Ministère de l’enseignement supérieur et de la rechercher scientifique Université Telidji Amar – Laghouat Faculté des sciences et de l’ingénieur Département de biologie Complément des cours de microbiologie industrielle destiné aux étudiants de la cinquième année génie biologique Introduction à la microbiologie industrielle Par M. Y. Goudjal 2005 / 2006 Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal -1- MICROBIOLOGIE INDUSTRIELLE. Généralités. Les microorganismes au service de l'homme : Des ouvriers qualifiés mis en œuvre selon des processus génimicrobiologiques, en l’échelle industrielle, afin d’assurer une biosynthèse et/ou une bioconversion. ¾ Domaines d’activité de la microbiologie industrielle – agro-alimentaire (agents de saveurs, émulsifiants, fermentations alcoolique, lactique…) – production d'énergie (éthanol, méthane, hydrogène,…) – production de solvants (acétone, butanol,…) – environnement (bioremédiation des sols pollués, épuration biologique de 'eau, forage pétrolier, extraction de minerais ou biolixiviation,…) – agriculture, horticulture…(vecteur pour la production d’OGM, herbicides, insecticides, hormone végétales - gibbérellines… ) – biologie moléculaire (production d'enzymes de restriction,…) – industrie pharmaceutique (antibiotiques, vitamines, acides aminés, insuline, hormone de croissance, hydrocortisone, interféron beta-1b,…et de nombreux autres produits du groupes des antitumoraux, immunosuppresseurs, anti-inflammatoires,…) ¾ Intérêts de l’utilisation des microorganismes • Coût plus faible que les procédés par voie chimique : – catalyse enzymatique,… • Faisabilité – synthèse et biotransformations (ex : prostaglandines, stéroïdes) de certaines molécules ne peuvent se faire que par voie microbienne – spécificité de la réaction – stéréospécificité … • Sécurité accrue – absence de virus (sida, hépatite B) ou prion ex : cas de transmission de la maladie de Creutzfeldt Jacob par hormones de croissance extraites de l’hypophyse de cadavres contaminés. Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal -2- ¾ Cellule bactérienne : produits microbien d’intérêt industriel • Une fois le micro-organisme recherché obtenu, la formation des produits désirés dépend de la mise en culture du microorganisme. • L'utilisation des micro-organismes en biotechnologie moderne est donc basée sur les principes de la culture en masse. Implique alors : – la gestion des procédés de culture microbienne – la connaissance des facteurs limitants la croissance microbienne. Fig. 01 – Représentation schématique des produits microbiens d’intérêt industriel. Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal -3- 1 – Croissance microbienne. 1.1 – Modélisation de la croissance. —> croissance des populations microbiennes = augmentation de la population microbienne. —> Accroissement du nombre de cellules selon une progression géométrique d'ordre 2 X = biomasse G = temps de génération moyen d'une population. n = nombre de génération t= temps de culture - Expression mathématique de la croissance microbienne Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal -4- • µ = 1/X • dX/dt – correspond donc à la vitesse de croissance rapportée à l'unité de biomasse soit µ = rxt/Xt – rxt = vitesse de croissance au temps t. [unité de biomasse × h-1 × unité de biomasse -1] • µ (h-1) est un paramètre de la culture, il est fonction de la souche bactérienne et des conditions de culture. • En dehors de la phase exponentielle, la vitesse spécifique de croissance varie, traduisant des états physiologiques différents. Le phénomène de croissance cellulaire comporte en effet plusieurs phases. 1.2 – La courbe de croissance microbienne Fig. 02 – Courbe de croissance des microorganismes en milieu non renouvelé. Un milieu de culture est ensemencé par une suspension microbienne, la variation de la biomasse (X) est suivie en fonction du temps. 1.3. Effet de la concentration en substrat • Au cours de la phase exponentielle de croissance, bien que la composition du milieu de culture varie énormément, le taux de croissance µ reste constant. Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal -5- ¾ Effet de la concentration en substrat sur la croissance (µ) – µ est fonction de la concentration en nutriment limitant seulement dans une gamme de concentration très faible. – S = substrat limitant (celui qui règle la vitesse des synthèses et le rythme des divisions). • La connaissance de ces paramètres est indispensable pour mener correctement une culture bactérienne – prédire les cinétiques de production de biomasse (=masse de l'ensemble des cellules bactériennes) – connaître les concentrations minimales en substrat nécessaires à une croissance maximale,… – nécessiter parfois de faire travailler les cellules à des µ spécifiques de la molécule à produire. Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal -6- 2 – Besoins nutritifs. 2.1 – Eléments de constitution. • C, O, H, N, P et S éléments majeurs • Éléments de constitution des molécules biologiques (protéines, glucides, acides nucléiques, …) liés entre eux par des liaisons covalentes. • formule chimique de la biomasse bactérienne : • C5H7O2 NP0,03 • ou encore (C5H7O2N0,75P0,05S0,025) • Besoins nutritifs essentiels en C, N et P = 3 éléments essentiels et nécessaire en grande quantité pour les cellules afin d’assurer la formation de nouvelles structures cellulaires - Formes assimilables des éléments majeurs : C, N, P, S ( Les besoins en O et H sont satisfaits en général avec la source de carbone (ex : glucose = C6H12O6 ), par l ’eau ou la source d ’azote). • Carbone : – Le carbone = besoin fondamental, constituant de base de toute structure organique – Environ 50% de la masse cellulaire sèche = carbone. – Organismes hétérotrophes: besoin en carbone organique : Glucose, Acides aminés, acétate, fructose, lipides, protéines, polysaccharides, glycérol,… – (autotrophes: carbone inorganique : CO2, HCO3-) • Azote : Principalement incorporé sous trois formes: – NH4+ (ammonium) : Forme principale d ’assimilation de l ’azote. Peut aussi l’être sous forme d ’acides aminés. Toutes les bactéries sont en principe capables d ’assimiler l’azote sous cette forme. Mais attention aux effets répresseurs des formes facilement assimilables sur la synthèse d’antibiotiques, d’enzymes… – NO3-, NO2- (nitrate, nitrite) : Concerne un nombre plus restreint de microorganismes. Forme + oxydée donc plus coûteuse à assimiler ( nécessite une dépense d ’électrons pour réduire cette forme en ammonium). Toxicité des nitrites. NO3- + 8e- —> NH4+ – N2 (azote moléculaire) : Assimilation exclusivement connue chez les bactéries. Source inépuisable d ’azote mais très coûteuse en énergie. Concerne des groupes très spécifiques de micro-organismes ( Rhizobium,…). 1/2N2 + 4e- —> NH4+ Demande une énergie d ’activation très élevée. Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal -7- - Besoins en N : environ 14% de la masse cellulaire sèche = azote • Phosphore : essentiellement sous forme de phosphates (PO43-; HPO42 ; H2PO4- ; H3PO4) ou polyphosphates. – Besoins en P : 1 - 3% de la masse cellulaire sèche = phosphore. • Soufre : – Sous forme réduite, —SH ou —S— apporté par les AA soufrés (cystéine et méthionine) et les vitamines soufrés (biotine) = source préférentielle d’assimilation du soufre. – H2S, dans les environnements réducteurs (milieux anaérobies). – SO4-, sulfates. Forme coûteuse en énergie mais la plus abondante. – Besoins en S : < 1% de la masse cellulaire sèche = soufre • Eléments « mineurs » et oligoéléments • Essentiellement des cations, ne sont pas liés aux autres molécules par des liaisons covalentes (l. électrostatiques,…). • K+ (principal cation, cofacteur), Fe2+ (cytochromes), Ca2+ et Mg2+ (thermorésistance, cofacteurs, stabilité membranaire,…), Mn2+, Co2+ (pour vitamine B12), Zn2+, Cu2+, Mo2+, Ni+, … • besoins: – classiquement du ng au mg / L mais les besoins peuvent être spécifiques pour la synthèse d’antibiotiques (10 à 100 fois les besoins en Fe et Mn et Zn requis pour la croissance) • Facteurs de croissance —> Constituants indispensables à la croissance en très faible dose (0,1 - 1 mg/L). Souvent les microorganismes possèdent les voies métaboliques permettant leur synthèse = prototrophes ( ex : Escherichia coli). – Acides aminés essentiels (Glu, Lys, Arg, Trp, Tyr) – Bases puriques et pyrimidiques – Vitamines (en général : cofacteur ou précurseur de cofacteurs enzymatiques). —> Leur présence dans le milieu facilite la croissance des microorganismes prototrophes, elles est indispensable pour les auxotrophes. Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal -8- 2.2. Besoins énergétiques Hétéroorganotrophes : composés organiques = source de carbone et d’énergie - Utilisation de l'énergie cellulaire • Énergie nécessaire à la croissance et aux divisions cellulaires • Énergie d'entretien ou de maintenance : énergie utilisée pour d'autres voies que la production de biomasse. En principe, représente une constante. – mobilité cellulaire – assimilation, transport des nutriments – réparation –… • Énergie nécessaire à la synthèse des protéines recombinantes = énergie détournée, dissociée de la croissance. - Conversions énergétiques • Principe des conversions énergétiques: dégradation des molécules à haut potentiel énergétique couplée avec la production d'adénosine triphosphate (ATP) = catabolisme. • Deux mécanismes de base de production de l'ATP : – phosphorylation au niveau du substrat—> fermentation – phosphorylation oxydative—> respiration Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal -9- 2.2.1 – phosphorylation au niveau du substrat et fermentation - Schéma des fermentations (cellule bactérienne) Métabolisme cerevisiae) anaérobie (ex : fermentation alcoolique Saccharomyces. Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 10 Métabolisme anaérobie (fermentation) et énergie de maintenance 2.2.2. Phosphorylation oxydative et respiration Respiration = processus générant de l'ATP qui implique le transfert d'électrons au travers d'un système de transport d'électrons et de protons. Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - Fig. – Schéma de la respiration cellulaire. - Métabolisme respiratoire (aérobie)(ex : E. coli sur glucose) - 11 Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 12 - Métabolisme aérobie. - Respirations et fermentations • Rendement ATP: fermentations << respirations – A production égale d’ATP, plus de substrat est métabolisé lors des fermentations que lors de la respiration. • Selon les conditions environnementales la respiration ou la fermentation est empruntée. – Levures, E. coli,…possèdent les deux voies – Bacillus,… uniquement fermentation – Pseudomonas : uniquement respiration • (NB : respiration peut être aérobie ou anaérobie, ex. respiration des nitrates) 2.3. Milieux de culture industriels • La bonne formulation du milieu repose sur le choix de la source de carbone, d'azote, de vitamines ou d'oligoéléments, mais surtout leur équilibre. • L'accumulation des produits spécifiques à de nombreuses fermentations est contrôlée par des paramètres nutritifs : concentration en vitamines, la disponibilité en nutriments azotés ou carbonés ou encore par l'état de croissance de la culture,… ce qui impose donc une connaissance parfaite de ces interactions pour optimiser le procédé. • Contraintes légales (interdiction d’utiliser des produits animaux par principe de précaution, flux d’oxygène limités,…) • La matière brute du milieu de culture, par son coût, influence la compétitivité économique du procédé. •… Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 13 - Matières brutes couramment utilisées : • Sources de carbone et d'énergie: – mélasses – petit lait – grains de céréales – déchets agricoles,… • Sources d'azote – farine de soja – déchets d'abattoir – vinasses – ammoniaque et sels d'ammoniaque,… • Vitamines – préparations brutes de produits végétaux et animaux,… • Fer et oligoéléments – dérivés chimiques inorganiques bruts,… • Antimousses – alcools supérieurs – silicones – esters naturels – saindoux et huiles végétales,… • Tampons de pH – craie, carbonates bruts – phosphates pour engrais 2.4. Environnement physique Contrôle précis : • de l'agitation • de l'oxygénation – critique en culture aérobie, tenir compte des coefficients de transferts gaz, liquide, de la viscosité du milieu (milieu visqueux souvent observé en croissance mycélienne,…) – croissance floconneuse des mycètes qui modifie l'efficacité du transfert • de la température • du pH Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 14 3. Production des métabolites et molécules d’intérêt 3.1. Métabolites primaires et métabolites secondaires. • Les produits microbiens qui intéressent l'industrie sont : – des métabolites primaires : associés à la synthèse des cellules microbiennes. Ils sont impliqués dans la phase de croissance (AA, nucléotides, produits de fermentation, enzymes,…). Les voies de biosynthèse sont en général simples. – des métabolites secondaires : ne sont pas indispensables au développement de l’organisme. Synthétisés dans des conditions particulières, s'accumulent pendant la période suivant la phase de croissance active et n'ont pas de relation directe avec la synthèse des matières cellulaires et la croissance normale (antibiotiques et toxines). Voies de biosynthèse complexes et longues. Spécifique à une espèce voire à une souche microbienne. - Production des métabolites primaires et secondaires au cours de la croissance Fig. – production de métabolites primaires et secondaires au cours de la croissance. Les phases de la croissance doivent donc être parfaitement maîtrisées pour optimiser la production des métabolites d'intérêt. 3.2. Stratégie globale de production • Produits associés à la production d’énergie : – Conditions optimales : celles qui vont conduire à la production maximale du produit recherché associé à une production faible de biomasse = conversion optimale de la source de carbone en produit. Ex : produits de fermentation. Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 15 • Produits associés à la biomasse : rechercher les conditions de production maximale de cellules. • Produits inductibles (protéines recombinantes) : leur production est dépendante de l’induction du gène correspondant (fusionné avec un promoteur inductible : tac, Trp,…). 3. Principales familles de produits en microbiologie industrielle. 3.1. Métabolites primaires 3.1.1. Acides aminées : à l’aide de mutants dérégulés – Cas général : produits par perturbation des systèmes de production : accumulation intracellulaire. L'intérêt de production par voie bactérienne est la stéréospécificité de l'AA obtenu (on obtient uniquement des acides aminés L). – Acide glutamique : formé par amination de l’acide. cétoglutarique (αKG) (du cycle de Krebs) avec utilisation de C. glutamicum, fermentation en présence d'un excès de NH3, la souche a perdu la capacité à former le succinate à partir de l’αKG ; en outre, carence en biotine et ajout d'AG permettent d'augmenter la perméabilité membranaire. – Synthèse ou bioconversion d’AA essentiels ou non : Asp, Ala, Arg, Citrulline, Cys, DOPA (dihydrophénylalanine, par Erwinia herbocola), Gln, His, ornithine, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Val, Tyr, Ile, Leu. 3.1.2. Vitamines : Produits souvent intracellulaires. • Vitamine B12 (cyanocobalamine), seule source de production par culture microbienne (Streptomyces olivaceus, Propionobacterium shermanii, P. denitrificans). • Vitamine B2 (riboflavine) par Ashbya gossypii & Eremothecium ashbyi). • ß-carotène précurseur vitamine A, par Blakeslea trispora,… • Ergosterol, a-tocophérol (vit. A), acide ascorbique (vit. C)… 3.1.3. Polysaccharides • Production spécifique par des microorganismes dont le polymère est extrait. Peut nécessiter la culture en conditions spécifiques (induction de la synthèse par carence d’un élément, par culture anaérobie, en phase stationnaire,…). • Xanthane, alginate, PHB polyhydroxybutyrate (dans les plastiques biodégradables), caraghénanes et agar (algues rouges), cellulose, chitosane, dextrane, gellane, pullulane,… Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 16 3.1.4.Divers • Acides organiques : ac. Acetiques (anaerobie, Clostridium thermoaceticum: 35 g/L, fed-batch), ac. Citrique ( Aspergillus niger,…), ac. Lactique, ac. Gluconique,… • Alcools et solvants : acétone ( dihydroxyacétone, polyols, butanol, éthanol,… Clostridium acetobutylicum), • Carburant : éthanol (80% de la production mondiale est produite par fermentation, à partir de cellulose, glucose, amidon), méthane (par décomposition anaérobie de la matière organique) et d’autres hydrocarbures. • Lipides (sphingolipides: cosmétologie,…) 3.2. Métabolites secondaires 3.2.1. Antibiotiques • Produits en particulier par les actinomycètes ( Streptomyces) et par des mycètes filamenteux. • Avec souvent des souches améliorées par mutation ou génie génétique (transfert du gène de résistance à l'AB permettant une hyperproduction sans inhibition). • La production a lieu au cours de la phase stationnaire de croissance, excepté pour les tétracyclines. • + concentrations en sels minéraux (Fe, Mn, Zn) 10 à 100 X supérieures à celles requises pour la croissance. • point crucial : contrôle du milieu. • Les conditions optimales requises pour la production des antibiotiques ne sont pas nécessairement identiques à celles permettant une bonne croissance ! • Exemple de la pénicilline : La production de pénicilline par Penicillum chrysogenum nécessite un ajustement soigneux de la composition du milieu, de l’air et de l’agitation. En présence de lactose ou d’amidon et avec limitation en azote, la pénicilline s'accumule. Le maintien du pH proche de la neutralité assure plus de stabilité à l'antibiotique. Une source facilement assimilable de carbone exerce une action négative sur la biosynthèse. Avec le glucose les rendements en antibiotiques sont faibles. C'est néanmoins possible en réacteur de type fed-batch avec un contrôle fin de la concentration en glucose. Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 17 3.2.2. Produits pharmacologiquement actifs, pesticides,… • Alcaloïdes • Analgésiques • Anti-inflammatoires • Antitumoraux • Immunodépresseurs • Toxines (toxine botulique,…) •… • Pesticides : nématicides, fongicides, insecticides (protoxine par Bacillus thuringiensis),… 3.3. Enzymes • Endo ou exocellulaires. Les exoenzymes seront plus faciles à extraire… • Leur synthèse est souvent inductible par le substrat, sensible au pH, les sources de carbone et/ou d’azote peuvent influer sur leur synthèse. – Une bonne connaissance des conditions de production est donc nécessaire pour une production optimale. • Recherche des souches ou production de mutants permettant une production maximale de l’enzyme recherchée (absence de répression dans leur synthèse,…), associée à une production minimale de sous produits (toxines, antibiotiques, pigments, protéases,…). • Applications : analyses, agro-alimentaire, synthèses, génie génétique, industries diverses, domaine de la santé… Ex : catalase 3.4. Biotransformations • = réaction chimique catalysée par une enzyme (la réaction correspondante par voie abiotique est souvent impossible ou difficile). • Concerne la synthèse d’acides aminés, d’antibiotiques, de vitamines, d’hormones (stéroïdes), de prostaglandines. • Très souvent il s'agit de simple bioconversion à partir d'un composé naturel ou obtenu par synthèse chimique. Ex: biotransformation de bases purique et de thymidine en ribothymine (5méthyluridine), procédé à l’origine de l’AZT (3’azido-3’ désoxythimidine) par Erwinia carotovora. 4. Production de molécules étrangères par des cellules transformées L’utilisation de micro-organismes transformés permet de produire des substances thérapeutiques jusqu’alors impossibles à synthétiser : – hormone de croissance humaine ou bovine par E. coli Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 18 – Insuline humaine par E. coli – Interférons humains par E. coliet B. subtilis – Stéroides : hydrocortisone récemment obtenu par utilisation d'un panel de souches de levures transformées (Ménard Szczebara, Chandelier et al. , 2003, Nature Biotechnol.) et à partir de glucose. – Leptine (hormone protéique associée à l’obésité) par E. coli –… 4.1. Cellules transformées • Principe général : clonage d’un gène d’une protéine désirée dans un plasmide multicopies sous contrôle d’un promoteur fortement inductible (ex promoteur de l’opéron lactose, trp,…). • Objectifs : – Produire une grande quantité de protéines, – Pouvoir déclencher la synthèse au moment voulu (ex. : selon la phase de croissance, température donnée,…). Fig. – Etapes d’obtention de cellules transformées Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 19 • Contraintes: - Extraction/Sécrétion : les protéines se trouvent généralement sous forme de corps d’inclusion (agrégat de protéines). Forcer la sécrétion en greffant une séquence signale spécifique de protéine extracellulaire. - Protéolyse : greffer une séquence protéique reconnue par la cellule pour éviter la protéolyse par le système de reconnaissance de la cellule. - Purification - Pas de modification post-traductionnelles (pas de maturation de l'ARNm), - Solubilisation, renaturation. La production d’une grande quantité de protéines est possible. Mais elle est généralement associée à une faible croissance, le stress provoqué conduit très rapidement à un arrêt de la croissance Une croissance sous forme filamenteuse des cellules peut alors se produire, traduisant une inhibition de la segmentation. Cette absence de segmentation est liée à une sous-expression des gènes impliqués dans la division cellulaire. Exemple : E. coli transformée pour produire l’IGF-I (insuline like) Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 20 5 – Conduite des bioréacteurs 5.1. Bioréacteurs - Définition : un bioréacteur est une enceintes permettant la culture de tout type de cellules (animale, végétale, levures, moisissure, bactéries) et répondant à des critères de conception permettant d'influer efficacement sur la culture, de contrôler et piloter les paramètres physiques et chimiques (T°C, aération, pH, substrats,…). Ils doivent permettrent une stérilisation facile et un maintien de l'asepsie pendant toute la durée de la culture. Et être caractérisés par une résistance mécanique et chimique aux contraintes liées à la culture de microorganismes : surpression, corrosion,… • Matériel en verre (vol. <10 L). • matériel en inox (Vol. de 2L à 100 000 L). Fig. – Représentation schématique d’un bioréacteur. Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 21 Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 22 5.2.Culture discontinue ("batch") ou « fermé » • Inoculum + milieu et on laisse se dérouler la culture dans un fermenteur parfaitement mélangé. • Le volume reste donc constant. • La biomasse augmente selon la courbe de croissance microbienne. • Le substrat S est consommé et le produit P attendu apparaît. Tous les composés se trouvent dans le milieu de culture au départ, on n'intervient plus sur la composition du milieu. Fig. – Paramètres d’un bioréacteur . - Fermentation discontinue ("batch") L'évolution de la biomasse suit la relation : Rx= vitesse de croissance cellulaire Productivité souvent faible (quantité de produit L-1 h-1), elle dépend surtout de la taille de l'inoculum, qui souvent est faible, et conduit à des phases de latence longues. Le démarrage de la culture, associé au temps nécessaire à la remise en service du réacteur (lavage, stérilisation,…) est donc souvent le facteur limitant. Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 23 5.3. Fermentation discontinue alimentée ("fed batch") • La fermentation est initiée dans un plus faible volume (pied de cuve). Donc pour une même taille d'inoculum, la fermentation va démarrer plus vite. • Lorsque la culture est en phase exponentielle de croissance, le milieu stérile est introduit dans la cuve. Le débit est réglé de sorte à ce que, par exemple, [X] ou [S] soit constant dans la cuve Fig. – Représentation schématique d’un fermenteur alimenté discontinu (fed batch) • Lorsque la cuve est remplie, on coupe l'alimentation, la culture évolue alors conformément à la courbe de croissance discontinue. • Technique très utilisée en pratique: – gain de temps et de productivité – possibilité de travailler à µ max. – possibilité de modifier la composition du milieu durant l'opération. - Permet d'orienter si nécessaire le métabolisme de la souche et de stimuler la production de métabolites après avoir favorisé la croissance. – possibilité d'augmenter la concentration en substrat à des valeurs qui seraient inhibitrices si on devait les appliquer en batch en début de croissance. – ex; utilisation de glucose pour la production de pénicilline théoriquement inhibiteur à de fortes concentrations). Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 24 5.4. Fermentation continue (en réacteur parfaitement mélangé) • La suspension microbienne est homogène en tout point de la cuve. • Initiation par une phase de croissance discontinue. • Ouverture des pompes, • Lorsque le système est à l'équilibre, tous les paramètres sont constants. • Le débit Q, dont dépend D, détermine µ et X (densité bactérienne) selon les relations qui relient µ à S et µ à X. Fig. – Représentation schématique d’un fermenteur en continu. D = taux de dilution, soit le taux auquel est ajouté le milieu par unité de temps = Q/V (t-1). - Modélisation mathématique de la croissance en chémostat (réacteur continu) : A l'état stable (équilibre), dX/dt = 0 et donc µ = D. Qté de cellules produites = qté de cellules perdues Si µ > D —> X Si µ < D —> X Le chémostat ne peut pas fonctionner pour D > µ max. Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 25 A l'équilibre, quel est l'effet d'une augmentation du débit (Q) sur µ et sur la biomasse [X] ? Fig. – Effet de l’augmentation du débit sur la biomasse. Le taux de perte en biomasse entraîne un ajustement du taux de croissance pour retourner à un équilibre. - Variations de S et X en fonction de D Cours de Microbiologie industrielle réalisé par Y. Goudjal - - 26 5.4. Fermentation continue • Productivité en biomasse est plus élevée qu'en discontinue ou semidiscontinu (volume utile de la cuve mieux utilisé, cuve n'est pas vidée, nettoyée, stérilisé…) • Problèmes de contamination d'un tel système difficile à maintenir, biofilms, mutations,… • Outil intéressant pour l'étude des cinétiques microbiennes – calcul de µ max et des Ks. – effet de la modification du milieu sur la physiologie et sur la suspension bactérienne. – possibilité de maintenir la culture à un µ donné – le débit et la concentration en nutriments fixent la vitesse spécifique de croissance. 5.5. Autres systèmes : – Réacteur flux piston – Culture avec recyclage – Systèmes immobilisés,…
