FACULTE DE MEDECINE DENTAIRE DE RABAT CENTRE D’ETUDES DOCTORALES DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE THESE N° : 28/14 CSVS THESE DE DOCTORAT EVALUATION DE L’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE D'HUILES ESSENTIELLES MAROCAINES SUR AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS : ETUDE IN VITRO Formation doctorale : Sciences Odontologiques Equipe de Recherche en Ecosystème buccal Présentée et soutenue par : Leila LAKHDAR Le 24 Février 2015 JURY Professeur Sana RIDA Président Faculté de Médecine Dentaire de Rabat Université Mohammed V Professeur Oumkeltoum Ennibi Directeur de Thèse Faculté de Médecine Dentaire de Rabat Université Mohammed V Professeur El khanchoufi Abdessalam Rapporteur Faculté des sciences de Fès Université Sidi Mohamed Ben Abdellah Professeur Driss Benazza Rapporteur Faculté de Médecine Dentaire de Rabat Université Mohammed V Professeur Mimoun Zouhdi Rapporteur Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat Université Mohammed V Professeur Abdellah Farah Faculté des sciences de Fès Université Sidi Mohamed Ben Abdellah Examinateur Dr LAKHDAR L. Dr LAKHDAR L. Je dédie cette thèse Aux êtres les plus chers : Mes parents, A mon père, Mon plus haut exemple et mon modèle de persévérance pour aller toujours de l’avant et ne jamais baisser les bras. Pour son enseignement continu à m’inculquer les vraies valeurs de la vie et pour ses précieux conseils. J’espère que cette thèse sera à la hauteur de tes attentes et qu’elle soit l’accomplissement de tous tes efforts. A ma mère, Pour son affection, sa patience, sa compréhension, sa disponibilité, son écoute permanente et son soutien sans égal dans les moments les plus difficiles de ma vie. Là où je suis arrivée aujourd’hui c’est à vous MES CHERS PARENTS que je le dois, que Dieu vous garde. A mes chers frères : Rachid, Fayçal et Youssef pour vous exprimer toute mon affection et ma tendresse A ma tendre et chère belle-sœur : Yasmina pour sa bonté, sa générosité de cœur et son aide si précieuse qui a rendu possible la soutenance de ce mémoire A ma grande famille, mes amis et collègues et tous ceux et toutes celles que j’ai involontairement omis de citer et qui n’en demeurent pas moins chers Dr LAKHDAR L. Je tiens à exprimer mes vifs remerciements à : Madame le Doyen de la Faculté de Médecine Dentaire de Rabat, le Professeur Sana Rida, pour sa générosité et les nombreuses facilités qu’elle n’a cessé d’accorder ainsi que son grand soutien pour l’accomplissement de ce travail. Je la remercie également pour la bienveillante attention qu’elle a accordée à ce travail et sa participation à ce jury. Monsieur le Professeur Jamal Taoufik, Vice Doyen de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat, Directeur du Centre d’Etudes Doctorales des sciences de la vie et de la santé pour son encouragement permanent, sa disponibilité et ses précieux conseils. Madame le Professeur Oumkeltoum Ennibi, Chef de service de Parodontologie, à la Faculté de Médecine Dentaire et Directrice de ma thèse, pour toute l’attention, la générosité de cœur, l’amabilité, la disponibilité, l’encouragement continu, le soutien sans égal et la supervision constante dont elle a fait preuve durant tout mon cursus doctoral, ainsi que pour sa grande contribution à faciliter toutes les étapes de ma formation et de la réalisation de ce travail. Veuillez trouver ici le témoignage de toute ma gratitude, ma profonde reconnaissance et ma grande estime. Dr LAKHDAR L. Monsieur le Professeur Abdellah Farah, de l’Institut National des Plantes Aromatiques et Médicinales de Taounate sans lequel ce travail ne pouvait avoir lieu. Je tiens à lui témoigner toute ma gratitude pour sa précieuse collaboration et contribution dans la réussite de ce travail, sa gentillesse, sa disponibilité et son support permanent. Je le remercie également d’avoir bien voulu accepter de participer au jury de cette thèse. Monsieur le Professeur Abdessalam El Khanchoufi, Directeur de l’Institut National des Plantes Aromatiques et Médicinales de Taounate, pour la bienveillante attention qu’il a accordée à ce travail et d’avoir bien voulu accepter de siéger dans ce jury. Monsieur le Professeur et cher maître Driss Benazza, du Service de Parodontologie du CCTD de Rabat et de la Faculté de Médecine Dentaire de Rabat, pour sa gentillesse, sa bienveillance et son amabilité à bien vouloir accepter de juger ce travail. Ce travail a été réalisé au sein de plusieurs unités de recherche : laboratoire de microbiologie de la faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat, laboratoire de Microbiologie de l’hôpital Avicenne de Rabat, laboratoire de Bactériologie et laboratoire de Recherche et Biosécurité P3 de l’Hôpital militaire et d’instruction Mohammed V de Rabat. Par conséquent, je tiens à remercier profondèment : Monsieur le Professeur Mimoun Zouhdi, Chef de Service du laboratoire de Microbiologie de l’hôpital Avicenne de Rabat et responsable du laboratoire de microbiologie de la faculté de Médecine et de Pharmacie Dr LAKHDAR L. de Rabat, pour son amabilité et sa gentillesse d’avoir accepté de m’accueillir au sein de son laboratoire et son support permanent pour la réalisation de ce travail. Je le remercie également d’avoir bien voulu accepter de siéger dans ce jury. Monsieur le Professeur Idriss Lahlou Amine, Chef de Service du laboratoire de Recherche et Biosécurité P3 de l’Hôpital militaire et d’instruction Mohammed V de Rabat, pour sa courtoisie, sa générosité, son empathie et son accueil chaleureux au sein de son laboratoire pour l’accomplissement de mes travaux de recherche. Veuillez trouver ici l’expression de mes sincères remerciements et mon profond respect. Monsieur le Professeur Larbi Sahim, du laboratoire de microbiologie de la faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat, pour sa gentillesse, son aide et ses précieux conseils, sa généreuse contribution à ma formation initiale en microbiologie et à l’acquisition des bases scientifiques théoriques et pratiques dans ce domaine. Veuillez trouver ici le témoignage de ma profonde reconnaissance et ma gratitude. Monsieur le Docteur Tahar Bajjou, du laboratoire de Recherche et Biosécurité P3 de l’Hôpital militaire et d’instruction Mohammed V de Rabat, sans lequel ce travail ne pouvait aboutir. Je tiens à lui exprimer mes sincères remerciements pour son amabilité, sa participation active et son aide précieuse pour la réalisation de toutes les étapes pratiques de mon travail. Je tiens à témoigner toute ma reconnaissance à tous les membres et toute l’équipe des laboratoires au sein desquels j’ai travaillé et qui m’on aidé à accomplir et mener à bien ce travail ; je cite Docteur Maamer Yaacoubi, Dr LAKHDAR L. Docteur Hicham Rhaffouli, Professeur Laraqui Abdelilah, Docteur Farida Hilali. Je tiens à remercier profondèment ma chère collègue Professeur Amal Bouziane pour sa disponibilité, sa gentillesse et son aide précieuse qu’elle a apporté à ce travail, par la réalisation des calculs statistiques qui m’ont aidé à interpréter les résultats obtenus et finaliser ce mémoire. Je remercie très sincèrement mes maîtres et collègues du Service de Parodontologie pour leur compréhension, leur patience et leur encouragement continu à mon égard tout au long de mon cursus doctoral. Enfin, pour tous ceux et toutes celles qui ont contribué de près ou de loin à l’élaboration de ce travail, qu’ils trouvent ici l’expression de mes sincères remerciements. Dr LAKHDAR L. SOMMAIRE Dr LAKHDAR L. LISTE DES ABREVIATIONS…………………………………………………………………………………………………I LISTE DES TABLEAUX………………………………………………………………………………………………….……III LISTE DES FIGURES……………………………………………………………………………………………………………IV INTRODUCTION GENERALE………………………………………………………………………………………………..1 PREMIERE PARTIE : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE CHAPITRE I : LES PLANTES MEDICINALES ET AROMATIQUES………………………………………………6 1. Terminologie…………………………………………………………………………………………………..……………6 2. Historique………………………………………………………………………………………………………………….…6 3 . Les plantes médicinales et aromatiques à visée thérapeutique au Maroc……………………..7 CHAPITRE II : LES HUILES ESSENTIELLES…………………………………………………….………………………26 1. Définition…………………………………………………………………………………………………….………….…26 2. Répartition des huiles essentielles dans la plante…………………………………………………..….26 3. Caractéristiques physico-chimiques des huiles essentielle……………………...…………………27 4. Contrôle de qualité………………………………………………………………………………….………………..29 5. Procédés d’extraction des huiles essentielles…………………………………………………………….29 5.1 Extraction par expression à froid………………………………………………………………………….29 5.2 Extraction par distillation et entraînement à la vapeur d’eau……………………………….30 5.3 Hydrodistillation ou distillation à l’eau…………………………………………………………………30 5.4 L’enfleurage…………………………………………………………………………………………………………30 5.5 Extraction par les solvants organiques………………………………………………………………….31 5.6 Extraction par le CO2……………………………………………………………………………………………31 6. Composition chimique des huiles essentielles…………..……………………………………………….32 7. Méthodes d’analyse des huiles essentielles……………………………………….………………………37 8. Toxicité des huiles essentielles ……………………..…………..……………………………………………..39 9. Activité antimicrobienne des huiles essentielles………………………………………..……………..40 9.1 Activité bactéricide et bactériostatique……………………………………………………………….40 9. 2 Facteurs influençant l’activité antimicrobienne des huiles essentielles….………….…41 9.2.1 Activité liée à la composition chimique…..…………………………………….………………………41 Dr LAKHDAR L. 9.2.2 Activité liée au microorganisme ………..……………………………………..………………………...42 9. 3 Méthodes de détermination de l’activité antimicrobienne des huiles essentielles in vitro ………………………………………………………………………………………………………………………….42 9.3.1 Techniques de screening des huiles essentielles…………………………………...……43 9.3.1.1 Aromatogramme………………………………………………..…………………….43 9.3.1.2 Technique de diffusion en puits……………………………………………………..44 9.3.2 Techniques de détermination de la CMI des huiles essentielles……………………..44 9.3.2.1Techniques de diffusion en milieu solide…………………………………………………44 9.3.2.2 Techniques de diffusion en milieu liquide……………………………………………….45 9.3.2. 3 Techniques de diffusion en phase vapeur……………………………………………….45 Conclusions du chapitre………………..………………………………………………………………………….46 CHAPITRE III : AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS……………………………………47 1. Taxonomie……………………………………………………………………………………………………………47 2. Caractéristiques culturales et morphologiques………………………………………..……………..48 3. Caractéristiques phénotypiques………………………………………………………………………………50 4. Pathogénie……………………………………………………………………………………………………………..50 4.1 Implications dans les parodontites agressives…………………………………………………….52 4.1.1 Facteurs de virulence…………………………………………………………………….…………………52 4.1.2 Transmission intrafamiliale………………………………………………………………..…………….54 4.2 Implication dans les infections extraorales………………………………………………………….55 5. Epidémiologie………………………………………………………………………………………………………….55 6. Traitement………………………………………………………………………………………………………………56 Conclusions du chapitre…………………………………………………………………………………………………..57 CHAPITRE IV : ETUDE SYSTEMATIQUE SUR L’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DES HUILES ESSENTIELLES SUR A. ACTINOMYCETEMCOMITANS.………………………………………………………..59 Introduction……………………………………………………………………………………………………………………59 Matériel et méthodes …………………………………………………………………………………………………….59 Résultats…………………………………………………………………………………………………………………………60 Dr LAKHDAR L. Discussion……………………………………………………………………………………………………………………….63 Conclusions …………………………………………………………………………………………………………………….65 CONCLUSIONS DE LA 1ère PARTE………………………………………………………………………………………66 DEUXIEME PARTIE : ETUDE IN VITRO CHAPITRE I : ISOLEMENT D’UNE SOUCHE CLINIQUE D’AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS………………………………………………………………………………….………68 Introduction…………………………………………………………………………………………………………………….68 Matériels et méthodes…………………………………………………………………………………………………….68 Résultats…………………………………………………………………………………………………………………………72 Discussion……………………………………………………………………………………………………………………….75 Conclusions ………………………………..………………………………………………………………………………….76 CHAPITRE II : RECHERCHE DE L’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE D’HUILES ESSENTIELLES MAROCAINES SUR AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS……………………….…….77 Introduction…………………………………………………………………………………………………………………….77 Matériels et méthodes…………………………………………………………………………………………………….78 Résultats…………………………………………………………………………………………………………………………95 Discussion……………………………………………………………………………………………………………………..112 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES……………………………………………………………………………………122 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………..………………………………………….……………….125 RESUME…………………………………………………………………………………………………………………………163 Dr LAKHDAR L. LISTE DES ABREVIATIONS Aa : Aggregatibacter actinomecetemcomitans OMS : Organisation Mondiale de la Santé PAM : Plantes Aromatiques Médicinales AFNOR : Association Française de Normalisation HEBBD : Huile Essentielle Botaniquement et Biochimiquement Définie CT : Chémotype ou chimiotype CO2 : Dioxyde de carbone C5 : 5 atomes de carbone CCM : Chromatographie sur Couche Mince CPG : Chromatographie en Phase Gazeuse GPC/SM : Chromatographie en Phase Gazeuse couplée à la spectrométrie de masse CLHP : Chromatographie Liquide à Haute Performance RMN : Résonnance Magnétique Nucléaire CMI : Concentration Minimale Inhibitrice CMB : Concentration Minimale Bactéricide TTC : Triphényl Tétrazolium Chloride TSBV : Tryptic soy-serum-bacitracin-vancomycine TCD: Toxine Cytolétale de Distension HACEK: groupe de bactéries incluant: Haemophilus, Agregatibacter actinomycetemcommitens, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens et Kingella kingae. LPS : Lipopolysaccharides II IL-1 : Interleukine 1 TNF : Tumor Necrosis Factor PGE-2 : Prostaglandine I Dr LAKHDAR L. ARN : Acide Ribonucléique ADN : Acide Désoxyribonucléique HE : Huile Essentielle CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards BHIA: Brain Heart Infusion Agar IR: Indice de Rétention III II Dr LAKHDAR L. LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : les différentes enquêtes réalisées au Maroc sur les Plantes Aromatiques et Médicinales (PAM) et leur usage populaire Tableau 2 : Etudes in vitro montrant l’activité antimicrobienne (CMI/CMB) des huiles essentielles sur A.actinomycetemcomitans Tableau 3 : Huiles essentielles Marocaines testées et leurs propriétés médicinales Tableau 4 : Composition chimique de Mentha pulegium L. huile essentielle Tableau 5 : Composition chimique de Cymbopogon citratus huile essentielle Tableau 6 : Composition chimique de Citrus aurantium huile essentielle Tableau 7 : Composition chimique de Thymus vulgaris huile essentielle Tableau 8 : Composition chimique de l’Origanum compactum huile essentielle Tableau 9 : Composition chimique de Cymbopogon martinii huile essentielle Tableau 10 : Diamètres d’inhibition (mm) obtenus par la méthode de diffusion en puits Tableau 11: Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) et Concentrations Minimales Bactéricides (CMB) (%) (v/v) des huiles essentielles testées sur les 2 souches de A. actinomycetemcomitans (JP2 et non-JP2) Tableau 12: Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) et Concentrations Minimales Bactéricides (CMB) (%) (v/v) des huiles essentielles testées obtenues selon le type de souche de A. actinomycetemcomitans (JP2 et non-JP2) III Dr LAKHDAR L. LISTE DES FIGURES Fig 1 : Structure de l’isoprène (C5H8) Fig 2 : Structure chimique de certains composés des huiles essentielles Fig 3 : Isolement de A.actinomycetemcomitans sur milieu sélectif (Dentaid 1) ((Laboratoire de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V, Souissi, Rabat) Fig 4: Aspect en coccobacilles en miccrographie électronique à balayage Fig 5: Aspect en microscopie optique après coloration de Gram (Service de Bactériologie, Hôpital Militaire Mohammed V, Rabat) Fig 6: Aspect des colonies sur gélose au sang cuit (Laboratoire de Recherche et Biosécurité (P3), Hôpital Militaire Mohammed V), Rabat Fig 7: Aspect des colonies de A.actinomycetemcomitans avec motif opaque au centre lors de la 1ère mise en culture sur gélose au sang cuit (Laboratoire de Recherche et Biosécurité (P3), Hôpital Militaire Mohammed V, Rabat) Fig 8: Aspect des colonies avec un motif opaque au centre: A: en forme d’étoile sur colonie lisse, B: en forme circulaire ou ellipsoïdale sur colonie rugueuse Fig 9 : Illustration de la délétion du fragment d’ADN 530 pb dans la région promotrice de l'opéron (ltx) concernant la souche de Aa clone JP2 entraînant un raccourcissement du fragment en comparaison avec celui d’une souche de Aa non-JP2 Fig 10: milieu de culture sélectif pour Aa (Dentaid 1) (Laboratoire de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V, Souissi, Rabat) Fig 11: hotte pour l’asepsie (Laboratoire de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V, Souissi, Rabat) Fig 12: prélèvement sous-gingival à l’aide d’un cône en papier (Centre de Consultation et de Traitement dentaire (CCTD) de Rabat, CH Ibn Sina, Rabat) Fig 13: échantillon de biofilm parodontal sous-gingival dans le milieu de transport (Centre de Consultation et de Traitement dentaire (CCTD) de Rabat, CH Ibn Sina, Rabat) Fig 14: prélèvement mixé au vortex (Laboratoire de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V, Souissi, Rabat) IV Dr LAKHDAR L. Fig 15 : milieu sélectif ensemensé mis dans une jarre anaérobie (Laboratoire de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V, Souissi, Rabat) Fig 16 : souche de référence lyophylisée de Aa : HK 1605 V Fig 17: résultat après 5j d’incubation : a: image des colonies sur toute la gélose, b: image agrandie des colonies (Laboratoire de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V, Souissi, Rabat) Fig 18: Eau oxygénée et disques d’oxydase pour identification biochimique du Aa Fig 19: test de catalase positif : apparition de bulles de gaz Fig 20 : test d’oxydase négatif : colonie déposée sur le disque n’a entraîné aucun changement de couleur Fig 21 : Aspect des colonies en coccobacilles au Microscope optique (Laboratoire de Bactériologie, Hôpital militaire d’instruction Mohammed V, Souissi, Rabat) Fig 22 : Menthe pouliot Fig 23 : Bigaradier Fig 24 : Citronnelle Fig 25 : Thym Fig 26 : Origan Fig 27 : Palmarosa Fig 28 : Souche marocaine Aa isolat clinique lyophilisée Fig 29: Souche Aa de référence ; sérotype b, clone non-JP2 de l’Institut Pasteur, Paris, France Fig 30 : Générateur de CO2 à 5% Fig 31 : Jarre anaérobie Fig 32 : Etuve (Laboratoire de Recherche et Biosécurité P3- Hôpital militaire et d’instruction Mohammed V, Rabat) Fig 33 : Cryotubes à billes pour conservation de souches Fig 34 : Géloses Brain Heart Infusion (BHI) Agar coulées dans des boîtes de pétri (Laboratoire de Bactériologie- Hôpital militaire et d’instruction Mohammed V Fig 35 : Gélose au sang cuit ou chocolat Polyvitex (Oxoid Deutschland Gmbh, Postfach, Wesel) V Dr LAKHDAR L. Fig 36 : Bouillon nutritif préparé à base de Brain Heart Infusion (BHI) et extrait de levure (Laboratoire de Recherche et Biosécurité P3- Hôpital militaire et d’instruction Mohammed V, Rabat) Fig 37 : Aspect des colonies de Aa isolat clinique après 48h de mise en culture VI Fig 38 : Aspect des colonies de Aa référence après 48h de mise en culture Fig 39 : Antibiotique (Doxycycline) en disque de 30 µg Fig 40 : Aspect des colonies de Aa après 24h de mise en culture (à partir de billes conservées à -20°C) Fig 41 : Solution de Nacl pour préparation de suspension bactérienne et étalon de 0,5 Mc Farland Fig 42 : Gélose de sang cuit ensemencée par inondation d’inoculum bactérien avec un puits creusé au centre Fig 43 : microplaque à 96 puits utilisée dans la méthode de microdilution Fig 44 : Colonies de Aa après 48h de mise en culture (à partir de billes conservées à -20°C) Fig 45 : Essai de microdilution pour la détermination de la CMI de l’Amoxicilline testé à différentes concentrations (0,01mg/ml, 0,1mg/ml, 1mg/ml, 10mg/ml) (la solution restant claire (à gauche) est considérée comme la CMI à 10mg/ml) Fig 46 : Distribution expérimentale de la microplaque pour chaque huile testée pour la détermination de la CMI Fig 47 : Mise en incubation des microplaques pour la détermination des CMI des huiles testées : a: les microplaques mises dans un sachet sous 5% de CO2, b : Le sachet contenant les microplaques est mis à l’étuve à 37°C Fig 48 : Triphényl Tétrazolium Chlorid (TTC) (Laboratoire de de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, UM5S- Rabat. Fig 49 : changement de couleur au niveau des puits de la microplaque en présence d’activité bactérienne sous l’effet de la solution TTC Fig 50 : Zone d’inhibition de croissance bactérienne produite par l’huile essentielle (dans le puits) après 48h d’incubation Fig 51 : Zone d’inhibition de croissance bactérienne produite par la Doxycycline (disque au centre de la gélose) après 48h d’incubation Fig 52 : Absence de zone d’inhibition de croissance bactérienne pour les contrôles négatifs (Tween 80 pur et dilué à 10% dans le puits) après 48h d’incubation VI Dr LAKHDAR L. Fig 53 : Témoin de croissance bactérienne après 48h d’incubation (film bactérien recouvrant la gélose) Fig 54 : Diamètres des zones d’inhibition (DZI) des différents agents testés (huiles essentielles HE pures, HE 1/10, Doxycycline et Tween 80 (10%)) pour les 2 souches de A. actinomycetemcomitans (isolat clinique JP2 et souche de référence non-JP2) VII Fig 55 : Résultats sur microplaque montrant les différentes dilutions testées de l’huile essentielle de Mentha pulegium pour le calcul de la CMI Fig 56 : Résultats sur microplaque montrant les différentes dilutions testées de l’huile essentielle de Citrus aurantium pour le calcul de la CMI (test en duplicata) Fig 57 : Résultats sur microplaque montrant les différentes dilutions testées de l’huile essentielle de Cymbopogon citratus pour le calcul de la CMI (A : microplaque recouverte de son couvercle, B : microplaque découverte) Fig 58 : Résultats sur microplaque montrant les différentes dilutions testées de l’huile essentielle de Thymus vulgaris pour le calcul de la CMI (test en duplicatat) Fig 59 : Résultats sur microplaque montrant les différentes dilutions testées de l’huile essentielle d’Origanum compactum pour le calcul de la CMI (test en duplicatat) Fig 60 : Résultats sur microplaque montrant les différentes dilutions testées de l’huile essentielle de Cymbopogon martinii pour le calcul de la CMI (test en duplicatat) Fig 61 : Le rapport (CMB/CMI) pour les différentes huiles testées concernant les 2 souches de A. actinomycetemcomitans (JP2 et non-JP2) VII Dr LAKHDAR L. INTRODUCTION GENERALE L’accumulation du biofilm bactérien à la surface des dents entraîne l’apparition de la maladie parodontale, affection qui atteint les tissus de soutien de la dent (gencive, ligament parodontal, cément et os alvéolaire). En l’absence de traitement, cette maladie peut aboutir à la perte des dents. Le biofilm dentaire est défini comme une communauté microbienne complexe composé de bactéries orales organisées en biofilm supra et sous-gingival (1). Le biofilm supragingival est fixé à la surface de la dent et peut être éliminé en faisant appel à des moyens mécaniques de contrôle de la plaque par le brossage quotidien des dents et des dispositifs de nettoyage interdentaire. La nature du biofilm sous-gingival est plus complexe (2), à la fois attaché à la surface dentaire (cément) et aux tissus sous-jacents (l’épithélium sulculaire), séparé par des cellules faiblement liés ou planctoniques mobiles (3). Ce biofilm peut contenir, selon la gravité de l’atteinte parodontale et les défenses immunitaires de l’hôte, différentes espèces complexes de pathogènes parodontaux virulents (4). Il s’agit principalement de actinomecetemcomitans, bactéries anaérobies Porphyromonas à Gram gingivalis, négatif Fusobacterium (Aggregatibacter nucleatum…). Aujourd’hui, il est bien établi que ces pathogènes isolés à partir des lésions parodontales, sont liés à l’apparition et la progression, ainsi qu’à la sévérité de la maladie parodontale (5, 6). De ce fait, le contrôle du développement de biofilm sous-gingival semble être plus difficile à cause de l'accès limité des zones colonisées (cément, poche parodontale) et de la virulence des agents pathogènes dans le biofilm. Par conséquent, l'utilisation en traitement adjuvant d’agents antimicrobiens pourrait être bénéfique. Des agents antiseptiques tels que la Chlorhexidine, Cetylpirinidium chloride, Fluorides, Polyvidone iodée…, sous différentes formulations (bains de bouche, gels…), sont souvent et encore utilisés en parodontologie pour potentialiser l’éradication des pathogènes parodontaux (7-9). Cependant, la majorité de ces agents présentent une efficacité limitée en sous-gingival n’atteignant que partiellement le biofilm sous-gingival et les tissus inflammés inaccessibles (10-12). Egalement, l’apparition d’effets indésirables (colorations dentaires, altération du goût…) et de résistances bactériennes ont été souvent décrits suite à une 1 Dr LAKHDAR L. utilisation prolongée de ces agents chimiques (13-18). D’autre part, d’autres agents antimicrobiens tels que les antibiotiques ont été également préconisée dans le traitement des maladies parodontales sévères associées à ces bactéries parodontopathogènes virulentes (1923). Cependant, au cours de ces dernières décennies, l’émergence d’une résistance antibiotique accrue au sein de la flore parodontale pathogène est apparue et ne cesse de croître (24-30), en raison d’une prescrition souvent intempestive ou inadaptée de ces agents antimicrobiens oraux par les praticiens au cours de leur exercice quotidien. Ainsi, pour toutes ces raisons, les recherches s’orientent aujourd’hui vers de nouvelles alternatives thérapeutiques entraînant moins d’effets secondaires et de résistances bactériennes, et présentant moins de danger pour la santé. Des produits d’origine naturelle, issus de plantes médicinales, tels que: les huiles essentielles, utilisées en médecine traditionnelle, peuvent être considérées comme une bonne alternative thérapeutique. Le Maroc figure parmi les principaux pays producteurs d’huiles essentielles pour différentes raisons: historiques, géographiques et économiques. En effet, à travers des siècles, les Marocains ont su préserver les techniques de distillation développées par les arabes leur permettant ainsi d’instaurer une grande tradition des plantes à parfum. Par ailleurs, la diversité géographique et climatique, qui caractérise le Maroc, lui procure un large éventail d’espèces dont 400 plantes aromatiques (31). En effet, le Maroc est un grand producteur et exportateur de plantes fraîches, d’huiles essentielles et de concrètes. Les huiles essentielles Marocaines sont très connues sur le marché international et plus particulièrement en Europe et aux USA (32). Depuis des décennies, des sociétés étrangères se sont installées sur le territoire national en vue d’exploiter cette richesse naturelle dans plusieurs secteurs dont l’industrie pharmaceutique et autres... Ainsi, les Plantes Médicinales et Aromatiques (PAM) constituent une ressource importante au Maroc avec des enjeux économiques, sociétaux et scientifiques. Selon des statistiques de 2003 de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), 80% de la population mondiale a recours à la médecine traditionnelle pour satisfaire aux besoins en soins de santé primaire. L’utilisation des plantes aromatiques dans la thérapeutique ne datent pas d’aujourd’hui. Les Marocains en particulier et les arabes en général, ont utilisé depuis les temps les plus anciens les plantes comme source majeure de médicaments. 2 Dr LAKHDAR L. Leurs propriétés médicinales et biologiques sont prometteuses, certaines ont été mises en évidence à travers plusieurs publications internationales et d’autres font encore l’objet d’études de recherche à travers le monde. Aujourd’hui, la recherche de l’activité antimicrobienne de ces huiles continue, en les testant sur davantage de microorganismes à l’origine de plusieurs maladies, dont les maladies parodontales. Notre présent travail va s’intéresser principalement à des huiles essentielles d’origine Marocaine, appartenant à des familles de plantes médicinales bien connues pour leur utilisation thérapeutique et leurs propriétés antiseptiques en médecine populaire. Cependant, il est important de signaler que l’usage répandu et les bienfaits décrits pour ces plantes par la population Marocaine dans différentes affections restent encore non supportés par des études scientifiques, d’où l’intérêt de notre travail. Ainsi, nous avons entrepris une étude expérimentale par des essais in vitro dans le but de tester l’effet antibactérien des huiles essentielles issues de ces plantes médicinales connues sur une bactérie orale parodontopathogène virulente. Il s’agit de « Aggregatibacter actinomycetemcomitans », l’un des pathogènes oraux majeurs fortement incriminés dans les parodontites agressives, maladies parodontales destructices à évolution rapide, constituant un réel problème de santé publique au Maroc. Dans la première partie de notre mémoire, nous allons passer en revue les données de littérature sur les plantes médicinales et aromatiques en général et leur usage au Maroc, puis les huiles essentielles en particulier concernant : leurs caractéristiques, leur composition, leurs techniques de préparation, leur propriétés antimicrobiennes… Et un chapitre sera ensuite consacré à la bactérie qui fera l’objet de notre recherche : Aggregatibacter actinomycetemcomitans : ses caractéristiques culturaux, son épidémiologie, ses facteurs de virulence…Nous allons terminer cette première partie de revue de littérature par une étude systématique répertoriant les différentes études qui ont porté sur la recherche de l’activité antimicrobienne des huiles essentielles sur Aggregatibacter actinomycetemcomitans . Enfin, la deuxième partie, qui représente l’essentiel de notre travail, consistera en une étude in vitro, procédant d’abord à l’isolement d’une souche clinique d’Aggregatibacter actinomycetemcomitans, avant de mettre en évidence les différents essais in vitro proprement dits effectués sur des huiles essentielles Marocaines en testant leur activité antibactérienne sur cette bactérie virulente. 3 Dr LAKHDAR L. Une conclusion générale résumera l’ensemble des résultats issus de cette étude et présentera les perspectives de recherche concernant toutes les étapes à réaliser dans l’avenir proche, afin de confirmer l’efficacité antibactérienne réelle in vivo de ces huiles testées, avant de pouvoir les utiliser comme agents antimicrobiens alternatifs dans le traitement des parodontites agressives. 4 Dr LAKHDAR L. PREMIERE PARTIE: REVUE BIBLIOGRAPHIQUE 5 Dr LAKHDAR L. CHAPITRE I : LES PLANTES MEDICINALES ET AROMATIQUES 1. Terminologie Phytothérapie : est un mot d’origine grecque : « phyto » qui veut dire plante et « therapeuein » qui veut dire soigner. Autrement dit, au sens étymologique, c’est « la thérapeutique par les plantes » ; elle utilise les plantes ou les formes immédiatement dérivées des plantes, en excluant les principes actifs purs issus de celles-ci. Les plantes sont consommées sous plusieurs formes : en l’état (infusions) ou après transformation (teintures, extraits, médicaments à base de plantes...) (31, 33, 34). Plante médicinale : définie par la pharmacopée par une plante dont au moins une partie possède des propriétés médicamenteuses. Egalement appelée « drogue végétale » (33). Aromathérapie : branche de la phytothérapie, elle recourt aux extraits aromatiques des plantes (essences et huiles essentielles). Elle se différencie de la phytothérapie qui fait appel à l’ensemble des éléments contenus dans la plante (31, 35). 2. Historique Les végétaux peuplaient la planète bien avant l’homme et ont d’abord servi à le nourrir via la cueillette puis la culture (35). Leur emploi a rapidement évolué en constatant leurs propriétés thérapeutiques pour traiter les blessures et les maladies. L’utilisation des arômes était également connue des civilisations de l’antiquité pour des usages religieux, cosmétiques mais aussi thérapeutiques (36). Ce sont les égyptiens, 3150-1085 avant Jésus-Christ, de l’époque pharaonique, qui furent les premiers à avoir recours aux plantes aromatiques pour embaumer les morts, avec notamment un mélange d’huiles essentielles comme l’huile de cèdre, de basilic (37, 38), et en utilisant des plantes aux propriétés antiseptiques connues comme le nard de l’Himalaya, la cannelle, le ciste, des produits de sécrétion aromatique comme l’encens ou la myrrhe (39). En Grèce antique, Hyppocrate indiquait les bains aromatiques dans le traitement des maladies de la femme (36). Et dans les grandes épidémies, on faisait brûler de la lavande, sarriette, romarin et de l’hysope (37). En Inde, à l’âge d’or de la médecine ayurvédique coïncidant avec l’apogée du boudhisme (de 327 av. J-C. à 750 apr. J-C.), on conseillait couramment les plantes médicinales et aromatiques pour différentes indications : massages, bains, hygiène, santé 6 Dr LAKHDAR L. et diététique (36, 40). Au 1er siècle apr. J-C., apparut le traité intitulé « De materia medica » écrit par Dioscoride, médecin et grand voyageur, dressant l’inventaire de 519 espèces de plantes et qui servira de référence dans la société Romaine et Arabe. Les arabes ont ainsi poursuivi les recherches sur les plantes médicinales en devenant les premiers à mettre au point la distillation des plantes, permettant d’en extraire l’huile essentielle, il y a de cela plus de mille ans (41). Cependant, avec les progrès de la science, l’avènement de la pharmacologie de synthèse (l’aspirine, la pénicilline…) et l’émergence de la médecine basée sur la preuve, l’usage des médicaments chimiques a pris son essor, et ce depuis la seconde guerre mondiale, tandis que la phytothérapie ainsi que l’aromathérapie ont perdu de leur intérêt. Récemment, depuis le début des années 2000, il y a un retour en force vers cette discipline alternative. En effet, la prise de conscience par les patients et le personnel médical d’une image de plus en plus défavorable des médicaments de synthèse suite à l’apparition des effets indésirables, d’une efficacité parfois insuffisante ou nulle, l’émergence de résistances bactériennes…a renvoyé à nouveau vers l’usage de produits naturels à base de plantes médicinales qui semblent avoir de grands avantages. Ainsi, la phytothérapie médicale, aujourd’hui, creuse son chemin, se développe et se codifie. Des études scientifiques se multiplient prouvant de plus en plus l’efficacité thérapeutique des plantes, dont l’utilisation est plus réglementée selon des critères scientifiques et une démarche clinique rigoureuse pratiquée par des professionnels de la santé spécifiquement formés. 3. Les plantes médicinales et aromatiques à visée thérapeutique au Maroc Le Maroc, de part sa situation géographique, constitue un climat et un cadre favorable à la culture d’une flore riche et variée. Sur les 7000 espèces et sous-espèces existantes, on retrouve environ 537 espèces endémiques du pays et 1625 rares ou menacées (42). Le Maroc occupe ainsi la première place parmi les pays du Sud de la Méditerranée pour sa richesse en plantes endémiques. On compte 800 espèces potentiellement exploitables de Plantes Aromatiques et Médicinales (PAM) (43). Vu cette richesse, le Maroc dispose d’un savoirfaire ancestral pour la médication par les plantes. En effet, il existe un véritable arsenal thérapeutique traditionnel de recettes et de pratiques au sein de notre pays, issus de traditions 7 Dr LAKHDAR L. et de croyances, transmis à travers les générations et/ou recueillies auprès des herboristes, enrichi par les expériences personnelles ou celles des proches. Cette pratique de la médecine traditionnelle est liée à plusieurs paramètres : âge, sexe, niveau d’étude, situation familiale, type de maladie, famille des plantes utilisées, connaissances sur la toxicité des plantes… (44, 45). Plusieurs enquêtes ont été menées au Maroc dans l’optique de recenser et répertorier les PAM les plus fréquemment utilisées et collecter les informations sur les usages thérapeutiques pratiqués par la population locale en fonction des différentes régions du pays et des pathologies à traiter (Tableau 1). 8 ETUDE El Rhaffari et al. 1999, 2002 (46, 47) REGION ETUDIEE le sud-est du Maroc (Tafilalet) FAMILLE DES PLANTES UTILISEES les Asteraceae Fabaceae Poaceae NOM SCIENTIFIQUE OU GENRE Anthemis, Anvillea, Atractylis , Senecio , Centaurea, Echinops, bubonium Genista, Acacia, Retama, Ononis Aristida, Cymbopogon, Stipa, Lygeum, NOM COMMUN/ NOM LOCAL USAGE POPULAIRE Traitement des maladies digestives (19,3 %), dermatocosmétologie (14 %), système nerveux central et périphérique (9 %), sphère ORL (7,5 %), pathologie de la musculature et ossements (7 %), parasitoses (5,9 %), appareil urinaire (5,6 %), appareil génital (5,5 %), appareil respiratoire (5,4 %), appareil Olea Oleaceae Lamiaceae Thymus, Forskahlea, Lavandula, Salvia, Marrubium, Teucrium, Brassicaceae Zygophyllaceae Moretti, Alyssum, Anastatica chenopodiaceae Zygophyllum, Balanite, Fagonia Fredolea Apiaceae Ammodaucus, Eryngium Asparagaceae Dipcadi, Urginea, Asparagus Rutaceae Ruta Euphorbiacea Euphorbia Compositae Ormenis, Brocchia Solanaceae Withani, Hyoscyamus, Lyciume Tamaricaceae Tamarix circulatoire (5,3 %), métabolisme et sécrétion (4,9 %), stomatologie (4,7 %), ophtalmologie (2,1 %), infection par germes pathogènes (1,9 %), empoisonnement et piqûre par venin (1,6 %), cancers et tumeurs (0,6 %). Dr LAKHDAR L. Hadouche 2000 (48) Rabat (Centre de Consultati on et de Traitement Dentaire CCTD) Ghafsay de la province de Taounate (Hôpital Hassan II) Cistaceae Helianthemum Plantaginaceae Globularia, Linaria Artemisia absinthium L. Artemisia mesatlantica L. Atractylis gummifera Matricacria camomilla L. Absinthe (chiba) Armoise (schi’h) Chardon à glu (addad) Matricaire (babnuj) Amaryllidaceae Ceratonia sibiqua L. Caroubier (el kharroub) Lamiaceae Ocium basilicum L. Origanum marjorana L. Marrubium vulgare L. Lamium album Salvia officinalis L. Thymus serpyllum Punica granatum L. Basilic (habaq) Marjolaine (mardaddouche) Marrube blanc (marriout) Ortie blanche (harrigua) Sauge (salmya) Thym (zaatar) Grenadier (roummen) Lawsonia inermis Roxb Ammi visnaga Lam Glycyrrhiza glabra L. Henné (henna) Khella (bechnikha) Réglisse (arq sus) Nitrariaceae Peganum harmala L. (Harmal) Harmel (harmal) Malvaceae Althaea officinalis L. Mauve (el khobiza) Coriandrum sativum L. Coriandre (al quazbur) Myrtus communis L. Eucalyptus golbulus L bill Eugenia caryophyllata Wight Quercus suber Myrte (rihane) Eucalytus (kallitus) Giroglier (oud anouar) Chêne-liège (d’bagh) Nerium oleander L. Laurier rose (defla) Asteraceae Lythraceae Fabaceae Apiaceae Myrtaceae Fagaceae Apocynacées 10 Affections bucco-dentaires : algie dentaire, aphtes, hémorragie, gingivite, herpès labial, mauvaise haleine, stomatite. Dr LAKHDAR L. Salvadoracées Salvadora persica garcin Souak (oud el araq) Amaryllidaceae Allium satium L. Ail (thoum) Nigella sativa L. Nigelle (sanouj) Juglandacées Juglans regia L. Noyer (gouz, guerguaa) Oléacées Iridacées Olea europeae L. Crocus sativus L. Olivier (zeitoun) Safran (zaâfran l’horr) Lamiaceae, Zingiberaceae, Ranunculaceae, Asteraceae, Liliaceae, Poaceae, Ranunculaceae, Myrtaceae, Araliaceae, Juglandaceae, Juncaceae, Chenopodiaceae, Urticaceae, Caryophyllaceae, Lauraceae, Papaveraceae, Brassicaceae, Rosaceae, Leguminosae, Rutaceae, Zygophyllaceae, Rhamnaceae, Cactaceae, Thymeleaceae, Lythraceae, Punicaceae, Oleaceae, Apocynaceae, Solanaceae, Myristicaceae, Verbenaceae Mentha pulegium L. Origanum compactum Benth., Zingiber officinale Rosc., Nigella sativa L., Marrubium vulgare L., Lepidium sativum L., Allium sativum L. Trigonella foenum- graecum L., Mentha suaveolens Ehrh., Cuminum cyminum L., Punica granatum L., Aloysia citriodora Links, Artemisia herba alba Asso Chenopodium ambrosioides L., Eucalyptus globulus Labill., Marrubium vulgare L., Citrus limon (L.) Burm., Allium cepa L., Trigonella foenum graecum L., Allium sativum L. Lawsonia inermis L., Rosa canina L., Daphne gnidium L., Eugenia caryophyllata Thunb., Peganum harmala L., Lavandula vera DC., Nicotiana glauca Graham Menthe pouliot, origan, gingembre, Nigelle, marrube blanc, Moutarde, Ail Ranunculacées Hseini et al. 2007 (49) la région de Rabat (Maroc occidental) Fenugreek, Menthe à feuilles rondes, Cumin, Grenadier, Verveine citronnelle, absinthe blanche Thé du Mexique, Gommier bleu, Marrube blanc, Citron, Ognion, Fenugreek, Ail. Henné, Rosier des chiens, Lin sauvage, Giroflier, Harmal, Lavande officinale, Tabac arborescent 11 Maladies de l’appareil respiratoire Maladies de l’appareil digestif Maladies de l’appareil circulatoire Maladies de la peau Dr LAKHDAR L. Lavandula vera DC., Cinnamomum cassia Blume, Origanum compactum Benth., Ranunculus muricatus L., Aloysia citriodora Links, Lavandula dentata L. ,Echinops spinosus L. Herniaria hirsuta L., Zea mays L., Lavandula vera DC., Ziziphus lotus (L.) Lam., Opuntia ficus-barbarica A. Berger, Juncus sp. Aloysia citriodora Links, Marrubium vulgare L., Coriandrum sativum L., Eugenia caryophyllata Thumb., Papaver somniferum L., Matricaria chamomilla L., Myristica fragrans Houtt. Pennisetum typhoides (Burm.) Stapf. & Hubb., Juglans regia L., Mentha suaveolens Ehr., Urtica cf. urens L., Nigella sativa L., Nerium oleander L., Ajuga iva (L.) Schreb. Allium sativum L., Olea europaea L. Artemisia absinthium L., Asphodelus microcarpus 5 Salzm. & Viv., Olea europaea L., Ruta graveolens L., Allium sativum L., Marrubium vulgare L. Lavande officinale, cannelle de Chine, Origan, Pied-de-coq, Verveine citronnelle, Lavande dentée, Chardon bleu Maladies de l’appareil génital Calice poilu, Zea mays L., Lavande officinale,, jujubier sauvage, figuier de barbarie, Joncs. Verveine citronnelle, Marrube blanc, Coriandre, Giroflier, Opium, Camomille, noix de muscade. Mil, Noyer commun, Menthe à feuilles rondes, L’Ortie brûlante, Nigelle, Laurier rose, pins au sol. Ail, Olivier. Absinthe, Asphodèle à petits fruits, Olivier, Rue commune, Ail, Marrube blanc. 12 Maladies de l’appareil urinaire Maladies du système nerveux Maladies du squelette Maladies de l’appareil visual Maladies de l’appareil auditif Dr LAKHDAR L. Mehdioui et al 2007 (45) Commune d’Imin’Tlit (Province Lamiaceae Lavandula maroccana Lavandula dentata Lavande Lavande à feuilles dentées (Ijerch) Marrubium vulgare Marrube blanc (Ifzi) Rosmarinus officinalis Romarin (Yazir) Teucrium polium Germandrée en capitule Thymus satureioides Thym sarriette (Tazouknite) Thymus broussonetii Thym de Broussonet (Azoukni) Artemisia herba alba Atractylis gummifera Centaurea chamaerhaponticum Warionia saharae Armoise blanche (Izri) Chardon à glu (Addad) (Tafghra) (Afezdad) Allium sativum Asphodelus microcarpus Smilax aspera Salsepareille Urginea maritima Pistacia lentiscus Rhus pentaphylla Ail (Tiskert) Asphodèle (Ighri) (Tanechfalt) Scille/ Urginée Lentisque (Titekt) Sumac (Azad/tazadt) Ranunculaceae Nigella sp Ranunculus arvensis Nigelle(Shanouj) Ouden lhalouf Anacardiaceae Pistacia atlantica Desf. Pistacia lentiscus L. Rhus pentaphylla Desf. Pistachier de l’Atlas (Btem) Lentisque (Drou) Tizgha (Sumac vernis) d’Essaouira) Asteraceae Liliaceae Anacardiaceae Lahsissene et al. 2009 (50) la région de zaër (Maroc occidental) 13 Maladies de l’appareil digestif (50%) Maladies de la peau (15%), de l’appareil circulatoire (13%), de l’appareil respiratoire (10%) et de l’appareil génital (5%). Maladies (appareils visuel, osseux, urinaire, et auditif, et système nerveux) (moins de 7 %). Maladies digestives Dr LAKHDAR L. Apiaceae (umbelliferae) Ammodaucus leucotrichus Coss. et Dur. Carum carvi L. Elaeoselinum asclepium (L.) Eryngium triquetrum Vahl Foeniculum vulgare Mill. Cumin laineux (Kammûn sofi) Carvi (Karwiya) Bertol.(Arq yabû) Panicaut (Mrîzla) Fenouil officinal (Besbass) Apocynaceae Nerium oleander L. Laurier rose (Defla) Aristolochiaceae Aristolochia longa L. Aristoloche (Bereztum) Asclepiadaceae Caralluma europaea Guss. (Daghmouss) Asteraceae Artemisia absinthium L. Absinthe (Chiba) Artemisia herba-alba Asso Armoise blanche (Chih el khrissi) Atractylis gummifera L. Chardon à glu (Dâd) Cynara cardunculus L. Cynara humilis L. Echinops spinosus L. Cardon cultivé (Khorchef) Chardon (Timta) Echinops (Tasekra) Dittrichia viscosa (L.) Greuter (syn. Inula viscosa (L.) Aiton Aunée visqueuse (Terrahla) 14 Maladies digestives gale, vermine et chute des cheveux (en friction externe), comme hypoglycémiant. Maux dentaires (en gargarisme) Maladies digestives et pour provoquer l’avortement chez les femmes. Maladies respiratoires, maladies gynécologiques Contre la lithiase rénale, les maux d’estomac et comme antidiabétique. Contre les vers intestinaux, les refroidissements, les douleurs gastriques, les maux urinaires et comme antidiabétique. Comme assouplissant des cheveux et antipelliculaire (en association avec le henné). Contre la fièvre et le rhume (en inhalation). Maladie hépatique Maladies hépatiques Maladies digestives, urinaires, gynécologiques (règles douloureuses, accouchement) Maladies digestives et urinaires Dr LAKHDAR L. Ormenis mixta (L.) Dumort. Camomille du Gharb (Hellâla) Contre la fièvre et les douleurs abdominales Rhaponticum acaule (L.) DC. Rhapontique à tige courte (Tafgha) Scolyme d’Espagne (Garnina) Cresson alénois (Hab rchad) Maladies respiratoires, digestives et hépatiques Scolymus hispanicus L. Comme antidiabétique Brassicaceae (cruciferae) Lepidium sativum L. Cactaceae Opuntia ficus-indica (L.) Mill. Figuier de barbarie (Hendiya) Caryophyllaceae Corrigiola telephiifolia Pourr. Corrigiola (Sarghina) Chenopodiaceae Herniaria glabra L. Chenopodium ambrosioides L. Herniaire (Hrras lehjar) Ansérine (Mkhinza) Maladies rénales (calculs rénaux). Affections gastro-intestinales, fièvre et migraine. Cistaceae Cistus albidus L. Ciste blanc (Tuzzala) Contre les douleurs gastriques et comme hypoglycémiant. Contre les abcès. Cistus monspeliensis L. Ciste de Montpellier (Tuzzalabéda,) Genévrier rouge (Ar’âr) Contre les douleurs d’estomac et pour traiter les blessures. Tetraclinis articulata (Vahl) Mast. Thuya de Berbérie (Ar’âr) Ericaceae Arbutus unedo L. Arbousier (Sasnu) Maladies digestives (émétique dans divers épisodes d’intoxication). Hypoglycémiant. Pour les soins des cheveux (associée au Henné). Maladies urinaires (calculs urinaires) et digestives (douleurs gastriques). Euphorbiaceae Euphorbia falcata L. Euphorbe en faux (Hayat ennufûs) Maladies rénales (calculs rénaux, rétention urinaire) et comme aphrodisiaque Mercurialis annua L. Mercuriale annuelle (Harrigua melsa) Maladies rénales (douleurs des Reins). Cupressaceae Juniperus phoenicea L. 15 Maladies respiratoires ( toux, asthme, bronchites), digestives (maux de ventre), troubles sexuels (impuissance, stérilité) et comme réchauffant. Maladies rénales (calculs rénaux, incontinence nocturne). Comme cataplasme antiinflammatoire et émollient dans les contusions douloureuses Maladies digestives (maux d’estomac), respiratoires et les affections rhumatismales. Comme fortifiante et apéritive. Comme hypoglycémiant. Dr LAKHDAR L. Ricinus communis L. Ricin (Kherwaê) Contre la fièvre (en cataplasme ou en inhalation) Astragalus lusitanicus Lam. Astragale (Fwila) Maladies rhumatismales (enflures, arthroses et luxations) Trigonella foenum-graecum L. Fenugrec (Helba) Contre les douleurs d’estomac, l’amaigrissement, les bronchites, comme hypoglycémiant et dépuratif. Quercus ilex L. Chêne vert (Korrich) Contre les douleurs gastriques Quercus suber L. Chêne liège (Fernan) Contre les maux de l’estomac et des intestins, et la chute des cheveux (associé au henné). Juncaceae Juncus acutus L. et Juncus maritimus Lam. Jonc (Smar) Lamiaceae Ajuga iva (L.) Schreb. Ivette musquée (Chendgoura) Lavandula multifida L. Lavandula angustifolia Mill. (=L. officinalis Chaix, L. vera DC.) Lavandula stoechas L. Lavande (Kohîla) Lavande vraie (Khzama fassiya) Contre les calculs rénaux et comme diurétique. (associées aux stigmates de Maïs, aux fleurs de Figuier de Barbarie et aux rhizomes) Contre les troubles gastriques, les douleurs rhumatismales, les règles douloureuses, la stérilité féminine, comme antidiabétique, anticancéreuse, vermifuge et réchauffant. Contre la toux et les désordres gastrointestinaux. Contre la toux, l’asthme, les bronchites et les refroidissements. Lavande stoechade (Halhal) Contre la grippe, le rhume, la toux, la bronchite, les douleurs d’estomac et comme hypoglycémiant. Marrubium vulgare L. Merrîwa, Marrube blanc Mentha pulegium L. Menthe pouliot (Fliyu) Mentha suaveolens L. Menthe à feuilles rondes (Marseta) Mentha viridis L. Menthe verte (Na’na’) Origan à inflorescence compacte (Za’tar) Contre la fièvre, et pour la cicatrisation des abcès et des furoncles (En usage externe) Refroidissements, rhume, de grippe, bronchite, toux et douleurs (en inhalation, en infusion ou en décoction). Douleurs gastriques, diarrhées, refroidissements, fièvre et affections respiratoires. En cataplasme ou en inhalation, les feuilles sont recommandées en cas de fièvre. Comme digestif et rafraîchissante. Contre les maux de tête et les brûlures. Contre les affections gastro-intestinales, la diarrhée et comme hypoglycémiant. En gargarisme, elle est employée contre les affections de la bouche et, en inhalation, contre la grippe et le rhume. Fabaceae Fagaceae Origanum compactum Benth. U.L. : La tige feuillée 16 Dr LAKHDAR L. Rosmarinus officinalis L. Romarin (Azir) Salvia verbenaca L. Sauge verveine (Khiyata) Calament (Manta) Liliaceae Satureja calamintha (L.) ScheeleU.L. : La tige feuillée est utilisée Asparagus officinalis L. Linaceae Asphodelus microcarpus Salzm. et Viv. Linum usitatissimum L. Asphodèle à petits fruits (Berwag) Lin (Zerî’at l-kettân) Lythraceae Lawsonia inermis L. Henné (Henna) Malvaceae Malva sylvestris L. Grande mauve (Khobbeyza) Moraceae Ficus carica L. Figuier (Kerma) Myrtaceae Myrtus communis L. Myrte (Rayhan) Oleaceae Phillyrea angustifolia L. et Phillyrea latifolia L. Chamaerops humilis L. Phyllaire (Ûd lehmer) Phoenix dactylifera L. Palmier dattier (Nkhel) Palmae Asperge (Sekkûm) Palmier nain (Dûm) 17 Contre les douleurs d’estomac, les refroidissements, les bronchites, les règles douloureuses et comme hypoglycémiant. En usage externe, comme vulnéraire et résolutif des contusions, des plaies et des abcès Appliquées, en cataplasme, sur les plaies et les abcès vidés pour faciliter leur cicatrisation. Contre la fièvre, la grippe, les douleurs gastriques et comme rafraîchissant (en infusion dans du thé). Contre les rhumatismes et la bronchite. En gargarisme, contre les maux dentaires Traitement des affections de l’oreille et dans les soins des abcès (en application locale). Contre la toux, l’asthme, les inflammations des voies urinaires (mélangées au miel) et comme apéritif. Contre les douleurs gastriques. En application locale pour le traitement des cheveux et l’embellissement des mains et des pieds, sur les eczémas, les furoncles, les abcès, les gerçures et les contusions. Contre la bronchite et les affections gastro-intestinales. contre les douleurs dorsales (en application locale) Contre la fièvre (en inhalation). Traitement des verrues (en application locale). Les figues séchées sont considérées comme énergétiques. Contre les maux d’estomac et comme purgatif. Contre la fièvre (en inhalation). Pour noircir et assouplir les cheveux (mélangé au henné). Contre les douleurs intestinales Comme antidiabétique et comme remède des atteintes gastriques et intestinales. contre la chute des cheveux (associées au henné). Comme aphrodisiaque et anti-diarrhéique. Pour les soins des yeux. Dr LAKHDAR L. Poaceae (Gramineae) Agropyrum repens (L.) Pal. Beauv. Chiendent (Njem) Contre les calculs rénaux. Cynodon dactylon (L.) Pers. Chiendent (Njem) Roseau (Qseb) Même utilisation qu’Agropyrum repens. Pour faire pousser les cheveux (associées au henné) Dauphinelle staphysaigre (Habbet râs) Pour lles soins des cheveux (associées au henné). Nigella sativa L. Nigelle (Sanûj) Ranunculus bullatus L. Renoncule (Wden l’hallûf) Rhamnaceae Ziziphus lotus (L.) Lam. Jujubier ( Sedra) Rosaceae Rosa canina L. Eglantier (Ward) contre les douleurs gastrointestinales, le rhume, la grippe, l’asthme, le rhumatisme, les affections pulmonaires (associées au miel), comme antidiabétique. Contre les règles douloureuses, les maux d’estomac et pour activer l’accouchement. Contre les calculs rénaux (associés auxfruits du jonc, au style de maïs, au chiendent et aux fleurs de figuier de barbarie). Traitement des furoncles et abcès. Traitement des cheveux (associés au myrte, au clou de girofle et au henné) Rubiaceae Rubia tinctoria L. Garance des teinturiers (Fuwa) Contre la jaunisse et les maladies hépatiques. Dépurative et augmente le volume du sang. Rutaceae Ruta montana L. Rue sauvage (Fijel) Solanaceae Mandragora autumnalis Bertol. Mandragore (Bid al ghul) Contre les maux d’estomac, les affections de l’appareil respiratoire et les maladies du foie Contre les abcès, les furoncles et les douleurs rhumatismales Solanum linnaeanum Hepper et Jaeger (= S. sodomaeum L., nom.rej.) Daphne gnidium L. Morelle de Sodome (Hedja) Traitement de dermatoses. Garou (Lezzâz) Traitement des cheveux (croissance, assouplissement et dégraissage) en association avec le henné. Thymelea lythroides Barr. et Murb. Passerine (Metnan) Contre les maux urinaires et les calculs rénaux. Contre la teigne (associées au henné). Aloysia citriodora L. Verveine odorante (Lwiza) Contre les douleurs abdominales et comme hypotenseur et rafraîchissant. Renonculaceae Thymeleaceae Verbenaceae Phragmites australis (Cav.) Steud. Delphinium staphysagria L. 18 Dr LAKHDAR L. Vitex agnus - castus L. Zingiberaceae Alpinia officinarum Hance Zygophyllaceae Peganum harmala L. Benkhnigue et al. 2006 et 2007 (44) Région de Mechraâ Bel Ksiri (Région du Gharb du Maroc) Lamiaceae (12,08 %) Apiaceae (10,07 %), Poaceae (8,05 %), Solanaceae (5,37 %), Fabaceae (4,70 %) Ghourri et al. 20072011 (51) Tan-Tan (Sud du Maroc) Asteraceae, Gattilier (Kherwaâ dial maâ) Galanga officinal (Khodenjal) Contre les calculs rénaux, les maux urinaires (mélangées au miel) et comme réchauffant dans les refroidissements. Contre le rhume, la grippe, le refroidissement, les règles douloureuses et comme réchauffant. Harmel (Harmel) Contre les douleurs intestinales. Pour les soins des cheveux (en association avec des clous de girofle) troubles métaboliques (22,65 %), troubles digestives (16,02 %), affections ostéo-articulaires (11,07 %), affections urogénitales (10,49 %), affections cutanées (8,84 %), soins des cheveux (7,73 %), troubles respiratoires et affections hépatiques ayant le même pourcentage (4,42 %) et maladies rénales (3,87 %). Autres maladies (10,49 %) Artimesia herba alba Armoise Contre diabète Cucurbitaceae, Citrullus colocynthis Coloquinte Cupressaceae, Juniperus phoenicea Genévrier rouge Fabaceae, Lupanus albus Lupin blanc Trigonella foenumgraecum Fenugrec Vicia sativa Vesce cultivée Plantaginaceae, Globularia alypum Globulaire turbith Juglandaceae, Juglans regia Noyer Lamiaceae, Ajuga iva Ivette musquée Marrubium vulgare Marrube blanc Salvia officinalis Sauge Prunus amygdalus Amandier Rosaceae, 19 Dr LAKHDAR L. Salhi et al. 2010 (52) El Midaoui et al. 2011 (53) Guessous 2011-2012 (54) ville de Kénitra (Nord ouest du Maroc) Région de Khenifra (montagne s du Moyenatlas) Villes de Rabat et Kénitra Zygophyllaceae, Zygophyllum gaetulum Zygophylle Poaceae, Hordeum vulgare Orge Aristolochiaceae, Aristolochia longa Aristoloche Rhamnaceae, Ziziphus lotus Jujubier Oleaceae, Olea europaea Olivier Apocynaceae, Nerium oleander Laurier rose Solanaceae Capsicum frutenscens Piment enrage Lamiaceae (22,58%), Asteraceae (6,45%), Apiaceae (4,84%), Caryophyllaceae (4,84%). Lamiaceae, Asteraceae, Rosaceae, Chenopodiaceae, Papaveraceae, Caryophyllaceae, Cupressaceae, Rutaceae, Anacardiaceae et Zygophyllaceae Salvadoraceae Traitement des affections digestives (26,15%), affections dermatologiques (10%), affections obstétriques et gynécologiques (17,70%), affections respiratoires (16,15%). Salvadora persica Miswak Parodontopathies : tuméfaction gingivale (77,7%), mauvaise Lamiaceae Thymus vulgaris Salvia officinalis Marrubium vulgare Mentha pulegium Thym Sauge Marrube Blanc Menthe Pouliot haleine (63,1%) et saignement gingival (75,7%) Myrtaceae Syzygium aromaticum Girofle Apiaceae Ammi visnaga Khella Oleaceae Asteraceae Olea europaea L. Artemisia herba-alba Olivier Armoise blanche 20 Dr LAKHDAR L. Zeggwagh et al. 2013 (55) la ville de Fès (centre du Maroc) Lamiaceae (23.33 %), les Apiaceae (13,33 %) et les Asteraceae (10 %). Affections urinaires (21%), maladies de l'appareil digestif (19.6%), des maladies rhumatologiques (18.2%) et maladies dermatologique (16.8%). Autres maladies (pulmonaire, gynécologique, auditif, système nerveux et autres) 24.4% Artemisiae absinthium, Artemisia vulgaris, Ceratonia siliqua, Cinnamomum , Zeylanicum, Citrullus colocynthis, Citrus limonia, Cocos nucifera, Coriandrum, Sativum, Crocus sativus, Fragaria vesca, Mentha piperita, Myristica fragrans, Myrtus communis, Nigella sativa, Ocymum basilicum, Ormenis mixta, Papaver, Somniferum, Peganum harmala, Phoenix dactylifera, Pimenta officinalis, Pimpinella anisum, Prunus amygdalus, Punica granatum, Quercus suber, Raphanus sativus, Ricinus communis, Rosa centifolia, Rosmarinus officinalis, Ruta graveolens, Salvadora persica, Sesamum indicum, Thymus serpyllum, Thymus vulgaris, Trigonnella foenumgraecum, Vitis vinifera, Zea mays, Zingiber Officinale. Absinthe, armoise, Caroube, Cannelle, Coloquinte, Citron, Noix de coco, Coriandre, Safran, Fraise, menthe, Muscadier, Myrte, Nigelle, Basilic, Camomille, Pavot, Harmel, Dattes, Piment de Jamaïque, Anis, Amande douce, Grenadier, Chêne, Radis, Ricin, Rose, Romarin, Rue, Souak, Sésame, Serpolet, Thym, Fénugrec, Raisin sec, Maïs, Gingembre 21 Maladies du système digestif Dr LAKHDAR L. Atropa belladona, Brassica rapa,Rosmarinus officinalis, Viola odorata, Cinnamomum zeylanicum, Eugenia caryophyllata, Mentha piperita, Marrubium vulgare, Myristica fragrans, Myrtus communis, Ocymum basilicum, Ormenis mixta, Papaver rhoeas, Papaver somniferum, Petroselinum sativum,Phoenix dactylifera, Pimpinella anisum, Prunus amygdalus, Thymus serpyllum, Thymus vulgaris, Zingiber officinale. Allium sativum, Argania spinosa,Artemisia vulgaris, Atropa belladona, Brassica rapa, Cinnamomum zeylanicum, Corylus avellana, Nigella sativa, Olea europaea, Papaver rhoeas, Pimenta officinalis, Punica Granatum, Rosmarinus officinalis, Sesamum indicum, Thymus vulgaris, Trigonnella foenumgraecum, Viola odorata, Vitis vinifera, Prunus amygdalus. Atropa belladona, Citrullus colocynthis, Lavandula officinalis, Malus pumila, Mentha piperita, Myrtus communis, Ormenis mixta, Belladone, Rave, Romarin, violet de bois, Cannelle, Clou de girofle, Menthe poivrée, Marrube blanc, Noix de muscade, Myrte, Basilic, Camomille marocaine, Pavot commune, Pavot à opium, Persil, Dattier, Anis, Amande, serpolet, Thym, Gingembre. Ail, Argan, Armoise, Belladone, Rave, Cannelle, Noisetier commun, Cumin noir, Olivier, Pavot commune, quatre-épices, Grenade, Romarin, Sésame, Thym, Fenugrec, violet de bois, Vigne commune, Amande. Belladone, Coloquinte, Lavande, Pomme, Menthe poivrée, Myrte commun, Camomille marocaine, , Pavot commune, Pavot à 22 Maladies du système respiratoire Maladies du système cardio-vasculaire Maladies neurologiques Dr LAKHDAR L. Papaver rhoeas, Papaver somniferum, Peganum harmala, Petroselinum sativum, Pimenta officinalis, Prunus amygdalus, Rosa centifolia, Ruta graveolens, Sesamum indicum, Thymus vulgaris. Argania spinosa, Citrus limonia, Cocos nucifera, Corylus avellana, Lawsonia inermis, Peganum harmala, Pimenta officinalis, Prunus amygdalus, Quercus suber, Raphanus sativus, Rosa centifolia, Ruta graveolens,Sesamum Indicum. opium, Harmel, Persil, Quatre-épices, Amande, Chou rose, Rue, Sésame, Thym. Citrullus colocynthis, Ocymum basilicum, Ormenis mixta,Papaver somniferum, Peganum harmala, Petroselinum sativum, Pimpinella anisum, Ricinus communis, Rosa centifolia, Ruta graveolens, Zingiber officinale. Atropa belladonna, Citrullus colocynthis, Myrtus communis, Ocymum basilicum, Olea europaea, Petroselinum sativum, Phoenix dactylifera, Punica granatum, Raphanus sativus, Zea mays. Coloquinte, Basilic, Camomille marocaine, Pavot à opium, Persil, Anis, Ricin, Chou rose, Gingembre. Maladies gynécologiques Belladone, Coloquinte, Myrte, Basilic, Olivier, Persil, Dattier, Grenadier, Radis, Mais. Maladies du système urinaire Argan, Mandarin, Noix de coco, Noisetier, Henné, Harmel, Quatre-épices, Amande, Chêne-liège, Radis, Chou rose, Rue, Sésame. 23 Maladies de la peau Dr LAKHDAR L. Cinnamomum camphora, Citrus limonia, Myristica fragrans, Papaver somniferum, Rosmarinus officinalis, Ruta graveolens, Thymus vulgaris, Vitis vinifera, Zea mays, Zingiber officinale. Camphrier, Mandarin, noix de muscade, Pavot à opium, Romarin, Chou rose, Thym, vigne commune, Mais, Gingembre. Maladies rhumatologiques TabLeau 1 : les différentes enquêtes réalisées au Maroc sur les Plantes Aromatiques et Médicinales (PAM) et leur usage populaire 24 L’analyse floristique du catalogue réalisé par toutes ces enquêtes, dans les différentes régions du Maroc, a mis en évidence les familles de plantes les plus représentées en médecine traditionnelle à savoir les Lamiaceae, les Asteraceae, les Apiaceae et Caryophyllaceae. Par ailleurs, concernant les indications thérapeutiques de ces plantes, les affections digestives, métaboliques et urinaires semblent être les plus fréquentes, tandis que les affections buccodentaires seraient moins traitées par l’usage des plantes. Néanmoins, on retrouve quelques enquêtes non publiées, qui ont été menées au Maroc sur l’utilisation des plantes dans le traitement des maladies bucco-dentaires (48, 54). Ces derniers ont mis en évidence une fréquence d’utilisation pour une série de plantes dont particulièrement le Thym, Girofle, Sauge et Miswak. L’usage de l’Armoise blanche et khella a été rapporté par les 2 enquêtes. Autrement dit, il s’avère que les plantes à usage populaire pour les affections bucco-dentaires appartiendraient surtout aux familles des lamiaceae et Myrtaceae, et à un degré moindre aux Asteraceae et Apiaceae, ce qui constitue ainsi un point de départ et une base pour une recherche scientifique expérimentale dans ce sens. En effet, ces enquêtes ethnobotaniques épidémiologiques constituent une source d’information précieuse, pouvant servir de base pour des études scientifiques ultérieures afin de valoriser ces plantes marocaines à visée thérapeutique, constituant une richesse inestimable de notre pays, encore peu exploitée. Les huiles essentielles constituant une partie non négligeable de notre patrimoine, évoluent aujourd’hui à grand pas dans plusieurs domaines essentiellement dans le domaine de la cosmétique, parfumerie, agroalimentaire… cependant, l’apport de ces huiles dans le domaine médical et surtout bucco-dentaire reste, à ce jour, peu exploré et peu étudié. C’est pourquoi plusieurs volontés concourent, actuellement, à préserver cette ressource naturelle et à la mettre en valeur. Ainsi, une bonne connaissance des huiles essentielles (composition, méthodes d’extraction, toxicité …) s’impose avant d’entamer toute étude. Ceci fera l’objet du chapitre suivant, avant d’aborder l’essentiel de notre travail sur la recherche de l’activité antimicrobienne des huiles essentielles (partie expérimentale). Dr LAKHDAR L. CHAPITRE II : LES HUILES ESSENTIELLES 1. Définition : Il s’agit d’un extrait pur et naturel provenant de plantes aromatiques (40, 56). Elle concentre l’essence de la plante, autrement dit son parfum. Il s’agit de substances odorantes, volatiles, de consistance huileuse, très concentrées, offrant une forte concentration en principes actifs (36). Il faut ainsi une très grande quantité de plantes fraîches pour obtenir quelques millilitres d’huiles essentielles (41). On ne peut définir une essence sans définir sa méthode d’extraction. Selon la pharmacopée européenne (57) : « Produit odorant, généralement de composition complexe, obtenu à partir d’une matière première végétale botaniquement définie, soit par entraînement par la vapeur d’eau, soit par distillation sèche, ou par un procédé mécanique approprié sans chauffage. L’huile essentielle est le plus souvent séparée de la phase aqueuse par un procédé physique n’entraînant pas de changement significatif de sa composition » Selon l’AFNOR (l’Association Française de Normalisation ) (58), ce sont des produits généralement odorants, obtenus soit par entraînement à la vapeur d’eau, de végétaux ou de parties de végétaux, soit par expression du péricarpe frais de certaines citrus. Cette définition excluant les essences obtenues par d’autres procédés d’extraction. 2. Répartition des huiles essentielles dans la plante Les huiles essentielles se rencontrent dans tout le règne végétal. Cependant, elles sont particulièrement abondantes chez certaines familles (59) telles que : les Conifères, les Rutacées, les Ombellifères, les Myrtacées, les Lamiacées, les Poacées. Elles sont présentes dans différents organes végétaux producteurs, variant en fonction de la zone productrice du végétal (60, 61) : les sommités fleuries (ex: lavande, menthe...), dans les racines ou rhizomes (ex: vétiver, gingembre), dans les écorces (ex: cannelles), le bois (ex: camphrier), les fruits (ex: citron), les graines (ex: Muscade) et sont contenues dans des structures spécialisées à savoir : les poils, les canaux sécréteurs et les poches (39). 26 Dr LAKHDAR L. 3. Caractères physico-chimiques des huiles essentielles Les huiles essentielles sont liquides à température ambiante mais aussi volatiles, ce qui les différencie des huiles dites fixes. Elles sont liposolubles et solubles dans les solvants organiques usuels ainsi que dans l’alcool, entraînables à la vapeur d’eau mais très peu solubles dans l’eau (62). Il faut donc impérativement un tensioactif pour permettre leur mise en suspension dans l’eau. Elles présentent une densité en général inférieure à celle de l’eau et un indice de réfraction élevé. Elles sont pour la plupart colorées : ex : rougeâtre pour les huiles de cannelle et une variété de thym, jaune pâle pour les huiles de sauge sclarée et de romarin officinal. Elles sont altérables et sensibles à l’oxydation. Par conséquent, leur conservation nécessite de l’obscurité et de l’humidité. De ce fait, l’utilisation de flacons en verre opaque est conseillée (39). Elles sont constituées de molécules à squelette carboné, le nombre d’atomes de carbone étant compris entre 5 et 22 (le plus souvent 10 ou 15) (62). 4. Contrôle de qualité Les huiles essentielles doivent répondre à des normes analytiques, établis par des commissions nationales et internationales d’experts et imposés par les pays importateurs ou exportateurs. Les points de contrôle à effectuer pour se prémunir de la falsification des huiles essentielles et éviter les confusions entre les différentes espèces concernent l’origine géographique, l’espèce botanique, l’organe producteur (feuilles, fleurs, fruits, écorces…) et les caractéristiques physico-chimiques (couleur, odeur, densité et indice de réfraction). Tout ceci permettra d’utiliser une appellation présente dans la nomenclature botanique et valable dans le monde entier (63). L’Institut de Normalisation Scientifique d’Aromatologie INSA a retenu trois critères pour conférer aux huiles essentielles le label « HEBBD » : Huile Essentielle Botaniquement et Biochimiquement Définie (60). Il s’agit de : L’espèce botanique L’organe producteur 27 Dr LAKHDAR L. Le chémotype ou chimiotype de la plante L’espèce botanique : Il s’agit du nom latin complet de la plante distillée à l’origine de l’extraction de l’huile essentielle. Par exemple, dans le terme « lavande », il y a plusieurs espèces dont on extrait des huiles essentielles différentes. Le nom complet sera composé par conséquent : - Du genre : ex : lavandula - D’une épithète qualitative : ex : spica, vera… - Et parfois de la variété si elle existe : ex : var fragans, étant donné que la composition et les propriétés des huiles essentielles peuvent varier d’une variété à l’autre. C’est le cas des eucalyptus où plus de 500 espèces différentes portant toutes le nom de genre Eucalyptus sont recensées dans le monde (39, 63). L’organe producteur (op) Selon l’organe producteur, l’huile essentielle peut avoir des propriétés et un usage totalement différents. C’est le cas de l’oranger amer : citrus aurantium var.amara qui fournit différentes huiles essentielles, l’une à partir de ses feuilles, une autre à partir de ses fleurs ainsi qu’une essence extraite de l’écorce des zestes de ses fruits. Ces 3 substances aromatiques diffèrent par leur composition, leur parfum, leurs propriétés médicinales…. (63). Le chémotype ou chimiotype de la plante (CT) Il indique le composant biochimique majoritaire et distinctif présent dans l’huile essentielle. Il permet ainsi de différencier entre les huiles essentielles extraites d’une même espèce botanique mais de composition biochimique différente et par conséquent aux propriétés différentes (39). En effet, deux plantes identiques peuvent produire des essences plus au moins différentes, selon les conditions de culture : ensoleillement, composants du sol, saison… (56). Le chémotype est retrouvé grâce à une analyse chromatographique et spectrométrique identifiant les molécules contenues dans l’huile essentielle. Par exemple, pour le thym (thymus vulgaris), l’huile essentielle de Thymus vulgaris CT thujanol possède des propriétés anti-infectieuses avec une action stimulante et régénératrice au niveau 28 Dr LAKHDAR L. hépatique, alors que l’huile essentielle de Thymus vulgaris CT thymol est antibactérienne mais hépatotoxique à doses élevées. 5. Les procédés d’extraction des huiles essentielles La quantité d'huile essentielle contenue dans les plantes est toujours faible, parfois très faible, voire infime. Il faut parfois plusieurs tonnes de plantes pour obtenir un litre d'huile essentielle. L’extraction des huiles essentielles est certainement la phase la plus délicate. Elle a pour but de capter les produits les plus subtils et les plus fragiles élaborées par le végétal. Il existe différents procédés d'extraction, mais le choix de la méthode utilisée définit obligatoirement la nature de l’essence ainsi que son éventuelle utilisation. L'entraînement par la vapeur ou l'hydrodistillation de la plante fraîche ou sèche reste la technique la plus utilisée. On distingue les procédés suivants: 5.1 Extraction par expression à froid Il s’agit du procédé d’extraction le plus simple et le plus limité. C’est une méthode artisanale qui est totalement abandonnée. Les plantes sont pressées à froid (notamment les agrumes : citron, orange, etc.) de l’écorce ou des fruits (64). Cette technique consiste à briser mécaniquement les poches oléifères de zestes frais d’agrumes pour libérer leur contenu aromatique. La rupture de la paroi des poches oléifères fait intervenir trois procédés : - Une technique qui agit sur le fruit entier, elle utilise des machines exerçant une action abrasive. - Une technique qui agit sur le fruit sans endocarpe. Elle utilise des machines exerçant une pression suffisante pour libérer l’essence. - Un troisième procédé permet d’extraire en une seule opération l’essence et le jus sans mélanger les deux produits (65). Le produit obtenu se nomme « essence » et non huile essentielle, car aucune modification chimique liée à des solvants ou à la vapeur d’eau n’a lieu (39, 60). 29 Dr LAKHDAR L. 5.2 Extraction par distillation et entraînement à la vapeur d’eau Il s’agit de l’un des procédés d'extraction ou de séparation de certaines substances organiques les plus anciens, apporté par les Arabes au IXe siècle. Cette opération s'accomplit dans un distillateur ou « alambic ». Le matériel végétal est supporté par une grille ou une plaque perforée placée à une distance adéquate du fond de l’alambic, rempli d’eau. Sous l’action de la chaleur, l’eau se transforme en vapeur et passe à travers les plantes en entraînant les molécules aromatiques vers un système de refroidissement. La vapeur d’eau chargée ainsi d’essence retourne à l’état liquide par condensation. Le produit de la distillation se sépare donc en deux phases distinctes : l’huile et l’eau condensée que l’on appelle eau florale ou hydrolat (64, 66). Les parties insolubles sont séparées de l’eau par décantation pour donner l’huile essentielle (65, 66). 5.3 Hydrodistillation ou distillation à l’eau Le matériel végétal est en contact direct avec l’eau. L’hydrodistillation consiste à immerger directement le matériel végétal à traiter (intact ou éventuellement broyé) dans un alambic rempli d’eau qui est ensuite porté à ébullition. Les vapeurs hétérogènes sont condensées sur une surface froide et l’huile essentielle se sépare par différence de densité (67). Cette méthode est généralement indiquée pour les huiles essentielles dont les constituants chimiques sont thermorésistants. Cependant, l’inconvénient majeur de cette méthode est la non maîtrise de la température du récipient contenant le mélange (eau + organes végétaux) et la modification de de la couleur, de l’odeur et de la composition de l’huile essentielle au cours de la distillation (68). 5.4 L’enfleurage L'enfleurage est une technique qui date de l'Antiquité égyptienne. Elle consiste à déposer des plantes en particulier les organes fragiles (fleurs d’oranger, pétales de rose) sur une couche de graisse animale qui se sature en essence. On épuise ensuite le corps gras par l'alcool qui récupère les senteurs et qui sera ensuite évaporé sous vide (66, 69). Cette technique est actuellement abandonnée au profit de l’extraction par les solvants en raison de son faible rendement et de l’importante main d’œuvre qu’elle nécessite (70). 30 Dr LAKHDAR L. 5.5 Extraction par les solvants organiques Cette méthode est utilisée pour les organes végétaux présentant une concentration en essence relativement faible ou pour les essences que l’on ne peut extraire par distillation. Etant de nature huileuse, les essences sont solubles dans les solvants organiques. Un épuisement des plantes est effectué à l’aide d’un solvant volatil dont l’évaporation laisse un résidu cireux, très coloré et très aromatique appelé «concrète». Le traitement de cette concrète par l’alcool absolu conduit à «l’absolue» (66, 71). On utilise comme solvant organique volatil l’hexane, qui est le plus utilisé actuellement; le benzène très utilisé dans le passé mais interdit pour des raisons de toxicité ; le propane ; le toluène, etc... (72, 73). L’extraction s’effectue en plusieurs étapes, on lave la matière avec le solvant deux à trois fois. Il semble que la presque totalité des produits odorants passe en solution dès la première extraction. Mais, étant donné que la matière traitée retient une forte proportion de la solution, il est nécessaire de pratiquer des dilutions successives avec de nouvelles charges de solvant (lavages). La matière épuisée retient une proportion importante de solvant. Il faut donc concentrer la solution en évaporant le solvant qui est recyclé pour d'autres lavages. La récupération du solvant atteint couramment 94 à 96 % de la quantité retenue (74). De ce fait une proportion résiduelle de solvants reste dans les concrètes d’où un risque de toxicité non négligeable (67). Pour cette raison, cette technique est limitée à l’industrie des parfums. 5.6 Extraction par le CO2 L’originalité de cette technique repose sur le solvant utilisé: il s’agit du CO2 en phase supercritique. L’extraction consiste à comprimer le dioxyde de carbone à des pressions et à des températures au delà de son point critique (P=72.8 bars et T= 31.1°C) (35). A l’état supercritique, le CO2 n’est ni liquide, ni gazeux, et cela lui confère un excellent pouvoir d’extraction, modulable à volonté en jouant sur la température de mise en œuvre. Les fluides supercritiques comme le CO2 sont de bons solvants à l'état supercritique, et de mauvais solvants à l'état gazeux (72). Les avantages de ce procédé sont les suivants : Le CO2 est totalement inerte chimiquement, il est naturel, non toxique et peu coûteux (67, 75) ; En fin de cycle, la séparation entre le solvant d'extraction et le soluté pour obtenir l’extrait est facile (simple détente qui ramène le CO2 à l’état gazeux), avec une récupération quasi-totale et peu coûteuse (67) ; 31 Dr LAKHDAR L. L’extraction des huiles essentielles par le CO2 supercritique fournit des huiles de très bonne qualité et en temps d’extraction relativement court par rapport aux méthodes classiques (76). Cependant l’installation industrielle de ce procédé reste onéreuse, et l’appareillage est encore envahissant. En conclusion, il n’existe pas de procédé meilleur que d’autres. Chaque méthode possède sa propre indication selon le végétal ou la partie du végétal, et l’utilisation du produit obtenu commande ainsi que l’aspect économique qui est tout aussi important (77). 6. Composition chimique des huiles essentielles Les huiles essentielles sont des mélanges complexes et variables de constituants appartenant exclusivement à deux groupes caractérisés par des origines biogénétiques distinctes : les terpènes volatils et les composés aromatiques dérivés du phénylpropane (67). On retrouve plus d’un millier de composants chimiques dans les huiles essentielles (66). On distingue : Les composés terpéniques : Il s’agit d’une famille de composés largement répandus dans le règne végétal. Ils sont formés par la combinaison de 5 atomes de carbone (C5) nommée : isoprène (78) (Fig 1). Fig 1 : Structure de l’isoprène (C5H8) 32 Dr LAKHDAR L. Ils sont classés selon (79) : • leurs fonctions : alcools (géraniol, linalol), esters (acétate de linalyle), aldéhydes (citral, citronellal), cétones (menthone, camphre, thuyone), éthers-oxydes (cinéole) ; • leur structure : linéaire (farnésène, farnésol) ou cyclique : monocyclique (humulène, zingiberène), bicyclique (cadinène, caryophyllène, chamazulène) ou tricyclique (cubébol, patchoulol, viridiflorol). Il convient à souligner que seuls les terpènes de faible masse moléculaire (mono – et sesquiterpènes) sont rencontrés dans les huiles essentielles (67) leur conférant un caractère volatil et des propriétés olfactives (80) (Fig 2). Monoterpènes : Ils sont constitués par le couplage de deux unités isopréniques (C10) et forment 90% des huiles essentielles avec une grande diversité de structures (78). Ils comportent plusieurs fonctions (74): Carbures: peuvent être de structure acyclique, monocyclique ou bicyclique : - Acyclique: ex : « myrcene », « ocimene », etc. - Monocyclique: ex : « terpinenes », « p-cimene », « phellandrenes », etc. - Bicyclique: ex : « pinenes », « camphene », « sabinene », etc. Ex : Huile essentielle de térébenthine : contient « alpha-pinène » et « camphene ». Alcools: - Acyclique: ex: « geraniol », « linalol », « citronellol », « lavandulol », « nerol », etc. - Monocyclique: ex: « menthol », « a-terpineol », « carveol » - Bicyclique: ex: « borneol », « fenchol », « chrysanthenol », « thuyan-3-ol », etc. Ex: Huile essentielle de coriandre : contient « linalol ». Aldehydes: - Acyclique: ex : « geranial », « neral », « citronellal », etc. Ex : Huile essentielle de citronnelle : contient « citral » et « citrannal ». 33 Dr LAKHDAR L. Cétones: - Acyclique:ex : « tegetone », etc. - Monocyclique: ex : « menthones », « carvone », « pulegone », « piperitone », etc. - Bicyclique: ex : « camphor », « fenchone », « thuyone », « ombellulone », « pinocamphone », « pinocarvone », etc. Ex: Huile essentielle de sauge : contient « thuyone ». Esters: - Acyclique: linalyl acetate or propionate, citronellyl acetate, etc. - Monocyclique: menthyl or a-terpinyl acetate, etc. - Bicyclique: isobornyl acetate, etc. Ex: Huile essentielle de menthe bergamote : contient « acétate de linalyle ». Ethers: ex : « 1,8-cineole », « menthofurane », etc. Ex : Huile essentielle d'eucalyptus globulus : contient « eucalyptol ». Peroxydes: ex : « ascaridole », etc. Ex : Huile essentielle de chénopode : contient « ascaridol ». Phénols: ex : « thymol », « carvacrol », etc. Ex : Huile essentielle de thym : contient « thymol ». Sesquiterpènes : Ils sont formés par l’assemblage de trois unités isopréniques (C15). Cependant leur structure ainsi que leur fonction restent similaires à celles des monoterpènes (78). Composés aromatiques dérivés du phénylpropane Ils sont beaucoup moins fréquents dans les huiles essentielles que les composés terpéniques. Ils comprennent : Aldéhyde: « cinnamaldehyde », ex : huile essentielle de cannelle Alcool: « cinnamic alcohol » Phénols: « chavicol », « eugénol », ex: huile essentielle de girofle (eugénol) 34 Dr LAKHDAR L. Dérivés méthoxy: « anéthole », « elémicine », « estragole », « methyleugénols », ex : huile essentielle de fenouil (anéthole) Composés de méthylène dioxy: « apiole », « myristicine », « safrole », ex : huile essentielle de persil (apiole) 35 Dr LAKHDAR L. Fig. 2: Structure chimique de certains composés des huiles essentielles (78) 36 Dr LAKHDAR L. 7. Les méthodes d’analyse des huiles essentielles Quelque soit le domaine d’utilisation des huiles essentielles (parfumerie, cosmétique, industrie pharmaceutique et agroalimentaire), une parfaite connaissance de leur composition chimique est nécessaire pour en contrôler la qualité et y déceler une éventuelle spécificité en vue de leur valorisation. Ainsi l’analyse des huiles essentielles, qui consiste en des méthodes de séparation et d’identification des composants, reste une étape importante. Cependant, elle demeure une opération délicate nécessitant la mise en œuvre de diverses techniques (81). La chromatographie est le procédé fréquemment utilisé pour séparer les constituants des huiles essentielles. Elle se base sur les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. La séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leurs adsorptions et désorptions successives sur la phase fixe, soit de leurs solubilités différentes dans chaque phase (82). Plusieurs méthodes existent : Chromatographie sur couche mince (CCM) Il s’agit d’une technique de routine utilisée pour l’analyse rapide de fractions obtenues à la suite d’une séparation initiale. Elle repose principalement sur des phénomènes d'adsorption. Après que l'échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide en plastique ou en aluminium, les substances migrent, entraînées par la phase mobile composée d’un ou de plusieurs solvants. Ensuite, le repérage des molécules s’effectue soit par ultra-violet (UV), soit par un colorant spécifique ou encore par exposition aux vapeurs d’iode (83). Cette technique, beaucoup moins performante que la chromatographie en phase gazeuse, peut être utilisée en routine pour le contrôle de qualité des huiles essentielles (67). Chromatographie en phase gazeuse (CPG) C’est de loin la technique la plus utilisée pour les huiles essentielles. Elle permet l’individualisation des constituants, leur quantification et le calcul de leurs indices de rétention (Ir). Le principe est basé sur la séparation des différents solutés gazeux par migration différentielle le long de la phase stationnaire. La phase mobile est un gaz (hélium, azote, argon ou hydrogène), appelé gaz vecteur (84). 37 Dr LAKHDAR L. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GPC/SM) Le but de combiner entre la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse CPG-SM, après séparation chromatographique, est d’ajouter à la chromatographie une deuxième dimension analytique (85). Le principe consiste à transférer les composés séparés par chromatographie en phase gazeuse par la phase mobile (le gaz vecteur) dans le spectromètre de masse au niveau duquel, ils vont être fragmentés en ions de masse variables dont la séparation sera en fonction de leur masse (67, 86). L’identification est ensuite réalisée par comparaison des indices de rétention (Ir) et des données spectrales (spectres de masse) des constituants individualisés avec les caractéristiques de produits de référence contenus dans des bibliothèques de spectres (87). La chromatographie liquide à haute performance (CLHP) Cette technique est indiquée pour étudier les constituants non volatils des concrètes et des absolues ou pour effectuer des préfractionnements. Elle peut être couplée également à un analyseur de masse (67). La chromatographie liquide à haute performance utilise une phase stationnaire très fine et une phase mobile liquide circulant sous l’effet d’une haute pression. Après la séparation des différents constituants de l’échantillon, un calculateur assure l’acquisition et le traitement des données (88). La Résonnance Magnétique Nucléaire RMN Parmi toutes les techniques spectroscopiques, la RMN est la technique de choix pour la caractérisation des molécules organiques ; elle permet l’accès à des informations concernant le squelette et la fonctionnalisation des molécules (89). L’originalité de la RMN par rapport aux autres techniques spectroscopiques réside dans le fait d’apporter une information précise et individuelle sur la très grande majorité des atomes constitutifs de la molécule, de permettre l’identification des connexions entre atomes des diverses entités tout en les situant dans l’espace les uns par rapport aux autres (90). 8. Toxicité des huiles essentielles 38 Dr LAKHDAR L. Bien que d’origine naturelle, les huiles essentielles peuvent se révéler dangereuses pour la santé. Il est ainsi important de connaître le produit, le choisir selon des critères qualificatifs rigoureux (produit de qualité non falsifié, non contaminé par des pesticides), de respecter scrupuleusement les doses et de choisir le mode d’administration adéquat, et ce afin d’éviter la survenue d’effets indésirables, voire même des interactions avec d’autres médicaments. Ainsi, les huiles essentielles peuvent s’avérer allergisants, photosensibilisants, cytotoxiques, irritants, néphrotoxiques, hépatotoxiques, neurotoxiques… On distingue les toxicités suivantes : Toxicité par voie orale : La majorité des huiles essentielles couramment utilisées présentent une toxicité par voie orale faible avec des doses létales à 50% (DL50) supérieures à 5 g/kg. Cependant, la Sarriette et l’Origan présentent une toxicité élevée autour des 1.4 g/kg (données observées chez l’animal), tandis que les plus toxiques sont les huiles essentielles de Boldo (0,13 g/kg), de Chénopode (0,25 g/kg), de Thuya (0,83 g/kg), ainsi que l’essence de moutarde (0,34 g/kg) (67). L’eugénol, l’un des constituants du Thym, peut s’avérer hépatotoxique et même entraîner une insuffisance rénale chez l’enfant à doses élevées (10 ml) (91). En effet, les accidents les plus graves sont généralement observés chez les enfants suite à l’ingestion de quantités importantes d’huiles essentielles. Toxicité dermique : L’usage des huiles essentielles en application locale, en parfumerie ou en cosmétique, peut générer des irritations, allergies voire photosensibilisation. C’est le cas de l’huile essentielle de Thym, d’Origan, de la Sarriette qui sont connues pour leur pouvoir irritant et agressif, l’huile essentielle de Cannelle qui est dermocaustique et allergisante pour les terrains sensibles, et les essences d’agrumes (pamplemousse, citron…) qui sont photosensibilisantes par des réactions épidermiques après exposition au soleil (92). Cytotoxicité : 39 Dr LAKHDAR L. Certaines huiles essentielles peuvent s’avérer cytotoxiques sur les cellules animales et humaines. En effet, il a été démontré que les huiles essentielles d’Origan, de différentes variétés, présentent une forte cytotoxicité sur des cellules humaines cancéreuses (93, 94). Egalement, il a été démontré que les huiles essentielles de Thym et de Lavande, selon la phase dans laquelle elles sont mises en contact (phase liquide ou gazeuse), sont cytotoxiques sur des cellules animales (hamster) (95). Neurotoxicité : Certaines huiles essentielles peuvent être convulsivantes et abortives suite à une utilisation prolongée. C’est le cas des huiles essentielles à thuyones (Thuya, Absinthe, Sauge officinale) qui sont neurotoxiques (92, 96). 9. Activité antimicrobienne des huiles essentielles Les propriétés médicinales des huiles essentielles sont nombreuses : antispasmodique, expectorant, rafraîchissant, diurétique, antiseptique…. Cependant, dans ce travail, nous allons nous limiter à leurs propriétés antimicrobiennes qui constitueront l’essentiel de notre étude de recherche. Les vertus antimicrobiennes des huiles essentielles sont bien connues et bien documentées. En effet, de nombreux travaux de recherche ont mis en évidence leur puissante activité antiseptique agissant aussi bien sur les bactéries, les champignons pathogènes que les virus (97- 99) leur conférant ainsi diverses indications thérapeutiques. 9.1 Activité bactéricide et bactériostatique L’activité antibactérienne des huiles essentielles a été la plus étudiée. On distingue deux sortes d’effets des huiles essentielles sur ces microorganismes : - Effet bactéricide (bactéricidie) : exerçant une activité létale - Effet bactériostatique (bactériostase) : entraînant une inhibition de la croissance. L’activité bactériostatique est souvent plus assimilable aux huiles essentielles que l’activité bactéricide. Cependant il a été démontré que certains constituants chimiques des huiles 40 Dr LAKHDAR L. essentielles ont des propriétés bactéricides (100-103). En effet, des dommages au niveau des cellules de différents microorganismes ont été rapportés, illustrés par microscopie électronique. Citons l’effet bactéricide des huiles essentielles riches en monoterpénols et en phénols sur Staphylococcus aureus (86), ou encore celui de l’Origanum compactum sur Escherichia coli (104). Toutefois, cette action bactéricide des huiles essentielles sur la cellule bactérienne demeure encore insuffisamment élucidée (105). Plusieurs mécanismes seraient mis en jeu (78): - Précipitation des protéines et des acides nucléiques (106). - Inhibition de la synthèse des macromolécules (AND, ARN, protéines et peptido-glycanes (107). - Inhibition de la perméabilité membranaire sélective (108) et détérioration membranaire. - Inhibition de la glycolyse et déplétion potassique (109). - Modification de la morphologie de la cellule bactérienne (110). - Absorption et formation d’un film autour de la cellule bactérienne avec inhibition des processus de respiration, d’absorption et d’excrétion (106). 9. 2 Facteurs influençant l’activité antimicrobienne des huiles essentielles L’efficacité antimicrobienne des huiles essentielles dépend de deux principaux paramètres : l’huile essentielle et sa composition chimique d’une part, et le microorganisme (type, structure…) d’autre part (111). 9.2.1 Activité liée à la composition chimique : L’activité des huiles essentielles est souvent réduite à l’activité de ses composés majoritaires, ou ceux susceptibles d’être actifs. Toutefois, les composés minoritaires pourraient agir de manière synergique (112). De nombreuses études ont mis en évidence une activité antimicrobienne qualitativement similaire entre les huiles essentielles et leurs composés chimiques testés isolément. Cependant il existe des différences quantitatives. En effet, il a été prouvé que l’effet antimicrobien des huiles essentielles est supérieur à celui de ses composés majoritaires testés séparément (112, 113). Et selon l’étude de Lambert et al. 2001 (114), l’association des principaux composés 41 Dr LAKHDAR L. actifs agirait de façon synergique en potentialisant l’action antimicrobienne de l’huile essentielle. Les composés chimiques connus pour leur efficacité antimicrobienne et leur large spectre sont les phénols (thymol, carvacrol et eugénol), les alcools, (α-terpineol, terpinen-4-ol, linalol), les aldéhydes, les cétones et plus rarement les carbures (115, 116). Les phénols, dont le thymol et l’eugénol, sont responsables de l’activité bactéricide des huiles essentielles qui en contiennent (104, 114, 117). Ils produisent des dégâts irréversibles au niveau de la membrane (118). Cependant, il est à signaler que les phénols seuls ne sont pas responsables de l’intégralité de l’activité des huiles essentielles; les autres composés chimiques doivent également être pris en compte (115). Les alcools sont généralement plus connus pour leur activité létale que bactériostatique sur les cellules végétatives, en dénaturant les protéines (116). Les aldéhydes, fortement électronégatif à double liaison, deviennent de puissants agents antimicrobiens en réagissant avec les composés nitrés vitaux (protéines et acides nucléiques) des bactéries (86, 116). 9.2.2 Activité liée au microorganisme Une huile essentielle peut être biocide vis-à-vis de certaines souches, biostatique vis-à-vis d’autres ou encore n’avoir aucun effet. Ceci peut être lié au type de microorganisme (à Gram positif ou à Gram négatif), à sa forme planctonique ou en biofilm, à son métabolisme et à sa résistance. En effet, les bactéries à Gram positif seraient plus résistantes aux huiles essentielles que les bactéries à Gram négatif (119, 120). Par ailleurs, l’activité antimicrobienne des huiles essentielles diffère selon que la bactérie croît en forme planctonique ou au sein d’un biofilm bactérien. La résistance bactérienne aux huiles essentielles, comme pour tout agent antimicrobien, semble être liée à la formation du biofilm. En effet, un isolat clinique récent peut montrer une résistance augmentée, pouvant provenir des interactions avec les cellules de l’hôte (121), tandis que les microorganismes évoluant sous forme planctonique sont plus susceptibles (122). 42 Dr LAKHDAR L. 9. 3 Méthodes de détermination de l’activité antimicrobienne des huiles essentielles in vitro : La détermination du pouvoir antimicrobien des huiles essentielles fait appel à plusieurs techniques expérimentales. Cependant, des difficultés pratiques liées à l'insolubilité des constituants des huiles essentielles dans l'eau, de leur volatilité, de la nécessité de les tester à de faibles concentrations et des problèmes de standardisation des méthodes, peuvent avoir une influence sur les résultats. Les différents protocoles peuvent ainsi être classés selon : 1. Le milieu dans lequel se fait la diffusion de l’huile essentielle, soit liquide, solide ou gazeux, 2. La nature du contact de l’huile essentielle avec le germe : diffusion sur disque, en puits, en solution alcoolique ou dispersion dans un émulsifiant. Une première étape consiste à faire un « screening » ou une sélection des huiles ayant un effet antimicrobien potentiel. Il s’agit d’une étude préliminaire qualitative. Une seconde étape consiste à calculer quantitativement le degré d’activité antimicrobienne des huiles essentielles sélectionnées, et ce en déterminant la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et la Concentration Minimale Bactéricide (CMB) de ces huiles. La CMI est définie comme étant la concentration la plus faible d'un agent antimicrobien qui inhibe la croissance visible d'un micro-organisme après incubation, et la CMB comme la plus faible concentration d'antimicrobien qui tue 99,9% des microorganismes après sous-culture sur milieu sans antibiotique (123, 124). 9.3.1 Techniques de screening des huiles essentielles: 9.3.1.1 Aromatogramme C’est une méthode de mesure in vitro du pouvoir antibactérien des huiles essentielles (125). Cet examen est équivalent à un antibiogramme où les antibiotiques sont remplacés par des essences préalablement sélectionnées et reconnues. Il s'agit d'une méthode en milieu gélosé à l'agar réalisée dans une boîte de Pétri. Le contact se fait par l'intermédiaire d'un disque de papier (de cellulose) de 6 mm sur lequel on dispose une quantité donnée d'huile essentielle 43 Dr LAKHDAR L. (10 µl) (126). Après ensemencement et incubation, on mesure le diamètre des zones d’inhibition. 9.3.1.2 Technique de diffusion en puits : Un puits (d’environ 6mm) est creusé au centre de la gélose dans lequel sera coulée une quantité d’huile essentielle pure ou diluée. Après incubation, des zones d’inhibition de croissance bactérienne sont obtenues (pour les huiles actives) et mesurées (127). Pour ces 2 techniques, la sensibilité du germe testé peut être évaluée selon le diamètre d’inhibition obtenu. En effet, la sensibilité d’un germe est nulle pour un diamètre inférieur ou égal à 8 mm. Elle est limitée pour un diamètre compris entre 8 et 14 mm, et moyenne pour un diamètre entre 14 et 20 mm. Pour un diamètre supérieur ou égale à 20 mm le germe est très sensible (128). 9.3.2 Techniques de détermination de la CMI des huiles essentielles 9.3.2.1Techniques de diffusion en milieu solide : L’huile essentielle est mélangée aux concentrations désirées avec le milieu gélosé liquéfié par simple agitation manuelle. Après refroidissement, on ensemence et on incube (129). L’adjonction d’un émulsifiant (Tween 80), inerte, stable et dépourvu d’action synergique antibiotique, peut être réalisée pour améliorer la solubilité de l’huile essentielle et sa diffusion dans la gélose (130). Ainsi, l’huile essentielle est préparée dans une solution de Tween 80 à la concentration désirée. Le mélange est agité manuellement pendant 10 minutes, puis ajouté au milieu gélosé liquéfié. L’ensemble est coulé en boîte de pétri. L’ensemencement est effectué après refroidissement de la gélose. 44 Dr LAKHDAR L. 9.3.2.2 Techniques de diffusion en milieu liquide Test de microdilution : (Carson et al. 1995) (131) L’incorporation de l’huile essentielle dans le milieu de culture liquide se fait en utilisant un émulsifiant (Tween 80) pour préparer les solutions de l’huile essentielle à la concentration désirée. La détermination de l’activité antimicrobienne de l’huile essentielle se fait au moyen d’une microplaque de 96 puits. La détermination de la CMI est réalisée en faisant appel à un indicateur de croissance en solution (Triphényl Tétrazolium Chloride) (TTC). La croissance bactérienne est indiquée par l’apparition d’une couleur rouge de la solution témoignant de la réduction ou la précipitation du TTC. La CMI est ainsi déterminée par le dernier puits de la microplaque, par ordre décroissant de concentration, qui ne montre aucun changement de couleur. La CMB est calculée en transportant 10 µl des puits ne montrant pas de croissance bactérienne sur un milieu solide. La plus faible concentration tuant 99,9% des micro-organismes en culture sur ce mileu correspond à la CMB. Test de macrodilution : (Onawunmi 1989) (132) Le principe est le même que celui du test de microdilution, sauf qu’il est effectué dans des tubes contenant l’huile essentielle, à différentes concentrations, incorporée dans un bouillon de culture liquide. La CMI est déterminée au niveau du dernier tube ne montrant aucune croissance microbienne visible. 9.3.2. 3 Techniques de diffusion en phase vapeur Méthode des micro-atmosphères : (Kellner et Kobert 1954) (133) : Le disque imprégné d’essence est disposé au centre géométrique du couvercle de la boîte de pétri et non plus au contact avec la gélose. La boîte est hermétiquement fermée. Il se produit une évaporation des substances volatiles dans l'enceinte de la boîte. La lecture des résultats de ce test porte sur la croissance ou non de l’inoculum, se traduisant par un halot qui sera mesuré par un pied à coulisse. Cette méthode ne quantifie pas l'activité antimicrobienne réelle des huiles essentielles, elle met en évidence seulement la sensibilité du microorganisme testé aux constituants volatils à la température d'incubation. 45 Dr LAKHDAR L. Conclusions du chapitre : Les huiles essentielles sont des substances naturelles complexes, possédant des caractéristiques physico-chimiques bien définies, et répondant à des critères de qualité qu’il faut connaitre pour éviter tout risque de toxicité qui peut se révéler dangereuse pour la santé. Par ailleurs, ces produits présentent une grande variabilité de leurs constituants chimiques, leur attribuant de nombreuses propriétés médicinales et biologiques qu’il convient de connaître et de valoriser. Leur activité antimicrobienne, constituant une de leurs grandes vertus, fait l’objet aujourd’hui de nombreux travaux de recherche, en testant ces huiles sur différents microorganismes (bactéries, champignons, virus…), faisant ainsi de ces extraits naturels des agents antimicrobiens potentiels. Dans notre présent travail, le pouvoir antimicrobien d’huiles essentielles Marocaines sélectionnées sera mis en évidence sur une bactérie orale, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, qui est un pathogène complexe avec des particularités génétiques, culturaux et pathogéniques liées des facteurs de virulence qu’il convient de connaître. Ces données seront détaillées dans le Chapitre III de notre travail. 46 Dr LAKHDAR L. CHAPITRE III : AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS La destruction des tissus de soutien de la dent (tissu conjonctif, os alvéolaire), connue sous le nom de « parodontite », représente l’une des maladies infectieuses les plus répandues à travers le monde. Il s’agit d’un processus inflammatoire induit par des dépôts microbiens ou « biofilm » colonisant la surface dentaire le long du sillon gingivo-dentaire (134). Une forme particulière, « la parodontite agressive », est caractérisée par une progression rapide et sévère des lésions, apparaissant souvent à un âge précoce (135). On distingue 2 formes : localisée et généralisée. Une prévalence significativement élevée de ces maladies a été enregistrée en Afrique du Nord et plus précisément au Maroc où elle constitue un réel problème de santé publique (136). En effet, un taux de 7,6 % a été rapporté par Haubek (136) dans une population âgée de 12 à 18 ans. Les parodontites agressives sont des maladies à étiologie multifactorielle : bactérienne, immunologique et environnementale (137- 141). Néanmoins, depuis des décennies, il est bien établi que l’étiologie bactérienne constitue la principale cause des maladies parodontales. Plusieurs études ont mis en évidence, dans les lésions des patients affectés vivant ou originaires du Maroc, la présence d’une bactérie, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, particulièrement le clone JP2, fortement incriminé dans l’initiation de ces parodontites agressives (142). La taxonomie, les aspects culturaux, l’épidémiologie les particularités génétiques et pathogéniques de ce pathogène seront décrits ci-après. 1. Taxonomie Bacterium actinomycetemcomitans a été décrit par Klinger en 1912 (143) comme une bactérie à Gram négatif, anaérobie facultative, coccobacille, isolée à partir de lésions actinomycotiques. Elle a été reclassée en « Actinobacillus actinomycetemcomitans » par Topley & Wilson 1929 (144), dans le genre Actinobacillus en raison d’une faible ressemblance avec Actinobacillus lignieresii (145). Cependant, plus tard une similitude phénotypique de cette bactérie avec Haemophilus aphrophilus a permis une nouvelle affiliation génique par Potts et al. 1985 (146) dans le genre Haemophilus. 47 Dr LAKHDAR L. Récemment, le nom de « Aggregatibacter actinomycetemcomitans », appartenant à la famille des Pasteurellaceae (147), fut attribué à cette bactérie, selon la nouvelle classification de Nørskov-Lauritsen N. et Kilian M. en 2006 (148). 2. Caractéristiques culturales et morphologiques A.actinomycetemcomitans peut être isolé à partir d’un échantillon clinique de la plaque sousgingivale, en utilisant un milieu sélectif tel : Tryptic soy-serum-bacitracin-vancomycine agar (TSBV) (149) ou Dentaid-1 (150) (Fig 3). Il s’agit de coccobacille (Fig 4) (151) à Gram négatif (Fig 5), pouvant se produire isolément, en deux ou en petits groupes. Anaérobie facultatif, il se développe aussi bien en milieu aérobie qu’anaérobie sous une concentration de 5% de CO2. Après 24h d’incubation à 37°C, les colonies sur une gélose au sang cuit sont petites, avec un diamètre de 0,5 mm, mais ne dépassant pas 1–2 mm après 48h (Fig 6). Lors du premier isolement, les colonies sont de texture rugueuse et adhérente avec un motif opaque au centre, en forme d’étoile (152) (Fig 7 et 8). Les cycles successifs de repiquage in vitro, sur milieu solide, peuvent conduire à la perte de cette morphologie, et la transformation en une surface lisse et non adhérente de la colonie. La croissance en culture est lente, nécessitant 2 à 5 jours. Selon Slots 1982 (153), tous les isolats de A. actinomycetemcomitans sont indépendants du facteur X (Hémine) ou V (NAD) pour leur croissance in vitro. Ils sont oxydase négatif, catalase positif, réduisant le nitrate et capable de fermenter le glucose et pas le lactose (154). Fig 3: Isolement de A.actinomycetemcomitans sur milieu sélectif (Dentaid 1) ((Laboratoire de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V, Rabat) 48 Fig 4: Aspect en coccobacilles en miccrographie électronique à balayage (151) Dr LAKHDAR L. Fig 5: Aspect en microscopie optique après coloration de Gram (Service de Bactériologie, Hôpital Militaire Mohammed V, Rabat) Fig 6: Aspect des colonies sur gélose au sang cuit (Laboratoire de Recherche et Biosécurité (P3), Hôpital Militaire Mohammed V), Rabat Fig 7: Aspect des colonies de A.actinomycetemcomitans avec motif opaque au centre lors de la 1ère mise en culture sur gélose au sang cuit (Laboratoire de Recherche et Biosécurité (P3), Hôpital Militaire Mohammed V, Rabat) 49 Fig 8: Aspect des colonies avec un motif opaque au centre: A: en forme d’étoile sur colonie lisse B: en forme circulaire ou ellipsoïdale sur colonie rugueuse (152) Dr LAKHDAR L. 3. Caractéristiques phénotypiques Des études génétiques ont démontré une hétérogénéité génétique dans l’espèce. En effet, des souches virulentes et non-virulentes de A. actinomycetemcomitans peuvent exister. Actuellement, six sérotypes (a-f) de A. actinomycetemcomitas sont connus (154-156). Cependant, la plupart des sujets sont infectés par un seul sérotype (157). Le sérotype b semble être le plus virulent. En effet, une augmentation des niveaux sériques d’anticorps spécifiques (Ig G) chez les patients atteints de parodontites agressives localisées a été associée à la présence de ce sérotype (b) (158,159). Ce dernier possède un clone particulier JP2, qui semble être fortement impliqué dans la pathogénie des lésions parodontales chez les adolescents et les jeunes adultes, notamment ceux d’origine marocaine (160-163). Le clone JP2 : Les méthodes de détection PCR (Polymerase Chain Reaction) ont permis de mettre en évidence, parmi certaines souches d’Aggregatibacter actinomyctemcomitans, une délétion d’un fragment d’ADN de 530 pb dans la région promotrice de l'opéron (ltx) du gène codant pour la leucotoxine (Fig 9) (161), toxine produite par la bactérie et l’implicant dans l’étiologie et la pathogénie des parodontites agressives. Il s’agit du clone JP2, qui possédant cette caractéristique génotypique serait ainsi à l’origine d’une production excessive de cette leucotoxine et associé à un risque élevé de développement de ces maladies parodontales destructrices. Par conséquent, on parle de souche d’Aggregatibacter actinomyctemcomitans clone JP2 hautement leucotoxique. Quant aux autres souches de Aa de sérotype b ne possédant pas ce clone particulier (JP2) sont désignées de souches de clone non-JP2 peu leucotoxiques. 50 Dr LAKHDAR L. Souche clone JP2 Souche clone non-JP2 Fig 9 : Illustration de la délétion du fragment d’ADN 530 pb dans la région promotrice de l'opéron (ltx) concernant la souche de Aa clone JP2 entraînant un raccourcissement du fragment en comparaison avec celui d’une souche de Aa non-JP2 (161) 4. Pathogénie Au cours de ces dernières années, de nombreuses études et travaux de recherche ont été conduits sur Aa, avec ses différents sérotypes, pouvant être associés à la santé parodontale, à différentes formes de parodontites ou encore impliqués dans la pathogénie d’infections extraorales (164, 165). D’après Van Winkelhoff et Slots 1999 (166), le Aa est une bactérie orale exogène, pour les raisons suivantes: - Il est rarement retrouvé chez les patients à parodonte sain - Possibilité de transmission du pathogène - Importante réponse de l’hôte contre l’infection par cet organisme - Capacité d’un traitement approprié à éliminer la bactérie de la cavité buccale. 51 Dr LAKHDAR L. 4.1 Implications dans les parodontites agressives: A. actinomycetemcomitans serait fortement incriminée dans le processus de destruction tissulaire liée aux maladies parodontales sévères, notamment aux parodontites agressives. En effet, des études à travers le monde ont confirmé l’implication pathogénique de ce pathogène (138, 142, 165). Et au Maroc, une série d’études prospectives réalisées par Haubek, en collaboration avec le Département de Parodontologie de la Faculté de Médecine Dentaire de Rabat (136, 160, 162, 163, 167, 168-170) a permis de mettre en évidence une forte association entre des taux élevés de Aa et des lésions parodontales progressives dans les parodontites agressives. Ces recherches ont ainsi confirmé l’implication du clone JP2 du A. actinomycetemcomitans, présent de façon endémique au Maroc, en tant qu’agent étiologique important dans l’initiation et la progression des lésions associées à la parodontite agressive chez les adolescents marocains. Cependant, davantage d’études sont nécessaires pour évaluer la relation causale de cette association. Néanmoins, A. actinomycetemcomitans joue un rôle majeur dans la pathogénèse des parodontites agressives par différents mécanismes : - Des facteurs de virulence : qui caractérisent ce pathogène et confirme son implication dans l’étiopathogénie de ces pathologies. - Transmisssion intra-familiale du pathogène : également incriminée dans la pathogénèse des parodontites agressives. 4.1.1 Facteurs de virulence A.actinomycetemcomitans possède de nombreux facteurs de virulence qui contribuent à la colonisation et la pathogenèse de ce germe. En effet, ces facteurs lui permettent de coloniser les zones sous-gingivales et d’envahir les tissus parodontaux, de perturber les mécanismes homéostatiques ou protecteurs de l’hôte et échapper aux mécanismes de défense antibactériens de ce dernier, d’initier la destruction du tissu conjonctif et d’interférer avec la réparation des tissus (171-174). Ces facteurs de virulence peuvent ainsi agir directement en initiant la destruction tissulaire ou indirectement en inhibant les réponses de l’hôte. 52 Dr LAKHDAR L. Action directe : destruction tissulaire Certains facteurs de virulence de A. actinomycetemcomitans ont la propriété de détruire les tissus parodontaux ou d'altérer leur réparation. L’adhésion bactérienne est la première étape dans le processus d’invasion cellulaire. Elle est médiée par des adhésines, lipopolysaccharides, ou fimbriae (175). A.actinomycetemcomitans, exprime à sa surface des lipopolysaccharides (LPS), molécules prédominante sur la surface bactérienne et importante pour la viabilité et la stabilité de la membrane des bactéries à Gram négatif (176). Il a été démontré que les LPS seraient impliqués dans la sécrétion d’autres facteurs de virulence (177-179) et dans la régulation de leurs activités biologiques (180-182). Ils auraient également pour rôle de stimuler la résorption osseuse et la production de cytokines et médiateurs de l’inflammation par les macrophages tels que l’IL-1, TNF, et les PGE2, qui participent aux réactions biologiques de destruction tissulaire (183). Les adhésines, également produits par A.actinomycetemcomitans jouent un rôle important dans l’adhérence bactérienne et les intéractions avec les cellules épithéliales gingivales (184, 185). Elles permettent la fixation à des récepteurs spécifiques sur la muqueuse buccale et le biofilm dentaire (175) facilitant ainsi le processus d’invasion tissulaire. D’autres facteurs de virulence retrouvés chez le Aa sont également incriminés dans la destruction des tissus de l’hôte tels que les collagénases qui dégradent le collagène du tissu conjonctif (183) et les facteurs cytotoxiques qui empêchent la croissance des fibroblastes, par diminution de la synthèse d'ADN et d'ARN (186). Ces derniers inhiberaient la réparation des lésions parodontales, en altérant la production du collagène. Action indirecte: Evasion aux défenses de l’hôte A. actinomycetemcomitans possède de nombreux facteurs de virulence lui permettant de coloniser les zones sous-gingivales et d’échapper aux mécanismes de défense antibactériens de l’hôte. Il a été démontré que A. actinomycetemcomitans est capable d’envahir les tissus de l’hôte en passant à travers les cellules épithéliales pour se retrouver dans le tissu conjonctif sous-jacent (187-189). Cette invasion intracellulaire peut isoler cette bactérie de façon à la rendre plus difficile à détecter par le système immunitaire, et échapper à l’éradication par le traitement mécanique conservateur (détartrage et débridement parodontal). 53 Dr LAKHDAR L. D’autres facteurs de virulence caractérisent également A.actinomycetemcomitans et sont impliqués dans la perturbation des mécanismes de défense de l’hôte tels que: les toxines comprenant essentiellement : la leucotoxine et la toxine cytolétale de distension (TCD). La leucotoxine a été la 1ère exotoxine de A.actinomycetemcomitans identifiée (190, 191) et représente un facteur de virulence majeur. Elle est composée génétiquement d’un groupe de quatre gènes responsable de la capacité du microorganisme à tuer les polynucléaires humains (191-194). Selon la variation dans la régulation de transcription de ces gènes, les souches leucotoxiques de A.actinomycetemcomitans seront classées en souches hautement ou peu leucotoxiques. Les souches hautement leucotoxiques feront l’objet de notre présent travail, telles la souche de sérotype b, clone JP2. Elles sont caractérisées par une délétion de 530 pb dans la région promotrice de l'opéron du gène de la leucotoxine, résultant en une production augmentée de la toxine (195). Cette leucotoxine induit une nécrose voire une apoptose des cellules cibles (178, 179, 196-199), incluant les neutrophiles, les macrophages (200), les lymphocytes et les érythrocytes (201-203), ainsi que les cellules endothéliales (204). La toxine cytolétale de distension (TCD) est une autre toxine exprimée par A.actinomycetemcomitans. Elle est également impliquée dans l’intéraction avec le système immunitaire (205, 206) et dans des dégâts au niveau des cellules de la barrière épithéliale (207). A.actinomycetemcomitans est la seule espèce bactérienne orale connue pour produire cette toxine (208). Plusieurs études supportent le rôle important que jouerait la TCD dans la pathogénèse des parodontites agressives (209-212). En effet, la TCD provoque une apoptose des lymphocytes ainsi qu’une perturbation de la fonction des macrophages (phagocytose et sécrétion des cytokines) (213, 214). En outre, il a été démontré que la TCD cause des dommages structuraux au niveau de l’épithélium oral (215) et induit un arrêt du cycle cellulaire ainsi que des dégâts au niveau des cellules épithéliales du parodonte (216). Tout ceci confirmerait ainsi le rôle de la TCD dans la pathogénèse précoce des parodontites agressives en présence de A.actinomycetemcomitans. 4.1.2 Transmission intrafamiliale Alaluusua et al en 1991 (217) ont étudié, au sein de la même famille, la distribution et la prévalence de A. actinomycetemcomitans et ont avancé l’hypothèse d’une possible transmission intrafamiliale du pathogène en retrouvant le même sérotype de A. 54 Dr LAKHDAR L. actinomycetemcomitans chez parents et enfants. Ces résultats ont été supportés en 2007 par Haubek et al. (218), qui ont mis en évidence une colonisation des membres de la même famille, originaire de l’Afrique du Nord, par le clone JP2 de A. actinomycetemcomitans. Ces souches comporteraient des mutations ponctuelles caractéristiques, distinguant les individus provenant de ces régions et appuyant ainsi cette hypothèse de transmission bactérienne intrafamiliale. La dissémination de la souche entre les membres de la famille serait due, d’après une autre étude de Haubek et al. chez des adolescents marocains (219), à des contacts étroits en rapport avec des habitudes comportementales telles que: partager le même plat ou la même boisson… Ces habitudes entraîneraient un échange de salive entre individus qui serait la cause de la transmission intrafamiliale du germe. 4.2 Implication dans les infections extraorales A. actinomycetemcomitans est un membre du groupe HACEK, associé à d’autres bactéries : Haemophilus influenzae, H. para influenzae, H. aphrophilus, H. paraphrophilus, cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens et Kingella kingae (220). Tous ces microorganismes sont à l’origine de 3% de cas d’endocardites infectieuses, et A. actinomycetemcomitans serait le plus fréquement impliqué dans cette pathologie cardiaque (221). En effet, plusieurs études ont mis en évidence divers signes et symptômes d’endocardite infectieuse causée par A. actinomycetemcomitans incluant fièvre, perte de poids, anémie, hématurie microscopique… (222-224). Par ailleurs, A. actinomycetemcomitans a été associé à d’autres infections systémiques telles : méningites, abcès cérébraux (225) ou encore pneumonie en entraînant une destruction de la paroi thoracique (226, 227). 5. Epidémiologie A. actinomycetemcomitans est retrouvé et répandu dans le monde entier. Cependant, une répartition géographique inégale a été mise en évidence selon le sérotype et l’origine ethnique des individus. 55 Dr LAKHDAR L. En effet, selon l’étude de Rylev & Kilian en 2008 (228), une prédominance du sérotype c chez la population asiatique a été rapportée. Quant au clone JP2 appartenant au sérotype b d’A. actinomycetemcomitans, plus virulent, il a été retrouvé chez les adolescents de descendance Méditerranéenne ou Ouest-africaine. Une prévalence élevée de ce germe a été également notée en Amérique latine notamment le Brésil. Cependant, une analyse de la dissémination géographique du clone JP2 du sérotype b de A. actinomycetemcomitans, chez des individus de diverses origines ethniques, réalisée par Haubek et al. en 1997 (229), a démontré que tous les sujets porteurs de ce clone possèderaient une affiliation génétique avec la population africaine. Ces résultats ont été confirmés par d’autres études qui ont également démontré le lien particulier entre la présence du clone JP2 et l’origine africaine des individus colonisés par ce clone (136, 167, 218, 204, 229-235). Ces études ont également mis en évidence une association entre Aa clone JP2 et les parodontites agressives (notamment la forme localisée de la maladie). Au Maroc, Une prévalence de 8,7% du clone JP2, chez 217 adolescents marocains, a été enregistrée en 2001 (136). En 2012, dans un échantillon de 70 marocains atteints de parodontites agressives 77% étaient clone JP2 positifs (236). Dans une autre étude en 2013, portant sur un échantillon de 32 sujets dont 20 atteints de parodontites agressives, un taux 83% de A. actinomycetemcomitans a été relevé (237). 6. Traitement A . actinomycetemcomitans se développe sous forme de biofilm au sein de la plaque sousgingivale. La souche virulente de type sérotype b clone JP2, incriminée dans la pathogénie des parodontites agressives, est retrouvée dans les poches parodontales des patients infectés (160). De ce fait, un traitement sera nécessaire faisant appel à un débridement mécanique du biofilm, souvent associée à un traitement antibiotique empirique. En effet, il existe actuellement un consensus bien clair que le débridement mécanique doit toujours précéder le traitement antimicrobien (238). Ceci s’explique par le fait que les bactéries du biofilm sont plus résistantes aux agents antimicrobiens que les bactéries planctoniques (239). Une désorganisation préalable du biofilm s’impose en conséquence, permettant de perturber les agrégats bactériens structurés qui pourraient protéger les bactéries de l'agent chimique (240). Une réduction mécanique de la charge bactérienne sous-gingivale est également nécessaire, qui pourrait, autrement, inhiber ou dégrader l'agent antimicrobien (238). Quant au traitement antibiotique associé, il trouve son indication dans le traitement des parodontites agressives dans le but majeur d’éliminer entre autre A . actinomycetemcomitans de type sérotype b (clone 56 Dr LAKHDAR L. JP2), agent étiologique principal de ces pathologies. Rappelons que cette bactérie virulente est dotée d’une capacité d’invasion tissulaire atteignant profondèment le tissu conjonctif la rendant ainsi indétectable par le système immunitaire, d’où l’indication d’une antibiothérapie contre ce germe. A. actinomycetemcomitans est généralement sensible aux céphalosporines, aminosides, fluoroquinolones, triméthoprime-sulfaméthoxazole et tétracycline (241, 243), également à rifampicin (244), chloramphenicol (165) et azithromycin (245). Sa susceptibilité à la pénicilline, amoxicilline et ampicilline reste variable (246-248). Par ailleurs, une résistance à l’érythromycine, clindamycin et vancomycine a été rapportée (249-251). Cependant, il est à noter que la susceptibilité de A. actinomycetemcomitans aux antibiotiques est généralement testée in vitro sur la souche sous forme planctonique, ce qui aura pour conséquence une efficacité clinique moindre sur la bactérie organisée en biofilm. Ainsi, en raison de la résistance accrue des bactéries du biofilm aux agents antimicrobiens, ces dernières décennies, des chercheurs commencent à utiliser des biofilms en culture pour leurs essais in vitro pour tester des antimicrobiens oraux (252-258). Néanmoins, les résultats restent encore contradictoires concernant l’efficacité des antibiotiques contre la souche virulente de A. actinomycetemcomitans. Conclusions du chapitre : A. actinomycetemcomitans est un pathogène parodontal complexe, dont le sérotype b (clone JP2) est connu le plus virulent et serait endémique au Maroc. Son traitement requiert un protocole rigoureux faisant appel à un débridement mécanique associé à une antibiothérapie. Cependant, il est important de souligner qu’à la date d’aujourd’hui, il n'y a pas de traitement optimal ou de protocoles universellement acceptés pour le traitement des parodontites agressives dans lesquelles A. actinomycetemcomitans est fortement impliqué. Ceci a pour conséquence l’apparition de résistances antimicrobiennes de plus en plus importantes, en raison de la prescription souvent intempestive ou inadaptée des agents antimicrobiens oraux. Pour toutes ces raisons, on s’oriente, depuis quelques années déjà, vers l’utilisation d’agents naturels à base d’huiles essentielles, aux propriétés antiseptiques bien connues et dépourvues d’effets secondaires, pouvant ainsi être considérés comme une bonne alternative thérapeutique. Cependant, leur activité antimicrobienne et leur efficacité sur les bactéries 57 Dr LAKHDAR L. orales, en particulier sur A. actinomycetemcomitans, reste encore peu explorée, ce qui fera l’objet du chapitre suivant. 58 Dr LAKHDAR L. CHAPITRE IV : ETUDE SYSTEMATIQUE SUR L’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DES HUILES ESSENTIELLES SUR A. ACTINOMYCETEMCOMITANS Introduction Au cours des dernières décernies, un intérêt croissant est porté sur l’utilisation de produits naturels à base d’huile essentielle dans le domaine médical et plus particulièrement en pratique dentaire. De ce fait, la recherche de l’efficacité antibactérienne de ces huiles sur les bactéries orales fait l’objet aujourd’hui de plus en plus d’études à travers le monde. L’objectif de cette étude systématique est de connaitre les huiles essentielles à effet antimicrobien sur A. actinomycetemcomitans ainsi que leurs Concentrations Minimales Inhibitrices et Bactéricides (CMI, CMB), qui nous serviraient de base pour notre partie expérimentale. Matériel et méthodes Notre recherche documentaire a fait appel à des bases de données électroniques internationales, en employant des mots clés (en langue anglaise et française) et des critères d’inclusion et d’exclusion, et en précisant les paramètres étudiés. Bases de données électroniques: Medline, Pubmed, Google scholar Langue utilisée : anglais et français Mots clés (en français et anglais) : essential oils, antibacterial activity, antimicrobial activity, Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans, periodontal bacteria, oral bacteria . Critères d’inclusion : Etudes prospectives in vitro déterminant la CMI et/ou la CMB des huiles essentielles ou de leurs composés testées sur A actinomycetemcomitans. Critères d’exclusion : - Revues de littérature - Etudes in vivo testant des huiles essentielles sur Aa - Etudes in vitro testant des huiles essentielles sur les bactéries orales ou parodontales n’incluant pas A actinomycetemcomitans. - Etudes n’ayant calculé que les diamètres d’inhibition de croissance du A actinomycetemcomitans sans la CMI ou CMB des huiles testées. - Etudes testant des extraits de plantes 59 Dr LAKHDAR L. Paramètres étudiés : - Nature des huiles essentielles à effet antibactérien sur Aa (nom commun, famille des plantes) ou des composés chimiques provenant d’huiles essentielles. - La Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) des huiles testées sur Aa - La Concentration Minimale Bactéricide (CMB) des huiles testées sur Aa - La technique employée pour la détermination de la CMI : méthode de diffusion en milieu solide, méthode de diffusion en milieu liquide en macrodilution ou en microdilution. Résultats - 14 études in vitro ont été trouvées. Dans ces études, l’efficacité antibactérienne des huiles essentielles et /ou de leurs composés sur A. actinomycetemcomitans ainsi que leurs Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) et leurs Concentrations Minimales Bactéricidesont été déterminées (voir le tableau 2). - Les familles des plantes étudiées démontrant un effet antibactérien sur Aa se résument à ce qui suit : Les Lamiaceae (4 études) : 7 espèces (Thymus vulgaris, Satureja hortensis L., Salvia fruticosa M., Lavandula stoechas, Lavandula officinalis, Romarinus officinalis, Salvia officinalis) dont l’espèce de Satureja hortensis L. a montré une CMI fortement faible <0,125µl/ml soit <0,01%. Les Myrtaceae (5 études) : 4 espèces (Myrtus communis L., Leptospermum scoparium, Melaleuca alternifolia, Eucalyptus radiata) dont l’espèce de Melaleuca alternifolia a présenté la CMB la plus faible (0,05%). Les Asteraceae (2 études): 2 espèces (Artemisia feddei, Artemisia lavandulaefolia) Les Fabaceae (1 étude) : 1 espèce (Cassia bakeriana Craib) Les Zingiberaceae (1 étude): 1 espèce (Boesenbergia pandurata) Les Cupressaceae : 1 espèce (Juniperus communis L. Les Taxodiaceae (1 étude): 1 espèce (Cryptomeria japonica) - L’espèce du Piper sarmentosum, appartenant à la famille « Piperaceae » semble n’avoir aucun effet inhibiteur ou bactéricide sur Aa. 60 Dr LAKHDAR L. - 12 études ont utilisé la méthode de diffusion en milieu liquide pour la détermination de la CMI dont 7 ont eu recours à la technique de microdilution, tandis que 2 études ont employé la méthode de diffusion en milieu solide. Une étude a associé les 2 méthodes (la méthode de diffusion en milieu liquide et solide). - Les valeurs de CMI et CMB rapportées ont été exprimées en: Pourcentage (5 études): 0,02 – 1,56% pour CMI et 0,05-1,56% pour CMB µMol (1 étude): 70-90 µMol pour CMI et CMB µl/ml (1 étude) : <0,125- 8 µl/ml pour CMI mg/ml (5 études) : 0,025- 6,4 mg/ml pour CMI et : 0,025- 12,8 mg/ml pour CMB µg/ml (2 études) : 125-1000 µg/ml pour CMI. Huile essentielle (HE)/ composé chimique HE de Cassia bakeriana Craib (Cassia rose °/ Fabaceae*) Menthol +Thymol +Eucalyptol (bain de bouche) Hinokitiol (composant de l’HE de Chamacyparis taiwanensis) HE de Thymus vulgaris (Thym°/ Lamiaceae*) Technique employée pour le calcul de la CMI Diffusion en milieu liquide (microdilution) Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) 125 µg/ml (feuille et écorce) 1000 µg/ml (bois) Concentration Minimale Bactericide (CMB) ND Diffusion en milieu liquide (microdilution) Diffusion en milieu liquide (macrodilution) Diffusion en milieu solide 1,56% (1/2 6) 1,56% (1/2 6) Francesca et al. 2013 (260) 70 µM 70 µM Shih et al. 2013 (261) 90 µM 90 µM Diffusion en milieu solide Linalool a-Terpineol Diffusion en milieu liquide (microdilution) HE de Boesenbergia pandurata (Zingiberaceae*) HE de Piper sarmentosum (Piperaceae*) Diffusion en milieu liquide (microdilution) ≤ 62-500 µg/ml 0,1 mg/ml 0,2 mg/ml 0,5 mg/ml - 61 ND 0,1-0,2 mg/ml 0,2-0,4 mg/ml 1 mg/ml - Etude Cunha et al. 2013 (259) Kędzia et al. 2013 (262) Park S-N. et al. 2012 (263) Taweechaisup apong et al. 2010 (264) Dr LAKHDAR L. HE de Satureja hortensis L. (sariette savourée°/ Lamiaceae*) HE de Salvia fruticosa M. (sauge grecque°/Lamiaceae*) HE de Lavandula stoechas L.(lavande°/Lamiaceae*) HE de Myrtus communis L. (Myrte commune/ Myrtaceae* HE de Juniperus communis L. (Genévrier commune°/ Cupressaceae*) HE de Cryptomeria japonica (Cèdre du Japon°/ Taxodiaceae*) α-Pinene Sabinene α-Terpineol Terpinen-4-ol HE de Artemisia feddei (Asteraceae*) Borneol α-Terpineol Camphor 1,8-Cineole Terpinen-4-ol β-Caryophyllene HE de Artemisia lavandulaefolia (Asteraceae*) HE de Leptospermum scoparium (Manuka° / Myrtaceae*) HE de Melaleuca alternifolia (Arbre à thé °/ Myrtaceae*) HE de Eucalyptus radiata (Eucalyptus radié°/Myrtaceae*) HE de Lavandula officinalis (Lavande°/ Lamiaceae*) HE de Romarinus officinalis (Romarin°/ Lamiaceae*) HE de Melaleuca alternifolia (Arbre à thé °/ Myrtaceae*) Diffusion en milieu solide <0,125 µl/ml ND Gursoy UK. et al. 2009 (265) 0,4 mg/ml 0,8 mg/ml Cha JD. et al. 2007 (266) 6.4 1.6 1.6 1.6 6.4 mg/ml 1.6 mg/ml 3,2 mg/ml 3,2 mg/ml 0,8 mg/ml 8 µl/ml 4 µl/ml 2-1 µl/ml 4 µl/ml Diffusion en milieu liquide (macrodilution) Diffusion en milieu liquide (macrodilution) Diffusion en milieu liquide (macrodilution) mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml 0,8 mg/ml 0.8 mg/ml 1.6 mg/ml 6.4 mg/ml 6.4 mg/ml 1.6 mg/ml 1.6 mg/ml 0.025 -0.05 mg/ml Diffusion en milieu liquide (microdilution) 0,03 % 1.6 mg/ml 3.2 mg/ml 12.8 mg/ml 12.8 mg/ml 3.2 mg/ml 1.6 mg/ml 0,025 – 0,1 mg/ml 0,13 % 0,25-0,5 % 0,5 % 0,5% 0,5% 0,5 % >1 % 0,5 % 1% 0,06% 0,06% Diffusion en milieu liquide (microdilution) 62 Cha et al. 2007 (267) Cha et al. 2005 (268) Takarada et al 2004 (269) Hammer et al 2003 (270) Dr LAKHDAR L. HE de Melaleuca alternifolia (Arbre à thé °/ Myrtaceae*) HE de Melaleuca alternifolia (Arbre à thé °/ Myrtaceae*) HE de Mentha x piperita (Menthe poivrée°/ Lamiaceae*) HE de Salvia officinalis (Sauge°/ Lamiaceae*) Thymol Eugenol Diffusion en milieu liquide 0,02 % (macrodilution) Diffusion en milieu liquide (microdilution) 0,05 % 0,11 % > 0,6 % 0,1- 0,3 % 0,43 % 0,06-0,2 % 0,57 % 0,02-0,03 % 0,05-0,14 % 0,04 % 0,14 % Kulik et al. 2000 (271) Shapiro et al 1994 (272) Tableau 2 : Etudes in vitro montrant l’activité antimicrobienne (CMI/CMB) des huiles essentielles sur A.actinomycetemcomitans ° : Nom commun de la plante, *: famille de la plante, ND : non déterminée, - : aucun effet inhibiteur /bactéricide. Discussion Cette étude a mis en évidence une série de travaux de recherche évaluant l’activité antimicrobienne des huiles essentielles et de certains composés chimiques sur A. actinomycetemcomitans, bactérie parodontopathogène, connue virulente (sérotype b) dans certaines formes de parodontopathies ou d’infections systémiques (voir chapitre III). Ces études in vitro ont démontré une efficacité antimicrobienne effective de toutes les huiles et les composés testés excepté pour l’huile essentielle de Piper sarmentosum, appartenant à la famille « Piperaceae » qui semble être inefficace sur Aa (264). La famille des « Lamiaceae » a été le plus étudiée, et a révélé une forte activité antimicrobienne avec l’effet le plus prononcé sur Aa pour l’huile essentielle de Satureja hortensis L (CMI< 0,01%). En effet, les plantes de la famille des Lamiaceae sont très répandues, possédant une distribution mondiale et comprenant plus de 7200 espèces sur environ 240 genres. Elles sont largement utilisées dans plusieurs domaines : culinaire, cosmétiques, production d’arômes et médecine populaire (273). Leurs activités biologiques intéressantes sont attribuées aux polyphénols, aux terpènes et aux huiles essentielles (274). Elles sont ainsi largement utilisées pour leurs propriétés antimicrobiennes (275, 276). 63 Dr LAKHDAR L. Par ailleurs, 4 espèces de la famille des « Myrtaceae » se sont avérées efficaces avec une valeur de CMI la plus faible (0,02%) pour l’huile essentielle de Melaleuca alternifolia (Arbre à thé). En effet, Il est bien connu que dans la famille Myrtaceae, il existe une grande variété de principes actifs contre les micro-organismes, y compris des huiles essentielles, des flavonoïdes et des tanins (277, 278). D’autre part, 2 espèces de la famille des « Asteraceae » ont montré des valeurs intéressantes de CMI et CMB témoignant d’un effet antibactérien non négligeable sur Aa. Les Asteraceae, considérées comme la plus large famille des plantes à fleurs, sont connues en médecine traditionnelle pour leurs propriétés médicinales. Cependant, l’évaluation de leur activité antimicrobienne contre divers microorganismes (Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli) réalisée par plusieurs études a été considérée comme faible ou modérée voir souvent nulle (276-281). Néanmoins, l’activité antibactérienne des 2 espèces des « Asteraceae » testées sur Aa (Artemisia lavandulaefolia, Artemisia feddei), figurant dans notre recherche documentaire, semble plus prometteuse. Concernant les composés chimiques testés des huiles essentielles, les valeurs de CMI et de CMB trouvées semblent proches de celles des huiles étudiées. Or, dans les études Cha et al en 2007 (266, 267), comparant l’effet antibactérien des huiles et celui de chacun ses composants majeurs isolèment sur Aa, des différences ont été observées. En effet, l’activité antimicrobienne de l’huile testée contre Aa s’est avérée supérieure, quantitativement, à celle des composants majoritaires testés séparèment. Ceci s’explique, selon les travaux de Lahlou et al. 2000, 2001, 2002, 2003 (281-289), par le fait que l'activité biologique d'une huile essentielle est en relation directe stricte et en corrélation avec sa composition chimique. L’analyse des méthodes employées, par l’ensemble des travaux répertoriés, pour la détermination de la CMI (tableau 2) a mis en évidence une grande variabilité entre les études. En effet, nous avons constaté que la majorité des études a fait appel à la technique de diffusion en milieu liquide, et plus précisèment à celle de microdilution sur microplaque de 96 puits. Selon l’étude de Budzyńska et al 2009 (290), cette technique est plus sensible que la méthode de diffusion en milieu solide offrant une meilleure précision et une meilleure reproductibilité des résultats. Ceci serait dû au cloisonnement des composants de l'huile dans la gélose en fonction de leur affinité avec l'eau. Cette limitation peut être réduite par le choix approprié d’un émulsifiant ou d’un solvant n’ayant pas d’effet sur la croissance bactérienne. 64 Dr LAKHDAR L. Les méthodes de microdilution utilisant d’emblée un émulsifiant pour améliorer la solubilité de l’huile et permettre un meilleur contact microorganisme-huile, ont été optimisées et s'avèrent ainsi plus précises pour tester l’activité antimicrobienne des huiles essentielles. Cependant, il est important de souligner qu’il n’existe pas de procédures standardisées pour la détermination du pouvoir antimicrobien des huiles essentielles telles qu’il en existe pour les antibiotiques selon les recommandations de CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (291-293) par The National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, PA, USA (NCCLS). Ceci étant lié aux nombres de facteurs pouvant influencer l’activité biologique des huiles essentielles (type de solvant, concentration létale de l’huile, composition…). En effet, ces données confirment la divergence des résultats entre les études de Tarakada et al 2004 (269), Hammer et al 2003 (270) et Shapiro et al 1994 (272) qui ont étudié la même huile (Melaleuca alternifolia), en employant la même méthode expérimentale, mais ont trouvé des valeurs différentes de CMI et CMB. Enfin, notre étude systémique comprend certaines limites. La comparaison des données concernant les CMI et CMB enregistrées pour les huiles essentielles testées sur le Aa est rendue difficile à cause de la divergence au niveau des unités de mesure utilisées pour ces valeurs (Pourcentage, µMol, µl/ml, mg/ml, µg/ml). Autrement dit, les CMI et CMB sont exprimées soit en v/v ou en m/v (m : masse, v : volume). Ceci rend les études difficilement comparables. Néanmoins, selon les données de littérature (294), pour les valeurs de CMI exprimées en mg/ml, l’activité antimicrobienne est considérée forte entre 0.05 – 0.50 mg/ml, modérée entre 0.6 –1.50 mg/ml et faible pour des valeurs supérieures à 1.50 mg/ml. Selon les résultats des études issues de notre présente recherche (tableau 2), les valeurs de CMI rapportées se situent entre 0,025 mg/ml et 1mg/ml, ce qui témoigne d’une activité antimicrobienne non négligeable des huiles essentielles testées sur le Aa, avec un effet maximal pour l’huile essentielle de Artemisia lavandulaefolia (CMI : 0,025- 0,05 mg/ml) (268) et minimal pour l’huile essentielle de Cassia bakeriana Craib (bois) (CMI : 1 mg/ml ) (259). Conclusions Il ressort de notre présente étude systématique qu’il existe des huiles essentielles ayant un effet antimicrobien prometteur sur A. actinomycetemcomitans. Cependant, selon leur 65 Dr LAKHDAR L. appartenance (famille de la plante), leur espèce botanique, leur composition ou la technique expérimentale employée, ces huiles présentent différents degrés d’activités antibactériennes. Il est par ailleurs important de souligner que le nombre d’études trouvées reste encore insuffisant, les méthodes non encore standardisées avec pour conséquence des résultats difficilement comparables. Par conséquent davantage de travaux de recherche scientifiques expérimentaux sont nécessaires, faisant appel à des protocoles rigoureux et fiables se basant sur des études randomisées de haut niveau de preuve scientifique. CONCLUSIONS DE LA 1ère PARTIE : A partir des données collectées d’après notre étude bibliographique et notre revue systématique, nous pouvons tirer les conclusions suivantes : - Les plantes les plus utilisées par les Marocains pour usage thérapeutique dans les affections bucco-dentaires, sont principalement représentées par les Lamiaceae, Myrtaceae, Asteraceae et Apiaceae (Chapitre I, tableau 1). Cependant, leur efficacité thérapeutique doit être démontrée scientifiquement par des études basées sur la preuve, en débutant par des essais in vitro. - Les huiles essentielles ayant un effet antibactérien puissant sur Aa appartiennent principalement aux familles des « Lamiaceae » et « Myrtaceae » (Chapitre IV), dont les espèces d’origine Marocaine, pourtant répandues, restent encore non explorées sur cette souche. - La méthode de microdilution pour la détermination de la CMI des huiles essentielles sur Aa est la plus recommandée (Chapitre IV). Néanmoins, un protocole rigoureux, basée sur la preuve et fondé sur des données de littérature fiables est nécessaire pour mener à bien des essais in vitro dans les meilleures conditions. Enfin, toutes ces informations nous serons utiles et seront pris en compte pour entamer notre expérimention in vitro sur l’effet antibactérien des huiles essentielles (marocaines) sur A. actinomycetemcomitans, qui représente la deuxième partie de notre travail. 66 Dr LAKHDAR L. PARTIE II (EXPERIMENTALE): ETUDE IN VITRO 67 Dr LAKHDAR L. CHAPITRE I : ISOLEMENT D’UNE SOUCHE CLINIQUE D’AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS Introduction L’Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) est considéré comme l’un des pathogènes oraux majeurs incriminés dans les parodontites agressives, réel problème de santé publique au Maroc. C’est une bactérie évoluant au sein du biofilm parodontal qui est une communauté bactérienne complexe. De ce fait, pour pouvoir mener des essais in vitro sur cette souche afin d’évaluer l’effet antibactérien des huiles essentielles, qui fait l’objet de notre travail, nous avons procédé tout d’abord à l’isolement de ce pathogène. Ainsi, ce chapitre de notre étude in vitro expose la démarche suivie pour l’isolement et la détection de Aa, souche bactérienne Marocainne, contenue dans des échantillons cliniques de biofilm parodontal. Matériel et méthodes 1. Milieu sélectif Nous avons choisi un milieu de culture sélectif dépourvu de sang : « Dentaid-1 » selon la méthode de Alsina et al. 2001 (295): Nous avons préparé le milieu à base de Brain Heart Infusion Agar (BHIA) avec additifs (extrait de levure, fumarate de sodium et formate de sodium) et de la Vancomycine (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) (Fig 10) en respectant les conditions d’asepsie (en présence d’une source de chaleur par le bec benzène et d’une hotte) (Fig 11). 68 Dr LAKHDAR L. Fig 10: milieu de culture sélectif pour Aa (Dentaid 1) (Laboratoire de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V, Rabat) Fig 11: hotte pour l’asepsie (Laboratoire de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V, Rabat) 2. Prélèvement clinique: Il a été réalisé chez des patients atteints de parodontite aggressive, ayant bénéficié d’une consultation au Service de Parodontologie du Centre de Consultation et de Traitement dentaire (CCTD) de Rabat. Nous avons effectué un prélèvement sous-gingival de biofilm parodontal à l’aide de pointe de papier endodontique stérile, à l’abri de salive et de sang (Fig 12). Ensuite, le prélèvement a été mis dans un milieu de transport (Fig 13), transporté au laboratoire de Microbiologie de la Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V, Souissi, Rabat. Une fois, au laboratoire, le prélèvement a été mixé au vortex (Fig 14) avant d’être ensemencé dans le milieu de culture. 69 Dr LAKHDAR L. Fig 13: échantillon de biofilm parodontal sous-gingival dans le milieu de transport (Centre de Consultation et de Traitement dentaire (CCTD) de Rabat, CH Ibn Sina, Rabat) Fig 12: prélèvement sous-gingival à l’aide d’un cône en papier (Centre de Consultation et de Traitement dentaire (CCTD) de Rabat, CH Ibn Sina, Rabat) Fig 14: prélèvement mixé au vortex (Laboratoire de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V, Rabat) 70 Dr LAKHDAR L. 3. Ensemencement du milieu Après avoir passé l’échantillon de biofilm au vortex, on ensemence à l’aide d’une oese le milieu Dentaid-1 qui sera incubé, dans une jarre (Fig 15), en anaérobiose (CO2 à 5%) à 37°C pendant 5j. Fig 15 : milieu sélectif ensemensé mis dans une jarre anaérobie (Laboratoire de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V, Rabat) 4. Souche de référence : Aa: HK 1605, fournie par le laboratoire de Microbiologie, Faculté de Médecine, Université Aarhus, Danemark., utilisée pour comparer les résultats de l’isolement (aspect des colonies, tests biochimiques d’identification) afin de confirmer ou infirmer le diagnostic (Fig 16). Fig 16 : souche de référence lyophylisée de Aa : HK 1605 71 Dr LAKHDAR L. Résultats Après 5j d’incubation en conditions anaérobies (5% de CO2), les résultats ont montré l’apparition de petites colonies circulaires, convexes en grains de sable (Fig 17a-b). En prélevant une colonie, nous avons réalisé les tests biochimiques d’identification (Fig 18): Catalase : à l’aide d’une solution d’eau oxygénée a montré un résultat positif (Fig 19) Test oxydase par disque s’est révélé négatif (Fig 20). a b Fig 17: résultat après 5j d’incubation a: image des colonies sur toute la gélose, b: image agrandie des colonies (Laboratoire de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V, Rabat) 72 Dr LAKHDAR L. Fig 19: test de catalase positif : apparition de bulles de gaz Fig 18: Eau oxygénée et disques d’oxydase pour identification biochimique du Aa Fig 20 : test d’oxydase négatif : colonie déposée sur le disque n’a entraîné aucun changement de couleur 73 Dr LAKHDAR L. Par ailleurs, la coloration de Gram a mis en évidence au microscope, au grossissement 100 des bactéries à Gram négatif sous forme de coccobacilles (Fig21). Fig 21 : Aspect des colonies en coccobacilles au Microscope optique (Laboratoire de Bactériologie, Hôpital militaire d’instruction Mohammed V, Rabat) Ces résultats, confrontés à la souche de référence (Aa: HK 1605) de même aspect colonial et microscopique, et répondant aux mêmes tests biochimiques, confirment ainsi ces résultats d’identification du Aa, isolat clinique. 74 Dr LAKHDAR L. Discussion Aggregatibacter actinomycetemcomitans est une bactérie à Gram négatif, anaérobie facultatif, qui nécessite, pour sa croissance, un milieu nutritionnel complexe. Cependant, sa croissance peut être inhibée in vitro par les espèces streptococciques oraux (296), d’où l’intérêt d’un milieu de culture sélectif pour la détection et l’énumération de cette bactérie. Bien qu’il existe de nouvelles techniques moléculaires extrêmement sensibles dans la détection de ce type de pathogène (297-299), les techniques de culture restent encore des méthodes de références. Le développement d’un milieu sélectif est basé sur la sélection d’une base nutritive adéquate et d’un système d’inhibition propre pour la réduction de microorganismes contaminants. Dans la littérature, la trypticase soja agar additionnée à du sang (300) ou du sérum (TSBV) (301) a été le milieu sélectif de référence pour l’isolement du Aa. Récemment, BHIA paraît être également une base nutritive permettant une bonne croissance des cultures pures de bactéries. Aussi, l’adjonction d’extraits de levures permet un développement colonial comparable à celui observé dans le milieu TSBV (301). Par ailleurs, si le sang et le sérum sont omis de la formule, les micro-organismes contaminants avec une exigence nutritionnelle élevée sont contrôlés, et le coût par plaque diminue considérablement. De plus, Dentaid-1, grâce à son contenu en vancomycine, formate, fumarate et BHIA, ajoutés à l’absence de sang ou sérum, permet une inhibition de croissance de Heamophilus aphrophilus et Heamophilus paraphrophilus (301), pathogènes moins contrôlés par TSBV; sachant que H. aphrophilus est morphologiquement similaire au Aa (295). La vancomycine contenue dans Dentaid-1 a été choisie pour son efficacité dans l’élimination des espèces streptococciques, connues pour être inhibiteurs de la croissance de Aa in vitro (300, 301), et pour la haute résistance de Aa à cet antibiotique. Dans notre étude, l’identification présomptive de Aa est basée sur l’activité catalase et oxydase ainsi que sur la morphologie coloniale sur gélose et bactérienne au microscope. Il existe d’autres moyens de détection rapide tels que le test de fermentation de lactose (302, 303). Cependant, pour confirmer les résultats, la réalisation d’un test PCR spécifique est recommandée en présence d’un test biochimique négatif non concluant. En effet, on peut rencontrer des souches catalase négatif poussant sur Dentaid-1 et TSBV, mais cela est relativement rare (295). Néanmoins, une fois Aa identifié, d’autres tests restent nécessaires pour diagnostiquer le sérotype en question (a, b, c…) afin de mesurer la pathogénicité du germe, évaluer le pronostic de la maladie parodontal et œuvrer pour un 75 Dr LAKHDAR L. traitement adéquat. Dans notre cas de souche clinique Marocaine isolée, prélevée chez des patients atteints de parodontite agressive, des tests supplémentaires sont nécessaires pour chercher et identifier le sérotype b clone JP2, qui est le plus incriminé dans la pathogénie de ces maladies. Conclusion L’isolement du Aa à partir d’un échantillon clinique sur le milieu sélectif Dentaid-1 semble améliorer la détection de ce pathogène avec un faible coût, présentant ainsi un réel intérêt dans le diagnostic microbiologique et le suivi des patients infectés par cette bactérie virulente. Cette identification constituera ainsi une base pour l’étude de la susceptibilité de ce pathogène aux différents agents antimicrobiens, en l’occurrence les huiles essentielles qui représente l’objet de notre étude doctorale. Néanmoins, des tests de diagnostic plus avancés supplémentaires sont nécessaires pour identifier le clone JP2 de la souche hautement pathogène incriminée dans les parodontites agressives au Maroc. 76 Dr LAKHDAR L. CHAPITRE II : RECHERCHE DE L’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE D’HUILES ESSENTIELLES MAROCAINES SUR AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS INTRODUCTION Compte tenu de l’incidence élevée des parodontites agressives au Maroc liée une souche hautement virulente d’Aggregatibacter actinomycetemcomitans (clone JP2 du sérotype b), et vu la résistance croissante des bactéries orales aux antibiotiques et des effects secondaires provoquées par les agents antiseptiques souvent utilisée en dentisterie (colorations dentaires, altération du goût…), la recherche d’un nouvel agent d’origine naturelle comme alternative thérapeutique, entraînant moins d’effets secondaires et moins de résistances bactériennes est devenu une nécessité. Le Maroc, par sa diversité géographique, possède de grandes ressources naturelles en plantes médicinales et aromatiques, et figure parmi les principaux pays producteurs d’huiles essentielles. Des enquêtes réalisées au Maroc auprès de la population dans différentes régions (voir Partie I, chapitre I) ont mis en évidence un usage thérapeutique fréquent de ce patrimoine naturel en Médecine traditionnelle. Aujourd’hui, des recherches et des études, en continuelle augmentation, sont menées à travers le monde afin de connaître leurs différentes propriétés médicinales et pharmacologiques, et ce dans le but de pouvoir les intégrer dans l’arsenal thérapeutique, selon des normes de qualité et d’efficacité. Cependant, les travaux sur l’apport des plantes médicinales et des huiles essentielles en dentisterie demeurent peu nombreux et leurs activités antimicrobiennes sur les bactéries orales sont peu étudiées. En effet, notre étude systématique portant sur l’effet des huiles essentielles sur Aggregatibacter actinomycetemcomitans a bien mis en évidence cette insuffisance. Pour toutes ces raisons, nous avons mené une recherche sur l’évaluation de l’activité antibactérienne de certaines huiles essentielles d’origine Marocaine sur Aggregatibacter actinomycetemcomitans, souche connue virulente dans le contexte Marocain, puisque 77 Dr LAKHDAR L. fortement incriminée dans les parodontites agressives, réel problème de santé publique dans notre pays. MATERIEL ET METHODES 1. Matériel 1.1. Huiles essentielles : Fournies par l’Institut National des Plantes Médicinales et Aromatiques (INPMA) de Taounate, Maroc (tableau 3). Il s’agit de : - L’huile essentielle de Menthe pouliot (Fig 22) - L’huile essentielle de Bigaradier (Fig 23) - L’huile essentielle de Citronnelle (Fig 24) - L’huile essentielle de Thym (Fig 25) - L’huile essentielle d’Origan (Fig 26) - L’huile essentielle de Palma rosa (Fig 27) Ces huiles ont été extraites de plantes qui ont été cultivées au Maroc, choisis en fonction des effets antimicrobiens connus et documentés et / ou de l'utilisation anecdotique chez les marocains (tableau 3). L'identification botanique a été faite par Prof. Farah Abdellah et les spécimens authentifiés ont été déposés dans l'herbier de laboratoire de photochimie de l'Institut national de plantes médicinales et aromatiques - Université de Sidi Mohamed Ben Abdellah, Fès, Maroc. Les codes ont été fournis à différents échantillons: Mentha pulegium L. (code: FA/RP/INPMA/104), Cymbopogon citratus (code: FA/RP/INPMA/105), Citrus aurantium L. (code: FA / RP / INPMA/106), Thymus vulgaris (code: FA / RP / INPMA/108), Origanum compactum (code: FA / RP / INPMA/107), Cymbopogon martinii (code: FA / RP / INPMA/109). 78 Dr LAKHDAR L. Fig 22 : Menthe pouliot Fig 23 : Bigaradier Fig 25 : Thym Fig 24 : Citronnelle Fig 26 : Origan Fig 27 : Palmarosa 79 Dr LAKHDAR L. Nom Nom Nom commun local scientifique Menthe Fliyo Mentha pouliot Famille Partie utilisée Lamiaceae pulegium L. Partie Propriétés médicinales Antiseptique aéérienne pulmonaire, expectorant, antispasmodique, stomachique, rafraîchissant (31) Citronnelle Leimoun Cymbopogon Poaceae citratus Bigaradier Narendj Citrus Partie Insectifuge (304), aéérienne antiseptique (31) Rutaceae aurantium L. Partie Anti infectieux, aéérienne inotrope (31) (Fleurs) Sédatif et anxiolytique (305, 306) Thym Zîitra Thymus Lamiaceae vulgaris Partie Antiseptique intestinal aéérienne et pulmonaire, expectorant, diurétique, stomachique, vermifuge, antispasmodique (31). Origan Zaâtar Origanum Lamiaceae compactum Partie Antiseptique aéérienne intestinal, diurétique, antiacide, stomachique, antispasmodique (31). Palmarosa Palmarosa Cymbopogon Poaceae martinii Partie Insectifuge (307), aéérienne vermifuge (308), antifongique (309) Tableau 3 : Huiles essentielles Marocaines testées et leurs propriétés médicinales 80 Dr LAKHDAR L. En raison de la faible hydrosolubilité des huiles essentielles, des émulsifiants tels que le Tween 80 sont souvent utilisés pour augmenter la solubilité des composés hydrophobes dans les milieux solides ou liquides (310). Ainsi, une solution mère de travail de ces huiles essentielles émulsifiées dans du Tween 80 à 10% est préparée selon le protocole de Benjilali et al. 1986 (311). 1.2. Souches bactériennes L’activité antimicrobienne des huiles essentielles a été évaluée sur 2 souches bactériennes d’Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa). Il s’agit : * D’une souche Aa isolat clinique ; sérotype b, clone JP2 (Fig 28) : issue de prélèvements de plaque sous-gingivale de patients atteints de parodontite agressive, au Service de Parodontologie du Centre de Consultation et de traitement dentaire de Rabat. Elle a été isolée et lyophilisée par Prof. Akihiro Yoshida de Kyushu Dental University au Japon. Fig 28 : Souche marocaine Aa isolat clinique lyophilisée * Une souche Aa de référence; sérotype b, clone non-JP2 (Fig 29) : CIP 101032 de l’Institut Pasteur à Paris, France. 81 Dr LAKHDAR L. Fig 29: Souche Aa de référence ; sérotype b, clone nonJP2 de l’Institut Pasteur, Paris, France Ces souches ont été mises en culture dans des milieux de culture nutritifs à 37°C sous 5% de CO2 (Fig 30) dans des jarres (Fig 31) à l’intérieur d’une étuve (Fig 32), puis ont été conservées à une température de -20°C et -80°C dans des milieux de conservation (Fig 33). Fig 30 : Générateur de CO2 à 5% Fig 31 : Jarre anaérobie 82 Dr LAKHDAR L. Fig 32 : Etuve (Laboratoire de Recherche et Biosécurité P3- Hôpital militaire et d’instruction Mohammed V, Rabat) Fig 33 : Milieu de conservation de souches 1.3 Milieux de culture : La culture des bactéries a nécessité l’utilisation des milieux suivants : la gélose Brain Heart Infusion (BHI) Agar (Fig 34), gélose au sang cuit ou chocolat Polyvitex (Oxoid Deutschland Gmbh, Postfach, Wesel) (Fig 35) et un bouillon nutritif à base de Brain Heart Infusion (BHI) et extrait de levure (1%) (Fig 36). L’aspect des colonies après mise en culture des souches lyophilisées de Aa isolat clinique (Fig 37) et Aa référence est illustré sur gélose de sang cuit (Fig 38). 83 Dr LAKHDAR L. Fig 34 : Géloses Brain Heart Infusion (BHI) Agar coulées dans des boîtes de pétri (Laboratoire de BactériologieHôpital militaire et d’instruction Mohammed V Fig 35 : Gélose au sang cuit ou chocolat Polyvitex (Oxoid Deutschland Gmbh, Postfach, Wesel) Fig 36 : Bouillon nutritif préparé à base de Brain Heart Infusion (BHI) et extrait de levure (Laboratoire de Recherche et Biosécurité P3- Hôpital militaire et d’instruction Mohammed V, Rabat) 84 Dr LAKHDAR L. Fig 37 : Aspect des colonies de Aa isolat clinique après 48h de mise en culture Fig 38 : Aspect des colonies de Aa référence après 48h de mise en culture 1.4 Antibiotiques : Les antibiotiques suivants ont été utilisés comme produits contrôles (contrôle positive) dans notre étude : Doxycycline (DO) : sous forme de disque de 30 µg pour la méthode de diffusion en milieu solide (gélosé) (Fig 39). Fig 39 : Antibiotique (Doxycycline) en disque de 30 µg Amoxicilline : en solution préparée à la concentration de 10 mg/ml pour la méthode de diffusion en milieu liquide. 85 Dr LAKHDAR L. 2. Méthode expérimentale : 2.1. Extraction des huiles essentielles Une portion (100 g) des parties aériennes des plantes a été hydrodistillée, pendant au moins trois heures, en utilisant un appareil de type Clevenger. Pour éliminer toute trace d'eau, l'huile extraite a été traitée avec du sulfate de sodium anhydre (Na2SO4), filtrée et ensuite stockée à l'obscurité à 4 ° C. Le rendement en huiles essentielles a été exprimé en ml/100 g de matière sèche. 2.2. Analyse chromatographique et caractérisation des huiles essentielles GC : analyse par CG est effectuée sur un chromatographe Hewlett -Packard ( HP 6890 ) gazeuse ( FID) , équipé d'une colonne capillaire HP- 5 (5% de phényl méthyl silicone ) . La caractéristique de cette colonne était de: 30 m de longueur, 0,25 mm de diamètre et de 0,25 m d'épaisseur de film. La température est programmée de 50 ° C (5min d'attente initiale) à 200 ° C à 4 ° C / min . Des conditions de chromatographie en phase gazeuse ont été les suivantes : N2 comme gaz porteur (1,8 ml / min) ; mode partagé (débit: 72,1 ml / min , le rapport : 1/50 ) a été utilisée , les températures de l'injecteur et le détecteur sont de 275 ° C et 250 ° C respectivement . Les échantillons dilués (1/20 dans l'hexane) de 1 l ont été injectés manuellement. La machine a été dirigée par un type de système informatique « HP ChemStation ». GC / MS : La composition chimique des huiles essentielles ont été analysées en utilisant un chromatographe en phase gazeuse (GC Ultra TRACE ) monté sur un spectromètre de masse (Polaris Q-Ion Trap MS). Fonctionnement en mode impact électronique d'assurance-emploi (70 eV). VB- 5 ( méthylpolysiloxane 5% phényle ) et une colonne ( 30m x 0,25 mm x épaisseur de 0,25 pm ) ont été utilisés (Centre national de la recherche scientifique et technique - ( CNRST ) , Rabat , Maroc ) . Les conditions chromatographiques sont les suivantes: températures de l’injecteur et du détecteur à 220 et 300 ° C respectivement; gaz porteur, de l'hélium à un débit de 1,4 ml / min, température de programme rampe de 40 à 300 ° C avec un gradient de 4 ° C / min (maintien de la température initiale et finale pendant 4min). La quantité relative des composants individuels de l'huile totale a été exprimée en pourcentage d’aire du pic par rapport à la zone de pic totale. Une recherche bibliographique a été réalisée en utilisant la combinaison de NIST MS Recherche et de la littérature. Les 86 Dr LAKHDAR L. composants des huiles ont également été identifiés par leurs indices de rétention relatifs à nalcanes (C8 - C24). 2.3. Etude de l’activité antimicrobienne in vitro des huiles essentielles Tous les essais in vitro de recherche de l’activité antimicrobienne des huiles essentielles Marocaines testées ont été réalisés au Laboratoire de Recherche et Biosécurité P3- Hôpital militaire et d’instruction Mohammed V, Rabat. L’activité antibactérienne des huiles essentielles sur les souches d’Aggregatibacter actinomycetemcomitans est réalisée, en 1er temps, par la technique de contact direct par diffusion en milieu gélosé, qui permet de prévoir l’efficacité in vitro de l’huile essentielle. Cette méthode servira ainsi à la présélection des huiles essentielles ayant une activité antimicrobienne effective. Ensuite, pour le calcul de la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) de ces huiles testées efficaces, la méthode de microdilution sur microplaque de 96 puits est utilisée dans notre étude. Enfin, la CMB (Concentration Minimale Bactéricide) est également mesurée suivant le protocole ci-après. 2.3.1. Méthode de diffusion en puits Ce test est réalisé par dépôt de l’huile essentielle dans des puits creusés dans la gélose. Elle assure une diffusion totale de l'H.E. à partir d'un puits en donnant une zone d'inhibition claire et de diamètre facilement mesurable sur gélose ensemencée par la suspension bactérienne selon la technique de DORMAN et DEANS 2000 (127). Préparation de l’inoculum A partir de souches conservées à -20°C (sous formes de billes), une mise en culture est réalisée sur gélose au sang cuit en condition d’anaérobiose sous 5% de CO2 à 37°C pendant 24h. Une suspension bactérienne d’une densité de 0.5 Mc Farland est ensuite préparée à partir de cette culture pure et jeune (âgée de 24 heures) (Fig 40) dans une solution de 0,85% Nacl (Fig 41), en utilisant un étalon (Fig 14). La suspension ajustée devra ainsi contenir approximativement 108 CFU/ml (colony forming units /ml). Il est à signaler que l’inoculum ainsi préparé ne doit pas être utilisé au delà de 30 minutes au risque d’une augmentation de la densité de l’inoculum à cause de la croissance bactérienne. 87 Dr LAKHDAR L. Fig 40 : Aspect des colonies de Aa après 24h de mise en culture (à partir de billes conservées à -20°C) Fig 41 : Solution de Nacl pour préparation de suspension bactérienne et étalon de 0,5 Mc Farland Ensemencement des boîtes de pétri : L’inoculum préparé est ensemencé en surface du milieu gélosé par inondation. Après 15 min, des puits de 6mm sont creusés (Fig 42). Fig 42 : Gélose de sang cuit ensemencée par inondation d’inoculum bactérien avec un puits creusé au centre Ensuite, l'huile essentielle est versée dans chaque puits. On teste l’huile essentielle pure et diluée dans du Tween 80 à 1/10 (10%). 88 Dr LAKHDAR L. La doxycycline en disque de 30ug est utilisée comme contrôle positif, Tween 80 pur et dilué à 10% sont utilisés comme contrôle négatif. Une boîte de pétri ensemencée par inondation a été prise comme témoin de croissance bactérienne (Fig 26). Tous les tests ont été effectués en triplicata. Incubation Les boîtes de pétri ensemencées sont incubées à l’étuve à 37°C, dans des jarres, sous 5% de CO2, pendant 48h. 2.3.2 Méthode de microdilution La détermination de la concentration minimale inhibitrice des huiles testées sur l’Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) est réalisée sur microplaque à 96 puits de culture cellulaire (Fig 43) selon une modification de la méthode décrite par Shapiro et al. (272) et Carson et al. (131). Fig 43 : microplaque à 96 puits utilisée dans la méthode de microdilution A partir de colonies de Aa des 2 souches (isolat et souche de référence) datant de 48h (Fig 44), on inocule 2 tubes contenant BHI (Brain Heart Infusion) stérile. Après24h d’incubation à 37°C dans une jarre sous 5% de CO2, on ajuste la densité à 0.5 Mc Farland. 89 Dr LAKHDAR L. Fig 44 : Colonies de Aa après 48h de mise en culture (à partir de billes conservées à -20°C) Parallèlement, des dilutions en série successives par progression géométrique de raison 2 de la solution mère obtenue pour chaque huile essentielle testée sont préparées dans un milieu de culture stérile (BHI), de façon à obtenir successivement les dilutions : 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512. En prenant en compte la solution mère de base préparée de l’huile essentielle (10%), ces dilutions correspondent, par conséquent, à : 5%, 2,5%, 1,25%, 0,6%, 0,3%, 0,15%, 0,07%, 0,03%, 0,01% . Ensuite, des aliquotes de 100 µl de chaque dilution préparée d’huile testée ont été ajoutées, dans chaque puits de microplaque, à 100 µl d’inoculum préparé, et ce concernant les 2 souches de Aa. Le Tween 80 à 10% est utilisé comme contrôle négatif. Un contrôle de croissance (inoculum seul) pour chaque souche a été inclus également dans l’essai. Pour chaque huile testée, les tests ont été effectués en triplicata sur la même microplaque et l’expérimentation a été répétée 2 fois. Le schéma de la distribution expérimentale au niveau des microplaques est illustré ciaprès (Fig 46). Concernant le contrôle positif : nous avons utilisé l’amoxicilline que nous avons préparé et dont nous avons déterminé la CMI sur les 2 souches de Aa en utilisant la méthode de microdilution dans un bouillon de culture adapté. En l’absence de méthode standardisée d’antibiogramme de Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (304) pour ce type de 90 Dr LAKHDAR L. souche, nous avons adopté la procédure suivante en s’inspirant de celle des « entérobactéries » dans les recommandations de CLSI (312, 313): Une suspension bactérienne en bouillon équivalente au standard McFarland 0,5 a été préparée et ajoutée aux solutions antibiotiques à différentes concentrations (0,01mg/ml, 0,1mg/ml, 1mg/ml, 10mg/ml). Un contrôle négatif (eau stérile + inoculum) est utilisé comme témoin de croissance bactérienne et une solution contenant du bouillon stérile est utilisée comme contrôle de contamination. Ainsi, la concentration de 10 mg/ml, dont la solution est restée claire (non trouble) (Fig 45) a été considérée comme la CMI de l’Amoxicilline qui sera utilisée comme contrôle positif dans notre essai sur les huiles essentielles. Fig 45 : Essai de microdilution pour la détermination de la CMI de l’Amoxicilline testé à différentes concentrations (0,01mg/ml, 0,1mg/ml, 1mg/ml, 10mg/ml) (la solution restant claire (à gauche) est considérée comme la CMI à 10mg/ml) 91 Dr LAKHDAR L. C1 C1 C1 C1 C1 C1 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C4 C4 C4 C4 C4 C4 C+ C- Cc Cc Cc Cc C- C+ Fig 46 : Distribution expérimentale de la microplaque pour chaque huile testée pour la détermination de la CMI C1 C4 : différentes concentrations de l’huile testée + inoculum (Aa isolat clinique en rouge et Aa référence en vert), Cc : contrôle de croissance (inoculum seul), C- : contrôle négatif (tween 80 à 10% + inoculum), C+ : contrôle positif (Amoxicilline + inoculum) Les microplaques, recouvertes de leurs couvercles, ont été mises à l’étuve pour incubation dans des sachets en plastique sous 5% de CO2 (Fig 47), à 37°C pendant 48h. 92 Dr LAKHDAR L. a b Fig 47 : Mise en incubation des microplaques pour la détermination des CMI des huiles testées a: les microplaques mises dans un sachet sous 5% de CO2 b : Le sachet contenant les microplaques est mis à l’étuve à 37°C Après la période d'incubation, une solution à 2 mg / mL de Triphényl Tétrazolium Chloride (TTC) (indicateur de croissance bactérienne) (314) (Fig 48) est ajoutée dans chaque puits et la plaque est incubée à 37 ° C. La solution d'indicateur TTC change du clair au pourpre en présence d’activité bactérienne, tandis qu’elle reste claire lorsque la croissance microbienne est inhibée. CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) est définie comme la plus faible concentration de l'huile essentielle qui ne montre aucune croissance bactérienne visible après la période d'incubation (pas de changement de couleur (claire) de TTC) (Fig 49). 93 Dr LAKHDAR L. Fig 48 : Triphényl Tétrazolium Chlorid (TTC) (Laboratoire de de Microbiologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, UM5SRabat. Fig 49 : changement de couleur au niveau des puits de la microplaque en présence d’activité bactérienne sous l’effet de la solution TTC Pour déterminer la Concentration Minimale Bactéricide (CMB), une aliquote est prélevée à partir de cultures au niveau des puits ne présentant pas de turbidité visible, et ensemencée sur des milieux de gélose de sang cuit et incubée pendant 48h à 37 ° C sous 5% de CO2 (315). La détermination des valeurs de CMB a été réalisée en triplicata. Le rapport CMB / CMI a également été calculé pour mettre en évidence la nature de l'effet antibactérien des huiles essentielles testées. Lorsque le rapport est inférieur à 4, l'huile essentielle est considérée comme une huile essentielle bactéricide et lorsque le ratio est supérieur à 4, elle est considérée comme une huile essentielle bactériostatique (316). 2.4 Analyse statistique Les diamètres des zones d’inhibition, variables continues avec distribution normale, ont été présentés en moyenne ± écart type. Pour les différences statistiques entre les sept groupes (Mentha pulegium, Cymbopogon citratus, Citrus aurantium, Thymus vulgaris, Origanum compactum, Cymbopogon martinii, Doxycycline), l’analyse à un facteur (ANOVA) avec correction Bonferroni a été effectuée. Les variables de Concentrations Minimales inhibitrices (CMI) (%) (v/v) ont été exprimées en médiane et interquartile, et celles concernant les Concentrations Minimales Bactéricides (CMB) (%) (v/v) et le rapport CMB / CMI ont été 94 Dr LAKHDAR L. présentées en moyenne ± écart type. La différence entre la souche Aa JP2 isolat clinique et la souche Aa de référence non JP2 a été testée par le test de Mann-Whitney. La valeur du P < 0.05 a été considérée comme statistiquement significative. L’analyse statistique a été menée en utilisant SPSS pour Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). RESULTATS 1. Composition chimique : L’analyse chimique des huiles essentielles étudiées a mis en évidence les constituants majeurs suivants : - Pour Mentha pulegium : R(+)-pulégone (71.48%) et carvone (5,66%) (Tableau 4) ; - Pour Cymbopogon citratus : Geraniol (27,13%), Citronellol (12,67%), Citronellal (32,77%) et citronellyl acetate (5,08%) (Tableau 5) ; - Pour Citrus aurantium : β-pinene (8,73%), Linalool (33, 92%) et (E)-Nerolidol (5,24%) (Tableau 6) ; - Pour Thymus vulgaris : Thymol (42.01%), P-Cymene (14.34%), γ-Terpinene (12.04%), Carvacrol (5.07%) (Tableau 7) ; - Pour Origanum compactum : γ-terpinene (25.11%), Carvacrol (22.29%), Thymol (19.21 %), p-cymene (18.68 %) (Tableau 8) ; - Pour Cymbopogon martinii : Géraniol 84,12%, Geranyl acetate (6,67%) (Tableau 9) 95 Dr LAKHDAR L. Constituants Indice de Rétention (IR) % 939 -pinene 0.52 952 Cyclohexanone-3-methyl 0.26 980 -pinene 0.39 993 Myrcene 0.16 994 Octanol-3 1.86 1001 -2-carene 0.07 1031 Limonene 1.88 1072 p-mentha-3,8-diene 1.44 1154 Menthone 0.19 1168 Pinocarvone 1.27 1173 Menthol 0.72 1194 Dihydrocarvone 4.64 1238 R(+)-pulégone 71.48 1242 Carvone 5.66 1252 Peperitone 1.13 1418 -Caryophyllene 0.33 1630 -eudesmol 0.28 1649 -eudesmol 0.49 Total 92.77 Rendement 2.34 Tableau 4 : Composition chimique de Mentha pulegium L. huile essentielle 96 Dr LAKHDAR L. Indice de Rétention (IR) Constituants % 930 Tricyclene 0,04 936 -thujene 0,09 939 -pinene 2,22 975 -pinene 0,12 991 -myrcene 0,82 1023 Limonene 3,25 1098 Linalol 0,92 1146 Isopulegol 0,81 1165 Borneol 0,12 1171 Terpinen-4-ol 0,43 1192 -terpineol 0,54 1228 Citronellol 12,67 1255 Geraniol 27,13 1153 Citronellal 32,77 1240 Neral 0,44 1270 Geranial 0,38 1298 Carvacrol 0,13 1356 Eugenol 1,59 1354 citronellyl acetate 5,08 1383 Geranyl acetate 1,87 1391 -elemene 1,3 1480 Germacrene D 1,86 1513 -cadinene 0,32 1524 -cadinene 1,83 1549 Elemol 1,92 1649 -eudesmol 0,34 1653 -cadinol 0,08 Total 99.07 Rendement 1.8 % Tableau 5 : Composition chimique de Cymbopogon citratus huile essentielle 97 Dr LAKHDAR L. Indice de Rétention (IR) Constituants % 936 -thujene 0.06 939 -pinene 0.82 953 Camphene 0.05 975 -pinene 8.72 991 -myrcene 1.88 1074 Linalool oxide 1.25 1088 α-Terpinolene 0.42 1098 Linalool 33.92 1165 Borneol 0.07 1177 Terpinen-4-ol 0.23 1192 -terpineol 3.54 1228 Nerol 0.37 1255 Geraniol 0.08 1240 Neral 0.05 1270 Geranial 0.06 1418 -Caryophyllene 1.21 1564 (E)-Nerolidol 5.24 1722 Farnesol 3.08 Total 61,05 Rendement 0.04 Tableau 6 : Composition chimique de Citrus aurantium L. huile essentielle 98 Dr LAKHDAR L. Indice de Rétention (IR) Constituants* Pourcentage (%)** 931 α-Thujene 2.10 939 α-Pinene 1.87 980 β-Pinene 0.79 988 Octan-l-en-3-ol 0.16 991 Myrcene 2.18 1005 α-Phellandrene 0.51 1018 α-Terpinene 2.04 1026 P-Cymene 14.34 1031 Limonene 1.01 1033 1,8-cineole 0.82 1062 γ-Terpinene 12.04 1068 Cis-sabinen hydrate 0.05 1087 Fenchone 0.06 1088 Terpinolene 0.78 1098 Linalool 4.41 1177 Terpinene-4-ol 1.08 1235 Thymol methyl ether 2.14 1290 Thymol 42.01 1298 Carvacrol 5.07 1352 Terpinyl acetate 0.41 1356 Eugenol 0.25 1391 β-elemene 0.15 1401 Methyl Eugenol 0.41 1418 β-Caryophyllene 0.82 1430 β-copaene 0.16 1454 α-Humlene 0.26 1480 Germacrene D 0.34 1509 -Bisabolene 0.37 1520 δ-cadinene 0.07 1581 Caryophyllene oxide 0.32 Total 97,02 *: constituants identifiés par GC-IK and GC-MS, **: Pourcentages des constituants donnés par GC Tableau 7 : Composition chimique de Thymus vulgaris huile essentielle 99 Dr LAKHDAR L. Indice de Rétention (IR) Constituants % 931 939 α-thujene α-pinene 0.22 0.54 948 Camphene 0.17 973 Sabinene 0.23 976 Sabinene 0.83 980 β-pinene 0.16 984 2-octanol 0.86 991 Myrcene 2.21 999 δ-2-carene 0.09 1005 α-Phellandrene 0.26 1011 δ-3-carene 0.08 1018 α-terpinene 2.79 1023 ο-cymene 0.48 1026 p-cymene 18.68 1143 Camphor 0.05 1050 β-E-ocimene 0.09 1062 γ-terpinene 25.11 1067 Cis-hydrate sabinene 0.15 1080 m-cymenene 0.14 1087 Terpinolene 0.07 1098 linalool 1.24 1165 borneol 0.20 1177 terpinen-4-ol 0.34 1184 ρ -cymen-8-ol 0.09 1189 α-terpineol 0.99 1290 Thymol 19.21 1298 Carvacrol 22.29 1418 E-caryophyllene 1.03 1513 γ−cadinene 0.05 1582 Caryophyllene oxide 0.06 Total 98.71 Tableau 8 : Composition chimique de l’Origanum compactum huile essentielle 100 Dr LAKHDAR L. Indice de Rétention (IR) Constituants % 931 939 α-thujene α-pinene 0.05 0.14 948 Camphene 0.07 973 Sabinene 0.09 980 β-pinene 0.06 991 -Myrcene 0.34 1011 δ-3-carene 0.08 1018 α-terpinene 0.09 1031 Limonene 0.28 1044 b-Ocimene 0.86 1098 Linalool 2.42 1228 Nerol 0.13 1240 Neral 0.21 1255 Geraniol 84.12 1270 Geranial 2.16 1383 Geranyl acetate 6.67 1418 b-Caryophyllene 0.54 1581 Caryophyllene oxide 0.64 Total 98.95 Tableau 9 : Composition chimique de Cymbopogon martinii huile essentielle 101 Dr LAKHDAR L. 2. Activité antibactérienne : Essai de diffusion en puits : Après la période d’incubation (48h), des zones d'inhibition de croissance bactérienne sur gélose, concernant les 2 souches de Aa, sont observées et mesurées par un pied à coulisse (Fig 50-51) (Tableau 10). Cependant, aucun halo d’inhibition n’est obtenu pour les contrôles négatifs (Tween 80 pur et dilué à 10%) (Fig 52). Concernant, le témoin de croissance utilisé, une croissance bactérienne sous forme d’un film recouvrant la gélose est obtenue (Fig 53). Fig 50 : Zone d’inhibition de croissance bactérienne produite par l’huile essentielle (dans le puits) après 48h d’incubation 102 Fig 51 : Zone d’inhibition de croissance bactérienne produite par la Doxycycline (disque au centre de la gélose) après 48h d’incubation Dr LAKHDAR L. Fig 52 : Absence de zone d’inhibition de croissance bactérienne pour les contrôles négatifs (Tween 80 pur et dilué à 10% dans le puits) après 48h d’incubation Fig 53 : Témoin de croissance bactérienne après 48h d’incubation (film bactérien recouvrant la gélose) Les diamètres moyens des zones d’inhibition induits par la Doxycycline pour Aa isolat clinique et Aa référence (22,67 ± 1,15 et 19,33 ± 0,57 respectivement) sont significativement plus petits que ceux produits par les huiles essentielles testées à l’état pur (Mentha pulegium: 39 ± 1,00 et 34,67 ± 0,57, Citrus aurantium: 40 ± 0,00 et 34,33 ± 1,15 Cymbopogon citratus: 42,33 ± 2,51 et 41,33 ± 1,15, Thymus vulgaris 45,00 ± 6,24 et 47,33 ± 6,42, Origanum compactum 51,67 ± 5,77 et 53 ± 2,00, Cymbopogon martinii 39,00 ± 6,55 et 25,67 ± 1,15 respectivement) et à l’état dilué (1/10) (Mentha pulegium15,67 ± 0,57et 15,33 ± 0,57, Citrus aurantium: 15,33 ± 0,57 et 15,66 ± 0,57, Cymbopogon citratus: 28 ± 0,00 et 30,667 ± 1,15, Thymus vulgaris 18,67 ± 1,15 et 20 ± 3,00, Origanum compactum 17,67 ± 2,08 et 18,33 ± 0,57, Cymbopogon martinii 22,67 ± 1,52 et 20,50 ± 5,07 respectivement) (Tableau 10, Fig 54). Pour toutes les valeurs de diamètres d’inhibition obtenues, aucune différence statistiquement significative n’a été enregistrée entre Aa isolat clinique (JP2) and Aa de référence (non-JP2) (P = 0.8). 103 Dr LAKHDAR L. Diamètres des zones d’inhibition (mm) † (M±ET) Agents Mentha pur Aggregatibacter actinomycetemcomitans JP2 (isolat clinique) (N=24) 39,00 ± 1,00 pulegium 1/10 15,67 ± 0,57 15,33 ± 0,57 Citrus pur 40,00 ± 0,00 34,33 ± 1,15 aurantium 1/10 15,33 ± 0,57 15,66 ± 0,57 Cymbopogon pur 42,33 ± 2,51 41,33 ± 1,15 citratus 1/10 28 ± 0,00 30,66 ± 1,15 Thymus pur 45,00 ± 6,24 47,33 ± 6,42 vulgaris 1/10 18,67 ± 1,15 20 ± 3,00 Origanum pur 51,67 ± 5,77** 53 ± 2,00*** compactum 1/10 17,67 ± 2,08 18,33 ± 0,57 Cymbopogon pur 39,00 ± 6,55 25,67 ± 1,15 martinii 1/10 22,67 ± 1,52 20,50 ± 5,07 22,67 ± 1,15 * 19,33 ± 0,57 * pur 6,00 ± 0††† 6,00 ± 0††† (10%) 6,00 ± 0° 6,00 ± 0° Doxycycline (30µg) Tween 80 P <0,001 Aggregatibacter actinomycetemcomitans non-JP2 (CIP 101032) (N=24) 34,67 ± 0,57 <0,001 N : nombre de l’effectif, M± ET : Moyenne ± Ecart Type (pour une expérimentation en triplicata), †:diamètre de la zone d’inhibition incluant le diamètre du puits (6mm). * : P <0,001: Doxycycline Vs Mentha pulegium, Citrus aurantium, Cymbopogon citratus, Thymus vulgaris, Origanum compactum, Cymbopogon martinii (à l’état pur). ** : P < 0,05 : (P= 0,03) : Origanum compactum Vs Mentha pulegium et Cymbopogon martinii. *** : P <0,001: Origanum compactum Vs Mentha pulegium, Citrus aurantium, Cymbopogon citratus et Cymbopogon martinii †† : P <0,001 : Rosmarinus officinalis L. Vs Mentha pulegium, Citrus aurantium, Cymbopogon citratus, Thymus vulgaris, Origanum compactum, Cymbopogon martinii et Doxycycline. ††† : P <0,001 : Tween 80 (pur) Vs Mentha pulegium, Citrus aurantium, Cymbopogon citratus, Thymus vulgaris, Origanum compactum, Cymbopogon martinii et Doxycycline. ° : P <0,001 : Tween 80 (10%) Vs Mentha pulegium, Citrus aurantium, Cymbopogon citratus, Thymus vulgaris, Origanum compactum, Cymbopogon martinii et Doxycycline. Tableau 10 : Diamètres d’inhibition (mm) obtenus par la méthode de diffusion en puits pour les 2 souches de A.actinomycetemcomitans (JP2 et non-JP2) 104 Dr LAKHDAR L. Fig 54 : Diamètres des zones d’inhibition (DZI) des différents agents testés (huiles essentielles HE pures, HE 1/10, Doxycycline et Tween 80 (10%)) pour les 2 souches de A. actinomycetemcomitans (isolat clinique JP2 et souche de référence non-JP2) 105 Dr LAKHDAR L. Essai de microdilution : L’essai des dilutions en série dans les microplaques de 96 puits a révélé des valeurs de CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) allant de 0,03 à 0,7% (v/v) (tableau 11) (Fig 55-60). Origanum compactum a montré l'effet antibactérien le plus prononcé sur les 2 souches de Aa à une CMI de 0,03 %. Concernant les CMB (Concentrations Minimales Bactéricides) enregistrées des huiles testées, les valeurs étaient égales ou proches de celles de la CMI, indiquant une bonne activité bactéricide des huiles essentielles testées contre le Aa. Pour les valeurs de CMI et CMB, aucune différence n'a été observée entre les 2 souches de Aa (isolat clinique et Aa référence) pour toutes les huiles étudiées sauf pour Thymus vulgaris et Origanum compactum qui ont montré des valeurs de CMB pour Aa isolat clinique (0,15% et 0,07% respectivement) supérieures à celles obtenues pour Aa référence (0,07% et 0,03% respectivement). Pour le rapport MBC/MIC, les valeurs étaient inférieures à 4 concernant toutes les huiles testées (Tableau 11, Fig 61). Concernant les comparaisons entre les 2 souches de Aa, une différence statistiquement significative a été rapportée pour le rapport MBC/MIC (P=0,007) (Tableau 12). 106 Dr LAKHDAR L. Fig 55 : Résultats sur microplaque montrant les différentes dilutions testées de l’huile essentielle de Mentha pulegium pour le calcul de la CMI Fig 56 : Résultats sur microplaque montrant les différentes dilutions testées de l’huile essentielle de Citrus aurantium pour le calcul de la CMI (test en duplicata) 107 Dr LAKHDAR L. A B Fig 57 : Résultats sur microplaque montrant les différentes dilutions testées de l’huile essentielle de Cymbopogon citratus pour le calcul de la CMI (A : microplaque recouverte de son couvercle, B : microplaque découverte) Fig 58 : Résultats sur microplaque montrant les différentes dilutions testées de l’huile essentielle de Thymus vulgaris pour le calcul de la CMI (test en duplicatat) 108 Dr LAKHDAR L. Fig 59 : Résultats sur microplaque montrant les différentes dilutions testées de l’huile essentielle d’Origanum compactum pour le calcul de la CMI (test en duplicatat) Fig 60 : Résultats sur microplaque montrant les différentes dilutions testées de l’huile essentielle de Cymbopogon martinii pour le calcul de la CMI (test en duplicatat) 109 Dr LAKHDAR L. A. Actinomycetemcomitans JP2 Agents CMI (%) (M(IQ)) Mentha pulegium 0,3(0,3-0,3) A. Actinomycetemcomitans non-JP2 (isolat clinique) (souche de référence) (N=36) (N=36) CMB(%) (M ±ET) CMB/CMI (M ±ET) 0,6±0 2±0* CMI (%) (M(IQ)) 0,3(0,3-0,3) CMB (%) (M ±ET) CMB/CMI (M ±ET) 0,6 ±0 2±0† Citrus aurantium 0,3(0,3-0,3) 0,3±0 1±0** 0,3(0,3-0,3) 0,3±0 1±0 Cymbopogon citratus 0,07 (0,07-0,07) 0,07±0 1±0*** 0,07 (0,07-0,07) 0,07 ±0 1±0 Thymus vulgaris 0,07 (0,06-0,07) 0,15±0 2,4±0,69° 0,07(0,03-0,07) 0,07±0 1,26±0,41 Origanum compactum 0,03 (0,01-0,03) 0,07±0 2,4±0,97°° 0,03(0,03-0,03) 0,03±0 1±0 Cymbopogon martinii 0,07(0,03-0,07) 0,07±0 1,26±0,41 0,07(0,03-0,07) 0,07±0 1,26±0,41 P <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 M(IQ) : médiane et interquartile, M ±ET: moyenne± écart type * :P <0,05 : Mentha pulegium Vs Citrus aurantium et Cymbopogon citratus (P=0,03) **: P <0,05 : Citrus aurantium Vs Thymus vulgaris et Origanum compactum (P=0,001) *** : P <0,05 : Cymbopogon citratus Vs Thymus vulgaris et Origanum compactum (P=0,001) ° : P <0,05 : Thymus vulgaris Vs Cymbopogon martinii (P= 0,008) °° : P <0,05 : Origanum compactum Vs Cymbopogon martinii (P= 0,008) † : P<0,001 :Mentha pulegium Vs Citrus aurantium,Cymbopogon citratus, Thymus vulgaris, Origanum compactum et Cymbopogon martinii Tableau 11: Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) et Concentrations Minimales Bactéricides (CMB) (%) (v/v) des huiles essentielles testées sur les 2 souches de A. actinomycetemcomitans (JP2 et non-JP2) 110 Dr LAKHDAR L. Fig 61 : Le rapport (CMB/CMI) pour les différentes huiles testées concernant les 2 souches de A. actinomycetemcomitans (JP2 et non-JP2) A. Actinomycetemcomitans JP2 CMI(%) (M(IQ)) 0,07(0,04-0,30) CMB(%) (M(IQ)) 0,11(0,07-0,30) CMB/CMI (M ±ET) 1,68±0,79 (isolat clinique) A. actinomycetemcomitans non-JP2 0,07(0,04-0,30) 0,07(0,07-0,30) 1,25±0,41 0,12 0,98 0,007 (souche de référence) P M(IQ) : médiane et interquartile, M ±ET: moyenne± écart type Tableau 12: Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) et Concentrations Minimales Bactéricides (CMB) (%) (v/v) des huiles essentielles testées obtenues selon le type de souche de A. actinomycetemcomitans (JP2 et non-JP2) 111 Dr LAKHDAR L. DISCUSSION Les résultats de notre présente étude ont mis en évidence une forte activité antimicrobienne des huiles essentielles testées (Mentha pulegium, Citrus aurantium, Cymbopogon citratus, Thymus vulgaris, Origanum compactum, Cymbopogon martinii) contre des souches virulentes d’Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa). Ces huiles étudiées sont d’origine Marocaine, connues pour leur usage thérapeutique en médecine traditionnelle, en particulier concernant Thymus vulgaris, Origanum compactum et Mentha pulegium (48 -50, 54, 55). Ces dernières appartiennent à la famille des Lamiaceae les plus représentées en médecine populaire pour le traitement des affections extra-buccales (digestives, respiratoires…) et buccales (tuméfactions gingivale, stomatite…) (voir Partie 1, chapitre I/. Les plantes médicinales et aromatiques à visée thérapeutique au Maroc). Cymbopogon citratus et Cymbopogon martinii, appartenant à la famille des Poaceae, sont bien connues pour leurs propriétés insectifuges en médecine traditionnelle (304, 307). Leur effet au niveau buccal contre les affections bucco-dentaires est encore inconnu. Quant au Citrus aurantium, appartenant à la famille des Rutaceae, son utilisation thérapeutique en médecine populaire a été rarement rapportée. Cependant des données dans la littérature relatent ses diverses propriétés médicinales comme anti-infectieux principalement (31, 317). Ces huiles d’origine Marocaine, aux nombreux bienfaits, n’ont pour la plupart jamais été testées au niveau buccal pour évaluer leur activité antimicrobienne contre des bactéries orales pathogènes telles que Aggregatibacter actinomycetemcomitans (sérotype b) connu virulent et responsable de dégâts tissulaires considérables au niveau parodontal. Les résultats de notre étude ont mis en évidence une sensibilité de 2 souches virulentes de Aa ; JP2 et non-JP2 vis-à-vis de ces huiles essentielles testées. Ces résultats étaient issus d’une méthodologie que nous avons adoptée en 2 étapes. La 1ère étape consistait en une évaluation qualitative dans le but de présélectionner les huiles possédant une activité antibactérienne sur les 2 souches de Aa. Le 2ème essai représentait une évaluation quantitative par la détermination de la CMI et CMB de ces huiles actives. La méthode de microdilution a été adoptée. Cette dernière est largement utilisée pour l’étude du pouvoir antimicrobien des huiles essentielles et s’avère plus précise avec des résultats plus 112 Dr LAKHDAR L. reproductibles à condition d’inclure un émulsifiant pour améliorer la solubilité de l’huile et permettre un meilleur contact microorganisme-huile (290). L’émulsifiant utilisé dans notre étude a été le Tween 80, qui a été recommandé par plusieurs auteurs (283, 284, 288, 289, 311, 318, 319). Par ailleurs, pour le calcul proprement dit de la CMI, nous avons eu recours à un indicateur de croissance bactérienne, en faisant appel au Triphényl Tétrazolium Chloride (TTC), tel retrouvé dans plusieurs études (131, 314, 320-322). Il s’agit d’un indicateur Redox, qui change de couleur en présence de croissance bactérienne (320). Cependant, cet indicateur peut avoir un effet inhibiteur sur la croissance bactérienne à haute concentration. Dans notre étude, nous avons utilisé une concentration initiale de 2mg/ml, qui équivaut à 0,2%, et qui aboutit à une concentration finale de 0,03%, après adjonction à la solution contenue dans le puits de la microplaque (inoculum + huile essentielle diluée). Ceci est en accord avec l’étude de Rahman et al 2004 (320) qui ont démontré qu’à une concentration < 0.125%, le TTC utilisé pour la détermination de la CMI des bactéries à Gram négatif ne montre aucun effet inhibiteur sur la croissance bactérienne. Concernant nos résultats obtenus lors du 1er essai (diffusion en puits), les diamètres des zones d’inhibition observés pour les huiles essentielles à l’état brut, concernant les 2 souches de Aa testées (isolat clinique et souche de référence), ont montré des valeurs supérieures à 20 mm (Tableau 10), traduisant une haute sensibilité des germes testés aux huiles étudiées, selon Duraffourd et al 1990 (71). Ces huiles émulsionnées dans du Tween 80 à 10% ont été également testées, exposant des diamètres d’inhibition compris entre 15,33 et 30,66 mm, démontrant toujours une sensibilité supérieure des souches testées. Il est important de souligner, dans ces résultats rapportés, que les valeurs des diamètres des zones d’inhibition obtenues pour les huiles pures se sont révélées supérieures à celles trouvées pour la Doxycycline (contrôle positif), avec une différence statistiquement significative (P <0,001), ce qui confirme l’efficacité supérieure des huiles testées. Se référant aux données de littérature, la Doxycycline est un antibiotique connu actif sur Aa avec une CMI90 de 1 µg/ml témoignant déjà d’une forte activité antibactérienne sur cette bactérie (323). (CMI90 : Concentration Minimale Inhibitrice d’antibiotique permettant d'inhiber la croissance de 90% des souches d'une espèce bactérienne). D’autre part, l’effet inhibiteur démontré des huiles essentielles étudiées contre Aa semble plus fort comparé à d’autres bactéries à Gram négatif testées dans des études antérieures. 113 Dr LAKHDAR L. En effet, pour Citrus aurantium (pur), les diamètres enregistrés pour les 2 souches de Aa (40 et 34,33 mm) se sont avèrés plus importants que ceux trouvés pour d’autres microorganismes à Gram négatif tels Salmonella enteritidis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae (11-19 mm), comme rapportés dans les travaux de Ben Hsouna et al. 2013 (324) et Ammar et al. 2012 (325). Pour Cymbopogon citratus, les diamètres d’inhibition calculés pour les 2 souches de Aa (42,33 et 41,33 mm) sont également supérieurs comparés à ceux concernant d’autres bactéries à Gram négatif anaérobies facultatives comme Escherichia coli, Citrobacter diversus, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri (12-17mm) (326). Concernant Mentha pulegium, les diamètres d’inhibition enregistrés pour l’huile à l’état pur dépassent également ceux trouvés par Boukhebti et al. 2011 (9-10 mm) (327) et Silva et al. 2013 (15,33-24,33 mm) (328) sur des bactéries à Gram négatif anaérobies facultatives. Mahboubi et al. 2008 (329) ont noté une résistance de certaines bactéries à Gram négatif (Escherichia coli, Salmonella typhimurium) à cette huile essentielle diluée à 10% dans DMSO, et une sensibilité pour Vibrio cholera avec un diamètre d’inhibition de 13 mm. Ces résultats comparés avec les diamètres enregistrés dans notre étude (d’une moyenne de 15 mm) pour l’huile essentielle diluée à 10% plaident pour une sensibilité supérieure du Aa. Ceci est également vrai pour Thymus vulgaris, dont les diamètres d’inhibition obtenus dans des études précédentes concernant d’autres bactéries à Gram négatif (S. enteritidis; S. typhimurium; E. coli, L. monocytogenes, S. flexneri, S. sonnei) (16-44 mm) demeurent moins importants que ceux issus de notre essai (45- 47,33 mm) (330). Quant au Cymbopogon martinii, des zones d’inhibition de faibles diamètres (3-10 mm) ont été enregistrées, dans l’étude de Chao et al. 2000 (331), pour des bactéries à Gram négatif (Alcaligenes faecalis, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) comparées à des diamètres plus grands (39 et 25,67 mm) pour Aa. Enfin, l’Origanum compactum a montré des diamètres d’inhibition significativement plus grands (51,67 et 53 mm) en comparaison avec toutes les huiles testées. Cette huile, également testée sur d’autres bactéries (332) avec des diamètres ne dépassant pas 37mm, a confirmé sa plus forte activité antibactérienne sur Aa. Ainsi, ces résultats plaideraient pour une sensibilité plus prononcée de ce microorganisme oral (Aa) comparée à d’autres pathogènes extra-oraux à 114 Dr LAKHDAR L. Gram négatif anaérobies facultatifs. Ceci pourrait être expliqué par la différence de croissance et de métabolisme bactériens, de conditions de croissance requises spécifiques à chaque type de bactérie (milieu de culture approprié, conditions d’anaérobiose…), ainsi que par la différence de protocoles employés dans chaque étude (densité optique de l’inoculum, quantité d’huile utilisée, diffusion en puits ou en disques en papier…). Aa est un micro-organisme complexe et exigeant, nécessitant une longue période d’incubation (48-72h) et des conditions de croissance particulières (5 à 10% de CO2), ce qui le différencie, entre autres, des autres bactéries à Gram négatif non orales. Aussi, les tests d’évaluation de sa susceptibilité antimicrobienne restent encore non standardisés. En effet, à ce jour, il n’existe pas de standards internationaux concernant les tests de susceptibilité pour les bactéries orales, rendant ainsi les comparaisons des résultats plus difficiles avec d’autres bactéries extra-orales. Par ailleurs, notre étude a mis en évidence une activité antimicrobienne prononcée pour toutes les huiles testées sur les 2 souches de Aa (JP2 et non-JP2). Cette activité semble être liée aux familles botaniques auxquelles appartiennent ces huiles. En effet, il est apparu dans plusieurs études que les lamiaceae, largement utilisées pour leurs propriétés antimicrobiennes (275, 276), ont un effet antibactérien non négligeable sur Aa (voir première partie ; chapitre IV : « Etude systematique sur l’activite antimicrobienne des huiles essentielles »). D’après les résulats rapportés dans ces études, des huiles essentielles appartenant à cette famille (telles:Mentha piperita, Satureja hortensis L.,Salvia fructicosa M.., Lavandula stoechas,Salvia officinalis, Thymus vulgaris, Rosmarinus offinalis et Lavandula officinalis) ont montré des valeurs de CMI allant de 0,8% à moins de 0,01 % (262, 265, 269, 272), ce qui concorde avec celles obtenues dans notre étude pour Thymus vulgaris, Origanum compactum et Mentha pulegium (CMI entre 0,3 et 0,03%). Concernant la famille des Poaceae également étudiée (dans laquelle figurent Cymbopogon citratus et Cymbopogon martinii que nous avons téstés), son activité sur le Aa n’a pas été rapportée dans d’autres publications. Toutefois, on retrouve dans la littérature d’autres extraits appartenant à cette famille, tels que : Sasa senanensis qui s’est avéré actif sur d’autres bactéries orales à Gram négatif parodonpathogènes telles que : Fusobacterium nucleatum et Prevotella intermedia (332). Quant à la famille des rutaceae (dans laquelle figure Citrus aurantium), également non testée à ce jour sur Aa, des études antérieures ont par ailleurs démontré une activité antibactérienne de certaines huiles essentielles (telles que : Citrus hystrix) (333) et de certains composants (334) appartenant à cette famille sur d’autres bactéries parodontales telles que: 115 Dr LAKHDAR L. Porphyromonas gingivalis et Prevotella intermedia. Cependant, il est important de souligner qu’il existe d’autres familles de plantes qui ont révélé dans des travaux précédents une activité antibactérienne faible ou nulle sur Aa, telles que : la famille « Piperaceae dont l’huile essentielle de Piper sarmentosum qui n’a montré aucun effet inhibiteur sur Aa (264). Toutes ces données peuvent être expliquées essentiellement par la composition chimique de l’huile essentielle étudiée. En effet, il a été démontré que l’activité antimicrobienne d’une huile essentielle est souvent liée à ses composés majoritaires (112). Dans notre étude, toutes les huiles étaient caractérisées par la dominance de composés antibactériens divers (Tableau 4-9). L’analyse chimique de l’Origanum compactum, qui s’est avéré le plus actif, a montré une dominance marquée de phénols (thymol 19.21% et carvacrol 22.29%). Ces derniers sont connus responsables de l’activité bactéricide des huiles essentielles qui en contiennent (103, 114, 117). Egalement, plusieurs études ont prouvé leurs niveaux élevés d’activité antimicrobienne sur divers microorganismes (335-337). Aussi, Le thymol a montré un effet antibactérien considérable sur Aa dans l’étude de Shapiro et al. 1994 (272) avec une CMI de 0,03%. Ce même composé est également retrouvé en majorité (thymol 42.01%) dans la constitution chimique du Thymus vulgaris, ce expliquerait également la puissante activité antimicrobienne de cette huile démontrée dans le 1er essai (diffusion en puits). Tandis que les autres composés γ-Terpinene et p-Cymene constituant les 2 huiles d’Origanum compactum et de Thymus vulgaris, aucun pouvoir antimicrobien spécifique ne leur a été attribué dans des études antérieures (335, 338). Concernant Cymbopogon citratus dont les résultats étaient aussi prometteurs (Tableau 10), ses principaux constituants chimiques (Geraniol (27,13%), Citronellol (12,67%), Citronellal (32,77%)) seraient à l’origine de son efficacité antibactérienne marquée, grâce à leur grande activité antimicrobienne démontrée dans des travaux précédents (326, 339-342). En effet, selon la littérature, les alcools et les aldéhydes sont bien connus comme puissants agents antimicrobiens (86, 116) (voir Partie 1, chapitre II, Activité antimicrobienne des huiles essentielles). Les autres huiles essentielles Mentha pulegium, Citrus aurantium et Cymbopogon martinii se sont également montrées très actives sur les 2 souches de Aa avec de grands halos d’inhibition (tableau 10). Leur composition chimique est dominée principalement par des composés de 116 Dr LAKHDAR L. type alcools (linalool 33, 92% pour Citrus aurantium et géraniol 84,12% pour Cymbopogon martinii) et cétones (R(+)-pulégone 71.48% pour Mentha pulegium). Se reportant aux données de littérature, ces composés majoritaires sont connus pour posséder des propriétés antimicrobiennes intéressantes sur des bactéries orales et non orales (263, 267, 333, 339, 343348). Concernant l’essai de microdilution en microplaques de 96 puits, les résultats obtenus pour la CMI sont pour la majorité en concordance avec les diamètres des zones d'inhibition observées dans l’essai de diffusion en puits. D’autre part, toutes les huiles essentielles testées ont montré une activité bactéricide avec des résultats prometteurs de CMB et un rapport CMB/CMI inférieur à 4. Les valeurs de CMB étaient similaires ou presque à celles de CMI. Origanum compactum a présenté l’activité inhibitrice la plus élevée contre les 2 souches de Aa (CMI= 0,03%) et l’effet bactéricide le plus prononcé contre la souche de référence de Aa (CMB= 0,03%) (Tableau 11). Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus dans des travaux antérieurs sur d’autres bactéries à Gram négatif non orales testées (331, 349-351). Néanmoins, les valeurs de CMI trouvés demeurent supérieures à ceux enregistrées pour Aa, traduisant ainsi une meilleure activité antibactérienne sur cette bactérie orale. Après Origanum compactum, les huiles essentielles de Thymus vulgaris, Cymbopogon citratus et Cymbopogon martinii ont présenté des CMI de 0,07% témoignant aussi d’une forte activité antibactérienne sur Aa. Ces résultats rejoignent ceux trouvés dans la littérature sur d’autres bactéries extraorales (350, 352-354). Le Thymus vulgaris a été récemment testé sur le Aa dans l’étude de Kędzia et al. 2013 (262) démontrant également un fort effet antimicrobien (CMI ≤ 62-500 µg/ml). Les huiles essentielles de Citrus aurantium et Mentha pulegium ont témoigné d’une activité inhibitrice (CMI=0,3%) et bactéricide (CMB= 0,6% et 0,3% respectivement) moindre en comparaison avec les autres huiles étudiées. Néanmoins, leur effet antimicrobien demeure non négligeable appuyé par des travaux précédents réalisés sur un ensemble de bactéries dont des bactéries à Gram négatif (354, 355). Dans l’étude de Shapiro et al. (272), une valeur de CMI similaire (0,3%) sur Aa a été trouvée pour Mentha piperita, qui est de la même espèce (Mentha) que Mentha pulegium, ce qui vient appuyer nos résultats. Toutefois, la divergence des résulats concernant les valeurs de CMI trouvées entre Aa et les autres bactéries extra orales à Gram négatif pourrait être due aux mêmes raisons évoquées plus haut dans notre 117 Dr LAKHDAR L. discussion (concernant la technique de diffusion en puits) et aussi principalement à la non standardisation des protocoles adoptés dans les différentes études pour l’évaluation de l’activité antimicrobienne des huiles essentielles (méthode de diffusion en milieu solide ou en milieu liquide par macro ou microdilution, solubilité de l’huile ou de ses composants, utilisation et quantité de l’émulsifiant, exposition du microorganisme à l’huile testée…) (112). De plus, il convient de noter que l’activité antibacterienne des huiles essentielles dépend également du stade de croissance des cellules bactériennes. En effet, selon un récent rapport, les cellules en division seraient plus sensibles, ceci serait probablement dû au fait que les huiles essentielles pénétrent plus efficacement dans les sites en pleine croissance (78). Ces données supporteraient nos résultats prometteurs, puisque dans notre méthodologie, nous avons testé les souches en phase exponentielle de croissance (après 24h de culture). Selon d’autres données de littérature, la nature de la membrane cellulaire bactérienne et l’étendue des dommages membranaires produits par les huiles essentielles sont aussi à prendre en compte pour expliquer les résultats obtenus (356). Les huiles essentielles, comme tout agent antimicrobien ciblent la paroi et membrane de la cellule bactérienne. Et étant de nature lipophile, ces huiles passent à travers ces structures; perturbant les différents composants (polysaccharides, acides gras and phospholipides) rendant ainsi la paroi cellulaire et la membrane cytoplasmique plus perméables. La fuite des macromolécules et ions provoquerait alors la lyse et la mort cellulaire (348). Cependant, le mécanisme d’action des huiles essentielles sur la cellule bactérienne reste encore non entièrement élucidé. Davantage d’investigations sont nécessaires pour mieux comprendre le processus et la nature de cet effet antibactérien des huiles essentielles. Il ressort également dans nos résultats concernant la comparaison entre les valeurs de CMI et CMB obtenues pour chaque souche, qu’il n’existe aucune différence significative entre Aa souche de référence non-JP2 et Aa isolat clinique clone JP2. Il est important de souligner que la résistance antimicrobienne souvent décrite pour les souches isolées cliniquement est principalement liée aux antibiotiques et au jour d’aujourd’hui aucune résistance bactérienne aux huiles essentielles n’a été rapportée ou démontrée (78). Ceci serait probablement dû au mode d’action de ces huiles affectant simultanèment différentes structures de la cellule bactérienne (78). Nos résultats s’accordent avec ceux retrouvés dans des études antérieures. En effet, il a été rapporté pour Cymbopogon citratus dans l’étude de Khongkhunthian et al. 2009 (357), un effet antibactérien sur des bactéries parodontopathogènes (Actinomyces 118 Dr LAKHDAR L. naeslundii et Porphyromonas gingivalis); aussi bien sur des souches de référence que des souches isolées cliniquement chez des patients atteints de gingivites et de parodontites. Aussi, Gattuso et al. en 2007 (358) ont démontré que les limonoids présents dans l’espèce du Citrus possèdent une activité sur plusieurs souches bactériennes isolées cliniquement. D’autres essais ont montré que le Geraniol, constituant principal du Citrus aurantium et Cymbopogon citratus, exerce une activité antibactérienne sur des isolats cliniques multi-résistantes provenant de nombreuses espèces bactériennes à Gram négatif (Enterobacter aerogenes, E. coli, P. aeruginosa) (359). Pour Mentha pulegium, une efficacité antibactérienne a été également rapportée envers des isolats cliniques multi-résistants de Klebsiella (360). Cymbopogon martinii s’est avéré puissant dans l’inhibition de bactéries à Gram négatif pathogènes isolées cliniquement à partir d’infections vaginales dans l’étude de Schwiertz et al. 2006 (361). De même, Thymus vulgaris a montré une activité contre des isolats cliniques du tractus respiratoire incluant des espèces à Gram négatif anaérobies facultatifs (Haemophilus influenzae) (362). Enfin, Origanum compactum, dans des études précédentes, a montré aussi une efficacité antibactérienne sur des souches cliniques de bactéries à Gram négatif d’origine intestinale, respiratoire et dermique (350, 363). Concernant le rapport CMB/CMI qui renseigne sur la nature de l’effet antibactérien des huiles essentielles testées, d’après les résultats obtenus (Tableau 11) toutes les huiles se sont avérées bactéricides sur les 2 souches de Aa à des degrés différents en fonction des huiles testées et de la souche testée. En effet, pour les huiles essentielles d’Origanum compactum et de Thymus vulgaris, ce rapport (CMB/CMI) était significativement différent de celui enregistré pour l’huile essentielle de Cymbopogon martinii, traduisant ainsi une différence d’activité bactéricide entre ces huiles. Ceci pourrait s’expliquer par la nature des composants chimiques antibactériens constituant ces agents. Les phénols, dont le thymol essentiellement, qui représente le constituant chimique majeur des huiles essentielles d’Origanum compactum et de Thymus vulgaris, sont non retrouvés dans la composition chimique du Cymbopogon martinii. Ces composés sont bien connus responsables de l’activicité bactéricide des huiles essentielles qui en contiennent (104, 114, 117), en produisent des dégâts irréversibles au niveau de la membrane de la cellule bactérienne (118). Par ailleurs, il est à noter que les valeurs enregistrées concernant le pouvoir bactéricide d’Origanum compactum et Thymus vulgaris étaient différentes entre les 2 souches de Aa. L’effet bactéricide de ces 2 huiles était plus marqué pour Aa non-JP2 de référence que pour Aa JP2 clinique. Il est à souligner que la 119 Dr LAKHDAR L. comparaison de l’effet bactéricide (CMB/CMI) concernant toutes les huiles testées entre les 2 souches de Aa a mis en évidence une différence statistiquement significative, avec une bactéricidie plus prononcée envers Aa de référence. Ces résultats corroborent avec les données de littérature concernant la résistance plus marquée aux agents antimicrobiens des bactéries évoluant au sein du biofilm par rapport aux bactéries planctoniques (319, 364-366), ce qui explique la sensibilité plus importante de la souche de référence de Aa aux huiles essentielles par rapport à l’isolat clinique. En effet, cette souche clinique provenant du biofilm parodontal, aurait une résistance acquise due à une modification des caractéristiques de l’enveloppe bactérienne, cible d’action de nombreux antimicrobiens par transfert génétique à partir des autres bactéries au sein du biofilm (367, 368). De plus, il se produit une modification du phénotype exprimé par les bactéries du biofilm liée à leur adhésion à une surface dentaire ou épithéliale de la poche parodontale (238). Toutes ces caractéristiques acquises par les bactéries du biofilm seront perdues pour une bactérie évoluant sous forme planctonique. Ainsi, dans notre présent travail, nous avons démontré une haute sensibilité d’une bactérie parodontopathogène virulente, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, envers de nouveaux agents naturels, pour la plupart jamais étudiés ou même testés sur des bactéries orales, et plus particulièrement sur ce type de souche. Or, ce microorganisme testé dans notre étude évolue au sein d’un biofilm parodontal complexe chez des patients atteins de parodontites agressives. Ce biofilm est composé de différentes bactéries parodontopathogènes aussi complexes et virulentes telles : Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus, Fusobacterium nucleatum….Ces pathogènes parodontaux ont été fortement associés à la progression et à la sévérité des maladies parodontales ainsi qu’aux récidives de traitement parodontal (369, 370). Par conséquent, une évaluation ultérieure in vitro de l’activité antibactérienne de ces huiles sur Aggregatibacter actinomycetemcomitans, non sous forme isolée mais organisée au sein de ce biofilm complexe serait nécessaire, et ce afin de nous rapprocher plus du contexte clinique réel et pouvoir considérer la possibilité d’intégrer ces huiles dans le traitement parodontal comme agents antimicrobiens potentiels, avant de passer aux essais in vivo. D’autre part, notre recherche comprend d’autres limites, qui consistent au manque de données concernant la toxicité in vitro de ces huiles essentielles testées qui n’a pas encore été étudiée. En effet, les concentrations antibactériennes efficaces obtenues pour ces huiles doivent être testées sur des cellules vivantes in vitro afin d’évaluer leur cytotoxicité. Ceci prends toute son 120 Dr LAKHDAR L. importance, quand on sait que la CMI obtenue d’une huile active peut ne pas correspondre à la concentration non toxique, comme l’a démontré Fabio et al. 2007 (362) sur des cellules Vero. 121 Dr LAKHDAR L. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES Dans notre présent travail, nous avons étudié l’activité antibactérienne in vitro de six huiles essentielles d’origine Marocaine : Mentha pulegium, Citrus aurantium, Cymbopogon citratus, Thymus vulgaris, Origanum compactum et Cymbopogon martinii.sur une souche virulente clone JP2 originelle Marocaine d’Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) prélevée chez des patients atteints de parodontites agressives, et ce en comparaison avec une souche de référence non-JP2 connue. La méthode expérimentale employée a consisté à isoler la souche clinique, puis à réaliser une évaluation qualitative (méthode de diffusion en puits) et quantitative (méthode de microdilution) de l’activité antimicrobienne des huiles testées sur l’isolat clinique et sur une souche de référence. A partir des résultats obtenus, nous pouvons résumer les conclusions issues de cette étude comme suit : 1. La première étape de « screening » pour l’évaluation qualitative de l’activité antimicrobienne des huiles essentielles étudiées a montré un effet antimicrobien pour toutes les huiles testées en mettant en évidence des zones d’inhibition avec des diamètres dépassant 20 mm, montrant ainsi une sensibilité non négligeable de la bactérie étudiée. 2. Ces résultats ont été confirmés dans la seconde étape de notre partie expérimentale qui a permis de quantifier cette activité en trouvant des valeurs de CMI et CMB variant de 0,0 3 à 0,3% mettant en évidence ainsi une forte activité antibactérienne de ces agents étudiés contre Aa. 3. L’huile essentielle d’Origanum compactum, riche en phénols, s’est avérée la plus efficace, et celle de Mentha pulegium, riches en cétones, la moins active sur Aa. Ainsi, ces résultats demeurent prometteurs, et pourraient servir de base pour des études cliniques ultérieures afin de confirmer l’efficacité antimicrobienne de ces produits naturels et de proposer leur utilisation en tant qu’agents antimicrobiens alternatifs effectifs dans les parodontites agressives, palliant aux effets secondaires des antibiotiques et aux résistances bactériennes accrues. Toutefois, plusieurs points sont à prendre en considération avant l’étape de l’essai clinque, à savoir : 122 Dr LAKHDAR L. - L’étude de la cytotoxicité des huiles testées : Les valeurs de CMI obtenues pour nos huiles étudiées (0,3- 0.03%) contre Aa sont intéressantes. Cepend ant ces concentrations ont été testées in vitro et peuvent s’avérer toxiques sur des cellules vivantes in vivo. Ainsi, il serait nécessaire de réaliser au préalable des essais in vitro pour tester ces concentrations sur des cellules vivantes en culture aussi bien sur des cellules diverses de l’organisme (sanguines, rénales…) pour tester la toxicité générale que sur des cellules des tissus parodontaux (cellules desmodontales, osseuses, kératinocytes …) pour tester la toxicité locale .puisqu’il s’agit de traiter des parodontites agressives. L’étude de la toxicité de ces huiles par des expérimentations in vivo sur des animaux de laboratoire serait également judicieuse, en testant la toxicité aigue et sub-chronique. - L’évaluation in vitro de l’activité antibactérienne de ces huiles sur tout le biofilm parodontal sous gingival (incluant Aggregatibacter actinomycetemcomitans), prélevé chez des patients atteints de parodontites agressives : Dans notre étude, nous avons démontré un effet antimicrobien « in vitro » d’huiles essentielles sur une souche isolée d’Aggregatibacter actinomyctemcomitans. Cependant, il est important de noter que ce microorganisme évolue au sein d’un biofilm parodontal complexe chez des patients atteins de parodontites agressives, composé d’autres bactéries parodontopathogènes connues également impliquées dans ces maladies, telles : Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus, Fusobacterium nucleatum…. En conséquence, il serait judicieux de vérifier l’activité antibactérienne de ces mêmes huiles étudiées sur ces microorganismes ainsi que sur tout le biofilm sous-gingival associé aux parodontites agressives, et ce avant de passer aux études in vivo. - L’étude in vitro de l’activité antimicrobienne des composants majoritaires de ces huiles sur Aa et d’autres bactéries parodontopathogènes impliquées dans les parodontites agressives : Etant donné que l’activité antimicrobienne des huiles essentielles est étroitement liée à leur composition chimique, il serait intéressant de tester, dans un travail ultérieur, les composés majoritaires de ces huiles sur notre souche étudiée et d’autres bactéries parodontopathogènes incriminées dans les parodontites agressives, ainsi que sur tout le 123 Dr LAKHDAR L. biofilm parodontal à partir de prélèvement clinique chez des patients atteints de ces maladies parodontales destructrices. Une fois toutes ces étapes réalisées, des essais cliniques suivant un protocole bien établi approuvé par le comité d’éthique seront effectués chez des patients atteints de maladies parodontales en l’occurrence les parodontites agressives, et ce afin d’évaluer l’efficacité réelle de ces agents antimicrobiens d’origine naturelle. 124 Dr LAKHDAR L. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Costerton JW., Lewandowski Z., Caldwell DE., Korber DR., Lappin-scott HM. Microbial biofilms. Annu. Rev. Microbiol. 1995; 49:711-45 2. Lakhdar L., Hmamouchi M., Rida S., Ennibi O.Antibacterial activity of essential oils against periodontal pathogens: a qualitative systematic review. Trop Dent J. 2012; 35(140): 38-46. 3. Lindhe J., Karring T., Lang NP. Clinical periodontology and implant dentistry. Fifth edition, Blackwell Munksgaard 2008. 4. Listgarten MA.Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. 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RESUME Aujourd’hui, il existe suffisamment de preuves scientifiques sur l’existence d’une résistance accrue et croissante des bactéries orales aux antibiotiques. De ce fait, la recherche de nouveaux agents d’origine naturelle, présentant moins de danger pour la santé et palliant aux effets secondaires des antibiotiques, tels: « les huiles essentielles », est devenue une nécessité. Etant donné que le Maroc figure parmi les principaux pays producteurs d’huiles essentielles, notre présente étude de recherche s’est proposée de tester l’activité antibactérienne d’huiles essentielles d’origine Marocaine sur Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) (sérotype b), bactérie orale connue virulente et incriminée dans les parodontites agressives, réel problème de santé publique au Maroc. Il s’agit d’un pathogène parodontal nécessitant pour son élimination un débridement mécanique associé à une antibiothérapie. Dans notre étude, l’isolement d’une souche clinique Marocaine originelle de Aa a été d’abord réalisé à partir de prélèvements chez des patients atteints de parodontites agressives suivant un protocole bien établi. Ensuite, l’activité antibactérienne de six huiles Marocaines a été étudiée sur une souche clinique clone JP2 et une souche de référence non-JP2 de Aa. Il s’agit des huiles essentielles de Mentha pulegium, Citrus aurantium, Cymbopogon citratus, Thymus vulgaris, Origanum compactum et Cymbopogon martinii. Après une analyse chromatographique de ces huiles mettant en évidence leur composition chimique, leur activité antimicrobienne a été évaluée en faisant appel à la méthode de diffusion en puits et de microdilution. Les résultats obtenus ont mis en évidence des zones d’inhibition de diamètres dépassant 20 mm, pour les deux souches de Aa et concernant toutes les huiles étudiées, suggérant une forte sensibilité de la bactérie aux agents testés. Aucune différence statistiquement significative n’a été observée entre les 2 souches Aa JP2 et non-JP2. Les Concentrations Minimales Inhibtrices (CMI) et Bactéricides (CMB) ensuite calculées ont montré des valeurs variant de 0,03 à 0,3% et de 0,07 à 0,6% respectivement, témoignant ainsi d’une forte activité bactéricide in vitro de toutes les huiles testées sur Aa. Par conséquent, sur la base de ces résultats prometteurs obtenus dans notre présent travail, nous pouvons proposer ces huiles marocaines en tant qu’agents antimicrobiens potentiels dans les parodontites agressives dans lesquels les souches de Aa étudiées (JP2 et non-JP2) peuvent être associées. Cependant, des études cliniques in vivo ultérieures sont nécessaires pour confirmer l’efficacité antimicrobienne de ces produits naturels. Mots clés : huiles essentielles, bactéries orales, bactéries paropathogènes, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, activité antibactérienne, concentration minimale inhibitrice. 164 ﻣﻠﺨﺺ ﻓﺈﻥ ﺍﻟﺒﺤﺙ ﻋﻥ ﻭﻜﻼﺀ ﺠﺩﺩ، ﻭﻟﺫﻟﻙ. ﻫﻨﺎﻙ ﺃﺩﻟﺔ ﻋﻠﻤﻴﺔ ﻜﺎﻓﻴﺔ ﻋﻠﻰ ﻭﺠﻭﺩ ﺯﻴﺎﺩﺓ ﻤﻘﺎﻭﻤﺔ ﺍﻟﺒﻜﺘﻴﺭﻴﺎ ﻟﻠﻤﻀﺎﺩﺍﺕ ﺍﻟﺤﻴﻭﻴﺔ ﻋﻥ ﻁﺭﻴﻕ ﺍﻟﻔﻡ،ﺍﻟﻴﻭﻡ . ﻤﺜل " ﺍﻟﺯﻴﻭﺕ ﺍﻟﻌﻁﺭﻴﺔ " ﺃﺼﺒﺢ ﻀﺭﻭﺭﺓ، ﻤﻊ ﺨﻁﺭ ﺃﻗل ﻟﻠﺼﺤﺔ ﻭ ﺍﻟﺘﻐﻠﺏ ﻋﻠﻰ ﺍﻵﺜﺎﺭ ﺍﻟﺠﺎﻨﺒﻴﺔ ﻟﻠﻤﻀﺎﺩﺍﺕ ﺍﻟﺤﻴﻭﻴﺔ، ﻤﻥ ﺃﺼل ﻁﺒﻴﻌﻲ ﺘﻘﺘﺭﺡ ﺩﺭﺍﺴﺘﻨﺎ ﺍﻟﺒﺤﺜﻴﺔ ﻻﺨﺘﺒﺎﺭ ﺍﻟﻨﺸﺎﻁ ﺍﻟﻤﻀﺎﺩ، ﻭﺒﺎﻟﻨﻅﺭ ﺇﻟﻰ ﺃﻥ ﺍﻟﻤﻐﺭﺏ ﻫﻲ ﻭﺍﺤﺩﺓ ﻤﻥ ﺍﻟﺩﻭل ﺍﻟﺭﺌﻴﺴﻴﺔ ﺍﻟﻤﻨﺘﺠﺔ ﻟﻠﺯﻴﻭﺕ ﺍﻟﻌﻁﺭﻴﺔ ﺍﻜﺭﻜﺘﺒﻜﺘﻴﺭactinomycetemcomitan Aggregatibacter ﻟﻠﺒﻜﺘﻴﺭﻴﺎ ﻤﻥ ﺍﻟﺯﻴﻭﺕ ﺍﻷﺴﺎﺴﻴﺔ ﻤﻥ ﺃﺼل ﻤﻐﺭﺒﻲ ﻋﻠﻰ ﻤﺸﻜﻠﺔ، ﺃﺃ ﺍﻟﻨﻤﻁ ﺍﻟﻤﺼﻠﻲ ﺏ( ﺒﻜﺘﻴﺭﻴﺎ ﻋﻥ ﻁﺭﻴﻕ ﺍﻟﻔﻡ ﻤﻌﺭﻭﻓﺔ ﻀﺎﺭﺓ ﻭ ﻤﺘﻭﺭﻁﺔ ﻓﻲ ﺍﻤﺭﺍﺽ ﺍﻟﻠﺜﺔ ﺍﻟﻌﺩﻭﺍﻨﻴﺔaA)ﺍﻜﺘﻨﻭﻤﺴﺘﻴﻤﻜﻭﻤﻴﺘﺎﻨﺱ ﻓﻲ. ﻤﻤﺭﺽ ﺍﻟﻠﺜﺔ ﻫﺫﺍ ﻴﺘﻁﻠﺏ ﻟﻠﺘﺨﻠﺹ ﻤﻨﻪ ﺍﻟﺘﻨﻀﻴﺭ ﺍﻟﻤﻴﻜﺎﻨﻴﻜﻴﺔ ﺍﻟﻤﺭﺘﺒﻁﺔ ﺍﻟﻌﻼﺝ ﺒﺎﻟﻤﻀﺎﺩﺍﺕ ﺍﻟﺤﻴﻭﻴﺔ. ﺼﺤﻴﺔ ﻋﺎﻤﺔ ﺤﻘﻴﻘﻴﺔ ﻓﻲ ﺍﻟﻤﻐﺭﺏ ﺘﻡ ﺇﺠﺭﺍﺀ ﻋﺯل ﺴﻼﻟﺔ ﺍﻟﺴﺭﻴﺭﻱ ﺍﻟﻤﻐﺭﺒﻲ ﺍﻷﺼﻠﻲ ﺃﺃ ﻤﻥ ﻋﻴﻨﺎﺕ ﻤﻥ ﺍﻟﻤﺭﻀﻰ ﺍﻟﺫﻴﻥ ﻴﻌﺎﻨﻭﻥ ﻤﻥ ﺍﻟﺘﻬﺎﺏ ﺍﻟﻠﺜﺔ ﺍﻟﻌﺩﻭﺍﻨﻴﺔ ﺒﺎﺘﺒﺎﻉ، ﺩﺭﺍﺴﺘﻨﺎ ﻭ ﺴﻼﻟﺔ ﺇﺸﺎﺭﺓ2JP ﺜﻡ ﺩﺭﺍﺴﺔ ﺍﻟﻨﺸﺎﻁ ﺍﻟﻤﻀﺎﺩ ﻟﻠﺒﻜﺘﻴﺭﻴﺎ ﻤﻥ ﺴﺘﺔ ﺍﻟﺯﻴﻭﺕ ﺍﻟﻤﻐﺭﺒﻴﺔ ﻋﻠﻰ ﺴﺭﻴﺭﻱ ﺍﺴﺘﻨﺴﺎﺥ ﺴﻼﻟﺔ.ﺒﺭﻭﺘﻭﻜﻭل ﺍﻟﻤﻌﻤﻭل ﺒﻬﺎ ﺍﻟﻤﺭﺩﻜﻭﺵ ﺍﻟﻤﻜﺘﻨﺯﺓ، ﺍﻟﻐﺩﺓ ﺍﻟﺼﻌﺘﺭﻴﺔ ﺍﻟﺸﺎﺌﻊ، ﺇﺫﺨﺭ ﻟﻴﻤﻭﻨﻲ، ﺍﻟﻨﺎﺭﻨﺞ، ﻫﺫﻩ ﺍﻟﺯﻴﻭﺕ ﺍﻷﺴﺎﺴﻴﺔ ﻤﻥ ﺍﻟﻨﻌﻨﺎﻉ. ﻤﻥ ﺃﺃ2JP ﻏﻴﺭ ﻭﺠﺭﻯ ﺘﻘﻴﻴﻡ، ﺒﻌﺩ ﺍﻟﺘﺤﻠﻴل ﺍﻟﻜﺭﻭﻤﺎﺘﻭﻏﺭﺍﻓﻲ ﻤﻥ ﻫﺫﻩ ﺍﻟﺯﻴﻭﺕ ﻤﻥ ﺍﺠل ﺘﺴﻠﻴﻁ ﺍﻟﻀﻭﺀ ﻋﻠﻰ ﺘﺭﻜﻴﺒﺘﻬﺎ ﺍﻟﻜﻴﻤﻴﺎﺌﻴﺔ.ﻭﺴﻴﻤﺒﻭﺒﻭﻜﻭﻥ ﻤﺎﺭﺘﻴﻨﻲ ﻭ ﺃﻅﻬﺭﺕ ﺍﻟﻨﺘﺎﺌﺞ ﺍﻟﺘﻲ ﺘﻡ ﺍﻟﺤﺼﻭل ﻋﻠﻴﻬﺎ ﻤﻥ ﺃﻗﻁﺎﺭ ﻤﻨﺎﻁﻕ ﺘﺜﺒﻴﻁ.ﺍﻟﻨﺸﺎﻁ ﺍﻟﺒﻜﺘﻴﺭﻱ ﺒﺎﺴﺘﺨﺩﺍﻡ ﻁﺭﻴﻘﺔ ﻨﺸﺭ ﺍﻵﺒﺎﺭ ﻭ ﺍﻟﺘﺨﻔﻴﻑ ﺍﻟﺠﺯﺌﻲ ﻤﻤﺎ ﻴﺸﻴﺭ ﺇﻟﻰ ﺤﺴﺎﺴﻴﺔ ﻗﻭﻴﺔ ﻟﻠﺒﻜﺘﻴﺭﻴﺎ ﺇﻟﻰ، ﺴﻭﺍﺀ ﻟﻜل ﻤﻥ ﺍﻟﺴﻼﻻﺕ ﺃﺃ ﻭﻓﻴﻤﺎ ﻴﺘﻌﻠﻕ ﺒﺠﻤﻴﻊ ﺍﻟﺯﻴﻭﺕ ﺍﻟﺘﻲ ﺘﻤﺕ ﺩﺭﺍﺴﺘﻬﺎ، ﻤﻠﻡ20 ﺃﻜﺜﺭ ﻤﻥ ﺃﻅﻬﺭﺕ ﺍﻟﺘﺭﻜﻴﺯﺍﺕ ﺍﻟﻤﺜﺒﻁﺔ ﺍﻟﺩﻨﻴﺎ ﻭ ﺍﻟﻤﺒﻴﺩﺓ.2JP ﻭﻏﻴﺭ2JP ﺴﻼﻻﺕ ﺃﺃ2 ﻻ ﻓﺭﻭﻕ ﻟﻭﺤﻅﺕ ﺫﺍﺕ ﺩﻻﻟﺔ ﺇﺤﺼﺎﺌﻴﺔ ﺒﻴﻥ.ﻭﻜﻼﺀ ﺍﺨﺘﺒﺎﺭﻫﺎ ﻤﻤﺎ ﻴﻌﻜﺱ ﺍﻟﻨﺸﺎﻁ ﺍﻟﻘﻭﻱ ﻟﻠﺠﺭﺍﺜﻴﻡ ﻓﻲ ﺍﻟﻤﺨﺘﺒﺭ ﻤﻥ، ﻋﻠﻰ ﺍﻟﺘﻭﺍﻟﻲ٪0،6 ﺤﺘﻲ0،07 ﻭ٪3،-0،03 ﻟﻠﺠﺭﺍﺜﻴﻡ ﺜﻡ ﺍﻟﻤﺤﺴﻭﺒﺔ ﻗﻴﻡ ﺘﺘﺭﺍﻭﺡ ﻴﻤﻜﻨﻨﺎ ﺃﻥ ﻨﻘﺩﻡ ﻫﺫﻩ ﺍﻟﺯﻴﻭﺕ، ﻭﺒﻨﺎﺀ ﻋﻠﻰ ﻫﺫﻩ ﺍﻟﻨﺘﺎﺌﺞ ﺍﻟﻭﺍﻋﺩﺓ ﺍﻟﺘﻲ ﺘﻡ ﺍﻟﺤﺼﻭل ﻋﻠﻴﻬﺎ ﻓﻲ ﻋﻤﻠﻨﺎ ﺍﻟﺤﺎﻟﻲ، ﻟﺫﻟﻙ.ﺠﻤﻴﻊ ﺍﻟﺯﻴﻭﺕ ﺍﺨﺘﺒﺎﺭ ﺃﺃ ﻓﻲ، ﻭﻤﻊ ﺫﻟﻙ.( ﻗﺩ ﺘﺘﺭﺍﻓﻕ2JP ﻭﻏﻴﺭ2JP) ﺍﻟﻤﻐﺭﺒﻴﺔ ﻜﻭﻜﻼﺀ ﻤﺤﺘﻤﻠﻴﻥ ﻤﻀﺎﺩﺍﺕ ﺍﻟﻤﻴﻜﺭﻭﺒﺎﺕ ﻓﻲ ﺍﻟﻠﺜﺔ ﺍﻟﻌﺩﻭﺍﻨﻴﺔ ﺍﻟﺘﻲ ﺩﺭﺴﺕ ﺴﻼﻻﺕ ﺃﺃ .ﺍﻟﺩﺭﺍﺴﺎﺕ ﺍﻟﺴﺭﻴﺭﻴﺔ ﺍﻟﻼﺤﻘﺔ ﻭﻫﻨﺎﻙ ﺤﺎﺠﺔ ﻟﺘﺄﻜﻴﺩ ﺍﻟﻔﻌﺎﻟﻴﺔ ﺍﻟﻤﻀﺎﺩﺓ ﻟﻤﻴﻜﺭﻭﺒﺎﺕ ﺍﻟﺠﺴﻡ ﺍﻟﺤﻲ ﻤﻥ ﻫﺫﻩ ﺍﻟﻤﻨﺘﺠﺎﺕ ﺍﻟﻁﺒﻴﻌﻴﺔ actinomycetemcomitans ، ﺍﻟﺒﻜﺘﻴﺭﻴﺎ ﺍﻟﻤﺴﺒﺒﺔ ﻷﻤﺭﺍﺽ ﺍﻟﻠﺜﺔ، ﺍﻟﺒﻜﺘﻴﺭﻴﺎ ﻋﻥ ﻁﺭﻴﻕ ﺍﻟﻔﻡ، ﺍﻟﺯﻴﻭﺕ ﺍﻷﺴﺎﺴﻴﺔ:ﻜﻠﻤﺎﺕ ﺍﻟﺒﺤﺙ . ﺍﻟﺘﺭﻜﻴﺯ ﺍﻟﻤﺜﺒﻁ ﺍﻷﺩﻨﻰ، ﺍﻟﻨﺸﺎﻁ ﺍﻟﻤﻀﺎﺩ ﻟﻠﺒﻜﺘﻴﺭﻴﺎ، Aggregatibacter ABSTRACT Today, there is enough scientific evidence on the existence of an increased resistance of oral bacteria to antibiotics. Therefore, the search for new natural agents, with less danger for the health and overcoming the side effects of antibiotics, such "essential oils," has become a necessity. Since Morocco is one of the major producers of essential oils, our present research study proposed to test the antibacterial activity of Moroccan native essential oils on Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) (serotype b), known virulent oral bacteria and implicated in aggressive periodontitis, real public health problem in Morocco. It is a periodontal pathogen requiring for its elimination a mechanical debridement associated with an antibiotic treatment. In our study, the isolation of an original Moroccan clinical strain of Aa was first performed from specimens in patients with aggressive periodontitis according to an established protocol. Then, the antibacterial activity of six selected Moroccan oils was studied in a clinical JP2 strain and a reference non-JP2 strain of Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa). These are the essential oils of Mentha pulegium, Citrus aurantium, Cymbopogon citratus, Thymus vulgaris, Origanum compactum and Cymbopogon martinii. After chromatographic analysis of these oils highlighting their chemical composition, antimicrobial activity was evaluated using well-diffusion and microdilution methods. The results showed inhibition zones of diameters exceeding 20 mm, for both strains of Aa and on all studied oils, suggesting a high sensitivity of the bacterium to the tested agents. No statistically significant difference was observed between the two strains JP2 and non-JP2 Aa. Minimal Inhibitory and bactericidal Concentrations (MIC, MBC) then calculated, showed values ranging from 0.03 to 0.3% and from 0.07 to 0.6%, respectively, reflecting a strong in vitro bactericidal activity of all tested oils on Aa. Therefore, based on these promising results obtained in our present work, we can suggest these Moroccan oils as potential antimicrobial agents in aggressive periodontitis where studied strains of Aa (JP2 and non-JP2) may be associated. However, further in vivo clinical studies are required to confirm the antimicrobial efficacy of these natural products. Key words: essential oils, oral bacteria, periopathogens, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, antibacterial activity, Minimum inhibitory concentration.