Université de Bourgogne – Dijon UFR des Sciences de la Vie, de la Terre et de l’Environnement Master Sciences, Technologies, Vie, Terre et Santé Mention Biologie Santé Spécialité Biologie Cellulaire et Physiologie Parcours « Physiologie végétale et Biotechnologies » M1-Sciences du végétal Année universitaire 2009 /2010 Hicham MESSAOUDI Institut Universitaire de la Vigne et du Vin – Jules Guyot Laboratoire de Recherche en Vigne et Vin (REVV) Maître de stage: Pr Hervé ALEXANDRE Maryse BONNIN-JUSSERAND Remerciements Je tiens à remercier Monsieur le Pr Hervé ALEXANDRE Directeur du laboratoire de recherche en vigne et vin pour m’avoir accueilli dans son laboratoire et pour m’avoir conseillé et encadré. Je tiens à remercier particulièrement Mademoiselle Maryse BONNINJUSSERAND étudiante en 3eme années de thèse, pour sa disponibilité, sa patience, ses encouragements et son aide précieuse. Enfin, je remercie toutes les personnes de l’IUVV qui ont participés à la réalisation de mon stage. I. Introduction ....................................................................................................................... 01 II. Présentation du laboratoire d’accueil ........................................................................... 06 III. Objectif du stage ............................................................................................................ 06 IV. Matériels et méthodes..................................................................................................... 07 IV.1 clonage du gène odc........................................................................................................ 07 IV.2 Test des conditions optimales d’expression. .................................................................. 07 IV.2.1 Préculture ..................................................................................................................... 07 IV.2.2 Culture et induction ..................................................................................................... 08 IV.2.2.1 Dosage protéique ...................................................................................................... 08 IV.4 Purification de l’ODC sur une colonne résine Ni-NTA ................................................ 08 IV.7 Dosage de l’activité enzymatique de l’Ornithine decarboxylase par HPLC ................. 09 I. IV.7.2 Réaction de derivatisation ........................................................................................ 10 IV.7.3 Analyse HPLC ............................................................................................................ 10 IV.8 Test de la stabilité de l’enzyme ODC ............................................................................. 11 V. Résultats et discussion ..................................................................................................... 12 V.1 Les conditions optimales d’induction et d’expression d’ODC ........................................ 12 V.2 Confirmation de la Purification de l’ODC par SDS PAGE ............................................. 12 V.3 Activité enzymatique de l’ODC ....................................................................................... 13 V.4 Paramètre déterminants la meilleure stabilité de l’ODC ................................................. 15 VI. Conclusion et perspectives ............................................................................................. 17 1 Introduction I. Introduction: Les composés du vin susceptibles d’avoir des incidences sur la santé humaine sont de plus en plus étudiés. Les amines biogènes sont présents dans les aliments et boissons, issus en particulier de fermentation par des bactéries lactiques (Kanny et al. 2000). Biochimiquement, les amines biogènes sont des bases organiques qui proviennent pour la plupart de la décarboxylation d'acides aminés sous l'action de décarboxylases, assistées par le pyridoxal-5'-phosphate (PLP ; coenzyme dérivé de la vitamine B6), ils sont donc associées à une origine fermentaire. En présence de l'acide aminé précurseur, certains genres de bactéries lactiques comme Lactobacillus et Oenococcus oeni sont capables de synthétiser l’Ornithine decarboxylase. La putrescine, l’histamine et la tyramine respectivement sont les trois amines biogènes des vins en teneurs les plus élevées (Gerbaux et al. 2000 ; Izquierdo Canãs et al. 2008), parmi ces trois amines, la Putrescine est l'amine biogène principal associé a l'altération microbienne des aliments, formée par l’action de l’Ornithine decarboxylase sur l’Ornithine figure.1 (Marcobal1et al. 2004). Le tableau I rassemble les acides aminés et leurs amines biogènes associés et les structures de certains amines. Tableau I-acides aminés et leurs amines biogènes associés et structures de certains amines. 2 Introduction Fig.1 La voie de biosynthèse de la Putrescine à partir d’Ornithine par l’ODC. Dans le vin, O. oeni a été très efficace dans la formation de putrescine à partir de l'Ornithine. La souche O. oeni BR14/97 contribue de manière significative à la teneur globale d’amines biogènes des vins, notamment la teneur en putrescine (Guerrini et al. 2002). En outre, la putrescine et les polyamines spermine et spermidine peuvent aussi être formées par une autre voie biochimique impliquant la désamination de l’agmatine (Lu et al. 2002). Peu de micro-organismes sont capables d'utiliser l’agmatine. La voie déiminase agmatine a été signalée chez Lactobacillus hilgardii X1B (Arena et al. 2008), la Transformation de l’agmatine en putrescine chez L. hilgardii produit par ces deux réactions suivantes : Il est généralement admis que la capacité de formation des amines biogènes semble être reliée à la souche bactérienne plutôt que d'être liée à des espèces particulières (Bover-Cid et al. 2001). En ce sens, l'isolement de la souche d’O. oeni IOEB 8419 produisant de la putrescine à partir d’un vin rouge visqueux a été décrite (Coton et al. 1999). Cette souche possède l'activité Ornithine décarboxylase et exige le PLP comme cofacteur. Plus tard, dans une étude visant à vérifier la capacité de production d’amines biogènes de 44 souches d’O. oeni, seulement sept 3 Introduction souches d’O. oeni en mesure de produire la putrescine dans le milieu de culture (Guerrini et al. 2002). Guerrini et collaborateurs affirment que dans une étude effectuée, dont les résultats ne sont pas encore publiés, que des souches d’O. oeni produisant de la putrescine isolées à partir de lie de vin avec une concentration élevée de putrescine. Récemment vingt-six souches sauvages d’Oenococcus oeni ont été étudiées pour leurs capacités à former des amines biogènes pendant la fermentation malolactique (FML) en milieu synthétique et dans le vin. Huit souches parmi les vingt-six produisent l’histamine et la putrescine à des concentrations de 2.6-5.6 mg/l et de 1.2-5.3 mg/l, respectivement, ces résultats indiquent que la capacité d’O. oeni à produire l'histamine et la putrescine est dépendante de la souche bactérienne et la composition du vin, qui à son tour dépend de la souche de levure utilisée pour la fermentation alcoolique et de la durée de contact de bactéries avec la levure après l'achèvement de la FML (Rosi et al. 2009). L’Ornithine décarboxylase (ODC, CE 4.1.1.17) de Lactobacillus 30a inductible par l’isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside (IPTG) a été purifiée, elle est spécifique pour l- Ornithine. L'enzyme native a un poids moléculaire de 1,04 l06 Da. À pH 7,3 et au-dessus, l’ODC se dissocie de façon réversible à une sous unité de masse moléculaire de 184 kDa, l’analyse de l’enzyme sur gel SDS PAGE (conditions dénaturantes), montre qu’il ya une seule bande de 85 kDa (Beverly et al. 1980). L’attribution de ces sous unités à la dodécamère, dimère et monomère, respectivement, d'une sous-unité peptidique unique. La micrographie électronique montre un réseau hexagonal de sous-unités apparemment dimérique de l'enzyme native. Qui présentent un dodécamère de forte activité enzymatique de l’ODC (Momany et al. 1995). L'identification du gène d'Ornithine décarboxylase putrescine-producteur chez la souche RM83 d’Oenococcus oeni qui contient un cadre de lecture ouvert de 2235 nucléotides codant pour une protéine de 745 acides aminés avec un poids moléculaire de 81 kDa. La structure primaire de l'ODC déduite de la séquence nucléotidique, on a une séquence consensus contenant un domaine de liaison du pyridoxal-5’-phosphate (PLP), et les acides aminés impliqués dans l'activité enzymatique sont également conservés. Déterminé par analyse BLAST, l’alignement entre ODC d’Oenococcus oeni RM83 présente un taux de similarité de 67% avec l'ODC de Lactobacillus 30a, figure 2 (Marcobal1 et al. 2004). 4 Introduction Fig.2 Alignement de séquences de L. 30a ODC et O. oeni ODC (base de donnée NCBI). La relation évolutive entre ODC d’Oenococcus oeni RM 83 et ODC de bactéries apparentées basée sur l’alignement de séquences protéiques par les programmes Clustal W et phylogenetic tree, montre que l’Ornithine decarboxylase des deux espèces sont très similaires, figure 3 (Marcobal1 et al. 2004). Fig. 3 Relation évolutive ODC d’Oenococcus oeni RM 83 et ODC de bactéries apparentées, l’alignement de séquences protéiques par Clustal W et phylogenetic tree (Marcobal1 et al. 2004). 5 Introduction La séquence nucléotidique du fragment d'ADN chromosomique de 17,2 kb contenant le gène codant pour l'Ornithine décarboxylase ODC a été déterminé dans la souche RM83 d’Oenococcus oeni produisant de la putrescine. Ce fragment d'ADN contient 13 cadres de lecture ouverts, y compris les gènes codant pour cinq transposases et deux protéines du phage. Cette description pourrait représenter la première preuve d'un événement de transfert horizontal de gènes à l'origine d'un locus de biosynthèse d’amine biogène (Marcobal2 et al. 2006). L'analyse des composés dont la fraction est azotée comme les acides aminés et les amines biogènes est difficile en raison de leurs différentes structures et l'absence d'un chromophore spécifique, par conséquent, ils sont dérivés en utilisant différents composés chimiques les rendrais détectables au UV-visible. Il est habituel d'analyser les amines biogènes et les acides aminés séparément par HPLC après derivatisation pré-ou post-colonne: les dérivés fluorescents réagissent avec o-phthaldialdéhyde (OPA), bien que le principal acide aminé du vin (la proline) ne réagissent pas a l’OPA, par contre la derivatisation de la proline à la ninhydrine lui confère une absorption très forte en UV-vis (Herberger et al. 2003 ; Soufleros et al. 1998). Certaines méthodes d’analyse des acides aminés et des amines biogènes dans le vin ont étés récemment publiées permettant la standardisation de l’analyse de ces composés. Gomez et al. 2007 ont développés une nouvelle méthode pour l’analyse des amines biogènes du vin et de la bière, la méthode consiste a une séparation HPLC en phase inverse et une détection UV-vis des aminoenones formés par la réaction des acides aminés, des amines biogènes avec le réactif de derivatisation le diethyl ethoxymethylenemalonate (DEEMM), figure 4. Fig.4 Structure des dérivés aminoenone: (a) réaction de derivatisation; (b) derivatisation primaire d’acide aminé ; et (c). Derivatisation secondaire d’acide aminé. 6 Introduction Finalement, la sur-expression de notre protéine recombinante ODC (Oenococcus oeni BR 14/97) est réalisée par le clonage dans le plasmide pET28a (Novagen), de la séquence codante du gène odc (ADN amplifiée par PCR) en phase avec une séquence codant pour six résidus histidine et sous le contrôle du promoteur T7, inductible a l’IPTG la souche BL21 de E. coli est transformée avec ce plasmide et va permettre la sur-expression de la protéine recombinante. II. Présentation du laboratoire d’accueil : Laboratoire de Recherche en Vigne et Vin (REVV) Directeur : Pr. Hervé ALEXANDRE Cette Equipe d'Accueil qui est entièrement rattachée à l'Institut universitaire de la vigne et du vin Jules Guyot (IUVV) depuis septembre 2007, développe deux thématiques de recherche : Maîtrise de la fermentation malolactique : Caractérisation de la réponse adaptative d’O. oeni. Etude des Flores d’altération. 65 Publication de 2002 à 2009 III. Objectif du stage : L’objectif du stage consiste à : La mise au point du protocole de purification de l’Ornithine decarboxylase par une colonne contenant la résine Ni-NTA (Qiagen). Trouvé la concentration de l’IPTG (induction) et de temperature pour lesquelles l’expression du gène odc chez E. coli BL21 est optimale. Déterminé les conditions optimales en température et pH pour une meilleure activité enzymatique de l’Ornithine decarboxylase. 7 Materiels et méthodes IV. Matériels et méthodes IV.1 Clonage du gène odc: La séquence codante du gène odc d’Oenococcus oeni BR14/97 (ADN amplifiée par PCR) est clonée dans le vecteur pET28a (Novagen) pour donner le vecteur pETodchis. Ce gène a été cloné de façon à ce que sa séquence codante soit en phase avec une séquence codant pour six résidus histidine et sous le contrôle du promoteur T7, inductible par l’IPTG. La souche BL21 E. coli est transformée avec ce plasmide résistant à la Kanamycine et va permettre la sur-expression de la protéine recombinante ODC-6His. La figure 5 illustre les étapes de construction du vecteur pETodchis selon Guerrini et al 2002. Fig.5 Clonage gène odc dans le vecteur pET28a (Novagen) exprimé par E. coli BL21. IV. 2 Test des conditions optimales d’expression: IV.2.1 Préculture: La souche LB21-ODC E. coli est ensemencée dans 100 ml du milieu Luria Bertani (LB) contenant 100µl de la Kanamycine à 50µg/ml, la solution est incubée à 37°C pendant 12h sous agitation. 8 Materiels et méthodes IV.2.2 Culture et induction: La souche LB21-ODC E. coli, transformée est cultivée dans 1 litre du milieu LB supplémenté en kanamycine (50µg/ml), à 37°C. Lorsque l’ABS600 atteint 0,5, la biosynthèse de la protéine recombinante est induite en ajoutant de l’IPTG ; 50µM et 100µM à 16°C et 25°C, l’incubation pendant 12h sous agitation. Les cellules sont récoltées par centrifugation (5min à 5000 g à 4°C), le culot est repris dans du tampon de composition suivante : Na H2 PO4 50 mM, NaCl 300 mM. Les cellules d’E. coli sont cassées par un passage au FastPrep-24system. Les extraits cellulaires totaux, obtenus après deux centrifugations successives (10 min à 8000 g à 4°C), sont soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10% dans un tampon de migration 1x (Tris [pH 7,8] 80mM, glycine 1,6 M, SDS 4mM). 15µl du bleu de dénaturation (SDS 25%, glycérol 100%, bleu de bromophénol 0,5%, DDT 100mM, Tris 1M, pH 6,8), sont ajouté pour chaque 15µl d’échantillons à différentes condition d’induction en IPTG et T°C, les mélanges sont passés au thermocycleur 5min à 90°C. Le volume maximal de dépôt sur gel d’acrylamide 10% est de 25µl. 10µl du marqueur de poids moléculaire sont aussi déposés sur le gel. IV.2.2.1 Dosage protéique: Le dosage des protéines totales est réalisé selon la méthode de Bradford avec le kit Protein Assay (Bio-Rad, France). Le principe est basé sur le changement de coloration du bleu de Coomasie G250 qui change de couleur lorsqu’il se lie aux protéines. La coloration ainsi obtenue peut être mesurée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 595 nm. Le *Dye reagent* (200µl) est mélangé à la solution protéique diluée (800µl). L’absorbance des différents mélanges ([C] en IPTG et T°) est mesurée après 15min d’incubation à temperature ambiante. Afin de calculer la concentration des échantillons, une gamme étalon est réalisée avec des quantités de sérum albumine bovine (BSA) dans un intervalle de 0,2 à 1,4 mg/ml. IV.3 Purification de l’ODC sur une colonne de résine Ni-NTA (Oiagen) : Les conditions de culture d’E. coli BL21 est comme décrit précédemment, sauf que l’induction est réalisée par 50µM de l’IPTG et 16°C pendant 12h. La culture est centrifugée pendant 5min à 5000 g à 4°C, le culot est repris dans 7ml du tampon dont la composition est la suivante ; Na H2 PO4 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazole 10 mM, pH 8. Les cellules sont cassées par un passage au disrupteur (Cell Disrupter) à une pression de 1,4 x 108 Pa. Une centrifugation pendant 5min à 10000 g à 4°C est réalisée pour éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est récupéré dans la 9 Materiels et méthodes glace. Le surnageant est chargé sur une colonne contenant de la résine Ni-NTA préalablement équilibrée par le tampon dont la composition est : Na H2 PO4 50 mM, NaCl 300 mM, pH= 8. La protéine est éluée par un tampon composé de ; Na H2 PO4 50 mM, NaCl 300 mM, pH= 8, une gamme de l’imidazole de 50 mM à 100 mM. Les différentes fractions sont récupérées ET SONT analysées par SDS PAGE comme décrit précédemment, dans le but de révéler la présence de l’ODC. La figure 6 résume les étapes de purification de l’ODC sur la colonne résine Ni-NTA. Induction Fixation Lavage Elution Fig. 6 Principe de purification sur colonne Ni2+-NTA, protéine ODC-6His-tag IV.4 Dosage de l’activité enzymatique de l’ODC par HPLC : Dans un premier temps : nous vérifiant si notre enzyme ODC purifiée est bien active par la réaction enzyme-substrat et produit détecté par HPLC. Le mélange réactionnel est le suivant : 10 Materiels et méthodes 1ml de la solution tampon A (0,05M potassium phosphate ou citrate-phosphate, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, pH 5,8) comme décrit par Beverly et al 1984. 50 µl BSA solution mère de 1g/l (confère la stabilité pour l’ODC). 1µl PLP (1mM). 50µl Ornithine (substrat, 10g/l). 200µl de l’ODC purifiée. Le mélange réactionnel est incubé pendant 2h à 28°C, ensuite le dosage de l’activité enzymatique de l’ODC est réalisé en deux étapes, suivant la méthode décrite par Gomez et al 2007 : la réaction de derivatisation et l’analyse HPLC Dans un deuxième temps : la même réaction que la précédente est réalisée, sauf que pour déterminer l’influence de la temperature sur l’activité spécifique de cette enzyme, les mesures ont été réalisées à différentes températures constantes (27°, 30°, 35° et 37°C). L’influence du pH a été déterminée en faisant varier le pH (3.4, 4, 5, 5.4, 5.6, 5.8, 6, 6.2, 6.4, 7 et 8) du tampon A (citrate-phosphate 0,05M). IV.4.1 Réaction de derivatisation: les dérivés Aminoenones ont été obtenus par le mélange réactionnel suivant : 1,75 ml de tampon borate H3BO3 à 1 M, pH 9, 750 µl de méthanol pureté HPLC, 1 ml de la solution ODC purifiée sans aucun prétraitement, 40 µl du standard interne (2,4,6trimethylphenethylamine hydrochloride 97%), et 30 µL DEEMM (diethyl ethoxymethylenemalonate) puis 30 min dans un bain à ultrasons incubation à 70 ° C pendant 2 h pour permettre la dégradation complète de DEEMM en excès. IV.4.2 Analyse HPLC : Pour déterminer la quantité du putrescine formée (produit) ou la quantité de l’ornithine disparue (substrat), la méthode d’analyse utilisée est la chromatographie liquide haute performance décrite par Gomez et al 2007, les caractéristiques de la méthode sont ; colonne (5 C18-HL), taille des particules 5 µm (250 mm - 4.6 mm) la T°C du four thermostat est 16°C. Phase A ; 25 mM tampon acétate à pH 5.8 avec 0.02% sodium azide et la phase B ; 80:20 mélange d’acetonitrile et du méthanol, débit 0,9ml/min, détection à 280nm, les gradients d’élution d’HPLC sont présentés dans le tableau II. 11 Materiels et méthodes Tableau II. Gradient d’élution HPLC time (min) 0 20 30 33.5 65 73 78 82 85 Éluant A (%) 90 90 83 83 60 28 18 0 0 Éluant B (%) 10 10 17 17 40 72 82 100 100 Les composés ont étés identifiés en fonction du temps de rétention et les caractéristiques spectrales UV-vis des dérivés ont été quantifiés à l'aide du standard interne, le volume réactionnel injecté est de 50µl. IV.5 Test de la stabilité de l’ODC : Pour la conservation de notre enzyme ODC purifiée on a utilisé deux solutions de conservations avec et sans glycérol (congélation) afin de voir dans quelle condition l’enzyme ODC est stable, le mode opératoire est le suivant ; 1ml du tampon pH 5.8, 50µl BSA, 1µl PLP et 50µl ornithine, on ajoute 25µl ODC purifiée avec glycérol et 25µl ODC purifiée sans glycérol, les deux solutions avec et sans glycérol sont mises à 35°C pendant 1 heurs puis on réalise la réaction de derivatisation et l’analyse HPLC comme décrit précédemment. 12 Résultats et discussion V. Résultats et discussion V.1 Les conditions optimales d’induction et d’expression du gène odc : La figure 7 du gel SDS PAGE montre que les meilleures conditions d’expression en IPTG et temperature, de la séquence du gène odc d’O. oeni clonée dans le vecteur pET28a, exprimée chez E. coli BL21 est représenté par la piste 50µM IPTG à 16°C représentant a ce niveau des bandes de 85 kDa qui sont des bandes de l’ODC. Les résultats de dosage de Bradford confirment que la grande quantité des protéines est de 129.32 mg/l obtenue par 50µM de l’IPTG à 16°C comme conditions optimales d’expression et d’induction. Donovan et al 2000 ont étudiés l'expression du fragment Fab d'un anticorps monoclonal chez la souche d'Escherichia coli RB791/pComb3 induite avec de l’IPTG, ils ont trouvés qu’une concentration de 50µM d'IPTG suffisante pour atteindre une expression maximale de la protéine Fab (Donovan et al. 2000). Lee et al 2007 ont rapportés que la meilleure temperature d’expression de la séquence du gène odc dans le vecteur pET-15b chez E.coli BL21 est de 16°C (Lee et al. 2007). Fig.7 Profile SDS PAGE de l’expression du gène odc sous différentes conditions d’induction en IPTG et temperature. V.2 Confirmation de la Purification de l’ODC par SDS PAGE: La figure 8 montre des bandes de 85 kDa de l’ODC-6his très nettes sans bandes de contaminations, l’ODC commence à être éluées à partir de 50 mM d’imidazole (solutions 13 Résultats et discussion d’élutions), le poids moléculaire de l’ODC de Lactobacillus 30a selon Beverly et al 1980 est de 85kDa, les résultats de l’alignement des deux séquences ODC O. oeni et ODC Lactobacillus 30a présentent une grande similarité. Fig. 8 Profile SDS PAGE de purification de l’ODC par différentes Solutions d’élutions à des concentrations en imidazole de 50 mM à 100 mM. V.3 Activité enzymatique de l’ODC : La figure 9 présente le chromatogramme HPLC obtenu après la réaction enzymatique (substratenzyme-produit). La détection de putrescine à un temps de rétention de 77,20 min, donc notre enzyme ODC est active. Gomez et al. 2007 ont rapportés que le pic de putrescine est détectable à un temps de rétention de 77min et celui de l’Ornithine (substrat) à 62. 30 min. La figure 10 montre la courbe d’évolution du pourcentage de l’activité enzymatique en fonction de la temperature et l’influence de la temperature sur l’activité de l’ODC. La temperature optimale est de 35°C, à cette temperature l’ODC est 100% active. Par contre à 37°C il y a une perte de 40% d’activité, à 30°C une perte de 60% d’activité de l’ODC et à 27°C une perte de 80% d’activité. En conclusion, on peut dire que l’ODC est thermosensible à des petites variations de temperature de l’ordre de 2°C. La figure 11 montre la courbe de variation de l’activité de l’ODC en fonction du pH. Une activité de 100% de l’ODC est enregistrée à pH5,8. Par contre s’il ya une baisse ou une augmentation du pH, d’une unité de l’ordre de 0,2 une perte de l’activité à 80%. Par exemple, à 14 Résultats et discussion pH 6 et 5,6, une perte de 80% de l’activité de l’ODC est enregistrée. A pH 7 et 4 une perte totale de l’activité de l’ODC est enregistrée. Donc l’ODC et sensible aux variations du pH dans les deux sens (base /acide). Fig. 9 Chromatogramme HPLC de l’activité enzymatique de l’ODC à 200µl/28°C. 15 Résultats et discussion Fig. 10 Courbe de variations de l’activité enzymatique d’ODC en fonction de la temperature. Fig. 11 Courbe de variations de l’activité enzymatique d’ODC en fonction du pH. V.4 Paramètre déterminants la meilleure stabilité de l’ODC : Habituellement la conservation des protéines dans du glycérol assure une meilleur stabilité des ces dernières. Mais nos résultats obtenus présentés dans le tableau III montre que la meilleure activité et stabilité de l’ODC est obtenue en conservant à – 20°C sans glycérol ; 10.8 mg de putrescine formée /litre. Par contre une baisse de putrescine formée ; 3.9 mg /l dans la solution de conservation au glycérol 50% à -20°C. Les protéines purifiées sont souvent peu stables et 16 Résultats et discussion doivent généralement être conservées dans des conditions les protégeant de la dégradation ou la réduction de l’activité. Certaines protéines sont beaucoup plus exigeantes que d'autres et doivent être gardées à -80°C (Boyer. 1986), cependant beaucoup se conservent aux alentours de -20°C. Il est possible aussi de garder certaines protéines qui se dénaturent durant la congélation dans une solution de glycérol (Osterlund et Janson. 1997). Il convient aussi d'éviter de répéter des cycles de congélation et de décongélation. La façon la plus commune d'éviter ce problème est de congeler la préparation en petites fractions qui pourront être décongelées une à la fois (Price. 1992). En perspectives, ça sera mieux de tester un échantillon de l’ODC sans congélation ni glycérol, mais a temperature ambiante dans du tampon A adéquat qui va ne permettre de comparer nos résultats à ce témoin. Tableau III : résultats de stabilité de l’ODC exprimés par la production de Putrescine formée. 17 Conclusion et perspectives VI. Conclusion et perspectives Les amines biogènes (putrescine, histamine, tyramine, cadavérine) proviennent pour l’essentiel de la transformation des acides aminés libres par certaines souches bactériennes par l’action des décarboxylases. Ils remplissent des fonctions essentielles dans l’organisme mais, consommés en excès, peuvent occasionner certains troubles (maux de tête et troubles intestinaux surtout) généralement transitoires. Dans ce travail nous nous sommes intéressés à l’étude de l’Ornithine décarboxylases de la souche BR14/97 d’Oenococcus oeni exprimée par le gène odc chez E. coli BL21 responsable de la formation de la putrescine à partir de l’ornithine. La première partie a été consacrée pour la détermination des conditions optimales d’induction et d’expression du gène odc exprimé chez E. coli BL21. Nous avons réussi à déterminé la meilleure condition d’induction à 50µM d’IPTG à 16°C. La deuxième partie consiste à la mise au point du protocole de purification de l’ODC-6His-tag par la colonne résine Ni-NTA en utilisant des solutions d’élutions à différentes concentration en imidazole. Une SDS PAGE a été réalisée confirmant que l’élution de l’ODC commence à partir de 60 mM d’imidazole. Finalement nous avons déterminés que le pH5.8 et la Temperature de 35°C sont les optimums pour une activité maximale d’ODC. En perspectives, Il serait intéressant de faire une cinétique enzymatique pour déterminer les constantes enzymatiques Km et Vmax et de vérifier l'effet des inhibiteurs et leurs modes d’inhibition sur l’activité de l’Ornithine decarboxylase. Arena ME, Landete JM, Manca de Nadra MC, Pardo I, Ferrer S, (2008) Factors affecting the production of putrescine by Lactobacillus hilgardii X1B isolated from wine. J. Appl. Microbiol 10 :1365-2672 Bover-Cid S, Hugas M, Izquierdo-Pulido M, Vidal-Carou MC (2001) Amino acid decarboxylase activity of bacteria isolated from fermented pork sausages. Int. J. Food Microbiol 66:185– 189. Beverly M, Guirard and Esmond E, Snell (1980) Purification and Properties of Ornithine Decarboxylase from Lactobacillus sp. 30a* the journal of biological chemistry 255: 59605964 Boyer RF, (1986) Modern experimental biochemistry, Addison-Wesley Publishing Co, Reading (Mass., USA), p. 243-52 Coton E, Torlois S, Bertrand A, Lonvaud-Funel A (1999) Biogenic amines and wine lactic acid bacteria. Bull L_OIV 815–816: 22–35 Donovan R S, Robinson CW, Glick BR (2000) Optimizing the expression of a monoclonal antibody fragment under the transcriptional control of the Escherichia coli lac promoter. Canadian journal of microbiology 46: 532-541 Gerbaux V, Monamy C, (2000) Les amines biogènes dans les vins de Bourgogne - 1ère partie : Teneurs, origine et maîtrise dans les vins. Rev. Fr. Oenol 183 : 25-28. Guerrini S, Mangani S, Granchi L, Vincenzini M (2002). Biogenic Amine Production by Oenococcus oeni. Current Microbiology 44:374–378 Gomez-alonso S, Gutieä rrez I H, Garciäa ROE (2007) Simultaneous HPLC Analysis of Biogenic Amines, Amino Acids, and Ammonium Ion as Aminoenone Derivatives in Wine and Beer Samples J. Agric. Food Chem 55: 608-613 Herberger K, Cosmos E, Simon-Sarkadi L(2003) Principal component and linear discriminant analyses of free amino acids and biogenic amines in Hungarian wines. J. Agric. Food Chem 51 : 8055-8060 Izquierdo Canãs PM, GarcΊa Romero Ea, GΌmez Alonso S, Fernàndez Gonzàlez M, Palop Herreros MLL (2008) Amino acids and biogenic amines during spontaneous malolactic fermentation in Tempranillo red wines Journal of Food Composition and Analysis 21: 731– 735 Kanny G, Gerbaux V(2000). Les amines biogènes dans les vins de Bourgogne - 2e partie : Rôle de l’histamine dans l’intolérance aux vins. Rev. Fr. Oenol 184 : 33-35. Lu CD, Itoh Y, Nakada Y, Jiang Y, (2002) Functional analysis and regulation of the divergent spuABCDEFGH-spuI operons for polyamines uptake and utilization in Pseudomonas aeruginosa PAO 1. J. Bacteriol 184: 3765–3773 Lee J, Anthony J M L, Dariusz M, Elizabeth JG, Margaret AP (2007) Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the -barrel fold basic amino acid decarboxylases. The Journal of Biological Chemistry 282: 27115-27125 Marcobal1 A, De las Rivas B, Moreno-Arribas MV, MunÕz R (2004) Identification of the ornithine decarboxylase gene in the putrescine-producer Oenococcus oeni BIFI-83 FEMS Microbiology Letters 239: 213–220 Marcobal2 A De las Rivas B,1 Moreno-Arribas M V, MunÕz R (2006) Evidence for Horizontal Gene Transfer as Origin of Putrescine Production in Oenococcus oeni RM83 Applied and Environmental Microbiology72: 7954–7958 Osterlund B, Janson JC (1997) A strategic approach to protein purification: Part 1, Pharmacia Biotech 2(3): 8-10 Price NC (1992) Techniques for enzymes extraction in R Eisenthal, MJ Danson (éditeurs), Enzymes assays, IRL Press, Oxford : 255-76 Rosi L , Nannelli F, Giovani G (2009) Biogenic amine production by Oenococcus oeni during malolactic fermentation of wines obtained using different strains of Saccharomyces cerevisiae LWT - Food Science and Technology 42 :525–530 Soufleros E, Barrios ML, Bertrand A (1998) Correlation of biogenic amines and other wine compounds. Am. J. Enol. Vitic., 49: 266-278 Résumé Les amines biogènes sont des amines non volatiles qui proviennent de la dégradation microbienne des denrées riches en protéines, comme la putréfaction des viandes, maturation des fromages, et fermentations diverses, suite à la décarboxylation d’acides aminés. Cette réaction est catalysée par des enzymes *décarboxylases* présentes chez certaines bactéries. Dans le présent travail, l’ornithine décarboxylase d’Oenococcus oeni BR14/97 responsable de la formation de l’amine biogène *Putrescine* dans le vin, par la décarboxylation de l’ornithine. Les meilleures conditions d’induction et d’expression du gène odc exprimé chez E. coli BL21 ont été déterminées (50 µM IPTG/ 16°C). La révélation de l’ODC est réalisée par la migration en SDS PAGE. L’enzyme a été purifiée par chromatographie d’affinité sur colonne en résine Ni-NTA. Les paramètres et valeurs optimales d’activité de l’ODC ont été déterminées (pH 5.8, T 35° C) par la réaction ; ODC/Ornithine pour l’obtention de la putrescine qui sera détecté et quantifié par HPLC. Mots clés : Amines biogènes, Ornithine décarboxylase, Putrescine, Oenococcus oeni, E. coli BL21. Abstract Biogenic amines are non-volatile amines from the microbial degradation of foods rich in protein, such as decaying meat, cheese ripening, and various fermentation, following the decarboxylation of amino acids. This reaction is catalyzed by enzymes *decarboxylases* present in certain bacteria. In this work, ornithine decarboxylase Oenococcus oeni BR14/97 responsible for the formation of biogenic amine * Putrescine* in wine, by the decarboxylation of ornithine. The best conditions for induction and expression of the odc gene expressed in E. coli BL21 were determined (50 µM IPTG / 16 ° C). The revelation of the ODC carried out by migration on SDS PAGE. The enzyme was purified by affinity column chromatography resin Ni-NTA. The parameters and optimal values of ODC activity were determined (pH 5.8, T 35 ° C), by ODC / Ornithine reaction to obtain Putrescine to be detected and quantified by HPLC. Keywords: Biogenic amines, Ornithine decarboxylase, Putrescine, Oenococcus oeni, E. coli BL21. Université de Bourgogne -Dijon 2009/2010
