un certain ordre un test
épistatique.
Les stimuli environnementaux ou la queue développementale influent sur egl-1, un
inhibiteur de ced-9.
En aval de ces réactions, on une série de Ced (1 ; 6 ; 12 ; etc …) ainsi que des protéines
comme Nuc-1 ou Cps-6.
Ced-3 est une caspase protéolytique, régulateur positif de l'apoptose.
On parle de caspases pour cysteine-dependant aspartate-specific proteases.
L'aspartate et la cystéine sont donc très importantes dans ces protéines.
Les précurseurs des caspases sont formés de deux domaines catalytiques.
Dans le plus grand, une cystéine est présente, responsable de l'activité catalytique.
De nombreux acide aspartique dans le précurseur marque les zones de clivage pour
former un domaine catalytique.
Une fois que le clivage est effectué, on obtient deux sous-domaines, une large P20
et une petite P10.
Pour être catalytiquement actif, il faut former un dimère !
Une fois qu'elles sont actives, elles peuvent agir sur d'autres caspases, des protéines
du cytosquelette, des lamines, etc …
Cela induira des manifestations morphologiques et biochimiques de l'apoptose.
Les régulateurs de l'apoptose comme Ced-3 comprennent généralement une proenzyme composé de deux sous-unités (P20-P10) nécessaire deux fois pour obtenir une
holo-enzyme.
Ils agiront alors sur des sites actif, comme des acides aminés précis.
Elles peuvent aussi clivés d'autres caspases et seront appelés caspases initiatrices.
Chez les Mammifères, la caspase 3, 7 et 6 sont les caspases initiatrices, toujours
construite identiquement.
Les pro-enzymes réaliseront des clivages, généralement d'abord celui de la partie Nterminal puis un second enlevant la partie au milieu du domaine catalytique, cela
induisant la formation de l'holo-enzyme fonctionnelle.
Activation des caspases par des signaux extrinsèques : La famille du récepteur TNF :
Le TNFr de type 1 et de type 2 sont composés de domaines cystéines riches (entre 4
et 6), puis un ligand activant le récepteur, le TNF.
Le TNF peut être produit par les macrophages, les monocytes, les lymphocytes (T et
B) et les fibroblastes.
C'est une petite protéine (26 kDa) transmembranaire, associés à des sheddases qui
permettront de libérer la protéine mature (17 kDa).
Il existe d'autres types de récepteurs TNF dont les ligands ont des modes de
fonctionnement identiques.
On peut tester l'effet de ces récepteurs.
Seul les récepteurs Fas et TNFr1 induisent l'apoptose.
Sur ces récepteurs on trouve des Death domain (DD) qui sont nécessaire et
suffisant pour induire de l'apoptose.
Le DD permet l'activation des caspases et le début de l'apoptose.
Récepteur Fas et apoptose :
Après fixation sur le récepteur Fas par un ligand, on a la formation d'un complexe
DISC, précurseur de l'activation des caspases et de l'apoptose.
Les DD interagissent entre eux, les Dead-Dead agissent également entre eux, etc …
comme des dominos.
Les DD font environ 70 AA permettant des interactions homophile protéinesprotéines permettant ensuite le recrutement d'autre DD.
TNFr de type 1 :
Lorsqu'on active ce récepteur, on recrute la protéine TRADD, possédant aussi un DD,
qui recrute une protéine FADD, possédant un DED (Death effector domain)
Ce DED permet de recruter une caspase 8, sous forme de pro-enzyme, possédant
aussi un DED. C'est une caspase initiatrices qui clivera d'autres caspases et qui
s'auto-active. C'est aussi une caspase apical.
Cette caspases 8 activera des caspase 3, 6 et 7 entraînant l'apoptose. On parle de
caspases effectrices.
Elles agiront sur la fragmentation de l'ADN, la condensation de la chromatine ou des
modifications de surface.
La super-famille des DD :
On en trouve 4 grands types :
- Les Death Domain
- Les Death Effector domain
- Les CARD (Caspases recruitment domain)
- Les PYD (pyrin domain)
Il y a une centaines de protéines avec des DD, une dizaine avec les DED et une faible
quantité avec PYD et CARD chez l'Homme.
Parallèle avec les récepteurs tyrosines kinase :
Les RTK ont des domaines Y permettant de recruter des protéines à domaines SH2,
lié à des SH3 recrutant des protéines comme Grb2 permettant l'activation de la GEF,
la stimulation de Ras et la prolifération cellulaire.
On peut faire une analogie avec le mode de fonctionnement des récepteurs Fas.
Que se passe-t-il si on lie un domaine SH2 avec un domaine DED ?
On crée des protéines chimériques.
Une avec juste SH2, une avec SH2-DED et une SH2-DED, muté au niveau du
récepteur de la tyrosine, se liant à la tyrosine du RTK.
Si on met juste le SH2 ou le SH2 muté et DED, on a une survie normale de la cellule.
Mais si on lie SH2-DED, on a une induction de l'apoptose !
Le domaine DED par lui-même ne suffit pas à activer l'apoptose, il doit être recrutés
au niveau de la membrane pour activer les caspases apicales !
Initiateurs de l'apoptose :
Les caspases 8, 9, 2 ou 10 (ou la C-FLIP (large ou small) possédant une tyrosine plutôt
qu'une cystéine) sont les caspases initiatrices, possèdent aussi deux domaines
catalytiques mais aussi soit des domaines DED ou CARD.
Cela permet les interactions protéines-protéines au niveau apical.
La C-FLIP est également recruté au pôle apical mais ce n'est pas une caspase, elle
n'a pas de cystéine permettant l'activité protéolytique ! :O
Sans aspartate entre les DED et la grande sous-unité, on a également pas de clivage
pour la rendre fonctionnelle !
Elle va rentrer en compétition avec les Cas-8 !
Comme nous l'avons dit, il faut un dimère de Cas-8 pour qu'il y est une activité
fonctionnelle.
Avec que de la caspase 8, on a aucun problème à créer des dimères et réaliser de
l'apoptose.
Si on a peu de C-FLIP, on a la formation de quelques dimères actif, ce qui rend
l'apoptose possible.
Si on a beaucoup de C-FLIP, voir des C-FLIP small, on a une quantité très faible de
dimères fonctionnelles donc pas d'apoptose !
La formation des ces longs filaments (nucléation) de caspase entraînant l'apoptose
est donc inhibé par la concentration variable de C-FLIP (large ou small).
Inhibiteurs de l'apoptose : La famille Bcl-2 :
C'est une protéine de la famille des anti-apoptotic B-cell lymphoma, dont le but est de
bloquer l'apoptose.
Bcl-2 augmente la survie cellulaire, à l'inverse des loncogène classique dont le rôle
est de promouvoir la prolifération cellulaire.
Certaines protéines de la famille Bcl-2 sont pro-apoptotiques.
Cette famille est impliqué dans l'apoptose via des signaux intrinsèques.
On peut séparer les protéines de cette famille Bcl-2 en trois domaines :
- BH1 – 4, possédant le domaine BH4, étant anti-apoptotiques.
- BH1-3, ne possédant plus le domaine BH4 mais seulement le BH3, 2 et 1, dont les
homologues mammifères sont Bax et Bak.
Comme BH1-4 avant lui, cette famille possède un domaine transmembranaire.
- BH-3 only, des pro-apoptotiques possédant seulement BH3. Ils ont des domaines
transmembranaire comme Bim et Bik, ou pas, comme Bid, Bad, Puma et Noxa.
Si on réprime Bad, on augmente la survie cellulaire, vu qu'ils sont pro-apoptotiques.
Cette dernière catégorie est associé à la membrane mitochondriale.
On a une balance entre ceux qui promouvoit l'apoptose et ceux qui l'inhibent.
•
La lésion de l'ADN induit la formation de p53 qui induisent la formation
(transcriptionnel) de NOXA et PUMA.
•
Si on a un facteur de croissance ou de survie, on exprime une PI3K, qui réprime
BAD.
•
L'activation de TNF ou Fas entraîne la formation de Casp-8 et l'activation de
BID.
Ces trois exemples activent Bax et Bak, qui entraînent l'apoptose.
Interaction de BIM avec BAX :
Avant fixation de BIM sur BAX, on a une queue N-terminal flottante. Quand elles
sont fixés, cette queue activent la protéines et n'est plus flottante.
Bax et Bak sont localisés sur la mitochondrie, dont l'activation active Apaf-1,
Caspase-9 ou Apaf-3, ces trois là agissant sur des caspases effectrices comme la
caspase-3.
Cette activation libère aussi le cytochrome C dans le cytoplasme.
Si il part dans le cytoplasme, il jouera le rôle d'activateur de l'apoptose !
Bax, localisés dans les mitochondries, est associés à une protéines Bh3-only qui la
rend plutôt inactive.
Un activateur Bh3 va changer la configuration de cette protéine et on aura formation
d'oligomères de Bax. Pleins de Bax vont se regrouper ensemble. Et c'est ça qui
entrainera la libération du cytochrome C dans le cytoplasme car ces oligomères
forment les canaux permettant le passage du cytochrome C.
Rôle critique des mitochondries dans l'activation de l'apoptose :
Dans le cytoplasme, on trouve Apaf-1 et la pro Caspase-9 qui sont inactives. Ils ont
des death domain de type CARD pouvant normalement interagir entres elles MAIS
Apaf-1 cache son domaine CARD via des répétitions WD.
Quand le cytochrome C arrive, il change la configuration de Apaf-1, libérant son site
CARD, qui dimèrise, activant la pro caspase-9 et permettant un auto-clivage formant
une holo-enzyme fonctionnelle ! CQFD !
On a alors formation d'une structure appelés apoptosome.
60 millions de cellules qui rentrent en apoptose chaque jour.
Les IAP (inhibitor of apoptosis proteins) sont des inhibiteurs de l'apoptose et il y a
toujours une valence entre inhibition et activation d'apoptose.
Contrôle génétique de l'apoptose chez C.elegans :
On utilise 3 caspases majoritairement en résumé :
- ced-3, une caspase protéolytique, régulateur positif de l'apoptose.
- ced-4, homologue de l'Apaf-1 chez les mammifère.
- ced-9, régulateur négatif de l'apoptose.
L'apoptose est très importante au cours du développement, elle permet de compenser
la prolifération cellulaire et offre une certaine homéostasie cellulaire.
Phagocytose des cellules apoptotiques :
Des macrophages vont venir nettoyer des débris cellulaires.
Ces cellules en apoptose libèrent des signaux « Find-me », qui serviront à recruter
des phagocytes. On trouve notamment de la LPC, de la Sphingosine-1-phosphate ou
encore des ATP ou UTP.
On a ensuite une phase d'ingestion « Eat-me », où les phagocytes dégraderont les
corps apoptotiques.
LE signal le plus important est le phosphatidylsérine, censé se retrouver sur la face
interne mais libérer lors de l'apoptose, permettant le signalement et l'ingestion par
les phagocytes.
Voie extrinsèque et voie intrinsèque de l'apoptose :
La partie majeure, qui est centrale du mécanisme de l'apoptose est conservé au niveau
de l'évolution.
Apoptose et maladie humaine :
Trop d'apoptose conduit à une atrophie tissulaire, on le retrouve dans les maladie
neurodégénérative ou le SIDA.
Peu d'apoptose conduit à une hyperplasie, un gonflement des tissus, on le retrouve
dans certains cancers.
III. Bases moléculaires du cancer :
1. Les oncogènes :
Ils sont aussi appelés carcinogènes et sont souvent mutagènes.
On en trouve des chimiques, induisant des mutations génétiques ou encore des
radiations ionisantes (rayons X) et enfin des virus.
Mise en évidence de la transformation cancéreuse :
En général, parmi une culture de cellules, on peut voir des cellules qui formeront des
amas cellulaire et formeront des tumeurs.
Suite à l'ajout d'un agent carcinogène, certaines cellules de la culture perdent leurs
contacts avec leurs supports, on une perte de l'inhibition de contact. On peut
étudier ce phénomène via un test de formation de foyers.
On peut aussi voir des pertes de la dépendance à l'ancrage, que l'on met en évidence
via un test de formation de colonies en agar.
Au début du 20ème siècle, Rous observe des tumeurs chez des poules qu'il explique
avec le Rous Sarcoma Virus.
On regarde si les cellules infectées par le RSV forment des foyers cellulaires. C'est
effectivement ce qui a été observés, on pouvait en déduire que c'était un carcinogène.
Le RSV est un rétrovirus. Il pénètre dans un cytoplasme d'un hôte et après libération
de la capside, il libère son matériel génétique, de l'ARN.
Cette ARN est composé de deux extrémités R et U ainsi que des 3 protéines gag, pol
et env pour coder la capside, les protéines nécessaires à la réplication et l'enveloppe.
Le virus vient avec une reverse-transcriptase, non présente dans la cellule,
permettant de remonter à l'ADN.
Le double-brin ADN formé ira s'intégrer dans le génome de l'hôte pour être
transcrit.
En fonction de où se situera l'infection (somatique ou germinale) on pourra avoir une
transmission à la descendance.
Le RSV contient un oncogène v-onc :
Chez le RSV possède un gène en plus que les gag, pol et env, le v-src.
On a créer en laboratoire un virus sans le v-src et on n'observe pas de formation de
cancer. On voit que le gène est nécessaire pour former des cancers.
En réalisant l'expérience inverse et en mettant uniquement le gène sans le reste des
gènes, on prouve qu'il est suffisant car on observe une formation de cancer.
On a donc caractériser v-src comme un oncogène.
En observant la structure de ce gène, on observe que c'est une protéine de type
tyrosine-kinase. Il activera la prolifération cellulaire pour répandre plus vite sa
descendance.
Si on regarde ce gène en détail via un Southern Blot avec d'une part des fibroblastes
de poulet + RSV et d'une autre part des fibroblastes de poulet non-infectés, on
observe une bande commune entre les infectés et non-infectés, le c-src.
On a deux gènes, un du virus, le v-src et un du fibroblastes, le c-src, très proche du
v-src.
C'est un proto-oncogène, si elle est sur-exprimé ou sous-exprimé, elle entrainera un
effet oncogène.
Test de mutagénicité :
Si on veut évaluer la capacité d'un oncogène à créer des mutations, on réalise un test
de Ames, utilisant des salmonelles mutantes dont le gène de l'histidine est muté.
On va chercher des révertants, une mutation qui ramènera la production d'histidine.
Une mutation ponctuelle transforme le proto-oncogène en oncogène.
Si on prend le gène ras impliqué dans des carcinomes de la vessie, on se rend compte
qu'il est muté dans un acide aminé précis.
Activation constitutive des voies de signalisation par les oncogènes :
Dans une cellule normale, la voie RTK – AP1 n'est pas activé, sauf quand un facteur de
croissance active le RTK.
Chez ces cellules mutés en Ras, on a une activation de la cascade induisant la
prolifération cellulaire sans avoir à activer les RTK !
Transformation cancéreuse par amplification de proto-oncogènes cellulaires :
Si on exprime plus de proto-oncogène, on a plus d'expression d'oncogène et donc
plus de chance d'avoir des cancers.
Dans le génome, on a une augmentation de la proportion du gène !
Exemples de proto-oncogènes :
Type
Type
Type
Type
Type
1 : Facteurs de croissances
2 : Tyrosines kinases (récepteurs ou protéines associés)
3 : Régulateurs cytoplasmiques
4 : sérine/thréonine kinases cytoplasmiques
5 : facteurs de transcription
Des gènes suppresseurs de tumeurs sont présents pour réguler les tumeurs. Si on
fusionne une cellule tumorale et une cellule non-tumorale, on obtient une cellule
normale, et cela grâce à des gènes suppresseurs de tumeurs comme p53.
Le gène du rétinoblastome (Rb) code pour un suppresseur de tumeur.
La progression tumorale :
On peut regarder les mutations sur Ras et p53, on peut regarder leurs méthylations,
qui joue sur leurs expressions (si on est hypométhylés, on sera exprimé)
La probabilité de développer un cancer dépend de l'âge, de la biomasse (le nombre de
cellule dans le corps), etc …
Il y a 40 copies de p53 chez les éléphants, qui ne développent pas plus de cancer que
l'Homme alors qu'ils vivent plus longtemps et on plus de biomasse !
Téléchargement
Explore flashcards