Memoire de maitrise HM Universite de Bourgogne

Université de Bourgogne – Dijon
UFR des Sciences de la Vie, de la Terre et de l’Environnement
Master Sciences, Technologies, Vie, Terre et Santé
Mention Biologie Santé
Spécialité Biologie Cellulaire et Physiologie
Parcours « Physiologie végétale et Biotechnologies »
M1-Sciences du végétal
Année universitaire 2009 /2010
Hicham MESSAOUDI
Institut Universitaire de la Vigne et du Vin – Jules Guyot
Laboratoire de Recherche en Vigne et Vin (REVV)
Maître de stage:
Pr Hervé ALEXANDRE
Maryse BONNIN-JUSSERAND

Remerciements
Je tiens à remercier Monsieur le Pr Hervé ALEXANDRE
Directeur du laboratoire de recherche en vigne et vin pour m’avoir
accueilli dans son laboratoire et pour m’avoir conseillé et encadré.
Je tiens à remercier particulièrement Mademoiselle Maryse BONNIN-
JUSSERAND étudiante en 3eme années de thèse, pour sa disponibilité, sa
patience, ses encouragements et son aide précieuse.
Enfin, je remercie toutes les personnes de l’IUVV qui ont participés à la
réalisation de mon stage.

I. Introduction ....................................................................................................................... 01
II. Présentation du laboratoire d’accueil ........................................................................... 06
III. Objectif du stage ............................................................................................................ 06
IV. Matériels et méthodes ..................................................................................................... 07
IV.1 clonage du gène odc ........................................................................................................ 07
IV.2 Test des conditions optimales d’expression. .................................................................. 07
IV.2.1 Préculture ..................................................................................................................... 07
IV.2.2 Culture et induction ..................................................................................................... 08
IV.2.2.1 Dosage protéique ...................................................................................................... 08
IV.4 Purification de l’ODC sur une colonne résine Ni-NTA ................................................ 08
IV.7 Dosage de l’activité enzymatique de l’Ornithine decarboxylase par HPLC ................. 09
I. IV.7.2 Réaction de derivatisation ........................................................................................ 10
IV.7.3 Analyse HPLC ............................................................................................................ 10
IV.8 Test de la stabilité de l’enzyme ODC ............................................................................. 11
V. Résultats et discussion ..................................................................................................... 12
V.1 Les conditions optimales d’induction et d’expression d’ODC ........................................ 12
V.2 Confirmation de la Purification de l’ODC par SDS PAGE ............................................. 12
V.3 Activité enzymatique de l’ODC ....................................................................................... 13
V.4 Paramètre déterminants la meilleure stabilité de l’ODC ................................................. 15
VI. Conclusion et perspectives ............................................................................................. 17

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Introduction
I. Introduction:
Les composés du vin susceptibles d’avoir des incidences sur la santé humaine sont de plus en
plus étudiés. Les amines biogènes sont présents dans les aliments et boissons, issus en particulier
de fermentation par des bactéries lactiques (Kanny et al. 2000). Biochimiquement, les amines
biogènes sont des bases organiques qui proviennent pour la plupart de la décarboxylation
d'acides aminés sous l'action de décarboxylases, assistées par le pyridoxal-5'-phosphate (PLP ;
coenzyme dérivé de la vitamine B6), ils sont donc associées à une origine fermentaire. En
présence de l'acide aminé précurseur, certains genres de bactéries lactiques comme Lactobacillus
et Oenococcus oeni sont capables de synthétiser l’Ornithine decarboxylase.
La putrescine, l’histamine et la tyramine respectivement sont les trois amines biogènes des vins
en teneurs les plus élevées (Gerbaux et al. 2000 ; Izquierdo Canãs et al. 2008), parmi ces trois
amines, la Putrescine est l'amine biogène principal associé a l'altération microbienne des
aliments, formée par l’action de l’Ornithine decarboxylase sur l’Ornithine figure.1 (Marcobal1et
al. 2004). Le tableau I rassemble les acides aminés et leurs amines biogènes associés et les
structures de certains amines.
Tableau I-acides aminés et leurs amines biogènes associés et structures de certains amines.

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Introduction
Fig.1 La voie de biosynthèse de la Putrescine à partir d’Ornithine par l’ODC.
Dans le vin, O. oeni a été très efficace dans la formation de putrescine à partir de l'Ornithine. La
souche O. oeni BR14/97 contribue de manière significative à la teneur globale d’amines
biogènes des vins, notamment la teneur en putrescine (Guerrini et al. 2002).
En outre, la putrescine et les polyamines spermine et spermidine peuvent aussi être formées par
une autre voie biochimique impliquant la désamination de l’agmatine (Lu et al. 2002). Peu de
micro-organismes sont capables d'utiliser l’agmatine. La voie déiminase agmatine a été signalée
chez Lactobacillus hilgardii X1B (Arena et al. 2008), la Transformation de l’agmatine en
putrescine chez L. hilgardii produit par ces deux réactions suivantes :
Il est généralement admis que la capacité de formation des amines biogènes semble être reliée à
la souche bactérienne plutôt que d'être liée à des espèces particulières (Bover-Cid et al. 2001).
En ce sens, l'isolement de la souche d’O. oeni IOEB 8419 produisant de la putrescine à partir
d’un vin rouge visqueux a été décrite (Coton et al. 1999). Cette souche possède l'activité
Ornithine décarboxylase et exige le PLP comme cofacteur. Plus tard, dans une étude visant à
vérifier la capacité de production d’amines biogènes de 44 souches d’O. oeni, seulement sept