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Production de souches de Trypanosoma congolense sur des souris Naval Medical Research Institute

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N° d’ordre------UNIVERSITE NAZI BONI
****************
UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE
EN SCIENCES ET TECHNIQUES
****************
GENIE BIOLOGIQUE
CENTRE INTERNATIONAL DE
RECHERCHE-DEVELOPPEMENT SUR
L’ELEVAGE EN ZONE SUBHUMIDE
****************
UNITE MALADIES A VECTEURS ET
BIODIVERSITE
****************
****************
RAPPORT DE FIN DE CYCLE
Pour obtention de la
LICENCE PROFESSIONNELLE DE GENIE BIOLOGIQUE
Option : Analyses Biologiques
Sur le thème :
Production de souches de Trypanosoma congolense
sur des souris Naval Medical Research Institute
Présenté par
KOMBASSERE ELIE
Maître de stage : Dr Jacques KABORE
Directeur de rapport : Pr Aboubacar TOGUYENI
Année universitaire : 2015-2016
SOMMAIRE
DÉDICACE ....................................................................................................................... iii
REMERCIEMENTS .......................................................................................................... iv
LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ..................................................................... vi
RESUME .......................................................................................................................... vii
ABSTRACT ..................................................................................................................... viii
LISTE DES FIGURES ...................................................................................................... ix
LISTE DES TABLEAUX................................................................................................... x
LISTE DES ANNEXES ..................................................................................................... x
INTRODUCTION .............................................................................................................. 1
PREMIERE PARTIE : SYNTHESE
BIBLIOGRAPHIQUE .......................................... 1
Chapitre I : La Trypanosomose Animale Africaine ............................................................ 3
I-1- Définition et répartition géographique ..................................................................... 3
I-2- Importance socio-économique ................................................................................. 4
Chapitre II: Les agents pathogènes ..................................................................................... 6
II-1- Définition et taxonomie .......................................................................................... 6
II-2- Morphologie et Cycle de développement ............................................................... 7
II-3- Virulence et symptômes ....................................................................................... 11
II-4- Épidémiologie de la TAA ..................................................................................... 13
II-5- Diagnostic ............................................................................................................. 14
II-6- Traitement ............................................................................................................. 18
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE ...................................................... 1
Chapitre I : Matériel et méthodes...................................................................................... 19
I-1- Matériel .................................................................................................................. 19
I-2- Méthodologie ......................................................................................................... 21
I-3- Analyse des données .............................................................................................. 26
Chapitre II : Résultats et discussion .................................................................................. 27
II-1- Résultats................................................................................................................ 27
i
II-2- Discussion ............................................................................................................. 31
Conclusion et perspectives ................................................................................................ 34
BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................ 35
ANNEXES
TABLE DES MATIERES .................................................................................................. II
ii
DÉDICACE
Je dédie ce travail à :
A mon très cher père, Emmanuel P. KOMBASSERE, celui qui ne se
lasse point d’aménager tous ses efforts pour que j’atteigne mes
objectifs ;
A ma très chère mère, Thérèse ZONGO, celle qui ne cesse de me
réconforter et m’encourager dans les moments difficiles de ma vie ;
A mes frères et sœurs pour leurs compréhensions et leurs soutiens,
Puisse le seigneur nous unir d’avantage dans son amour.
A tous ceux qui de loin ou de près, ont participé à la réalisation de
ce travail.
Trouvez ici le témoignage de ma pleine reconnaissance
iii
REMERCIEMENTS
La réalisation de ce travail entrant dans le cadre de notre Licence n’a été possible
que grâce à la disponibilité et à la sincère collaboration de plusieurs personnes. A cet
effet, nous voudrions exprimer notre profonde gratitude :
 au Dr Valentine C. YAPI-GNAORE, Directrice Générale du Centre
International de Recherche-Développement sur l’Élevage en zone Subhumide
(CIRDES) qui a bien voulu nous accepter en tant qu’étudiant-stagiaire au sein de
son institution ;
 au Pr Aboubacar TOGUYENI, Enseignant-chercheur à l’Université Nazi Boni
(UNB), notre Directeur de rapport pour avoir accepté de nous encadrer. Nous
tenons à vous remercier pour la confiance placée en nous ;
 au Dr Jacques KABORE, Enseignant-chercheur à l’UNB et Chercheur au
CIRDES, notre maître de stage. Vous avez accepté de nous encadrer malgré vos
multiples occupations. Nous vous remercions pour tout ce que vous nous avez
appris, merci pour votre gentillesse, votre disponibilité, votre sens de l’écoute et
votre compréhension. Vos qualités humaines et d’homme de science suscitent
respect et admiration ;
 au Dr Zakaria BENGALY, Directeur scientifique du CIRDES pour avoir
toujours été à nos cotés pour nous soutenir et nous encourager ;
 au Dr Charles DAYO, Chef de l’Unité Maladies à Vecteurs et Biodiversité
(UMaVeB), pour nous avoir reçu au sein de son service ;
 au Dr Augustin BANCE, Responsable du service de Communication et de
Valorisation (C-VALO) pour sa disponibilité.
 aux Dr Hamidou ILBOUDO et Dr Stijn DEBORGGRAEV, pour la formation
de qualité qu’ils nous ont donnés sur la PCR en temps réel dès les premiers jours
de notre arrivé au CIRDES.
iv
 au Dr Olivier AMOUSSOU pour sa constante disponibilité, son sens d’écoute et
ses précieux conseils ;
 à tous nos aînés étudiants stagiaires au CIRDES, particulièrement au doctorant
Justin Windingoudi KABORE et Charlie COMPAORE pour leurs soutiens,
leurs sympathies et les bons moments passés ensemble.
 aux sieurs Hassane SAKANDE et Mohamed BAMBA, techniciens de
laboratoire au CIRDES, pour nous avoir initié aux techniques de diagnostic
sérologique, parasitologique et de biologie moléculaire. Nous n’oublions pas leurs
collègues, Léopold MILLOGO, Mêmê YOUL, Souleymane SYLLA, Adrien
ZOUNGRANA, Maurice KONKOBO, Victor BAZEMO, pour leurs précieux
conseils et le climat de convivialité qui règne au sein du laboratoire ;
 à tous mes camarades de la 2ème promotion de Génie-Biologique option :
Analyses Biologiques pour ces trois ans de fraternité passés ensemble.
 à tous les chercheurs et le personnel du CIRDES pour leur accueil et leur
courtoisie.
Nous tenons à remercier également :
 le Pr Georges Anicet OUEDRAOGO, Président de l’UNB pour nous avoir
autorisé à s’inscrire à l’université ;
 le Pr Sado TRAORE, Directeur de l’Unité de Formation et de Recherche en
Sciences et Techniques (UFR/ST) pour avoir permis la réalisation de ce stage ;
 le Dr Roland MEDA, Directeur Adjoint de l’Unité de Formation et de Recherche
en Sciences et Techniques (UFR/ST) pour les conseils et les encouragements qu’il
nous a prodigué tout au long de notre formation ;
 le Dr Ernest SALOU, coordonnateur de la filière Génie-Biologique, qui fait du
mieux qu’il peut pour accompagner les étudiants. Merci pour la confiance placée
en nous ;
 à tout le comité pédagogique de la formation de la Licence professionnelle de
Génie Biologique et l’administration pour les enseignements de qualité qu’ils
nous ont fournis tout au long de notre formation.
v
LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS
Abréviations/sigles
Significations
ADN :
Acide Désoxyribonucléique
CIRDES :
Centre International de RechercheDéveloppement sur l’Élevage en zone
Subhumide
ELISA :
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FAO
Food and Agriculture Organization
LCR :
Liquide Céphalorachidien
NMRI :
Naval Medical Research Institute
OMS :
Organisation Mondiale de la Santé
PCR :
Polymerase Chain Reaction
SNC :
Système Nerveux Central
TAA :
Trypanosomose Animale Africaine
UI :
Unité Internationale
UNB :
Université Nazi Boni
vi
RESUME
La Trypanosomose Animale Africaine (TAA) est une parasitose due à des
protozoaires flagellés appartenant au genre Trypanosoma (T). Causée principalement par
les espèces T. congolense, T. vivax et T. brucei brucei, elle touche plus de 37 pays
africains et est transmise par un vecteur hématophage du genre Glossina appelé
communément mouche tsé-tsé. La TAA entrave le développement de l’élevage, de
l’agriculture et en générale le développement du continent Africain. Malgré les
importants efforts de lutte, l’éradication de la TAA reste toujours un défi à relever et
passe par une bonne connaissance de l’interaction entre le trypanosome et son hôte
animal. Ainsi dans le but de mieux connaitre les trypanosomes afin de mettre en place des
méthodes de lutte plus adaptées, cette étude réalisée au CIRDES a eu pour objectifs :
d’une part de cultiver six souches de T. Congolense, de faire des stabilats pour des études
antérieures et d’autre part de caractériser ces différentes souches par rapport à leurs
virulences. Ainsi, six lots de deux souris NMRI (Naval Medical Research Institute) ont
été infectés avec des souches de T.congolense puis passé sur six lots de trois souris.
Pendant l’expérimentation, le taux d’hématocrite, le poids corporel et la parasitémie de
chaque souris ont été suivi. Les résultats obtenus ont révélé une baisse du taux
d’hématocrite allant de 4 à 14%, une période prépatente des souches allant de un à trois
jours et une augmentation légère de 0,85 à 5,65 g du poids corporel des souris. En fin de
compte, la souche Ser71/SMB/212 a semblée être la souche la plus virulente des six
souches de T. congolense étudiées.
Mots-clés : Trypanosomose Animale Africaine -Trypanosoma congolense -Souris NMRI
-Stabilat -Virulence.
vii
ABSTRACT
African Animal Trypanosomiasis (AAT) is a parasitic disease caused by a
protozoan belonging to the genus Trypanosoma: T. congolense, T. vivax and T. brucei
brucei. This disease affects more than 37 African countries and is transmitted by a
hematophagous vector called tsetse fly. The AAT hampers the development of breeding,
agriculture and in general, the African continent. Despite important struggle efforts, the
eradication of the AAT remains a challenge to achieve and requires a good knowledge
concerning interaction between trypanosome and its animal host. So, in the goal to know
trypanosomes better in order to put in place of the struggle methods more adapted, this
survey achieved in the CIRDES had for objectives: on the one hand, to cultivate six
strains of T. congolense and make some stabilats for previous studies and on the other
hand, to characterize these different strains in relation to their virulence. Thus, six batches
of two NMRI mice were infected with T.congolense strains and then passed on six
batches of three mice. During experiment, the rate of hematocrit, body weight and the
parasitemia of each mouse were monitored. The results obtained revealed a decrease of
the rate of hematocrit of 4 to 14%, prepotency period of the strains going from one to
three days and light increase of 0.85 to 5.65 g of body weight of mice. At the end,
Ser71/SMB/212 appeared to be the most virulent strain of six strains of T. congolense
studied.
Key words: Animal African Trypanosomiasis -Trypanosoma congolense -Mouse NMRI
-Stabilat -Virulence.
viii
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Aire de répartition des glossines en Afrique (DFID/AHP, 2005) ...................... 4
Figure 2 : Diagramme de Classification de quelques trypanosomes importants de
mammifères (Farougou et al., 2007)................................................................................... 7
Figure 3 : Morphologie des trypanosomes (Walker, 1994) ................................................ 8
Figure 4 : Représentation schématique d'un trypanosome montrant les différentes parties
du micro-organisme (Lamine et Desquesnes, 2003)........................................................... 9
Figure 5 : Cycle de développement des trypanosomes (Descamps, 2002) ....................... 10
Figure 6: Animal trypanosomé en état de prostration (Lamine et Desquesnes, 2003) ..... 13
Figure 7 : Souris NMRI utilisées pour l’amplification des souches de T. congolense
(Kombassere, 2017) .......................................................................................................... 21
Figure 8 : Pesée des souris avec la balance électronique (Kombassere, 2017) ................ 23
Figure 9 : Lecture de la parasitémie avec le microscope optique sous l’objectif 40
(Kombassere, 2017) .......................................................................................................... 24
Figure 10 : Centrifugation des tubes capillaires et lecture du taux
d’hématocrite
(Kombassere, 2017) .......................................................................................................... 25
Figure 11 : Évolution journalière de la parasitémie des lots de souris infectées par les six
souches de T. congolense. ................................................................................................. 28
Figure 12 : Évolution journalière du poids des lots de souris infectées par les six souches
de T. congolense................................................................................................................ 29
Figure 13 : Comparaison du taux d’hématocrite moyen des souris avant l’infection et
après l’infection par les six souches de Trypanosoma congolense. .................................. 30
ix
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I : Description des souches de trypanosomes utilisées pour l’étude
expérimentale. ................................................................................................................... 20
Tableau II : Analyse statistique de la moyenne journalière des taux d’hématocrites avant
et après l’infection des lots de souris par les six souches de T.congolense ...................... 31
LISTE DES ANNEXES
Annexe 1 : Tableau d’estimation de la parasitémie (Herbert et Lumsden 1976).................I
x
INTRODUCTION
La Trypanosomose Animale Africaine (TAA) est une parasitose qui affecte
principalement les bovidés et les équidés. Elle est provoquée par des protozoaires
flagellés du genre Trypanosoma (T). Les espèces sont dans l’ordre d’importance T.
congolense suivi de T. vivax et de façon moindre, T. brucei brucei. En effet, la maladie
est essentiellement transmise par un insecte hématophage du genre Glossina ou glossine,
communément appelé la mouche tsé-tsé (Tazé et Gruvel, 1978). Elle peut également être
transmise mécaniquement par des insectes piqueurs tels que les tabanidés et les stomoxes
(Duvallet et al., 1987). Par ailleurs, d’autres trypanosomes tels que Trypanosoma brucei
gambiense (T. b. gambiense) et T. b. rhodesiense sont transmis à l’Homme par les
mouches tsé-tsé et sont responsables d’une pathologie appelée la maladie du sommeil.
La TAA sévit dans près de 37 pays d’Afrique subsaharienne, soit un tiers du continent
africain. Elle se manifeste par des fièvres intermittentes, des œdèmes, des avortements,
une baisse de la fertilité et l’amaigrissement. L’anémie est observée habituellement chez
l’animal parasité suivie d’une dégradation de son état général (Diaite, 1991). L’animal
devient sans valeur économique, peu apte aux travaux agricoles et sans aucune valeur
monétaire à la réforme. Ainsi, elle rend vulnérable à la pauvreté les populations rurales
qui dépendent de l’agriculture et de l’élevage. Pour vaincre ce fléau, plusieurs stratégies
de contrôle à savoir, la lutte contre le vecteur, l’élevage de bovins trypanotolérants et les
traitements trypanocides sont utilisées. Parmi ces stratégies de luttes, les traitements
trypanocides constituent la principale. Cependant, plusieurs travaux montrent l’apparition
de souches de trypanosomes résistantes à ces médicaments (Fotso, 1978 ; Delespaux et
Koning, 2007 ; Munday et al., 2015). De plus, certaines techniques de diagnostic rapide
utilisées sur le terrain sont peu sensibles (Kageruka, 1989), ce qui rend difficile la
maîtrise de cette maladie.
Pour pallier à cette situation, le CIRDES a mis en route un vaste projet de
génotypage des souches de trypanosomes animaux (T. congolense, T. vivax et T. brucei
brucei), dans le but de comprendre les liens entre les variantes génétiques et la pathologie
afin de développer de nouvelles techniques de lutte plus adaptées.
1
Pour une bonne conduite de ces mesures, trois étapes s’est avérés nécessaire. La
première a été de recenser toutes les souches disponibles au CIRDES. L’étape suivante
est l’amplification des souches et enfin le génotypage. C’est dans ce contexte que
s’inscrit notre étude qui a pour objectif global d’obtenir une suspension suffisante de
trypanosomes de chaque souche pour le génotypage et de caractériser les souches en
fonction de leurs virulences.
En terme d’objectifs spécifiques, il s’agit de :

cultiver six souches de T.congolense sur des souris NMRI et de faire des
stabilats ;

d’évaluer l’effet des souches de trypanosomes sur l’évolution du poids, du taux
d’hématocrite et de la parasitémie des souris infectées.
Le travail que nous rapportons ici s’organise en deux grandes parties :
 une revue bibliographique sur la Trypanosomose Animale Africaine ;
 une partie expérimentale dans laquelle nous présentons le matériel et les méthodes
utilisés, les résultats et leur discussion, la conclusion et la bibliographie.
2
PREMIERE PARTIE : SYNTHESE
BIBLIOGRAPHIQUE
PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre I : La Trypanosomose Animale Africaine
I-1- Définition et répartition géographique
I-1-1- Définition
La TAA est une parasitose à transmission vectorielle. En effet, elle est due à la
présence et à la multiplication d’un protozoaire appartenant au genre Trypanosoma dans
le plasma sanguin et/ou dans divers tissus ou liquides des animaux. Les principaux agents
responsables sont les suivants : T. congolense, T. vivax et dans une moindre mesure T.
brucei brucei (Diaite, 1991). Tout comme pour la maladie du sommeil chez l’Homme, le
parasite est transmis de manière cyclique après piqûre de l’hôte animal par l’insecte
vecteur, glossine ou mouche tsé-tsé du genre Glossina. Les animaux domestiques ou
sauvages porteurs de parasites pathogènes constituent les principaux réservoirs des
trypanosomes. Cependant deux autres espèces à savoir T. evansi et T. equiperdum sont
transmises de façon mécanique par des insectes piqueurs (tabanidés et stomoxes), causant
respectivement le surra et la dourine.
De plus, la TAA est une maladie qui évolue d’une forme aiguë à une forme
chronique en fonction du parasite, provoquant des accès de fièvre. Cette fièvre est
accompagnée de symptomatologie avec une durée variable en fonction de l’espèce
animale infectée et de l’espèce parasitaire incriminée dans l’infection.
I-1-2- Répartition géographique
La TAA est exclusivement transmise par les glossines et sévit dans près de 37
pays d’Afrique dans les régions tropicales et intertropicales. Elle occupe une superficie
d’environ 10 millions de Km2 soit un tiers du continent africain. La TAA s’étend entre
15° de latitude Nord et 20° de latitude Sud, de part et d’autre de l’équateur. La maladie
est répartie de façon hétérogène dans sa surface de présence en fonction du climat, de
l’écologie et de l’intensité de la lutte (Courtin et al., 2009). Quant à la distribution du
vecteur (figure 1), elle revêt une importance primordiale dans l’épidémiologie de la
maladie.
3
Figure 1 : Aire de répartition des glossines en Afrique (DFID/AHP, 2005)
I-2- Importance socio-économique
La Trypanosomose Animale Africaine sévit principalement en Afrique au Sud du
Sahara, dans les zones à fort potentiel de production agricole. Par conséquent, elle est une
contrainte majeure au développement socio-économique des populations occupant ces
régions. En principe, les conséquences engendrées par la TAA sont d’ordre direct et
indirect.
Tout d’abord, les effets directs se font sentir dans les taux de natalité des animaux
infectés (Boly et al., 1993; Sangare et al., 2010), la baisse de la production animale
(viande, lait) et la mortalité des animaux (Bontoulougou et al., 2000). Une étude menée
en Gambie en 1998 par des experts de la FAO montre que malgré l’introduction des
animaux trypanotolérants, la TAA cause la mort de 20% des veaux qui sont nés, réduit la
production laitière de 26% et les naissances d’agneaux et de chevaux de 37%.
4
Ensuite, les pertes indirectes de la TAA sont liées à l’établissement humain, à
l’utilisation des terres et des cultures (Courtin et al., 2009). En effet, la TAA couvre les
zones subhumides et les parties les plus humides de la zone aride, qui sont les régions
détentrices du plus grand potentiel d’expansion agricole et fourragère du continent
(Gruvel, 1984). La population est contrainte d’abandonner ces zones de culture et de
pâturage qui sont les surfaces de présence de la maladie pour se concentrer dans les zones
semi-arides aux ressources limitées ou la maladie est absente. Il en découle la dégradation
progressive des terres et par conséquent la baisse de la production animale et agricole. Le
fait que les éleveurs et les agriculteurs fuient les zones infestées pour se concentrer dans
les zones semi-arides est également source de conflit entre eux car il n’y a pas
suffisamment de terre pour la l’agriculture et pour l’élevage. De plus, la TAA réduit la
disponibilité et l’efficacité des animaux de traits utilisés pour préparer les sols aux
cultures (Vall et al., 2003). Enfin, les coûts élevés de l’importation de la viande, des
produits laitiers et les coûts des mesures de lutte contre la TAA contribuent à la pauvreté
de la population vivant dans la surface de présence de la maladie.
5
Chapitre II: Les agents pathogènes
II-1- Définition et taxonomie
II-1-1- Définition
Les trypanosomes sont des protozoaires flagellés, sanguicoles et exoérythrocytaires. Leur déplacement est assuré par un flagelle de forme allongée dirigé vers
l’avant, près de la base duquel se trouve une structure particulière, le kinétoplaste. Les
espèces d’intérêt médical sont généralement dixène c’est-à-dire qu’elles ont un cycle
évolutif passant par deux hôtes (Jacquiet et al., 1993). Un hôte invertébré, généralement
un insecte piqueur hématophage où elles évoluent dans le tractus digestif et un hôte
vertébré chez lequel elles se multiplient dans les liquides physiologiques, en particulier le
sang.
II-1-2- Taxonomie
Les trypanosomes africains sont de l’embranchement des Sarcomastigophora, de
la classe des Zoomastigophora et de l’ordre des Trypanosomatidae. Ils se rangent dans la
section Salivaria du genre Trypanosoma (figure 2). Ils se distinguent des membres de la
section Stercoraria à laquelle appartient les trypanosomes americains qui sont transmis
par les matières fécales de leurs vecteurs (OMS, 1986).
6
Figure 2 : Diagramme de Classification de quelques trypanosomes importants de
mammifères (Farougou et al., 2007)
II-2- Morphologie et Cycle de développement
II-2-1- Morphologie et structure
II-2-1-1- Morphologie
Les trypanosomes africains sont des parasites unicellulaires, extracellulaires qui
vivent librement dans le sang ou dans d’autres liquides de l’organisme, notamment la
lymphe et le liquide céphalo-rachidien (LCR). Ils se présentent sous la forme d’une
cellule plate élancée (figure 3) et fusiforme avec une membrane ondulante enroulée
autour du corps d’où le nom de Trypanosoma qui signifie corps en « vrille ». Les
7
trypanosomes sont munis d’un noyau médian et un point à l’une de ces extrémités, le
kinétoplaste d’où part un flagelle. Cette forme varie selon l’espèce et le stade de
développement dans le vecteur ou l’hôte vertébré (Hoof, N.D., et al., 1944).
Trypanosomes
Figure 3 : Morphologie des trypanosomes (Walker, 1994)
II-2-1-2- Structure
Les trypanosomes sont des êtres vivants unicellulaires autonomes. Leur corps est
constitué principalement de cytoplasme entouré par une paroi cellulaire, dans lequel
baignent des organites et des inclusions diverses. Le noyau qui contient le nucléole est
entouré par une double membrane perforée (figure 4). En plus des structures classiques
telles que le réticulum endoplasmique, l’appareil de golgi, les lysosomes, s’ajoutent des
structures particulières telles que :
 la membrane ou périplasme ;
 le kinétoplaste, constitué du génome mitochondriale est la base du flagelle ;
 le flagelle, servant de moyen de locomotion.
8
Figure 4 : Représentation schématique d'un trypanosome montrant les différentes
parties du micro-organisme (Lamine et Desquesnes, 2003).
II-2-2- Cycle de développement
II-2-2-1- Chez la glossine
Les trypanosomes responsables de la TAA sont transmis par un insecte
hématophage, la glossine ou mouche tsé-tsé. La glossine s’injecte les formes
trypomastigotes (courtes) du parasite lors d’un repas sanguin sur un animal infecté (figure
5). Une adaptation morphologique et métabolique permanente est nécessaire au parasite
pour subsister dans l’organisme de la glossine. Ces formes trypomastigotes courtes,
infectantes une fois dans l’intestin moyen de la glossine, vont se différencier alors en
trypomastigotes procycliques allongés (Reifenberg et al., 1996). Puis, Ils migrent vers les
glandes salivaires où ils se différencient en formes trypomastigotes métacycliques avec
l’apparition d’un manteau antigénique qui les permettent de survivre après transmission à
son hôte mammifère. Les formes infectantes matures se détachent des cellules
épithéliales salivaires et restent dans la salive. La durée du cycle varie de 12 à 14 jours
pour T. congolense, 5 à 23 jours pour T. vivax et 20 à 30 jours pour T. brucei brucei.
9
Figure 5 : Cycle de développement des trypanosomes (Descamps, 2002)
II-2-2-2- Chez l’hôte mammifère
Les glossines injectent les formes métacycliques à l’hôte mammifère lors d’un
second repas sanguin. Ces formes se multiplient et se différencient en formes sanguicoles
longues et grêles provoquant une réaction immunitaire au site de la piqûre appelée
chancre d’inoculation. Les trypanosomes migrent ensuite vers le sang et les voies
lymphatiques, puis gagnent le système nerveux central. Après un certain temps
d’évolution, apparaissent les formes trapus trypomastigotes infectantes pour le vecteur
(glossine) (Reifenberg et al., 1997).
10
II-3- Virulence et symptômes
II-3-1- Virulence
La virulence est la capacité de multiplication du parasite chez son hôte animal
(Holzmuller et al., 2008). L’étude de la virulence des trypanosomes est utilisée pour
mettre en évidence la diversité clinique des infections dues aux trypanosomes et elle se
rapporte aux différents phénotypes induits par le trypanosome suite à l’infection (Huse et
al., 2010). La virulence d’une souche de trypanosome se décrite par : le niveau de
parasitémie ; la période prépatente (période qui s’écoule entre l’infection et la première
apparition des trypanosomes dans le sang) et l’efficacité de la transmission du
trypanosome par le vecteur.
II-3-2- Symptômes
La trypanosomose est une maladie à évolution le plus souvent aigue mais
chronique dans certains cas (Mawuena, 1986). Elle est caractérisée par une période
d’incubation variable d’une à quelques semaines. Les symptômes sont progressifs et
débutent par une fièvre. Par ailleurs la fièvre cause des altérations sanguines qui ont pour
conséquences des œdèmes, des larmoiements, une hypertrophie des nœuds lymphatiques,
l’avortement, une diminution de la fertilité, un amaigrissement suivi de la détérioration de
l’état général de l’animal. La mort s’ensuit en l’absence de traitement (figure 6).

Fièvre
La fièvre est intermittente et corrélée avec l’évolution de la parasitémie. La
présence d’un nombre élevé de parasite dans le sang détermine une forte élévation de la
température, le plus souvent supérieure ou égale à 40°C. Selon des études menées par
Murray en 1989, T. vivax est responsable d’une parasitémie plus élevée (107
trypanosomes par millilitres (mL) de sang) suivi de T. congolense (106 trypanosomes par
mL de sang), T. b. brucei est d’une poussée modérée (105 trypanosomes par mL de sang).
11

Anémie
L’anémie est le principal signe de la Trypanosomose Animale Africaine. Elle
intervient deux à trois semaines après la piqûre infectante d’une glossine et est due à la
chute du nombre des hématies. L’anémie se répartie entre trois phases. D’abord, une
phase hémolytique synchronisée avec la poussée parasitaire. Ensuite, une phase anémique
chronique débutée entre la sixième semaine et la septième semaine après l'infection.
Enfin, une troisième phase pendant laquelle les taux d’hématies restent constants et
inférieurs à la normale, pouvant aller jusqu’à 20%.

Œdèmes
Les œdèmes débutent le plus souvent sous forme de bourrelets œdémateux situés à la
partie médiane de la cage thoraxo-abdominale, puis envahissent les membres. Ils sont
rares chez les bovins et chez les petits ruminants par rapport au cheval et au chien.

Atteinte nerveuse et oculaire
La TAA provoque des troubles neurologiques qui se traduisent par l’affaiblissement
du train postérieur et parfois la parésie qui précède la mort du sujet infecté. Il peut y avoir
des sécrétions oculaires, allant du larmoiement avec photophobie à l’apparition de croûte
au bord interne des paupières (Pollock, 1992).

Amaigrissement
L’amaigrissement survient lorsque la maladie est avancée et plus la maladie dure,
plus l’animal maigrit. Il est souvent accru par une diarrhée qui vide l’animal de son poids
corporel. La mort survient d’habitude entre le deuxième et le troisième mois, sauf si
l’animal est traité. En plus de ces symptômes, il est fréquent d’observer un gonflement
des ganglions lymphatiques superficiels, des avortements, une baisse de la fertilité
(Desquesnes, 2001) et de la production laitière.

Lésions
La TAA est responsable de lésions non spécifiques (Itard et Frézil, 2003). Généralement,
il se forme un chancre d’inoculation au point de piqûre. Dans la phase initiale,
l’hypertrophie ganglionnaire, la splénomégalie et l’hépatomégalie sont de règle.
12
Par ailleurs, les bovins porteurs d’une infection chronique présentent une
hypoplasie des organes lymphoïdes. L’atteinte cardiaque, le plus souvent sous forme de
myocardite dégénérative, est la cause immédiate de la mort dans de nombreux cas
d’infection chronique.
Figure 6: Animal trypanosomé en état de prostration (Lamine et Desquesnes, 2003)
II-4- Épidémiologie de la TAA
La TAA touche les animaux domestiques de même que les animaux sauvages qui
représentent un réservoir immense de trypanosomes. Certains animaux porteurs sains ou
porteurs latents qui sont généralement les antilopes (guibs, kobs, élands), les phacochères
et les buffles, participent énormément à la pérennisation de la maladie. La principale voie
d’infection est la voie cutanée. L’infection de T. congolense et de T. brucei brucei est
essentiellement assurée par la glossine ou mouche tsé-tsé qui est le vecteur biologique. T.
vivax est également transmis par des mouches tsé-tsé, mais dans une certaine mesure peut
être transmis par des vecteurs mécaniques (tabanidé, stomoxes). La transmission par la
voie placentaire est également possible lors d’une infection aiguë chez la femelle
13
gestante. La transmission est beaucoup plus élevée en saison humide, et perdure tout au
long de l’année (De La Rocque, 2003). Elle est influencée par le taux de glossines
infectées et des interactions hôte-vecteur.
II-5- Diagnostic
Le diagnostic de la TAA se résume en un diagnostic clinique et un diagnostic de
laboratoire.
II-5-1- Diagnostic clinique
Le diagnostic clinique de la TAA est difficile à cause de la non-spécificité de ses
symptômes. Il est fondé sur une symptomatologie peu caractéristique (fièvre, anémie,
larmoiement, œdème et parésie du train postérieur inconstants). De nombreuses
hématoparasitoses (babésioses, anaplasmoses, microfilarioses) voire d’autres maladies du
bétail (helminthoses, charbon bactéridien) peuvent causer les mêmes symptômes que la
TAA (Desquesnes et al., 1999). Vue la non-spécificité des symptômes de la TAA, un
diagnostic par des méthodes au de laboratoire doit toujours confirmer ou infirmer le
diagnostic clinique.
II-5-2- Diagnostic par des méthodes au laboratoire
Le diagnostic par des méthodes au laboratoire dispose de deux méthodes à savoir
la méthode directe et la méthode indirecte.
II-5-2-1 Méthodes directes

Frottis sanguin
C’est une technique qui peut être utilisée lorsqu’on possède un microscope. Elle
présente un double intérêt car non seulement elle permet la détection des trypanosomes
mais aussi l’identification de l’espèce incriminée dans l’infection. Le prélèvement est soit
du sang soit du liquide de ponction ganglionnaire. Le liquide prélevé est étalé sur une
lame et coloré par la technique de May-Grünwald-Giemsa. Après la coloration, le
cytoplasme du parasite est coloré en bleu, le noyau et le kinétoplaste en rouge. Quant à la
14
membrane ondulante, elle reste incolore mais visible par sa bordure externe. Le frottis
sanguin est moins sensible car les trypanosomes sont rares dans le sang périphérique lors
d’une faible infection (Hope-Rapp et al., 2009).

Goutte épaisse
C’est une variante de frottis sanguin et elle consiste à étaler partiellement une goutte
de sang sur une lame à l’aide du coin d’une autre lame, en réalisant des mouvements
circulaires. Elle est colorée au Giemsa dilué au un dixième.

Le taux d’’hématocrite et la méthode de Murray
Cet examen est réalisé à partir du sang de l’animal contenu dans un tube capillaire à
microhématocrite, prélevé à son oreille par piqûre d'une veine superficielle. Les tubes
capillaires à microhématocrite, sont des tubes héparinés, de 75 millimètres (mm) de
longueur et 0,5 mm de diamètre intérieur. Ces tubes présentent le double avantage d'être
solides (grâce à l'épaisseur de leur paroi) et d'avoir un cercle noir dessiné à 15 mm d'une
extrémité, ce qui permet d'obtenir un volume de sang constant. Le remplissage se fait en
mettant en contact avec le sang, l’une des extrémités et l’autre extrémité abaissée, tout en
évitant les bulles d’air. Après le remplissage, les tubes sont bouchés avec la plasticine.
Une fois le prélèvement terminé, les tubes sont mis dans une boite coiffée de son
couvercle, puis placé dans un portoir contenant de la glace et acheminé rapidement vers
le lieu de l’examen car l’examen des échantillons doit se faire impérativement dans un
délai maximum de cinq heures après le prélèvement. Les tubes sont ensuite placés sur la
couronne d’une centrifugeuse à tube microcapillaire, pour être centrifugés pendant trois
minutes à trois mille tours par minutes. A la fin de la centrifugation, Ils se présentent
alors trois couches : les globules rouges près de la plasticine, une mince couche de
globules blancs et une couche claire de sérum.
L'hématocrite est le rapport exprimé en pourcentage, du volume des globules rouges
par rapport au volume total du sang. Il donne une indication sur l'état général de l'animal.
Sa valeur normale chez les bovins d’Afrique est comprise entre 30 à 40%. Tout animal
présentant une valeur de l’hématocrite inférieure ou égale à 27% est considéré comme
animal anémié.
15
La mesure du taux l'hématocrite s'effectue avec le lecteur d'hématocrite, en faisant
correspondre le 0 au bas des globules rouges et le 100 au haut du sérum (extrémité libre
du tube s'il est complètement rempli) ; la réglette orientable doit passer par le haut des
globules rouges et son extrémité donne la valeur de l'hématocrite. L’hématocrite permet
d’orienter le diagnostic, mais un étalement d’une partie du contenue du tube est
nécessaire pour confirmer ou infirmer le diagnostic (Dia et Desquesnes, 2007).
Avec un stylo diamant, on sectionne la partie comprise entre un mm de globule rouge
et trente mm de sérum de part et d’autre des globules blancs, puis on recueille sur une
lame. L’étalement est observé sous un microscope à fond noir à l’objectif 40, après avoir
été recouvert d’une lamelle. Les trypanosomes sont détectés lorsque leur concentration
atteint 102 à 103 parasites par mL de sang.
II-5-2-2- Méthodes indirectes.
Le diagnostic indirect se base sur la mise en évidence des traces de la présence ou
des traces du passage des trypanosomes dans les liquides biologiques des animaux.

ELISA
Le test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) indirect est une technique de
diagnostic utilisée pour la détection des anticorps. Son principe repose sur la
sensibilisation de microplaques ELISA par des antigènes solubles extraits du parasite,
grâce à une sonication et une ultracentrifugation. Toutefois que les échantillons à
analyser contiennent des anticorps spécifiques aux antigènes, il se forme des complexes
anticorps-antigènes. Les complexes anticorps-antigènes sont ensuite révélés par des
antiglobulines d’espèce, et un complexe substrat/révélateur. Un lavage exporte le
conjugué et les puits restent incolores pour les échantillons négatifs. La lecture des
plaques est ensuite faite à l’œil nu, ou au spectrophotomètre à une longueur d’onde
adaptée au chromogène (Desquesnes et al., 1999). Cette technique présente une très
bonne reproductibilité et un faible coût, ce qui en fait un très bon outil pour les enquêtes
épidémiologiques. Son seul inconvénient réside dans le fait que ce test ne permet pas de
distinguer les infections actives, des infections passées. De ce fait, d’autres méthodes plus
16
précises, comme le diagnostic visant la détection du matériel génétique du parasite sont
de plus en plus utilisées.

Méthodes moléculaires
La méthode moléculaire utilisée est la PCR (Polymerase Chain Reaction) ou
réaction par polymérisation en chaine. Son principe consiste à amplifier sélectivement
une séquence d’ADN donnée, spécifique à une espèce ou à un genre de trypanosome.
Cette amplification est possible grâce à l’action d’une enzyme thermostable extraite de
Thermophilus aquaticus, qui assure la polymérisation des acides nucléiques et des
amorces spécifiques. Le volume réactionnel est constitué de 25 microlitres (µl) contenant
de l’ADN extrait à partir des échantillons suspects, de taq polymérase, d’acides
désoxyribonucléiques phosphates, de tampon adéquat et d’une amorce (couple
d’oligonucléotides spécifiques qui cernent une portion spécifique d’ADN). Ce mélange
est ensuite soumis à une trentaine de cycles thermiques à l’aide d’un thermocycler.
Chaque cycle est constitué de trois étapes à savoir :
 l’étape de dénaturation à 94°C environ qui provoque la séparation des doubles
brins d’ADN ;
 l’étape d’hybridation des oligonucléotides à 55°C environ ;
 l’étape d’élongation des acides nucléiques à 72°C environ.
Au bout de 2 à 3 heures plus tard, on obtient un produit composé de plusieurs
portions d’ADN identique. Un volume de 10 μl de chaque échantillon est ensuite révélé
par électrophorèse dans un gel à 2% d’agarose teinté au Gel Red (agent intercalant de
l’ADN), et observé sous lumière Ultra-Violet. La fiabilité de chaque réaction
d’amplification est contrôlée par un témoin positif (adjonction au volume réactionnel
d’ADN purifié d’une souche de référence) et un témoin négatif (tampon réactionnel
contenant tous les constituants nécessaires à l’amplification, mais sans ADN cible). La
PCR permet le diagnostic d’une infection active car la persistance d’ADN libre dans la
circulation de l’hôte après la mort du parasite est assez brève, de l’ordre de 24 à 48 heures
(Desquesnes, 1997).
17
II-6- Traitement
Le traitement de la TAA repose essentiellement sur une chimiothérapie et une
chimioprophylaxie appropriée. Les trypanocides sont généralement des composés
arsenicaux, des diamidines ou des dérivés de l'urée. Ce sont souvent des composés assez
toxiques ou mal tolérés par les animaux ; en outre certaines souches de trypanosome ont
développé une résistance face à ces médicaments. Les molécules utilisées de nos jours
sont principalement :

l’acéturate de diminazène (Bérénil), utilisé à titre curatif chez les
ruminants, à la posologie de 3,5 mg/kg ou de 7 mg/kg en une seule
injection par voie intramusculaire (IM) et s’avère efficace vis-à-vis des
trypanosomoses africaines à T. evansi et T. bruce brucei ;

le chlorure d’isométamidium (trypamidium ou samorin) utilisé à titre
préventif (0,5 mg/kg, 2 à 5 fois par an) et à titre curatif (0,25 mg/kg à 0,5
mg/kg) en injection IM ou intraveineuse (IV).
Toutefois, il est nécessaire après le traitement trypanocides, d’améliorer l’état des
animaux par un traitement symptomatique pour accélérer leur guérison. Dans ce cadre,
une attention particulière doit être accordée au régime alimentaire des animaux (Balis et
Richard, 1977). Quant à la prophylaxie, elle est basée sur la lutte contre les glossines.
18
DEUXIEME PARTIE : ETUDE
EXPERIMENTALE
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
Chapitre I : Matériel et méthodes
I-1- Matériel
Six souches de T. congolense ont été amplifiées puis soumises à l’étude de leurs
virulences. Pour atteindre notre but, du matériel de laboratoire, biologique et des réactifs
ont été utilisés.
I-1-1- Matériel de laboratoire
Avant toute activité au laboratoire, nous nous sommes assurés du respect des
bonnes pratiques au laboratoire : le port d’une blouse, d’une chaussure fermée et des
gants. L’hypochlorite de sodium (eau de javel) était également utilisé pour la désinfection
des différents matériels avant et après leurs utilisations.
Nous avons par la suite utilisé :
 une balance électronique (Startorius) de portée 320 g, de précision 0,001 g et un
portoir en verre pour le suivi quotidien du poids des différentes souris ;
 un microscope optique, une paire de ciseaux, des lames portes objets et des
lamelles pour le suivi de la parasitémie ;
 des tubes capillaires à microhématocrite, des portoirs de tubes contenant de la
plasticine, une microcentrifugeuse pour la centrifugation et la lecture de
l’hématocrite ;
 des cryotubes de 1,5 mL et de 3,6 mL, de l'héparine (500 UI), de la kétamine (50
mg/mL), du glycérol, des pipettes, des embouts, des seringues, un agitateur pour
recueillir du sang et pour la préparation des stabilats ;
 un congélateur (-80°C) et de l'azote liquide (-196°C) ont servi à la conservation
des stabilats.
19
I-1-2- Matériels biologiques
I-1-2-1- Les souches de T. Congolense
Les trypanosomes utilisés pour l’expérimentation sont tous du genre
Trypanosoma, de l’espèce T. congolense provenant de la cryobanque du CIRDES. Ils
étaient tous du type savane, récoltés dans divers pays (tableau I).
Les trypanosomes ont été isolés pour la première fois à partir de sang d’animaux
infectés. Le sang infecté était mélangé à du glycérol (0,111mL/mL de sang) et conservé
dans de l’azote liquide à -196° C au CIRDES.
Tableau I : Description des souches de trypanosomes utilisées pour l’étude
expérimentale.
Code
Types génétique
Pays d’origine
Date d’isolement
D27
savane
Burkina Faso
2011
IL1180
savane
Tanzanie
1970
Kot256
savane
Burkina Faso
2011
Sark103
savane
Burkina Faso
2011
Ser71/SMB/212
savane
Tanzanie
1981
TG4/09
savane
Mali
2009
I-1-2-2- Les souris NMRI
Les souris NMRI (figure 7) sont des souris au pelage blanc et aux yeux rouges, se
reproduisant facilement. Importées de France (Charles River) depuis 2015, elles sont
élevées uniquement pour les travaux de recherche et d'enseignement. Les souris utilisées
dans cette étude, sont du sexe mâle et femelle, âgés de huit à dix semaines et ayant un
poids corporel compris entre 20 à 30 g.
20
Figure 7 : Souris NMRI utilisées pour l’amplification des souches de T. congolense
(Kombassere, 2017)
I-2- Méthodologie
I-2-1- Amplification des souches
L’amplification des souches est une technique qui permet d’obtenir un grand
nombre de trypanosome. Ainsi, à partir de la banque de données, les souches faisant
l’objet d’étude étaient retirées de l’azote liquide et décongelées à la température
ambiante. La viabilité était ensuite vérifiée par observation microscopique au
grossissement 400 d’une goutte du stabilat étalée entre lame et lamelle. Le mouvement
des trypanosomes était le signe de leur viabilité. Pour chaque souche de trypanosome,
deux souris dont le poids a été déterminé et le sang prélevé dans de tube capillaire
hépariné pour la détermination de l’hématocrite étaient traitées au cyclophosphamide
(endoxan®). Le cyclophosphamide immunodéprimait ces souris pour les rendre plus
sensibles à l’infection. A l’aide d’une seringue stérile à usage unique, le stabilat était
recueilli et injecté aux souris par voie intrapéritonéale. Après l’infection, le poids et la
21
parasitémie étaient suivis quotidiennement. Lorsque la parasitémie atteignait 64.106
trypanosomes/mL ou 125.106 trypanosomes/mL de sang, le sang était à nouveau prélevé
au niveau de la queue dans des tubes capillaires pour la mesure du taux d’hématocrite
avant le saignement. Les souris étaient ensuite anesthésiées par injection de 0,3 mL de
kétamine. Après l’ouverture du thorax, le sang cardiaque était mélangé avec 0,1 mL
d’héparine et prélevé par ponction cardiaque. Ce sang était utilisé pour réinfecter de
nouvelles souris afin de pouvoir caractériser la virulence des trypanosomes. Des stabilats
ont été préparés avec le reste du sang et conservés à -80° C dans une boite à polystyrène
puis à -196° C dans de l’azote liquide.
I-2-2- Préparation de l’inoculum
L’inoculum était constitué de sang fraichement prélevé à partir de souris dont la
parasitémie était 125.106 trypanosomes/mL. L’infection des souris avec la même quantité
de trypanosomes permettait d’éviter l’influence de la variation des différents paramètres
(poids, parasitémie, hématocrite, mortalité) due à la quantité de trypanosomes. De ce fait,
0,3 mL de sang à 125.106 trypanosomes/mL était utilisé pour l’inoculation des nouvelles
souris.
I-2-3- infection expérimentale
L’expérimentation a été réalisée sur six lots de trois souris, à raison de trois souris
par souche de trypanosome. Les trois souris de chaque lot étaient numérotées d’un à trois
à la queue à l’aide d’un marqueur et entretenu dans une cage étiquetée (code de la
souche, nombre de passage et la date d’infection). Les souris disposaient d’eau, de
granule et l’air de la salle d’expérimentation était conditionné à 24° C. Avant l’infection,
les souris étaient pesées. Un prélèvement de sang était effectué pour la détermination du
taux d’hématocrite. Après ces opérations, les souris étaient immunodéprimées par
injection sous-cutané de 0,2 mL de cyclophosphamide (endoxan®). Les souris étaient
maintenant prêtes pour être infectées. A cet effet, l’inoculum d’un volume de 0,3 mL à
125.106 trypanosomes/mL était injecté aux souris par voie intrapéritonéale. Tout au long
de l’expérimentation, les paramètres suivants ont été suivis :
22

Le suivi quotidien de l’évolution du poids
Avant l’infection et par suite, le poids quotidien de chaque souris était déterminé à
l’aide d’une balance électrique (figure 8). Pour effectuer l’opération, la balance est mise
sous tension et après avoir calibrer, nous déposons le bocal, puis on tare pour annuler le
poids du bocal. La souris vivante est ensuite déposée dans le bocal en verre et sur l’écran
s’affiche le poids de la souris.
Figure 8 : Pesée des souris avec la balance électronique (Kombassere, 2017)

Le suivi de la parasitémie.
L’évolution de la parasitémie des souris était quotidiennement suivie par examen
microscopique. A l’aide d’une paire de ciseaux, le bout de la queue de la souris était
coupé et la goutte de sang obtenue était étalée entre lame et lamelle. Ensuite, cette
préparation est observée au microscope optique au grossissement 400 (figure 9). La
parasitémie observée était comparée au dessin du tableau d’estimation rapide de la
parasitémie d’Herbert et de Lumsden (1976) (voir annexe 1) pour déterminer la valeur de
la parasitémie. Lorsque la parasitémie atteignait 7,8 ou 8,1 soit 64.106 trypanosomes/mL
ou 125.106 trypanosomes/mL, en fonction de l’état général des souris, elles sont
anesthésiées, disséquées, et un prélèvement de sang par ponction cardiaque est effectué
pour les besoins de stabilats.
23
Figure 9 : Lecture de la parasitémie avec le microscope optique sous l’objectif 40
(Kombassere, 2017)

La mesure du taux d’hématocrite
Le taux d’hématocrite est la proportion en pourcentage des globules rouges contenue
dans le sang par rapport au volume total de sang. Elle permet d’apprécier l’anémie. Avant
l’infection et avant de saigner la souris, l’hématocrite devait être mesuré. A cet égard, le
bout de la queue de la souris était coupé à l’aide d’une paire de ciseaux et des tubes
capillaires héparinés étaient remplis de sang. Ces tubes étaient ensuite soumis à une
centrifugation à 12 500 tours/minute pendant 5 minutes. Après la centrifugation, le sang
contenu dans les tubes se sépare en trois couches : les globules rouges près de la
plasticine, une mince couche de globules blancs et une couche claire de sérum. La mesure
de l'hématocrite s'effectue avec le lecteur d'hématocrite en faisant correspondre le 0 au
bas des globules rouges et le 100 au haut du sérum (extrémité libre du tube s'il est
24
complètement rempli) (figure 10) ; la réglette orientable doit passer par le haut des
globules rouges et son extrémité donne la valeur de l'hématocrite.
Figure 10 : Centrifugation des tubes capillaires et lecture du taux d’hématocrite
(Kombassere, 2017)

La préparation et la conservation des stabilats
Un stabilat est une suspension d’un grand nombre de trypanosomes préparée à
partir de sang infecté de souris et de glycérol. Pour sa réalisation, le sang cardiaque des
souris additionné de 0,1 mL d’héparine à 500 UI était prélevé avec une seringue stérile et
mis dans des cryotubes. Les tubes contenant le sang étaient ensuite placés dans des
portoirs contenant de la glace pour être transporté au laboratoire de sérologie. Le sang
était ensuite mélangé avec un cryoconservateur (le glycérol) à une proportion de 111µl de
glycérol pour 1000 µl soit un 1 mL de sang.
Le mélange ainsi constitué (stabilat) était reparti dans des tubes (à raison de 0,5
mL/tube), puis disposés dans des boîtes en polystyrène contenant de l'isopropanol et
gardées dans le congélateur à -80°C pendant 24 à 48h. L'isopropanol assure une
25
congélation progressive des stabilats. Les stabilats étaient enfin récupérés et stockés dans
de l'azote liquide à -196°C pour une conservation de longue durée.
I-3- Analyse des données
Les résultats obtenus ont été saisis dans des feuilles de calcul du logiciel
Microsoft Office Excel 2010. Le calcul de la moyenne journalière de la parasitémie et du
poids corporel, la moyenne du taux d’hématocrite avant et après infection puis la
réalisation des graphiques ont été également effectués par ce même logiciel. L’analyse
statistique du taux d’hématocrite a été effectuée à l’aide du logiciel R version 3.4.2. Le
seuil de signification de 5% a été retenu pour les comparaisons des résultats. Cependant,
lorsque la P-value serait inférieure au seuil, nous concluons que les données ne suivent
pas une loi normale ; par conséquent, les analyses ne peuvent être effectuées qu'avec des
tests non paramétriques. Le test de Kruskal Wallis a alors été utilisé pour vérifier s'il
existait une différence significative entre les lots de données indépendants.
26
Chapitre II : Résultats et discussion
II-1- Résultats
II-1-1- La parasitémie
Après une durée d’inoculation de 24 heures, la parasitémie des souris commence à
apparaitre au microscope et évolue de façon variable en fonction des souches de
trypanosomes.
Ainsi, en premier lieu, nous avons remarqué pendant le suivi quotidien de la
parasitémie que la période prépatente du lot de souris infectées par la souche
Ser71/SMB/212, IL1180, Sark103, Kot256 et TG4/09 est d’un jour. Quant à la période
prépatente du lot de souris infectées par la souche D27, elle est de trois jours.
La figure 11 illustre l’évolution de la parasitémie des souris infectées par les
différentes souches de Trypanosoma congolense. Nous constatons que cette évolution
varie d’une souche à une autre. Cependant, le lot de souris infectées par les souches
Ser71/SMB/212 et IL1180 ont atteint le maximum de parasitémie souhaité soit 125.106
trypanosomes/mL de Sang en trois jours après l’infection. Les souris infectées par les
souches Sark103, Kot256 et D27 ont atteint le maximum de parasitémie respectivement
au quatrième, cinquième et huitième jour après l’infection. La parasitémie des souris
infectées par la souche TG4/09 a été celle qui a évoluée plus lentement par rapport aux
autres. Elle atteint le maximum de parasitémie en 11 jours après l’infection. Cette figure
montre donc une différence importante entre les moyennes journalières de la parasitémie
des souris infectées par les différentes souches de T. congolense.
27
30000
25000
Ser71/SMB/2
12
IL1180
20000
sark103
15000
Kot256
TG4/09
10000
5000
0
J0
J1
J2
J3
J4
J5
J6
J7
J8
J9
J10 J11
Jours
Figure 11 : Évolution journalière de la parasitémie des lots de souris infectées par
les six souches de T. congolense.
II-1-2-Le poids
Le poids moyen des lots de souris utilisées pour l’expérimentation est compris
entre 19,4 et 32,17 g. Le suivi quotidien du poids moyen des lots de souris infectées par
les différentes souches de trypanosomes montre une évolution en deux phases (figure 12).
D’abord, une première phase caractérisée par une légère baisse du poids du lot de souris
infectées par les souches : Ser71/SMB/212, IL1180, Kot256 et D27 au jour un (J1) postinfection ; Sark103 au jour deux (J2) et TG4/09 au jour neuf (J9). Une deuxième phase
caractérisée par une évolution en dents de scie du poids de tous les lots de souris infectées
par les différentes souches de trypanosomes, en réalisant une légère augmentation enfin
de l’expérience. Ainsi dans l’ordre d’importance de gain de poids, le lot de souris
infectées par la souche : TG4/09 augmente de 5,65 g ; Kot256 augmente de 2,56 g ;
Sark103 augmente de 1,7 g ; D27 augmente de 1,4 g ; Ser71/SMB/212 augmente de 1,27
g et enfin IL1180 augmente de 0,85 g.
28
35
30
Poids en g
25
Ser71/SMB/212
IL1180
20
Sark103
15
Kot256
TG4/09
10
D27
5
0
J0
J1
J2
J3
J4
J5
J6
J7
J8
J9
J10
J11
J12
Jours
Figure 12 : Évolution journalière du poids des lots de souris infectées par les six
souches de T. congolense
II-1-3- Le Taux d’hématocrite
Le taux d’hématocrite moyen des souris avant l’infection par les souches
Ser71/SMB/212, IL1180, Sark103, Kot256, TG4/09, D27 est respectivement de 55%,
54,5%, 55%, 54,33%, 51%, 52,67%. Ce taux a considérablement baissé de façon variable
en fonction des souches de T. congolense. La figure 13 compare le taux d’hématocrite des
différents lots de souris avant l’infection et après l’infection par les trypanosomes. Le lot
de souris infectées par la souche Ser71/SMB/212 est le lot qui a connu une diminution
considérable du taux d’hématocrite par rapport aux autres avec une baisse de 14% en
trois jours après l’infection. Ensuite, suit respectivement le lot infecté par la souche
Sark103 avec une baisse de 13% en quatre jours ; Kot256 avec une baisse de 12,67% en
cinq jours ; IL1180 avec une baisse de 10% en 3 jours ; D27 avec une baisse de 8,67% en
huit jours. Le lot de souris infectées par la souche TG4/09 a enregistré la plus faible
baisse de son taux d’hématocrite (4,5%) en 11 jours post-infection.
29
Taux d'hématocrite en pourcentage
60
55
55
54,5
54.33
52.67
51
50
46,5
44,5
42
41
44
41.67
40
30
20
10
0
Ser71/SMB/212
IL1180
Sark103
Avant infection
Kot256
TG4/09
Après infection
D27
Souches
Figure 13 : Comparaison du taux d’hématocrite moyen des souris avant l’infection
et après l’infection des six souches de Trypanosoma congolense.
L’analyse statistique du taux d’hématocrite moyen journalier des lots de souris
avant et après l’infection par les six souches de Trypanosoma congolense ne révèle
aucune différence significative (tableau II).
30
Tableau II : Analyse statistique de la moyenne journalière des taux d’hématocrites
avant et après l’infection des lots de souris par les six souches de T.congolense
Souches
Période
Moyenne
Écart type
P-value
D27
Avant infection
52,66
1,15
0,07652
Après infection
44
3,60
Avant infection
54,33
2,51
Après infection
37
13,07
Avant infection
54,33
2,51
Après infection
41,66
2,51
Avant infection
55
00
Après infection
42
2,67
Ser71/SMB/212 Avant infection
55
7,81
Après infection
41
00
Avant infection
52,33
3,05
Après infection
46,33
0,57
IL1180
Kot256
Sark103
TG4/09
0,1
0,1
0,0636
0,0636
0,07652
II-2- Discussion
Cette expérimentation ayant pour but de cultiver et comparer le degré de virulence
des six souches de Trypanosoma congolense s’est basée sur une comparaison d’ordre
parasitologique et hématologique entre les lots de souris infectées par ces différentes
souches.
Dans nos conditions expérimentales, la totalité des souches de T. congolense ont
pu se multiplier chez toutes les souris infectées avec une période prépatente et une
31
évolution parasitémique variable en fonction des souches. Ainsi, les périodes prépatentes
des souches Ser71/SMB/212, IL1180, TG4/09 ont été très brèves (un jour). Cependant,
les deux premières souches se distinguent des autres par une évolution rapide, tandis que
TG4/09 se définit par une évolution très lente. En effet, une étude protéomique des
facteurs excrétés/ sécrétés au cours des infections à T. congolense dirigée par Milon et al.
en 2008 a montré que les différentes souches de T. congolense sécrètent différemment
des protéines (sécrétome) qui favorisent leurs multiplications dans l’organisme des
animaux. Quant aux souches Sark103, D27 et Kot256, l’évolution relative de leur
parasitémie a été intermédiaire aux groupes précédents. Ce constat se rapproche à celui
de Authié, (1984) et celui de Sidibe, (1996) qui ont pu montrer qu’il existe une diversité
d’interaction des souches de T. congolense du type savane avec leurs hôtes.
Ensuite, le suivi du taux d’hématocrite révèle que la souche Ser71/SMB/212 a été
celle qui a causé une anémie plus sensible en seulement trois jours (14% de baisse du
taux d’hématocrite). Cependant cette baisse n’est pas corrélée avec l’évolution du poids
des souris concernées car leur poids n’a varié que très faiblement. L’installation de
l’anémie est due à plusieurs formes de cystéines protéase, métabolite des trypanosomes
qui lysent les globules rouges lors des infections (Descamps, 2002). A L’instar de la
souche Ser71/SMB/212, les souches Sark103, Kot256, IL1180, et D27 ont enregistré par
ordre décroissant, d’importantes chutes du taux d’hématocrite. La souche TG4/09 a causé
moins d’anémie (4,5% de baisse du taux d’hématocrite). Parmi tous les lots de souris,
aucune anémie n’a été corrélé avec la variation du poids car le poids n’a varié que très
légèrement. Cela n’a pas été un premier constat car Duvallet et collaborateurs, (1987) ont
également constaté que l’infection des trypanosomes ne provoquait qu’une légère
variation de poids chez certains animaux. De plus Ndoutamia et collaborateurs, (2000)
ont montré que l’infection aux trypanosomes avait des effets modérés sur le poids selon
que l’animal est en pleine croissance et dans de bonne condition alimentaire. En outre au
sein d’un même lot de souris infectées par la même souche de T. congolense, nous avons
constaté une variabilité de baisse importante du taux d’hématocrite entre les souris. Cela
pourrait s’expliquer par le faite les souris utilisées pour l’expérimentation étaient de sexe
et d’âge différent. De plus les souris NMRI sont non consanguines, par conséquent, le
32
système immunitaire des souris NMRI peut développer différemment une défense contre
les Trypanosomes d’une même souche.
Par ailleurs, notre étude n’a pas pu établir une corrélation entre l’anémie et la
parasitémie observée parce que le taux d’hématocrite n’était pas mesuré chaque jour.
Néanmoins, le constat fait au niveau hématologique et parasitologique laisse penser que
la souche Ser71/SMB/212 présente un degré de virulence supérieure.
33
Conclusion et perspectives
Cette étude menée au CIRDES dans le but de cultiver six souches de
Trypanosoma congolense sur des souris NMRI et de caractériser leurs degrés de
virulence a montré une diversité d’interaction entre ces trypanosomes et leurs hôtes. En
effet, ces souches sont capables de se multiplier de façon variable dans l’organisme des
souris NMRI et de faire baisser le taux d’hématocrite de ces souris. En outre ces souches
n’ont pas d’effet significatif sur la variation du poids corporel des souris infectées.
Nonobstant le caractère virulent de toutes ces souches, il ressort enfin de compte que la
souche Ser71/SMB/212 semble être la plus virulente, suivi de la souche IL1180. La
souche TG4/09 serait la moins virulente.
Les souris NMRI sont des animaux de laboratoire chez lesquelles il existe une
variabilité génétique importante. Cette variabilité génétique est susceptible d’influencer
l’étude de la virulence des souches de trypanosomes. Il est donc important de poursuivre
l’étude de la virulence des souches de trypanosomes sur des animaux de laboratoire à
variabilité génétique négligeable vis-à-vis de la virulence, afin de mieux caractériser les
souches de trypanosomes par rapport à leurs virulences.
34
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39
ANNEXE
ANNEXES
Annexe 1 : Tableau d’estimation de la parasitémie (Herbert et Lumsden 1976)
I
TABLE DES MATIERES
SOMMAIRE ....................................................................................................................... i
DÉDICACE ...................................................................................................................... iii
REMERCIEMENTS ....................................................................................................... iv
LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ................................................................. vi
RESUME ......................................................................................................................... vii
ABSTRACT .................................................................................................................... viii
LISTE DES FIGURES .................................................................................................... ix
LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................. x
LISTE DES ANNEXES .................................................................................................... x
INTRODUCTION............................................................................................................. 1
PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre I : La Trypanosomose Animale Africaine ...................................................... 3
I-1- Définition et répartition géographique ................................................................ 3
I-1-1- Définition .......................................................................................................... 3
I-1-2- Répartition géographique ................................................................................. 3
I-2- Importance socio-économique .............................................................................. 4
Chapitre II: Les agents pathogènes ................................................................................. 6
II-1- Définition et taxonomie ........................................................................................ 6
II-1-1- Définition ........................................................................................................ 6
II-1-2- Taxonomie ....................................................................................................... 6
II-2- Morphologie et Cycle de développement ........................................................... 7
II-2-1- Morphologie et structure ................................................................................. 7
II-2-1-1- Morphologie ............................................................................................. 7
II-2-1-2- Structure ................................................................................................... 8
II
II-2-2- Cycle de développement ................................................................................. 9
II-2-2-1- Chez la glossine ....................................................................................... 9
II-2-2-2- Chez l’hôte mammifère.......................................................................... 10
II-3- Virulence et symptômes ..................................................................................... 11
II-3-1- Virulence ....................................................................................................... 11
II-3-2- Symptômes .................................................................................................... 11
II-4- Épidémiologie de la TAA ................................................................................... 13
II-5- Diagnostic ............................................................................................................ 14
II-5-1- Diagnostic clinique ........................................................................................ 14
II-5-2- Diagnostic par des méthodes au laboratoire .................................................. 14
II-5-2-1 Méthodes directes .................................................................................... 14
II-5-2-2- Méthodes indirectes. .............................................................................. 16
II-6- Traitement .......................................................................................................... 18
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
Chapitre I : Matériel et méthodes ................................................................................. 19
I-1- Matériel ................................................................................................................. 19
I-1-1- Matériel de laboratoire.................................................................................... 19
I-1-2- Matériels biologiques ..................................................................................... 20
I-1-2-1- Les souches de T. Congolense ................................................................ 20
I-1-2-2- Les souris NMRI ..................................................................................... 20
I-2- Méthodologie ........................................................................................................ 21
I-2-1- Amplification des souches .............................................................................. 21
I-2-2- Préparation de l’inoculum .............................................................................. 22
I-2-3- infection expérimentale .................................................................................. 22
I-3- Analyse des données ............................................................................................ 26
III
Chapitre II : Résultats et discussion.............................................................................. 27
II-1- Résultats .............................................................................................................. 27
II-1-1- La parasitémie ........................................................................................... 27
II-1-2-Le poids ...................................................................................................... 28
II-1-3- Le Taux d’hématocrite .............................................................................. 29
II-2- Discussion ............................................................................................................ 31
Conclusion et perspectives ............................................................................................. 34
BIBLIOGRAPHIE .......................................................................................................... 35
ANNEXE ............................................................................................................................. I
IV
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