Production de souches de Trypanosoma congolense sur des souris Naval Medical Research Institute
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N° d’ordre------UNIVERSITE NAZI BONI **************** UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE EN SCIENCES ET TECHNIQUES **************** GENIE BIOLOGIQUE CENTRE INTERNATIONAL DE RECHERCHE-DEVELOPPEMENT SUR L’ELEVAGE EN ZONE SUBHUMIDE **************** UNITE MALADIES A VECTEURS ET BIODIVERSITE **************** **************** RAPPORT DE FIN DE CYCLE Pour obtention de la LICENCE PROFESSIONNELLE DE GENIE BIOLOGIQUE Option : Analyses Biologiques Sur le thème : Production de souches de Trypanosoma congolense sur des souris Naval Medical Research Institute Présenté par KOMBASSERE ELIE Maître de stage : Dr Jacques KABORE Directeur de rapport : Pr Aboubacar TOGUYENI Année universitaire : 2015-2016 SOMMAIRE DÉDICACE ....................................................................................................................... iii REMERCIEMENTS .......................................................................................................... iv LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ..................................................................... vi RESUME .......................................................................................................................... vii ABSTRACT ..................................................................................................................... viii LISTE DES FIGURES ...................................................................................................... ix LISTE DES TABLEAUX................................................................................................... x LISTE DES ANNEXES ..................................................................................................... x INTRODUCTION .............................................................................................................. 1 PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE .......................................... 1 Chapitre I : La Trypanosomose Animale Africaine ............................................................ 3 I-1- Définition et répartition géographique ..................................................................... 3 I-2- Importance socio-économique ................................................................................. 4 Chapitre II: Les agents pathogènes ..................................................................................... 6 II-1- Définition et taxonomie .......................................................................................... 6 II-2- Morphologie et Cycle de développement ............................................................... 7 II-3- Virulence et symptômes ....................................................................................... 11 II-4- Épidémiologie de la TAA ..................................................................................... 13 II-5- Diagnostic ............................................................................................................. 14 II-6- Traitement ............................................................................................................. 18 DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE ...................................................... 1 Chapitre I : Matériel et méthodes...................................................................................... 19 I-1- Matériel .................................................................................................................. 19 I-2- Méthodologie ......................................................................................................... 21 I-3- Analyse des données .............................................................................................. 26 Chapitre II : Résultats et discussion .................................................................................. 27 II-1- Résultats................................................................................................................ 27 i II-2- Discussion ............................................................................................................. 31 Conclusion et perspectives ................................................................................................ 34 BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................ 35 ANNEXES TABLE DES MATIERES .................................................................................................. II ii DÉDICACE Je dédie ce travail à : A mon très cher père, Emmanuel P. KOMBASSERE, celui qui ne se lasse point d’aménager tous ses efforts pour que j’atteigne mes objectifs ; A ma très chère mère, Thérèse ZONGO, celle qui ne cesse de me réconforter et m’encourager dans les moments difficiles de ma vie ; A mes frères et sœurs pour leurs compréhensions et leurs soutiens, Puisse le seigneur nous unir d’avantage dans son amour. A tous ceux qui de loin ou de près, ont participé à la réalisation de ce travail. Trouvez ici le témoignage de ma pleine reconnaissance iii REMERCIEMENTS La réalisation de ce travail entrant dans le cadre de notre Licence n’a été possible que grâce à la disponibilité et à la sincère collaboration de plusieurs personnes. A cet effet, nous voudrions exprimer notre profonde gratitude : au Dr Valentine C. YAPI-GNAORE, Directrice Générale du Centre International de Recherche-Développement sur l’Élevage en zone Subhumide (CIRDES) qui a bien voulu nous accepter en tant qu’étudiant-stagiaire au sein de son institution ; au Pr Aboubacar TOGUYENI, Enseignant-chercheur à l’Université Nazi Boni (UNB), notre Directeur de rapport pour avoir accepté de nous encadrer. Nous tenons à vous remercier pour la confiance placée en nous ; au Dr Jacques KABORE, Enseignant-chercheur à l’UNB et Chercheur au CIRDES, notre maître de stage. Vous avez accepté de nous encadrer malgré vos multiples occupations. Nous vous remercions pour tout ce que vous nous avez appris, merci pour votre gentillesse, votre disponibilité, votre sens de l’écoute et votre compréhension. Vos qualités humaines et d’homme de science suscitent respect et admiration ; au Dr Zakaria BENGALY, Directeur scientifique du CIRDES pour avoir toujours été à nos cotés pour nous soutenir et nous encourager ; au Dr Charles DAYO, Chef de l’Unité Maladies à Vecteurs et Biodiversité (UMaVeB), pour nous avoir reçu au sein de son service ; au Dr Augustin BANCE, Responsable du service de Communication et de Valorisation (C-VALO) pour sa disponibilité. aux Dr Hamidou ILBOUDO et Dr Stijn DEBORGGRAEV, pour la formation de qualité qu’ils nous ont donnés sur la PCR en temps réel dès les premiers jours de notre arrivé au CIRDES. iv au Dr Olivier AMOUSSOU pour sa constante disponibilité, son sens d’écoute et ses précieux conseils ; à tous nos aînés étudiants stagiaires au CIRDES, particulièrement au doctorant Justin Windingoudi KABORE et Charlie COMPAORE pour leurs soutiens, leurs sympathies et les bons moments passés ensemble. aux sieurs Hassane SAKANDE et Mohamed BAMBA, techniciens de laboratoire au CIRDES, pour nous avoir initié aux techniques de diagnostic sérologique, parasitologique et de biologie moléculaire. Nous n’oublions pas leurs collègues, Léopold MILLOGO, Mêmê YOUL, Souleymane SYLLA, Adrien ZOUNGRANA, Maurice KONKOBO, Victor BAZEMO, pour leurs précieux conseils et le climat de convivialité qui règne au sein du laboratoire ; à tous mes camarades de la 2ème promotion de Génie-Biologique option : Analyses Biologiques pour ces trois ans de fraternité passés ensemble. à tous les chercheurs et le personnel du CIRDES pour leur accueil et leur courtoisie. Nous tenons à remercier également : le Pr Georges Anicet OUEDRAOGO, Président de l’UNB pour nous avoir autorisé à s’inscrire à l’université ; le Pr Sado TRAORE, Directeur de l’Unité de Formation et de Recherche en Sciences et Techniques (UFR/ST) pour avoir permis la réalisation de ce stage ; le Dr Roland MEDA, Directeur Adjoint de l’Unité de Formation et de Recherche en Sciences et Techniques (UFR/ST) pour les conseils et les encouragements qu’il nous a prodigué tout au long de notre formation ; le Dr Ernest SALOU, coordonnateur de la filière Génie-Biologique, qui fait du mieux qu’il peut pour accompagner les étudiants. Merci pour la confiance placée en nous ; à tout le comité pédagogique de la formation de la Licence professionnelle de Génie Biologique et l’administration pour les enseignements de qualité qu’ils nous ont fournis tout au long de notre formation. v LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS Abréviations/sigles Significations ADN : Acide Désoxyribonucléique CIRDES : Centre International de RechercheDéveloppement sur l’Élevage en zone Subhumide ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FAO Food and Agriculture Organization LCR : Liquide Céphalorachidien NMRI : Naval Medical Research Institute OMS : Organisation Mondiale de la Santé PCR : Polymerase Chain Reaction SNC : Système Nerveux Central TAA : Trypanosomose Animale Africaine UI : Unité Internationale UNB : Université Nazi Boni vi RESUME La Trypanosomose Animale Africaine (TAA) est une parasitose due à des protozoaires flagellés appartenant au genre Trypanosoma (T). Causée principalement par les espèces T. congolense, T. vivax et T. brucei brucei, elle touche plus de 37 pays africains et est transmise par un vecteur hématophage du genre Glossina appelé communément mouche tsé-tsé. La TAA entrave le développement de l’élevage, de l’agriculture et en générale le développement du continent Africain. Malgré les importants efforts de lutte, l’éradication de la TAA reste toujours un défi à relever et passe par une bonne connaissance de l’interaction entre le trypanosome et son hôte animal. Ainsi dans le but de mieux connaitre les trypanosomes afin de mettre en place des méthodes de lutte plus adaptées, cette étude réalisée au CIRDES a eu pour objectifs : d’une part de cultiver six souches de T. Congolense, de faire des stabilats pour des études antérieures et d’autre part de caractériser ces différentes souches par rapport à leurs virulences. Ainsi, six lots de deux souris NMRI (Naval Medical Research Institute) ont été infectés avec des souches de T.congolense puis passé sur six lots de trois souris. Pendant l’expérimentation, le taux d’hématocrite, le poids corporel et la parasitémie de chaque souris ont été suivi. Les résultats obtenus ont révélé une baisse du taux d’hématocrite allant de 4 à 14%, une période prépatente des souches allant de un à trois jours et une augmentation légère de 0,85 à 5,65 g du poids corporel des souris. En fin de compte, la souche Ser71/SMB/212 a semblée être la souche la plus virulente des six souches de T. congolense étudiées. Mots-clés : Trypanosomose Animale Africaine -Trypanosoma congolense -Souris NMRI -Stabilat -Virulence. vii ABSTRACT African Animal Trypanosomiasis (AAT) is a parasitic disease caused by a protozoan belonging to the genus Trypanosoma: T. congolense, T. vivax and T. brucei brucei. This disease affects more than 37 African countries and is transmitted by a hematophagous vector called tsetse fly. The AAT hampers the development of breeding, agriculture and in general, the African continent. Despite important struggle efforts, the eradication of the AAT remains a challenge to achieve and requires a good knowledge concerning interaction between trypanosome and its animal host. So, in the goal to know trypanosomes better in order to put in place of the struggle methods more adapted, this survey achieved in the CIRDES had for objectives: on the one hand, to cultivate six strains of T. congolense and make some stabilats for previous studies and on the other hand, to characterize these different strains in relation to their virulence. Thus, six batches of two NMRI mice were infected with T.congolense strains and then passed on six batches of three mice. During experiment, the rate of hematocrit, body weight and the parasitemia of each mouse were monitored. The results obtained revealed a decrease of the rate of hematocrit of 4 to 14%, prepotency period of the strains going from one to three days and light increase of 0.85 to 5.65 g of body weight of mice. At the end, Ser71/SMB/212 appeared to be the most virulent strain of six strains of T. congolense studied. Key words: Animal African Trypanosomiasis -Trypanosoma congolense -Mouse NMRI -Stabilat -Virulence. viii LISTE DES FIGURES Figure 1 : Aire de répartition des glossines en Afrique (DFID/AHP, 2005) ...................... 4 Figure 2 : Diagramme de Classification de quelques trypanosomes importants de mammifères (Farougou et al., 2007)................................................................................... 7 Figure 3 : Morphologie des trypanosomes (Walker, 1994) ................................................ 8 Figure 4 : Représentation schématique d'un trypanosome montrant les différentes parties du micro-organisme (Lamine et Desquesnes, 2003)........................................................... 9 Figure 5 : Cycle de développement des trypanosomes (Descamps, 2002) ....................... 10 Figure 6: Animal trypanosomé en état de prostration (Lamine et Desquesnes, 2003) ..... 13 Figure 7 : Souris NMRI utilisées pour l’amplification des souches de T. congolense (Kombassere, 2017) .......................................................................................................... 21 Figure 8 : Pesée des souris avec la balance électronique (Kombassere, 2017) ................ 23 Figure 9 : Lecture de la parasitémie avec le microscope optique sous l’objectif 40 (Kombassere, 2017) .......................................................................................................... 24 Figure 10 : Centrifugation des tubes capillaires et lecture du taux d’hématocrite (Kombassere, 2017) .......................................................................................................... 25 Figure 11 : Évolution journalière de la parasitémie des lots de souris infectées par les six souches de T. congolense. ................................................................................................. 28 Figure 12 : Évolution journalière du poids des lots de souris infectées par les six souches de T. congolense................................................................................................................ 29 Figure 13 : Comparaison du taux d’hématocrite moyen des souris avant l’infection et après l’infection par les six souches de Trypanosoma congolense. .................................. 30 ix LISTE DES TABLEAUX Tableau I : Description des souches de trypanosomes utilisées pour l’étude expérimentale. ................................................................................................................... 20 Tableau II : Analyse statistique de la moyenne journalière des taux d’hématocrites avant et après l’infection des lots de souris par les six souches de T.congolense ...................... 31 LISTE DES ANNEXES Annexe 1 : Tableau d’estimation de la parasitémie (Herbert et Lumsden 1976).................I x INTRODUCTION La Trypanosomose Animale Africaine (TAA) est une parasitose qui affecte principalement les bovidés et les équidés. Elle est provoquée par des protozoaires flagellés du genre Trypanosoma (T). Les espèces sont dans l’ordre d’importance T. congolense suivi de T. vivax et de façon moindre, T. brucei brucei. En effet, la maladie est essentiellement transmise par un insecte hématophage du genre Glossina ou glossine, communément appelé la mouche tsé-tsé (Tazé et Gruvel, 1978). Elle peut également être transmise mécaniquement par des insectes piqueurs tels que les tabanidés et les stomoxes (Duvallet et al., 1987). Par ailleurs, d’autres trypanosomes tels que Trypanosoma brucei gambiense (T. b. gambiense) et T. b. rhodesiense sont transmis à l’Homme par les mouches tsé-tsé et sont responsables d’une pathologie appelée la maladie du sommeil. La TAA sévit dans près de 37 pays d’Afrique subsaharienne, soit un tiers du continent africain. Elle se manifeste par des fièvres intermittentes, des œdèmes, des avortements, une baisse de la fertilité et l’amaigrissement. L’anémie est observée habituellement chez l’animal parasité suivie d’une dégradation de son état général (Diaite, 1991). L’animal devient sans valeur économique, peu apte aux travaux agricoles et sans aucune valeur monétaire à la réforme. Ainsi, elle rend vulnérable à la pauvreté les populations rurales qui dépendent de l’agriculture et de l’élevage. Pour vaincre ce fléau, plusieurs stratégies de contrôle à savoir, la lutte contre le vecteur, l’élevage de bovins trypanotolérants et les traitements trypanocides sont utilisées. Parmi ces stratégies de luttes, les traitements trypanocides constituent la principale. Cependant, plusieurs travaux montrent l’apparition de souches de trypanosomes résistantes à ces médicaments (Fotso, 1978 ; Delespaux et Koning, 2007 ; Munday et al., 2015). De plus, certaines techniques de diagnostic rapide utilisées sur le terrain sont peu sensibles (Kageruka, 1989), ce qui rend difficile la maîtrise de cette maladie. Pour pallier à cette situation, le CIRDES a mis en route un vaste projet de génotypage des souches de trypanosomes animaux (T. congolense, T. vivax et T. brucei brucei), dans le but de comprendre les liens entre les variantes génétiques et la pathologie afin de développer de nouvelles techniques de lutte plus adaptées. 1 Pour une bonne conduite de ces mesures, trois étapes s’est avérés nécessaire. La première a été de recenser toutes les souches disponibles au CIRDES. L’étape suivante est l’amplification des souches et enfin le génotypage. C’est dans ce contexte que s’inscrit notre étude qui a pour objectif global d’obtenir une suspension suffisante de trypanosomes de chaque souche pour le génotypage et de caractériser les souches en fonction de leurs virulences. En terme d’objectifs spécifiques, il s’agit de : cultiver six souches de T.congolense sur des souris NMRI et de faire des stabilats ; d’évaluer l’effet des souches de trypanosomes sur l’évolution du poids, du taux d’hématocrite et de la parasitémie des souris infectées. Le travail que nous rapportons ici s’organise en deux grandes parties : une revue bibliographique sur la Trypanosomose Animale Africaine ; une partie expérimentale dans laquelle nous présentons le matériel et les méthodes utilisés, les résultats et leur discussion, la conclusion et la bibliographie. 2 PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Chapitre I : La Trypanosomose Animale Africaine I-1- Définition et répartition géographique I-1-1- Définition La TAA est une parasitose à transmission vectorielle. En effet, elle est due à la présence et à la multiplication d’un protozoaire appartenant au genre Trypanosoma dans le plasma sanguin et/ou dans divers tissus ou liquides des animaux. Les principaux agents responsables sont les suivants : T. congolense, T. vivax et dans une moindre mesure T. brucei brucei (Diaite, 1991). Tout comme pour la maladie du sommeil chez l’Homme, le parasite est transmis de manière cyclique après piqûre de l’hôte animal par l’insecte vecteur, glossine ou mouche tsé-tsé du genre Glossina. Les animaux domestiques ou sauvages porteurs de parasites pathogènes constituent les principaux réservoirs des trypanosomes. Cependant deux autres espèces à savoir T. evansi et T. equiperdum sont transmises de façon mécanique par des insectes piqueurs (tabanidés et stomoxes), causant respectivement le surra et la dourine. De plus, la TAA est une maladie qui évolue d’une forme aiguë à une forme chronique en fonction du parasite, provoquant des accès de fièvre. Cette fièvre est accompagnée de symptomatologie avec une durée variable en fonction de l’espèce animale infectée et de l’espèce parasitaire incriminée dans l’infection. I-1-2- Répartition géographique La TAA est exclusivement transmise par les glossines et sévit dans près de 37 pays d’Afrique dans les régions tropicales et intertropicales. Elle occupe une superficie d’environ 10 millions de Km2 soit un tiers du continent africain. La TAA s’étend entre 15° de latitude Nord et 20° de latitude Sud, de part et d’autre de l’équateur. La maladie est répartie de façon hétérogène dans sa surface de présence en fonction du climat, de l’écologie et de l’intensité de la lutte (Courtin et al., 2009). Quant à la distribution du vecteur (figure 1), elle revêt une importance primordiale dans l’épidémiologie de la maladie. 3 Figure 1 : Aire de répartition des glossines en Afrique (DFID/AHP, 2005) I-2- Importance socio-économique La Trypanosomose Animale Africaine sévit principalement en Afrique au Sud du Sahara, dans les zones à fort potentiel de production agricole. Par conséquent, elle est une contrainte majeure au développement socio-économique des populations occupant ces régions. En principe, les conséquences engendrées par la TAA sont d’ordre direct et indirect. Tout d’abord, les effets directs se font sentir dans les taux de natalité des animaux infectés (Boly et al., 1993; Sangare et al., 2010), la baisse de la production animale (viande, lait) et la mortalité des animaux (Bontoulougou et al., 2000). Une étude menée en Gambie en 1998 par des experts de la FAO montre que malgré l’introduction des animaux trypanotolérants, la TAA cause la mort de 20% des veaux qui sont nés, réduit la production laitière de 26% et les naissances d’agneaux et de chevaux de 37%. 4 Ensuite, les pertes indirectes de la TAA sont liées à l’établissement humain, à l’utilisation des terres et des cultures (Courtin et al., 2009). En effet, la TAA couvre les zones subhumides et les parties les plus humides de la zone aride, qui sont les régions détentrices du plus grand potentiel d’expansion agricole et fourragère du continent (Gruvel, 1984). La population est contrainte d’abandonner ces zones de culture et de pâturage qui sont les surfaces de présence de la maladie pour se concentrer dans les zones semi-arides aux ressources limitées ou la maladie est absente. Il en découle la dégradation progressive des terres et par conséquent la baisse de la production animale et agricole. Le fait que les éleveurs et les agriculteurs fuient les zones infestées pour se concentrer dans les zones semi-arides est également source de conflit entre eux car il n’y a pas suffisamment de terre pour la l’agriculture et pour l’élevage. De plus, la TAA réduit la disponibilité et l’efficacité des animaux de traits utilisés pour préparer les sols aux cultures (Vall et al., 2003). Enfin, les coûts élevés de l’importation de la viande, des produits laitiers et les coûts des mesures de lutte contre la TAA contribuent à la pauvreté de la population vivant dans la surface de présence de la maladie. 5 Chapitre II: Les agents pathogènes II-1- Définition et taxonomie II-1-1- Définition Les trypanosomes sont des protozoaires flagellés, sanguicoles et exoérythrocytaires. Leur déplacement est assuré par un flagelle de forme allongée dirigé vers l’avant, près de la base duquel se trouve une structure particulière, le kinétoplaste. Les espèces d’intérêt médical sont généralement dixène c’est-à-dire qu’elles ont un cycle évolutif passant par deux hôtes (Jacquiet et al., 1993). Un hôte invertébré, généralement un insecte piqueur hématophage où elles évoluent dans le tractus digestif et un hôte vertébré chez lequel elles se multiplient dans les liquides physiologiques, en particulier le sang. II-1-2- Taxonomie Les trypanosomes africains sont de l’embranchement des Sarcomastigophora, de la classe des Zoomastigophora et de l’ordre des Trypanosomatidae. Ils se rangent dans la section Salivaria du genre Trypanosoma (figure 2). Ils se distinguent des membres de la section Stercoraria à laquelle appartient les trypanosomes americains qui sont transmis par les matières fécales de leurs vecteurs (OMS, 1986). 6 Figure 2 : Diagramme de Classification de quelques trypanosomes importants de mammifères (Farougou et al., 2007) II-2- Morphologie et Cycle de développement II-2-1- Morphologie et structure II-2-1-1- Morphologie Les trypanosomes africains sont des parasites unicellulaires, extracellulaires qui vivent librement dans le sang ou dans d’autres liquides de l’organisme, notamment la lymphe et le liquide céphalo-rachidien (LCR). Ils se présentent sous la forme d’une cellule plate élancée (figure 3) et fusiforme avec une membrane ondulante enroulée autour du corps d’où le nom de Trypanosoma qui signifie corps en « vrille ». Les 7 trypanosomes sont munis d’un noyau médian et un point à l’une de ces extrémités, le kinétoplaste d’où part un flagelle. Cette forme varie selon l’espèce et le stade de développement dans le vecteur ou l’hôte vertébré (Hoof, N.D., et al., 1944). Trypanosomes Figure 3 : Morphologie des trypanosomes (Walker, 1994) II-2-1-2- Structure Les trypanosomes sont des êtres vivants unicellulaires autonomes. Leur corps est constitué principalement de cytoplasme entouré par une paroi cellulaire, dans lequel baignent des organites et des inclusions diverses. Le noyau qui contient le nucléole est entouré par une double membrane perforée (figure 4). En plus des structures classiques telles que le réticulum endoplasmique, l’appareil de golgi, les lysosomes, s’ajoutent des structures particulières telles que : la membrane ou périplasme ; le kinétoplaste, constitué du génome mitochondriale est la base du flagelle ; le flagelle, servant de moyen de locomotion. 8 Figure 4 : Représentation schématique d'un trypanosome montrant les différentes parties du micro-organisme (Lamine et Desquesnes, 2003). II-2-2- Cycle de développement II-2-2-1- Chez la glossine Les trypanosomes responsables de la TAA sont transmis par un insecte hématophage, la glossine ou mouche tsé-tsé. La glossine s’injecte les formes trypomastigotes (courtes) du parasite lors d’un repas sanguin sur un animal infecté (figure 5). Une adaptation morphologique et métabolique permanente est nécessaire au parasite pour subsister dans l’organisme de la glossine. Ces formes trypomastigotes courtes, infectantes une fois dans l’intestin moyen de la glossine, vont se différencier alors en trypomastigotes procycliques allongés (Reifenberg et al., 1996). Puis, Ils migrent vers les glandes salivaires où ils se différencient en formes trypomastigotes métacycliques avec l’apparition d’un manteau antigénique qui les permettent de survivre après transmission à son hôte mammifère. Les formes infectantes matures se détachent des cellules épithéliales salivaires et restent dans la salive. La durée du cycle varie de 12 à 14 jours pour T. congolense, 5 à 23 jours pour T. vivax et 20 à 30 jours pour T. brucei brucei. 9 Figure 5 : Cycle de développement des trypanosomes (Descamps, 2002) II-2-2-2- Chez l’hôte mammifère Les glossines injectent les formes métacycliques à l’hôte mammifère lors d’un second repas sanguin. Ces formes se multiplient et se différencient en formes sanguicoles longues et grêles provoquant une réaction immunitaire au site de la piqûre appelée chancre d’inoculation. Les trypanosomes migrent ensuite vers le sang et les voies lymphatiques, puis gagnent le système nerveux central. Après un certain temps d’évolution, apparaissent les formes trapus trypomastigotes infectantes pour le vecteur (glossine) (Reifenberg et al., 1997). 10 II-3- Virulence et symptômes II-3-1- Virulence La virulence est la capacité de multiplication du parasite chez son hôte animal (Holzmuller et al., 2008). L’étude de la virulence des trypanosomes est utilisée pour mettre en évidence la diversité clinique des infections dues aux trypanosomes et elle se rapporte aux différents phénotypes induits par le trypanosome suite à l’infection (Huse et al., 2010). La virulence d’une souche de trypanosome se décrite par : le niveau de parasitémie ; la période prépatente (période qui s’écoule entre l’infection et la première apparition des trypanosomes dans le sang) et l’efficacité de la transmission du trypanosome par le vecteur. II-3-2- Symptômes La trypanosomose est une maladie à évolution le plus souvent aigue mais chronique dans certains cas (Mawuena, 1986). Elle est caractérisée par une période d’incubation variable d’une à quelques semaines. Les symptômes sont progressifs et débutent par une fièvre. Par ailleurs la fièvre cause des altérations sanguines qui ont pour conséquences des œdèmes, des larmoiements, une hypertrophie des nœuds lymphatiques, l’avortement, une diminution de la fertilité, un amaigrissement suivi de la détérioration de l’état général de l’animal. La mort s’ensuit en l’absence de traitement (figure 6). Fièvre La fièvre est intermittente et corrélée avec l’évolution de la parasitémie. La présence d’un nombre élevé de parasite dans le sang détermine une forte élévation de la température, le plus souvent supérieure ou égale à 40°C. Selon des études menées par Murray en 1989, T. vivax est responsable d’une parasitémie plus élevée (107 trypanosomes par millilitres (mL) de sang) suivi de T. congolense (106 trypanosomes par mL de sang), T. b. brucei est d’une poussée modérée (105 trypanosomes par mL de sang). 11 Anémie L’anémie est le principal signe de la Trypanosomose Animale Africaine. Elle intervient deux à trois semaines après la piqûre infectante d’une glossine et est due à la chute du nombre des hématies. L’anémie se répartie entre trois phases. D’abord, une phase hémolytique synchronisée avec la poussée parasitaire. Ensuite, une phase anémique chronique débutée entre la sixième semaine et la septième semaine après l'infection. Enfin, une troisième phase pendant laquelle les taux d’hématies restent constants et inférieurs à la normale, pouvant aller jusqu’à 20%. Œdèmes Les œdèmes débutent le plus souvent sous forme de bourrelets œdémateux situés à la partie médiane de la cage thoraxo-abdominale, puis envahissent les membres. Ils sont rares chez les bovins et chez les petits ruminants par rapport au cheval et au chien. Atteinte nerveuse et oculaire La TAA provoque des troubles neurologiques qui se traduisent par l’affaiblissement du train postérieur et parfois la parésie qui précède la mort du sujet infecté. Il peut y avoir des sécrétions oculaires, allant du larmoiement avec photophobie à l’apparition de croûte au bord interne des paupières (Pollock, 1992). Amaigrissement L’amaigrissement survient lorsque la maladie est avancée et plus la maladie dure, plus l’animal maigrit. Il est souvent accru par une diarrhée qui vide l’animal de son poids corporel. La mort survient d’habitude entre le deuxième et le troisième mois, sauf si l’animal est traité. En plus de ces symptômes, il est fréquent d’observer un gonflement des ganglions lymphatiques superficiels, des avortements, une baisse de la fertilité (Desquesnes, 2001) et de la production laitière. Lésions La TAA est responsable de lésions non spécifiques (Itard et Frézil, 2003). Généralement, il se forme un chancre d’inoculation au point de piqûre. Dans la phase initiale, l’hypertrophie ganglionnaire, la splénomégalie et l’hépatomégalie sont de règle. 12 Par ailleurs, les bovins porteurs d’une infection chronique présentent une hypoplasie des organes lymphoïdes. L’atteinte cardiaque, le plus souvent sous forme de myocardite dégénérative, est la cause immédiate de la mort dans de nombreux cas d’infection chronique. Figure 6: Animal trypanosomé en état de prostration (Lamine et Desquesnes, 2003) II-4- Épidémiologie de la TAA La TAA touche les animaux domestiques de même que les animaux sauvages qui représentent un réservoir immense de trypanosomes. Certains animaux porteurs sains ou porteurs latents qui sont généralement les antilopes (guibs, kobs, élands), les phacochères et les buffles, participent énormément à la pérennisation de la maladie. La principale voie d’infection est la voie cutanée. L’infection de T. congolense et de T. brucei brucei est essentiellement assurée par la glossine ou mouche tsé-tsé qui est le vecteur biologique. T. vivax est également transmis par des mouches tsé-tsé, mais dans une certaine mesure peut être transmis par des vecteurs mécaniques (tabanidé, stomoxes). La transmission par la voie placentaire est également possible lors d’une infection aiguë chez la femelle 13 gestante. La transmission est beaucoup plus élevée en saison humide, et perdure tout au long de l’année (De La Rocque, 2003). Elle est influencée par le taux de glossines infectées et des interactions hôte-vecteur. II-5- Diagnostic Le diagnostic de la TAA se résume en un diagnostic clinique et un diagnostic de laboratoire. II-5-1- Diagnostic clinique Le diagnostic clinique de la TAA est difficile à cause de la non-spécificité de ses symptômes. Il est fondé sur une symptomatologie peu caractéristique (fièvre, anémie, larmoiement, œdème et parésie du train postérieur inconstants). De nombreuses hématoparasitoses (babésioses, anaplasmoses, microfilarioses) voire d’autres maladies du bétail (helminthoses, charbon bactéridien) peuvent causer les mêmes symptômes que la TAA (Desquesnes et al., 1999). Vue la non-spécificité des symptômes de la TAA, un diagnostic par des méthodes au de laboratoire doit toujours confirmer ou infirmer le diagnostic clinique. II-5-2- Diagnostic par des méthodes au laboratoire Le diagnostic par des méthodes au laboratoire dispose de deux méthodes à savoir la méthode directe et la méthode indirecte. II-5-2-1 Méthodes directes Frottis sanguin C’est une technique qui peut être utilisée lorsqu’on possède un microscope. Elle présente un double intérêt car non seulement elle permet la détection des trypanosomes mais aussi l’identification de l’espèce incriminée dans l’infection. Le prélèvement est soit du sang soit du liquide de ponction ganglionnaire. Le liquide prélevé est étalé sur une lame et coloré par la technique de May-Grünwald-Giemsa. Après la coloration, le cytoplasme du parasite est coloré en bleu, le noyau et le kinétoplaste en rouge. Quant à la 14 membrane ondulante, elle reste incolore mais visible par sa bordure externe. Le frottis sanguin est moins sensible car les trypanosomes sont rares dans le sang périphérique lors d’une faible infection (Hope-Rapp et al., 2009). Goutte épaisse C’est une variante de frottis sanguin et elle consiste à étaler partiellement une goutte de sang sur une lame à l’aide du coin d’une autre lame, en réalisant des mouvements circulaires. Elle est colorée au Giemsa dilué au un dixième. Le taux d’’hématocrite et la méthode de Murray Cet examen est réalisé à partir du sang de l’animal contenu dans un tube capillaire à microhématocrite, prélevé à son oreille par piqûre d'une veine superficielle. Les tubes capillaires à microhématocrite, sont des tubes héparinés, de 75 millimètres (mm) de longueur et 0,5 mm de diamètre intérieur. Ces tubes présentent le double avantage d'être solides (grâce à l'épaisseur de leur paroi) et d'avoir un cercle noir dessiné à 15 mm d'une extrémité, ce qui permet d'obtenir un volume de sang constant. Le remplissage se fait en mettant en contact avec le sang, l’une des extrémités et l’autre extrémité abaissée, tout en évitant les bulles d’air. Après le remplissage, les tubes sont bouchés avec la plasticine. Une fois le prélèvement terminé, les tubes sont mis dans une boite coiffée de son couvercle, puis placé dans un portoir contenant de la glace et acheminé rapidement vers le lieu de l’examen car l’examen des échantillons doit se faire impérativement dans un délai maximum de cinq heures après le prélèvement. Les tubes sont ensuite placés sur la couronne d’une centrifugeuse à tube microcapillaire, pour être centrifugés pendant trois minutes à trois mille tours par minutes. A la fin de la centrifugation, Ils se présentent alors trois couches : les globules rouges près de la plasticine, une mince couche de globules blancs et une couche claire de sérum. L'hématocrite est le rapport exprimé en pourcentage, du volume des globules rouges par rapport au volume total du sang. Il donne une indication sur l'état général de l'animal. Sa valeur normale chez les bovins d’Afrique est comprise entre 30 à 40%. Tout animal présentant une valeur de l’hématocrite inférieure ou égale à 27% est considéré comme animal anémié. 15 La mesure du taux l'hématocrite s'effectue avec le lecteur d'hématocrite, en faisant correspondre le 0 au bas des globules rouges et le 100 au haut du sérum (extrémité libre du tube s'il est complètement rempli) ; la réglette orientable doit passer par le haut des globules rouges et son extrémité donne la valeur de l'hématocrite. L’hématocrite permet d’orienter le diagnostic, mais un étalement d’une partie du contenue du tube est nécessaire pour confirmer ou infirmer le diagnostic (Dia et Desquesnes, 2007). Avec un stylo diamant, on sectionne la partie comprise entre un mm de globule rouge et trente mm de sérum de part et d’autre des globules blancs, puis on recueille sur une lame. L’étalement est observé sous un microscope à fond noir à l’objectif 40, après avoir été recouvert d’une lamelle. Les trypanosomes sont détectés lorsque leur concentration atteint 102 à 103 parasites par mL de sang. II-5-2-2- Méthodes indirectes. Le diagnostic indirect se base sur la mise en évidence des traces de la présence ou des traces du passage des trypanosomes dans les liquides biologiques des animaux. ELISA Le test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) indirect est une technique de diagnostic utilisée pour la détection des anticorps. Son principe repose sur la sensibilisation de microplaques ELISA par des antigènes solubles extraits du parasite, grâce à une sonication et une ultracentrifugation. Toutefois que les échantillons à analyser contiennent des anticorps spécifiques aux antigènes, il se forme des complexes anticorps-antigènes. Les complexes anticorps-antigènes sont ensuite révélés par des antiglobulines d’espèce, et un complexe substrat/révélateur. Un lavage exporte le conjugué et les puits restent incolores pour les échantillons négatifs. La lecture des plaques est ensuite faite à l’œil nu, ou au spectrophotomètre à une longueur d’onde adaptée au chromogène (Desquesnes et al., 1999). Cette technique présente une très bonne reproductibilité et un faible coût, ce qui en fait un très bon outil pour les enquêtes épidémiologiques. Son seul inconvénient réside dans le fait que ce test ne permet pas de distinguer les infections actives, des infections passées. De ce fait, d’autres méthodes plus 16 précises, comme le diagnostic visant la détection du matériel génétique du parasite sont de plus en plus utilisées. Méthodes moléculaires La méthode moléculaire utilisée est la PCR (Polymerase Chain Reaction) ou réaction par polymérisation en chaine. Son principe consiste à amplifier sélectivement une séquence d’ADN donnée, spécifique à une espèce ou à un genre de trypanosome. Cette amplification est possible grâce à l’action d’une enzyme thermostable extraite de Thermophilus aquaticus, qui assure la polymérisation des acides nucléiques et des amorces spécifiques. Le volume réactionnel est constitué de 25 microlitres (µl) contenant de l’ADN extrait à partir des échantillons suspects, de taq polymérase, d’acides désoxyribonucléiques phosphates, de tampon adéquat et d’une amorce (couple d’oligonucléotides spécifiques qui cernent une portion spécifique d’ADN). Ce mélange est ensuite soumis à une trentaine de cycles thermiques à l’aide d’un thermocycler. Chaque cycle est constitué de trois étapes à savoir : l’étape de dénaturation à 94°C environ qui provoque la séparation des doubles brins d’ADN ; l’étape d’hybridation des oligonucléotides à 55°C environ ; l’étape d’élongation des acides nucléiques à 72°C environ. Au bout de 2 à 3 heures plus tard, on obtient un produit composé de plusieurs portions d’ADN identique. Un volume de 10 μl de chaque échantillon est ensuite révélé par électrophorèse dans un gel à 2% d’agarose teinté au Gel Red (agent intercalant de l’ADN), et observé sous lumière Ultra-Violet. La fiabilité de chaque réaction d’amplification est contrôlée par un témoin positif (adjonction au volume réactionnel d’ADN purifié d’une souche de référence) et un témoin négatif (tampon réactionnel contenant tous les constituants nécessaires à l’amplification, mais sans ADN cible). La PCR permet le diagnostic d’une infection active car la persistance d’ADN libre dans la circulation de l’hôte après la mort du parasite est assez brève, de l’ordre de 24 à 48 heures (Desquesnes, 1997). 17 II-6- Traitement Le traitement de la TAA repose essentiellement sur une chimiothérapie et une chimioprophylaxie appropriée. Les trypanocides sont généralement des composés arsenicaux, des diamidines ou des dérivés de l'urée. Ce sont souvent des composés assez toxiques ou mal tolérés par les animaux ; en outre certaines souches de trypanosome ont développé une résistance face à ces médicaments. Les molécules utilisées de nos jours sont principalement : l’acéturate de diminazène (Bérénil), utilisé à titre curatif chez les ruminants, à la posologie de 3,5 mg/kg ou de 7 mg/kg en une seule injection par voie intramusculaire (IM) et s’avère efficace vis-à-vis des trypanosomoses africaines à T. evansi et T. bruce brucei ; le chlorure d’isométamidium (trypamidium ou samorin) utilisé à titre préventif (0,5 mg/kg, 2 à 5 fois par an) et à titre curatif (0,25 mg/kg à 0,5 mg/kg) en injection IM ou intraveineuse (IV). Toutefois, il est nécessaire après le traitement trypanocides, d’améliorer l’état des animaux par un traitement symptomatique pour accélérer leur guérison. Dans ce cadre, une attention particulière doit être accordée au régime alimentaire des animaux (Balis et Richard, 1977). Quant à la prophylaxie, elle est basée sur la lutte contre les glossines. 18 DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE Chapitre I : Matériel et méthodes I-1- Matériel Six souches de T. congolense ont été amplifiées puis soumises à l’étude de leurs virulences. Pour atteindre notre but, du matériel de laboratoire, biologique et des réactifs ont été utilisés. I-1-1- Matériel de laboratoire Avant toute activité au laboratoire, nous nous sommes assurés du respect des bonnes pratiques au laboratoire : le port d’une blouse, d’une chaussure fermée et des gants. L’hypochlorite de sodium (eau de javel) était également utilisé pour la désinfection des différents matériels avant et après leurs utilisations. Nous avons par la suite utilisé : une balance électronique (Startorius) de portée 320 g, de précision 0,001 g et un portoir en verre pour le suivi quotidien du poids des différentes souris ; un microscope optique, une paire de ciseaux, des lames portes objets et des lamelles pour le suivi de la parasitémie ; des tubes capillaires à microhématocrite, des portoirs de tubes contenant de la plasticine, une microcentrifugeuse pour la centrifugation et la lecture de l’hématocrite ; des cryotubes de 1,5 mL et de 3,6 mL, de l'héparine (500 UI), de la kétamine (50 mg/mL), du glycérol, des pipettes, des embouts, des seringues, un agitateur pour recueillir du sang et pour la préparation des stabilats ; un congélateur (-80°C) et de l'azote liquide (-196°C) ont servi à la conservation des stabilats. 19 I-1-2- Matériels biologiques I-1-2-1- Les souches de T. Congolense Les trypanosomes utilisés pour l’expérimentation sont tous du genre Trypanosoma, de l’espèce T. congolense provenant de la cryobanque du CIRDES. Ils étaient tous du type savane, récoltés dans divers pays (tableau I). Les trypanosomes ont été isolés pour la première fois à partir de sang d’animaux infectés. Le sang infecté était mélangé à du glycérol (0,111mL/mL de sang) et conservé dans de l’azote liquide à -196° C au CIRDES. Tableau I : Description des souches de trypanosomes utilisées pour l’étude expérimentale. Code Types génétique Pays d’origine Date d’isolement D27 savane Burkina Faso 2011 IL1180 savane Tanzanie 1970 Kot256 savane Burkina Faso 2011 Sark103 savane Burkina Faso 2011 Ser71/SMB/212 savane Tanzanie 1981 TG4/09 savane Mali 2009 I-1-2-2- Les souris NMRI Les souris NMRI (figure 7) sont des souris au pelage blanc et aux yeux rouges, se reproduisant facilement. Importées de France (Charles River) depuis 2015, elles sont élevées uniquement pour les travaux de recherche et d'enseignement. Les souris utilisées dans cette étude, sont du sexe mâle et femelle, âgés de huit à dix semaines et ayant un poids corporel compris entre 20 à 30 g. 20 Figure 7 : Souris NMRI utilisées pour l’amplification des souches de T. congolense (Kombassere, 2017) I-2- Méthodologie I-2-1- Amplification des souches L’amplification des souches est une technique qui permet d’obtenir un grand nombre de trypanosome. Ainsi, à partir de la banque de données, les souches faisant l’objet d’étude étaient retirées de l’azote liquide et décongelées à la température ambiante. La viabilité était ensuite vérifiée par observation microscopique au grossissement 400 d’une goutte du stabilat étalée entre lame et lamelle. Le mouvement des trypanosomes était le signe de leur viabilité. Pour chaque souche de trypanosome, deux souris dont le poids a été déterminé et le sang prélevé dans de tube capillaire hépariné pour la détermination de l’hématocrite étaient traitées au cyclophosphamide (endoxan®). Le cyclophosphamide immunodéprimait ces souris pour les rendre plus sensibles à l’infection. A l’aide d’une seringue stérile à usage unique, le stabilat était recueilli et injecté aux souris par voie intrapéritonéale. Après l’infection, le poids et la 21 parasitémie étaient suivis quotidiennement. Lorsque la parasitémie atteignait 64.106 trypanosomes/mL ou 125.106 trypanosomes/mL de sang, le sang était à nouveau prélevé au niveau de la queue dans des tubes capillaires pour la mesure du taux d’hématocrite avant le saignement. Les souris étaient ensuite anesthésiées par injection de 0,3 mL de kétamine. Après l’ouverture du thorax, le sang cardiaque était mélangé avec 0,1 mL d’héparine et prélevé par ponction cardiaque. Ce sang était utilisé pour réinfecter de nouvelles souris afin de pouvoir caractériser la virulence des trypanosomes. Des stabilats ont été préparés avec le reste du sang et conservés à -80° C dans une boite à polystyrène puis à -196° C dans de l’azote liquide. I-2-2- Préparation de l’inoculum L’inoculum était constitué de sang fraichement prélevé à partir de souris dont la parasitémie était 125.106 trypanosomes/mL. L’infection des souris avec la même quantité de trypanosomes permettait d’éviter l’influence de la variation des différents paramètres (poids, parasitémie, hématocrite, mortalité) due à la quantité de trypanosomes. De ce fait, 0,3 mL de sang à 125.106 trypanosomes/mL était utilisé pour l’inoculation des nouvelles souris. I-2-3- infection expérimentale L’expérimentation a été réalisée sur six lots de trois souris, à raison de trois souris par souche de trypanosome. Les trois souris de chaque lot étaient numérotées d’un à trois à la queue à l’aide d’un marqueur et entretenu dans une cage étiquetée (code de la souche, nombre de passage et la date d’infection). Les souris disposaient d’eau, de granule et l’air de la salle d’expérimentation était conditionné à 24° C. Avant l’infection, les souris étaient pesées. Un prélèvement de sang était effectué pour la détermination du taux d’hématocrite. Après ces opérations, les souris étaient immunodéprimées par injection sous-cutané de 0,2 mL de cyclophosphamide (endoxan®). Les souris étaient maintenant prêtes pour être infectées. A cet effet, l’inoculum d’un volume de 0,3 mL à 125.106 trypanosomes/mL était injecté aux souris par voie intrapéritonéale. Tout au long de l’expérimentation, les paramètres suivants ont été suivis : 22 Le suivi quotidien de l’évolution du poids Avant l’infection et par suite, le poids quotidien de chaque souris était déterminé à l’aide d’une balance électrique (figure 8). Pour effectuer l’opération, la balance est mise sous tension et après avoir calibrer, nous déposons le bocal, puis on tare pour annuler le poids du bocal. La souris vivante est ensuite déposée dans le bocal en verre et sur l’écran s’affiche le poids de la souris. Figure 8 : Pesée des souris avec la balance électronique (Kombassere, 2017) Le suivi de la parasitémie. L’évolution de la parasitémie des souris était quotidiennement suivie par examen microscopique. A l’aide d’une paire de ciseaux, le bout de la queue de la souris était coupé et la goutte de sang obtenue était étalée entre lame et lamelle. Ensuite, cette préparation est observée au microscope optique au grossissement 400 (figure 9). La parasitémie observée était comparée au dessin du tableau d’estimation rapide de la parasitémie d’Herbert et de Lumsden (1976) (voir annexe 1) pour déterminer la valeur de la parasitémie. Lorsque la parasitémie atteignait 7,8 ou 8,1 soit 64.106 trypanosomes/mL ou 125.106 trypanosomes/mL, en fonction de l’état général des souris, elles sont anesthésiées, disséquées, et un prélèvement de sang par ponction cardiaque est effectué pour les besoins de stabilats. 23 Figure 9 : Lecture de la parasitémie avec le microscope optique sous l’objectif 40 (Kombassere, 2017) La mesure du taux d’hématocrite Le taux d’hématocrite est la proportion en pourcentage des globules rouges contenue dans le sang par rapport au volume total de sang. Elle permet d’apprécier l’anémie. Avant l’infection et avant de saigner la souris, l’hématocrite devait être mesuré. A cet égard, le bout de la queue de la souris était coupé à l’aide d’une paire de ciseaux et des tubes capillaires héparinés étaient remplis de sang. Ces tubes étaient ensuite soumis à une centrifugation à 12 500 tours/minute pendant 5 minutes. Après la centrifugation, le sang contenu dans les tubes se sépare en trois couches : les globules rouges près de la plasticine, une mince couche de globules blancs et une couche claire de sérum. La mesure de l'hématocrite s'effectue avec le lecteur d'hématocrite en faisant correspondre le 0 au bas des globules rouges et le 100 au haut du sérum (extrémité libre du tube s'il est 24 complètement rempli) (figure 10) ; la réglette orientable doit passer par le haut des globules rouges et son extrémité donne la valeur de l'hématocrite. Figure 10 : Centrifugation des tubes capillaires et lecture du taux d’hématocrite (Kombassere, 2017) La préparation et la conservation des stabilats Un stabilat est une suspension d’un grand nombre de trypanosomes préparée à partir de sang infecté de souris et de glycérol. Pour sa réalisation, le sang cardiaque des souris additionné de 0,1 mL d’héparine à 500 UI était prélevé avec une seringue stérile et mis dans des cryotubes. Les tubes contenant le sang étaient ensuite placés dans des portoirs contenant de la glace pour être transporté au laboratoire de sérologie. Le sang était ensuite mélangé avec un cryoconservateur (le glycérol) à une proportion de 111µl de glycérol pour 1000 µl soit un 1 mL de sang. Le mélange ainsi constitué (stabilat) était reparti dans des tubes (à raison de 0,5 mL/tube), puis disposés dans des boîtes en polystyrène contenant de l'isopropanol et gardées dans le congélateur à -80°C pendant 24 à 48h. L'isopropanol assure une 25 congélation progressive des stabilats. Les stabilats étaient enfin récupérés et stockés dans de l'azote liquide à -196°C pour une conservation de longue durée. I-3- Analyse des données Les résultats obtenus ont été saisis dans des feuilles de calcul du logiciel Microsoft Office Excel 2010. Le calcul de la moyenne journalière de la parasitémie et du poids corporel, la moyenne du taux d’hématocrite avant et après infection puis la réalisation des graphiques ont été également effectués par ce même logiciel. L’analyse statistique du taux d’hématocrite a été effectuée à l’aide du logiciel R version 3.4.2. Le seuil de signification de 5% a été retenu pour les comparaisons des résultats. Cependant, lorsque la P-value serait inférieure au seuil, nous concluons que les données ne suivent pas une loi normale ; par conséquent, les analyses ne peuvent être effectuées qu'avec des tests non paramétriques. Le test de Kruskal Wallis a alors été utilisé pour vérifier s'il existait une différence significative entre les lots de données indépendants. 26 Chapitre II : Résultats et discussion II-1- Résultats II-1-1- La parasitémie Après une durée d’inoculation de 24 heures, la parasitémie des souris commence à apparaitre au microscope et évolue de façon variable en fonction des souches de trypanosomes. Ainsi, en premier lieu, nous avons remarqué pendant le suivi quotidien de la parasitémie que la période prépatente du lot de souris infectées par la souche Ser71/SMB/212, IL1180, Sark103, Kot256 et TG4/09 est d’un jour. Quant à la période prépatente du lot de souris infectées par la souche D27, elle est de trois jours. La figure 11 illustre l’évolution de la parasitémie des souris infectées par les différentes souches de Trypanosoma congolense. Nous constatons que cette évolution varie d’une souche à une autre. Cependant, le lot de souris infectées par les souches Ser71/SMB/212 et IL1180 ont atteint le maximum de parasitémie souhaité soit 125.106 trypanosomes/mL de Sang en trois jours après l’infection. Les souris infectées par les souches Sark103, Kot256 et D27 ont atteint le maximum de parasitémie respectivement au quatrième, cinquième et huitième jour après l’infection. La parasitémie des souris infectées par la souche TG4/09 a été celle qui a évoluée plus lentement par rapport aux autres. Elle atteint le maximum de parasitémie en 11 jours après l’infection. Cette figure montre donc une différence importante entre les moyennes journalières de la parasitémie des souris infectées par les différentes souches de T. congolense. 27 30000 25000 Ser71/SMB/2 12 IL1180 20000 sark103 15000 Kot256 TG4/09 10000 5000 0 J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 Jours Figure 11 : Évolution journalière de la parasitémie des lots de souris infectées par les six souches de T. congolense. II-1-2-Le poids Le poids moyen des lots de souris utilisées pour l’expérimentation est compris entre 19,4 et 32,17 g. Le suivi quotidien du poids moyen des lots de souris infectées par les différentes souches de trypanosomes montre une évolution en deux phases (figure 12). D’abord, une première phase caractérisée par une légère baisse du poids du lot de souris infectées par les souches : Ser71/SMB/212, IL1180, Kot256 et D27 au jour un (J1) postinfection ; Sark103 au jour deux (J2) et TG4/09 au jour neuf (J9). Une deuxième phase caractérisée par une évolution en dents de scie du poids de tous les lots de souris infectées par les différentes souches de trypanosomes, en réalisant une légère augmentation enfin de l’expérience. Ainsi dans l’ordre d’importance de gain de poids, le lot de souris infectées par la souche : TG4/09 augmente de 5,65 g ; Kot256 augmente de 2,56 g ; Sark103 augmente de 1,7 g ; D27 augmente de 1,4 g ; Ser71/SMB/212 augmente de 1,27 g et enfin IL1180 augmente de 0,85 g. 28 35 30 Poids en g 25 Ser71/SMB/212 IL1180 20 Sark103 15 Kot256 TG4/09 10 D27 5 0 J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 Jours Figure 12 : Évolution journalière du poids des lots de souris infectées par les six souches de T. congolense II-1-3- Le Taux d’hématocrite Le taux d’hématocrite moyen des souris avant l’infection par les souches Ser71/SMB/212, IL1180, Sark103, Kot256, TG4/09, D27 est respectivement de 55%, 54,5%, 55%, 54,33%, 51%, 52,67%. Ce taux a considérablement baissé de façon variable en fonction des souches de T. congolense. La figure 13 compare le taux d’hématocrite des différents lots de souris avant l’infection et après l’infection par les trypanosomes. Le lot de souris infectées par la souche Ser71/SMB/212 est le lot qui a connu une diminution considérable du taux d’hématocrite par rapport aux autres avec une baisse de 14% en trois jours après l’infection. Ensuite, suit respectivement le lot infecté par la souche Sark103 avec une baisse de 13% en quatre jours ; Kot256 avec une baisse de 12,67% en cinq jours ; IL1180 avec une baisse de 10% en 3 jours ; D27 avec une baisse de 8,67% en huit jours. Le lot de souris infectées par la souche TG4/09 a enregistré la plus faible baisse de son taux d’hématocrite (4,5%) en 11 jours post-infection. 29 Taux d'hématocrite en pourcentage 60 55 55 54,5 54.33 52.67 51 50 46,5 44,5 42 41 44 41.67 40 30 20 10 0 Ser71/SMB/212 IL1180 Sark103 Avant infection Kot256 TG4/09 Après infection D27 Souches Figure 13 : Comparaison du taux d’hématocrite moyen des souris avant l’infection et après l’infection des six souches de Trypanosoma congolense. L’analyse statistique du taux d’hématocrite moyen journalier des lots de souris avant et après l’infection par les six souches de Trypanosoma congolense ne révèle aucune différence significative (tableau II). 30 Tableau II : Analyse statistique de la moyenne journalière des taux d’hématocrites avant et après l’infection des lots de souris par les six souches de T.congolense Souches Période Moyenne Écart type P-value D27 Avant infection 52,66 1,15 0,07652 Après infection 44 3,60 Avant infection 54,33 2,51 Après infection 37 13,07 Avant infection 54,33 2,51 Après infection 41,66 2,51 Avant infection 55 00 Après infection 42 2,67 Ser71/SMB/212 Avant infection 55 7,81 Après infection 41 00 Avant infection 52,33 3,05 Après infection 46,33 0,57 IL1180 Kot256 Sark103 TG4/09 0,1 0,1 0,0636 0,0636 0,07652 II-2- Discussion Cette expérimentation ayant pour but de cultiver et comparer le degré de virulence des six souches de Trypanosoma congolense s’est basée sur une comparaison d’ordre parasitologique et hématologique entre les lots de souris infectées par ces différentes souches. Dans nos conditions expérimentales, la totalité des souches de T. congolense ont pu se multiplier chez toutes les souris infectées avec une période prépatente et une 31 évolution parasitémique variable en fonction des souches. Ainsi, les périodes prépatentes des souches Ser71/SMB/212, IL1180, TG4/09 ont été très brèves (un jour). Cependant, les deux premières souches se distinguent des autres par une évolution rapide, tandis que TG4/09 se définit par une évolution très lente. En effet, une étude protéomique des facteurs excrétés/ sécrétés au cours des infections à T. congolense dirigée par Milon et al. en 2008 a montré que les différentes souches de T. congolense sécrètent différemment des protéines (sécrétome) qui favorisent leurs multiplications dans l’organisme des animaux. Quant aux souches Sark103, D27 et Kot256, l’évolution relative de leur parasitémie a été intermédiaire aux groupes précédents. Ce constat se rapproche à celui de Authié, (1984) et celui de Sidibe, (1996) qui ont pu montrer qu’il existe une diversité d’interaction des souches de T. congolense du type savane avec leurs hôtes. Ensuite, le suivi du taux d’hématocrite révèle que la souche Ser71/SMB/212 a été celle qui a causé une anémie plus sensible en seulement trois jours (14% de baisse du taux d’hématocrite). Cependant cette baisse n’est pas corrélée avec l’évolution du poids des souris concernées car leur poids n’a varié que très faiblement. L’installation de l’anémie est due à plusieurs formes de cystéines protéase, métabolite des trypanosomes qui lysent les globules rouges lors des infections (Descamps, 2002). A L’instar de la souche Ser71/SMB/212, les souches Sark103, Kot256, IL1180, et D27 ont enregistré par ordre décroissant, d’importantes chutes du taux d’hématocrite. La souche TG4/09 a causé moins d’anémie (4,5% de baisse du taux d’hématocrite). Parmi tous les lots de souris, aucune anémie n’a été corrélé avec la variation du poids car le poids n’a varié que très légèrement. Cela n’a pas été un premier constat car Duvallet et collaborateurs, (1987) ont également constaté que l’infection des trypanosomes ne provoquait qu’une légère variation de poids chez certains animaux. De plus Ndoutamia et collaborateurs, (2000) ont montré que l’infection aux trypanosomes avait des effets modérés sur le poids selon que l’animal est en pleine croissance et dans de bonne condition alimentaire. En outre au sein d’un même lot de souris infectées par la même souche de T. congolense, nous avons constaté une variabilité de baisse importante du taux d’hématocrite entre les souris. Cela pourrait s’expliquer par le faite les souris utilisées pour l’expérimentation étaient de sexe et d’âge différent. De plus les souris NMRI sont non consanguines, par conséquent, le 32 système immunitaire des souris NMRI peut développer différemment une défense contre les Trypanosomes d’une même souche. Par ailleurs, notre étude n’a pas pu établir une corrélation entre l’anémie et la parasitémie observée parce que le taux d’hématocrite n’était pas mesuré chaque jour. Néanmoins, le constat fait au niveau hématologique et parasitologique laisse penser que la souche Ser71/SMB/212 présente un degré de virulence supérieure. 33 Conclusion et perspectives Cette étude menée au CIRDES dans le but de cultiver six souches de Trypanosoma congolense sur des souris NMRI et de caractériser leurs degrés de virulence a montré une diversité d’interaction entre ces trypanosomes et leurs hôtes. En effet, ces souches sont capables de se multiplier de façon variable dans l’organisme des souris NMRI et de faire baisser le taux d’hématocrite de ces souris. En outre ces souches n’ont pas d’effet significatif sur la variation du poids corporel des souris infectées. Nonobstant le caractère virulent de toutes ces souches, il ressort enfin de compte que la souche Ser71/SMB/212 semble être la plus virulente, suivi de la souche IL1180. La souche TG4/09 serait la moins virulente. Les souris NMRI sont des animaux de laboratoire chez lesquelles il existe une variabilité génétique importante. Cette variabilité génétique est susceptible d’influencer l’étude de la virulence des souches de trypanosomes. Il est donc important de poursuivre l’étude de la virulence des souches de trypanosomes sur des animaux de laboratoire à variabilité génétique négligeable vis-à-vis de la virulence, afin de mieux caractériser les souches de trypanosomes par rapport à leurs virulences. 34 BIBLIOGRAPHIE Authié, E., 1984. Mise en évidence d’une résistance aux trypanocides parmi des souches de Trypanosoma congolense récemment isolées au Burkina. Rev. 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Springer Science & Business Media, 201p. 39 ANNEXE ANNEXES Annexe 1 : Tableau d’estimation de la parasitémie (Herbert et Lumsden 1976) I TABLE DES MATIERES SOMMAIRE ....................................................................................................................... i DÉDICACE ...................................................................................................................... iii REMERCIEMENTS ....................................................................................................... iv LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ................................................................. vi RESUME ......................................................................................................................... vii ABSTRACT .................................................................................................................... viii LISTE DES FIGURES .................................................................................................... ix LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................. x LISTE DES ANNEXES .................................................................................................... x INTRODUCTION............................................................................................................. 1 PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Chapitre I : La Trypanosomose Animale Africaine ...................................................... 3 I-1- Définition et répartition géographique ................................................................ 3 I-1-1- Définition .......................................................................................................... 3 I-1-2- Répartition géographique ................................................................................. 3 I-2- Importance socio-économique .............................................................................. 4 Chapitre II: Les agents pathogènes ................................................................................. 6 II-1- Définition et taxonomie ........................................................................................ 6 II-1-1- Définition ........................................................................................................ 6 II-1-2- Taxonomie ....................................................................................................... 6 II-2- Morphologie et Cycle de développement ........................................................... 7 II-2-1- Morphologie et structure ................................................................................. 7 II-2-1-1- Morphologie ............................................................................................. 7 II-2-1-2- Structure ................................................................................................... 8 II II-2-2- Cycle de développement ................................................................................. 9 II-2-2-1- Chez la glossine ....................................................................................... 9 II-2-2-2- Chez l’hôte mammifère.......................................................................... 10 II-3- Virulence et symptômes ..................................................................................... 11 II-3-1- Virulence ....................................................................................................... 11 II-3-2- Symptômes .................................................................................................... 11 II-4- Épidémiologie de la TAA ................................................................................... 13 II-5- Diagnostic ............................................................................................................ 14 II-5-1- Diagnostic clinique ........................................................................................ 14 II-5-2- Diagnostic par des méthodes au laboratoire .................................................. 14 II-5-2-1 Méthodes directes .................................................................................... 14 II-5-2-2- Méthodes indirectes. .............................................................................. 16 II-6- Traitement .......................................................................................................... 18 DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE Chapitre I : Matériel et méthodes ................................................................................. 19 I-1- Matériel ................................................................................................................. 19 I-1-1- Matériel de laboratoire.................................................................................... 19 I-1-2- Matériels biologiques ..................................................................................... 20 I-1-2-1- Les souches de T. Congolense ................................................................ 20 I-1-2-2- Les souris NMRI ..................................................................................... 20 I-2- Méthodologie ........................................................................................................ 21 I-2-1- Amplification des souches .............................................................................. 21 I-2-2- Préparation de l’inoculum .............................................................................. 22 I-2-3- infection expérimentale .................................................................................. 22 I-3- Analyse des données ............................................................................................ 26 III Chapitre II : Résultats et discussion.............................................................................. 27 II-1- Résultats .............................................................................................................. 27 II-1-1- La parasitémie ........................................................................................... 27 II-1-2-Le poids ...................................................................................................... 28 II-1-3- Le Taux d’hématocrite .............................................................................. 29 II-2- Discussion ............................................................................................................ 31 Conclusion et perspectives ............................................................................................. 34 BIBLIOGRAPHIE .......................................................................................................... 35 ANNEXE ............................................................................................................................. I IV
